JPH1156372A - ユビキノン−１０の生成方法 - Google Patents
ユビキノン−１０の生成方法Info
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- JPH1156372A JPH1156372A JP9244811A JP24481197A JPH1156372A JP H1156372 A JPH1156372 A JP H1156372A JP 9244811 A JP9244811 A JP 9244811A JP 24481197 A JP24481197 A JP 24481197A JP H1156372 A JPH1156372 A JP H1156372A
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- prc10
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 光合成細菌、例えばRhodobacter capsul
atus由来のデカプレニル二リン酸合成酵素の構造遺伝子
ｄｄｓ１を単離、配列決定し、大腸菌を用いてこれを発
現せしめる。 【効果】 大腸菌からユビキノン−１０を生産すること
ができる。
atus由来のデカプレニル二リン酸合成酵素の構造遺伝子
ｄｄｓ１を単離、配列決定し、大腸菌を用いてこれを発
現せしめる。 【効果】 大腸菌からユビキノン−１０を生産すること
ができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ユビキノン、特に
ユビキノン−１０の生成に関する。更に詳細には、本発
明は、光合成細菌由来のデカプレニル二リン酸合成酵素
（ＤＤＳということもある）をコードする遺伝子を単
離、発現せしめてユビキノン−１０を生成する新規シス
テムに関するものである。
ユビキノン−１０の生成に関する。更に詳細には、本発
明は、光合成細菌由来のデカプレニル二リン酸合成酵素
（ＤＤＳということもある）をコードする遺伝子を単
離、発現せしめてユビキノン−１０を生成する新規シス
テムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】イソプレノイドは炭素数が５のイソペン
テニル二リン酸（ＩＰＰ）を基本単位とする天然の有機
化合物であり自然界に数多く存在している。その例を挙
げれば、色素のカロチノイド、天然ゴム、呼吸鎖電子伝
達系で働くイソプレノイドキノンなどがそれにあたる。
イソプレノイドキノンにはユビキノン（ＵＱ）、メナキ
ノン、プラストキノンなどキノン骨格の違いにより区別
されるものが数種存在し、またそれぞれについてはイソ
プレノイド側鎖長の違いにより多数のホモログが存在す
る。ユビキノンは、キノン骨格にイソプレノイドが付加
した化合物であって、2,3-dimethoxy-5-methyl-6-polyp
renyl-1,4-benzoquinoneの構造を持ち、補酵素（Ｃｏ
Ｑ）とも称される重要な役割を果たしている生体成分で
ある。ユビキノンは、動植物の組織、微生物の菌体成分
として存在し、抗酸化物質としても知られるビタミン様
物質であり、電子伝達系の必須成分としても生理的、生
化学的に重要な機能を果たしている。天然には側鎖のイ
ソプレノイド単位の数により主にユビキノン−１からユ
ビキノン−１２までの同族体が存在している。
テニル二リン酸（ＩＰＰ）を基本単位とする天然の有機
化合物であり自然界に数多く存在している。その例を挙
げれば、色素のカロチノイド、天然ゴム、呼吸鎖電子伝
達系で働くイソプレノイドキノンなどがそれにあたる。
イソプレノイドキノンにはユビキノン（ＵＱ）、メナキ
ノン、プラストキノンなどキノン骨格の違いにより区別
されるものが数種存在し、またそれぞれについてはイソ
プレノイド側鎖長の違いにより多数のホモログが存在す
る。ユビキノンは、キノン骨格にイソプレノイドが付加
した化合物であって、2,3-dimethoxy-5-methyl-6-polyp
renyl-1,4-benzoquinoneの構造を持ち、補酵素（Ｃｏ
Ｑ）とも称される重要な役割を果たしている生体成分で
ある。ユビキノンは、動植物の組織、微生物の菌体成分
として存在し、抗酸化物質としても知られるビタミン様
物質であり、電子伝達系の必須成分としても生理的、生
化学的に重要な機能を果たしている。天然には側鎖のイ
ソプレノイド単位の数により主にユビキノン−１からユ
ビキノン−１２までの同族体が存在している。
【０００３】ユビキノンは、その薬理、臨床効果につい
ても研究され、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、貧
血症等に効果があるとされ、心疾患薬その他各種医薬品
としても価値の高い物質である。しかし、医薬品として
効果が認められているのは、ユビキノン−１０のみであ
る。ユビキノン−１０は、現在、たばこの葉、酵母ある
いは微生物菌体から抽出精製されているが、それらの詳
細は明らかにされていない。しかも、その生産は需要に
追いつかず、従来の方法に代るより効率的な生産方法の
開発が求められている。
ても研究され、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、貧
血症等に効果があるとされ、心疾患薬その他各種医薬品
としても価値の高い物質である。しかし、医薬品として
効果が認められているのは、ユビキノン−１０のみであ
る。ユビキノン−１０は、現在、たばこの葉、酵母ある
いは微生物菌体から抽出精製されているが、それらの詳
細は明らかにされていない。しかも、その生産は需要に
追いつかず、従来の方法に代るより効率的な生産方法の
開発が求められている。
【０００４】このユビキノンの側鎖を形成するイソプレ
ノイドは炭素数が５のイソペンテニル二リン酸（ＩＰ
Ｐ）を基本単位とする、天然有機化合物であり、自然界
に数多く存在する。ユビキノンの側鎖として利用される
他に、カロチノイド、天然ゴム、またプレニル化蛋白質
としての姿も知られている。生体内での生合成は、基本
となるＩＰＰや、ＦＰＰ（ファネシル二リン酸）に新た
なＩＰＰが結合していき、徐々に長い鎖長のイソプレノ
イドに成っていく。このようにイソプレノイドの合成を
触媒する酵素はプレニルトランスフェラーゼという。プ
レニルトランスフェラーゼはバクテリアを中心として多
種類存在が確認されている。Ｅ．ｃｏｌｉではＦＰＳ，
ＯＰＳ，ＵＰＳの３つの酵素の存在が確認されており、
遺伝子として単離されているのは、ＦＰＳの構造遺伝子
であるｉｓｐＡとオクタプレニル二リン酸合成酵素（Ｏ
ＰＳ）の構造遺伝子ｉｓｐＢである。
ノイドは炭素数が５のイソペンテニル二リン酸（ＩＰ
Ｐ）を基本単位とする、天然有機化合物であり、自然界
に数多く存在する。ユビキノンの側鎖として利用される
他に、カロチノイド、天然ゴム、またプレニル化蛋白質
としての姿も知られている。生体内での生合成は、基本
となるＩＰＰや、ＦＰＰ（ファネシル二リン酸）に新た
なＩＰＰが結合していき、徐々に長い鎖長のイソプレノ
イドに成っていく。このようにイソプレノイドの合成を
触媒する酵素はプレニルトランスフェラーゼという。プ
レニルトランスフェラーゼはバクテリアを中心として多
種類存在が確認されている。Ｅ．ｃｏｌｉではＦＰＳ，
ＯＰＳ，ＵＰＳの３つの酵素の存在が確認されており、
遺伝子として単離されているのは、ＦＰＳの構造遺伝子
であるｉｓｐＡとオクタプレニル二リン酸合成酵素（Ｏ
ＰＳ）の構造遺伝子ｉｓｐＢである。
【０００５】このプレニルトランスフェラーゼの作用に
よって、大腸菌では側鎖長が８のオクタプレニル二リン
酸が、出芽酵母では側鎖長が６のヘキサプレニル二リン
酸が合成される。一方、大腸菌ｕｂｉＡ、酵母ＣＯＱ２
産物によって、ＰＨＢ（ｐ−ヒドロキシベンゾエート）
から派生したベンゾキノン骨格にこれらのイソプレノイ
ドが付加されて、それぞれユビキノン−８、ユビキノン
−６が完成する。このようなことから、ｉｓｐＢ産物と
ｕｂｉＡ産物等の触媒するポイントがユビキノン合成に
とって重要であると考えられる。ユビキノン−１０は、
上述のように薬理作用の高い生理活性物質として注目さ
れているが、側鎖を合成するデカプレニル二リン酸合成
酵素の遺伝子とｕｂｉＡ産物、酵母ＣＯＱ２産物を利用
することでユビキノン−１０の効率的生産につながると
の新しい観点にたち、デカプレニル二リン酸合成酵素遺
伝子のクローニングの必要性に着目した。
よって、大腸菌では側鎖長が８のオクタプレニル二リン
酸が、出芽酵母では側鎖長が６のヘキサプレニル二リン
酸が合成される。一方、大腸菌ｕｂｉＡ、酵母ＣＯＱ２
産物によって、ＰＨＢ（ｐ−ヒドロキシベンゾエート）
から派生したベンゾキノン骨格にこれらのイソプレノイ
ドが付加されて、それぞれユビキノン−８、ユビキノン
−６が完成する。このようなことから、ｉｓｐＢ産物と
ｕｂｉＡ産物等の触媒するポイントがユビキノン合成に
とって重要であると考えられる。ユビキノン−１０は、
上述のように薬理作用の高い生理活性物質として注目さ
れているが、側鎖を合成するデカプレニル二リン酸合成
酵素の遺伝子とｕｂｉＡ産物、酵母ＣＯＱ２産物を利用
することでユビキノン−１０の効率的生産につながると
の新しい観点にたち、デカプレニル二リン酸合成酵素遺
伝子のクローニングの必要性に着目した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑み、ＵＱ−１０の側鎖であるデカプレノイ
ド合成に係わる遺伝子を利用し、ＵＱ−１０を微生物で
生産する技術を開発する目的でなされたものである。
術の現状に鑑み、ＵＱ−１０の側鎖であるデカプレノイ
ド合成に係わる遺伝子を利用し、ＵＱ−１０を微生物で
生産する技術を開発する目的でなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、生理活性を有するＵＱ−１０を生成する生物よ
り、その合成に必要な遺伝子、すなわち側鎖のデカプレ
ニル二リン酸を合成するのに必要なデカプレニル二リン
酸合成酵素遺伝子を単離し、大腸菌内で発現させること
でＵＱ−１０生成を行うこととした。
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、生理活性を有するＵＱ−１０を生成する生物よ
り、その合成に必要な遺伝子、すなわち側鎖のデカプレ
ニル二リン酸を合成するのに必要なデカプレニル二リン
酸合成酵素遺伝子を単離し、大腸菌内で発現させること
でＵＱ−１０生成を行うこととした。
【０００８】この新規技術課題を解決するため、種々の
ポリプレニル二リン酸合成酵素（ＰＤＳ）に共通して存
在するアミノ酸配列（ドメイン２及び６のアミノ酸配
列）をもとにしてデザインしたミックスプライマーを合
成し、これを用いて、ＵＱ−１０を生合成している光合
成細菌Rhodobacter capsulatusのゲノムＤＮＡを鋳型に
してＰＣＲを行った。このＰＣＲで得られた増幅断片を
シークエンスしたところ、目的の遺伝子を含むと思われ
るＤＮＡ断片であったので、その断片から上流および下
流側にカセットおよびカセットプライマーを用いたＰＣ
Ｒによるゲノムウォーキングにより、全長を含むと思わ
れる遺伝子断片を得た。この遺伝子断片について、その
塩基配列を決定した。
ポリプレニル二リン酸合成酵素（ＰＤＳ）に共通して存
在するアミノ酸配列（ドメイン２及び６のアミノ酸配
列）をもとにしてデザインしたミックスプライマーを合
成し、これを用いて、ＵＱ−１０を生合成している光合
成細菌Rhodobacter capsulatusのゲノムＤＮＡを鋳型に
してＰＣＲを行った。このＰＣＲで得られた増幅断片を
シークエンスしたところ、目的の遺伝子を含むと思われ
るＤＮＡ断片であったので、その断片から上流および下
流側にカセットおよびカセットプライマーを用いたＰＣ
Ｒによるゲノムウォーキングにより、全長を含むと思わ
れる遺伝子断片を得た。この遺伝子断片について、その
塩基配列を決定した。
【０００９】その結果、９７８ｂｐ、３２５アミノ酸か
ら構成されるＯＲＦの存在が確認され、更にホモロジー
検索をした結果、この塩基配列から予想されるアミノ酸
は、酢酸菌Gluconobacter suboxydansのＤｄｓ１（デカ
プレニル二リン酸合成酵素）及び大腸菌ＩｓｐＢ（オク
タプレニル二リン酸合成酵素）のアミノ酸とそれぞれ高
い相同性を示した。
ら構成されるＯＲＦの存在が確認され、更にホモロジー
検索をした結果、この塩基配列から予想されるアミノ酸
は、酢酸菌Gluconobacter suboxydansのＤｄｓ１（デカ
プレニル二リン酸合成酵素）及び大腸菌ＩｓｐＢ（オク
タプレニル二リン酸合成酵素）のアミノ酸とそれぞれ高
い相同性を示した。
【００１０】これらのことから、このようにしてクロー
ン化した遺伝子は、デカプレニル二リン酸合成酵素をコ
ードする遺伝子であると認定し、これをｄｄｓ１遺伝子
と命名した。そしてこの遺伝子を大腸菌発現ベクターに
クローン化し、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子のプロモーターを
利用して発現させたところ、本来ホストが有するＵＱ−
８に加えて、ＵＱ−９、ＵＱ−１０の生成が確認され、
また、Ｄｄｓ活性も認められた。
ン化した遺伝子は、デカプレニル二リン酸合成酵素をコ
ードする遺伝子であると認定し、これをｄｄｓ１遺伝子
と命名した。そしてこの遺伝子を大腸菌発現ベクターに
クローン化し、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子のプロモーターを
利用して発現させたところ、本来ホストが有するＵＱ−
８に加えて、ＵＱ−９、ＵＱ−１０の生成が確認され、
また、Ｄｄｓ活性も認められた。
【００１１】また、ＵＱ−８合成に必要なオクタプレニ
ル二リン酸合成酵素遺伝子（ｉｓｐＢ遺伝子）を欠損せ
しめた大腸菌を作成しておき、一方、上記と同様にし
て、ｄｄｓ１遺伝子を大腸菌発現ベクターにクローン化
しておき、これを上記したｉｓｐＢ破壊株で発現させる
ことにより、ＵＱ−１０をメイン産物として生成せしめ
ることも確認した。
ル二リン酸合成酵素遺伝子（ｉｓｐＢ遺伝子）を欠損せ
しめた大腸菌を作成しておき、一方、上記と同様にし
て、ｄｄｓ１遺伝子を大腸菌発現ベクターにクローン化
しておき、これを上記したｉｓｐＢ破壊株で発現させる
ことにより、ＵＱ−１０をメイン産物として生成せしめ
ることも確認した。
【００１２】そしてその結果、ＵＱ−１０を製造するこ
とにはじめて成功した。そしてその際、前者の場合は、
ＵＱ−８、ＵＱ−９とともにＵＱ−１０を製造するのに
成功し、また、ｉｓｐＢ破壊株を用いる後者の場合にお
いては、主としてＵＱ−１０を製造することができ、高
純度のＵＱ−１０を効率的に製造するのも可能となり、
これらの成功に基づき、本発明を完成するに至った。以
下、本発明について詳述する。
とにはじめて成功した。そしてその際、前者の場合は、
ＵＱ−８、ＵＱ−９とともにＵＱ−１０を製造するのに
成功し、また、ｉｓｐＢ破壊株を用いる後者の場合にお
いては、主としてＵＱ−１０を製造することができ、高
純度のＵＱ−１０を効率的に製造するのも可能となり、
これらの成功に基づき、本発明を完成するに至った。以
下、本発明について詳述する。
【００１３】
（１）R. capsulatusからのデカプレニル二リン酸合成
酵素（ＤＤＳ）をコードするｄｄｓ１遺伝子のクローニ
ング
酵素（ＤＤＳ）をコードするｄｄｓ１遺伝子のクローニ
ング
【００１４】ａ）プライマーの作製及びＰＣＲ反応 イソプレノイドを合成する酵素（プレニル二リン酸合成
酵素、ＰＤＳ）に存在する高く保存された７つの領域の
内、特に保存性の高いドメインII及びVIのアミノ酸配列
をもとに、センスプライマーＡ及びアンチセンスプライ
マーＢをデザインした。
酵素、ＰＤＳ）に存在する高く保存された７つの領域の
内、特に保存性の高いドメインII及びVIのアミノ酸配列
をもとに、センスプライマーＡ及びアンチセンスプライ
マーＢをデザインした。
【００１５】Primer Ａ： ５’−ＹＴＮＹＴＮＣＡＹＧＡＹＧＡＹＧＴ−３’ Primer Ｂ： ５’−ＲＴＣＮＴＣＮＡＧＹＴＧＲＴＴ−３’ 但し Ｙ：Ｔ又はＣ Ｎ：Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ Ｒ：Ａ又はＧ
【００１６】ＡおよびＢプライマーを用いてR. capsula
tusのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。反応の条
件は、ゲノム約０．５μｇを９４℃で５分間、熱変性さ
せ、それを鋳型に９４℃、３０秒間の熱変性、５５℃、
２分間のプライマーとのアニール反応、７２℃、２分間
の伸長反応を２５サイクル行った。次に、反応液の一部
をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、約４００
ｂｐ付近に増幅が確認できた。
tusのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。反応の条
件は、ゲノム約０．５μｇを９４℃で５分間、熱変性さ
せ、それを鋳型に９４℃、３０秒間の熱変性、５５℃、
２分間のプライマーとのアニール反応、７２℃、２分間
の伸長反応を２５サイクル行った。次に、反応液の一部
をアガロースゲル電気泳動で確認したところ、約４００
ｂｐ付近に増幅が確認できた。
【００１７】ｂ）ＰＣＲ増幅断片のクローニング 使用したミックスプライマーＡおよびＢの５’末端に制
限酵素ＢａｍＨＩ認識サイトが付加してあるので、この
サイトを利用してクローン化した。ベクターであるｐＵ
Ｃ１８および増幅断片をＢａｍＨＩで消化後、ベクター
にはＢＡＰ処理を行った。タカラのＤＮＡ ligation Ki
t Ver.1を用いてligation反応後、一部をハナハン法に
より大腸菌ＤＨ１０Ｂに導入し、目的遺伝子の挿入され
たと思われるクローンからプラスミド抽出し、制限酵素
反応で確認した。また、構築したプラスミドをｐＲＣ３
と命名した。（図１）
限酵素ＢａｍＨＩ認識サイトが付加してあるので、この
サイトを利用してクローン化した。ベクターであるｐＵ
Ｃ１８および増幅断片をＢａｍＨＩで消化後、ベクター
にはＢＡＰ処理を行った。タカラのＤＮＡ ligation Ki
t Ver.1を用いてligation反応後、一部をハナハン法に
より大腸菌ＤＨ１０Ｂに導入し、目的遺伝子の挿入され
たと思われるクローンからプラスミド抽出し、制限酵素
反応で確認した。また、構築したプラスミドをｐＲＣ３
と命名した。（図１）
【００１８】ｃ）ＰＣＲ増幅断片のシークエンス ABI PRISMTM 377 DNA Seqencerによりシークエンスをお
こなった。ｐＲＣ３を鋳型にユニバーサル及びリバース
プライマーを用いて両側からシークエンスを決定した。
他のプレニル二リン酸合成酵素とのホモロジーを調べた
ところ、長鎖のイソプレノイド合成酵素である大腸菌
Ｅ．ｃｏｌｉのｉｓｐＢにコードされるオクタプレニル
二リン酸合成酵素（octaprenyl diphosphate synthas
e）やH. infulenzaeのｉｓｐＢによりコードされるポリ
プレニル二リン酸合成酵素（polyprenyl diphosphate s
ynthase）など長鎖の合成酵素と高い相同性（４８．８
％及び４７．７％）がみられた。光合成細菌R. capsula
tusは、ＵＱ−１０を生合成しているためデカプレニル
二リン酸合成酵素（decaprenyl diphosphate synthas
e）活性を有していると思われることから、クローニン
グした約４００ｂｐの断片は、デカプレニル二リン酸合
成酵素（decaprenyl diphosphate synthase）をコード
する遺伝子ｄｄｓ１の一部であると予想した。
こなった。ｐＲＣ３を鋳型にユニバーサル及びリバース
プライマーを用いて両側からシークエンスを決定した。
他のプレニル二リン酸合成酵素とのホモロジーを調べた
ところ、長鎖のイソプレノイド合成酵素である大腸菌
Ｅ．ｃｏｌｉのｉｓｐＢにコードされるオクタプレニル
二リン酸合成酵素（octaprenyl diphosphate synthas
e）やH. infulenzaeのｉｓｐＢによりコードされるポリ
プレニル二リン酸合成酵素（polyprenyl diphosphate s
ynthase）など長鎖の合成酵素と高い相同性（４８．８
％及び４７．７％）がみられた。光合成細菌R. capsula
tusは、ＵＱ−１０を生合成しているためデカプレニル
二リン酸合成酵素（decaprenyl diphosphate synthas
e）活性を有していると思われることから、クローニン
グした約４００ｂｐの断片は、デカプレニル二リン酸合
成酵素（decaprenyl diphosphate synthase）をコード
する遺伝子ｄｄｓ１の一部であると予想した。
【００１９】（２）カセット及びカセットプライマーを
利用した全長のｄｄｓ１遺伝子のクローン化
利用した全長のｄｄｓ１遺伝子のクローン化
【００２０】ａ）カセット及びカセットプライマーを利
用したＰＣＲ プラスミドライブラリーを構築してのスクリーニングで
は、ｄｄｓ１遺伝子全長のクローニングには至らなかっ
たが、少なくとも構築したライブラリーに対してＰＣＲ
で確認しているので、ｄｄｓ１遺伝子は存在していると
思われる。従って、スクリーニングに使用したプローブ
（４００ｂｐ弱）が、もう少し長ければ偽陽性の低減に
つながるのではないかと考え、タカラのカセットおよび
カセットプライマーを利用したＰＣＲでのゲノムウォー
キングによりプローブを長くする、もしくはそれにより
全長をクローニングする戦略を立てた。図２に示したよ
うに、既にクローン化したｄｄｓ１遺伝子の一部約４０
０ｂｐの配列に相補的である上流域及び下流域を増幅さ
せるためのプライマーＳ１およびＳ２を合成した。市販
されているカセットはＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、Ｐｓ
ｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、Ｓａｕ３ＡＩ Ｃａｓｓｅ
ｔｔｅであるので、これに対応した制限酵素でR. capsu
latusゲノムＤＮＡを消化後、ＴＯＹＯＢＯのLigation
highを使用して各カセットとライゲーションした。この
うち一部を鋳型にカセットプライマーＣ１と既知領域に
相補的なプライマーＳ１を用いて、１回目のＰＣＲを行
った。次に、１回目のＰＣＲ反応液中の１μｌを用いて
２回目のＰＣＲを行い電気泳動で確認してみたところ、
上流域にはＰｓｔＩカセットをライゲーションしたも
の、下流域にはＨｉｎｄIIIカセットをライゲーション
後、ＰＣＲにより増幅したもので、それぞれ約１．４ｋ
ｂと２．２の特異的な増幅断片が観察された。しかし、
それ以外のカセットを利用してのＰＣＲでは、非特異な
増幅断片が複数みられクローン化は困難であった。（図
３）
用したＰＣＲ プラスミドライブラリーを構築してのスクリーニングで
は、ｄｄｓ１遺伝子全長のクローニングには至らなかっ
たが、少なくとも構築したライブラリーに対してＰＣＲ
で確認しているので、ｄｄｓ１遺伝子は存在していると
思われる。従って、スクリーニングに使用したプローブ
（４００ｂｐ弱）が、もう少し長ければ偽陽性の低減に
つながるのではないかと考え、タカラのカセットおよび
カセットプライマーを利用したＰＣＲでのゲノムウォー
キングによりプローブを長くする、もしくはそれにより
全長をクローニングする戦略を立てた。図２に示したよ
うに、既にクローン化したｄｄｓ１遺伝子の一部約４０
０ｂｐの配列に相補的である上流域及び下流域を増幅さ
せるためのプライマーＳ１およびＳ２を合成した。市販
されているカセットはＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、Ｐｓ
ｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、Ｓａｕ３ＡＩ Ｃａｓｓｅ
ｔｔｅであるので、これに対応した制限酵素でR. capsu
latusゲノムＤＮＡを消化後、ＴＯＹＯＢＯのLigation
highを使用して各カセットとライゲーションした。この
うち一部を鋳型にカセットプライマーＣ１と既知領域に
相補的なプライマーＳ１を用いて、１回目のＰＣＲを行
った。次に、１回目のＰＣＲ反応液中の１μｌを用いて
２回目のＰＣＲを行い電気泳動で確認してみたところ、
上流域にはＰｓｔＩカセットをライゲーションしたも
の、下流域にはＨｉｎｄIIIカセットをライゲーション
後、ＰＣＲにより増幅したもので、それぞれ約１．４ｋ
ｂと２．２の特異的な増幅断片が観察された。しかし、
それ以外のカセットを利用してのＰＣＲでは、非特異な
増幅断片が複数みられクローン化は困難であった。（図
３）
【００２１】ｂ）上流域増幅断片および下流域増幅断片
のクローン化 はじめに、上流域増幅断片１．４ｋｂと下流域増幅断片
２．２ｋｂがｄｄｓ１遺伝子の一部であることをサザン
ハイブリダイゼーションにより確認後、クローン化に取
り掛かった。ＰＣＲ増幅断片にはＰＣＲに使用したＬＡ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの特性のため末端にＡが付
加されている。そこで、３’側にＴが１塩基突出したベ
クターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Novagen
製）に増幅断片をライゲーション後、反応液の一部をエ
レクトロポレーション法により大腸菌ＪＭ１０９に導入
した。プラスミドを抽出し、目的の上流域増幅断片１．
４ｋｂ及び下流域増幅断片２．２ｋｂの挿入されたプラ
スミドｐＨＣＡ及びｐＰＣＢを得た。（図１）
のクローン化 はじめに、上流域増幅断片１．４ｋｂと下流域増幅断片
２．２ｋｂがｄｄｓ１遺伝子の一部であることをサザン
ハイブリダイゼーションにより確認後、クローン化に取
り掛かった。ＰＣＲ増幅断片にはＰＣＲに使用したＬＡ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの特性のため末端にＡが付
加されている。そこで、３’側にＴが１塩基突出したベ
クターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Novagen
製）に増幅断片をライゲーション後、反応液の一部をエ
レクトロポレーション法により大腸菌ＪＭ１０９に導入
した。プラスミドを抽出し、目的の上流域増幅断片１．
４ｋｂ及び下流域増幅断片２．２ｋｂの挿入されたプラ
スミドｐＨＣＡ及びｐＰＣＢを得た。（図１）
【００２２】ｃ）塩基配列の決定 （上流域のシークエンス）上流域に増幅した約１．４ｋ
ｂの挿入されたプラスミドｐＨＣＡをユニバーサルプラ
イマー及びリバースプライマーを用いてシークエンス反
応後、ABI PRISMTM377 DNA Sequencerによりシークエン
スをおこなった。しかし、全領域の決定には、インサー
トＤＮＡのサイズが大きく困難であったので、サブクロ
ーン化することにした。図１に示したようにベクターの
ＳｍａＩサイトとインサートＤＮＡのＳｍａＩサイトで
消化後、その断片をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＶサイトへク
ローン化し、プラスミドｐＳＭＩを構築した。これを両
側からシークエンスすることにより、上流域増幅断片
１．４ｋｂの塩基配列を決定した。
ｂの挿入されたプラスミドｐＨＣＡをユニバーサルプラ
イマー及びリバースプライマーを用いてシークエンス反
応後、ABI PRISMTM377 DNA Sequencerによりシークエン
スをおこなった。しかし、全領域の決定には、インサー
トＤＮＡのサイズが大きく困難であったので、サブクロ
ーン化することにした。図１に示したようにベクターの
ＳｍａＩサイトとインサートＤＮＡのＳｍａＩサイトで
消化後、その断片をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＶサイトへク
ローン化し、プラスミドｐＳＭＩを構築した。これを両
側からシークエンスすることにより、上流域増幅断片
１．４ｋｂの塩基配列を決定した。
【００２３】（下流域のシークエンス）下流域増幅断片
約２．２ｋｂの挿入されたプラスミドｐＰＣＢもｐＨＣ
Ａと同様ユニバーサルプライマー及びリバースプライマ
ーを用いてシークエンスを行ったところユニバーサルプ
ライマー側がＮ末端であることが分かった。このシーク
エンスで塩基配列を確定できなかった部位をシークエン
スするため、ディレーションプラスミドを構築すること
にした。はじめに、インサートＤＮＡ中にＫｐｎＩ、Ｂ
ａｍＨＩサイトの存在しないことを確認後、ｐＰＣＢを
ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで完全消化後、Exonuclease II
IとMung bean nucleaseにより上流域が約４００ｂｐ欠
失されたプラスミドｐＰＣＢΔ３００を構築した。ライ
ゲーション後、ＤＨ１０Ｂに導入し目的の遺伝子を単
離、シークエンスした。その結果、９７８ｋｂ、３２５
アミノ酸から構成されるＯＲＦの存在が確認された。そ
の塩基配列と予想されるアミノ酸配列は図４に示した。
約２．２ｋｂの挿入されたプラスミドｐＰＣＢもｐＨＣ
Ａと同様ユニバーサルプライマー及びリバースプライマ
ーを用いてシークエンスを行ったところユニバーサルプ
ライマー側がＮ末端であることが分かった。このシーク
エンスで塩基配列を確定できなかった部位をシークエン
スするため、ディレーションプラスミドを構築すること
にした。はじめに、インサートＤＮＡ中にＫｐｎＩ、Ｂ
ａｍＨＩサイトの存在しないことを確認後、ｐＰＣＢを
ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで完全消化後、Exonuclease II
IとMung bean nucleaseにより上流域が約４００ｂｐ欠
失されたプラスミドｐＰＣＢΔ３００を構築した。ライ
ゲーション後、ＤＨ１０Ｂに導入し目的の遺伝子を単
離、シークエンスした。その結果、９７８ｋｂ、３２５
アミノ酸から構成されるＯＲＦの存在が確認された。そ
の塩基配列と予想されるアミノ酸配列は図４に示した。
【００２４】（ｄ）ホモロジー検索 ＤＮＡの遺伝子情報がｍ−ＲＮＡへ転写され蛋白質へと
翻訳される部分であるＯＲＦ（オープン リーディング
フレーム）の塩基配列から予想されるアミノ酸と他の
プレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸と高い相同性を示
し、大腸菌ＩｓｐＢ、酢酸菌Gluconobacter suboxydans
のＤｄｓ１とそれぞれ４３．６％、４１．６％の相同性
が認められた。
翻訳される部分であるＯＲＦ（オープン リーディング
フレーム）の塩基配列から予想されるアミノ酸と他の
プレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸と高い相同性を示
し、大腸菌ＩｓｐＢ、酢酸菌Gluconobacter suboxydans
のＤｄｓ１とそれぞれ４３．６％、４１．６％の相同性
が認められた。
【００２５】このことより、今回クローン化した遺伝子
は、ポリプレニル二リン酸合成酵素の構造遺伝子と考え
られ、また光合成細菌R. capsulatusはＵＱ−１０を生
合成していることからデカプレニル二リン酸合成酵素活
性を有することが予想されるので、この遺伝子をデカプ
レニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子ｄｄｓ１と
命名し、その塩基配列をＤＤＳのアミノ酸配列とともに
配列表の配列番号２及び１にそれぞれ示した。
は、ポリプレニル二リン酸合成酵素の構造遺伝子と考え
られ、また光合成細菌R. capsulatusはＵＱ−１０を生
合成していることからデカプレニル二リン酸合成酵素活
性を有することが予想されるので、この遺伝子をデカプ
レニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子ｄｄｓ１と
命名し、その塩基配列をＤＤＳのアミノ酸配列とともに
配列表の配列番号２及び１にそれぞれ示した。
【００２６】（３）大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉでのｄｄｓ１遺
伝子の発現 ａ）ｄｄｓ１遺伝子発現用プラスミドの構築 図５に示したように、ｄｄｓ１遺伝子のＯＲＦを増幅さ
せることのできる制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIサ
イトの付加されたプライマーＲｃａｐＮ，ＲｃａｐＣを
用いてＰＣＲを行った。次に増幅断片をｐＵＣ１１８の
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトへクローン化し、ｌａ
ｃＺ遺伝子の翻訳フレームに合わせて挿入されたプラス
ミドｐＲＣ１０を構築した。
伝子の発現 ａ）ｄｄｓ１遺伝子発現用プラスミドの構築 図５に示したように、ｄｄｓ１遺伝子のＯＲＦを増幅さ
せることのできる制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIサ
イトの付加されたプライマーＲｃａｐＮ，ＲｃａｐＣを
用いてＰＣＲを行った。次に増幅断片をｐＵＣ１１８の
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトへクローン化し、ｌａ
ｃＺ遺伝子の翻訳フレームに合わせて挿入されたプラス
ミドｐＲＣ１０を構築した。
【００２７】ｂ）大腸菌での発現（１） 構築したｐＲＣ１０を大腸菌ＤＨ１０Ｂに導入し、対数
増殖期に入る直前に２ｍＭの濃度になるようにＩＰＴＧ
（イソプロピル−４−チオ−β−Ｄ−ガラクトサイド）
を加えることにより誘導をかけて培養した。この大腸菌
よりＵＱを抽出し、ＴＬＣ展開後、ＨＰＬＣ分析したと
ころ、本来生合成しているＵＱ−８に加えてＵＱ−１０
のピークが確認できた。（図６）還元剤ＮａＢＨ4を添
加することにより、ＵＱ−１０を示すピークが消失する
ことからＵＱ−１０を生合成していることが確認され
た。
増殖期に入る直前に２ｍＭの濃度になるようにＩＰＴＧ
（イソプロピル−４−チオ−β−Ｄ−ガラクトサイド）
を加えることにより誘導をかけて培養した。この大腸菌
よりＵＱを抽出し、ＴＬＣ展開後、ＨＰＬＣ分析したと
ころ、本来生合成しているＵＱ−８に加えてＵＱ−１０
のピークが確認できた。（図６）還元剤ＮａＢＨ4を添
加することにより、ＵＱ−１０を示すピークが消失する
ことからＵＱ−１０を生合成していることが確認され
た。
【００２８】上記から明らかなように、R. capsulatus
由来のｄｄｓ１で形質転換した形質転換微生物である、
ｐＲＣ１０を保持させた大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Escherichi
a coli DH10B/pRC10）は、ｄｄｓ１を発現し、ＵＱ−１
０を生産することが確認され、これを、大腸菌ＤＨ１０
Ｂ／ｐＲＣ１０と命名して、工業技術院生命工学工業技
術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６０６１として国際寄託し
た。なお、ＵＱ抽出、ＴＬＣ展開、ＨＰＬＣ分析は、そ
れぞれ次のようにして行った。
由来のｄｄｓ１で形質転換した形質転換微生物である、
ｐＲＣ１０を保持させた大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Escherichi
a coli DH10B/pRC10）は、ｄｄｓ１を発現し、ＵＱ−１
０を生産することが確認され、これを、大腸菌ＤＨ１０
Ｂ／ｐＲＣ１０と命名して、工業技術院生命工学工業技
術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６０６１として国際寄託し
た。なお、ＵＱ抽出、ＴＬＣ展開、ＨＰＬＣ分析は、そ
れぞれ次のようにして行った。
【００２９】（ＵＱ抽出）培養液５０ml（酵母細胞）、
２０ml（大腸菌）を集菌後、沈澱にアセトン／メタノー
ル（７：２）を３ml加え３０秒間ソニケーションし、３
０秒間、氷中におく。以上を６回繰り返す。遠心分離
後、上清を真空乾燥させる。沈澱にクロロホルム／メタ
ノール（１：１）溶液４００μｌと等量の０．７％Ｎａ
Ｃｌ溶液を加えて撹拌する。遠心後、下層を抽出し乾燥
させ、クロロホルム／メタノール（２：１）溶液１００
μｌに懸濁する。
２０ml（大腸菌）を集菌後、沈澱にアセトン／メタノー
ル（７：２）を３ml加え３０秒間ソニケーションし、３
０秒間、氷中におく。以上を６回繰り返す。遠心分離
後、上清を真空乾燥させる。沈澱にクロロホルム／メタ
ノール（１：１）溶液４００μｌと等量の０．７％Ｎａ
Ｃｌ溶液を加えて撹拌する。遠心後、下層を抽出し乾燥
させ、クロロホルム／メタノール（２：１）溶液１００
μｌに懸濁する。
【００３０】（ＴＬＣ展開）サンプルをＴＬＣプレート
にスポットする。ベンゼン／アセトン（９３：７）溶液
で約１時間展開後、プレートにＵＶを照射しＵＱを確認
する。プレートからＵＱと思われる部分をかき取る。ク
ロロホルム／メタノール（１：１）溶液４００μｌを加
えて撹拌し、遠心分離後、上清を真空乾燥させる。１０
０％エタノール１００μｌに懸濁し、このうち２０μｌ
を分析サンプルとする。
にスポットする。ベンゼン／アセトン（９３：７）溶液
で約１時間展開後、プレートにＵＶを照射しＵＱを確認
する。プレートからＵＱと思われる部分をかき取る。ク
ロロホルム／メタノール（１：１）溶液４００μｌを加
えて撹拌し、遠心分離後、上清を真空乾燥させる。１０
０％エタノール１００μｌに懸濁し、このうち２０μｌ
を分析サンプルとする。
【００３１】（ＨＰＬＣ分析） 以下の条件で分析する。 Column；ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＣＬＣ−ＯＤＳ Eluent；１００％エタノール Flow rate；１．０ml／分 Wave length；２７５nm
【００３２】以上、プラスミドｐＲＣ１０で形質転換し
た大腸菌ＤＨ１０Ｂ（E.coli DH10B/pRC10)（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６０６１））を用いる、ＵＱ−８の生成を伴う
ＵＱ−１０の生成についての実施例について述べたが、
以下に他の実施例について述べる。
た大腸菌ＤＨ１０Ｂ（E.coli DH10B/pRC10)（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６０６１））を用いる、ＵＱ−８の生成を伴う
ＵＱ−１０の生成についての実施例について述べたが、
以下に他の実施例について述べる。
【００３３】ｃ）大腸菌での発現（２） また上記と同様にして、R. capsulatus由来のｄｄｓ１
で形質転換した形質転換微生物である、ｐＲＣ１０を保
持させた大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coliJM109/pR
C10）を培養し、ｄｄｓ１遺伝子産物の活性測定及び産
物同定を行った。
で形質転換した形質転換微生物である、ｐＲＣ１０を保
持させた大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coliJM109/pR
C10）を培養し、ｄｄｓ１遺伝子産物の活性測定及び産
物同定を行った。
【００３４】すなわち、基質として14ＣでラベルしたＩ
ＰＰ（イソペンテニル二リン酸：Amersham LIFESCIENCE
社）とＦＰＰ（ファルネシル二リン酸）を使用し、遺伝
子を発現させた大腸菌からの粗酵素（０．０５mg prote
in）３０℃で２時間反応させた後、ブタノールで抽出し
たポリプレニル二リン酸を加水分解後、ポリプレノール
の状態でＴＬＣ展開した。その結果、図７に示すように
ｐＲＣ１０を保持させたＪＭ１０９において（２レー
ン）デカプレノールが検出された。これらの結果から、
我々が得たｄｄｓ１遺伝子はＵＱ−１０合成に必要な側
鎖のデカプレニル二リン酸合成を担う遺伝子であること
が明かとなり、ｄｄｓ１遺伝子を大腸菌内で発現させて
やることでＵＱ−１０生成が可能であることが証明され
た。
ＰＰ（イソペンテニル二リン酸：Amersham LIFESCIENCE
社）とＦＰＰ（ファルネシル二リン酸）を使用し、遺伝
子を発現させた大腸菌からの粗酵素（０．０５mg prote
in）３０℃で２時間反応させた後、ブタノールで抽出し
たポリプレニル二リン酸を加水分解後、ポリプレノール
の状態でＴＬＣ展開した。その結果、図７に示すように
ｐＲＣ１０を保持させたＪＭ１０９において（２レー
ン）デカプレノールが検出された。これらの結果から、
我々が得たｄｄｓ１遺伝子はＵＱ−１０合成に必要な側
鎖のデカプレニル二リン酸合成を担う遺伝子であること
が明かとなり、ｄｄｓ１遺伝子を大腸菌内で発現させて
やることでＵＱ−１０生成が可能であることが証明され
た。
【００３５】なお、図面から明らかなように、１レーン
はコントロールのＪＭ１０９であるが、この場合オクタ
プレノールが検出されている。これに対して、２レーン
（遺伝子発現レーン）では、オクタプレノールに加え
て、ソラネソール、デカプレノールの生成が確認され、
これらの結果から、ｄｄｓ１はソラネシル、デカプレニ
ル二リン酸合成酵素の構造遺伝子であることが明かにな
った。
はコントロールのＪＭ１０９であるが、この場合オクタ
プレノールが検出されている。これに対して、２レーン
（遺伝子発現レーン）では、オクタプレノールに加え
て、ソラネソール、デカプレノールの生成が確認され、
これらの結果から、ｄｄｓ１はソラネシル、デカプレニ
ル二リン酸合成酵素の構造遺伝子であることが明かにな
った。
【００３６】次いで、ｄｄｓ１を発現させたＪＭ１０９
からＵＱを抽出し、ＨＰＬＣ分析したところ、本来生合
成しているＵＱ−８に加えて、ＵＱ−９及びＵＱ−１０
のピークが確認できた（図８）。これに対して、コント
ロールのＪＭ１０９はＵＱ−８のみを生成しており、こ
れらの結果から、プラスミドｐＲＣ１０で形質転換した
大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109/pRC10）に
よるＵＱ−１０の生産が確認された。換言すれば、ｄｄ
ｓ１がＤＤＳの構造遺伝子であり、しかも異種の微生物
で発現することが確認された。
からＵＱを抽出し、ＨＰＬＣ分析したところ、本来生合
成しているＵＱ−８に加えて、ＵＱ−９及びＵＱ−１０
のピークが確認できた（図８）。これに対して、コント
ロールのＪＭ１０９はＵＱ−８のみを生成しており、こ
れらの結果から、プラスミドｐＲＣ１０で形質転換した
大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109/pRC10）に
よるＵＱ−１０の生産が確認された。換言すれば、ｄｄ
ｓ１がＤＤＳの構造遺伝子であり、しかも異種の微生物
で発現することが確認された。
【００３７】（４）Ｄｄｓ１による大腸菌ｉｓｐＢ欠損
株ＫＯ２２９（ΔｉｓｐＢ：ＣＡＴ）の変異の相補試験 大腸菌ＫＯ２２９は染色体上のオクタプレニル二リン酸
合成酵素をコードしているｉｓｐＢ遺伝子をＣＡＴ（Ch
loramphenicol Acetyl Transferase）をコードする遺伝
子の挿入により破壊された株であるため、ＵＱ−８を生
合成することはできず、また、このままでは生育不能と
なるためｉｓｐＢ遺伝子を持つプラスミドｐＫＡ３を導
入することにより変異を相補している。
株ＫＯ２２９（ΔｉｓｐＢ：ＣＡＴ）の変異の相補試験 大腸菌ＫＯ２２９は染色体上のオクタプレニル二リン酸
合成酵素をコードしているｉｓｐＢ遺伝子をＣＡＴ（Ch
loramphenicol Acetyl Transferase）をコードする遺伝
子の挿入により破壊された株であるため、ＵＱ−８を生
合成することはできず、また、このままでは生育不能と
なるためｉｓｐＢ遺伝子を持つプラスミドｐＫＡ３を導
入することにより変異を相補している。
【００３８】一般に、生育に必要でないプラスミドは分
裂時、娘細胞に分離されずに、プラスミドを欠落するが
ＫＯ２２９の有するｐＫＡ３（スペクチノマイシン耐性
遺伝子を持つ）は変異を相補し、生育するために必須で
あるため、スペクチノマイシンの存在しない非選択培地
による数回の継代培養においてもｐＫＡ３を欠落させる
ことはできない。そこで大腸菌のＩｓｐＢの機能をin v
ivoにおいて、Ｄｄｓ１タンパク質で代用できるならｉ
ｓｐＢ遺伝子の挿入されたｐＫＡ３を欠落させることが
可能ではないかと考えプラスミド欠落実験を行った。
裂時、娘細胞に分離されずに、プラスミドを欠落するが
ＫＯ２２９の有するｐＫＡ３（スペクチノマイシン耐性
遺伝子を持つ）は変異を相補し、生育するために必須で
あるため、スペクチノマイシンの存在しない非選択培地
による数回の継代培養においてもｐＫＡ３を欠落させる
ことはできない。そこで大腸菌のＩｓｐＢの機能をin v
ivoにおいて、Ｄｄｓ１タンパク質で代用できるならｉ
ｓｐＢ遺伝子の挿入されたｐＫＡ３を欠落させることが
可能ではないかと考えプラスミド欠落実験を行った。
【００３９】すなわち、ＫＯ２２９にｐＲＣ１０を導入
後、非選択培地（Ｃｍ＋Ａｍｐ）で数回継代培養した。
スペクチノマイシンを含まない非選択プレートでコロニ
ーを形成させ、非選択及び選択プレート（Ｃｍ＋Ｓｐ
ｃ）にレプリカし、ｐＫＡ３の選択マーカーであるスペ
クチノマイシンに感受性を示す、つまりプラスミドを欠
落したと思われる株をいくつか得ることができた。その
うちのスペクチノマイシンに感受性を示す株からＵＱを
抽出し、ＨＰＬＣ分析したところ、図９のようにＤｄｓ
１タンパク質により供給されたと思われる長さのイソプ
レノイド鎖を有するＵＱ−９、ＵＱ−１０のピークが観
察された。このことはＩｓｐＢタンパク質の代わりにＤ
ｄｓ１タンパク質で変異を相補することができた為にプ
ラスミドｐＫＡ３を欠落させることに成功した。
後、非選択培地（Ｃｍ＋Ａｍｐ）で数回継代培養した。
スペクチノマイシンを含まない非選択プレートでコロニ
ーを形成させ、非選択及び選択プレート（Ｃｍ＋Ｓｐ
ｃ）にレプリカし、ｐＫＡ３の選択マーカーであるスペ
クチノマイシンに感受性を示す、つまりプラスミドを欠
落したと思われる株をいくつか得ることができた。その
うちのスペクチノマイシンに感受性を示す株からＵＱを
抽出し、ＨＰＬＣ分析したところ、図９のようにＤｄｓ
１タンパク質により供給されたと思われる長さのイソプ
レノイド鎖を有するＵＱ−９、ＵＱ−１０のピークが観
察された。このことはＩｓｐＢタンパク質の代わりにＤ
ｄｓ１タンパク質で変異を相補することができた為にプ
ラスミドｐＫＡ３を欠落させることに成功した。
【００４０】このようにして相補が確認された菌株を、
その有用性に鑑み、大腸菌ＫＯ２２９／ｐＲＣ１０と命
名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−６０６２として国際寄託した。本菌株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６０６２）を上記にしたがってＵＱ抽出し、得
られた結果を図１０に示した。その結果から明らかなよ
うに、ＵＱ−１０の生成が確認された。
その有用性に鑑み、大腸菌ＫＯ２２９／ｐＲＣ１０と命
名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−６０６２として国際寄託した。本菌株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６０６２）を上記にしたがってＵＱ抽出し、得
られた結果を図１０に示した。その結果から明らかなよ
うに、ＵＱ−１０の生成が確認された。
【００４１】
【発明の効果】本発明によって、各種の光合成細菌、例
えばRhodobacter capsulatus由来のデカプレニル二リン
酸合成酵素の構成遺伝子を単離し、その配列決定に成功
しただけでなく、大腸菌で発現させることにはじめて成
功した。
えばRhodobacter capsulatus由来のデカプレニル二リン
酸合成酵素の構成遺伝子を単離し、その配列決定に成功
しただけでなく、大腸菌で発現させることにはじめて成
功した。
【００４２】その結果、ＵＱ−８、ＵＱ−９の生産のほ
か、ＵＱ−１０の大腸菌による生産がはじめて可能にな
っただけでなく、ｉｓｐＢ遺伝子欠損株を用いることに
より、ＵＱ−８の生産を抑制してＵＱ−１０を選択的に
高純度、大量生産することも期待できる。なお、本発明
において使用した微生物である、R. capsulatus、E. co
li DH10B、E. coli JM109、E. coli KO229等は、文献に
記載され、市販されており、自由に入手することがで
き、また、島根大学松田研究室より分譲を受けることも
可能である。
か、ＵＱ−１０の大腸菌による生産がはじめて可能にな
っただけでなく、ｉｓｐＢ遺伝子欠損株を用いることに
より、ＵＱ−８の生産を抑制してＵＱ−１０を選択的に
高純度、大量生産することも期待できる。なお、本発明
において使用した微生物である、R. capsulatus、E. co
li DH10B、E. coli JM109、E. coli KO229等は、文献に
記載され、市販されており、自由に入手することがで
き、また、島根大学松田研究室より分譲を受けることも
可能である。
【００４３】
【配列表】本発明に係るＤＤＳのアミノ酸配列（３２５
アミノ酸）を配列番号１に示し、それをコードする遺伝
子（ｄｄｓ１）の塩基配列（９７８ｂｐ）を配列番号２
に示し、各番号をそれぞれ下記表１、表２及び表３、表
４に示す。
アミノ酸）を配列番号１に示し、それをコードする遺伝
子（ｄｄｓ１）の塩基配列（９７８ｂｐ）を配列番号２
に示し、各番号をそれぞれ下記表１、表２及び表３、表
４に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
【表４】
【図１】構築したプラスミドの制限酵素地図を示す。
【図２】ＰＣＲ反応用の特定プライマーＳ１及びＳ２の
デザインを示す。
デザインを示す。
【図３】カセット及びカセットプライマーを利用したＰ
ＣＲによるゲノムウォーキングを示す。
ＣＲによるゲノムウォーキングを示す。
【図４】R. capsulatus由来のＤＤＳをコードする遺伝
子（ｄｄｓ１）を含む塩基配列及びそれから予想される
アミノ酸配列を示す。停止コドンはアステリスクで示さ
れている。
子（ｄｄｓ１）を含む塩基配列及びそれから予想される
アミノ酸配列を示す。停止コドンはアステリスクで示さ
れている。
【図５】ｄｄｓ１遺伝子発現用プラスミドｐＲＣ１０の
構築図である。
構築図である。
【図６】大腸菌ＤＨ１０Ｂ／ｐＲＣ１０培養物から抽出
したＵＱのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
したＵＱのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７】大腸菌ＪＭ１０９／ｐＲＣ１０産物の薄層クロ
マトグラムを示す。
マトグラムを示す。
【図８】大腸菌ＪＭ１０９／ｐＲＣ１０培養物から抽出
したＵＱのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
したＵＱのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図９】ｐＫＡ３欠落株からのＵＱのＨＰＬＣクロマト
グラムを示す。
グラムを示す。
【図１０】大腸菌ＫＯ２２９／ｐＲＣ１０培養物から抽
出したＵＱのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
出したＵＱのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/66 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 朱 旭芬 島根県松江市菅田町167−23 金田アパー ト２−２ (72)発明者 岡田 憲典 島根県松江市西川津町298−７ ル・シエ ール・ヴァロン105 (72)発明者 神谷 康裕 大阪府堺市三原台２−７−１ 泉北丘陵宿 舎７−１−542
Claims (11)
- 【請求項１】 光合成細菌、例えばRhodobacter capsul
atus由来のデカプレニル二リン酸合成酵素（ＤＤＳ）を
コードする遺伝子で形質転換してなる形質転換微生物。 - 【請求項２】 オクタプレニル二リン酸合成酵素（ＯＰ
Ｓ）をコードする遺伝子は破壊しておくことを特徴とす
る請求項１に記載の形質転換微生物。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示
されるＤＤＳをコードする遺伝子のＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号２の塩基配列で示される、請求
項３に記載のＤＤＳをコードする遺伝子（ｄｄｓ１遺伝
子）のＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号２の塩基配列で示され、配列番
号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡを含有
してなる遺伝子のＤＮＡ。 - 【請求項６】 ＤＤＳをコードする遺伝子のＤＮＡを組
み込んでなるプラスミド。 - 【請求項７】 請求項３〜５のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡをベクターｐＵＣ１８に挿入してなる発現プラスミ
ドｐＲＣ１０。 - 【請求項８】 請求項６又は７に記載のプラスミドで形
質転換してなる形質転換微生物。 - 【請求項９】 形質転換微生物が、大腸菌ＤＨ１０Ｂ／
ｐＲＣ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６１）、大腸菌ＫＯ
２２９／ｐＲＣ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６２）又は
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＲＣ１０である、請求項８に記載
の形質転換微生物。 - 【請求項１０】 請求項１、２、８又は９に記載の形質
転換微生物を培養することを特徴とするユビキノン−１
０の生成方法。 - 【請求項１１】 大腸菌ＤＨ１０Ｂ／ｐＲＣ１０、大腸
菌ＫＯ２２９／ｐＲＣ１０又は大腸菌ＪＭ１０９／ｐＲ
Ｃ１０を培養することを特徴とする高純度ユビキノン−
１０の生成方法。
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| JP9244811A JPH1156372A (ja) | 1997-08-27 | 1997-08-27 | ユビキノン−１０の生成方法 |
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