ES2440665T3

ES2440665T3 - Método para producir astaxantina o un producto metabólico de la misma utilizando genes de carotenoide cetolasa y carotenoide hidroxilasa

Info

Publication number: ES2440665T3
Application number: ES05743757.6T
Authority: ES
Inventors: Seon-Kang Choi; Norihiko Misawa
Original assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Current assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2005-05-26
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2025-05-26
Also published as: US20090298146A1; JP4803739B2; EP1780281A4; EP1780281A1; EP1780281B1; JPWO2005118812A1; WO2005118812A1; US7999151B2

Abstract

Un microorganismo o una planta transformados con (i) un gen de anillo de ß-ionona 4-cetolasa que codifica (a) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2; o (b) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada enel SEQ ID NO: 2 mediante adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y que tiene actividad deanillo de ß-ionona 4-cetolasa; y (ii) un gen de anillo de ß-ionona 3-hidroxilasa que codifica (c) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 10; o (d) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada enel SEQ ID NO: 10 mediante adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y tiene actividad de anillode ß-ionona 3-hidroxilasa; siendo el microorganismo o la planta capaces de sintetizar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster deastaxantina.

Description

Método para producir astaxantina o un producto metabólico de la misma utilizando genes de carotenoide cetolasa y carotenoide hidroxilasa

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para preparar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o ésteres de astaxantina utilizando un microorganismo o una planta transformados con un gen de oxigenasa que codifica una enzima que sustituye un grupo metileno en la posición 4 (4') de un anillo de β-ionona (anillo β) de un carotenoide con un grupo ceto y un gen de hidroxilasa que codifica una enzima que introduce un grupo hidroxilo en el carbono de la posición 3 (3') de un anillo de β-ionona (anillo β) de un carotenoide.

Técnica anterior

Carotenoide (también denominado "carotinoide") es un término general para los pigmentos que se encuentran de manera abundante en la naturaleza y está formado por una cadena principal de isopreno de 40 átomos de carbono. Hasta la fecha, se han aislado más de 600 especies de carotenoides (Pfander, H., ed., Key to Carotenoids, Birkhauser, Basel, 1987). Recientemente, se han reconocido los efectos profilácticos de los carotenoides en diferentes enfermedades crónicas tales como el cáncer, y se han realizado numerosos informes (véanse, por ejemplo, Nishino, H., Murakoshi, M., Yano, M. Food Style 21, 4, 53-55, 2000; Nishino, H. et al, Carotenoids in cancer chemoprevention, Cancer Metastasis Rev. 21, 257-264, 2002; Mayne, S.T., β-Carotene, carotenoids, and disease prevention in humans, FASEB J., 10, 690-701, 1996). Entre ellos, la astaxantina es un carotenoide que ha sido particularmente reconocido como material para la alimentación sana, recientemente (Uonomi, T., Antioxidant effect and cancer-metastasis-suppressive effect of, the greatest carotenoid of all time, "astaxantin", Food Style 21, 4, 70-75, 2000). La evaluación in vitro de la astaxantina en cuanto al efecto de eliminación del oxígeno singlete, que es un tipo de oxígeno activo, demuestra que el efecto de la astaxantina es 500 veces mayor que el de la vitamina E, 40 veces mayor que la del β-caroteno, y 10 veces mayor que la del licopeno. Adicionalmente, en estudios epidemiológicos y clínicos de sujetos humanos, se ha observado que la astaxantina suprime la oxidación de la LDL de la sangre y de ese modo suprime la arteriosclerosis (documento anteriormente mencionado: Uonomi, T. Food Style 21, 4, 70-75, 2000). Además, se ha revelado que la astaxantina intensifica la actividad de las células NK y tiene efectos sobre la prevención de las cataratas, la degeneración macular asociada con la edad, y el cáncer de vejiga (documento anteriormente mencionado: Food Style 21, 4, 70-75, 2000; Tanaka, T. et al, Chemoprevention of mouse urinary bladder carcinogenesis by the naturally occurring carotenoid astaxanthin, Carcinogenesis 15, 15-19, 1994).

La astaxantina se prepara comercialmente extrayéndola de crustáceos tales como eufaúsidos y langostas, y también se extrae de un cultivo de algas verdes productoras de astaxantina Haematococcus pluvialis. Sin embargo, en el primer caso, la astaxantina tiene desventajas en la calidad y el coste, esto es, disparidad en la concentración del pigmento, un olor peculiar para materias primas, y un bajo rendimiento. En el último caso, la astaxantina no puede ser producida de manera estable debido al requerimiento de cultivo durante un largo período de tiempo a una temperatura intermedia a un pH neutro. De este modo, hasta la fecha, no se ha logrado alcanzar un suministro estable de astaxantina poco costosa. Por lo tanto, el suministro estable de astaxantina poco costosa puede permitir llevar a cabo diferentes ensayos fisiológicos novedosos para evaluar los efectos ventajosos de la astaxantina sobre la salud humana. Por consiguiente, el actual mercado de comida sana se ampliará significativamente.

Con el fin de lograr el objeto anteriormente mencionado, se puede suministrar astaxantina comercialmente diseñando un microorganismo o una planta recombinante que pueda producir una gran cantidad de astaxantina por medio del diseño metabólico. Los genes que permiten que un microorganismo o una planta produzcan astaxantina ya han sido obtenidos. Ha sido posible elaborar un microorganismo tal como una bacteria o una levadura o un órgano específico de una planta, que no producía originalmente carotenoides, que sintetiza astaxantina utilizando estos genes (Documento no de Patente 1: Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser. P.D., y Misawa, N., Production of the carotenoids, lycopene, β-carotene, and astaxanthin in the food yeast Candida utilis. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1226-1229, 1998; Mann, V., Harker, M., Pecker, I., y Hirschberg, J., Metabolic engineering of astaxanthin production in tobacco flowers, Nat. Biotechnol. 18, 888-892, 2000). No obstante, cuando todos los genes necesarios para sintetizar astaxantina ya se han introducido y expresado, se acumula una gran cantidad de intermedios biosintéticos de astaxantina además de la astaxantina como producto final. Estos intermedios son carotenoides que son intermedios biosintéticos producidos en las rutas de β-caroteno a astaxantina (véase la FIG. 1). Estas rutas son etapas que determinan la velocidad de la síntesis de astaxantina. En un ejemplo en el que se utiliza una Escherichia coli recombinante, además de astaxantina (36 a 50%) como producto final, se detectaron intermedios biosintéticos tales como adonixantina (4-cetozeaxantina), adonirrubina (fenicoxantina), cantaxantina, 3hidroxiequinenona, 3'-hidroxiequinenona (Documento no de Patente 1). Recientemente, se ha introducido un gen de anillo de β-ionona 4-cetolasa (β-C4-cetolasa) (crtO) derivado de Haematococcus pluvialis en Arabidopsis yse ha expresado en las semillas. Sin embargo, todos los carotenoides produjeron principalmente intermedios biosintéticos (adonirrubina, cantaxantina, y similares) de astaxantina. Se ha revelado que dos enzimas, esto es, anillo de β-ionona

3-hidroxilasa (β-C3-hidroxilasa) (CrtZ) y anillo de β-ionona 4-cetolasa (β-C4-cetolasa) (CrtW, CrtO, o Bkt), son responsables de la ruta de síntesis desde β-caroteno a astaxantina (véase la FIG. 1). Por lo tanto, se ha deseado incrementar la eficacia de estas dos enzimas para acelerar la producción de astaxantina. Por ejemplo, la eficacia de la anillo de β-ionona 4-cetolasa para convertir adonixantina en astaxantina es particularmente baja, y por lo tanto la adonixantina se acumula en muchos casos (Documento no de Patente 2: Yokoyama, A. y Miki, W., Composition and presumed biosynthetic pathway of carotenoids in the astaxanthin-producing bacterium Agrobacterium aurantiacum, FEMS Microbiol. Lett. 128, 139-144, 1995).

Documento no de Patente 1: Misawa, N., Satomi, Y., Kondo, K., Yokoyama, A., Kajiwara, S., Saito, T., Ohtani, T., y Miki, W., Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level, J. Bacteriol. 177, 6575-6584, 1995. Documento no de Patente 2: Fraser, P.D., Shimada, H., y Misawa, N., Enzymic confirmation of reactions involved in routes to astaxanthin formation, elucidated using a direct substrate in vitro assay, Eur. J. Biochem. 252, 229-236, 1998.

Descripción de la invención

Problemas que va a resolver la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir eficazmente astaxantina o metabolitos de la misma utilizando un microorganismo o planta recombinantes, que están transformados con genes que codifican una enzima que sustituye un grupo metileno en la posición 4 de un anillo de β-ionona por un grupo ceto [anillo de β-ionona 4-cetolasa (β-C4-cetolasa); carotenoide 4,4'-β-oxigenasa] y una enzima que introduce un grupo hidroxilo en la posición del carbono 3 de un anillo de β-ionona [anillo de β-ionona 3-hidroxilasa (β-C3-hidroxilasa); carotenoide 3,3'-β-hidroxilasa] y expresan tales genes.

Métodos para resolver el problema

Los autores de la presente invención se han centrado en el hecho de que aunque una bacteria marina Brevundimonas sp. cepa SD-212 (MBIC 03018) es capaz de producir astaxantina y metabolitos de la misma, las propiedades de sus enzimas de biosíntesis de carotenoides todavía no se han revelado. Los autores de la presente invención han llevado a cabo estudios exhaustivos y, como resultado, han descubierto que una oxigenasa clonada a partir de la bacteria marina y que es capaz de remplazar un grupo metileno en la posición 4 de un anillo de β-ionona por un grupo ceto [CrtW: anillo de β-ionona 4-cetolasa (β-C4-cetolasa); carotenoide 4,4'-β-oxigenasa] puede sintetizar eficazmente astaxantina a partir de adonixantina. Además, los autores de la presente invención han descubierto que una hidroxilasa clonada a partir de una bacteria marina y que es capaz de introducir un grupo hidroxilo en la posición del carbono 3 de un anillo de β-ionona [CrtZ: anillo de β-ionona 3-hidroxilasa (β-C3hidroxilasa); carotenoide 3,3'-β-hidroxilasa] sintetiza astaxantina más eficazmente que la misma enzima (CrtZ) derivada de otra bacteria.

Primero, se preparó una genoteca de cósmidos en E. coli utilizando el ADN cromosómico de Brevundimonas sp. cepa SD-212. Con posterioridad, se diseñaron los cebadores de PCR basándose en el descubrimiento de que los genes de la fitoeno desaturasa (crtI) tenían dos dominios conservados entre las bacterias productoras de carotenoides. Utilizando los cebadores resultantes, se llevó a cabo la PCR con el ADN cromosómico de Brevundimonas sp. cepa SD-212 como molde. Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN de 1,1 kb. Se determinó la secuencia de nucleótidos de este fragmento y se encontró era una secuencia parcial de crtI.La hibridación de colonias de la genoteca de cósmidos de SD-212 se llevó a cabo con el fragmento de la secuencia parcial de crtI como sonda. Se obtuvieron numerosas colonias positivas. El ADN plasmídico se preparó a partir de las colonias positivas y se sometió a hibridación Southern, para obtener de ese modo un fragmento de ADN EcoRI de 12 kb positivo. Se determinó la secuencia de nucleótidos de este fragmento EcoRI de 12 kb, y de ese modo se confirmó que una agrupación de genes de biosíntesis de carotenoides [siete marcos de lectura abiertos (ORF) que tienen homología con los genes de crt existentes (6 genes) incluyendo crtW y crtZ, y el gen idi (un gen)] está presente dentro de este fragmento. Después, para la expresión forzada del gen crtW derivado de la cepa en E. coli por el método de la proteína de fusión utilizando el promotor lac en el vector de E. coli pUC18 y una secuencia líder LacZ, se prepararon constructos. De un modo similar, se prepararon como controles constructos de dos genes de crtW derivados de Paracoccus sp. A continuación, utilizando una agrupación de genes crt derivada de Erwinia (crtE, crtB, crtI, crtY, y crtZ), se llevó a cabo el análisis funcional de diferentes tipos de CrtW en células de E. coli anfitrionas que producían zeaxantina. Los resultados revelaron que CrtW derivado de Brevundimonas sp. cepa SD212 puede convertir eficazmente adonixantina en astaxantina y de ese modo puede sintetizar eficazmente astaxantina. Además, para la expresión forzada del gen crtZ derivado de la cepa en E. coli mediante el método de la proteína de fusión utilizando el promotor lac en el vector de E. coli pUC18 y una secuencia líder LacZ, se prepararon los constructos. De un modo similar, se prepararon como controles constructos de dos genes crtZ derivados de Paracoccus sp. Adicionalmente, se prepararon de un modo similar constructos de crtZ derivados de Erwinia sp. y Flavobacterium sp. cepa P99-3. Sin embargo, en el caso del último ctrZ de la cepa P99-3, se utilizó pUC8 en lugar

de pUC18. Después, utilizando una agrupación de genes crt derivada de Erwinia (crtE, crtB, crtI,y crtY) y un gen crtW derivado de Paracoccus, se llevó a cabo el análisis funcional de diferentes tipos de CrtZ en células de E. coli anfitrionas que cantaxantina. Los resultados revelaron que cuando se utilizó el CrtZ derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212, la cantidad de astaxantina producida era la más alta, esto es, este CrtZ puede sintetizar astaxantina muy eficazmente. De este modo, se ha completado la presente invención.

La presente invención proporciona los siguientes apartados (1) a (4):

(1): Un microorganismo o una planta transformados con (i) un gen de anillo de β-ionona 4-cetolasa que codifica (a) un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2; o (b) un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2 por adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y que tiene actividad anillo de β-ionona 4-cetolasa; y (ii) un gen de anillo de β-ionona 3-hidroxilasa que codifica (c) un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 10; o (d) un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 10 por adición, deleción, o sustitución de cinco aminoácidos

: o menos y que tiene actividad anillo de β-ionona 3-hidroxilasa; en donde el microorganismo o la planta es capaz de sintetizar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina.

(2): El microorganismo de acuerdo con el apartado (1) anterior, en donde el microorganismo es Escherichia coli;

(3): Un método para preparar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina, incluyendo el método las etapas de cultivar el microorganismo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (1) a (2) anteriores en un medio y obtener astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina del cultivo o las células; y

(4): Un método para preparar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina, incluyendo el método las etapas de cultivar la planta de acuerdo con uno cualquiera de los apartados ((1) o (2) anteriores y obtener astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina de la planta.

La presente invención se describirá con detalle a continuación.

1. Bacteria marina Brevundimonas sp. cepa SD-212 (MBIC 03018) como fuente de genes.

La bacteria marina Brevundimonas sp. cepa SD-212 (SD212; MBIC 03018) es una fuente de genes de interés y es una α-proteobacteria aislada de agua marina próxima a las Islas Volcano. El contenido de GC es de 67,1 % (en moles). Yokoyama et al. del Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. han informado de que los carotenoides producidos por esta bacteria marina incluyen astaxantina, 2-hidroxiastaxantina, y 2-hidroxiadanixantina (véanse Yokoyama, A., Miki, W., Izumida, H., y Shizuri, Y., New trihidroxi-keto-carotenoids isolated from an astaxanthinproducing marine bacterium. Biosci. Biotech. Bioche. 60, 200-203, 1996). Esta bacteria se encuentra disponible en el Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. con el Núm. MBIC 03018. La secuencia del ADNr de 16S y la secuencia del gen de gyrB de esta bacteria están registradas en GenBank/DDBJ con los Núms. de Acceso AB016849 y AB014993, respectivamente.

2. Gen que codifica la anillo de β-ionona 4-cetolasa

En la presente invención, se utiliza un gen que codifica los siguientes péptidos (a) o (b) (en adelante, referidos a veces como "gen crtW de la presente invención"):

(a): un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2;

(b): un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2 por adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y que tiene actividad anillo de βionona 4-cetolasa.

El péptido (a) es un péptido derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212 (referido a veces como CrtW) que tiene una actividad anillo de β-ionona 4-cetolasa y que consiste en una secuencia de 244 aminoácidos.

El péptido (b) es un péptido derivado del péptido (a) por mutación dentro de un intervalo que no ocasiona la eliminación de la actividad anillo de β-ionona 4-cetolasa eficaz. La mutación incluye mutaciones artificiales así como también mutaciones espontáneas. Las mutaciones artificiales se pueden introducir por medio de un método de mutagénesis específica del sitio (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982), pero el método no está limitado a este.

El gen crtW gene de la presente invención se puede obtener, por ejemplo, como se describe más abajo. Primero, se prepara la genoteca de cósmidos de la bacteria marina Brevundimonas sp. cepa SD-212 en E. coli. A continuación, se puede obtener el gen de la presente invención mediante un método de hibridación de colonias utilizando una

secuencia homóloga de un gen de biosíntesis de carotenoides como se describe en el Ejemplo 6 o un método de clonación por PCR.

3. Gen que codifica anillo de β-ionona 3-hidroxilasa

En la presente invención, se utiliza un gen que codifica los siguientes péptidos (c) o (d) (en adelante, referidos a veces como "gen crtZ de la presente invención"):

(c): un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 10;

(d): un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 10 por adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y que tiene actividad anillo de β3ionona 3-hidroxilasa.

El péptido (c) es un péptido derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212 (referido algunas veces como CrtZ) que tiene actividad anillo de β-ionona 3-hidroxilasa y que consiste en una secuencia de 161-aminoácidos.

El péptido (d) es un péptido derivado del péptido (d) por mutación dentro de un intervalo que no ocasiona la eliminación de la actividad anillo de β-ionona 3-hidroxilasa eficaz. La "mutación" es la misma que en el gen crtW gene de la presente invención descrito anteriormente.

El gen crtZ de la presente invención se puede obtener, por ejemplo, como se describe más abajo. Primero, se prepara una genoteca de cósmidos de la bacteria marina Brevundimonas sp. cepa SD-212 en E. coli. A continuación, se puede obtener el gen de la presente invención por medio de un método de hibridación de colonias utilizando una secuencia homóloga de un gen de biosíntesis de carotenoides como se describe en el Ejemplo 6 o un método de clonación por PCR.

El gen crtW y el gen crtZ de acuerdo con la presente invención están contenidos en un fragmento de ADN EcoRI de 12 kb que contiene una agrupación de genes de biosíntesis de carotenoides de Brevundimonas sp. cepa SD-212. La Escherichia coli que porta un plásmido p5Bre2-15 obtenido insertando el fragmento de ADN en el vector de E. coli pBluescript II KS-ha sido depositada en el International Patent Organism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology con el Núm. de AccesoP-19580.

4. Microorganismo o planta que producen astaxantina o metabolitos de la misma

La presente invención incluye un microorganismo o una planta transformados con el gen crtW descrito en el apartado 2 anterior, y un microorganismo o una planta transformados con el gen crtZ descrito en el apartado 3 anterior. El microorganismo o la planta a menudo son transformados de manera que porten no solamente el gen de la invención si no también otro gen de la biosíntesis de carotenoides, pero que cuando el microorganismo o el órgano que se va a expresar inherentemente en la planta produce un carotenoide que sirve como sustrato, el otro gen de biosíntesis de carotenoides pueda no ser introducido o pueda ser introducido parcialmente.

Los ejemplos de los microorganismos anfitriones incluyen, pero no están limitados a, E. coli. Los ejemplos de las plantas anfitrionas incluyen, pero no están limitados a, colza.

En general, el otro gen de biosíntesis de carotenoides puede ser todo o parte de una agrupación de genes requeridos para sintetizar β-caroteno a partir de pirofosfato de farnesilo (FPP). Los ejemplos de semejante agrupación de genes incluyen un gen crtE que codifica una enzima que sintetiza geranilgeranil pirofosfato (GGPP) a partir de FPP, un gen crtB que codifica una enzima que sintetiza fitoeno a partir de dos moléculas de GGPP, un gen crtI que codifica una enzima que sintetiza licopeno a partir de fitoeno, y el gen acrtY (normalmente derivado de la bacteria Erwinia) que codifica una enzima que sintetiza β-caroteno a partir de licopeno. Con el fin de sintetizar astaxantina a partir de β-caroteno, es preferible utilizar tanto el gen crtW como el gen crtZ de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, solamente se puede utilizar uno de ellos. Cuando se utiliza el gen crtW de acuerdo con la presente invención solo, es necesario utilizar un gen crtZ derivado de otro organismo (normalmente, Erwinia sp. o Paracoccus sp.) o un gen equivalente del mismo para introducir un grupo hidroxilo en la posición 3 (3') del β-caroteno. Cuando se utiliza el gen crtZ de acuerdo con la presente invención solo, es necesario utilizar un gen crtW derivado de otra especie (normalmente, Paracoccus sp.) o un gen equivalente del mismo para introducir un grupo ceto en la posición 4 (4') del β-caroteno.

Cuando toda o una parte de la agrupación de genes de biosíntesis de carotenoides se insertan en un vector de expresión apropiado y a continuación se introducen en un microorganismo anfitrión empleado para la expresión, el microorganismo recombinante empieza a producir un carotenoide que contiene un anillo de β-ionona (β-carotene o su metabolito), un carotenoide que contiene un anillo de 3-hidroxi-β-ionona (zeaxantina o su metabolito), o un carotenoide que contiene un anillo de 4-ceto-β-ionona (cantaxantina o su metabolito). (Cada microorganismo es

capaz de producir el FPP sustrato. Aunque algunos microorganismos producen solamente una pequeña cantidad de GGPP, cada microorganismo es capaz de producir GGPP).

Con respecto a una planta, cuando una parte de la agrupación de genes anteriormente mencionada es insertada en un vector apropiado para la transformación de la planta utilizando un promotor (por ejemplo, un promotor de napina para la expresión en semillas) que se va a expresar en un órgano empleado para la expresión y un péptido de tránsito (por ejemplo, péptido de tránsito de la subunidad pequeña de Rubisco) que se dirige a un plástido tal como un cloroplasto y después es introducido en una planta, la planta recombinante comienza a producir un carotenoide que contiene un anillo de β-ionona (β-caroteno o su metabolito), un carotenoide que contiene un anillo de 3-hidroxiβ-ionona (zeaxantina o su metabolito), o un carotenoide que contiene un anillo de 4-ceto-β-ionona (cantaxantina o su metabolito). En general, muchos órganos de plantas que producen carotenoides de plantas, por ejemplo, semillas de colza, tienen la mayor parte de los genes necesarios para producir carotenoides que contienen un anillo de β-ionona. No obstante, mediante la introducción y expresión del gen crtB, posiblemente se incrementa la cantidad de producción de carotenoides. (Shewmaker, C. K. et al., Seed-specific overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects. Plant J. 20, 401-412, 1999).

Cuando el gen crtW y/o el gen crtZ (cuando el anfitrión es una planta, la secuencia del péptido de tránsito anteriormente mencionado está conectada necesariamente a la secuencia N-terminal) de acuerdo con la presente invención son introducidos adicionalmente y expresados en el microorganismo o planta recombinantes preparados de ese modo que producen un carotenoide que contiene un anillo de β-ionona (β-caroteno o su metabolito), un carotenoide que contiene un anillo de 3-hidroxi-β-ionona (zeaxantina o su metabolito), o un carotenoide que contiene un anillo de 4-ceto-β-ionona (cantaxantina o su metabolito), el microorganismo o la planta comienzan a producir astaxantina que es un carotenoide en el que un grupo metileno de la posición 4 (4') del β-caroteno es remplazado por un grupo ceto y un grupo hidroxilo es introducido en la posición del carbono 3 (3') del β-caroteno, en el que un grupo metileno de la posición 4 (4') de la zeaxantina es remplazado por un grupo ceto, o en el que un grupo hidroxilo es introducido en la posición del carbono 3 (3') de la cantaxantina, o producen metabolitos de astaxantina (por ejemplo, 2-hidroxiastaxantina y ésteres de astaxantina) convertidos por una enzima endógena que metaboliza la astaxantina.

La información acerca de los vectores de diferentes microorganismos tales como E. coli y levadura, y los métodos para la introducción y expresión de genes exógenos se describen en un gran número de manuales experimentales (por ejemplo, Sambrook, J., Russel, D. W., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª Edición, CSHL Press, 2001). La selección de vectores y la introducción y expresión de los genes se pueden llevar a cabo de acuerdo con estos manuales.

La información sobre los vectores para la transformación de plantas y los métodos para la introducción y expresión de genes exógenos se describen en un gran número de manuales experimentales (por ejemplo, Ishida, I., Misawa, N., Saibo Kogaku Jikken Sosa Nyumon (The handbook for the cell engineering experimental manipulation), Kodansha Scientific, 1992). La selección de vectores y la introducción y expresión de genes se pueden llevar a cabo de acuerdo con estos manuales.

4. Método de preparación de astaxantina o metabolitos de la misma

La presente invención proporciona un método de preparación eficaz de astaxantina o metabolitos de la misma cultivando el microorganismo descrito anteriormente en un medio y obteniendo astaxantina o metabolitos de la misma a partir del cultivo o las células. Además, la presente invención también proporciona un método para preparar eficazmente astaxantina o sus metabolitos cultivando la planta descrita anteriormente y obteniendo astaxantina o metabolitos de la misma a partir de un órgano, tal como una semilla, de la planta.

En los métodos de la presente invención los metabolitos de astaxantina se seleccionan entre 2-hidroxiastaxantina y ésteres de astaxantina. Además, existen casos en los que no se producen metabolitos de astaxantina.

Los SEQ ID NO de la LISTA DE SECUENCIAS de la presente memoria descriptiva representan las siguientes secuencias:

SEQ ID NO: 1: secuencia de nucleótidos del gen crtW de Brevundimonas sp. cepa SD-212 y secuencia de aminoácidos codificada de ese modo;

SEQ ID NO: 2: secuencia de aminoácidos codificada por el gen crtW de Brevundimonas sp. cepa SD-212;

SEQ ID NO: 3: cebador (directo) para la amplificación de crtw derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212; SEQ ID NO: 4: cebador (inverso) para la amplificación de crtW derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212; SEQ ID NO: 5: cebador (directo) para la amplificación de crtW derivado de Paracoccus sp. cepa PC1; SEQ ID NO: 6: cebador (inverso) para la amplificación de crtW derivado de Paracoccus sp. cepa PC1;

SEQ ID NO: 7: cebador (directo) para la amplificación de crtW derivado de Paracoccus sp. cepa N81106; SEQ ID NO: 8: cebador (inverso) para la amplificación de crtW derivado de Paracoccus sp. cepa N81106; SEQ ID NO: 9: secuencia de nucleótidos del gen crtZ de Brevundimonas sp. cepa SD-212 y secuencia de aminoácidos codificada de ese modo;

SEQ ID NO: 10: secuencia de aminoácidos codificada por el gen crtZ de Brevundimonas sp. cepa SD-212;

SEQ ID NO: 11: cebador (directo) para la amplificación de crtZ derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212; SEQ ID NO: 12: cebador (inverso) para la amplificación de crtZ derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212; SEQ ID NO: 13: cebador (directo) para la amplificación de crtZ derivado de Erwinia uredovora; SEQ ID NO: 14: cebador (inverso) para la amplificación de crtZ derivado de Erwinia uredovora; SEQ ID NO: 15: cebador (directo) para la amplificación de crtZ derivado de Paracoccus sp. cepa PC1; SEQ ID NO: 16: cebador (inverso) para la amplificación de crtZ derivado de Paracoccus sp. cepa PC1; SEQ ID NO: 17: cebador (directo) para la amplificación de crtZ derivado de Paracoccus sp. cepa N81106; SEQ ID NO: 18: cebador (inverso) para la amplificación de crtZ derivado de Paracoccus sp. cepa N81106; SEQ ID NO: 19: cebador (directo) para la amplificación de crtZ derivado de Flavobacterium sp. Cepa P99-3; y SEQ ID NO: 20: cebador (inverso) para la amplificación de crtZ derivado de Flavobacterium sp. Cepa P99-3.

Efecto ventajoso de la invención

De acuerdo con la presente invención, se puede preparar una gran cantidad de astaxantina o metabolitos de la misma utilizando el gen crtW y/o el gen crtZ derivados de Brevundimonas sp. cepa SD-212.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama que muestra las rutas de biosíntesis de astaxantina y las funciones de diferentes enzimas de Crt en E. coli productora de astaxantina. La FIG. 2 es un diagrama que muestra la estructura de una agrupación de genes de biosíntesis de carotenoides de Brevundimonas sp. cepa SD-212. La FIG. 3 es un gráfico que muestra los resultados del análisis HPLC-PDA de los pigmentos acumulados en diferentes células de E. coli recombinantes (cultivadas durante 48 hr después de la adición de IPTG). (En los gráficos, los picos indicados por la referencia numérica 1 son para la astaxantina, los picos indicados por la referencia numérica 2 son para la adonixanthin, los picos indicados por la referencia numérica 3 son para la adonirrubina, un pico indicado por la referencia numérica 4 es para la zeaxantina, los picos indicados por la referencia numérica 5 son para la 3'-hidroxiequinenona, los picos indicados por la referencia numérica 6 son para la 3-hidroxiequinenona, y los picos indicados por la referencia numérica 7 son para el licopeno). a) Cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109Ercrt-zea, b) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109BreW-asta, c) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109ParaPC1W-asta, y d) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109ParaN8W-asta. La FIG. 4 es un gráfico que muestra la relación entre los tiempos de incubación y las cantidades de astaxantina acumuladas en diferentes células de E. coli recombinantes. La FIG. 5 es un gráfico que muestra los resultados del análisis HPLC-PDA de los pigmentos acumulados en diferentes células de E. coli recombinantes (cultivadas durante 6 hr después de la adición de IPTG). a) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109BreW-asta, b) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109ParaPC1W-asta, y c) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109ParaN8W-asta. La FIG. 6 es un gráfico que muestra los resultados del análisis HPLC-PDA de los pigmentos acumulados en diferentes células de E. coli recombinantes (cultivadas durante 48 hr después de la adición de IPTG). (En los gráficos, los picos indicados por la referencia numérica 1 son para la astaxantina, los picos indicados por la referencia numérica 2 son para la adonixantina, a los picos indicados por la referencia numérica 3 son para la adonirrubina, y los picos indicados por la referencia numérica 4 son para la cantaxantina). a) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109Pancrt-Cantha, b) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109BreZ-asta, c) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109PanZasta, d) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109ParaPC1Z-asta, e) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109ParaN8Z-asta, y f) cromatograma HPLC (470 nm) de los pigmentos producidos por JM109P99Z-asta. La FIG. 7 es un gráfico que muestra la relación entre los tiempos de incubación y las cantidades de astaxantina acumuladas en diferentes células de E. coli recombinantes.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención se describirá a continuación específicamente con referencia a los Ejemplos. No obstante, la presente invención no está limitada a estos Ejemplos.

Ejemplos [Ejemplo 1] Cepas, plásmidos, y condiciones de crecimiento

Las cepas y plásmidos utilizados en la presente invención (crtW) se muestran en la Tabla 1. Las cepas se cultivaron a 37°C o 30°C en medio LB (Luria-Bertani). Cuando fue necesario, se añadió ampicilina (Ap, 100 μg/ml) o cloramfenicol (Cm, 30 μg/ml) al medio.

[Tabla 1]

Cepas y plásmidos utilizados en la presente invención

Cepa/Plásmido: Naturaleza* Referencia/Fabricante

Cepa

E. coli JM109: Anfitrión para experimentos de ingeniería genética Takara

JM109Ercrt-zea: E. coli cepa JM109 con pACCAR25ΔcrtX introducido en ella Presente invención,

JM109BreW-asta: E. coli cepa JM109 con pACCAR25ΔcrtX y pUCBreW introducida en ella Presente invención

JM109ParaPClWasta: E. coli cepa JM109 con pACCAR25ΔcrtX y pUCParaPC1W introducida en ella Presente invención

JM109ParaNBWasta: E. coli cepa JM109 con pACCAR25ΔcrtX y pUCParaN8W introducida en ella Presente invención

Plásmido

pACCAR25ΔcrtX: Cmr: plásmido que incluye crtE, crtB, crtI, crtY, y crtZ Misawa, et al., 1995

pUC18: Apr: vector de clonación TOYOBO

p5Bre2-15: Apr: Fragmento EcoRI de 12 kb derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212 (MBIC03018) (que contiene una agrupación de genes de biosíntesis de carotenoides) insertado en un sitio EcoRI de pBluescript II KS- Presente invención

pPC17: Apr: Fragmento de ADN de 1,63 kb derivado de Paracoccus sp. cepa PC-1 (MBIC03024) insertado en los sitios Psd y PstEII de pBluescript II SK+ Misawa, et al., 1995

AK96K: Apr: Fragmento de ADN de 1,88 kb derivado de Paracoccus sp. cepa N81106 (MBIC01143) insertado en los sitios BamHI y KpnI de pBluescript II SK- Misawa, et al., 1995

pUCBreW: Apr: β-caroteno cetolasa derivada de Brevundimonas sp. cepa SD-21 (MBIC03018) amplificada por PCR e insertada en pUC818 Presente invención

pUCParaPC1W: Apr: β-caroteno cetolasa derivada de Paracoccus sp. cepa PC-1 (MBIC03024) amplificada por PCR e insertada en pUC18 Presente invención

pUCParaN8W: Apr: β-caroteno cetolasa de Paracoccus sp. cepa N81106 (MBIC01143) amplificada por PCR e insertada en pUC818 Presente invención

*Apr: resistencia a ampicilina, Cmr: resistencia a cloramfenicol

Misawa, N., Satomi, Y., Kondo, K., Yokoyama, A., Kajiwara, S., Saito, T., Ohtani, T., y Miki, W., Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level. J. Bacteriol. 177: 6575-6585 1995: Documento no de Patente 1.

[Ejemplo 2] Experimentos de ingeniería genética

Los experimentos de ingeniería genética habituales tales como la preparación de plásmidos, el tratamiento con enzimas de restricción, las reacciones de ligación, y la transformación se llevaron a cabo de acuerdo con los métodos descritos en Molecular Cloning, Sambrook et al. (1989). Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis T., Molecular cloning: a laboratory manual. 2ª ed. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

[Ejemplo 3] Preparación de ADN cromosómico de Brevundimonas sp. Cepa SD-212

Se cultivó Brevundimonas sp. cepa SD-212 (SD212; MBIC 03018) en 300 ml de un medio de Caldo Marino (MB) (Difco) a 25°C durante 3 días. Las células se cosecharon, se lavaron con un tampón STE (NaCl 100 mM, Trsi-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) dos veces, se trataron térmicamente a 68°C durante 15 min, y después se suspendieron en una solución I (glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0) que contenía 5 mg/ml de lisozima (Sigma) y 100 μg/ml de ARNasa A (Sigma). Después de 1 hora de incubación a 37°C, se añadió Proteinasa K (Sigma) para dar una concentración de 250 μg/ml y la mezcla resultante se incubó a 37°C durante 10 min. A esto se le añadió Nlauroilsarcosina-Na para dar una concentración final de 1% y se mezcló suave y cuidadosamente inviertiéndola. La mezcla se incubó a 37°C durante 3 hr. Después de extraer varias veces con fenol/cloroformo, mientras se añadían lentamente dos volúmenes de etanol, se enrolló el ADN cromosómico depositado alrededor de una varilla de vidrio y se enjuagó con etanol del 70%. A continuación, se disolvió el ADN cromosómico en 2 ml de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) para preparar una solución de ADN cromosómico.

[Ejemplo 4] Amplificación de un fragmento parcial del gen de fitoeno desaturasa (crtI) por medio de PCR

Se amplificó un fragmento parcial del gen de fitoeno desaturasa (crtI) por medio de PCR utilizando un cebador crtI-Fo (5'-TTY GAY GCI GGI CCI ACI GT-3') y un cebador crtI-Re (5'-CCI GGR TGI GTI CCI GCI CC-3') y el ADN cromosómico obtenido como se ha descrito antes de Brevundimonas sp. cepa SD-212 como molde. Los cebadores habían sido diseñados utilizando la homología de los genes de fitoeno desaturasa (crtI) entre las bacterias productoras de carotenoides. Como ADN polimerasa termoestable, se utilizó La-Taq (TaKaRa). Después de la desnaturalización térmica a 96°C durante 5 min, se llevaron a cabo 35 ciclos de amplificación a 98°C durante 20 seg, 58°C durante 30 seg, y 72°C durante 1 min. El producto amplificado se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. A continuación, el fragmento de ADN de 1,1 kb se cortó del gel de agarosa y se purificó (con Qiagen Gel Extraction kit: QIAGEN, o Gene Clean II Kit: BIO101). El fragmento de ADN purificado se ligó a pGEM-T Easy y se transformó en E. coli (DH5α). Este plásmido se denominó pCRTI-SD212. La E. coli se cultivó en 2 ml de medio líquido LB que contenía ampicilina a 37°C durante la noche, y a continuación se extrajo el plásmido. La secuencia de nucleótidos (parcial) del plásmido extraído se determinó utilizando un Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN modelo 3700 (Perkin-Elmer) de acuerdo con el protocolo adjunto. La secuencia de ADN determinada de este modo se sometió a búsqueda de homología utilizando Blast (Altschul y Lipman, 1990) para confirmar que esta secuencia de ADN es un fragmento de ADN que tiene homología con el gen de fitoeno desaturasa (crtI). El fragmento de ADN purificado después de la PCR se utilizó como sonda en la hibridación de colonias y en la hibridación Southern llevada a cabo en los Ejemplos 6 y 7. Altschul, S.F. y Lipman, D.J., Protein database search for multiple alignments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 55095513, 1990.

[Ejemplo 5] Construcción de una genoteca de cósmidos

Los procedimientos experimentales para obtener partículas de fagos a partir de una solución de ADN cromosómico preparada a partir de Brevundimonas sp. cepa SD-212 se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones adjuntas al SuperCos 1 Cosmid Vector Kit asequible de Stratagene. En resumen, el ADN cromosómico de Brevundimonas sp. cepa SD-212 se digirió parcialmente con Sau3AI y se ligó al sitio BamHI de un vector cosmídico, y se empaquetó en partículas de fagos utilizando LAMBDA INN (Nippon Gene). Con posterioridad, Escherichia coli cepa XL1-Blue MR se infectó con las partículas de fagos resultantes para obtener aproximadamente 1000 colonias resistentes a Ap sobre placas de LB que contenían Ap. Las colonias resultantes se transfirieron a placas de LB de nueva aportación que contienen un antibiótico con palillos esterilizados. Este vector cosmídico SuperCos 1 es un vector de 7,9 kb y puede portar un fragmento de ADN de 30 a 45 kb.

[Ejemplo 6] Hibridación de colonias

Las colonias (500) de la genoteca de cósmidos construida utilizando E. coli XL1-Blue MR como anfitrión en el Ejemplo 5 se escrutaron para determinar los clones que contenían crtI mediante hibridación de colonias utilizando el fragmento parcial del gen de la fitoeno desaturasa (crtI) amplificado por medio del método de PCR del Ejemplo 4 como sonda. Primero, se sembró E. coli sobre placas y se cultivó a 37°C. En este momento, se sembró E. coli a 48 colonias por placa. Después de cultivar durante la noche, se colocó una membrana Hybond-N+ (Amersham Pharmacia) que tenía un diámetro de 82 mm sobre cada placa y la membrana se marcó con una aguja para inyectables. La membrana se separó y se colocó (la muestra hacia arriba) sobre papel de filtro de 3 mm (Whattman) impregnado con solución de SDS al 10% para su incubación durante 5 min. A continuación, el ADN de la membrana se incubó durante otros 5 min sobre un papel de filtro de 3 mm impregnado con una solución desnaturalizante (NaCl

1,5 M, NaOH 0,5 M). A continuación, la membrana se empapó en solución neutralizadora (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M) durante 5 min (dos veces). Adicionalmente, la membrana se lavó con 2 × SSC dos veces. En este momento, la membrana se secó fuertemente con Kimtowel de manera que no quedaras desechos sobre la membrana. Después de estos tratamientos, la membrana se secó al aire sobre Kimtowel y Kimwipe durante 30 min y se coció a 80°C durante 2 hr para inmovilizar de ese modo el ADN sobre la membrana. Se preparó una sonda de ADN utilizando Alkphos Direct Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia) y se llevó a cabo la hibridación de colonias de acuerdo con el protocolo adjunto. Como resultado, se obtuvieron 6 clones positivos a partir de las 500 colonias por medio de la hibridación de colonias utilizando el fragmento parcial del gen de fitoeno desaturasa (crtI) como sonda. Los plásmidos contenidos en estos 6 clones se denominaron pCos5-1, pCos5-2, pCos7-1, pCos8-1, pCos91, y pCos10-1.

[Ejemplo 7] Hibridación Southern

Los 6 clones positivos seleccionados en el Ejemplo 6 se cultivaron en 2 ml de un medio LB líquido que contenía Ap a 37°C durante la noche, y a continuación se extrajo el ADN plasmídico. El ADN plasmídico extraído se digirió completamente con EcoRI y después se sometió a electroforesis. Luego, el ADN se transfirió a una membrana de nailon (Hybond N+) mediante transferencia capilar utilizando una solución de NaOH 0,4 M. Después de este tratamiento, la membrana se coció a 80°C durante 2 hr para inmovilizar de ese modo el ADN sobre la membrana. A continuación, se llevó a cabo la hibridación Southern utilizando Alkphos Direct Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia) de acuerdo con el protocolo adjunto. El fragmento parcial del gen de fitoeno desaturasa (crtI) descrito anteriormente se utilizó como sonda. Como resultado, se observaron señales positivas en el fragmento EcoRI de 12 kb EcoRI de 3 clones, pCos5-2, pCos7-1, y pCos9-1, de los 6 positivos.

[Ejemplo 8] Análisis de una agrupación de genes de carotenoides

El fragmento del inserto de 12 kb se cortó de uno (pCos5-2) de los clones positivos seleccionados en el Ejemplo 7 con EcoRI, se ligó al sitio EcoRI de un vector plasmídico pBluescript II KS-, y se transformó en E. coli cepa DH5α. Este plásmido se denominó p5Bre2-15. La E. coli resultante se cultivó en 2 ml de un medio líquido LB que contenía Ap a 37°C durante la noche, y a continuación se extrajo el plásmido. La secuencia de nucleótidos del plásmido extraído se determinó utilizando Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN modelo 3700 (Perkin-Elmer) de acuerdo con el protocolo adjunto. Las regiones que codificaban el gen de la secuencia de ADN de 11991 pb así determinada se estimaron utilizando GeneMark.hmm (Lukashin A. y Borodovsky M.) y se confirmaron las secuencias de tipo SD. Como resultado, se encontraron 12 marcos de lectura abiertos (ORF) en el fragmento de 12 kb (FIG. 2). Cada ORF se sometió a búsqueda de homología a nivel de la secuencia de aminoácidos utilizando Blast. Siete ORF de los doce ORF mostraron homología con los genes de biosíntesis de carotenoides existentes (crtW, crtY, crtI, crtB, crtE, crtZ, y idi) (Tabla 2), y se denominaron genes crtW, crtY, crtI, crtB, crtE, crtZ,y idi, respectivamente. Los 5 genes restantes fueron genes desconocidos que no tenían homología general con ningún gen existente.

La Escherichia coli que portaba el plásmido p5Bre2-15 ha sido depositada en el International Patent Organism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology con el Número de Acceso P-19580.

[Tabla 2] Características y funciones pronosticadas de los diferentes ORF presentes en la agrupación de genes de biosíntesis de carotenoides de Brevundimonas sp. Cepa SD-212

Denominación de ORF: GC% Núm. de residuos de aminoácido Función pronosticada Homología con el producto génico de otro organismo (%) Número GeneBank

ORF1: 69,7 140 Desconocida

crtW: 69,6 244 β-caroteno C4 oxigenasa CrtW:Brevundimonas aurantiaca (96) AAN86030

crtY: 70,2 392 Licopeno ciclasa CrtY:Xanthobacter autotrophicusPy2 (53) AF408848

crfI: 67,5 489 Fitoeno desaturasa Crtl:Xanthobacter autotrophicusPy2 (72) AF408848

crtB: 72 310 Fitoeno sintasa CrtB:Xanthobacter autotrophicusPy2 (54) AF408848

ORF6: 75,8 355 Desconocida

ORF7: 74,6 315 Desconocida

crtE: 71 298 GGPP sintasa CrtE:Xanthobacter autotrophicusPy2 (42) AF408847

idi: 74,9 350 Tipo II IPP isomerasa IPP isomerasa:Pantoea agglomeransEho10 (55) Q01335

crtZ: 66,9 161 β-caroteno C3 hidroxilasa CrtZ:Alcaligenes sp. PC1 (49) Q44262

ORF11: 70,7 257 Desconocida

ORF12: 66,7 122 Desconocida

CrtW, Brevundimonas aurantiaca (Núm. GeneBank AAN86030); CrtY, CrtI, CrtB, CrtE, Xanthobacter sp. Py2 (Núm. GeneBank AF408848, A408847); IPP isomerasa, Pantoea agglomerans Eho10 (Erwinia herbicola) (Núm. GeneBank Q01335); CrtZ, Alcaligenes sp. PC1 (Núm. GeneBank Q44262)

Lukashin A. y Borodovsky M., GeneMark.hmm: new solutions for gene finding, NAR, Vol. 26, No. 4, págs. 1107

5 1115, 1998. Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K. y Harashima, K., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli, J. Bacteriol. 172, 6704-6712, 1990.

Misawa, N., Satomi, Y., Kondo, K., Yokoyama, A., Kajiwara, S., Saito, T., Ohtani, T., y Miki, W., Structure and

10 functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level, J. Bacteriol. 177, 6575-6585, 1995 (Documento no de Patente 1).

Hannibal, L., Lorquin, J., D'Ortoli, N.A., Garcia, N., Chaintreuil, C., Masson-Boivin, C., Dreyfus, B. y Giraud, E., Isolation and characterization of canthaxanthin biosynthesis genes from the photosynthetic bacterium

15 Bradyrhizobium sp. strain ORS278, J. Bacteriol. 182, 3850-3853, 2000.

Larsen, R.A., Wilson, M.M., Guss, A.M. y Metcalf, W.W., Genetic analysis of pigment biosynthesis in Xanthobacter autotrophicus Py2 using a new, highly efficient transposon mutagenesis system that is functional in a wide variety of bacteria, Arch. Microbiol. 178, 193-201, 2002.

20 La enzima CrtW codificada por el gen crtW de Brevundimonas sp. Cepa SD-212 es un péptido que consiste en 244 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos se muestra en el SEQ ID NO: 2, y la secuencia de nucleótidos del gen crtW y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en el SEQ ID NO: 1. La CrtW de Brevundimonas sp. Cepa SD-212 tiene una homología (identidad) de solamente 46% tanto con la CrtW de Paracoccus sp. Cepa N81106

25 (DDBJ/Núm. de acceso GenbankD58420) como con la CrtW de Paracoccus sp. Cepa PC-1 (DDBJ/Núm. de Acceso GenBank D58422) a nivel de la secuencia de aminoácidos. Como se muestra en la Tabla 2, la CrtW de Brevundimonas sp. Cepa SD-212 tiene una homología (identidad) del 96% con la CrtW de Brevundimonas aurantiaca, pero acerva de la CrtW de Brevundimonas aurantiaca no se conoce nada más que la secuencia que simplemente se describe en la red. De este modo, las funciones y características de esta enzima no son conocidas

30 en absoluto.

[Ejemplo 9] Construcción de plásmidos de expresión de proteínas de fusión con β-Galactosidasa

Se amplificaron los genes crtW individuales por medio de PCR y se construyeron los plásmidos individuales para expresar cada proteína de fusión con β-galactosidasa a fin de sintetizar cada producto del gen crtW fusionado a una secuencia líder del gen de β-galactosidasa (lacZ) por medio de un vector de E. coli pUC18 (TOYOBO). Específicamente, se amplificaron los fragmentos de ADN requeridos por medio de PCR utilizando p5Bre2-15, pPC17, o pAK96K como ADN molde y se diseñaron los cebadores (mostrados en los SEQ ID NO: 3 a 8) de manera que se pudiera obtener cada producto de crtW amplificado que tuviera un sitio EcoRI en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3'. pPC17 y pAK96K son plásmidos que contienen genes crtW derivados de Paracoccus sp. cepa PC-1 y Paracoccus sp. N81106, respectivamente.

Se utilizó ADN Polimerasa PfuTurbo Hotstart (Stratagene) como ADN polimerasa termoestable. Tras la desnaturalización térmica a 95°C durante 20 seg, se llevaron a cabo 30 ciclos de amplificación a 95°C durante 20 seg, 51°C durante 30 seg, y 72°C durante 1 min y 30 seg. Una parte del producto amplificado se confirmó por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1%. El resto del producto amplificado se precipitó con etanol, se digirió con EcoRI y BamHI, y a continuación se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. A continuación, el fragmento de ADN con una longitud esperada se cortó del gel de agarosa y se purificó (utilizando Gene Clean Turbo Kit: Q-BIOgene). El ADN purificado se ligó a los sitios EcoRI y BamHI de pUC18 y se transformó en E. coli JM109. Se diseñó la secuencia líder en estos plásmidos de expresión de proteínas de fusión con β-galactosidasa, con los siete residuos de aminoácido Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser, para ser añadida a la Met del inicio original del crtW individual.

[Ejemplo 10] Construcción de E. coli productora de Zeaxantina o Astaxantina

Se cultivaron cada uno de los clones de E. coli que portaban el plásmido que contenía los genes crtW individuales en 4 ml de un medio líquido que contenía Ap a 37°C durante la noche, y a continuación se extrajo el plásmido. La secuencia de nucleótidos del plásmido extraído se confirmó utilizando un Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN modelo 3700 (Perkin-Elmer) de acuerdo con el protocolo adjunto. Los plásmidos individuales que se confirmó que contenían la secuencia de nucleótidos correcta del gen crtW derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212, Paracoccus sp. cepa PC-1, o Paracoccus sp. cepa N81106 se denominaron pUCBreW (lacZ::crtW), pUCParaPC1W (lacZ::crtW), y pUCParaN8W (lacZ::crtW), respectivamente. Se construyó E. coli productora de zeaxantina introduciendo un plásmido pACCAR25ΔcrtX en E. coli JM109 y seleccionando las colonias resistentes a Cm. Adicionalmente, se construyó E. coli productora de astaxantina introduciendo un plásmido pACCAR25ΔcrtX con pUCBreW, pUCParaPC1W, o pUCParaN8W en E. coli y seleccionando las colonias resistentes a Ap y Cm. Los clones de E. coli se denominaron JM109Ercrt-zea, JM109BreW-asta, JM109ParaPC1W-asta, y JM109ParaN8W-asta.

[Ejemplo 11] Análisis de la eficacia de producción de Astaxantina en E. coli que expresa genes crtW individuales

Se cultivó JM109Ercrt-zea en 4 ml de un medio líquido LB que contenía Cm y se cultivaron cada uno de JM109BreW-asta, JM109ParaPC1W-asta, y JM109ParaN8W-asta en 4 ml de un medio líquido LB que contenía Ap y Cm, a 37°C durante la noche. Se inocularon 50 microlitros de cada uno de los medios líquidos LB en 4 ml de un medio líquido LB y se sometieron a un cultivo principal a 30°C. Cuando la A600 alcanzó aproximadamente 0,5, se añadieron 0,5 mM de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranósido) al medio de cultivo, seguido de un cultivo adicional a 30°C. Las células se cosecharon mediante centrifugación del medio de cultivo y se lavaron con STE dos veces. A esto se le añadió acetona (400 μl) y se sometió a vórtice para transferir de ese modo los pigmentos desde las células a la acetona. La mezcla resultante se centrifugó. El sobrenadante se filtró y se sometió a un análisis de pigmentos con un sistema HPLC-PDA (detector de matriz de fotodiodos Waters Alliance 2695 y 2996) o un sistema HPLC-PDA-MS (Shiseido Nano Space SI-2 y ThermoQuest LCQ Advantage). En el HPLC-PDA, se utilizó una columna ODS-80Ts con gel TSK (TOSOH). Las fases móviles fueron la solución A (metanol del 95%) y la solución B [metanol : tetrahidrofurano (THF) = 7 : 3]. El programa de elución con una velocidad de flujo de 1,0 ml/min fue el siguiente: 100% de la solución A durante 5 min, un gradiente lineal desde 100% de la solución A hasta 100% de la solución B durante 5 a 10 min, y la solución B durante 8 min. Los pigmentos se detectaron con un detector de matriz de fotodiodos y se analizaron con un soporte lógico accesorio Empower. En el HPLC-PDA-MS, se utilizó una columna Deverosil C30-UG-3 (1,0 mm i.d. × 150 mm) (Nomura Chemical), y se utilizó Devorosil C30-UG-S como pre-columna. Las fases móviles fueron la solución A (metanol del 95%) y la solución B [metanol : t-butilmetiléter (tBME) = 3 : 7]. El programa de elución con una velocidad de flujo de 0,09 ml/min fue el siguiente: 100% de la solución A durante 15 min, un gradiente lineal desde 100% de la solución A hasta 100% de la solución B durante 15 a 115 min, y la solución B durante 20 min.

El análisis de los pigmentos producidos por los diferentes clones de E. coli se llevó a cabo 48 hr después de la adición de IPTG utilizando un sistema HPLC-PDA y un sistema HPLC-PDA-MS (véase la FIG. 3). Los resultados demuestran que casi todos los pigmentos producidos por JM109Ercrt-zea eran zeaxantina (HPLC/PDA: RT 8,5 min, λmax 450, 479 nm; HPLC/PDA/MS: RT 25,55 min, λmax 450, 476 nm, m/z 569.2 [M+H]+) (véase la FIG. 3a). En

JM109BreW-asta, además de un pico del pigmento principal, astaxantina, (HPLC/PDA: RT 5,8 min, λmax 473 nm; HPLC/PDA/MS: RT 13,28, λmax 476 nm, m/z 597,2 [M+H]+), se observaron picos de adonirrubina (Fenicoxantina) (HPLC/PDA: RT 8,1 min; HPLC/PDA/MS: RT 20,92 min, λmax 469 nm, m/z 581,2 [M+H]+), 3'-hidroxiequinenona (HPLC/PDA: RT 11,5 min, λmax 473; HPLC/PDA/MS: RT 62,10 min, λmax 469, m/z 567,2 [M+H]+), 3hidroxiequinenona (HPLC/PDA: RT 11,7 min; HPLC/PDA/MS: RT 62,72 min, m/z 567,2 [M+H]+), y licopeno (HPLC/PDA: RT 13,4 min, λmax 446, 473, 505 nm; HPLC/PDA/MS: RT 90,27 min, λmax 444, 471, 501 nm, m/z 537,1) (FIG. 3b). En JM109ParaPC1W-asta y JM109ParaN8W-asta, además de los picos de los carotenoides anteriormente mencionados, se observó un pico de adonixantina (HPLC/PDA: RT 7,6 min; HPLC/PDA/MS: RT 17,45 min, λmax 460, 482 nm, m/z 583,2 [M+H]+) (FIG. 3c y d). Los contenidos de astaxantina en los carotenoides acumulados en JM109BreW-asta, JM109ParaPC1W-asta, y JM109ParaN8W-asta fueron de 75%, 65%, y 47%, respectivamente. De este modo, el contenido de astaxantina en JM109BreW-asta fue el más alto (FIG. 3). Además, la 3'-hidroxiequinenona se pudo acumular en cada extracto de pigmento de los clones de E. coli recombinantes, JM109BreW-asta, JM109ParaPC1W-asta, y JM109ParaN8W-asta, y no se observó ninguna diferencia en la cantidad entre los clones de E. coli recombinantes. Por otra parte, en el extracto de pigmento de JM109BreW-asta, no se observó ningún pico de adonixantina, que se observó en los extractos de pigmento de JM109ParaPC1W-asta y JM109ParaN8W-asta. Por lo tanto, se pronostica que JM109BreW-asta tiene una eficacia de conversión de adonixantina en astaxantina y, como resultado, tiene una elevada eficacia de producción de astaxantina. Adicionalmente, con el fin de confirmar esto, la relación entre el tiempo de incubación y la eficacia de producción de astaxantina, se recogió Escherichia coli 10, 17, y 24 hr después de la adición de IPTG, y se analizaron las cantidades de pigmentos acumulados (FIG. 4). La eficacia de la biosíntesis de astaxantina de JM109BreW-asta (símbolo en la figura: ◆) fue significativamente elevada en comparación con las de JM109ParaPC1W-asta (símbolo en la figura: ■) y JM109ParaN8W-asta (símbolo en la figura: ▲) en la fase estacionaria, y después la diferencia en la eficacia disminuyó gradualmente en la fase de muerte.

Adicionalmente, la tendencia por la cual la adonixantina se acumuló en JM109ParaPC1W-asta y JM109ParaN8Wasta pero no en JM109BreW-asta se observó durante todas las fases de cultivo. En particular, en el análisis de pigmentos 6 horas después de la adición de IPTG, se acumuló una gran cantidad de adonixantina (cantidad similar a la de astaxantina) en JM109ParaPC1W-asta y JM109ParaN8W-asta (FIG. 5b y c). Sin embargo, en JM109BreWasta, no se acumuló adonixantina en absoluto y en lugar de eso la cantidad de producción de astaxantina se incrementó (FIG. 5a).

Como resultado de este estudio, se ha revelado que la CrtW derivada de Brevundimonas sp. cepa SD-212 tiene una elevada eficacia conversión de adonixantina en astaxantina y produce muy eficazmente astaxantina. Estos resultados demuestran que el gen crtW derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212 es eficaz para la producción en masa para uso industrial de astaxantina y metabolitos de la misma (éster de astaxantina y similares) utilizando un microorganismo recombinante o una planta recombinante.

[Ejemplo 12] Cepas, plásmidos, y condiciones de crecimiento

Las cepas y plásmidos utilizados en la presente invención (crtZ) se muestran en la Tabla 3. Las cepas se cultivaron a 37°C o 30°C en un medio LB (Luria-Bertani). Cuando fue necesario, se añadió ampicilina (Ap, 100 μg/ml) o cloramfenicol (Cm, 30 μg/ml) al medio.

[Tabla 3]

Cepas y plásmidos utilizados en la presente invención

Cepa/Plásmido: Naturaleza* Referencia/Fabricante

Cepa

E. coli JM109: Anfitrión para experimentos de ingeniería genética Takara

JM109Pancrt-Cantha: E. coli cepa JM109 con pAC-Cantha introducido en ella Presente invención

JM109BreZ-asta: E. coli cepa JM109 con pAC-Cantha y pUCBreZ introducidos en ella Presente invención

JM109PanZ-asta: E. coli cepa JM109 con pAC-Cantha y pUCpanZ introducidos en ella Presente invención

JM109ParaPClZasta: E. coli cepa JM109 con pAC-Cantha y pUCParaPC1Z introducidos en ella Presente invención

JM109ParaN8Z-: E. coli cepa JM109 con pAC-Cantha y Presente invención

Cepas y plásmidos utilizados en la presente invención

Cepa/Plásmido: Naturaleza* Referencia/Fabricante

Cepa

asta: pUCParaN8Z introducidos en ella

JM109P99Z-asta: E. coli cepa JM109 con pAC-Cantha y pUCP99Z introducidos en ella Presente invención

Plásmido

pAC-Cantha: Cmr: plásmido que incluye crtE, crtB, crtI, crtY, y crtW Nishida, et al., datos no publicados

pUC18: Apr: vector de clonación TOYOBO

pUC8: Apr: vector de clonación TOYOBO

p5Bre2-15: Apr: Fragmento de ADN de 12 kb derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212 (MBIC03018) insertado en el sitio EcoRI de pBluescript II KS- Presente invención

pCAR25: Apr: Fragmento de ADN de 6,9 kb derivado de Pantoea ananatis sp. cepa 20D3 (D90087) insertado en los sitios KpnIy HindIII de pUC19 Misawa, et al.,1990

pPC17: Apr: Fragmento de ADN de 1,63 kb derivado de Paracoccus sp. cepa PC-1 (MBIC03024) insertado en los sitios PstIy PstEII de pBluescript II SK+ Misawa, et al., 1995

AK96K: Apr: Fragmento de ADN de 1,88 kb derivado de Paracoccus sp. cepa N81106 (MBIG01143) insertado en los sitios BamHIy KpnIde pBluescript II SK- Misawa, et al., 1995

pBS606: Apr: Fragmento de ADN de 8,9 kb derivado de Flavobacteria sp. cepa P99-3 (AB106143) insertado en los sitios BglIII y SalI de pBluescript II SK- Teramoto, et al., 2003

pUCBreZ: Apr: β-caroteno hidroxilasa derivada de Brevundimonas sp. cepa SD-21 (MBIC03018) amplificada por medio de PCR e insertada en pUC18 Presente invención

pUCPanZ: Apr: β-caroteno hidroxilasa derivada de Pantoea ananatis sp. cepa 20D3 (D90087) amplificada por medio de PCR e insertada en pUC18 Presente invención

pUCParaPC1Z: Apr: β-caroteno hidroxilasa derivada de Paracoccus sp. cepa PC-1 (MBIC03024) amplificada por medio de PCR e insertada en pUC18 Presente invención

pUCParaN8Z: Apr: β-caroteno hidroxilasa derivada de Paracoccus sp. cepa N81106 (MBIC01143) amplificada por medio de PCR e insertada en pUC18 Presente invención

pUCP99Z: Apr: β-caroteno hidroxilasa derivada de Flavobacteria sp. cepa P99-3 (AB106143) amplificada por medio de PCR e insertada en pUC8 Presente invención

*Apr: resistencia a ampicilina, Cmr: resistencia a cloramfenicol

Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., y Harashima, K., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia

14

coli, J. Bacteriol. 172: 6704-6712, 1990.

Misawa, N., Satomi, Y., Kondo, K., Yokoyama, A., Kajiwara, S., Saito, T., Ohtani, T., y Miki, W., Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level, J. Bacteriol. 177: 6575-6585, 1995: Documento no de Patente 1.

Teramoto, M., Takaichi, S., Inomata, Y., Ikenaga, H., y Misawa, N., Structural and functional analysis of a lycopene β-monociclasa gene isolated from a unique marine bacterium that produces myxol, FEBS Lett. 545: 120-126, 2003.

[Ejemplo 13] Construcción de plásmidos de expresión de la proteína de fusión con β-galactosidasa

Se amplificó cada uno de los genes crtZ individuales por medio de PCR y se construyeron los plásmidos individuales para expresar cada proteína de fusión con β-galactosidasa con el fin de sintetizar cada producto del gen crtZ fusionado a una secuencia líder del gen de β-galactosidasa (LacZ) por medio de un vector de E. coli pUC18 o pUC8 (TOYOBO). Específicamente, se amplificaron los fragmentos de ADN requeridos por medio de PCR utilizando los plásmidos p5Bre2-15, pCAR25, pPC17, pAK96K, y pBS606 como moldes de ADN y se diseñaron cebadores (mostrados en los SEQ ID NO: 11 a 20) de tal manera que se pudiera obtener cada producto amplificado de crtZ que tenía un sitio EcoRI en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3' (p5Bre2-15, pCAR25, pPC17, y pAK96K) o que tenía un sitio SmaI en el extremo 5' y un sitio HindIII en el extremo 3' (pBS606). pCAR25, pPC17, pAK96K, y pBS606 fueron los plásmidos que contenían los genes crtZ derivados de Pantoea ananatis cepa 20D3 (nombre anterior: Erwinia uredovora), Paracoccus sp. cepa PC-1, Paracoccus sp. cepa N81106, y Flavobacterium sp. cepa P99-3, respectivamente.

Se utilizó ADN Polimerasa PfuTurbo Hotstart (Stratagene) como ADN polimerasa termoestable. Después de la desnaturalización térmica a 95°C durante 20 seg, se llevaron a cabo 30 ciclos de amplificación a 95°C durante 20 seg, 51°C durante 30 seg, y 72°C durante 1 min y 30 seg. Una parte del producto amplificado se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. El resto del producto amplificado se precipitó con etanol, se digirió con EcoRI y BamHI (cuando se utilizó p5Bre2-15, pCAR25, pPC17, o pAK96K como molde) o con SmaIy HindIII (cuando se utilizó pBS606 como molde), y a continuación se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Después, el fragmento de ADN con una longitud esperada se cortó del gel de agarosa y se purificó (utilizando Gene Clean Turbo Kit: Q-BIOgene). El ADN purificado se ligó a los sitios EcoRI y BamHI de pUC18 o a los sitios SmaIy HindIII de pUC8 y se transformó en E. coli JM109. La secuencia líder de estos plásmidos de expresión de proteínas de fusión con β-galactosidasa, con 7 o 9 aminoácidos, esto es, Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser (cuando se utilizó p5Bre2-15, pCAR25, pPC17, o pAK96K como molde) o Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly (cuando se utilizó pBS606 como molde), se diseñó para añadirla a la Met del inicio original de crtZ individual.

[Ejemplo 14] Construcción de E. coli productora de Cantaxantina o Astaxantina

Se cultivó cada uno de los clones de E. coli que portaba el plásmido que contenía los genes crtZ individuales en 4 ml de un medio líquido LB que contenía Ap a 37°C durante la noche, y después se extrajo el plásmido. La secuencia de nucleótidos del plásmido extraído se confirmó utilizando Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN modelo 3700 (Perkin-Elmer) de acuerdo con el protocolo adjunto. Los plásmidos individuales que se confirmó que contenían la secuencia de nucleótidos correcta del gen crtZ derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212, Pantoea ananatis cepa 20D3, Paracoccus sp. cepa PC1, Paracoccus sp. cepa N81106, o Flavobacterium sp. cepa P99-3 se denominaron pUCBreZ, pUCPanZ, pUCParaPC1Z, pUCParaN8Z, y pUCP99Z, respectivamente. La E. coli productora de cantaxantina (referida como JM109Pancrt-Cantha) se construyó introduciendo un plásmido pAC-Cantha en E. coli JM109 y seleccionando las colonias resistentes a Cm. Adicionalmente, la E. coli productora de astaxantina se construyó introduciendo un plásmido pAC-Cantha con pUCBreZ, pUCPanZ, pUCParaPC1Z, pUCParaN8W, o pUCP99Z en E. coli y seleccionando las colonias resistentes a Ap y Cm. Los transformantes de E. coli se denominaron JM109BreZ-asta, JM109PanZ-asta, JM109ParaPC1Z-asta, JM109ParaN8Z-asta, y JM109P99Z-asta.

[Ejemplo 15] Análisis de la eficacia de producción de astaxantina en E. coli que expresa los genes crtZ individuales

Se cultivó JM109Pancrt-Cantha en 4 ml de un medio líquido LB que contenía Cm y cada uno de JM109BreZ-asta, JM109PanZ-asta, JM109ParaPC1Z-asta, JM109ParaN8Z-asta, y JM109P99Z-asta se cultivó en 4 ml de un medio líquido LB que contenía Ap y Cm a 37°C durante la noche. Se inocularon cincuenta microlitros de cada medio líquido LB en 4 ml de un medio líquido LB u se sometieron al cultivo principal a 30°C. Cuando la A600 fue de aproximadamente 0,5, se añadieron 0,5 mM de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranósido) al medio de cultivo, seguido de cultivo adicional a 30°C. Las células se cosecharon mediante centrifugación del medio de cultivo y se lavaron con STE dos veces. A esto se le añadió acetona (400 μl) y se sometió a vórtice para transferir de ese modo los pigmentos desde las células a la acetona. La mezcla resultante se centrifugó. El sobrenadante se filtró y se sometió a análisis del pigmento con un sistema HPLC-PDA (detector de matriz de fotodiodos Waters Alliance 2695 y 2996). En el HPLC-PDA, se utilizó una columna ODS-80Ts con gel TSK (TOSOH). Las fases móviles fueron la solución A (metanol del 95%) y la solución B [metanol : tetrahidrofurano (THF) = 7 : 3]. El programa de elución con una velocidad de flujo de 1,0 ml/min fue el siguiente: 100% de la solución A durante 5 min, un gradiente lineal desde 100% de la solución A hasta 100% de la solución B durante 5 a 10 min, y la solución B durante 8 min. Los pigmentos

El análisis de los pigmentos producidos por los diferentes clones de E. coli se llevó a cabo 48 hr después de la adición de IPTG utilizando un sistema HPLC-PDA (véase la FIG. 6). Los resultados demuestran que casi todos los pigmentos producidos por JM109Pancrt-Cantha fueron cantaxantina (TR 10,2 min, λmax 478 nm) (véase la FIG. 10 6a). En cada uno de JM109BreZ-asta, JM109PanZ-asta, JM109ParaPC1Z-asta, y JM109ParaN8Z-asta, además de un pico del pigmento principal, astaxantina, (TR 5,7 min, λmax 476 nm), se observó un pico de adonixantina (TR 7,2 min, λmax 463 nm) (FIG. 6b, c, d, y e). En JM109P99Z-asta, cantaxantina y adonirrubina (Fenicoxantina) (TR 8,6 min, λmax 470) fueron los pigmentos principales (FIG. 6f). Adicionalmente, como se muestra en la FIG. 7, los contenidos de astaxantina en los carotenoides acumulados en JM109BreZ-asta (símbolo en la figura: ◆),

15 JM109PanZ-asta (símbolo en la figura: □), JM109ParaPC1Z-asta (símbolo en la figura: ▲), JM109ParaN8Z-asta (símbolo en la figura: ▼), y JM109P99Z (símbolo en la figura: ●) después de 48 hr tras la adición de IPTG fueron de 42%, 29%, 21%, 17%, y 4%, respectivamente, y el contenido de JM109BreZ-asta fue el más alto durante todas las fases de cultivo.

20 Como resultado de este estudio, se ha revelado que la CrtZ derivada de Brevundimonas sp. cepa SD-212 produce muy eficazmente astaxantina. Estos resultados demuestran que el gen crtZ derivado de Brevundimonas sp. cepa SD-212 es eficaz para la producción en masa para uso industrial de astaxantina y metabolitos de la misma (éster de astaxantina y similares) utilizando un microorganismo recombinante o una planta recombinante.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> MARINE BIOTECHNOLOGY INSTITUTE CO., LTD.

5 <120> UN MÉTODO PARA PRODUCIR ASTAXANTINA O SUS METABOLITOS UTILIZANDO UN GEN DE CAROTENOIDE CETOLASA Y UN GEN DE CAROTENOIDE HIDROXILASA

<130> FP-048PCT 10 <160> 20

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1 15 <211> 735

<212> ADN

<213> Brevundimonas sp.

<220> 20 <221> CDS

<222> (1)..(732)

<400> 1

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> Brevundimonas sp.

<400> 2

10

<210> 3

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador

5 10: <400> 3 tacgaattcg atgaccgccg ccgtcg <210> 4 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> 26

<223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador

15: <400> 4 tagaggatcc tcaagactcg ccgcgccaca a 31

20: <210> 5 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

25: <223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador

<400> 5 tacgaattcg atgtccggac ggaagc: 26

30: <210> 6 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

35: <220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador

40: <400> 6 tagaggatcc tcatgcgcgg cctccgg 27

45: <210> 7 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

50: <223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador <400> 7 tacgaattcg atgagcgcac atgccc 26

55: <210> 8 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

60: <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador

<400> 8 tagaggatcc tcatgcggtg tccccct: 27 19

<210> 9

<211> 486

<212> ADN

<213> Brevundimonas sp. 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(483)

10 <400> 9

<210> 10

<213> Brevundimonas sp.

<400> 10 <210> 11

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador

<400> 11 tacgaattcg atggcctggc tgacgt 26

15 <210> 12

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador

<400> 12 25 tagaggatcc tcaggcgccg ctgctgg 27

<210> 13

<211> 26

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de laSecuencia artificial: cebador 35

<400> 13 tacgaattcg atgttgtgga tttgga 26

<210> 14 40 <211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 45

<223> Descripción de laSecuencia artificial: cebador

<400> 14

tagaggatcc ttacttcccg gatgcgg 27 50

<210> 15

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5

<223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador

<400> 15

tacgaattcg atgacgcaat tcctca 26 10

<210> 16

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador

20 <400> 16 tagaggatcc tcacgacgga cgctcgt 27

<210> 17

<211> 26 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

30 <223> Descripción de laSecuencia artificial: cebador

<400> 17 tacgaattcg atgaccaatt tcctga 26

35 <210> 18

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> Descripción de laSecuencia artificial: cebador

<400> 18 45 tagaggatcc tcacgtgcgc tcctgcg 27

<210> 19

<211> 26

<212> ADN 50 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de laSecuencia artificial: cebador 55

<400> 19 ttcccgggga atggaaatag ttctct 26

<210> 20 60 <211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador

<400> 20 tgccaagctt ttatttgaaa tacttga 27

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo o una planta transformados con

(i)

un gen de anillo de β-ionona 4-cetolasa que codifica 5 (a) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2; o

(b) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2 mediante adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y que tiene actividad de anillo de β-ionona 4-cetolasa; y

(ii)

un gen de anillo de β-ionona 3-hidroxilasa que codifica 10 (c) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 10; o

(d) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 10 mediante adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y tiene actividad de anillo de β-ionona 3-hidroxilasa; siendo el microorganismo o la planta capaces de sintetizar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de

15 astaxantina.
2.

El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo es Escherichia coli.
3.

Un método para preparar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina, comprendiendo el método

20 las etapas de cultivar el microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en un medio y obtener astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina a partir del cultivo o las células.
4. Un método para preparar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina, comprendiendo el método

las etapas de cultivar la planta de acuerdo con la reivindicación 1 y obtener astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un 25 éster de astaxantina a partir de la planta.