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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet des Messens
eines Analyten in einem flüssigen Medium.
Genauer gesagt betrifft sie einen Assay zum Messen einer Droge in
einer biologischen Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung ein
hochempfindliches Immunoassayverfahren zum Nachweis von Amphetaminen,
Methamphetaminen, und Methylendioxy-Designeramphetaminen wie 3,4-Methylendioxymethamphetamin
(MDMA) in biologischen Proben.
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Die
Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin sind eine Reihe
von Verbindungen, die als "Designer"-Amphetamine bezeichnet werden. Wie in 1 dargestellt,
handelt es sich bei diesen psychotropen Drogen um ringsubstituierte
Derivate, die chemisch mit Mescalin verwandt sind. Sie schließen Methylendioxyamphetamin
(MDA), Methylendioxymethamphetamin (MDMA, auch als Ecstasy bekannt),
Methylendioxyethylamphetamin (MDEA), N-Methylbenzodioxazolylbutanamin
(MBDB), Benzodioxazol-5'-yl-2-butanamin
(BDB) und 4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin
(HMMA) ein, wobei MDMA am häufigsten
angetroffen wird.
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Es
wurde gezeigt, daß MDA
ein Metabolit sowohl von MDMA als auch von MDEA ist. In mehreren
Tierstudien wurde festgestellt, daß MDMA durch N-Demethylierung,
Desaminierung, O-Methylierung und O-Konjugation an Glucuronid und/oder
Sulfatmetaboliten metabolisiert wird. Nachgewiesen im Urin werden
die Stammdroge (MDMA), 3,4-Methylendioxylamphetamin (MDA), 4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin
(HMMA), 3-Hydroxy-4-methoxymethamphetamin, 4-Hydroxy-3-methoxyphenylaceton,
3,4-Methylendioxyphenylaceton
und 3,4-Dihydroxyphenylaceton. Die meisten dieser Metaboliten kommen
auch im Blut vor.
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Urin
und Blut sind die am häufigsten
untersuchten biologischen Matrizen für MDMA, MDA, MDEA und MBDB,
und sie sind in der Literatur gut dokumentiert. Von einer Bestimmung
dieser Designerdrogen in anderen biologischen Proben wie Speichel,
Schweiß und
Haaren wurde vor kurzem berichtet. In diesen Matrizen wird die Stammdroge
in höheren
Konzentrationen als ihre Metaboliten nachgewiesen.
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Der
Mißbrauch
dieser Designeramphetamine nimmt überall auf der Welt zu, und
ihr Nachweis durch Screening-Verfahren
gewinnt an Bedeutung. Zhao, H. et al., J. Anal. Toxicology 25, 258–269 (2001)
haben festgestellt, daß 71%
aller Urinproben von Teilnehmern an Rave-Parties MDMA oder MDA alleine oder in
Kombination mit Amphetamin oder anderen Designeramphetaminen wie
MDEA enthielten. Gegenwärtig
gibt es keine kommerziellen Immunoassays, die speziell für den Nachweis
dieser Substanzen entwickelt wurden, und ihr Nachweis hängt daher
von den relativen Kreuzreaktivitäten
ab, die sie bei dem angewandten Amphetamin- bzw. Methamphetamin-Screeningverfahren
zeigen. Im allgemeinen ist die Kreuzreaktivität der im Handel erhältlichen
Amphetamin- bzw.
Methamphetamin-Assays hinsichtlich vieler dieser Verbindungen niedrig,
was nahelegt, daß einige
positive Proben nicht nachgewiesen werden könnten.
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Beim
Testen auf Drogen haben sich Immunoassays, insbesondere Immunoassays
auf kompetitive Bindung, als besonders vorteilhaft erwiesen. Bei
Immunoassays auf kompetitive Bindung konkurriert ein Analyt in einer
biologischen Probe mit einem markierten Reagens, oder einem Analytanalogon,
oder einem Tracer, um eine begrenzte Anzahl von Rezeptorbindungsstellen
auf für
den Analyten und das Analytanalogon spezifischen Antikörpern. Enzyme
wie β-Galactosidase
und Peroxidase, fluoreszente Moleküle wie Fluoresceinverbindungen,
radioaktive Verbindungen wie 125I und Mikropartikel
sind häufig
verwendete Markierungssubstanzen, die als Tracer eingesetzt werden.
Durch die Analytkonzentration in der Probe ist die Menge an Analytanalogon,
die vom Antikörper
gebunden wird, festgelegt. Die Menge an Analytanalogon, die gebunden
wird, ist umgekehrt proportional zur Analytkonzentration in der
Probe, da Analyt und Analytanalogon jeweils im Verhältnis zu
ihren jeweiligen Konzentrationen vom Antikörper gebunden werden. Die Menge
an freiem bzw. gebundenem Analytanalogon läßt sich dann nach dem jeweils
verwendeten Marker entsprechenden Verfahren bestimmen.
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Die
Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) ist hochspezifisch,
und der gleichzeitige Nachweis von MDMA, MDA, Amphetamin, Methamphetamin,
MDEA und ihren Metaboliten damit wurde beschrieben. Für die Bestätigung und
Verifikation der Ergebnisse eines immunologischen Assays oder einer zweifelhaften
Diagnose ist gewöhnlich
eine GC/MC-Analyse erforderlich. Bei diesem Verfahren werden MDMA oder
Designerdrogen in fester Phase extrahiert und dann derivatisiert
und mittels GC/MS analysiert.
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In
dem am 26 März
1996 erteilten
US-Patent Nr.
5,501,987 beschreiben Ordonez et al. ein Zwei-Analyten-Immunoassay für die Bestimmung
von Amphetamin und Methamphetamin unter Verwendung eines einfach
markierten Bindungspartners, der dazu in der Lage ist, mit verschiedenen
Empfindlichkeiten mit von Konjugatderivaten von Amphetamin und Methamphetamin
abgeleiteten Antikörpern
eine Kreuzreaktion einzugehen. Die verwendeten Eichstandards werden
hergestellt, indem man drogenfreien, normalen menschlichen Urin
mit d-Amphetamin
versetzt.
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Kunsman
et al. (J. Analyt. Toxicol. 14, 1990, Seiten 149–153) offenbaren die Anwendung
von Amphetamin-Immunoassays
zum Nachweis von Methylendioxy-Designeramphetaminen. Als Standards
werden Amphetaminlösungen verwendet.
Die Verwendung eines eine bekannte Menge an Methylendioxy- Designeramphetamin
enthaltenden Standards wird von Kunsman et al. nicht gelehrt.
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EP-A-0674782 gehört zur gleichen
Patentfamilie wie das
US-Patent
Nr. 5,262,333 und offenbart die Anwendung eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays
zur Bestimmung von Amphetamin und Methamphetamin in einer biologischen
Probe. Die beschriebene Vorschrift umfaßt eine Vorbehandlung der biologischen
Probe mit Periodat und riboflavinbindendem Protein zum Eliminieren
von Kreuzreaktanten wie β-Hydroxyphenethylamin.
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In
der
EP-A-0375422 wird
ein Immunoassay beschrieben, mit dem sich das Vorhandensein von
Amphetaminen in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin
und/oder Methamphetamin enthält, nachweisen
läßt, indem
man wenigstens zwei Konjugate einsetzt, die jeweils aus einem funktionell ähnlichen, an
ein Amphetaminanalogon bzw. ein Methamphetaminanalogon gebundenen
Marker und einem Antikörper gegen
Amphetamin und einem Antikörper
gegen Methamphetamin bestehen, wobei es sich bei wenigstens einem
der Antikörper
um einen monoklonalen Antikörper
handelt.
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Ruangyuttikarn
und Moody (J. Analyt. Toxicol. 12 (4): 229–233 (1988)) offenbaren einen
Vergleich von drei im Handel erhältlichen
Amphetamin-Immunoassays zum Nachweis von Methamphetamin, Methylendioxyamphetamin,
Methylendioxymethamphetamin und Methylendioxyethylamphetamin. Alle
Assays wurden mit Amphetamin als Vergleichssubstanz geeicht.
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Ward
et al. (Journal of Forensic Sciences, 39 (6), 1994, Seiten 1486–1496) offenbaren
einen Radioimmunoassay für
den dualen Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin. Bei dem Verfahren
werden Amphetamin oder Methamphetamin als Eichstandards verwendet.
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Cody
und Schwarzhoff (J. Analyt. Toxicol. 17 (1993), Seiten 26–30) beschreiben
einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für den Nachweis von Amphetamin,
Methamphetamin und Amphetaminanaloga. Auch bei diesem Verfahren
werden Amphetamin und Methamphetamin als Eichstandards verwendet
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KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
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Ganz überraschend
wurde entdeckt, daß sich
ein hochspezifisches Immunoassayverfahren zum Nachweis von Amphetaminen,
Methamphetaminen und Methylendioxy-Designeramphetaminen wie 3,4-Methylendioxymethamphetamin
(MDMA) in Urinproben erzielen läßt, indem
man einen Eichstandard, umfassend eine Substanz ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Methylendioxy-Designeramphetaminen in drogenfreiem,
normalem menschlichen Urin und einen Antikörper mit Spezifität für Amphetamin
oder Methamphetamin und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von
Methylendioxyphenylalkylamin verwendet.
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus
der aus Amphetamin, Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen
bestehenden Gruppe in einer biologischen Probe, welches die folgenden
Schritte umfaßt:
- a. Zusammengeben einer Probe, von der vermutet
wird, daß sie
den Analyten enthält,
mit einem ersten Antikörper,
der spezifisch für
Amphetamin ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von
Methylendioxyphenylalkylamin aufweist, einem zweiten Antikörper, der
spezifisch für
Methamphetamin ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von
Methylendioxyphenylalkylamin aufweist, und einem Komplex, der einen
an eine Markergruppe gekoppelten Liganden dieses Analyten enthält,
- b. Messen des Vorhandenseins von bzw. der Menge an Komplex,
der an die Antikörper
gebunden bleibt oder als Folge der kompetitiven Verdrängung durch
den Analyten von den Antikörpern
losgelöst
wurde, und
- c. Vergleich des Vorhandenseins von bzw. der Menge an in Schritt
b) gemessenem Komplex mit dem Vorhandensein bzw. der Menge eines ähnlichen,
in einer eine bekannte Menge an einer Substanz ausgewählt aus
der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe enthaltenden
Vergleichsprobe gemessenen Komplexes, wobei die Vergleichsprobe
gemäß Schritt
(a) und (b) behandelt wurde.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus
der aus Amphetamin, Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen
bestehenden Gruppe in einer biologischen Probe, welches die folgenden
Schritte umfaßt:
- a. Zusammengeben einer Probe, von der vermutet
wird, daß sie
den Analyten enthält,
mit einem Antikörper, der
aus der aus Antikörpern,
die spezifisch für
Amphetamin sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von
Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, und Antikörpern, die
spezifisch für
Methamphetamin sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von
Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, bestehenden Gruppe ausgewählten Antikörper und
weiterhin mit einem Komplex, der einen an eine Markergruppe gekoppelten
Liganden dieses Analyten enthält,
- b. Messen des Vorhandenseins von bzw. der Menge an Komplex,
der an die Antikörper
gebunden bleibt oder als Folge der kompetitiven Verdrängung durch
den Analyten von den Antikörpern
losgelöst
wurde, und
- c. Vergleich des Vorhandenseins von bzw. der Menge an in Schritt
b) gemessenem Komplex mit dem Vorhandensein bzw. der Menge eines ähnlichen,
in einer eine bekannte Menge an einer Substanz ausgewählt aus
der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe enthaltenden
Vergleichsprobe gemessenen Komplexes, wobei die Vergleichsprobe
gemäß Schritt
(a) und (b) behandelt wurde.
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Bei
beiden Verfahren wird als Probe vorzugsweise Urin verwendet und
als die in einer bekannten Menge in einer Vergleichsprobe vorhandene
Substanz wird vorzugsweise 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA)
verwendet.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
gibt man eine Probe, von der vermutet wird, daß sie Amphetamin, Methamphetamin
oder eine strukturell verwandte Droge enthält, mit einem Antikörper, der
für Amphetamin
oder Methamphetamin spezifisch ist, und einem markierten Bindungspartner,
der mit der Kombination von Antikörper und seinem entsprechenden
Analyten in Wechselwirkung treten kann, zusammen, um das Vorhandensein
der Analyten bei ausgewählten
Cutoff-Konzentrationen entweder alleine oder in Kombination nachzuweisen.
Der betreffende verwendete Antikörper
bzw. die betreffenden verwendeten Antikörper müssen eine Kreuzreaktion mit
Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin zeigen. Die vorliegende
Erfindung kann mit allen Immunoassayformattypen, zum Beispiel einem
turbidometrischen Agglutinationsassay, einem Radioimmunoassay, einem
Enzymimmunoassay oder einem Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay
angewendet werden.
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Besonders
bevorzugt ist die Anwendung der vorliegenden Erfindung mit agglutinometrischen
Formaten, die gegenüber
einem instrumentellen Verfahren zur Messung der durch die Agglutinationsreaktion
bewirkten Veränderungen
empfindlich sind. Für
eine solche agglutinometrische Analyse können sowohl manuelle als auch
automatisierte Apparate-Testverfahren geeignet eingesetzt werden.
Typischerweise verläuft
der Betrieb einer automatisierten Instrumentierung unter Verwendung
einer Mehrzahl an Reagensbehältern
bzw. -reservoiren, aus denen die entsprechende Menge jedes Reagens
für die
Zugabe zur Probe pipettiert wird. Bei Immunoassays wie dem in Rede
stehenden Agglutinationsassay wird man sich gewöhnlich wenigstens zweier dieser
Behälter
bedienen; typischerweise eines für
ein Antikörperreagens
und des anderen für
die an den entsprechenden Liganden gebundenen Mikropartikel. Bei
einigen Instrumenten können
weitere Behälter
bzw. -reservoire mit Verdünnungsmittel,
Puffern oder anderen Zusätzen
für die
entsprechende Behandlung der Probe vorhanden sein.
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Der
klinische Analyzer pipettiert die darin befindlichen Reagentien
und Proben in eine Küvette,
in der die kompetitive Agglomerationsreaktion stattfindet, und die
Eintrübung
wird gemessen. Zum Beispiel wird bei der Verwendung des HITACHI
917-Analyzers (Roche Diagnostics) und des ABUSCREEN® OnLine
Amphetamin-Reagenskits
(Roche Diagnostics, Kat.-Nr. 1985965) die Urinprobe mit dem Probenverdünnungsmittel
in die Küvette
pipettiert, unmittelbar gefolgt von der entsprechenden Menge an
Antikörperreagens
und Mischen. Ein Spektrophotometer-Ausgangswert wird abgelesen.
Dann wird die entsprechende Menge an Mikropartikelreagens in die
Küvette überführt, und
der Ansatz wird durchmischt. Nach einer kurzen Inkubation wird eine
abschließende
Turbiditätsmessung
vorgenommen. Die Gesamtänderung
bei der Turbidität
(Extinktion) im Ansatz wird mit einer Eichkurve verglichen, und
die Ergebnisse werden in ng/ml angegeben.
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Die
vorliegende Erfindung umfaßt
außerdem
ein Reagens-Testkit,
das in einer abgepackten Kombination einen für Amphetamin spezifischen Antikörper, einen
für Methamphetamin
spezifischen Antikörper,
einen Komplex umfassend einen Liganden von Amphetamin oder ein Amphetaminderivat
gekoppelt an eine Markergruppe und einen Eichstandard umfassend
eine bekannte Menge einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Methylendioxy-Designeramphetaminen enthält. Solch ein Testkit stellt
die Reagentien für
einen Assay mit verbesserter klinischer Empfindlichkeit für MDMA und
strukturell verwandte Verbindungen bereit.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Kit zum Durchführen eines
Assays für
die Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus der aus Amphetamin,
Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden
Gruppe in einer biologischen Probe, enthaltend in einer abgepackten
Kombination:
- a. einen ersten Antikörper, der
amphetaminspezifisch ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von Methylendioxyphenylalkylamin
aufweist,
- b. einen zweiten Antikörper,
der methamphetaminspezifisch ist und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga
von Methylendioxyphenylalkylamin aufweist,
- c. einen Komplex, enthaltend einen Liganden von Amphetamin oder
ein an eine Markergruppe gekoppeltes Amphetaminderivat, und
- d. einen Eichstandard, enthaltend eine bekannte Menge einer
Substanz ausgewählt
aus der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Kit zum Durchführen eines
Assays für
die Bestimmung eines Analyten ausgewählt aus der aus Amphetamin,
Methamphetamin und Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden
Gruppe in einer biologischen Probe, enthaltend in einer abgepackten
Kombination:
- a. einen Antikörper, ausgewählt aus
der aus Antikörpern,
die amphetaminspezifisch sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von
Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, und Antikörpern, die
methamphetaminspezifisch sind und Kreuzreaktivität mit Amphetaminanaloga von
Methylendioxyphenylalkylamin aufweisen, bestehenden Gruppe,
- b. einen Komplex, enthaltend einen Liganden von Amphetamin oder
ein an eine Markergruppe gekoppeltes Amphetaminderivat, und
- c. einen Eichstandard, enthaltend eine bekannte Menge einer
Substanz ausgewählt
aus der aus Methylendioxy-Designeramphetaminen bestehenden Gruppe.
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Beide
Kits werden vorzugsweise für
Urin als biologische Probe verwendet. Vorzugsweise enthalten beide
Kits 3,4-Methylendioxymethamphetamin
(MDMA) als die Substanz, die in einer bekannten Menge in dem Eichstandard
enthalten ist.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die Strukturen von Amphetamin, Methamphetamin und 3,4-Methylendioxy-Designerdrogen.
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2 ist
eine Dosis-Reaktions-Kurve, die mit dem einen für Amphetamin spezifischen Antikörper, einen
für Methamphetamin
spezifischen Antikörper
und Eichstandards mit bekannten Mengen an MDMA enthaltenden Assay
der vorliegenden Erfindung erstellt wurde.
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3 ist
eine Dosis-Reaktions-Kurve, die mit dem einen für Amphetamin spezifischen Antikörper, einen
für Methamphetamin
spezifischen Antikörper
und Eichstandards mit bekannten Mengen an MDA enthaltenden Assay
der vorliegenden Erfindung erstellt wurde.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Im
Handel sind gegenwärtig
keine Immunoassaykits für
die Bestimmung von MDMA erhältlich.
Die einzige Möglichkeit,
MDMA mittels eines Immunoassays zu bestimmen, ist die Verwendung
von Reagentien oder eines Reagenskits zur Bestimmung von Amphetamin
oder Methamphetamin, umfassend einen Amphetamin-Antikörper und
einen Methamphetamin-Antikörper
mit hoher Kreuzreaktivität
mit MDMA und die Verwendung von Amphetamin oder Methamphetamin als
Eichstandard. Bei der vorliegenden Erfindung wird eine Substanz
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Methylendioxy-Designeramphetaminen
für die
Eichung eines im Handel erhältlichen
Assays, bei dem Antikörper
gegen Amphetamin und Methamphetamin zum Einsatz kommen, verwendet.
Durch die Verwendung eines Methylendioxy-Designeramphetamin-Eichstandard wird
die klinische Empfindlichkeit für
MDMA, MBDB, MDA, MDE und BDB signifikant gesenkt, ohne daß es zu
einer signifikanten Erhöhung
bei Medikamenten wie β-Hydroxyphenylaminen,
zum Beispiel Ephedrin, Pseudoephedrin, Phentamin, Tyramin und Phenylpropanolamin
(PPA) kommt.
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Verwendete Abkürzungen:
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- AMP
- Amphetamin
- BDB
- (+/–)-(3,4-Methylendioxyphenyl)-2-butanamin
- HMMA
- 4-Hydroxy-3-methoxymethamphetamin
- MAMP
- Methamphetamin
- MBDB
- (+/–)-N-Methyl-1-(3,4-methylendioxyphenyl)-2-butanamin
- MDA
- (+/–)-3,4-Methylendioxyamphetamin
- MDEA
- (+/–)-3,4-Methylendioxyethylamphetamin
- MDMA
- (+/–)-3,4-Methylendioxymethamphetamin
- NT
- nicht getestet
- PPA
- Phenylpropanolamin
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Kreuzreaktivitäten von
gegenwärtig
auf dem Markt befindlichen Assays für MDMA and MDA gemäß der publizierten
Literatur sowie Kreuzreaktivitäten
gemäß des Verfahrens
der vorliegenden Erfindung sind in der Tabelle unten aufgeführt.
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Unter "Methylendioxy-Designeramphetaminen" ist die Gruppe von
Amphetaminanaloga bestehend aus Methylendioxyphenylalkylamin einschließlich 3,4-Methylendioxyamphetamin
(MDA), 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA, Ecstasy), 3,4-Methylendioxyethylamphetamin
(MDEA), N-Methyl-1-(3,4-methylendioxyphenyl)-2-butanamin(N-methyl)benzodioxazolylbutanamin)
(MBDB) und 3,4-Methylendioxyphenyl-2-butanamin(benzodioxazol-5'-yl-2-butanamin) (BDB) zu verstehen.
Verbindung | Roche
Hitachi
AMP
500 ng/ml | Roche
Integra
AMPSC
500 ng/ml | Abbott
TDX
AMP/methAMP
1000 ng/ml | CEDIA
DAU
AMP
1000 ng/ml | Roche
Hitachi
AMP/MDMA
300 ng/ml |
MDMA | 36% | 79% | 97% | 69% | 100,0% |
MDA | 35,5% | 40% | 148% | 1,9% | 25,0% |
MDEA | NT | NT | 42,7% | 2,4% | 15,0% |
MBDB | NT | NT | (+) | NT | 70,0% |
BDB | NT | NT | (+) | NT | 4,7% |
d-AMP | 100% | 100% | 100% | 101% | 97,0% |
l-AMP | 6% | 4.2% | 56,9% | 3.0% | 3,8% |
d-MAMP | 82,2% | 12% | 97,8% | 100% | 300.0% |
l-MAMP | 0,8% | 12% | 7,2% | 12% | 18% |
dl-Ephedrin | < 0,1% | < 0,1% | NT | 0,4% | < 0,3% |
l-PPA | 1,5% | 1,1% | NT | NT | 0,6% |
HMMA | NT | NT | NT | NT | < 0,3% |
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Bei
den in der obigen Tabelle für
die einzelnen Verfah ren angegebenen Cutoff-Konzentrationen handelt
es sich um die bei dem Test für
die Bestimmung eines positiven Ergebnisses erforderliche Konzentration an
Drogen.
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Beispiel 1. Herstellung eines Antikörper-Reagens
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Ein
erstes Reagens wurde nach den dem ABUSCREEN® OnLine
HS Amphetamin/MDMA-Reagenskit (Roche Diagnostics, Kat.-Nr. 1986619) beiliegenden
Anweisungen hergestellt. Das Reagens enthielt monoklonale Amphetamin-
und Methamphetamin-Antikörper
(Maus) in einem Puffer mit Rinderserumalbumin und einem Konservierungsmittel.
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Beispiel 2. Herstellung eines Mikropartikelreagens
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Ein
zweites Reagens wurde gemäß den dem
ABUSCREEN® OnLine
HS Amphetamin/MDMA-Reagenskit (Roche Diagnostics, Kat.-Nr. 1986619)
beigefügten
Anweisungen hergestellt. Das Reagens enthielt ein mit Latex-Mikropartikeln konjugiertes
Amphetaminderivat in einem Puffer mit einem Konservierungsstoff.
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Beispiel 3. Herstellung eines MDMA-Eichstandards
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Eichstandards
wurden gemäß den den
ABUSCREEN® OnLine
Preciset® MDMA-Eichstandards
(Roche Diagnostics, Cat. No. 4745556) beigefügten Anweisungen hergestellt.
Die Eichstandardlösungen
enthielten 3,4-Methylendioxymethamphetamin in menschlichem Urin
mit einem Konservierungsmittel. Die Endkonzentrationen an Eichstandard
betrugen 0, 150, 300 und 600 ng/ml.
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Beispiel 4. Assay mit MDMA-Eichstandard
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Die
gemäß Beispiel
3 hergestellten Eichstandards bzw. Vergleichsproben wurden gemäß den dem OnLine-Reagenskit
beigefügten
Anweisungen mit einem HITACHI 917-Analyzer (Roche Diagnostics) und
einem Cutoff-Wert von 300 ng/ml getestet. Die verwendeten Parameter
waren wie folgt: 10 μl
Probe, 160 μl
Antikörperreagens
und 90 μl
Mikropartikelreagens. Die Umsetzung wurde monochromatisch (505 nm)
im Endpunkt (Ablesepunkt 19–33)
durchgeführt.
Die Dosis-Reaktions-Kurve ist in 2 gezeigt,
wobei die Veränderung
bei der Extinktion bei 505 nm auf der y-Achse und die MDMA-Konzentration
auf der x-Achse aufgetragen sind.
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Beispiel 5. Assay mit MDA-Eichstandard
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Wie
in Beispiel 3 beschrieben hergestellte Eichstandards bzw. Vergleichsproben,
wobei allerdings MDA anstelle von MDMA verwendet wurde, wurden gemäß den dem
OnLine-Reagenskit beigefügten
Anweisungen mit einem HITACHI 717-Analyzer (Roche Diagnostics) getestet.
Die verwendeten Parameter waren wie folgt: 15 μl Probe, 170 μl Antikörperreagens
und 80 μl
Mikropartikelreagens. Die Umsetzung wurde monochromatisch (505 nm)
im Endpunkt (27–50)
durchgeführt.
Die erhaltene Dosis-Reaktions-Kurve
ist in 3 gezeigt, wobei die Veränderung bei der Extinktion
bei 505 nm auf der y-Achse und die MDA-Konzentration auf der x-Achse
aufgetragen sind.
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Die
bei der Verwendung von MDA als Eichstandard beobachteten Kreuzreaktivitäten waren
wie folgt:
Verbindung | Roche
Hitachi
AMP/MDMA
300 ng/ml |
MDMA | 81,0% |
MDA | 100,0% |
d-AMP | 319,0% |
l-AMP | 15,2% |
d-MAMP | 269,0% |
l-MAMP | 24,7% |
dl-Ephedrin | 0,34% |
l-PPA | 6,2% |
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Beispiel 6. Assay von Urinproben
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Urinproben,
bei denen der Verdacht besteht, daß sie Amphetamin, Methamphetamin
oder Methylendioxy-Designeramphetamine enthalten, wurden gemäß der in
Beispiel 4 beschriebenen Vorschrift mit MDMA-Eichstandards in Konzentrationen
von 0, 150, 300 und 600 ng/ml versetzt. Die Ergebnisse wurden erhalten,
indem man die Veränderung
bei der Extinktion bei 505 nm von einer unbekannten Probe mit den
mit den Eichstandards mit bekannter Konzentration erhaltenen verglich.
Die für
72 Urinproben erhaltenen Ergebnisse zeigten eine 100%ige Übereinstimmung
mit einem chromatographischen Vergleichsverfahren zum Nachweis von
Designeramphetaminen.