DE60131701T2 - Immunoassay zum Nachweis von Amphetaminen und Derivaten davon - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet des Messens eines Analyten in einem flüssigen Medium. Genauer gesagt betrifft sie einen Assay zum Messen einer Droge in einer biologischen Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung ein hochempfindliches Immunoassayverfahren zum Nachweis von Amphetaminen, Methamphetaminen, und Methylendioxy-Designeramphetaminen wie 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) in biologischen Proben.
  • Die Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin sind eine Reihe von Verbindungen, die als "Designer"-Amphetamine bezeichnet werden. Wie in 1 dargestellt, handelt es sich bei diesen psychotropen Drogen um ringsubstituierte Derivate, die chemisch mit Mescalin verwandt sind. Sie schließen Methylendioxyamphetamin (MDA), Methylendioxymethamphetamin (MDMA, auch als Ecstasy bekannt), Methylendioxyethylamphetamin (MDEA), N-Methylbenzodioxazolylbutanamin (MBDB), Benzodioxazol-5'-yl-2-butanamin (BDB) und 4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin (HMMA) ein, wobei MDMA am häufigsten angetroffen wird.
  • Es wurde gezeigt, daß MDA ein Metabolit sowohl von MDMA als auch von MDEA ist. In mehreren Tierstudien wurde festgestellt, daß MDMA durch N-Demethylierung, Desaminierung, O-Methylierung und O-Konjugation an Glucuronid und/oder Sulfatmetaboliten metabolisiert wird. Nachgewiesen im Urin werden die Stammdroge (MDMA), 3,4-Methylendioxylamphetamin (MDA), 4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin (HMMA), 3-Hydroxy-4-methoxymethamphetamin, 4-Hydroxy-3-methoxyphenylaceton, 3,4-Methylendioxyphenylaceton und 3,4-Dihydroxyphenylaceton. Die meisten dieser Metaboliten kommen auch im Blut vor.
  • Urin und Blut sind die am häufigsten untersuchten biologischen Matrizen für MDMA, MDA, MDEA und MBDB, und sie sind in der Literatur gut dokumentiert. Von einer Bestimmung dieser Designerdrogen in anderen biologischen Proben wie Speichel, Schweiß und Haaren wurde vor kurzem berichtet. In diesen Matrizen wird die Stammdroge in höheren Konzentrationen als ihre Metaboliten nachgewiesen.
  • Der Mißbrauch dieser Designeramphetamine nimmt überall auf der Welt zu, und ihr Nachweis durch Screening-Verfahren gewinnt an Bedeutung. Zhao, H. et al., J. Anal. Toxicology 25, 258–269 (2001) haben festgestellt, daß 71% aller Urinproben von Teilnehmern an Rave-Parties MDMA oder MDA alleine oder in Kombination mit Amphetamin oder anderen Designeramphetaminen wie MDEA enthielten. Gegenwärtig gibt es keine kommerziellen Immunoassays, die speziell für den Nachweis dieser Substanzen entwickelt wurden, und ihr Nachweis hängt daher von den relativen Kreuzreaktivitäten ab, die sie bei dem angewandten Amphetamin- bzw. Methamphetamin-Screeningverfahren zeigen. Im allgemeinen ist die Kreuzreaktivität der im Handel erhältlichen Amphetamin- bzw. Methamphetamin-Assays hinsichtlich vieler dieser Verbindungen niedrig, was nahelegt, daß einige positive Proben nicht nachgewiesen werden könnten.
  • Beim Testen auf Drogen haben sich Immunoassays, insbesondere Immunoassays auf kompetitive Bindung, als besonders vorteilhaft erwiesen. Bei Immunoassays auf kompetitive Bindung konkurriert ein Analyt in einer biologischen Probe mit einem markierten Reagens, oder einem Analytanalogon, oder einem Tracer, um eine begrenzte Anzahl von Rezeptorbindungsstellen auf für den Analyten und das Analytanalogon spezifischen Antikörpern. Enzyme wie β-Galactosidase und Peroxidase, fluoreszente Moleküle wie Fluoresceinverbindungen, radioaktive Verbindungen wie 125I und Mikropartikel sind häufig verwendete Markierungssubstanzen, die als Tracer eingesetzt werden. Durch die Analytkonzentration in der Probe ist die Menge an Analytanalogon, die vom Antikörper gebunden wird, festgelegt. Die Menge an Analytanalogon, die gebunden wird, ist umgekehrt proportional zur Analytkonzentration in der Probe, da Analyt und Analytanalogon jeweils im Verhältnis zu ihren jeweiligen Konzentrationen vom Antikörper gebunden werden. Die Menge an freiem bzw. gebundenem Analytanalogon läßt sich dann nach dem jeweils verwendeten Marker entsprechenden Verfahren bestimmen.
  • Die Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) ist hochspezifisch, und der gleichzeitige Nachweis von MDMA, MDA, Amphetamin, Methamphetamin, MDEA und ihren Metaboliten damit wurde beschrieben. Für die Bestätigung und Verifikation der Ergebnisse eines immunologischen Assays oder einer zweifelhaften Diagnose ist gewöhnlich eine GC/MC-Analyse erforderlich. Bei diesem Verfahren werden MDMA oder Designerdrogen in fester Phase extrahiert und dann derivatisiert und mittels GC/MS analysiert.
  • In dem am 26 März 1996 erteilten US-Patent Nr. 5,501,987 beschreiben Ordonez et al. ein Zwei-Analyten-Immunoassay für die Bestimmung von Amphetamin und Methamphetamin unter Verwendung eines einfach markierten Bindungspartners, der dazu in der Lage ist, mit verschiedenen Empfindlichkeiten mit von Konjugatderivaten von Amphetamin und Methamphetamin abgeleiteten Antikörpern eine Kreuzreaktion einzugehen. Die verwendeten Eichstandards werden hergestellt, indem man drogenfreien, normalen menschlichen Urin mit d-Amphetamin versetzt.
  • Kunsman et al. (J. Analyt. Toxicol. 14, 1990, Seiten 149–153) offenbaren die Anwendung von Amphetamin-Immunoassays zum Nachweis von Methylendioxy-Designeramphetaminen. Als Standards werden Amphetaminlösungen verwendet. Die Verwendung eines eine bekannte Menge an Methylendioxy- Designeramphetamin enthaltenden Standards wird von Kunsman et al. nicht gelehrt.
  • EP-A-0674782 gehört zur gleichen Patentfamilie wie das US-Patent Nr. 5,262,333 und offenbart die Anwendung eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays zur Bestimmung von Amphetamin und Methamphetamin in einer biologischen Probe. Die beschriebene Vorschrift umfaßt eine Vorbehandlung der biologischen Probe mit Periodat und riboflavinbindendem Protein zum Eliminieren von Kreuzreaktanten wie β-Hydroxyphenethylamin.
  • In der EP-A-0375422 wird ein Immunoassay beschrieben, mit dem sich das Vorhandensein von Amphetaminen in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin und/oder Methamphetamin enthält, nachweisen läßt, indem man wenigstens zwei Konjugate einsetzt, die jeweils aus einem funktionell ähnlichen, an ein Amphetaminanalogon bzw. ein Methamphetaminanalogon gebundenen Marker und einem Antikörper gegen Amphetamin und einem Antikörper gegen Methamphetamin bestehen, wobei es sich bei wenigstens einem der Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
  • Ruangyuttikarn und Moody (J. Analyt. Toxicol. 12 (4): 229–233 (1988)) offenbaren einen Vergleich von drei im Handel erhältlichen Amphetamin-Immunoassays zum Nachweis von Methamphetamin, Methylendioxyamphetamin, Methylendioxymethamphetamin und Methylendioxyethylamphetamin. Alle Assays wurden mit Amphetamin als Vergleichssubstanz geeicht.
  • Ward et al. (Journal of Forensic Sciences, 39 (6), 1994, Seiten 1486–1496) offenbaren einen Radioimmunoassay für den dualen Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin. Bei dem Verfahren werden Amphetamin oder Methamphetamin als Eichstandards verwendet.
  • Cody und Schwarzhoff (J. Analyt. Toxicol. 17 (1993), Seiten 26–30) beschreiben einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für den Nachweis von Amphetamin, Methamphetamin und Amphetaminanaloga. Auch bei diesem Verfahren werden Amphetamin und Methamphetamin als Eichstandards verwendet
  • KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Ganz überraschend wurde entdeckt, daß sich ein hochspezifisches Immunoassayverfahren zum Nachweis von Amphetaminen, Methamphetaminen und Methylendioxy-Designeramphetaminen wie 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) in Urinproben erzielen läßt, indem man einen Eichstandard, umfassend eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylendioxy-Designeramphetaminen in drogenfreiem, normalem menschlichen Urin und einen Antikörper mit Spezifität für Amphetamin oder Methamphetamin und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin verwendet.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus der aus Amphetamin, Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe in einer biologischen Probe, welches die folgenden Schritte umfaßt:
    • a. Zusammengeben einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, mit einem ersten Antikörper, der spezifisch für Amphetamin ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweist, einem zweiten Antikörper, der spezifisch für Methamphetamin ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweist, und einem Komplex, der einen an eine Markergruppe gekoppelten Liganden dieses Analyten enthält,
    • b. Messen des Vorhandenseins von bzw. der Menge an Komplex, der an die Antikörper gebunden bleibt oder als Folge der kompetitiven Verdrängung durch den Analyten von den Antikörpern losgelöst wurde, und
    • c. Vergleich des Vorhandenseins von bzw. der Menge an in Schritt b) gemessenem Komplex mit dem Vorhandensein bzw. der Menge eines ähnlichen, in einer eine bekannte Menge an einer Substanz ausgewählt aus der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe enthaltenden Vergleichsprobe gemessenen Komplexes, wobei die Vergleichsprobe gemäß Schritt (a) und (b) behandelt wurde.
  • Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus der aus Amphetamin, Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe in einer biologischen Probe, welches die folgenden Schritte umfaßt:
    • a. Zusammengeben einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, mit einem Antikörper, der aus der aus Antikörpern, die spezifisch für Amphetamin sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, und Antikörpern, die spezifisch für Methamphetamin sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, bestehenden Gruppe ausgewählten Antikörper und weiterhin mit einem Komplex, der einen an eine Markergruppe gekoppelten Liganden dieses Analyten enthält,
    • b. Messen des Vorhandenseins von bzw. der Menge an Komplex, der an die Antikörper gebunden bleibt oder als Folge der kompetitiven Verdrängung durch den Analyten von den Antikörpern losgelöst wurde, und
    • c. Vergleich des Vorhandenseins von bzw. der Menge an in Schritt b) gemessenem Komplex mit dem Vorhandensein bzw. der Menge eines ähnlichen, in einer eine bekannte Menge an einer Substanz ausgewählt aus der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe enthaltenden Vergleichsprobe gemessenen Komplexes, wobei die Vergleichsprobe gemäß Schritt (a) und (b) behandelt wurde.
  • Bei beiden Verfahren wird als Probe vorzugsweise Urin verwendet und als die in einer bekannten Menge in einer Vergleichsprobe vorhandene Substanz wird vorzugsweise 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) verwendet.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gibt man eine Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin, Methamphetamin oder eine strukturell verwandte Droge enthält, mit einem Antikörper, der für Amphetamin oder Methamphetamin spezifisch ist, und einem markierten Bindungspartner, der mit der Kombination von Antikörper und seinem entsprechenden Analyten in Wechselwirkung treten kann, zusammen, um das Vorhandensein der Analyten bei ausgewählten Cutoff-Konzentrationen entweder alleine oder in Kombination nachzuweisen. Der betreffende verwendete Antikörper bzw. die betreffenden verwendeten Antikörper müssen eine Kreuzreaktion mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin zeigen. Die vorliegende Erfindung kann mit allen Immunoassayformattypen, zum Beispiel einem turbidometrischen Agglutinationsassay, einem Radioimmunoassay, einem Enzymimmunoassay oder einem Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay angewendet werden.
  • Besonders bevorzugt ist die Anwendung der vorliegenden Erfindung mit agglutinometrischen Formaten, die gegenüber einem instrumentellen Verfahren zur Messung der durch die Agglutinationsreaktion bewirkten Veränderungen empfindlich sind. Für eine solche agglutinometrische Analyse können sowohl manuelle als auch automatisierte Apparate-Testverfahren geeignet eingesetzt werden. Typischerweise verläuft der Betrieb einer automatisierten Instrumentierung unter Verwendung einer Mehrzahl an Reagensbehältern bzw. -reservoiren, aus denen die entsprechende Menge jedes Reagens für die Zugabe zur Probe pipettiert wird. Bei Immunoassays wie dem in Rede stehenden Agglutinationsassay wird man sich gewöhnlich wenigstens zweier dieser Behälter bedienen; typischerweise eines für ein Antikörperreagens und des anderen für die an den entsprechenden Liganden gebundenen Mikropartikel. Bei einigen Instrumenten können weitere Behälter bzw. -reservoire mit Verdünnungsmittel, Puffern oder anderen Zusätzen für die entsprechende Behandlung der Probe vorhanden sein.
  • Der klinische Analyzer pipettiert die darin befindlichen Reagentien und Proben in eine Küvette, in der die kompetitive Agglomerationsreaktion stattfindet, und die Eintrübung wird gemessen. Zum Beispiel wird bei der Verwendung des HITACHI 917-Analyzers (Roche Diagnostics) und des ABUSCREEN® OnLine Amphetamin-Reagenskits (Roche Diagnostics, Kat.-Nr. 1985965) die Urinprobe mit dem Probenverdünnungsmittel in die Küvette pipettiert, unmittelbar gefolgt von der entsprechenden Menge an Antikörperreagens und Mischen. Ein Spektrophotometer-Ausgangswert wird abgelesen. Dann wird die entsprechende Menge an Mikropartikelreagens in die Küvette überführt, und der Ansatz wird durchmischt. Nach einer kurzen Inkubation wird eine abschließende Turbiditätsmessung vorgenommen. Die Gesamtänderung bei der Turbidität (Extinktion) im Ansatz wird mit einer Eichkurve verglichen, und die Ergebnisse werden in ng/ml angegeben.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem ein Reagens-Testkit, das in einer abgepackten Kombination einen für Amphetamin spezifischen Antikörper, einen für Methamphetamin spezifischen Antikörper, einen Komplex umfassend einen Liganden von Amphetamin oder ein Amphetaminderivat gekoppelt an eine Markergruppe und einen Eichstandard umfassend eine bekannte Menge einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylendioxy-Designeramphetaminen enthält. Solch ein Testkit stellt die Reagentien für einen Assay mit verbesserter klinischer Empfindlichkeit für MDMA und strukturell verwandte Verbindungen bereit.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kit zum Durchführen eines Assays für die Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus der aus Amphetamin, Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe in einer biologischen Probe, enthaltend in einer abgepackten Kombination:
    • a. einen ersten Antikörper, der amphetaminspezifisch ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweist,
    • b. einen zweiten Antikörper, der methamphetaminspezifisch ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweist,
    • c. einen Komplex, enthaltend einen Liganden von Amphetamin oder ein an eine Markergruppe gekoppeltes Amphetaminderivat, und
    • d. einen Eichstandard, enthaltend eine bekannte Menge einer Substanz ausgewählt aus der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Kit zum Durchführen eines Assays für die Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus der aus Amphetamin, Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe in einer biologischen Probe, enthaltend in einer abgepackten Kombination:
    • a. einen Antikörper, ausgewählt aus der aus Antikörpern, die amphetaminspezifisch sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, und Antikörpern, die methamphetaminspezifisch sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, bestehenden Gruppe,
    • b. einen Komplex, enthaltend einen Liganden von Amphetamin oder ein an eine Markergruppe gekoppeltes Amphetaminderivat, und
    • c. einen Eichstandard, enthaltend eine bekannte Menge einer Substanz ausgewählt aus der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe.
  • Beide Kits werden vorzugsweise für Urin als biologische Probe verwendet. Vorzugsweise enthalten beide Kits 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) als die Substanz, die in einer bekannten Menge in dem Eichstandard enthalten ist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Strukturen von Amphetamin, Methamphetamin und 3,4-Methylendioxy-Designerdrogen.
  • 2 ist eine Dosis-Reaktions-Kurve, die mit dem einen für Amphetamin spezifischen Antikörper, einen für Methamphetamin spezifischen Antikörper und Eichstandards mit bekannten Mengen an MDMA enthaltenden Assay der vorliegenden Erfindung erstellt wurde.
  • 3 ist eine Dosis-Reaktions-Kurve, die mit dem einen für Amphetamin spezifischen Antikörper, einen für Methamphetamin spezifischen Antikörper und Eichstandards mit bekannten Mengen an MDA enthaltenden Assay der vorliegenden Erfindung erstellt wurde.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Im Handel sind gegenwärtig keine Immunoassaykits für die Bestimmung von MDMA erhältlich. Die einzige Möglichkeit, MDMA mittels eines Immunoassays zu bestimmen, ist die Verwendung von Reagentien oder eines Reagenskits zur Bestimmung von Amphetamin oder Methamphetamin, umfassend einen Amphetamin-Antikörper und einen Methamphetamin-Antikörper mit hoher Kreuzreaktivität mit MDMA und die Verwendung von Amphetamin oder Methamphetamin als Eichstandard. Bei der vorliegenden Erfindung wird eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylendioxy-Designeramphetaminen für die Eichung eines im Handel erhältlichen Assays, bei dem Antikörper gegen Amphetamin und Methamphetamin zum Einsatz kommen, verwendet. Durch die Verwendung eines Methylendioxy-Designeramphetamin-Eichstandard wird die klinische Empfindlichkeit für MDMA, MBDB, MDA, MDE und BDB signifikant gesenkt, ohne daß es zu einer signifikanten Erhöhung bei Medikamenten wie β-Hydroxyphenylaminen, zum Beispiel Ephedrin, Pseudoephedrin, Phentamin, Tyramin und Phenylpropanolamin (PPA) kommt.
  • Verwendete Abkürzungen:
    • AMP
      Amphetamin
      BDB
      (+/–)-(3,4-Methylendioxyphenyl)-2-butanamin
      HMMA
      4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin
      MAMP
      Methamphetamin
      MBDB
      (+/–)-N-Methyl-1-(3,4-methylendioxyphenyl)-2-butanamin
      MDA
      (+/–)-3,4-Methylendioxyamphetamin
      MDEA
      (+/–)-3,4-Methylendioxyethylamphetamin
      MDMA
      (+/–)-3,4-Methylendioxymethamphetamin
      NT
      nicht getestet
      PPA
      Phenylpropanolamin
  • Kreuzreaktivitäten von gegenwärtig auf dem Markt befindlichen Assays für MDMA and MDA gemäß der publizierten Literatur sowie Kreuzreaktivitäten gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind in der Tabelle unten aufgeführt.
  • Unter "Methylendioxy-Designeramphetaminen" ist die Gruppe von Amphetaminanaloga bestehend aus Methylendioxyphenylalkylamin einschließlich 3,4-Methylendioxyamphetamin (MDA), 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA, Ecstasy), 3,4-Methylendioxyethylamphetamin (MDEA), N-Methyl-1-(3,4-methylendioxyphenyl)-2-butanamin(N-methyl)benzodioxazolylbutanamin) (MBDB) und 3,4-Methylendioxyphenyl-2-butanamin(benzodioxazol-5'-yl-2-butanamin) (BDB) zu verstehen.
    Verbindung Roche Hitachi AMP 500 ng/ml Roche Integra AMPSC 500 ng/ml Abbott TDX AMP/methAMP 1000 ng/ml CEDIA DAU AMP 1000 ng/ml Roche Hitachi AMP/MDMA 300 ng/ml
    MDMA 36% 79% 97% 69% 100,0%
    MDA 35,5% 40% 148% 1,9% 25,0%
    MDEA NT NT 42,7% 2,4% 15,0%
    MBDB NT NT (+) NT 70,0%
    BDB NT NT (+) NT 4,7%
    d-AMP 100% 100% 100% 101% 97,0%
    l-AMP 6% 4.2% 56,9% 3.0% 3,8%
    d-MAMP 82,2% 12% 97,8% 100% 300.0%
    l-MAMP 0,8% 12% 7,2% 12% 18%
    dl-Ephedrin < 0,1% < 0,1% NT 0,4% < 0,3%
    l-PPA 1,5% 1,1% NT NT 0,6%
    HMMA NT NT NT NT < 0,3%
  • Bei den in der obigen Tabelle für die einzelnen Verfah ren angegebenen Cutoff-Konzentrationen handelt es sich um die bei dem Test für die Bestimmung eines positiven Ergebnisses erforderliche Konzentration an Drogen.
  • Beispiel 1. Herstellung eines Antikörper-Reagens
  • Ein erstes Reagens wurde nach den dem ABUSCREEN® OnLine HS Amphetamin/MDMA-Reagenskit (Roche Diagnostics, Kat.-Nr. 1986619) beiliegenden Anweisungen hergestellt. Das Reagens enthielt monoklonale Amphetamin- und Methamphetamin-Antikörper (Maus) in einem Puffer mit Rinderserumalbumin und einem Konservierungsmittel.
  • Beispiel 2. Herstellung eines Mikropartikelreagens
  • Ein zweites Reagens wurde gemäß den dem ABUSCREEN® OnLine HS Amphetamin/MDMA-Reagenskit (Roche Diagnostics, Kat.-Nr. 1986619) beigefügten Anweisungen hergestellt. Das Reagens enthielt ein mit Latex-Mikropartikeln konjugiertes Amphetaminderivat in einem Puffer mit einem Konservierungsstoff.
  • Beispiel 3. Herstellung eines MDMA-Eichstandards
  • Eichstandards wurden gemäß den den ABUSCREEN® OnLine Preciset® MDMA-Eichstandards (Roche Diagnostics, Cat. No. 4745556) beigefügten Anweisungen hergestellt. Die Eichstandardlösungen enthielten 3,4-Methylendioxymethamphetamin in menschlichem Urin mit einem Konservierungsmittel. Die Endkonzentrationen an Eichstandard betrugen 0, 150, 300 und 600 ng/ml.
  • Beispiel 4. Assay mit MDMA-Eichstandard
  • Die gemäß Beispiel 3 hergestellten Eichstandards bzw. Vergleichsproben wurden gemäß den dem OnLine-Reagenskit beigefügten Anweisungen mit einem HITACHI 917-Analyzer (Roche Diagnostics) und einem Cutoff-Wert von 300 ng/ml getestet. Die verwendeten Parameter waren wie folgt: 10 μl Probe, 160 μl Antikörperreagens und 90 μl Mikropartikelreagens. Die Umsetzung wurde monochromatisch (505 nm) im Endpunkt (Ablesepunkt 19–33) durchgeführt. Die Dosis-Reaktions-Kurve ist in 2 gezeigt, wobei die Veränderung bei der Extinktion bei 505 nm auf der y-Achse und die MDMA-Konzentration auf der x-Achse aufgetragen sind.
  • Beispiel 5. Assay mit MDA-Eichstandard
  • Wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellte Eichstandards bzw. Vergleichsproben, wobei allerdings MDA anstelle von MDMA verwendet wurde, wurden gemäß den dem OnLine-Reagenskit beigefügten Anweisungen mit einem HITACHI 717-Analyzer (Roche Diagnostics) getestet. Die verwendeten Parameter waren wie folgt: 15 μl Probe, 170 μl Antikörperreagens und 80 μl Mikropartikelreagens. Die Umsetzung wurde monochromatisch (505 nm) im Endpunkt (27–50) durchgeführt. Die erhaltene Dosis-Reaktions-Kurve ist in 3 gezeigt, wobei die Veränderung bei der Extinktion bei 505 nm auf der y-Achse und die MDA-Konzentration auf der x-Achse aufgetragen sind.
  • Die bei der Verwendung von MDA als Eichstandard beobachteten Kreuzreaktivitäten waren wie folgt:
    Verbindung Roche Hitachi AMP/MDMA 300 ng/ml
    MDMA 81,0%
    MDA 100,0%
    d-AMP 319,0%
    l-AMP 15,2%
    d-MAMP 269,0%
    l-MAMP 24,7%
    dl-Ephedrin 0,34%
    l-PPA 6,2%
  • Beispiel 6. Assay von Urinproben
  • Urinproben, bei denen der Verdacht besteht, daß sie Amphetamin, Methamphetamin oder Methylendioxy-Designeramphetamine enthalten, wurden gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Vorschrift mit MDMA-Eichstandards in Konzentrationen von 0, 150, 300 und 600 ng/ml versetzt. Die Ergebnisse wurden erhalten, indem man die Veränderung bei der Extinktion bei 505 nm von einer unbekannten Probe mit den mit den Eichstandards mit bekannter Konzentration erhaltenen verglich. Die für 72 Urinproben erhaltenen Ergebnisse zeigten eine 100%ige Übereinstimmung mit einem chromatographischen Vergleichsverfahren zum Nachweis von Designeramphetaminen.

Claims (12)

  1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus der aus Amphetamin, Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe in einer biologischen Probe, welches die folgenden Schritte umfaßt: a. Zusammengeben einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, mit einem ersten Antikörper, der spezifisch für Amphetamin ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweist, einem zweiten Antikörper, der spezifisch für Methamphetamin ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweist, und einem Komplex, der einen an eine Markergruppe gekoppelten Liganden dieses Analyten enthält, b. Messen des Vorhandenseins von bzw. der Menge an Komplex, der an die Antikörper gebunden bleibt oder als Folge der kompetitiven Verdrängung durch den Analyten von den Antikörpern losgelöst wurde, und c. Vergleich des Vorhandenseins von bzw. der Menge an in Schritt b) gemessenem Komplex mit dem Vorhandensein bzw. der Menge eines ähnlichen, in einer eine bekannte Menge an einer Substanz ausgewählt aus der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe enthaltenden Vergleichsprobe gemessenen Komplexes, wobei die Vergleichsprobe gemäß Schritt (a) und (b) behandelt wurde.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Probe um Urin handelt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei der Substanz um 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) handelt.
  4. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus der aus Amphetamin, Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe in einer biologischen Probe, welches die folgenden Schritte umfaßt: a. Zusammengeben einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, mit einem Antikörper, der aus der aus Antikörpern, die spezifisch für Amphetamin sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, und Antikörpern, die spezifisch für Methamphetamin sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, bestehenden Gruppe ausgewählten Antikörper und weiterhin mit einem Komplex, der einen an eine Markergruppe gekoppelten Liganden dieses Analyten enthält, b. Messen des Vorhandenseins von bzw. der Menge an Komplex, der an die Antikörper gebunden bleibt oder als Folge der kompetitiven Verdrängung durch den Analyten von den Antikörpern losgelöst wurde, und c. Vergleich des Vorhandenseins von bzw. der Menge an in Schritt b) gemessenem Komplex mit dem Vorhandensein bzw. der Menge eines ähnlichen, in einer eine bekannte Menge an einer Substanz ausgewählt aus der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe enthaltenden Vergleichsprobe gemessenen Komplexes, wobei die Vergleichsprobe gemäß Schritt (a) und (b) behandelt wurde.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei der Probe um Urin handelt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei der Substanz um 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) handelt.
  7. Kit zum Durchführen eines Assays für die Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus der aus Amphetamin, Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe in einer biologischen Probe, enthaltend in einer abgepackten Kombination: a. einen ersten Antikörper, der amphetaminspezifisch ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweist, b. einen zweiten Antikörper, der methamphetaminspezifisch ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweist, c. einen Komplex, enthaltend einen Liganden von Amphetamin oder ein an eine Markergruppe gekoppeltes Amphetaminderivat, und d. einen Eichstandard, enthaltend eine bekannte Menge einer Substanz ausgewählt aus der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe.
  8. Kit nach Anspruch 7, wobei es sich bei der Probe um Urin handelt.
  9. Kit nach Anspruch 8, wobei es sich bei der Substanz um 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) handelt.
  10. Kit zum Durchführen eines Assays für die Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus der aus Amphetamin, Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe in einer biologischen Probe, enthaltend in einer abgepackten Kombination: a. einen Antikörper, ausgewählt aus der aus Antikörpern, die amphetaminspezifisch sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, und Antikörpern, die methamphetaminspezifisch sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, bestehenden Gruppe, b. einen Komplex, enthaltend einen Liganden von Amphetamin oder ein an eine Markergruppe gekoppeltes Amphetaminderivat, und c. einen Eichstandard, enthaltend eine bekannte Menge einer Substanz ausgewählt aus der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe.
  11. Kit nach Anspruch 10, wobei es sich bei der Probe um Urin handelt.
  12. Kit nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Substanz um 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) handelt.
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