DE102004041717A1

DE102004041717A1 - Restriktions-Modifikationssystem von Bacillus licheniformis und darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren

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Publication number: DE102004041717A1
Application number: DE200410041717
Authority: DE
Inventors: Stefan Evers; Cornelius Dr. Bessler; Jörg Dr. Feesche; Karl-Heinz Dr. Maurer; Armin Dr. Ehrenreich; Birgit Veith; Heiko Dr. Liesegang; Anke Dr. Henne; Christina Herzberg; Gerhard Prof. Gottschalk
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2004-08-28
Filing date: 2004-08-28
Publication date: 2006-03-16

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft neun neue Gene und deren Genprodukte von Bacillus licheniformis und hinreichend ähnliche Gene und Proteine, die in vivo am Restriktions-Modifikationssystem beteiligt sind. Dabei handelt es sich um die Gene hsdlS2, hsdlM, hsdlS1, hsdlR, rmlA, hsdllR, hsdllS, hsdX und hsdllM beziehungsweise die durch sie codierten Proteine. Diese Gene sind auf dem Chromosom von B. licheniformis in zwei zusammenhängenden Gruppen angeordnet, wobei jeweils die Gene mit der Bezeichnung I und rmlA im R/M-Locus I zusammenliegen und in umgekehrter Orientierung an anderer Stelle im Chromosom die Gene mit der Bezeichnung II zusammen mit hsdX als R/M-Locus II. Sie können zur Verbesserung biotechnologischer Produktionsverfahren durch Mikroorganismen genutzt werden, indem sie funktionell inaktiviert werden. Zudem stehen diese Gene und Proteine für eine positive Nutzung zur Verfügung, das heißt entsprechend ihrer jeweiligen biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neun neue Gene und deren Genprodukte von Bacillus licheniformis und hinreichend ähnliche Gene und Proteine, die in vivo am Restriktions-Modifikationssystem beteiligt sind und für entspechende Reaktionen wie die Transformation von Mikroorganismen genutzt werden können, darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren durch Mikroorganismen, die durch eine Inaktivierung dieser Gene gekennzeichnet sind, sowie eine positive Nutzung der betreffenden Gene und Proteine.
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere der Herstellung von Wertstoffen durch Fermentation von Mikroorganismen, die zur Bildung der interessierenden Wertstoffe in der Lage sind. Hierzu zählen beispielsweise die Herstellung niedermolekularer Verbindungen, etwa von Nahrungsmittelergänzungsstoffen oder pharmazeutisch relevanten Verbindungen, oder von Proteinen, für welche aufgrund ihrer Diversität wiederum ein großes technisches Einsatzgebiet besteht. Im ersten Fall werden die Stoffwechseleigenschaften der betreffenden Mikroorganismen zur Herstellung der Wertstoffe ausgenutzt und/oder verändert; im zweiten Fall werden Zellen eingesetzt, die die Gene der interessierenden Proteine exprimieren. In beiden Fällen handelt es sich zumeist also um gentechnisch veränderte Organismen (GVO).

Zur Fermentation von Mikroorganismen besteht ein reichhaltiger Stand der Technik, insbesondere auch im großtechnischen Maßstab; er reicht von der Optimierung der betreffenden Stämme hinsichtlich der Bildungsrate und der Nährstoffausnutzung über die technische Gestaltung der Fermenter bis hin zur Gewinnnung der Wertstoffe aus den betreffenden Zellen selbst und/oder dem Fermentationsmedium. Hierfür kommen sowohl genetische und mikrobiologische als auch verfahrenstechnische und biochemische Ansätze zu tragen. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diesen Prozeß zu verbessern, und zwar auf der Ebene der genetischen Eigenschaften der eingesetzten Stämme.

Für die großtechnische, biotechnologische Produktion werden die betreffenden Mikroorganismen zumeist in Fermentern kultiviert, die ihren Stoffwechseleigenschaften entsprechend ausgelegt sind. Während der Kultivierung verstoffwechseln sie das angebotene Substrat und bilden neben dem eigentlichen Produkt üblicherweise eine Vielzahl weiterer Substanzen, an denen in der Regel kein Interesse besteht. Auch hierauf wirkt sich die vorliegende Erfindung in günstiger Weise aus.

Es ist seit langem bekannt, daß Mikroorganismen in vivo insbesondere zum Schutz vor viralen Infektionen über das sogenannte Restriktions-Modifikationssystem verfügen. Es ermöglicht ihnen, eigene von fremder DNA zu unterscheiden und die als fremd erkannte DNA abzubauen. Diese Systeme sind insbesondere für Bakterien eingehend beschrieben.

Wesentliche Bestandteile des Restriktions-Modifikationssystems sind DNA-Methylasen, die Methylgruppen auf Cytosin und Adenin übertragen und auf diese Weise die zelleigene DNA markieren. Weitere Bestandteile dieses Systems sind Restriktionsendonukleasen (E.C. 3.1.23.-), die art- und enzymspezifische, meist palindromische DNA-Sequenzen erkennen und daraufhin hydrolysieren. Hierbei werden drei Typen unterschieden: Typ-I-Enzyme spalten nichtmethylierte DNA an zufälligen Stellen, die 1 kb oder mehr von der Erkennungssequenz entfernt liegen; Typ-II-Restriktionsendonukleasen erkennen eine DNA-Sequenz aus vier oder sechs Basenpaaren und schneiden den DNA-Strang in dieser Region, während Typ-III-Enzyme die DNA ungefähr 25 Basenpaare vom Erkennungsort schneiden. Auch die Enzyme dieser beiden Typen hydrolysieren jeweils nur nichtmethylierte DNA. Die Typ-II-Restriktionsendonukleasen sind dabei von herausragender kommerzieller Bedeutung.

Bei den Typ-I-Systemen sind, wie allgemein bekannt ist, die Methylase und die Nuklease mit einem Komplex assoziiert, der drei verschiedene Polypeptidketten enthält: eine R-Kette mit Restriktions-Aktivität, eine M-Kette mit Methylase-Aktivität und eine S-Kette mit einer Erkennungsstelle für die jeweilige DNA-Sequenz. Sie benötigen S-Adenosyl-L-Methionin und ATP für die Restriktions- und die Methylase-Aktivität. Auch die Enzyme der Typ-III-Systeme sind in Komplexen aus mehreren Untereinheiten vereint. In Typ-II-Systemen liegen die Methylasen und Restriktionsenzyme getrennt vor; Adenosyl-L-Methionin dient als Methyldonor, nimmt an der DNA-Spaltung aber nicht teil. Typ-II-Systeme benötigen kein ATP.

Die wirtskontrollierte DNA-Restriktion beruht demnach auf der Wirkung von Nukleasen, die jegliche DNA degradieren, welche nicht zum Schutz vor den Nukleasen der Wirtszelle spezifisch modifiziert ist. Das Restriktions-Modifikationssystem dient somit dem Schutz der Bakterien vor fremder DNA. Der Reaktionsmechanismus der DNA-Methyltransferasen und ihre Rolle bei der Erzeugung eines epigenetischen Codes werden beispielsweise in der Publikation „Beyond Watson and Crick: DNA Methylation and Molecular Enzymology of DNA Methyltransferases" von A. Jeltsch (2002) in ChemBioChem, Band 3, Seiten 274 – 293 beschrieben.

Die Herstellung gentechnisch modifizierter Stämme zur biotechnologischen Produktion ist, wie bereits gesagt, im Stand der Technik etabliert. Hierfür wird die für die Bildung des Wertstoffs nötige genetische Information in Form von DNA in den als Produzent oder Zwischenwirt vorgesehenen Wirtsorganismus übertragen, das heißt mit geeigneten Methoden transformiert. Dieser wehrt sich gegen die fremde DNA insbesondere jedoch mithilfe seines Restriktions-Modifikationssystems, so daß Transformationen nur zu einem gewissen Prozentsatz erfolgreich sind, nämlich in dem Maße, indem die artifiziell zugesetzte DNA diesem Mechanismus entgeht. Die Herstellung eines Produktionsstamms für die Biotechnologie durch Transformation mit fremder DNA wird also durch das Vorhandensein von Restriktions-Modifikationssystemen in erheblicher Weise negativ beeinflußt.

Im weiteren Verlauf der Produktion, das heißt wenn die Transformation erfolgreich gewesen ist, wird ein aktives Restriktions-Modifikationssystems nicht benötigt. Denn die Produktion des Wertstoffs erfolgt in der Regel unter kontrollierten und zumeist auch sterilen Bedingungen, so daß sich die betreffenden Zellen nicht gegen fremde DNA schützen müssen. Unter diesen Bedingungen stellt die Bildung von Restriktions- und von Modifikationsenzymen einen nicht notwendigen Verbrauch von Ressourcen dar. Umgekehrt sollte die Inaktivierung dieses Systems zu einem besseren Ausschöpfen der vorgelegten Rohstoffe, insbesondere der N-Quellen, führen und die Gesamtausbeute der betreffenden biotechnologischen Produktion erhöhen.

Es erscheint also wünschenswert, biotechnologisch relevante Mikroorganismenstämme, insbesondere Bakterienstämme zu erhalten, die für die Fremd-DNA eine verbesserte genetische Zugänglichkeit aufweisen, um erwünschte Transformanten in besserer Ausbeute gewinnen zu können.

Es stellte sich somit die Aufgabe, die Aktivität bakterieller Systeme zum Schutz gegen artfremde DNA in biotechnologisch relevanten Spezies, insbesondere in Produktionsstämmen für die Biotechnologie zu verringern. Insbesondere sollte eine Lösung gefunden werden, die eine ursächliche Inaktivierung darstellt.

Damit war als Teilaufgabe die Identifizierung der zugehörigen codierenden DNA-Abschnitte verbunden, insbesondere bei Vertretern der biotechnologisch besonders relevanten Gattung Bacillus und hierunter insbesondere der Spezies B. licheniformis.

Sollte es in einer Spezies mehr als ein System geben, so erschien es vorteilhaft, die Inaktivierung auch auf mehrere dieser Systeme auszudehnen.

Einen weiteren Aspekt dieser Aufgabe bildet die Bereitstellung der betreffenden Gene für deren positive Nutzung, etwa im Zusammenhang mit biochemischen Reaktionsansätzen und der zugehörigen regulatorischen Elemente, etwa der Promotoren, um hierüber die Expression, auch von anderen Genen steuern zu können.

Zur Lösung dieser Aufgabe wurde ein molekularbiologischer Ansatz gewählt. Als Angriffspunkt stellte sich unerwarteterweise das Restriktions-Modifikationssystem als geeignet heraus.

Diese Aufgabe wird durch jedes der im Sequenzprotokoll angegebenen neun für B. licheniformis gefundenen Proteine, einschließlich der jeweils hinreichend homologen Proteine gelöst; weitere eigenständige Lösungen der Aufgabe stellen die zugehörigen Nukleinsäuren dar, ebenfalls einschließlich der jeweils hinreichend homologen Nukleinsäuren. Die jeweiligen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen sind vollständig im Sequenzprotokoll (Sequence Listing) der vorliegenden Anmeldung angegeben. Sie können aufgrund ihrer chromosomalen Anordnung in B. licheniformis zwei Gruppen zugeordnet werden: hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR und rmIA, einerseits und hsdIIR, hsdIIS, hsdX und hsdIIM andererseits. Sie werden erfindungsgemäß als R/M-Locus I beziehungsweise R/M-Locus II bezeichnet. Die jeweiligen Funktionen werden ebenfalls weiter unten ausgeführt (vergleiche auch Tabelle 2 in Beispiel 3).

Weitere Lösungen dieser Aufgabe stellen zusammenhängende chromosomale Abschnitte mit mehreren dieser Gene, Vektoren mit den zugehörigen Nukleinsäureabschnitten, Zellen und Verfahren zur Produktion dieser Proteine dar. Hinzu kommen die Verwendungsmöglichkeiten der nicht-proteincodierenden Abschnitte, insbesondere als Promotoren.

Durch die vorliegende Erfindung sind somit die jeweiligen Typ-I-Restriktions-Modifikationssysteme auf molekularer Ebene zugänglich und damit kontrollierbar.

Mithilfe dieser genetischen Informationen können nun Verfahren zur Fermentation von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien und ganz besonders von grampositiven Bakterien der Spezies Bacillus etabliert werden, in denen einzelne oder mehrere dieser Gene oder sogar beide Gruppen von Genen funktionell inaktiviert sind. Dadurch werden die Zellen daran gehindert, fremde DNA abzubauen, wodurch die Effizienz der Transformation mit derjenigen DNA, die für den jeweiligen Produktionsprozeß benötigt wird, erhöht wird. Die betreffenden Stämme erhalten also eine verbesserte genetische Zugänglichkeit. Die Inaktivierung beeinträchtigt zudem nicht erheblich die Lebensfähigkeit der betreffenden Stämme bei der biotechnologischen Fermentation. Als Vorteil ist anzusehen, daß ein Großteil der eingesetzten Rohstoffe, etwa der N-Quelle, nicht in ein nicht interessierendes und unter den herrschenden Bedingungen nicht notwendiges Genprodukt umgewandelt wird, so daß in Stämmen mit diesen funktionellen Inaktivierungen insgesamt eine höhere Fermentationsausbeute zu erwarten ist, weil die vorgegebenen Ressourcen besser ausgenutzt werden.

Dem genannten Teilaspekt der Aufgabe zur Erschließung von solchen essentiellen Proteinen, für die aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften selbst technische Anwendungsmöglichkeiten bestehen, wird ebenfalls entsprochen. Die zugehörigen Proteine können nun über die erfindungsgemäß zur Verfügung gestellten Nukleotidsequenzen gezielt produziert werden und stehen damit den betreffenden technischen Anwendungsmöglichkeiten zur Verfügung. Ferner können die betreffenden Nukleinsäuren zur Identifizierung verwandter Gene oder aller natürlicherweise mit ihnen verbundenen Regulationselemente verwendet werden.

Wie in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, konnten über eine Sequenzierung der genomischen DNA von B. licheniformis DSM 13, dem von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) erhältlichen Referenzstamm für diese Spezies neun neue Gene identifiziert werden, die die gestellte Aufgabe erfüllen.

Die hierzu im Stand der Technik bekannten jeweils nächstähnlichen Gene und zugehörigen Proteine weisen die in Beispiel 3 (Tabelle 1) zur vorliegenden Anmeldung angegebenen Sequenzhomologien auf. Hierüber definiert sich der mit der vorliegenden Anmeldung jeweils abgedeckte Schutzbereich. Dementsprechend stellen alle folgenden Nukleinsäuren und Proteine, einschließlich ihrer jeweils angegebenen Homologiebereiche prinzipiell gleichwertige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar, wobei ein zunehmender Grad an Homologie (angegeben in Prozent Identität) jeweils zunehmend bevorzugt ist:

– Eine Nukleinsäure hsdIS2, codierend für eine Spezifitäts-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 91% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Spezifitäts-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIS2), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 86% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Nukleinsäure hsdIM, codierend für eine Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 83% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIM), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 87% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Nukleinsäure hsdIS1, codierend für ein Spezifitäts-Protein eines Restriktions-Enzyms des Typs I (E.C. 3.1.21.3), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 5 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 62% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– ein Spezifitäts-Protein eines Restriktions-Enzyms des Typs I (E.C. 3.1.21.3; HsdIS1), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 40% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Nukleinsäure hsdIR, codierend für eine Helicase-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 7 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 76% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Helicase-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIR), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 8 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 78% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Nukleinsäure rmIA, codierend für ein 5-Methylcytosin-spezifisches Restriktionsenzym A (E.C. 3.1.21.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 9 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 43% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– ein 5-Methylcytosin-spezifisches Restriktionsenzym A (E.C. 3.1.21.-; RmIA), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 10 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 34% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Nukleinsäure hsdIIR, codierend für eine Restriktionskette eines Restriktions-Enzyms des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 11 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 56% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Restriktionskette eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIIR), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 39% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Nukleinsäure hsdIIS, codierend für eine HsdS-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 13 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 53% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine HsdS-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIIS), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 14 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 33% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Nukleinsäure hsdX, codierend für ein DNA-bindendes Protein mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 15 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– ein DNA-bindendes Protein HsdX mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 16 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 51% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Nukleinsäure hsdIIM, codierend für eine Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 17 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
– eine Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIIM), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 18 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 55% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.

In den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung ist dargestellt, wie die insgesamt neun genannten Nukleinsäuren (weil proteincodierend auch als „Gene" bezeichnet) ursprünglich aus Bacillus licheniformis DSM13 identifiziert werden konnten. Hiermit erklärt sich die jeweils am stärksten bevorzugte 100%ige Identität zu den im Sequenzprotokoll jeweils angegebenen Sequenzen. Ausschlaggebend für die Bestimmung der Identität mit bekannten Enzymen ist ein Alignment, wie es für die gefundenen Gene und Proteine in den 1 bis 18 jeweils mit den nächstähnlichen Vertretern des Stands der Technik dargestellt ist. Für die Erstellung eines Alignments wie für die darauf aufbauende Berechnung des Homologiewerts, angegeben in Prozent Identität, stehen kommerziell erhältliche Computerprogramme zur Verfügung. In Beispiel 3 wurde hierfür das Computerprogramm Vector NTI^® Suite Version 7, verwendet, welches von der Firma Informax Inc., Bethesda, USA (beziehungsweise der Firma Invitrogen, Carsbad, Kalifornien, USA), erhältlich ist; die gewählten Randbedingungen sind ebenfalls in Beispiel 3 angegeben.

Die biochemischen Funktionen der gefundenen Proteine konnten, wie ebenfalls in Beispiel 3 erläutert ist, anhand der Homologien zu den im Stand der Technik beschriebenen nächstähnlichen Gene beziehungsweise Enzyme zweifelsfrei ermittelt werden.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuren und Proteine können nun insbesondere anhand der im Sequenzprotokoll dargestellten Sequenzen erhalten werden. Die Gewinnung der in die jeweiligen Homologiebereiche fallenden Nukleinsäuren und Proteine ist im Prinzip in den Beispielen beschrieben und dem Fachmann anhand allgemein bekannter Methoden möglich. Hierzu gehört neben der möglichen Vollsynthese insbesondere die Möglichkeit, über PCR die jeweiligen Sequenzen zu amplifizieren. Dies erfolgt gegebenenfalls anhand einer aus einem natürlichen Bakterien-, insbesondere Bacillus-Stamm präparierten genomischen DNA als Matrize wobei die PCR umso erfolgreicher sein sollte, je enger die ausgewählten Stämme mit B. licheniformis DSM 13 verwandt sind, weil damit eine zunehmende Sequenzübereinstimmung auch innerhalb der Primer-Bindungsregionen einhergehen dürfte.

Alternativ dazu können die im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuren auch als DNA-Sonden eingesetzt werden, um die jeweiligen homologen Gene in Präparationen genomischer DNA anderer Spezies nachzuweisen. Das Vorgehen hierzu ist ebenfalls an sich bekannt; ebenso wie die Isolierung der auf diese Weise erhaltenen Gene, deren Klonierung, deren Expression und Gewinnung der zugehörigen Proteine. Insbesondere ist dabei an solche Arbeitsschritte gedacht, wie sie in Beispiel 2 für B. licheniformis selbst dargestellt sind.

Im Falle der exakten im Sequenzprotokoll dargestellten Sequenzen kann der Stamm B. licheniformis DSM13 von Stammsammlungen wie der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) bezogen werden. Das erhaltene Fragment kann beispielsweise in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert und durch einen Wirtsstamm gebildet werden, so daß das zugehörige Protein in prinzipiell beliebigen Mengen zur Verfügung steht. Abweichende Aminosäuren können aufgrund der Universalität des genetischen Codes durch Variation der in die Klonierung eingebrachten DNA eingeführt werden.

Unter den bisher genannten erfindungsgemäßen, unter Verweis auf SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 definierten, an Restriktions-Modifikationssystemen beteiligten Proteinen ist jeweils solch eines bevorzugt, welches natürlicherweise von einem Mikroorganismus gebildet wird, vorzugsweise von einem Bakterium, besonders bevorzugt von einem grampositiven Bakterium, hierunter bevorzugt von einem der Gattung Bacillus, hierunter besonders bevorzugt von einem der Spezies B. licheniformis und hierunter ganz besonders bevorzugt von B. licheniformis DSM13.

Denn prinzipiell verfügen alle Mikroorganismen über Restriktions-Modifikationssysteme zum Schutz gegen speziesfremde DNA. Es ist, wie soeben beschrieben, gegenüber der Neusynthese vergleichsweise einfach möglich, die betreffenden Proteine aus natürlichen Spezies, insbesondere Mikroorganismen zu erhalten. Hierunter sind in Hinblick auf die gestellte Aufgabe zunehmend diejenigen bevorzugt, die sich fermentieren lassen und die in großtechnischen Fermentationen tatsächlich eingesetzt werden. Dazu zählen besonders Vertreter der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterium und Bacillus. Hierunter sind beispielsweise S. carnosus und C. glutamicum zu nennen, sowie B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. lentus, B. globigi und B. alkalophilus. Am meisten ist B. licheniformis DSM13 bevorzugt, weil aus diesem exakt die im Sequenzprotokoll aufgelisteten Sequenzen erhalten werden konnten.

Insbesondere bei diesen fermentierbaren und deshalb eine erhebliche wirtschaftliche Bedeutung besitzenden Mikroorganismen stellte sich die Aufgabe, die Fermentation durch solche Selektionssysteme zu verbessern, die die eingangs dargestellten Vorteile aufweisen. Zum anderen sollte dies, wenn hierfür die zugehörigen Nukleinsäuren verwendet werden, umso erfolgreicher sein, je enger die betreffenden Gene und/oder Genpro dukte mit den im Sequenzprotokoll angegebenen verwandt sind. Je höher die Verwandtschaft ist, desto eher sollten die betreffenden Genprodukte auch dieselben biochemischen Eigenschaften wie die oben genannten Enzyme und Proteinfaktoren besitzen, beispielswiese hinsichtlich der Temperatur- oder pH-Optima. Dies ist wichtig, wenn an ebendiesen Aktivitäten ein Interesse besteht, beispielsweise für In-vitro-Reaktionsansätze (siehe unten), für die diese Enzyme und Faktoren bereitgestellt werden sollen.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen Nukleinsäuren dar, die die proteincodierenden Abschnitte der vier Nukleinsäuren (Gene) hsdIS2, hsdIM, hsdIS1 und hsdIR umfassen, wie sie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, und 7 definiert worden sind.

Bei den genannten Nukleinsäuren handelt es sich, wie oben erläutert, um proteincodierende Abschnitte, so daß sie ihrer Funktion nach auch als Gene bezeichnet werden können. (Üblicherweise umfaßt der Begriff des Gens den proteincodierenden Bereich zusammen mit benachbarten regulatorischen Elementen. Diese benachbarten Elemente werden über die Formulierung der hierzu „unmittelbar benachbarten Bereiche" weiter unten in den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung aufgenommen.) Alle diese dem Typ I von Restriktions-Modifikationssystemen angehörenden Enzyme bilden, wie aufgrund ihrer gemeinsamen Lokalisation auf dem Chromosom von B. licheniformis DSM13 (SEQ ID NO. 19) vermutet werden kann, ein zusammenwirkendes Restriktions-Modifikationssystem, welches (zusammen mit rmIA) erfindungsgemäß als R/M-Locus I bezeichnet worden ist. Man kann vermuten, daß diese vier Gene über denselben Promotor gesteuert werden, welcher zumindest zum Teil auf dem vorangehenden 5'-Bereich lokalisiert sein dürfte, das heißt in den Positionen 1 bis 1414 von SEQ ID NO. 19. Hierbei dürfte in vivo lediglich zwischen denen Genen hsdIM und hsdIS1 ein Wechsel des Leserahmens erfolgen.

Nukleinsäuren, die alle vier Gene tragen, codieren für dieses erste Restriktions-Modifikationssystem; sie können beispielsweise dazu dienen, um dieses komplette System in einen anderen Stamm zu übertragen oder um daraus ein entsprechendes Deletionskonstrukt herzustellen (siehe unten).

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt diese Nukleinsäure zusätzlich den proteincodierenden Abschnitt der Nukleinsäure (des Gens) rmIA, wie es oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 9 definiert worden ist.

Denn dieses Gen beziehungsweise Protein steht aufgrund seiner Lokalisation und gleichen Orientierung vermutlich in einem funktionellen Zusammenhang mit den erwähnten, unmittelbar für Restriktion und Modifikation benötigten Genprodukten. Das rechtfertigt seine Einbeziehung in den genannten R/M-Locus I. Daß es nichtsdestoweniger auch als einzelnes Enzym verwendbar sein dürfte, wird weiter unten ausgeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Nukleinsäuren dieses Erfindungsgegenstands zusätzlich mindestens 100 bp und zunehmend bevorzugt 200 bp, 300 bp, 400 bp und besonders bevorzugt mindestens 500 bp von jeweils unmittelbar benachbarten Abschnitten.

Hiermit sind sowohl proteincodierende als auch nicht-proteincodierende Abschnitte gemeint. Denn zum einen umfaßt der in SEQ ID NO. 19 und 19 dargestelle Abschnitt aus B. licheniformis neben den genannten Genen nicht-proteincodierende Randbereiche der proteincodierenden Abschnitte dieser Gene. Hier können regulatorische Sequenzen vermutet werden. Wie beispielsweise der Wechsel des Leserahmens zwischen denen Genen hsdIM und hsdIS1 vermuten läßt, können aber auch in den proteincodierenden Bereichen regulatorische Elemente liegen.

In bevorzugten Ausführungsformen sind in den Nukleinsäuren dieses Erfindungsgegenstands die genannten Gene in ihrer natürlichen Lage zueinander angeordnet, vorzugsweise zusätzlich mit mindestens 100 bp und zunehmend bevorzugt 200 bp, 300 bp, 400 bp und besonders bevorzugt mindestens 500 bp von nicht-proteincodierenden Abschnitten 5'-wärts des proteincodierenden Abschnitts von hsdIS2 und/oder rmIA beziehungsweise von nicht-proteincodierenden Abschnitten 3'-wärts des proteincodierenden Abschnitts von hsdIR und/oder rmIA.

Denn wie bei polycistronischen DNA-Bereichen häufig, kann auch hier davon ausgegangen werden, daß die Expression der betreffenden Gene dann besonders erfolgreich ist, wenn die beteiligten Gene in ihrer konkreten Zuordnung zueinander nicht verändert werden. Zum anderen dürften insbesondere in den hier als bevorzugt genannten Abschnitten die für die Regulation besonders wichtigen Promotoren zu finden sein.

In bevorzugten Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands umfassen die Nukleinsäuren nicht mehr als 20.000 bp und zunehmend bevorzugt nicht mehr als 17.500 bp, 15.000 bp, 12.500 bp und ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 10.000 bp.

Denn der natürliche, in SEQ ID NO. 19 gezeigte, aus einer Bacillus-Spezies erhaltene Abschnitt weist insgesamt, einschließlich aller fünf proteincodierenden Abschnitte eine Gesamtlänge von 9.614 bp auf.

In der am meisten bevorzugten Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands handelt es sich um eine Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO. 19 dargestellten Nukleotidsequenz.

Denn dieser R/M-Locus I konnte, wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt ist, aus B. licheniformis DSM13 erhalten werden.

Wie bereits erwähnt und in den Beispielen dargestellt, wurde zur Lösung der genannten Aufgabe in B. licheniformis DSM13 noch ein weiteres Restriktions-Modifikationssystem identifiziert, welches ebenfalls dem Typ I angehört. Weil es das zweite seiner Art in B. licheniformis ist, wurden die zugehörigen Gene erfindungsgemäß mit der Nummer II versehen. Dabei handelt es sich um die drei Nukleinsäuren (Gene) hsdIIR, hsdIIS, und hsdIIM beziehungsweise die davon abgeleiteten Proteine. Diesen kann aufgrund seiner Lokalisation (vergleiche 20 und SEQ ID NO. 20) das DNA-bindende Protein HsdX beziehungsweise dessen zugehöriges Gen hsdX zugerechnet werden. Der gesamte Bereich wurde erfindungsgemäß als R/M-Locus II bezeichnet.

Dieser Nukleinsäurebereich stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, für die sinngemäß das gleiche gilt wie für die zuvor ausgeführte Gruppe von Genen des R/M-Locus I. Deshalb werden folgende Ausführungsformen entsprechend dem oben Gesagten entsprechend bevorzugt:

– Eine Nukleinsäure, umfassend die proteincodierenden Abschnitte der drei Nukleinsäuren (Gene) hsdIIR, hsdIIS und hsdIIM, wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 11, 13 und 17 definiert;
– eine derartige Nukleinsäure, zusätzlich umfassend den proteincodierenden Abschnitt der Nukleinsäure (des Gens) hsdX, wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 15 definiert;
– eine derartige Nukleinsäure, zusätzlich umfassend mindestens 100 bp und zunehmend bevorzugt 200 bp, 300 bp und besonders bevorzugt mindestens 400 bp von jeweils unmittelbar benachbarten Abschnitten;
– eine derartige Nukleinsäure, wobei die genannten Gene in ihrer natürlichen Lage zueinander angeordnet sind, vorzugsweise zusätzlich mit mindestens 100 bp und zunehmend bevorzugt 200 bp, 300 bp und besonders bevorzugt mindestens 400 bp von nicht-proteincodierenden Abschnitten 5'-wärts des proteincodierenden Abschnitts von hsdIIM und/oder hsdX beziehungsweise von nicht-proteincodierenden Abschnitten 3'-wärts des proteincodierenden Abschnitts von hsdIIR und/oder hsdIIM;
– eine derartige Nukleinsäure, umfassend nicht mehr als 20.000 bp und zunehmend bevorzugt nicht mehr als 17.500 bp, 15.000 bp, 12.500 bp und ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 10.000 bp;
– eine derartige Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO. 20 dargestellten Nukleotidsequenz, das heißt den R/M-Locus II von B. licheniformis.

In weiter bevorzugten Ausführungsformen ist unter den bisher genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, wie sie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 und 20 definiert worden sind und/oder weiteren erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, jeweils solche eine bevorzugt, welche natürlicherweise in einem Mikroorganismus enthalten ist, vorzugsweise einem Bakterium, besonders bevorzugt einem grampositiven Bakterium, hierunter bevorzugt einem der Gattung Bacillus, hierunter besonders bevorzugt einem der Spezies B. licheniformis und hierunter ganz besonders bevorzugt B. licheniformis DSM13.

Denn wie oben bereits für die zugehörigen Genprodukte (Proteine) erläutert, stellte sich die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe insbesondere für technisch wichtige, fermentierbare Mikroorganismen, hierunter insbesondere Bakterien. Hierfür stellen insbesondere die im Sequenzprotokoll dargestellten und unter Bezug darauf definierten Sequenzen Lösungen dieser Aufgabe dar. Mit einem zunehmenden Maß an Verwandtschaft mit den dort gezeigten Nukleotidsequenzen sollte auch eine zunehmend erfolgreiche Umsetzung der Erfindung in entsprechend verwandten Spezies einhergehen, beispielsweise was die Expression oder die Inaktivierung angeht (siehe unten).

Unter den genannten Nukleinsäuren, codierend für ein Protein, sind jeweils diejenigen bevorzugt, die für eines der zuvor beschriebenen, unter Verweis auf SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 definierten und/oder weiteren oben definierten erfindungsgemäßen Proteine codieren.

Denn für diese besteht der mit dieser Anmeldung belegte Bezug zur Restriktion beziehungsweise Modifikation von DNA. Zudem stehen einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung zufolge die erfindungsgemäßen Proteine auch für ihre positive Nutzung zur Verfügung. Insofern ist es wichtig, diese tatsächlich über an sich bekannte Methoden biotechnologisch herstellen zu können. Hierzu dienen die jeweils zugehörigen Nukleinsäuren.

Besonders zwischen entfernt verwandten Spezies bestehen Unterschiede hinsichtlich des Gebrauchs synonymer, für die jeweiligen Aminosäuren codierender Codons, worauf auch der Proteinbiosyntheseapparat ausgerichtet ist, etwa über die verfügbare Anzahl der passenden beladenen tRNAs. Die Übertragung eines der genannten Gene in eine weniger verwandte Spezies kann dann besonders erfolgreich beispielsweise zur Deletionsmutation oder zur Synthese des betreffenden Proteins genutzt werden, wenn sie hinsichtlich der Codons entsprechend optimiert ist. Hierdurch können prozentual auf der DNA-Ebene zunehmende Unterschiede eingeführt werden, die auf der Aminosäureebene jedoch ohne Folge bleiben. Aus diesem Grund stellen auch solche Nukleinsäuren Verwirklichungen der vorliegenden Erfindung dar.

Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen Vektoren dar, die eine der zuvor bezeichneten, unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, und 17 definierten und/oder weiteren oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten.

Denn um mit den erfindungsrelevanten Nukleinsäuren umzugehen, und damit insbesondere die Produktion erfindungsgemäßer Proteine vorzubereiten, werden sie geeigneterweise in Vektoren ligiert. Solche Vektoren sowie die zugehörigen Arbeitsmethoden sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Vektoren sind in großer Zahl und Variationsbreite, sowohl für die Klonierung als auch für die Expression kommerziell erhältlich. Dazu gehören beispielsweise Vektoren, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Bakteriophagen oder von Viren ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren. Ferner werden sie nach der Art der Zelltypen, in denen sie sich zu etablieren vermögen, beispielsweise nach Vektoren für gramnegative, für grampositive Bakterien, für Hefen oder für höhere Eukaryonten unterschieden. Sie bilden geeignete Ausgangspunkte beispielsweise für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen sowie für die Expression des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins. Insbesondere zur Herstellung von Konstrukten zur Deletion oder Verstärkung der Expression sind sie – wie aus dem hierfür einschlägigen Stand der Technik hervorgeht – praktisch unerläßlich.

Hierunter sind solche Vektoren bevorzugt, die zwei oder mehrere der zuvor bezeichneten Nukleinsäuren enthalten.

Denn darüber sind zum einen die betreffenden Gene gleichzeitig lagerbar oder können unter der Kontrolle desselben Promotors exprimiert werden. Einer anderen Anwendung zufolge kann ein Vektor, der gleichzeitig zwei oder mehr der erfindungsgemäßen Gene enthält, dazu dienen, sie gleichzeitig und in gleichem oder aufeinander abgestimmten Maße herzustellen oder in einer Zelle zur Expression zu bringen. Das ist dann besonders vorteilhaft, wenn sie in vivo ebenfalls in gleicher Menge gebildet werden. Entsprechend dem oben Gesagten ist es besonders vorteilhaft, hierbei auf deren natürliche Anordnung im Chromosom in den beiden genannten Bereiche zurückzugreifen, vorteilhafterweise zusammen mit den zugehörigen Kontrollelementen.

In einer Ausführungsform handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Klonierungsvektoren.

Denn Klonierungsvektoren eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifizierung oder der Selektion des interessierenden Gens für dessen molekularbiologische Charakterisierung. Gleichzeitig stellen sie transportierbare und lagerfähige Formen der beanspruchten Nukleinsäuren dar und sind auch Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die PCR oder In-vitro-Mutagenese-Verfahren.

Vorzugsweise handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Expressionsvektoren.

Denn derartige Expressionsvektoren sind die Basis dafür, die entsprechenden Nukleinsäuren in biologischen Produktionssystemen zu realisieren und damit die zugehörigen Proteine zu produzieren, da sie in vivo die Transkription und Translation, das heißt die Synthese des betreffenden Genprodukts ermöglichen. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind Expressionsvektoren, die die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen, beispielsweise den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor oder einen Promotor aus einem anderen Organismus. Diese Elemente können beispielsweise in Form einer sogenannten Expressionskassette angeordnet sein. Alternativ können einzelne oder alle Regulationselemente auch von der jeweiligen Wirtszelle bereitgestellt werden. Besonders bevorzugt sind die Expressionsvektoren hinsichtlich weiterer Eigenschaften, wie beispielsweise die optimale Kopienzahl, auf das gewählte Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle (siehe unten abgestimmt.

In der Regel ist die Bereitstellung eines Expressionsvektors die beste Möglichkeit, ein erfindungsgemäßes Protein vorzugsweise in Kombination mit damit zusammenwirkenden erfindnungsgemäßen Proteinen verstärkt zu bilden und somit die betreffende Aktivität zu erhöhen beziehungsweise einer quantitativen Herstellung zugänglich zu machen.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Zellen, die nach gentechnischer Modifizierung eine der zuvor bezeichneten, unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 und 17 definierten und/oder weiteren oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten.

Denn diese Zellen enthalten die genetische Information zur Synthese eines erfindungsgemäßen Proteins. Hierunter sind insbesondere diejenigen Zellen gemeint, die nach an sich bekannten Verfahren mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren versehen worden sind, beziehungsweise die sich von solchen Zellen ableiten. Dafür werden geeigneterweise solche Wirtszellen ausgewählt, die sich vergleichsweise einfach kultivieren lassen und/oder hohe Produktausbeuten liefern.

Sie ermöglichen beispielsweise die Amplifizierung der entsprechenden Gene, aber auch deren Mutagenese oder Transkription und Translation und letztlich die biotechnologische Produktion der betreffenden Proteine. Diese genetische Information kann entweder extrachromosomal als eigenes genetisches Element, das heißt bei Bakterien in plasmidaler Lokalisation vorliegen oder in ein Chromosom integriert sein. Die Wahl eines geeigneten Systems hängt von Fragestellungen, wie beispielsweise die Art und Dauer der Lagerung des Gens, beziehungsweise des Organismus oder die Art der Mutagenese oder Selektion ab. Derartige Realisierungsmöglichkeiten sind an sich dem Molekularbiologen bekannt.

Daraus erklärt sich auch die bevorzugte Ausführungsform, nach welcher in einer solchen Zelle die genannte Nukleinsäure Teil eines Vektors ist, insbesondere eines zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Vektors.

Denn damit sind die oben beschriebenen Vorteile bei der Handhabung, Lagerung, Expression etc. der betreffenden Nukleinsäure verbunden.

Bevorzugt ist unter diesen Zellen jeweils eine Wirtszelle, bei der es sich um ein Bakterium handelt.

Denn Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren etabliert werden. Zudem verfügt man bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf etc. gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein gramnegatives Bakterium, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α1, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).

Denn bei gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. In der Anmeldung WO 01/81597 A1 wird ein Verfahren offenbart, nach welchem erreicht wird, daß auch gramnegative Bakterien die exprimierten Proteine ausschleusen. Die als bevorzugt genannten gramnegativen Bakterien sind in der Regel leicht, das heißt kommerziell oder über öffentliche Stammsammlungen zugänglich und im Zusammenspiel mit ebenfalls in großer Zahl zur Verfügung stehenden übrigen Komponenten wie etwa Vektoren auf spezifische Herstellbedingungen hin optimierbar.

In einer alternativen, nicht minder bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein grampositives Bakterium, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebakterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum, und hierunter wiederum ganz besonders bevorzugt um ein Derivat von B. licheniformis DSM 13.

Denn grampositive Bakterien besitzen den gramnegativen gegenüber den grundsätzlichen Unterschied, sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abzugeben, aus welchem sich, wenn das gewünscht ist, die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aufreinigen lassen. Zudem sind sie mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so daß sie über eine ähnliche Codon-Usage verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist. Ganz besonders bevorzugt sind Derivate von B. licheniformis DSM 13 deshalb, weil sie zum einen ebenfalls im Stand der Technik als biotechnologische Produktionsstämme weit verbreitet sind und weil zum anderen mit der vorligenden Anmeldungen exakt die erfindungsgemäßen Gene und Proteine aus B. licheniformis DSM 13 zur Verfügung gestellt werden, so daß die Realisierung der vorliegenden Erfindung am ehesten in solchen Stämmen erfolgreich sein sollte.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bilden Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer der oben beschriebenen, unter Verweis auf SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 definierten und/oder weiteren oben definierten erfindungsgemäßen Genprodukte HsdIS2, HsdIM, HsdIS1, HsdIR, RmIA, HsdIIR, HsdIIS, HsdX oder HsdIIM.

Dazu gehört jedes Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins, beispielsweise chemische Syntheseverfahren. Demgegenüber sind jedoch alle im Stand der Technik etablierten, oben in einzelnen Aspekten bereits angesprochenen molekularbiologischen, mikrobiologischen, beziehungsweise biotechnologischen Herstellverfahren bevorzugt. Deren Ziel besteht in erster Linie darin, die erfindungsgemäßen Proteine zu erhalten, um sie entsprechenden Anwendungen zur Verfügung zu stellen.

Als Nachweis für die Bildung eines betreffenden Proteins in einem für die Herstellung eingesetzten Stamm dient ein enzymatischer Nachweis der betreffenden Enzymaktivitäten über geeignete Nachweisreaktionen. Dies geschieht beispielsweise so, daß die für die fragliche Reaktion relevante Ausgangsverbindung vorgelegt, mit einer Probe des Überstands (der die sekretierten Enzyme enthält) oder eines Zellextrakts (falls sie nicht sekretiert werden) inkubiert und das gebildete Produkt nach jeweils geeigneten Meßmethoden erfaßt wird. Derartige, im vorliegenden Fall immer auf das Substrat DNA bezogene Nachweisreaktionen sind dem Fachmann an sich vetraut.

Als Nachweis auf molekularbiologischer Ebene können die im vorliegenden Sequenzprotokoll dargestellten Proteine nach üblichen Methoden synthetisiert und hiergegen Antikörper gebildet werden. Diese Proteine sind dann beispielsweise über entsprechende Western-Blots nachweisbar.

Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz einer oben bezeichneten, jeweils entsprechenden Nukleinsäure und unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 und 17 definierten und/oder weiteren oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren erfolgen, vorzugsweise unter Einsatz eines zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Vektors und besonders bevorzugt unter Einsatz einer zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Zelle.

Denn durch die genannten Nukleinsäuren, insbesondere den konkreten im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuren wird die entsprechend bevorzugte genetische Information in mikrobiologisch verwertbarer Form, das heißt für gentechnische Produktionsverfahren zur Verfügung gestellt. Zunehmend bevorzugt ist die Bereitstellung auf einem von der Wirtszelle besonders erfolgreich verwertbaren Vektor beziehungsweise von solchen Zellen selbst. Die betreffenden Produktionsverfahren sind dem Fachmann an sich bekannt.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der zugehörigen Nukleinsäuresequenzen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Alle bereits oben ausgeführten Elemente können auch zu neuen Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar, so daß optimale Verfahren für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden müssen.

Weiterhin bevorzugt sind solche derartigen Verfahren, bei denen die Nukleotidsequenz in einem, vorzugsweise mehreren und besonders bevorzugt allen Codons an die Codon-Usage des Wirtsstamms angepaßt worden ist.

Denn entsprechend dem oben Gesagten kann die Übertragung eines der genannten Gene in eine weniger verwandte Spezies dann besonders erfolgreich zur Synthese des betreffenden Proteins genutzt werden, wenn sie hinsichtlich des Gebrauchs der Codons entsprechend optimiert ist.

Eine weitere Ausprägung der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 und 17 definierten und/oder einer weiteren oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder Teilen davon zur funktionellen Inaktivierung mindestens eines jeweils zugehörigen Gens hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR, rmIA, hsdIIR, hsdIIS, hsdX beziehungsweise hsdIIM in einem Mikroorganismus.

Unter der funktionellen Inaktivierung ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung jede Art von Modifikation oder Mutation zu verstehen, wonach die Funktion des betreffenden Proteins unterbunden wird. Dazu gehört die Ausführungsform, daß ein praktisch vollständiges, aber inaktives Protein gebildet wird, daß inaktive Teile eines solchen Proteins in der Zelle vorliegen, bis hin zu den Möglichkeiten, daß das zugehörige Gen nicht mehr translatiert wird oder sogar vollständig deletiert ist. Somit besteht eine spezielle „Verwendung" dieser Faktoren beziehungsweise Gene dieser Ausführungsform nach darin, daß sie in der betreffenden Zelle eben nicht mehr auf ihre natürliche Weise zur Wirkung kommen. Dies wird diesem Erfindungsgegenstand zufolge auf genetischer Ebene dadurch erreicht, daß das betreffende Gen ausgeschaltet wird.

Dadurch ergibt sich die Situation, daß die natürlicherweise vorhandene, zumeist chromosomale Kopie des betreffenden Gens inaktiviert ist, so daß von der Zelle in vivo kein funktionsfähiges Genprodukt mehr davon abgeleitet werden kann. Dasselbe gilt für alle davon abgeleiteten Zellen, insbesondere den hieraus resultierenden Klon.

Diese zeichnen sich wie oben erläutert dadurch aus, daß sie aufgenommene DNA nicht mehr so wirkungsvoll abbauen können und der dadurch erhaltene Stamm somit einfacher für gentechnische Arbeiten eingesetzt werden kann als der Ausgangsstamm; zudem wird ihm wie oben ebenfalls erläutert ein Teil seiner endogen ausgeübten Proteinbiosynthesearbeit erspart.

In einer bevorzugten Ausführungsform davon führt die funktionelle Inaktivierung dazu, daß das betreffende Protein nicht in vollständiger Länge, vorzugsweise überhaupt nicht synthetisiert wird.

So reicht es in vielen Fällen aus, nicht das komplette Gen zu deletieren, sondern lediglich Teile herauszuschneiden oder durch Umwandlung einzelner codierender Codons in Stopcodons das Gen soweit zu mutieren, daß nur noch Bruchstücke des abgeleiteten Genprodukts gebildet werden, die nur noch wenig oder gar nicht aktiv sind.

Demgegenüber ist die vollständige Nichtsynthese des Genprodukts jedoch bevorzugt. Denn dies führt zum einen zu einer Entlastung des Proteinsyntheseapparats und verhindert, daß sich im Zellinneren Fragmente der betreffenden Faktoren anhäufen. Damit stehen entsprechend größere Anteile des Proteinbiosyntheseapparats für die eigentlich interessierenden Proteine zur Verfügung. Vor allem aber ist eine Rückkehr zum Wildtyp, eine sogenannte Reversion nicht mehr möglich, wenn das Gen weitgehend entfernt ist. Beruht die Inaktivierung dagegen lediglich auf einer Punktmutation, so kann eine einfache Rückmutation den erfindungsgemäßen Effekt wieder aufheben.

Verschiedene Ausführungsformen dieses Gegenstand werden weiter unten ausgeführt. Hierbei ist unter anderem zu berücksichtigen, daß die im Stand der Technik zur Inaktivierung auf genetischer Ebene zur Verfügung stehenden Methoden unterschiedliche Ergebnisse liefern können. So kann mit Antisense-Konstrukten (siehe unten) in der Regel zwar eine sehr weitgehende, nicht jedoch 100%ige Inaktivierung erreicht werden. Hierfür ist eine Deletion des betreffenden Gens bevorzugt.

In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei diesen Verwendungen um solche, wobei die funktionelle Inaktivierung einer Fermentation des Mikroorganismus vorangeht.

Denn der Aufgabe entsprechend sollte die Fermentation der für eine biotechnologische Produktion eingesetzten Mikroorganismen verbessert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform hiervon werden die eindeutig auf die betreffenden, inaktivierten Enzyme oder Proteine zurückzuführenden Aktivitäten beziehungsweise Proteingehalte auf weniger als 50%, bevorzugt auf weniger als 20%, ganz besonders bevorzugt auf weniger als 5% der ohne die Inaktivierung auftretenden Aktivitätsbeziehungsweise Konzentrationswerte reduziert.

Diese Abstufung hinsichtlich des Maßes der Inaktivierung berücksichtigt die unterschiedliche Wirksamkeit der verschiedenen zur Inaktivierung zur Verfügung stehenden Methoden. Zur Bestimmung dieser Werte werden Zellen eines nichtbehandelten Stamms und eines behandelten Stamms unter ansonsten identischen Bedingungen fermentiert und geeigneterweise während der Fermentation die betreffenden Enzymaktivitäten geeigneterweise aus Zellextrakten bestimmt. Da die Stämme ansonsten identisch sind, sind die Aktivitätsunterschiede auf die erfindungsgemäßen Inaktivierungen zurückzuführen. Dabei ist erfindungsgemäß jede entsprechende Aktivitätserniedrigung erwünscht. Prozentual vergleichbare Werte erhält man, indem man aus beiden Fermentationen Proben nimmt und nach an sich bekannten Methoden die betreffenden Aktivitäten bestimmt. Zunehmend bevorzugt ist es, wenn der jeweilige in der erfindungsgemäßen Probe bestimmbare Wert beim Übergang in die stationäre Wachstumsphase weniger als 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 7,5, 5% und ganz besonders weniger als 1% des entsprechenden Werts der Vergleichsfermantation beträgt. Für die betroffenen Proteine kann zudem eine antikörperbasierte Nachweisreaktion durchgeführt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform solcher erfindungsgemäßen Verwendungen zur Inaktivierung werden 2, 3 4, 5, 6, 7 oder 9 der genannten Gene funktionell inaktiviert, vorzugsweise jeweils zwei oder mehrere Gene der Gruppen (1.) hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR und rmIA oder (2.) hsdIIR, hsdIIS, hsdX und hsdIIM.

Denn hierdurch wird der Proteinsyntheseapparat zunehmend entlastet. Die Inaktivierung der genannten Gruppen ist deshalb besonders vorteilhaft, weil sie vergleichweise einfach, nämlich in der Regel über einen einzigen Ansatz zusammen inaktiviert werden können, beispielsweise über einen Dekletionsvektor, der die Randsequenzen der jeweiligen Gengruppen und eine dazwischenliegende, mehrere Gene umfassende Deletion (siehe unten) aufweist.

In einer Ausführungsform dieser Verwendungen zur funktionellen Inaktivierung handelt es sich um solche Verwendungen, wobei für die Inaktivierung jeweils eine für mindestens ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt wird.

Derartige Nukleinsäuren können über an sich bekannte Verfahren zur Punktmutagenese erzeugt werden. Solche sind beispielsweise in einschlägigen Handbüchern wie dem von Fritsch, Sambrook und Maniatis, „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, dargestellt. Zudem stehen hierfür inzwischen zahlreiche kommerzielle Baukästen zur Verfügung, etwa das QuickChange^®-Kit der Firma Stratagene, La Jolla, USA. Dessen Prinzip besteht darin, daß Oligonukleotide mit einzelnen Austauschen (Mismatch-Primer) synthetisiert und mit dem einzelsträngig vorgelegten Gen hybridisiert werden; anschließende DNA-Polymerisation ergibt dann entsprechende Punktmutanten. Hierfür können die jeweiligen Spezies-eigenen Sequenzen dieser Gene verwendet werden. Aufgrund der hohen Homologien ist es möglich und erfindungsgemäß besonders vorteilhaft, diese Reaktion anhand der mit dem Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Nukleinsäuresequenzen durchzuführen. Diese Sequenzen können auch dazu dienen, entsprechende Mismatch-Primer für verwandte Spezies zu entwerfen, wie sie nach an sich bekannten Methoden anhand von Alignments der betreffenden Sequenzen ableitbar sind.

Nach einer alternativen Ausführungsform dieser Verwendung wird für die funktionelle Inaktivierung jeweils eine Nukleinsäure mit einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen eines für mindestens ein Protein codierenden Bereichs.

Auch diese Verfahren sind dem Fachmann an sich vertraut. Somit ist es möglich, die Bildung eines oder mehrerer der im Sequenzprotokoll angegebenen Genprodukte durch die Wirtszelle dadurch zu verhindern, daß ein Teil des betreffenden Gens auf einem entsprechenden Transformationsvektor über Restriktionsendonukleasen herausgeschnitten und der Vektor anschließend in den interessierenden Wirt transformiert wird, wo über die – bis dahin noch mögliche – homologe Rekombination das aktive Gen gegen die inaktive Kopie ausgetauscht wird. In der Ausführungsform der Insertionsmutation kann lediglich das intakte Gen unterbrechend oder anstelle eines Genteils ein anderes Gen, beispielsweise ein Selektionsmarker eingefügt werden. Hierüber ist das Mutationsereignis in an sich bekannter Weise phänotypisch überprüfbar.

Um diese jeweils notwendigen Rekombinationsereignisse zwischen dem in die Zelle eingeführten defekten Gen und der beispielsweise auf dem Chromosom endogen vorhandenen intakten Genkopie zu ermöglichen, ist nach dem derzeitigen Wissensstand eine Übereinstimmung in jeweils mindestens 70 bis 150 zusammenhängenden Nukleinsäurepositionen, jeweils in den beiden Randsequenzen zu dem nichtübereinstimmenden Teil nötig, wobei es auf den dazwischenliegenden Teil nicht ankommt. Dementsprechend sind solche Ausführungsformen bevorzugt, die lediglich zwei flankierende Regionen mit mindestens diesen Größen umfassen.

Nach einer alternativen Ausführungsform dieser Verwendung werden Nukleinsäuren mit insgesamt zwei Nukleinsäureabschnitten eingesetzt, die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassen und damit den für das Protein codierenden Bereich zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig flankieren. Die flankierenden Bereiche können dabei SEQ ID NO. 19 oder 20 entnommen werden oder ausgehend von den bekannten Sequenzen über an sich bekannte Methoden, beispielsweise mithilfe nach außen gerichteter PCR-Primer und einer Präparation genomischer DNA als Matrize ermittelt werden (anchored PCR). Denn allein um den Austausch der beiden Genkopien über homologe Rekombination zu ermöglichen, braucht es sich dabei nicht zwangsläufig um proteincodierende Abschnitte zu handeln.

Der vorliegenden Erfindung zufolge können die hierfür benötigten Primer anhand der im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleotidsequenzen auch für andere Spezies grampositiver Bakterien und hierunter insbesondere für solche der Gattung Bacillus entworfen werden. Alternativ zu diesem experimentellen Ansatz können derartige, wenigstens zum Teil nichtcodierende Bereiche für viele dieser Gene aus verwandten Spezies, beispielsweise aus B. subtilis Datenbankeinträgen entnommen werden, beispielsweise der Datenbank Subtilist des Institute Pasteur, Paris, Frankreich (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi).

Nach einer weiteren alternativen Ausführungsform dieser Verwendung wird für die funktionelle Inaktivierung jeweils eine Nukleinsäure eingesetzt, die mit der 5'-terminalen Sequenz, insbesondere der Signalsequenz des zugehörigen Gens oder Teilen davon identisch ist oder interferiert.

Hierunter ist der Einsatz solcher molekularbiologischer Konstrukte zu verstehen, mithilfe derer in den betreffenden, hiermit transformierten Zellen Antisense-RNA zu den 5'-terminalen, insbesondere für das Signalpeptid codierenden Abschnitten der jeweiligen mRNA gebildet werden. Dadurch ergibt sich eine Hybridisierung zwischen der in vivo gebildeten, für das zu inaktivierende Protein codierenden mRNA und der artifiziell erzeugten homologen einzelsträngigen RNA. Hierdurch wird eine effiziente Translation, das heißt Bildung des betreffenden Proteins verhindert und die betreffende RNA über intrazelluläre Mechanismen abgebaut. Diese Form der Inaktivierung liefert in der Regel keine volständige Inaktivierung, so daß gewisse Restaktivitäten verbleiben.

Die vorliegende Erfindung wird auch in der Form gentechnisch modifizierter Mikroorganismen verwirklicht, auf die das oben Gesagte entsprechend zutrifft.

Ganz allgemein sind das Mikroorganismen, bei denen mindestens eines der Gene hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR, rmIA, hsdIIR, hsdIIS, hsdX beziehungsweise hsdIIM funktionell inaktiviert ist.

Hierunter sind entsprechend dem oben Gesagten solche zunehmend bevorzugt, bei denen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 der genannten Gene inaktiviert sind, vorzugsweise jeweils zwei oder mehrere Gene der Gruppen (1.) hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR und rmIA oder (2.) hsdIIR, hsdIIS, hsdX und hsdIIM.

Diese Ausführungsformen umfassen ganz allgemein alle Mikroorganismen, insbesondere solche, die biotechnologisch genutzt werden. Hierzu gehören beispielsweise Protozoen oder Hefen, wie etwa der Gattungen Saccharomyces oder Schizosaccharomyces.

Aufgrund ihrer biotechnologischen Bedeutung sind demgegenüber solche erfindungsgemäßen Mikroorganismen bevorzugt, bei denen es sich um Bakterien handelt.

Entsprechend den bisherigen Ausführungen zum Einsatzgebiet der vorliegenden Erfindung sind darunter solche Bakterien bevorzugt, bei denen es sich um gramnegative Bakterien handelt, insbesondere solche der Gattungen Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DHSα, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).

Entsprechend den bisherigen Ausführungen sind solche Bakterien nicht minder bevorzugt, bei denen es sich um grampositive Bakterien handelt, insbesondere solche der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum und hierunter ganz besonders um B. licheniformis DSM 13.

Der Aufgabe zufolge, die der vorliegenden Anmeldung zugrunde gelegen hatte, sollten in erster Linie technische Fermentationsverfahren verbessert werden. Dementsprechend wird die Erfindung insbesondere in entsprechenden, erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren verwirklicht.

Dabei handelt es sich ganz allgemein um Verfahren zur Fermentation eines zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Mikroorganismus.

Die durch derartige Mikroorganismen gekennzeichneten Verfahren sind den bisherigen Ausführungen entsprechend bevorzugt.

Unter den erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren sind diejenigen zur Herstellung eines Wertstoffs bevorzugt, insbesondere zur Herstellung einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.

Denn dies ist, wie bereits gesagt, das wichtigste Anwendungsgebiet für großtechnische Fermentationen.

In einer Ausführungsform sind das Verfahren, wobei es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.

Auf diese Weise werden beispielsweise Aminosäuren, Vitamine oder Oligopeptide produziert, die besonders als Nahrungsmittelergänzungsstoffe Verwendung finden. Bei pharmazeutisch relevanten Verbindungen kann es sich um Vor- oder Zwischenstufen zu Medikamenten oder sogar um diese selbst handeln. In all diesen Fällen spricht man auch von Biotransformation, wonach die Stoffwechseleigenschaften der Mikroorganismen ausgenutzt werden, um die ansonsten aufwendige chemische Synthese ganz oder zumindest in einzelnen Schritten zu ersetzen.

In einer weiteren Ausführungsform sind das entsprechende Verfahren, bei denen es sich bei dem auf diese Weise gebildeten Protein um ein Peptidhormon handelt.

So werden beispielsweise pharmazeutisch wichtige Peptidhormone wie Interleukine oder Insulin großtechnisch durch Fermentationen gewonnen, oft durch eukaryontische Wirtszellen.

Nicht minder bevorzugt sind entsprechende Verfahren, bei denen es sich bei dem auf diese Weise gebildeten Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.

Industrielle Enzyme, die mit derartigen Verfahren hergestellt werden, finden beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie Verwendung. So dienen α-Amylasen beispielsweise dazu, um das Altbackenwerden von Brot zu verhindern oder um Fruchtsäfte zu klären. Proteasen werden zum Aufschluß von Proteinen verwendet. All diese Enzyme sind für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben, wobei insbesondere die von grampositiven Bakterien bereits natürlicherweise hergestellten Subtilisin-Proteasen einen prominenten Platz einnehmen. Insbesondere in der Textil- und Lederindustrie dienen sie der Aufarbeitung der natürlichen Rohstoffe. Ferner können all diese Enzyme wiederum im Sinne der Biotransformation als Katalysatoren für chemische Reaktionen eingesetzt werden.

Viele dieser technisch relevanten Enzyme stammen ursprünglich aus Bacillusspezies und werden deshalb besonders erfolgreich in grampositiven Organismen, insbesondere solchen der Gattung Bacillus produziert, worunter in vielen Fällen auch Derivate von B. licheniformis DSM13 fallen. Insbesondere Produktionsverfahren, die auf diesen mikrobiellen Systemen beruhen, können mithilfe der vorliegenden Erfindung verbessert werden, weil insbesondere die im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus eben diesem Organismus stammen.

Wie oben bereits gesagt sollten mit der vorliegenden Erfindung nicht allein die betreffenden Nukleinsäuren zur Inaktivierung der betreffenden Gene zur Verfügung gestellt, sondern auch deren positive Nutzung ermöglicht werden. Denn in allen Fällen handelt es sich nicht bloß um Genprodukte oder Proteine sondern um solche Proteine, die eine chemische Reaktion katalysieren, das heißt um Enzyme.

Weitere Erfindungsgegenstände bestehen somit in der jeweiligen Verwendung eines oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 definierten und/oder weiteren oben definierten erfindungsgemäßen Proteins entsprechend seiner dort jeweils angegebenen biochemischen Eigenschaften. Die jeweiligen Aktivitäten sind auch in Tabelle 2 in Beispiel 3 angegeben. Dabei handelt es sich entsprechend der Natur dieser Proteine im einzelnen um folgende Verwendungsmöglichkeiten, die jeweils eine spezielle Reaktion am Substrat DNA darstellen:

– Verwendung einer Spezifitäts-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIS2), wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 2 definiert, entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA;
– Verwendung einer Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIM), wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 4 definiert, entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA;
– Verwendung eines Spezifitäts-Proteins eines Restriktions-Enzyms des Typs I (E.C. 3.1.21.3; HsdIS1), wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 6 definiert, entsprechend seiner biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA;
– Verwendung einer Helicase-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIR), wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 8 definiert, entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA;
– Verwendung eines 5-Methylcytosin-spezifischen Restriktionsenzyms A (E.C. 3.1.21.-; RmIA), wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 10 definiert, entsprechend seiner biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA;
– Verwendung einer Restriktionskette eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIIR), wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 12 definiert, entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA;
– Verwendung einer HsdS-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIIS), wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 14 definiert, entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA;
– Verwendung eines DNA-bindenden Proteins (HsdX), wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 16 definiert, entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA;
– Verwendung einer Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIIM), wie oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 18 definiert, entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.

Alle diese Verwendungen sind sowohl in vivo als auch in vitro möglich. So können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren prinzipiell in alle Wirtszellen transformiert und zur Expression gebracht werden. Diese Zellen verfügen dann zusätzlich über die betreffende biochemische Aktivität, was dann besonders vorteilhaft ist, wenn sie die jeweils zusammengehörenden Enzyme enthalten. Denn dann verfügen sie über einen weiteren Schutzmechanismus gegen Infektionen mit speziesfremden Nukleinsäuren.

In vitro läßt sich dieser Erfindungsaspekt verwirklichen, indem die betreffende Aktivität wie oben beschrieben überexprimiert und aufgereinigt wird. Die so gewonnenen Enzyme können dann zur Modifikation oder Restriktion von jeder Art von DNA verwendet werden. Das ist beispielsweise dann vorteilhaft, wenn eine – beispielsweise über PCR erhaltene – DNA methyliert wird, bevor sie in ein Bakterium transfomiert wird, welches über das zugehörige Restriktions-Modifikationssystem verfügt. Sie ist dort dann gegen Abbau geschützt.

In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich dabei um eine oder mehrere der genannten Verwendungen, wobei die genannten Enzyme in Komplexen aus mindestens zwei verschiedenen Untereinheiten eingesetzt werden, vorzugsweise aus den genannten Untereinheiten, besonders bevorzugt als einen der Komplexe HsdIS2 * HsdIS1 * HsdIM HsdIR oder HsdIIS * HsdIIM * HsdIIR, besonders bevorzugt HsdIS2, zumindest im Komplex mit HsdIS1 oder umgekehrt HsdIS1, zumindest im Komplex mit HsdIS2.

Denn dadurch ahmt man die in vivo wirksame Zusammensetzung der natürlicherweise ebenfalls in entsprechenden Komplexen auftretenden, das heißt zusammenwirkenden Restriktions-Modifikationsenzym des Typs I nach, wie dies einleitend dargestellt worden ist. Dadurch sollten sich die jeweiligen Aktivitäten optimal ergänzen. Dies gilt insbesondere deshalb für HsdIS2, zumindest im Komplex mit HsdIS1 und umgekehrt HsdIS1, zumindest im Komplex mit HsdIS2, weil HsdIS als wirksames B. licheniformis-Enzym natürlicherweise aus diesen beiden Untereinheiten aufgebaut ist.

Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines in SEQ ID NO. 19 oder 20 dargestellten, nicht-proteincodierenden Abschnitts zur Kontrolle der Expression eines Gens dar.

Denn wie oben erläutert spricht einiges dafür, daß zumindest in diesen Abschnitten genetische Elemente liegen, die die betreffenden Gene kontrollieren. Sie können beispielsweise in Expressionsvektoren dementsprechend zur Kontrolle von Genen verwendet werden.

In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich dabei jeweils um eine Verwendung zur Kontrolle eines der Gene hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR, rmIA, hsdIIR, hsdIIS, hsdX oder hsdIIM.

Denn für diese Gene ist der unmittelbare Zusammenhang durch die gemeinsame Lokalisation gegeben.

Außerdem bevorzugte Ausführungsformen sind jeweils solche Verwendungen, wobei es sich um einen 5'-wärts eines proteincodierenden Abschnitts gelegenen Abschnitt handelt, vorzugsweise mit Wirkung als Promotor.

Denn insbesondere an dieser Aktivität besteht im Zusammenhang mit der Produktion der betreffenden Proteine ein Interesse.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung weiter.

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme, Baukästen (Kits) und Geräte wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Kultivierung von Bacillus licheniformis und Nachweis eines Restriktions-Modifikationssystems in B. licheniformis DSM 13
Zellen von B. licheniformis sind unter der Nummer DSM 13 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascher oder Weg 1 b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) erhältlich.
B. licheniformis wird geeigneterweise in einem 500 ml-Schüttelkolben in 100 ml Horikoshi-Medium pH 9 (0,1 % K₂HPO₄, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,02 % MgSO₄, 0,3% Na₂CO₃) für 72 h bei 37°C und 200 rpm kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugation vom Überstand getrennt. Der Überstand enthält die sekretierten Proteine.
In Versuchen wurde gezeigt, daß Fremd-DNA durch Zellextrakte aus Bacillus licheniformis abgebaut wird. Dies ist ein eindeutiges Zeichen für das Vorhandensein mindesens eines Restriktions-Modifikationssystems in diesem Organismus.
Beispiel 2
Identifizierung der Gene hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR, rmIA, hsdIIR, hsdIIS, hsdX und hsdIIM aus B. licheniformis DSM 13
Aus dem von der DSMZ erhältlichen Stamm B. licheniformis DSM 13 wurde nach Standardmethoden die genomische DNA präpariert, mechanisch fraktioniert und über Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Für eine Schrotschußklonierung der kleineren Fragmente wurden die 2 bis 2,5 kb großen Fragmente aus dem Agarosegel eluiert, dephosphoryliert und als stumpf endende (blunt ended) Fragmente in die Smal-Restriktionsschnittstelle des Vektors pTZ19R-Cm ligiert.
Dabei handelt es sich um ein Chloramphenicol-Resistenz verleihendes Derivat des von der Firma Fermentas (St. Leon-Rot) kommerziell erhältliche Plasmid pTZ19R. Dadurch wurde eine Genbank der kleineren Fragmente erhalten. Als zweite Schrotschußklonierung wurden die durch eine partielle Restriktion mit dem Enzym Saulllal erhaltenen genomischen Fragmente in das SuperCos-1-Vektorsystem („Cosmid Vector Kit") der Firma Stratagene, La Jolla, USA, ligiert, wodurch eine Genbank über die überwiegend größeren Fragmente erhalten wurde.
Aus den durch Transformation mit den betreffenden Genbanken erhältlichen Bakterien E. coli DH5α (D.Hannahan (1983): „Studies on transformation on Escherichia coli"; J. Mol. Microbiol., Band 166, Seiten 557 – 580) wurden die betreffenden rekombinanten Plasmide isoliert und sequenziert. Hierbei kam die Farbstoffabbruchmethode (dye terminator chemistry) zum Einsatz, durchgeführt durch die automatischen Sequenziergeräte Mega-BACE 1000/4000 (Fa. Amersham Bioscence, Piscataway, USA) und ABI Prism 377 (Fa. Applied Biosystems, Foster City, USA).
Auf diese Weise wurden unter anderem die im Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung angegebenen Sequenzen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 13, 15 und 17 erhalten, die in dieser Reihenfolge für die Gene hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR, rmIA, hsdIIR, hsdIIS, hsdX und hsdIIM stehen. Die hiervon abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in entsprechender Reihenfolge in SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 angegeben.
Hierbei zeigte sich, daß bei folgenden Sequenzen: SEQ ID NO. 5 (hsdIS1) und SEQ ID NO. 9 (rmIA) das Startcodon nicht ATG lautet, sondern davon abweicht. Im Sequenzprotokoll befindet sich dazu sowohl bei der DNA- als auch bei der abgeleiteten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 6 beziehungsweise 10) jeweils folgende Anmerkung: „First codon translated as Met."
Ferner wurde gefunden, daß die ersten fünf dieser Gene auf einem 9614 Positionen umfassenden Abschnitt des Chromosoms in selber Orientierung nahe beieinander liegen, welcher deshalb als R/M-Locus I bezeichnet wurde. Gemäß SEQ ID NO. 19 umfaßt er die folgenden Bereiche: Positionen 1415 bis 1984: hsdIS2; Positionen 2005 bis 3597: hsdIM; Positionen 3587 bis 4780: hsdIS1; Positionen 4803 bis 7961: hsdIR; und Positionen 8534 bis 8956: rmIA. Dies ist in SEQ ID NO. 19 entsprechend vermerkt und wird durch 19 illustriert.
Außerdem wurde gefunden, daß die verbleibenden vier dieser Gene auf einem 8479 Positionen umfassenden Abschnitt des Chromosoms nahe beieinander liegen, welcher nun als R/M-Locus II bezeichnet wird. Gemäß SEQ ID NO. 20 umfaßt er die folgenden Bereiche: Positionen 469 bis 3576: hsdIIR; Positionen 3622 bis 4785: hsdIIS; Positionen 4807 bis 5724: hsdX; und Positionen 6366 bis 7895: hsdIIM. Dies ist in SEQ ID NO. 20 entsprechend vermerkt und wird durch 20 illustriert. Hier ist auffällig, daß diese zueinander jeweils gleich orientiert sind, in Bezug auf die zuerst genannte Gruppe von Genen im R/M-Locus I aber entgegengesetzt orientiert sind, das heißt durch den anderen DNA-Strang codiert werden. Im Sequenzprotokoll ist deshalb jeweils an entsprechender Stelle zu SEQ ID NO. 20 „complementary" vermerkt.
Beispiel 3
Sequenzhomologien
Nach Ermittlung der DNA- und Aminosäuresequenzen gemäß Beispiel 2 wurden durch Recherche in den Datenbanken GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov) und Subtilist des Institute Pasteur, Paris, Frankreich (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi) die jeweils nächstähnlichen, bisher bekannten Homologe (Gene und Proteine) ermittelt.
Die ermittelten DNA- beziehungsweise Aminosäuresequenzen wurden über die in den 1 bis 14 dargestellten Alignments einander gegenübergestellt; hierfür wurde das Computerprogramm Vector NTI^® Suite Version 7, verwendet, welches von der Firma Informax Inc., Bethesda, USA (beziehungsweise der Firma Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA), erhältlich ist. Hierbei wurden die Standard-Parameter dieses Programms angewendet, das heißt für den Vergleich der DNA-Sequenzen: K-tuple size: 2; Number of best Diagonals: 4; Window size: 4; Gap penalty: 5; Gap opening penalty: 15 und Gap extension penalty: 6,66. Für den Vergleich der Aminosäure-Sequenzen galten folgende Standard-Parameter: K-tuple size: 1; Number of best Diagonals: 5; Window size: 5; Gap penalty: 3; Gap opening penalty: 10 und Gap extension penalty: 0,1. Die Ergebnisse dieser Sequenzvergleiche sind in folgender Tabelle 1 zusammengestellt, wobei als Zugangsnummern diejenigen aus der NCBI-Datenbank angegeben sind.
Tabelle 1: Nächstähnliche Gene beziehungsweise Proteine zu den in Beispiel 2 ermittelten Genen und Proteinen.
Man erkennt, daß es sich bei den gefundenen Genen und den hiervon abgeleiteten Genprodukten um neue Gene beziehungsweise Proteine mit einem deutlichen Abstand zum bisher bekannten Stand der Technik handelt. Gleichzeitig sind die ermittelten Homologiewerete hinreichend, um den betreffenden Genen beziehungsweise abgeleiteten Proteinen über diesen Vergleich eindeutige Funktionen innerhalb des Restriktions-Modifikationssystems zuzuordnen. Diese sind in folgender Tabelle 2 zusammengestellt.
Tabelle 2: Funktionen der in Beispiel 2 ermittelten Gene beziehungsweise der abgeleiteten Proteine.
Diese Gennamen sind ebenfalls an entsprechender Stelle in das Sequenzprotokoll aufgenommen worden; sie bezeichnen die in dieser Tabelle 2 angegebenen biochemischen Funktionen.
Beispiel 4
Funktionelle Inaktivierung eines oder mehrerer der Gene hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR, rmIA, hsdIIR, hsdIIS, hsdX und hsdIIM in B. licheniformis
Prinzip der Herstellung eines Deletionsvektors
Jedes dieser Gene kann beispielsweise mittels eines sogenannten Deletionsvektors funktionell inaktiviert werden. Dieses Vorgehens ist an sich beispielsweise von J. Vehmaanperä et al. (1991) in der Publikation „Genetic manipulation of Bacillus amyloliquefaciens"; J. Biotechnol., Band 19, Seiten 221 – 240 beschrieben.
Ein geeigneter Vektor hierfür ist pE194, der in der Publikation „Replication and incompatibility properties of plasmid pE194 in Bacillus subtilis" von T.J. Gryczan et al. (1982), J. Bacteriol., Band 152, Seiten 722 – 735 charakterisiert ist. Der Vorteil dieses Deletionsvektors besteht darin, daß er einen Temperatur-abhängigen Replikationsursprung besitzt. Bei 33°C kann pE194 in der transformierten Zelle replizieren, so daß bei dieser Temperatur zunächst auf eine erfolgreiche Transformation selektiert wird. Anschließend werden die Zellen, die den Vektor enthalten, bei 42°C inkubiert. Bei dieser Temperatur repliziert der Deletionsvektor nicht mehr und es wird ein Selektionsdruck auf die Integration des Plasmids über einen zuvor ausgewählten homologe Bereich in das Chromosom ausgeübt. Eine zweite homologe Rekombination über einen zweiten homologen Bereich führt dann zur Excision des Vektors zusammen mit der intakten Genkopie aus dem Chromosom und damit zur Deletion des in vivo chromosomal lokalisierten Gens. Möglich wäre auch als zweite Rekombination die Umkehneaktion zur Integration, das heißt ein Herausrekombinieren des Vektors aus dem Chromosom, so daß das chromosomale Gen intakt bliebe. Die Gen-Deletion muß daher nach an sich bekannten Methoden, etwa im Southern-Blot nach Restriktion der chromosomalen DNA mit geeigneten Enzymen oder mit Hilfe der PCR-Technik anhand der Größe des amplifizierten Bereichs nachgewiesen werden.
Erforderlich ist also die Auswahl zweier homologer Bereiche des zu deletierenden Gens, die jeweils mindestens je 70 Basenpaare umfassen sollten, beispielsweise der 5'- und der 3'-Bereich des ausgewählten Gens. Diese werden so in den Vektor kloniert, daß sie einen für ein nichtaktives Protein codierenden Teil flankieren oder unter Auslassung des dazwischenliegenden Bereichs direkt aufeinanderfolgen. Hierdurch wird der Deletionsvektor erhalten.
Deletion der hier betrachteten Gene hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR, rmIA, hsdIIR, hsdIIS, hsdX und hsdIIM
Zur Konstruktion eines erfindungsgemäßen Deletionsvektors werden die 5'- und 3'-Bereiche eines dieser Gene mittels PCR amplifiziert. Zur Konstruktion geeigneter Primer stehen die im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 und 17 zur Verfügung, die aus B. licheniformis stammen, aufgrund zu erwartender Homologien aber auch für andere Spezies, insbesondere der Gattung Bacillus geeignet sein sollten.
Die beiden amplifizierten Bereiche werden geeigneterweise unmittelbar hintereinander auf einem für diese Arbeiten gebräuchlichen Vektor zwischenkloniert, zum Beispiel dem Vektor pUC18, der sich für Klonierungssschritte in E. coli. eignet.
Im nächsten Schritt erfolgt eine Umklonierung in den zur Deletion ausgewählten Vektor pE194 und dessen Transformation in B. subtilis DB104, etwa nach der Methode der Protoplasten-Transformation nach Chang & Cohen (1979; „High Frequency Transformation of Bacillus subtilis Protoplasts bp Plasmid DNA"; Molec. Gen. Genet. (1979), Band 168, Seiten 111-115). Alle Arbeitsschritte müssen bei 33°C durchgeführt werden um eine Replikation des Vektors zu gewährleisten.
In einem nächsten Schritt wird der zwischenklonierte Vektor ebenfalls mittels der Methode der Protoplastentransformation in den gewünschten Wirtsstamm, hier B. licheniformis, transformiert. Die solcherart erhaltenen und mit üblichen Methoden (Selektion über den Resistenzmarker des Plasmids; Kontrolle über Plasmidpräparation und PCR für das Insert) als positiv identifizierten Transformanten werden anschließend bei 42°C unter Selektionsdruck durch Zugabe von Erythromycin auf Anwesenheit des Plasmids kultiviert. Bei dieser Temperatur kann der Deletionsvektor nicht mehr replizieren und es überleben nur solche Zellen, bei denen der Vektor in das Chromosom integriert ist, wobei diese Integration mit höchster Wahrscheinlichkeit in homologen oder identischen Bereichen stattfindet. Durch Kultivierung bei 33°C ohne Erythromycin-Selektionsdruck kann dann nachfolgend die Excision des Deletionsvektors induziert werden, wobei das chromosomal codierte Gen vollständig aus dem Chromosom entfernt wird. Der Erfolg der Deletion wird anschließend über Southern-Blot nach Restriktion der chromosomalen DNA mit geeigneten Enzymen oder mit Hilfe der PCR-Technik überprüft.
Solche Transformanten, bei denen das betreffende Gen deletiert ist, zeichnen sich, je nachdem welches Gen(e) deletiert worden ist/sind, zudem durch die Unfähigkeit zur Methylierung zugesetzter DNA und/oder zur DNA-Hydrolyse in entsprechender Entfernung von der Erkennungsstelle dieses Typ-I-Restriktions-Modifikationssystems aus.
Beschreibung der Figuren
1: Alignment des Gens hsdIS2 (SEQ ID NO. 1) aus Bacillus licheniformis DSM 13 (B.LhsdIS2) mit dem homologen Gen NC_004722 aus Bacillus cereus ATCC 14579 (B. cereus); Homologie: 86,8% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
2: Alignment des Proteins HsdIS2 (SEQ ID NO. 2) aus B. licheniformis DSM 13 (B.LHsdIS2) mit dem homologen Protein NP_834172.1 aus B. cereus ATCC 14579 (B. cereus); Homologie: 82% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
3: Alignment des Gens hsdIM (SEQ ID NO. 3) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. hsdIM) mit dem homologen Gen NC_004722 aus B. cereus ATCC 14579 (B. cereus); Homologie: 78,8% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
4: Alignment des Proteins HsdIM (SEQ ID NO. 4) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. HsdIM) mit dem homologen Protein NP_834171.1 aus B. cereus ATCC 14579 (B. cereus); Homologie: 82,1 % Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
5: Alignment des Gens hsdIS1 (SEQ ID NO. 5) aus B. licheniformis DSM 13 (B.LhsdIS1) mit dem homologen Gen NC_004722 aus B. cereus ATCC 14579 (B. cereus); Homologie: 57,9% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
6: Alignment des Proteins HsdIS1 (SEQ ID NO. 6) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I.HsdIS1) mit dem homologen Protein NP_834170.1 aus B. cereus ATCC 14579 (B. cereus); Homologie: 35,5% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
7: Alignment des Gens hsdIR (SEQ ID NO. 7) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. hsdIR) mit dem homologen Gen NZ_AAAK01000294 aus Enterococcus faecium Efae_294 (E. faecium); Homologie: 71,5% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
8: Alignment des Proteins HsdIR (SEQ ID NO. 8) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. HsdIR) mit dem homologen Protein ZP_00037886.1 aus Enterococcus faecium (E. faecium); Homologie: 73,6% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
9: Alignment des Gens rmIA (SEQ ID NO. 9) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. rmIA) mit dem homologen Gen NC_004722 aus B. cereus ATCC 14579 (B. cereus); Homologie: 38,5% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
10: Alignment des Proteins RmIA (SEQ ID NO. 10) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. RmIA) mit dem homologen Protein NP_831911.1 aus B. cereus ATCC 14579 (B. cereus); Homologie: 30,0% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
11: Alignment des Gens hsdIIR (SEQ ID NO. 11) aus B. licheniformis DSM 13 (B.LhsdIIR) mit dem homologen Gen hsdR (BX842656) aus Bdellovibrio bacteriovorus HD100 (B. bacter.); Homologie: 51,5% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
12: Alignment des Proteins HsdIIR (SEQ ID NO. 12) aus B. licheniformis DSM 13 (B.LHsdIIR) mit dem homologen Protein HsdR (CAE81064.1) aus Bdellovibrio bacteriovorus HD100 (B. bacter.); Homologie: 35,0% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
13: Alignment des Gens hsdIIS (SEQ ID NO. 13) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. hsdIIS) mit dem homologen Gen hsdS (NC_003212) aus Listeria innocua (L. innocua); Homologie: 48,9% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
14: Alignment des Proteins HsdIIS (SEQ ID NO. 14) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. HsdIIS) mit dem homologen Protein HsdS (NP_469866.1) aus Listeria innocua (L. innocua); Homologie: 28,5% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
15: Alignment des Gens hsdX (SEQ ID NO. 15) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. hsdX) mit dem homologen Gen rhuM (NC_003197) aus Salmonella typhimurium LT2 (S. typhi.); Homologie: 52,1 % Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
16: Alignment des Proteins HsdX (SEQ ID NO. 16) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. HsdX) mit dem homologen Protein RhuM (NP_462654.1) aus Salmonella typhimurium LT2 (S. typhi.); Homologie: 46,2% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
17: Alignment des Gens hsdIIM (SEQ ID NO. 17) aus B. licheniformis DSM 13 (B.LhsdIIM) mit dem homologen Gen hsdM (NC_003902) aus Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC 33913 (X. campes.); Homologie: 52,7% Identität (vergleiche Beispiel 3, Tabelle 1).
18: Alignment des Proteins HsdIIM (SEQ ID NO. 18) aus B. licheniformis DSM 13 (B.I. HsdIIM) mit dem homologen Protein HsdM (NP_638250.1) aus Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC 33913 (X. campes.); Homologie: 50,8% Identität (vergleiche Beispile 3, Tabelle 1).
19: Der 9614 Positionen umfassende, in SEQ ID NO. 19 dargestellte Abschnitt des Chromosoms von B. licheniformis DSM 13 (R/M-Locus I) enthält neben unterschiedlich großen nicht proteincodierenden Abschnitten in dieser Reihenfolge folgende Gene (im Fall von hsdIM und hsdIS1 um 11 Positionen überlappend):
hsdIS2 (SEQ ID NO. 1), hsdIM (SEQ ID NO. 3), hsdIS1 (SEQ ID NO. 5), hsdIR (SEQ ID NO. 7) und rmIA (SEQ ID NO. 9).
20: Der 8479 Positionen umfassende, in SEQ ID NO. 20 dargestellte Abschnitt des Chromosoms von B. licheniformis DSM 13 (R/M-Locus II) enthält neben unterschiedlich großen nicht proteincodierenden Abschnitten in dieser Reihenfolge folgende Gene:
hsdIIR (SEQ ID NO. 11), hsdIIS (SEQ ID NO. 13), hsdX (SEQ ID NO. 15) und hsdIIM (SEQ ID NO. 17).
Sie sind gegenüber dem Abschnitt von SEQ ID NO. 19 umgekehrt orientiert, das heißt sie liegen auf dem DNA-Strang, der zu dem in 19 gezeigten komplementär ist.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Nukleinsäure hsdIS2, codierend für eine Spezifitäts-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 91% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Spezifitäts-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIS2), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 86% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Nukleinsäure hsdIM, codierend für eine Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 83% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIM), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 87% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Nukleinsäure hsdIS1, codierend für ein Spezifitäts-Protein eines Restriktions-Enzyms des Typs I (E.C. 3.1.21.3), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 5 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 62% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Spezifitäts-Protein eines Restriktions-Enzyms des Typs I (E.C. 3.1.21.3; HsdIS1), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 6 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 40% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Nukleinsäure hsdIR, codierend für eine Helicase-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 7 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 76% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Helicase-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIR), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 8 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 78% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Nukleinsäure rmIA, codierend für ein 5-Methylcytosin-spezifisches Restriktionsenzym A (E.C. 3.1.21.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 9 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 43% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
5-Methylcytosin-spezifisches Restriktionsenzym A (E.C. 3.1.21.-; RmIA), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 10 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 34% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Nukleinsäure hsdIIR, codierend für eine Restriktionskette eines Restriktions-Enzyms des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 11 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 56% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Restriktionskette eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIIR), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 39% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Nukleinsäure hsdIIS, codierend für eine HsdS-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 13 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 53% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
HsdS-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIIS), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 14 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 33% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Nukleinsäure hsdX, codierend für ein DNA-bindendes Protein mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 15 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
DNA-bindendes Protein HsdX mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 16 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 51% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Nukleinsäure hsdIIM, codierend für eine Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 17 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 57% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIIM), mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 18 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 55% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
Am Restriktions-Modifikationssystem beteiligtes Protein nach einem der Ansprüche 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18, welches natürlicherweise von einem Mikroorganismus gebildet wird, vorzugsweise von einem Bakterium, besonders bevorzugt von einem grampositiven Bakterium, hierunter bevorzugt von einem der Gattung Bacillus, hierunter besonders bevorzugt von einem der Spezies B. licheniformis und hierunter ganz besonders bevorzugt von B. licheniformis DSM13.
Nukleinsäure, umfassend die proteincodierenden Abschnitte der vier Nukleinsäuren (Gene) hsdIS2, hsdIM, hsdIS1 und hsdIR, gemäß den Ansprüchen 1,3,5,und 7.
Nukleinsäure nach Anspruch 20, zusätzlich umfassend den proteincodierenden Abschnitt der Nukleinsäure (des Gens) rmIA gemäß Anspruch 9.
Nukleinsäure nach Anspruch 20 oder 21, zusätzlich umfassend mindestens 100 bp und zunehmend bevorzugt 200 bp, 300 bp, 400 bp und besonders bevorzugt mindestens 500 bp von jeweils unmittelbar benachbarten Abschnitten.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei die genannten Gene in ihrer natürlichen Lage zueinander angeordnet sind, vorzugsweise zusätzlich mit mindestens 100 bp und zunehmend bevorzugt 200 bp, 300 bp, 400 bp und besonders bevorzugt mindestens 500 bp von nicht-proteincodierenden Abschnitten 5'-wärts des proteincodierenden Abschnitts von hsdIS2 und/oder rmIA beziehungsweise von nicht-proteincodierenden Abschnitten 3'-wärts des proteincodierenden Abschnitts von hsdIR und/oder rmIA.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 20 bis 23, umfassend nicht mehr als 20.000 bp und zunehmend bevorzugt nicht mehr als 17.500 bp, 15.000 bp, 12.500 bp und ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 10.000 bp.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 20 bis 24 mit der in SEQ ID NO. 19 dargestellten Nukleotidsequenz.
Nukleinsäure, umfassend die proteincodierenden Abschnitte der drei Nukleinsäuren (Gene) hsdIIR, hsdIIS und hsdIIM gemäß den Ansprüchen 11, 13 und 17.
Nukleinsäure nach Anspruch 26, zusätzlich umfassend den proteincodierenden Abschnitt der Nukleinsäure (des Gens) hsdX gemäß Anspruch 15.
Nukleinsäure nach Anspruch 26 oder 27, zusätzlich umfassend mindestens 100 bp und zunehmend bevorzugt 200 bp, 300 bp und besonders bevorzugt mindestens 400 bp von jeweils unmittelbar benachbarten Abschnitten.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei die genannten Gene in ihrer natürlichen Lage zueinander angeordnet sind, vorzugsweise zusätzlich mit mindestens 100 bp und zunehmend bevorzugt 200 bp, 300 bp und besonders bevorzugt mindestens 400 bp von nicht-proteincodierenden Abschnitten 5'-wärts des proteincodierenden Abschnitts von hsdIIM und/oder hsdX beziehungsweise von nicht-proteincodierenden Abschnitten 3'-wärts des proteincodierenden Abschnitts von hsdIIR und/oder hsdIIM.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 26 bis 29, umfassend nicht mehr als 20.000 bp und zunehmend bevorzugt nicht mehr als 17.500 bp, 15.000 bp, 12.500 bp und ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 10.000 bp.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 26 bis 30 mit der in SEQ ID NO. 20 dargestellten Nukleotidsequenz.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und/oder 20 bis 31, natürlicherweise enthalten in einem Mikroorganismus, vorzugsweise einem Bakterium, besonders bevorzugt einem grampositiven Bakterium, hierunter bevorzugt einem der Gattung Bacillus, hierunter besonders bevorzugt einem der Spezies B. licheniformis und hierunter ganz besonders bevorzugt B. licheniformis DSM13.
Nukleinsäure, codierend für ein Protein nach einem der Ansprüche 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 und/oder 19.
Vektor, der eine der in den Ansprüchen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und/oder 20 bis 33 bezeichneten Nukleinsäuren enthält.
Vektor nach Anspruch 34, der zwei oder mehrere der genannten Nukleinsäuren enthält.
Klonierungsvektor nach Anspruch 34 oder 35.
Expressionsvektor nach Anspruch 34 oder 35.
Zelle, die nach gentechnischer Modifizierung eine der in den Ansprüchen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und/oder 20 bis 33 bezeichneten Nukleinsäuren enthält.
Zelle nach Anspruch 38, wobei die genannte Nukleinsäure Teil eines Vektors ist, insbesondere eines Vektors nach einem der Ansprüche 34 bis 37.
Zelle nach Anspruch 38 oder 39, bei der es sich um ein Bakterium handelt.
Zelle nach Anspruch 40, wobei es sich um ein gramnegatives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DHSα, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
Zelle nach Anspruch 40, wobei es sich um ein grampositives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum, und hierunter wiederum ganz besonders bevorzugt um ein Derivat von B. licheniformis DSM 13.
Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer der Genprodukte HsdIS2, HsdIM, HsdIS1, HsdIR, RmIA, HsdIIR, HsdIIS, HsdX und HsdIIM nach den Ansprüchen 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 oder 18.
Verfahren nach Anspruch 43 unter Einsatz einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 und/oder 20 bis 33, vorzugsweise unter Einsatz eines Vektors nach einem der Ansprüche 34 bis 37, besonders bevorzugt unter Einsatz einer Zelle nach einem der Ansprüche 38 bis 42.
Verfahren nach Anspruch 43 oder 44, wobei die Nukleotidsequenz in einem oder vorzugsweise mehreren und besonders bevorzugt allen Codons an die Codon-Usage des Wirtsstamms angepaßt worden ist.
Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 17 oder 20 bis 33 zur funktionellen Inaktivierung mindestens eines jeweils zugehörigen Gens hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR, rmIA, hsdIIR, hsdIIS, hsdX beziehungsweise hsdIIM in einem Mikroorganismus.
Verwendung nach Anspruch 46, wobei die funktionelle Inaktivierung einer Fermentation des Mikroorganismus vorangeht.
Verwendung nach Anspruch 46 oder 47, wobei zunehmend bevorzugt 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 9 der genannten Gene funktionell inaktiviert werden, vorzugsweise jeweils zwei oder mehrere Gene der Gruppen (1.) hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR und rmIA oder (2.) hsdIIR, hsdIIS, hsdX und hsdIIM.
Verwendung nach einem der Ansprüche 46 bis 48, wobei für die genannte Inaktivierung jeweils eine für mindestens ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 46 bis 48, wobei für die genannte Inaktivierung jeweils eine Nukleinsäure mit einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt wird, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen eines für mindestens ein Protein codierenden Bereichs.
Verwendung nach einem der Ansprüche 46 bis 48, wobei für die Inaktivierung eine Nukleinsäure eingesetzt wird, die mit der 5'-terminalen Sequenz, insbesondere der Signalsequenz mindestens eines zugehörigen Gens oder Teilen davon identisch ist oder interferiert.
Mikroorganismus, bei dem mindestens eines der Gene hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR, rmIA, hsdIIR, hsdIIS, hsdX beziehungsweise hsdIIM funktionell inaktiviert ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 52, bei dem zunehmend bevorzugt 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 der genannten Gene inaktiviert sind, vorzugsweise jeweils zwei oder mehrere Gene der Gruppen (1.) hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR und rmIA oder (2.) hsdIIR, hsdIIS, hsdX und hsdIIM.
Mikroorganismus nach Anspruch 52 oder 53, bei dem es sich um ein Bakterium handelt.
Bakterium nach Anspruch 54, wobei es sich um ein gramnegatives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
Bakterium nach Anspruch 54, wobei es sich um ein grampositives Bakterium handelt, insbesondere eines der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus oder Corynebacterium glutamicum und hierunter ganz besonders um B. licheniformis DSM 13.
Verfahren zur Fermentation eines Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 52 bis 56.
Verfahren nach Anspruch 57 zur Herstellung eines Wertstoffs, insbesondere einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.
Verfahren nach Anspruch 58, wobei es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
Verfahren nach Anspruch 58, wobei es sich bei dem Protein um ein Peptidhormon handelt.
Verfahren nach Anspruch 58, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
Verwendung einer Spezifitäts-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIS2) gemäß Anspruch 2 entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.
Verwendung einer Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIM) gemäß Anspruch 4 entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.
Verwendung eines Spezifitäts-Proteins eines Restriktions-Enzyms des Typs I (E.C. 3.1.21.3; HsdIS1) gemäß Anspruch 6 entsprechend seiner biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.
Verwendung einer Helicase-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIR) gemäß Anspruch 8 entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.
Verwendung eines 5-Methylcytosin-spezifischen Restriktionsenzyms A (E.C. 3.1.21.-; RmIA) gemäß Anspruch 10 entsprechend seiner biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.
Verwendung einer Restriktionskette eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIIR) gemäß Anspruch 12 entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.
Verwendung einer HsdS-Untereinheit eines Restriktions-Enzyms des Typs I (HsdIIS) gemäß Anspruch 14 entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.
Verwendung eines DNA-bindenden Proteins (HsdX) gemäß Anspruch 16 entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.
Verwendung einer Methylierungs-Untereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems des Typs I (HsdIIM) gemäß Anspruch 18 entsprechend ihrer biochemischen Eigenschaften zur Restriktion und/oder Modifikation von DNA.
Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 62 bis 70, wobei die genannten Enzyme in Komplexen aus mindestens zwei verschiedenen Untereinheiten eingesetzt werden, vorzugsweise aus den genannten Untereinheiten, besonders bevorzugt als einen der Komplexe HsdIS2 * HsdIS1 HsdIM * HsdIR oder HsdIIS * HsdIIM * HsdIIR, besonders bevorzugt HsdIS2, zumindest im Komplex mit HsdIS1 oder umgekehrt HsdIS1, zumindest im Komplex mit HsdIS2.
Verwendung eines in SEQ ID NO. 19 oder 20 dargestellten, nicht-proteincodierenden Abschnitts zur Kontrolle der Expression eines Gens.
Verwendung nach Anspruch 72 zur Kontrolle eines der Gene hsdIS2, hsdIM, hsdIS1, hsdIR, rmIA, hsdIIR, hsdIIS, hsdX oder hsdIIM.
Verwendung nach Anspruch 72 oder 73, wobei es sich um einen 5'-wärts eines proteincodierenden Abschnitts gelegenen Abschnitt handelt, vorzugsweise mit Wirkung als Promotor.