DE60115222T2

DE60115222T2 - Kombination von defibrotid und g-csf und ihre verwendung zur aktivierung hämatopoietischer vorläuferzellen

Info

Publication number: DE60115222T2
Application number: DE60115222T
Authority: DE
Inventors: Laura Ferro; Roberto Porta; Massimo Iacobelli; Massimo Alessandro GIANNI; Carlo Carmelo STELLA
Original assignee: Gentium SRL
Current assignee: Gentium SRL
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2001-04-10
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2021-04-11
Also published as: NO20024988D0; ATE310532T1; IL152328A; US20040131588A1; AU2001258322B2; SI21079A; DK1621207T3; EP1621207A3; CA2406179A1; EE200200596A; EP1147777A1; RO121006B1; CA2406179C; PL358100A1; DE60140015D1; EP1276497B1; ATE443524T1; KR20030010603A; CN1434719A; IL152328A0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Formulierung, die zur Erhöhung der Menge an Stammzellen und Vorläuferzellen in der Lage ist, die im peripheren Blut eines Säugers zirkulieren; die Formulierung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie Defibrotid in Kombination mit mindestens einem hämatopoietischen Faktor mit der Fähigkeit enthält, hämatopoietische Vorläuferzellen zu mobilisieren, vorzugsweise G-CSF.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Möglichkeit des Erhaltens einer erhöhten Menge an Stammzellen und hämatopoietischen Vorläufern, die sich im Umlauf im peripheren Blut eines Säugers und insbesondere in dem eines Menschen befinden, ist seit Jahren Gegenstand intensiver Forschungsaktivität gewesen; die Verfügbarkeit von Stammzellen und/oder hämatopoietischen Vorläuferzellen ist in der Tat in Bereichen wie der antologen Transplantation umlaufender hämapoietischer Vorläuferzellen, der Alotransplantation von umlaufenden hämapoietischen Vorläuferzellen und in Programmen zur Gentherapie von umlaufenden hämapoietischen Zellen besonders wichtig.
Obgleich nach der Geburt Stammzellen und Vorläuferzellen nahezu ausschließlich im Knochenmark lokalisiert sind, zeigen sie nichtsdestotrotz Migrationseigenschaften; d.h. sie migrieren unter physiologischen Bedingungen durch die Kavitäten des Knochenmarks und treten in die Zirkulation ein. Dieser Prozeß, der gewöhnlich als "Mobilisierung" bekannt ist, kann in Säugern durch unterschiedliche Behandlungen verstärkt werden, wie etwa z.B. der Verabreichung von Cytokinen und insbesondere den Wachstumsfaktor von Granulozytenkolonien (G-CSF); der umgekehrte Prozeß, bekannt als "Homing", tritt zum Beispiel in bestrahlten Empfängern nach der Transplantation hämatopoietischer Zellen auf; die Mechanismen, auf denen das Mobilisieren und das Homing beruhen, sind jedoch nach wie vor unklar (C.F. Craddock et al., "Antibodies to VLA4 Integrin Mobilize Long-Term Re-populating Cells and Augment Cytokin-Induced Mobilization in Primates and Mice", Blood, Bd. 90, Nr. 12, 1997, S. 4779-4788; F. Prosper et al., "Mobilization and Homing of Peripheral Blood Progenitors is Related to Reversible Downregulation of α4β1 Integrin Expression and Function", J. Clin. Invest., Bd. 101, Nr. 11, 1998, S. 2456-2467; N. Vermuelen et al., "Role of Adehsion Molecules in the Homing and Mobilization of Murine Hämatopoietic Stem and Progenitor Cells", Blood, Bd. 92, Nr. 3, 1998, S. 894-990).
G-CSF (CAS-Registriernummer 143011-2-7/Merck Index, 1996, S. 4558) ist ein hämatopoietischer Wachstumsfaktor, der zur Proliferation und Differenzierung der Vorläuferzellen von Granulozyten unersetzlich ist; es ist ein 18-22-kDa-Glycoprotein, welches normalerweise als Antwort auf eine spezifische Stimulierung durch eine Reihe von Zellen, einschließlich Monozyten, Fibroblasten und Endothelzellen, erzeugt wird. Der Ausdruck Defibrotid (CAS-Registriernummer 83712-60-1) definiert normalerweise ein Polydeoxyribonucleotid, das durch Extraktion ( US 3,770,720 und US 3,899,481 ) aus Tier- und/oder Gemüsegewebe erhalten wurde; dieses Polydeoxyribonucleotid wird normalerweise in Form eines Salzes eines Alkalimetalls, im allgemeinen Natrium, verwendet. Defibrotid wird hauptsächlich wegen seiner Antithrombose-Wirksamkeit ( US 3,829,567 ) verwendet, obgleich es in unterschiedlichen Applikationen verwendet werden kann, wie z.B. der Behandlung akuter Niereninsuffizienz ( US 4,694,134 ) und der Behandlung akuter myokardialer Ischämie ( US 4,693,995 ). Die US-Patente US 4,985,552 und US 5,223,609 schließlich beschreiben ein Verfahren zum Herstellen von Defibrotid, das den Erhalt eines Produkts ermöglicht, welches konstante und gut definierte physikochemische Eigenschaften besitzt und ferner frei von unerwünschten Nebeneffekten ist.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sollte der Ausdruck Defibrotid deshalb in der Bedeutung jeglichen Oligonucleotids und/oder Polynucleotids verstanden werden, das durch Extraktion aus Tier- und/oder Gemüsegewebe, insbesondere aus den Organen von Säugern, erhalten wurde. Vorzugsweise wird Defibrotid gemäß den in den oben aufgelisteten Patenten beschriebenen Verfahren hergestellt, die somit als einen integralen Bestandteil der vorliegenden Beschreibung angesehen werden sollten noch weiter bevorzugt wird es gemäß dem in den US-Patenten US 4,985,552 und US 5,223,609 beschriebenen Verfahren hergestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist nun überraschenderweise gefunden worden, daß es möglich ist, eine erhöhte Mobilisierung von Stammzellen und hämatopoietischen Vorläuferzellen zu erhalten durch Verabreichung von Defibrotid in Kombination und/oder in enger Zeitnähe mit einem hämatopoietischen Faktor, der die Fähigkeit aufweist, hämatopoietische Vorläuferzellen zu mobilisieren.
Wie aus den Beispielen zu würdigen sein wird, gestattet die Verabreichung von Defibrotid in Kombination und/oder in enger Zeitnähe mit einem hämatopoietischen Faktor mit der Fähigkeit, hämatopoietische Vorläuferzellen zu mobilisieren, das Erzielen von Mobilisierungsgraden, die viel höher sind als jene, die durch Verabreichung des hämatopoietischen Faktors alleine erhältlich sind.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird deshalb repräsentiert durch eine Formulierung, die als "Wirkstoffe" Defibrotid in Kombination mit mindestens einem hämatopoietischen Faktor mit der Fähigkeit, hämatopoietische Vorläuferzellen zu mobilisieren, vorzugsweise G-CSF, enthält. In ihrer bevorzugten Ausführungsform ist diese Formulierung aufgebaut durch eine injizierbare wässrige Lösung; alternativ könnte die Formulierung aufgebaut sein aus zwei unterschiedlichen Lösungen, einer, die Defibrotid enthält, und der anderen, die den hämatopoietischen Faktor mit der Fähigkeit, hämatopoietische Vorläuferzellen zu mobilisieren, enthält. Die Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung ist deshalb als eine kombinierte Präparation ausgestaltet, zum gleichzeitigen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Gebrauch der vorerwähnten aktiven Wirkstoffe, um die Menge an Stammzellen und/oder hämatopoietischen Vorläuferzellen zu erhöhen, die sich in Zirkulation im peripheren Blut eines Säugers befinden.
Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird repräsentiert durch die Verwendung von Defibrotid in Kombination mit mindestens einem hämatopoietischen Faktor mit der Fähigkeit, hämatopoietische Vorläuferzellen zu mobilisieren, zur Herstellung von Formulierungen, die zur Erhöhung der Menge von Stammzellen und/oder hämatopoietischen Vorläuferzellen, die sich in Zirkulation in peripherem Blut eines Säugers, vorzugsweise eines Menschen befinden, in der Lage sind.
Schließlich macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Menge von Stammzellen und/oder hämatopoietischen Vorläuferzellen, die sich in Zirkulation in peripherem Blut ei nes Säugers befinden, möglich, dadurch gekennzeichnet, daß Defibrotid dem Säuger in Kombination oder in zeitlicher Nähe mit mindestens einem hämatopoietischen Faktor mit der Fähigkeit, hämatopoietische Vorläuferzellen zu mobilisieren, verabreicht wird. Der hämatopoietische Faktor, der zum Ausführen der Experimente verwendet wurde, die zur vorliegenden Erfindung führten, ist G-CSF; es ist jedoch nicht auszuschließen, daß ähnliche Ergebnisse erhalten werden können mit anderen hämatopoietischen Faktoren als G-CSF, aber nichtsdestoweniger die Fähigkeit besitzen, hämatopoietische Vorläuferzellen zu mobilisieren, wie z.B. dem Wachstumsfaktor von Granulozyten- und Makrophagenkolonien (GM-CSF), dem "Flt3-Liganden" (FL), dem "Stammzellenfaktor" (stem cell factor, SCF), dem Thrombopoietin (TPO), dem Interleukin 8 (IL8) sowie anderen, die dem Fachmann klar sein dürften.
Das Defibrotid, welches in diesem ersten experimentellen Stadium in Kombination mit G-CSF verwendet wurde, war das Defibrotid, welches gegenwärtig von Crinos Spa unter der Marke "Prociclide^TM vermarktet wird und gemäß dem in den US-Patenten US 4,985,552 und US 5,223,609 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
Defibrotid und der hämapoietische Faktor mit der Fähigkeit, hämapoietische Vorläuferzellen zu mobilisieren, können Säugern (und insbesondere Menschen) verabreicht werden in Übereinstimmung mit den im Stand der Technik bekannten Methoden und Posologien; im allgemeinen werden sie oral, intramuskulär, intraperitoneal, subkutan oder intravenös verabreicht, wobei die zuletzt genannte Route die bevorzugte ist.
Die zwei wirksamen Bestandteile können auch simultan oder aufeinanderfolgend verabreicht werden. Das heißt, sie werden im ersten Fall mittels einer Einzelformulierung verabreicht, die beide wirksamen Bestandteile enthält und zu der die gewöhnlichen Arzneimittelträger und/oder Co-Adjuvanzien, die im Stand der Technik bekannt sind, wahlweise zugefügt wurden; alternativ können die beiden wirksamen Bestandteile aufeinanderfolgend verabreichend werden, nämlich mittels zwei unterschiedlicher Formulierungen, wobei die eine den hämatopoietischen Faktor mit der Fähigkeit, hämatopoietische Vorläuferzellen zu mobilisieren, vorzugsweise G-CSF enthält, und die andere das Defibrotid enthält.
Im allgemeinen wird G-CSF subkutan bei einer Dosis von 5 bis 24 μg/kg verabreicht, wohingegen DEF durch kontinuierliche Infusion bei einer Dosierung von 5 bis 15 mg/kg/h für 2-7 Tage verabreicht werden wird.
Wie aus den beigefügten Beispielen, die als reine, nicht begrenzende Veranschaulichungen der Erfindung anzusehen sind, zu würdigen sein wird, gestattet die kombinierte Verabreichung von G-CSF und Defibrotid an Mäusen als dem gebräuchlichsten experimentellen Säugermodell sowie an Affen das Erzielen von Mobilisierungsgraden, die viel höher sind als jene, die durch Verabreichung von G-CSF alleine erhältlich sind, mit den deutlichen Vorteilen für alle jene therapeutischen Gebiete, für die ein hoher Grad an Mobilisierung erwünscht ist.
BEISPIEL 1
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung der Verabreichung von G-CSF und/oder Defibrotid (DEF) auf die Menge an weißen Blutzellen (WBC), die im Blut der Maus vorliegen, zu beurteilen. BALB/c-Mäuse, die sechs bis acht Wochen alt waren und ein Körpergewicht von 20 bis 25 g aufwiesen, wurden intraperi tonealen (EP) Injektionen von G-CSF (5 μg/Maus/Tag), DEF (1 mg/Maus/Tag) oder einer Kombination von G-CSF (5 μg/Maus/Tag) sowie ansteigenden Dosen von DEF (1, 10, 15 mg/Maus/Tag) unterzogen. Den Kontrollmäusen, die kein G-CSF und/oder DEF empfingen, wurden eine Salzlösung, die auf 0,1% Mäuseserumalbumin gepuffert war (PBS/MSA), mittels IP-Injektion verabreicht. Die Mäuse wurden fünf Tage behandelt und nach drei oder fünf Tagen der Behandlung, oder drei Tage nach Abbruch der Therapie geopfert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 1 wiedergegeben. Die folgenden Symbole wurden zur Veranschaulichung von jeder Mausgruppe verwendet: G-CSF (∎) (n = 24), DEF 1 (o) (n = 3), G-CSF + DEF 1 (♦) (n = 13), G-CSF + DEF 10
(n = 6), G-CSF + DEF 15 (•) (n = 23). Die mittlere Zahl weißer Blutzellen in PBS/MSA in den Kontrollmäusen betrug 2,87 ± 0,2 × 10⁶/ml Blut; die Daten werden ausgedrückt als Mittel ± Standardfehler des Mittels (SEM).
BEISPIEL 2
Mobilisierungskinetiken der Zellen, die die Gesamtkolonien (CFC) pro Milliliter Blut der Mäuse von Beispiel 1 bilden. Die mittlere CFC-Zahl in PBS/MSA in den Kontrollmäusen betrug 39 ± 12 pro ml Blut; die Daten sind in 2 wiedergegeben und werden als Mittel ± SEM ausgedrückt, stammend von Doppelkulturen von Proben aus jedem Tier für jeden Zeitpunkt.
BEISPIEL 3
Veränderungen der Häufigkeit der Gesamt-CFCs (CFU-GM + BFU-E + CFU-Mix + HPP-CFC) pro 10⁵ Leukozytenfilm- (Buffy-Coat-) Zellen von peripherem Blut in den im Beispiel 1 erwähnten Mäusen. Die mittlere CFC-Zahl in PBS/MSA in den Kontrollmäusen betrug 3,5 ± 1; die Daten sind in 3 wiedergegeben und werden ausge drückt als Mittel ± SEM, stammend aus Doppelkulturen von Proben aus jedem Tier bei jedem Zeitpunkt.
BEISPIEL 4
Gesamt-CFCs (CFU-GM + BFU-E + CFU-Mix + HPP-CFC) pro Milliliter Blut nach fünf Tagen Behandlung der Mäuse von Beispiel 1; die Daten sind in 4 wiedergegeben und werden ausgedrückt als Mittel ± SEM, stammend aus Doppelkulturen von Proben aus jedem Tier.
BEISPIEL 5
Häufigkeit der Gesamt-CFCs (CFU-GM + BFU-E + CFU-Mix + HPP-CFC) für 10⁵ Leukozytenfilm- (Buffy-Coat-) Zellen von peripherem Blut in den im Beispiel 1 erwähnten Mäusen; die Daten sind in 5 wiedergegeben und werden ausgedrückt als Mittel ± SEM, stammend aus Doppelkulturen von Proben aus jedem Tier.
BEISPIEL 6
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung der Verabreichung von G-CSF und/oder DEF auf die Menge an hämatopoietischen Vorläuferzellen/Stammzellen (hoch-poliferative Potentia-Kolonien-stimulierende Zellen bzw. HPP-CFC) in Zirkulation des peripheren Bluts von Affen zu untersuchen. Die Studie wurde durchgeführt in Rhesus-Affen (Macaca Mulatta) mit einem Alter von 4-6 Jahren, die sich in guter Gesundheit befanden und welche normale Werte in der Hämatologie und der klinischen Chemie zeigten. Das G-CSF wurde subkutan mit 100 μg/kg für fünf Tage und zwei Zyklen dosiert; DEF wurde bei 15 mg/kg/h mittels kontinuierlichem Infusionssystem für fünf Tage beim zweiten Zyklus dosiert. Die Tiere wurden zur Blutnahme, zur Verabreichung von G-CSF und zum Wechseln des Wirkstoffbeutels betäubt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 6 wiedergegeben, woraus zu würdigen ist, daß die kombinierte Verabreichung von G-CSF und Defibrotid eine HPP-CFC-Mobilisierung in Affen ermöglicht, die etwa 8-fach höher ist als diejenige, die durch Verabreichung von G-CSF alleine erhältlich ist.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Wie ohne weiteres aus den in 1 wiedergegebenen Daten zu würdigen ist, erzeugt die kombinierte Verabreichung von G-CSF und Defibrotid eine substantielle Erhöhung in der Menge weißer Blutzellen, die sich in Zirkulation im Mäuseblut befinden. Es sollte insbesondere bemerkt werden, daß die Verabreichung von Defibrotid alleine keinen positiven Einfluß auf die Menge von sich in Zirkulation befindlichen weißen Blutzellen aufweist; die Kombination von G-CSF und Defibrotid erzeugt daher einen überraschenden, Dosis-abhängigen Effekt auf die Erhöhung der Anzahl von weißen Blutzellen, was nicht nur die Summe der beiden Effekte ist, die unabhängig voneinander sind.
Die 2 bis 5 zeigen deutlich an, daß die kombinierte Verabreichung von G-CSF und Defibrotid Niveaus der Mobilisierung, die in Mäusen zu erhalten sind, ermöglicht, die 10-100-fach höher sind als jene, die durch Verabreichung von G-CSF alleine erhältlich sind.
Schließlich bestätigt 6, daß die kombinierte Verabreichung von G-CSF und Defibrotid eine Stammzellen (HPP-CFC)-Mobilisierung in Affen ermöglicht, die etwa 8-fach höher ist als jene, die durch die Verabreichung von G-CSF alleine erhältlich ist.
Die kombinierte Wirkung der beiden aktiven Bestandteile ist Dosis-abhängig, weil die Niveaus der Mobilisierung proportional mit der Menge an verabreichtem Defibrotid ansteigt; der höchste Mobilisierungspeak wird in allen Fällen etwa beim fünften Tag nach Verabreichung erreicht.

Claims

Formulierung, enthaltend als Wirkstoffe Defibrotid und mindestens einen hämatopoetischen Faktor mit der Fähigkeit, hämatopoetische Vorläuferzellen zu mobilisieren.
Formulierung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der hämatopoetische Faktor mit der Kapazität hämatopoetische Vorläuferzellen zu mobilisieren, G-CSF ist.
Formulierung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine wässrige Lösung ist.
Formulierung gemäß Anspruch 1, aufgebaut aus zwei unterschiedlichen, getrennt verabreichbaren Formulierungen, wobei eine den hämatopoetischen Faktor mit der Kapazität, hämatopoetische Vorläuferzellen zu mobilisieren, enthält, und die andere Defibrotid enthält.
Formulierung, enthaltend Defibrotid und mindestens einen hämatopoetischen Faktor mit der Fähigkeit, hämatopoetische Vorläuferzellen zu mobilisieren, vorzugsweise G-CSF, als eine kombinierte Präparation zur gleichzeitigen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Verwendung zur Erhöhung der Menge von Stammzellen und/oder hämatopoetischen Vorläuferzellen im peripheren Blut eines Säugers.
Formulierung gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, ferner die üblichen Arzneistoffträger und/oder Co-Hilfsstoffe enthaltend.
Verwendung von Defibrotid in Kombination mit mindestens einem hämatopoetischen Faktor mit der Fähigkeit, hämatopoetische Vorläuferzellen zu mobilisieren, zur Herstellung von Formulierungen, die zur Erhöhung der Menge von Stammzellen und/oder hämatopoetischen Vorläuferzellen im peripheren Blut eines Säugers in der Lage sind.
Verwendung gemäß Anspruch 7, damit gekennzeichnet, dass der hämatopoetische Faktor mit der Fähigkeit, hämatopoetische Vorläuferzellen zu mobilisieren, G-CSF ist.