DE60035035T2

DE60035035T2 - Injektion von autologem knochenmark in den herzmuskel

Info

Publication number: DE60035035T2
Application number: DE60035035T
Authority: DE
Inventors: Ran Rockville Kornowski; Shmuel Rockville Fuchs; Stephen E. Rockville Epstein; Martin B. New York Leon
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-03-30
Filing date: 2000-03-30
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2020-03-31
Also published as: CA2368677C; WO2000057922A1; JP2002540176A; AU767402B2; ATE363293T1; AU4045200A; DE60035035D1; CA2368677A1; EP1171165A4; ES2284489T3; EP1171165A1; DK1171165T3; EP1171165B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Anmeldung verweist auf die Verwendung von autologem Knochenmarkaspirat für die Herstellung eines Arzneimittels zum Erhöhen der Bildung kollateraler Blutgefäße in ischämischem Herz- oder Extremitätengewebe in einem Individuum, welches in Stellen im ischämischen Herz- oder Extremitätengewebe zu injizieren ist, um die Bildung kollateraler Blutgefäße im Gewebe zu erhöhen, wobei das Knochenmark nicht von einem menschlichen Embryo oder Fötus stammt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Verwendung rekombinanter Gene oder Wachstumsfaktoren, um die Funktion myocardialer kollateraler Blutgefäße zu erhöhen, könnte eine neue Methode zur Behandlung kardiovaskulärer Krankheit darstellen. Kornowski, R., et al., „Delivery strategies for therapeutic myocardial angiogenesis", Circulation 2000; 101:454–458. Der Nachweis von Machbarkeit ist in Tiermodellen myocardialer Ischämie gezeigt worden, und klinische Studien sind unterwegs. Unger, E. F., et al., „Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model", Am. J. Physiol. 1994; 266:H1588-1595; Banai, S. et al., "Angiogenic-induced enhancement of collateral blond flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs", Circulation 1994; 83-2189; Lazarous, D. F., et al., "Effect of chronic systemic administration of basic fibroblast growth factor an collateral development in the canine heart", Circulation 1995; 91:145–153; Lazarous, D. F., et al., "Comparative effects of basic development and the arterial response to injury", Circulation 1996; 94: 1074–1082; Giordano, F. J., et al., "Intracoronary gene transfer of fibroblast growth factor-5 increases blond flow and contractile function in an ischemic region of the heart", Nature Med. 1996; 2:534–9. Die meisten Strategien für eine Transkatheter-Zufuhr angiogenetischer Faktoren haben einen intrakoronaren Weg verwendet, welcher Begrenzungen infolge ungenauer Lokalisierung von Genen oder Proteinen und systemischer Zufuhr an nicht-Herzgewebe haben könnte.
Dementsprechend wäre es wünschenswert, die Kapazität für eine direkte Zufuhr angiogenetischer Faktoren oder Gene zu genau definierten Gebieten des Myocards zu haben, und eben nicht zu dem gesamten Herz, und das Potential für eine systemische Belastung zu verringern. Guzman, R. J., et al., „Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors", Circ. Res. 1993; 73:1202–7; Mack, C. A., et al., "Biologic bypass with the use of adenovirus-mediated gene transfer of the complementary deoxyribonucleic acid for VEGF-121, improves myocardial perfusion and function in the ischemic porcine heart", J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1998; 115:168–77.
Die Wirkung einer direkten intraoperativen intramyocardialen Injektion angiogenetischer Faktoren auf die kollaterale Funktion ist in Tiermodellen myocardialer Ischämie untersucht worden. Bei offenem Brustkorb ergibt die transepicardiale Verabreichung eines adenoviralen Vektors, der ein Transgen enthält, das ein angiogenetisches Peptid codiert, eine erhöhte kollaterale Funktion. (Mack et al., supra.). Über die Angiogenese wurde auch berichtet, dass sie bei direkter intramyocardialer Injektion eines angiogenetischen Peptids oder eines Plasmidvektors während einer Operation am offenen Herz bei Patienten entsteht. Schumacher, B., et al., „Induction of neoangiogenesis in ischemic myocardium by human growth factors. First clinical results of a new treatment of coronary heart disease", Circulation 1998; 97:645–650; Losordo, D. W., et al., "Gene therapy for myocardial angiogenesis: initial clinical results with direct myocardial injection of phVEGF165 as sole therapy for myocardial ischemic", Circulation 1998; 98:2800.
Trotz der Erfolg versprechenden Hoffnung für eine therapeutische Angiogenese als eine neue Modalität, Patienten mit einer koronaren Herzkrankheit zu behandeln, gibt es noch eine große Lücke im Hinblick darauf, welche spezifische Strategie eine klinisch relevante, therapeutische, angiogenetische Antwort optimalerweise fördern wird. Weiterhin ist unklar, welcher (oder welche) der vielfachen angiogenetischen Wachstumsfaktoren mit einer heilsamen angiogenetischen Antwort verbunden sein könnte. Zusätzlich ist die Verwendung verschiedener Gewebszufuhrplattformen, z. B. Proteine, Adenovirus oder „nackte" DNA, um die optimale angiogenetische Antwort zu fördern, ein offener Aspekt geblieben.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, eine Zusammensetzung autologen Knochenmarks bereitzustellen, umfassend ein konditioniertes Kulturmedium, das aus dem Züchten von Aspirat autologen Knochenmarks stammt. Es ist auch eine Aufgabe dieser Erfindung, die Verwendung von Aspirat autologen Knochenmarks für die Herstellung eines Arzneimittels zum Erhöhen der Bildung kollateraler Blutgefäße in ischämischem Herz- und Extremitätengewebe bereitzustellen.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden in der nachstehenden Diskussion offenkundiger werden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Knochenmark stammt nicht von einem menschlichen Embryo oder Fötus.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die meisten, derzeit geprüften, therapeutischen Methoden haben sich auf einen einzigen angiogenetischen Wachstumsfaktor (z. B. VEGF, FGF, Angiopoietin-1) fokussiert, der an das ischämische Gewebe abgegeben wird. Dies kann entweder durch Abgabe des Endproduktes (z. B. Protein) oder durch Gentransfer, indem verschiedene Vektoren verwendet werden, durchgeführt werden. Allerdings wird angenommen, dass komplexe Interaktionen zwischen verschiedenen Wachstumsfaktorsystemen möglicherweise für die Initiierung und die Aufrechterhaltung der Bildung neuer Blutgefäße nötig sind. Genauer gesagt, es wird als wichtig angenommen, dass eine spezifische, örtlich festgelegte, angiogenetische Umgebung mit verschiedenen angiogenetischen Cytokinen, die gemeinsam interagieren, und zu einer passenden Zeit induziert wird, um die Bildung und Funktion neuer Blutgefäße auszulösen und aufrechtzuerhalten.
Das Knochenmark (KM) ist eine natürliche Quelle eines breiten Spektrums an Cytokinen und Zellen, die an der Kontrolle angiogenetischer Prozesse beteiligt sind. Dementsprechend wird angenommen, dass die intramyocardiale Injektion autologen (A) KMs, indem man sich die natürliche Fähigkeit dieser Zellen, viele angiogenetische Faktoren zu passender Zeit zu sezernieren, zu Nutze macht, einen optimalen Eingriff zum Erreichen einer therapeutischen kollateralen Entwicklung im ischämischen Myocard liefert.
Gemäß der Erfindung wird autologes Knochenmark injiziert, entweder als ein „allein stehendes" therapeutisches Agens oder kombiniert mit einem beliebigen pharmakologischen Arzneistoff, Protein oder Gen oder einer beliebigen anderen Verbindung oder mit einem Eingriff, der die Herstellung angiogenetischer Wachstumsfaktoren des Knochenmarks erhöhen könnte und/oder die Vermehrung und Migration von Endothelzellen und die Bildung von Blutgefäßröhren fördern könnte. Die (Das) „zusammengesetzte(n)" Agenzien (Agens) können (kann) direkt an den Patienten oder an das Zielgewebe verabreicht werden oder mit Knochenmark ex vivo vor der Injektion des Knochenmarks in den Patienten inkubiert werden. Nicht begrenzende Beispiele dieser „zusammengesetzten" Agenzien sind der Granulocyten-Monocyten-koloniestimulierende Faktor (GM-CSF), das Monocyten-Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) und der Hypoxie-induzierbare Faktor-1 (HIF-1). Ein Beispiel eines Eingriffs, der die Herstellung angiogenetischer Faktoren des Knochenmarks erhöhen könnte, ist, indem Knochenmarkszellen ex vivo einer Hypoxie ausgesetzt werden. Das autologe Knochenmark, allein oder mit „zusammengesetzten" Agenzien, kann dem Patienten direkt entweder über trans-endocardiale oder trans-epicardiale Methoden entweder in das ischämische und/oder nicht ischämische Myocard oder direkt in beliebig andere ischämische Organe (einschließlich einer peripheren Extremität) verabreicht werden, um die Entwicklung der Bildung kollateraler Blutgefäße und dementsprechend einen kollateralen Fluss zum ischämischen Myocard oder zu den ischämischen Extremitäten zu erhöhen und/oder zu fördern. Diese Methode kann ebenfalls verwendet werden, um die Entwicklung neu implantierter entdifferenzierter und/oder differenzierter myocardialer Zellen durch den Prozess kardialer Myogenese zu fördern.
Die Erfindung offenbart verschiedene Transplantationsstrategien autologen Knochenmarks, um die Angiogenese und/oder Myogenese zu erhöhen und somit die Entwicklung neuer Blutgefäße in das ischämische Myocard oder die unteren Extremitäten zu beschleunigen. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Strategie der „Optimierung angiogenetischer Genexpression". Diese Strategie verwendet die gemeinsame Verabreichung von HIF-1 mit dem autologen Knochenmark. HIF-1 ist ein Transkriptionsfaktor, von dem bekannt ist, dass er durch Hypoxie induziert und aktiviert wird, und von dem bekannt ist, dass er eine Expression multipler Gene, die in die Antwort auf Hypoxie involviert sind, herbeiführt. Eine ähnliche Methode schließt ein, dass autologes Knochenmark endothelialem PAS-Domänen-Protein-1 (EPAS1) ausgesetzt wird. EPAS1 teilt eine hohe strukturelle und funktionelle Homologie mit HIF-1. Die Strategie schließt auch ein, dass das Knochenmark ex vivo vor seiner direkten Injektion in das Herz oder in ein beliebiges peripheres ischämisches Gewebe einer Hypoxie ausgesetzt wird, um die Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) oder anderer Cytokine mit nachgewiesener angiogenetischer Aktivität (wie beispielsweise MCP-1) zu erhöhen. Diese Erfindung schließt somit die direkte intramyocardiale (trans-epicardial oder trans-endocardial) oder periphere intramuskuläre Injektion von autologem Knochenmark; von stimuliertem autologem Knochenmark, zum Beispiel stimuliert durch HIF-1, EPAS1, MCP-1, GM-CSF oder indem es vorübergehend einer Hypoxie oder einer anderen Form von Energie ausgesetzt wird, wie beispielsweise Ultraschall, RF, elektromagnetischer oder Laserenergie; oder von autologem Knochenmarkprodukt ein, das von konditioniertem Medium (azelluläre Komponente (n) des kultivierten Knochenmarks) abstammt. Die Stimulierung des Knochenmarks könnte sein, indem das Knochenmark den Faktoren in Form von Proteinen direkt ausgesetzt wird, oder die Knochenmarkszellen können mit Vektoren transfiziert werden, die relevante Gene tragen. Zum Beispiel kann Knochenmark mit einem Plasmidvektor oder mit einem adenoviralen Vektor, der die HIF-1- oder EPAS1-Transgene trägt, transfiziert werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm der Vermehrung von PAEC's gegenüber den Quantitäten von konditioniertem Medium;
2 ist ein Diagramm der Vermehrung von Endothelzellen gegenüber den Quantitäten von konditioniertem Medium;
3 ist ein Diagramm der Konzentration von VEGF in konditioniertem Medium über eine vierwöchige Zeitspanne; und
4 ist ein Diagramm der Konzentration von MCP-1 in konditioniertem Medium über eine vierwöchige Zeitspanne.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Knochenmark ist eine natürliche Quelle eines weiten Spektrums an Cytokinen, die in die Kontrolle von angiogenetischen und inflammatorischen Prozessen eingeschlossen sind. Die exprimierten Cytokine umfassen Mediatoren, die bekannt dafür sind, dass sie an der Aufrechterhaltung früher und später Hämatopoese beteiligt sind (IL-1alpha und IL-1beta, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 und IL-13; Koloniestimulierende Faktoren, Thrombopoetin, Erythopoetin, Stammzellenfaktor, Fit-3-Ligand, Leberzellenwachstumsfaktor, Tumornekrosefaktor alpha, Leukämie-Inhibierungsfaktor, transformierende Wachstumsfaktoren beta 1 und beta 3; und das Macrophagen-inflammatorische Protein 1 alpha), angiogenetische Faktoren (Fibroblasten-Wachstumsfaktoren 1 und 2, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor) und Mediatoren, deren übliches Ziel (und Quelle) die bindegewebsbildenden Zellen sind (der von Blutplättchen abstammende Wachstumsfaktor A, epidermale Wachstumsfaktor, transformierende Wachstumsfaktoren alpha und beta 2, Onkostatin M und der insulinähnliche Wachstumsfaktor-1) oder neuronale Zellen (Nerven-Wachstumsfaktor). Sensebe, L., et al., Stem Cells 1997; 15:133–43. Zusätzlich ist gezeigt worden, dass VEGF-Polypeptide in Blutplättchen und Megakaryocyten anwesend sind und von aktivierten Blutplättchen zusammen mit der Freisetzung von beta-Thromboglobulin freigesetzt werden. Wartiovaara, U., et al., Thromb. Haemost. 1998; 80:171–5; Mohle, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94:663–8.
Es gibt auch Indikatoren, die das Konzept unterstützen, dass die Angiogenese benötigt wird, um die Funktion des Knochenmarks und die Entwicklung von hämatopoetischen Zellen zu unterstützen, einschließlich der Stammzellen und der Vorläuferzellen, die in den Kreislauf gelangen und Stellen der Wundheilung und/oder Ischämie ansteuern könnten, wobei sie letztendlich an der Bildung neuer Blutgefäße mitwirken. Von monoclonalen Antikörpern, die speziell undifferenzierte mesenchymale Vorläuferzellen, die aus reifem menschlichen Knochenmark isoliert wurden, erkennen, ist gezeigt worden, dass sie Zelloberflächenmarker von sich entwickelndem Mikrogefäßsystem erkennen, und Anzeichen legen nahe, dass solche Zellen eine Rolle bei der embryonalen Angiogenese spielen könnten. Fleming, J. E.,Jr., Dev. Dyn. 1998; 212:119–32.
Knochenmarksangiogenese kann bei pathologischen Zuständen übermäßig stattfinden, wobei das Knochenmark durch maligne Zellen (wie etwa im multiplen Myelom) aktiviert wird, wobei gezeigt worden ist, dass die Knochenmarksangiogenese simultan mit der Weiterentwicklung menschlicher multipler Myelomzellen ansteigt. Ribatti, D., et al., Br. J. Cancer 1999; 79:451–5. Außerdem ist für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) gezeigt worden, dass er eine Rolle beim Wachstum hämatopoetischer Neoplasmen wie beispielsweise den multiplen Myelomen spielt, entweder durch einen parakrinen oder einen autokrinen Mechanismus. Bellamy, W. T., Cancer Res. 1999; 59:728–33; Fiedler, W., Blood 1997; 89:1870–5). Es wird angenommen, dass autologes Knochenmark mit seinen einzigartigen natürlichen humoralen und zellulären Eigenschaften eine mögliche Quelle verschiedener angiogenetischer Verbindungen ist. Diese natürliche Quelle „gemischter" angiogener Cytokine kann überraschend als eine Mischung potenter interaktiver Wachstumsfaktoren genutzt werden, um eine therapeutische Angiogenese und/oder Myogenese herzustellen; die Verwendung der Zellen per se könnte eine länger anhaltende Quelle dieser natürlichen angiogenen Agenzien liefern.
Einer der Faktoren, der am ehesten an der Initiierung von Angiogenese als Anwort auf Ischämie teilnimmt, ist HIF-1, ein potenter Transkriptionsfaktor, der an den Promotor mehrerer Gene, die in Antworten auf Hypoxie eingeschlossen sind, bindet und ihn stimuliert. Induktion und Aktivierung von HIF-1 wird in engen Grenzen durch den pO2 im Gewebe gesteuert; HIF-1-Expression steigt in der Weise exponentiell an wie der pO2 sinkt, dadurch liefert sie eine positive Feedback-Schleife, bei der ein Abfall im pO2 einen Anstieg in der Expression von Genprodukten verursacht, die als eine angepasste Antwort auf eine sauerstoffarme Umgebung dienen. Aktivierung von HIF-1 führt zum Beispiel zur Induktion von Erythropoetin, Genen, die an der Glycolyse beteiligt sind, und zur Expression von VEGF. Er reguliert wahrscheinlich auch die Expression vieler anderer Gene, die an der angepassten Antwort auf niedrige pO2-Spiegel teilnehmen. Der Mechanismus, bei dem HIF-1 die Proteinmenge reguliert, die an der Antwort auf Hypoxie beteiligt ist, läuft über transkriptionale Regulation von Genen, die auf niedrige pO2 antworten. Folglich haben solche Gene kurze DNA-Sequenzen innerhalb des Promotors oder der Enhancerregionen, die HIF-1 Bindungsstellen enthalten, die als Hypoxie-responsive Elemente (HRE) bezeichnet werden. HIF-1 ist ein Heterodimer mit einem basischen Helix-Schleife-Helix-Motiv, bestehend aus den Untereinheiten HIF-1α und HIF-1β. Seine Spiegel werden durch pO2 reguliert, sowohl transkriptional als auch posttranskriptional – die HIF-1-Induktion wird durch Hypoxie erhöht, und seine Halbwertszeit wird merklich erniedrigt, wenn pO2-Spiegel ansteigen.
Es ist wichtig, dass, während die Expression von HIF-1 (wie in HeLa-Zellen bestimmt) exponentiell und invers mit dem pO2 in Beziehung steht, der Wendepunkt der Kurve bei einer Sauerstoffsättigung von 5 % liegt, mit maximaler Aktivität bei 0,5 % und der halben maximalen Aktivität bei 1,5–2,0 %. Dies sind relativ niedrige Hypoxiespiegel, und es ist nicht klar, ob solche Spiegel in der Anwesenheit von schwachen Spiegeln myocardialer Ischämie oder Ischämie der unteren Extremitäten vorkommen – d. h. Spiegel, die in der Abwesenheit von Gewebsnekrose vorkommen (myocardialer Infarkt beziehungsweise Beinulzerationen). Folglich könnten Knochenmarkszellen die Fähigkeit haben, angiogenetische Faktoren zu sezernieren und dadurch die kollaterale Entwicklung zu fördern. Jedoch ist es möglich, dass eine solche Aktivität in den spezifischen behandelten Gewebsumgebungen nicht offensichtlich werden kann, solange nicht ein gewisser zusätzlicher Reiz vorhanden ist. Es ist somit ein bevorzugter Aspekt der Erfindung, das Knochenmarksimplantat gemeinsam, wenn nötig, mit HIF-1 zu verabreichen. Es wird angenommen, dass HIF-1 eine optimale Expression vieler, durch Hypoxie induzierbarer angiogener Gene, die in dem Knochenmarksimplantat enthalten sind, liefert. HIF-1 kann entweder als das Protein oder als das Gen injiziert werden. Falls als das Letztere kann es entweder in einem Plasmid oder viralen Vektor oder einer beliebig anderen Art injiziert werden, die zu funktionell relevanten Proteinspiegeln führt. Zum Beispiel kann Knochenmark ex vivo mit einem Plasmidvektor oder adenoviralen Vektor transfiziert werden, der die HIF-1- oder EPSA1-Transgene trägt. Es wird jedoch nochmals betont, dass HIF-1 in diesem Abschnitt als ein Beispiel eines Eingriffes verwendet wird, der die Herstellung angiogenetischer Substanzen durch Knochenmark vergrößern könnte. Dieser Eingriff deckt auch die Verwendung anderer Agenzien ab, die durch Vergrößern der HIF-1-Aktivität (z.B. Verlängern seiner Halbwertszeit) oder durch Herstellung von Effekten, die denen von HIF-1 bewirkten analog sind, das Knochenmark stimulieren, um die Expression angiogenetischer Faktoren zu vergrößern. Eine ähnliche Methode schließt ein, dass das autologe Knochenmark dem endothelialen PAS-Domänen-Protein-1 (EPAS1) ausgesetzt wird. EPAS1 teilt eine hohe strukturelle und funktionelle Homologie mit HIF-1.
Weil die Aktivität des VEGF-Promotors durch HIF-1 erhöht wird, schließt diese Erfindung auch ein, dass die sich in Kultur befindenden Knochenmarkszellen ex vivo einer Hypoxie oder einer anderen Form von Energie wie beispielsweise Ultraschall, RF oder elektromagnetischer Energie ausgesetzt werden. Dieser Eingriff vergrößert die Expression von VEGF und anderer Gene. Anhand dieser Wirkung könnte die Kapazität des Knochenmarks die Angiogenese zu stimulieren verstärkt werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung schließt die ex vivo-Stimulierung aspirierten autologen Knochenmarks durch HIF-1 ein (oder Produkten, die die Wirkung von HIF-1 verstärken oder eine HIF-1 ähnliche Wirkung auf Knochenmark herstellen) oder die direkte Exposition von Knochenmark gegen eine hypoxische Umgebung, gefolgt von der Abgabe aktivierter Knochenmarkszellen an das ischämische Myocard oder periphere Organe (z. B. ischämische Extremität) ein, um die kollateral-abhängige Perfusion im Herz- und/oder peripheren ischämischen Gewebe zu erhöhen. Die Stimulierung des Knochenmarks könnte sein, indem das Knochenmark den Faktoren in Form von Proteinen direkt ausgesetzt wird, oder die Knochenmarkszellen können mit Vektoren, die relevante Gene tragen, transfiziert werden. Zum Beispiel kann Knochenmark mit einem Plasmidvektor oder mit einem adenoviralen Vektor, der die HIF-1 oder EAPS1-Transgene trägt, transfiziert werden.
Aktuelle Daten weisen auf die Wichtigkeit der von Monocyten abstammenden Cytokine zur Erhöhung der kollateralen Funktion hin. Monocyten werden durch kollaterales Wachstum in vivo aktiviert, und das Monocyten-chemotaktische Protein-1 (MCP-1) wird durch Scherstress in vitro hochreguliert. Es ist gezeigt worden, dass die Monocyten während des kollateralen Gefäßwachstums (Arteriogenese) und dem Kapillarsprossen (Angiogenese) sich an die vaskuläre Wand anheften. Für MCP-1 wurde auch gezeigt, dass es kollaterales Wachstum nach einer Okklusion der Oberschenkelarterie am Modell chronischer Ischämie der Hinterextremität beim Kaninchen erhöht (Ito et al., Circ. Res. 1997; 80:829–3). Eine Aktivierung von Monocyten scheint eine wichtige Rolle sowohl beim kollateralen Wachstum als auch bei der Kapillarsprossung zu spielen. Eine erhöhte Rekrutierung von Monocyten durch LPS ist sowohl mit einer erhöhten Kapillardichte als auch mit einer erhöhten kollateralen und peripheren Leitfähigkeit am siebten Tag nach der experimentellen arteriellen Okklusion verbunden (Arras M. et al., J. Clin. Invest. 1998; 101:40–50).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt die ex vivo-Stimulierung von aspiriertem autologen Knochenmark durch MCP-1 ein, gefolgt von der direkten Zufuhr aktivierter Knochenmarkszellen an das ischämische Myocard oder periphere Organ (z. B. ischämische Extremität), um die kollateral-abhängige Perfusion und muskuläre Funktion im Herz- und/oder peripheren ischämischen Gewebe zu erhöhen. Die Stimulierung des Knochenmarks könnte sein, indem das Knochenmark MPC-1 in der Form des Proteins direkt ausgesetzt wird, oder die Knochenmarkszellen können mit einem Vektor, der das MCP-1-Gen trägt, transfiziert werden. Zum Beispiel kann das Knochenmark mit einem Plasmidvektor oder mit einem adenoviralen Vektor, der das MPC-1-Transgen trägt, transfiziert werden.
Granulocyten-Macrophagen-koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) und Granulocyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF) sind stimulierende Cytokine für die Monocyten-Reifung und sie sind multipotente hämatopoetische Wachstumsfaktoren, die in der klinischen Praxis für verschiedene hämatologische Krankheiten benutzt werden, wie beispielsweise bei verminderter Anzahl weißer Blutzellen (z. B. Leukopenie oder Granulocytopenie oder Monocytopenie), die normalerweise als Antwort auf immunsuppressive oder chemotherapeutische Behandlung bei Krebspatienten auftritt. GM-CSF ist auch als Wachstumsfaktor für mehrere Linien beschrieben worden, der in vitro die Bildung von Kolonien aus burst forming whits von Zellen der erythrozytären Reihe, Eosinophilen-koloniebildenden Einheiten (CSF) und multipotentialen (CSF) sowohl aus Granulocyten-Makrophagen-CSF als auch Granulocyten-CFU herbeiführt. (Bot F. J., Exp. Hematol. 1989, 17:292–5). Für die ex vivo-Exposition gegen GM-CSF ist gezeigt worden, dass sie eine schnelle Vermehrung von CD-34+-Vorläuferzellen herbeiführt (Egeland T. et al., Blond 1991; 78:3192-9). Diese Zellen haben die Fähigkeit, sich in vaskuläre Endothelzellen zu differenzieren, und können natürlicherweise in die postnatale Angiogenese eingeschlossen sein. Zusätzlich besitzt GM-CSF viele stimulatorische Wirkungen auf Macrophagen/Monocyten-Vermehrung, -Differenzierung, -Beweglichkeit und -Überleben (verminderte Apoptoserate). In Übereinstimmung mit den kombinierten bekannten Wirkungen auf Knochenmark, das von endothelialen Vorläuferzellen abstammt und Monocyten, ist ein anderer Aspekt der Erfindung die Verwendung von GM-CSF als eine unterstützende Behandlung für autologe Knochenmarksinjektionen, die darauf ausgerichtet ist, die Bildung neuer Blutgefäße und Differenzierung in ischämischen cardiovaskulären Organen herbeizuführen. Weiterhin könnte GM-CSF die therapeutische myocardiale Angiogenese, die durch Knochenmark ausgelöst wird, erhöhen, indem die Wirkung des Knochenmarks verstärkt wird oder indem Knochenmark, entweder durch in vivo- oder in vitro-Verabreichung, weiter stimuliert wird, wobei das Knochenmark auch durch Agenzien wie beispielsweise HIF-1, EPAS1, Hypoxie oder MCP-1 stimuliert wird. Die vorliegende Erfindung liefert folglich die Ausführungsformen, die in den Ansprüchen definiert sind.
In den nachstehenden Beispielen werden bestimmte Tests, die die Aspekte der Erfindung betreffen, dargelegt. Diese Beispiele sind nicht begrenzend.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Wirkung der Knochenmark-Kulturmedien auf die Vermehrung von Endothelzellen Es wurden Studien durchgeführt, um zu bestimmen, ob aspirierte autologe Knochenmarkszellen vom Schwein sezernierten VEGF, einen potenten angiogenetischen Kofaktor, und MCP-1, der kürzlich als ein wichtiger angiogenetischer Kofaktor entdeckt worden ist, enthalten. Knochenmark wurde in vitro über vier Wochen kultiviert. Das konditionierte Medium wurde kultivierten Schweine-Aortaendothelzellen (PAECs) zugesetzt, und nach vier Tagen wurde die Vermehrung bestimmt. Die VEGF- und MCP-1-Spiegel in dem konditionierten Medium wurden mittels ELISA bestimmt. Während der vier Wochen in Kultur sezernierten die KM-Zellen VEGF und MCP-1 auf die Weise, dass ihre Konzentrationen in einer zeitabhängigen Weise anstiegen. Das so erhaltene konditionierte Medium erhöhte in einer dosisabhängigen Weise die Vermehrung von PAECs. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass KM-Zellen fähig sind, potente angiogenetische Cytokine wie beispielsweise VEGF und MCP-1 zu sezernieren und die Vermehrung vaskulärer Endothelzellen herbeizuführen.
Schweine-Knochenmarkskultur
Knochenmarkszellen (KM) wurden unter sterilen Bedingungen von Schweinen mit einer chronischen myocardialen Ischämie in konservierungsmittelfreiem Heparin (20 Einheiten/ml KM-Zellen) geerntet und sequentiell unter Verwendung von 300-μ- und 200-μ-Netzfilter aus rostfreiem Stahl gefiltert. KM-Zellen wurden dann durch eine Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation isoliert und in einem Langzeitkulturmedium (LTCM) (Stem Cell Tech, Vancouver, British Columbia, Kanada) bei 330°C mit 5 % CO₂ in T-25-Kulturflaschen kultiviert. Die Impfdichte der KMZs war 7 × 106/ml in jeder Kultur. Wöchentlich wurde eine Hälfte des Mediums entfernt und durch frisches LTCM ersetzt. Das entfernte Medium wurde gefiltert (0,2-µ-Filter) und bei –200 °C für nachfolgende enzymverbundene Immunadsorptionstests (ELISA) und Zellproliferationtests gelagert.
Isolation und Züchtung von Endothelzellen der Schweineaorta
Frische Endothelzellen der Schweineaorta (PAECs) wurden unter Verwendung üblicher Methoden isoliert. Wachstumsmedium für Endothelzellen (EGM-2 medium, Clonetics, San Diego, KA), enthaltend 2 % FKS, Hydrokortison, menschlichen FGF, VEGF, menschlichen EGF, IGF, Heparin und Antibiotika, bei 37°C mit 5 % Kohlendioxid. Als die Zellen nach etwa sieben Tagen konfluent waren, wurden sie durch 2,5 % Trypsin getrennt und danach im Medium 199 mit 10 % FKS kultiviert. Ihre Identität wurde durch eine typische Endothelzellen-Morphologie und durch eine Immunohistochemie-Färbung für Faktor VIII bestätigt. Es wurden drei bis zehn Passagen für die Vermehrungsstudie verwendet.
Wirkung von konditioniertem Medium auf Endothelzellen der Aorta
Zellproliferationstest: (PAECs) (Passage 3–10) wurden mittels Trypsinisierung aus den Kulturflaschen entfernt. Die abgelösten Zellen wurden auf Züchtungsplatten mit 96 Vertiefungen übertragen und mit einer Impfdichte von 5000 Zellen/Vertiefung plattiert. Die Zellen wurden 2–3 Tage kultiviert, bevor sie in Vermehrungs- und DNA-Synthese-Experimenten verwendet wurden. Das konditionierte Medium von KM-Zellkulturen wurde nach vier Wochen gesammelt; das Medium von sieben Kulturflaschen wurde vereint und im Biotest verwendet. Aliquots (10 µl, 30 µl, 100 µl oder 200 µl) des vereinten konditionierten Mediums oder LTCM (200 µl, als Kontrolle) wurden zu den konfluenten PAECs auf Platten mit 96 Vertiefungen in Dreifachausführung gegeben. Nach viertägiger Kultivierung mit konditioniertem Medium oder Kontrollmedium wurden die PAECs trypsinisiert und unter Verwendung eines Zellzählers (Coulter Counter Beckman Corporation, Miami FL) gezählt.
Wirkungen des konditionierten Mediums auf die PAEC-DNA-Synthese
Aliquots (10 µl, 30 µl, 100 µl oder 200 µl) des konditionierten Mediums der vereinigten Proben oder des Kontrollmediums (LTCM, 200 µl) wurden zu den PAECs auf Platten mit 96 Vertiefungen (dieselbe Impfdichte wie vorstehend) in Dreifachausführung gegeben. Nach zwei Tagen wurde 1 µCi tritiummarkiertes Thymidin in jede Vertiefung gegeben. 48 Stunden später wurde die DNA in den PAECs unter Verwendung eines Zellerntegeräts (Mach III M Tomtec; Hamden, CT) geerntet und die Radioaktivität wurde mittels Flüssigscintillationszählgerät (Multi detector Liquid Scintillation Luminescence Counter EG&G Wallac, Turku, Finnland) gezählt.
Bestimmung von VEGF und MCP-1 in konditioniertem Medium durch ELISA auf VEGF Die Konzentration von VEGF im konditioniertem Medium wurde unter Verwendung eines Sandwich-ELISA-Kits (Chemicon International Inc., Temecula, KA) gemessen. Kurz gesagt, eine mit anti-Mensch-VEGF-Antikörper vorbeschichtete Platte wurde verwendet, um VEGF in dem konditionierten Medium oder eine bekannte Konzentration von rekombinantem VEGF zu binden. Der Komplex wurde mittels des biotinylierten anti-VEGF-Antikörpers nachgewiesen, welcher an den eingefangenen VEGF bindet. Der biotinylierte VEGF-Antikörper wurde wiederum mit einer Streptavidin-alkalischen Phosphatase und einer Farbentwicklungslösung nachgewiesen. Der anti-Mensch-VEGF-Antikörper kreuzreagiert mit Schweine-VEGF.
Bestimmung von MCP-1 in konditioniertem Medium durch ELISA Die Konzentration von MCP-1 in konditioniertem Medium wurde durch einen Sandwich-Immunotest-Kit (R & D Systems, Minneapolis, MN) bestimmt: eine Platte, die mit anti-Mensch-MCP-1-Antikörper vorbeschichtet wurde, wurde verwendet, um MCP-1 in dem konditionierten Medium oder eine bekannte Konzentration von rekombinantem Protein zu binden. Der Komplex wurde durch den biotinylierten anti-MCP-1-Antikörper nachgewiesen, der an das eingefangene MCP-1 bindet. Der biotinylierte MCP-1-Antikörper wurde wiederum durch Streptavidin-alkalische Phosphatase und Farbentwicklungslösung nachgewiesen. Der anti-Mensch-MCP-1-Antikörper kreuzreagiert mit Schweine-MCP-1.
Ergebnisse
Das KM-konditionierte, nach vier Wochen gesammelte Medium erhöhte in einer dosisabhängigen Weise die Vermehrung von PAECs (1). Dies wurde gezeigt, indem die Anzahl an Zellen direkt gezählt wurde und indem die Aufnahme von tritiiummarkiertem Thymidin gemessen wurde (p < 0,001 für beide Messungen). Die dosisabhängige Antwort zeigte einen absteigenden Ast; die Vermehrung nahm bei 200 µl konditioniertem Medium verglichen mit 30 µl und 100 µl ab (P = 0,003 für beide Vergleiche). Ähnliche dosisabhängige Ergebnisse wurden bei Studien zur Aufnahme von tritiiummarkierten Thymidin beobachtet (P = 0,03 für 30 µl bzw. 100 µl verglichen mit markierten 200µl).
Eine begrenzte Anzahl (5 ± 4 %) frisch aspirierter KM-Zellen färbte sich positiv auf Faktor VIII. Die Ergebnisse werden in 2 dargelegt. Dies steht im Kontrast zu 57 ± 14 % der adhärenten Schicht der über vier Wochen kultivierten KM-Zellen, von denen 60 ± 23 % endothelähnliche Zellen waren und 40 ± 28 % Megakaryocyten zu sein schienen.
Nach einer vierwöchigen Zeitspanne vergrößerten sich die Konzentrationen von VEGF und MCP-1 in dem KM-konditionierten Medium allmählich zu der 10- bzw. 3-fachen Menge im Vergleich zu der Menge der ersten Woche (P < 0,001 für beide Vergleiche) (3). Im Vergleich waren die VEGF- und MCP-1-Mengen im Kontrollkulturmedium, das KM nicht ausgesetzt war, 0 bzw. 11 ± 2 pg/ml, wie in 4 gezeigt.
BEISPIEL 2
Wirkungen von Hypoxie auf VEGF-Sekretion bei kultivierten Schweineknochenmarkszellen
Es wurde gezeigt, dass Hypoxie die Expression von VEGF durch kultivierte Knochenmarksendothelzellen merklich erhöht, Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine ex vivo-Exposition gegen Hypoxie durch ein Erhöhen der Expression von Hypoxie-induzierbaren angiogenetischen Faktoren die kollaterale verstärkende Wirkung von Knochenmarkszellen und seinem konditioniertem Medium, welches in das ischämische Muskelgewebe zu injizieren ist, weiter vergrößert werden kann. Schweineknochenmark wurde geerntet und sequentiell unter Verwendung von 300-µ- und 200-µ-Netzfiltern aus rostfreiem Stahl filtriert. KMZ wurden dann über eine Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation isoliert und bei 33°C mit 5 % CO₂ in T-75-Kulturflaschen kultiviert. Als die Zellen nach etwa sieben Tagen konfluent wurden, wurden sie durch Trypsinisierung 1:3 getrennt. Nach 4-wöchiger Kultivierung wurden die KMZ 24 bis 120 Stunden entweder hypoxischen Bedingungen (sie wurden in eine Kammer gesetzt, die 1 % Sauerstoff enthielt) ausgesetzt oder sie wurden unter normalen Bedingungen gehalten. Das so erhaltene konditionierte Medium wurde gesammelt und VEGF, MCP-1 wurden mittels ELISA analysiert.
Indem einer Hypoxie ausgesetzt wurde, wurde die VEGF-Sekretion merklich vergrößert: Nach 24 Stunden stieg die VEGF-Konzentration von 106 ± 13 pg/ml unter normoxischen auf 1,600 ± 196 pg/ml unter hypoxischen Bedingungen (p = 0,0002) an; nach 120 Stunden stieg sie von 4,163 ± 62 auf 6,028 ± 167 pg/ml (p < 0,0001). Eine gesonderte Studie wurde mit frisch isolierten KMZ durchgeführt, und der gleiche Verlauf wurde entdeckt. Hypoxie verlangsamte auch die Vermehrungsrate der KMZ. MCP-1-Expression wurde durch Hypoxie nicht erhöht, was eine nicht unerwartete Entdeckung war, da der Promotor nicht dafür bekannt ist, HIF-Bindungsstellen zu haben.
BEISPIEL 3
Wirkung des Knochenmark-Kulturmediums auf die Bildung einer endothelialen Zellröhre
Es wurde unter Verwendung der gemeinsamen Kulturtechnik mit Endothelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen vom Schwein gezeigt, dass das konditionierte Medium von Knochenmarkszellen die Bildung struktureller vaskulärer Röhren in vitro herbeiführt. Ohne dem konditionierten Knochenmarksmedium ausgesetzt zu sein, wurde eine solche Wirkung auf die Bildung einer vaskulären Röhre nicht beobachtet. Die Ergebnisse legen nahe, dass Knochenmarkszellen und ihre sezernierten Faktoren pro-angiogenetische Wirkungen ausüben.
BEISPIEL 4
Die Wirkung transendocardialer Zufuhr von autologem Knochenmark auf kollaterale Perfusion und regionale Funktion im chronischen myocardialen Ischämie-Modell
Chronische myocardiale Ischämie wurde in 14 Schweinen durch die Implantierung von ameroiden Konstriktoren rund um die linke koronare Arteria circumflexa erzeugt. Vier Wochen nach einer Implantierung wurden sieben Tiere transendocardialen Injektionen frisch aspirierten AKM in den ischämischen Bereich unter Verwendung eines transendocardialen Injektionskatheters (2,4 ml pro Tier injiziert an zwölf Stellen) unterzogen und sieben Kontrolltieren wurde heparinisierte Kochsalzlösung injiziert. An der Grundlinie und vier Wochen später wurden die Tiere einem Ruhe- und Pacing-Echokardiogramm, um die örtliche Kontraktilität (% myocardiale Verdickung) zu bestimmen, und einer Mikrosphären-Studie unterzogen, um die kollateral-abhängige Perfusion bei Ruhe und während einer Adenosinfusion zu bestimmen. Vier Wochen nach Injektion von AKM verbesserte sich der kollaterale Fluss (ausgedrückt als das Verhältnis von ischämischem/normalem Bereich × 100) in mit AKM behandelten Schweinen, aber nicht in den Kontrollen (AKM: 95 ± 13 gegenüber 81 ± 11 bei Ruhe, P = 0,017; 85 ± 19 gegenüber 72 ± 10 während Adenosin, P = 0,046; Kontrollen: 86 ± 14 gegenüber 86 ± 14 bei Ruhe, P = NS; 73 ± 17 gegenüber 72 ± 14 während Adenosin, P = 0,63). Auf die gleiche Weise wurde die Kontraktilität in mit AKM behandelten Schweinen vergrößert, aber in den Kontrollen nicht (AKM: 83 ± 21 gegenüber 60 ± 32 bei Ruhe, P = 0,04; 91 ± 44 gegenüber 35 ± 43 während Pacing, P = 0,056; Kontrollen: 69 ± 48 gegenüber 64 ± 46 bei Ruhe, P = 0,74; 65 ± 56 gegenüber 37 ± 56 während Pacing, P = 0,23).
Die Ergebnisse zeigen, dass eine Katheter-basierte transendocardiale Injektion von AKM die kollaterale Perfusion und die myocardiale Funktion im ischämischen Myocard verstärken kann; die Erkenntnisse legen nahe, dass diese Methode eine neuartige therapeutische Vorgehensweise begründen könnte, um eine optimale therapeutische Angiogenese zu erreichen.
14 spezifisch pathogenfreie Hausschweine, die etwa 70 kg wogen, wurden anästhesiert, intubiert und erhielten ergänzend O₂ mit einer Rate von 2 l/min als auch eine 1–2 %ige Isofluraninhalation während des Eingriffes. Arterieller Zugang wurde über eine Isolation der rechten Oberschenkelarterie und Insertion einer 8-French-Sheath erhalten. Die linke Arteria circumflexa wurde durch eine linke laterale Thorakotomie isoliert und ein metallumschlossener Ameroidkonstriktor wurde am äußersten proximalen Bereich der Arterie implantiert. Vier Wochen nach Implantierung des Ameroidkonstriktors wurden alle Schweine (1) einer selektiven linken und rechten Koronarangiographie zur Überprüfung der ameroiden Okklusion und Bestimmung des kollateralen Flusses; (2) transthorakalen Echokardiographiestudien; und (3) einer örtlichen myocardialen Blutflussbestimmung unterzogen.
Knochenmarksaspiration und Aufbereitung und intramyocardiale Injektion
Direkt nach Vervollständigung der Grundlinienbestimmung wurden alle Tiere einer KM-Aspiration aus dem linken Oberschenkelschaft unter Verwendung üblicher Techniken unterzogen. KM wurde von zwei Seiten (3 ml pro Seite) unter Verwendung konservierungsmittelfreier heparinisierter Glassspritzen (20 Einheiten Heparin/1 ml frischem KM) aspiriert. Das aspirierte Knochenmark wurde direkt unter Verwendung von 300-µ- und 200-µ-Filtern aus rostfreiem Stahl sequentiell makrogefiltert. Dann wurde das Knochenmark unter Verwendung eines transendocardialen Injektionskatheters in das Myocard in zwölf Stellen (0,2 ml pro Injektionsstelle, eine Gesamtmenge von 2,4 ml) injiziert, gerichtet auf den ischämischen myocardialen Bereich und seine Grenzgebiete.
Echokardiographiestudie
Transthorakale Echocardiographiebilder mit Blick entlang der kurzen und langen Achse auf die Höhe des mittleren Papillarmuskels wurden bei den Tieren an der Grundlinie und während des Pacing, an der Grundlinie und während der Nachbetreuung vier Wochen nach der AKM-Implantierung aufgezeichnet. Verkürzungsfraktions-Messungen wurden durch Messung der prozentualen Wandverdickung (endsystolische Dicke minus enddiastolische Dicke/enddiastolische Dicke) × 100 erhalten. Diese Messungen wurden an dem ischämischen Bereich (laterales Gebiet) und entfernten Bereich (anterior-septales Gebiet) durchgeführt. Nachfolgend wurde eine vorübergehende Schrittmacher-Elektrode durch einen venösen rechten Oberschenkelschaft eingeführt und in dem rechten Atrium angeordnet. Bei den Tieren wurde mit einer Rate von 180/Minute über zwei Minuten ein Pacing durchgeführt und gleichzeitig wurden echocardiographische Bilder aufgenommen.
Örtlicher myocardialer Blutfluss
Örtliche Messungen des myocardialen Blutflusses wurden bei Ruhe und während einer maximalen koronaren Vasodilatation unter Verwendung von multiplen fluoreszierenden gefärbten Mikrosphären (Interactive Medical Technologies, West Los Angeles, KA) durchgeführt und mittels Referenz-Proben-Technik (Heymann MA, et. al., Prog. Cardiovasc. Dis. 1977; 20:55–79) quantifiziert. Fluoreszierende Mikrosphären (0,8 ml, 5 × 106 Mikrosphären/ml, 15 µm Durchmesser in einer Kochsalzsuspension mit 0,01 % Tween 80) wurden in das linke Atrium über einen Judkins Links 3,5-6-F-Diagnostikkatheter injiziert. Maximale koronare Vasodilatation wurde durch Infundieren von Adenosin mit einer konstanten Rate von 140 µg/kg/min (Fujisawa USA, Deerfield, IL) in die linke Oberschenkelvene über eine Dauer von sechs Minuten herbeigeführt. Während der letzten zwei Minuten der Infusion wurden Mikrosphäreninjektion und Blutreferenzentnahmen in gleicher Art und Weise wie bei der Ruhestudie durchgeführt.
Nach Beendigung der Perfusionsbestimmung wurden die Tiere mit einer Überdosis Natriumpentobarbital und KCL getötet. Herzen wurden entnommen, mit Ringerlactat gespült, für 10–15 Minuten perfusionsfixiert, und nachfolgend erfolgte eine Immersionsfixierung mit 10 % gepuffertem Formaldehyd über drei Tage. Nachdem die Fixierung vollständig war, wurden die Herzen entlang der kurzen Achse in 7 mm dicke Scheiben geschnitten. Die zwei zentralen Scheiben wurden in acht gleich groß Stücke geteilt, die weiterhin in endocardiale und epicardiale Teilsegmente geschnitten wurden. Der Durchschnitt der Messungen von acht lateralen ischämischen Zonen und acht normalen Septalzonen-Teilsegmenten wurde für die Bestimmung von endocardialem und epicardialem örtlichen myocardialen Blutfluss verwendet. Der relative kollaterale Fluss wurde auch als das Verhältnis des Blutflusses der ischämischen Zone/nicht-ischämischen Zone (IZ/NIZ) berechnet.
Histopathologie
Um zu bestimmen, ob das Injizieren von KM-Aspirat mittels Verwendung eines Injektionskatheters mit mechanischer Zellschädigung verbunden war, wurden Standard-KM-Abstriche vorbereitet, bevor und nachdem das frisch filtrierte AKM-Aspirat durch die Nadel unter Verwendung eines ähnlichen Injektionsdrucks wie in der in vivo-Studie getrieben wurde. Eine morphologische Bestimmung wurde von einem unabhängigen erfahrenen Fachmann, der das Studienprotokoll nicht kannte, durchgeführt.
Eine histopathologische Bestimmung wurde an ausgewähltem Herzgewebe durchgeführt. In der Pilotstudie wurden 7 mm dicke Scheiben entlang der kurzen Achse unter UV-Licht untersucht, um die fluoreszenzmarkierten Gebiete zu finden. Jedes bestimmte Gebiet wurde in drei nebeneinander liegende Blöcke voller Dicke (zentral, rechts und links) geschnitten, die in 10 % gepuffertem Formaldehyd immersionsfixiert wurden. Nachfolgend wurde jeder dieser Blöcke in drei ebene Stücke geschnitten, von denen zwei mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt wurden und einer mit PAS. Zusätzlich wurde ein frisch fluoreszenzmarkierter Gewebeblock aus dem ischämischen Gebiet jeden Tieres erhalten und wurde in einer OCT-Verbindung (Sakura Finetek USA Inc., Torance, KA) eingebettet und in flüssigem Stickstoff gefroren. Die gefrorenen Abschnitte dieses schockgefrorenen Myocardgewebes wurden luftgetrocknet und mit Aceton fixiert.
Immunoperoxidase-Färbung wurde mit dem automatisierten Dako-Immunno-Stainer (Dako, Carpenteria, KA) durchgeführt. Die intrinsische Peroxidase und nicht spezifische Aufnahme wurden mit 0,3 % Wasserstoffperoxid und 10 % Ovalbumin blockiert. Monoclonaler Maus-Antikörper gegen CD34 (Becton Dickinson, San Jose, KA) wurde als der primäre Antikörper verwendet. Der Verbindungsantikörper war ein biotinylierter Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörper und der tertiäre Antikörper war Streptavidin konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase. Diaminobenzidin (DAB) wurde als das Chromogen verwendet und die Schnitte wurden mit 1 % Methylgrün gegengefärbt. Nach der Dehydration und Klärung wurden die Objektträger fixiert und mit einem Nikon-Labphot-Mikroskop untersucht.
In der Wirksamkeitsstudie wurden 1,5 cm² große Schnitte vollständiger Dicke aus den ischämischen und den nicht-ischämischen Bereichen für die Paraffinschnitte aufbereitet. Jede der Proben wurde mit H&E, Masson-Trichrom und Faktor-VIII-assoziiertem Antigen gefärbt. Die mit Immunoperoxidase gefärbten Objektträger wurden im Hinblick auf die Dichte der Endothelzellenpopulation und Vaskularisierung untersucht. Letzteres wurde vom erstmaligen durch die Anwesenheit eines Lumens unterschieden. Vaskularität wurde unter Verwendung von fünf photomikrographischen Proben der Faktor-VIII-gefärbten Objektträger, die von der inneren Hälfte des ischämischen und nicht-ischämischen Myocards genommen wurden, bestimmt. Die Dichte der Endothelzellen wurde unter Verwendung digitalisierter Bilder derselben Photomikrographien bestimmt. Die Dichte der endothelialen Population wurde mittels Sigma-Scan Pro-Morphometrie-Software unter Verwendung der Intensitäts-Schwellenwert-Methode bestimmt. Der gesamte endotheliale Bereich jeder Probe als auch jedes Prüflings wurde zusammen mit dem relativen Prozentsatz an endothelialem Bereich (endothelialer Bereich/Bereich des untersuchten Myocards) erhalten. Der gesamte endotheliale Bereich wurde auch als der relative Prozentsatz an nicht-infarktgeschädigtem (lebensfähigem) Bereich des Myocards untersucht. Die Trichrom-gefärbten Schnitte wurden digitalisiert und der durch das Kollagen blau gefärbte Bereich als auch der Gesamtbereich des Schnittes ausser der durch das Epikard (das normalerweise Kollagen enthält) ausgefüllten Fläche wurden unter Verwendung von Sigma-Scan Pro gemessen. Der infarktgeschädigte Bereich wurde dann als der Bereich, der blaugefärbt war, berechnet.
Prozesstechnische Daten
Intramyocardiale Injektionen entweder mit AKM oder Placebo waren nicht mit einer akuten Veränderung des mittleren Blutdruckes, der Herzfrequenz oder Herbeiführung von Arrhythmie verbunden. Alle hämodynamischen Parameter waren zwischen den zwei Gruppen vergleichbar. Ein paarweiser Vergleich zeigte ähnliche hämodynamische Parameter innerhalb jeder Gruppe in dem index verglichen mit der Nachbetreuung, mit Ausnahme eines höheren mittleren arteriellen Ausgangsblutdrucks bei der Nachbetreuung in der Kontrollgruppe (P = 0,03) ohne anschließende Unterschiede zwischen Pacing oder Adenosin-Infusion.
Myocardiale Funktion
Die Bestimmung örtlicher myocardialer Funktion wird in Tabelle I unten gezeigt. Vor dem Eingriff war die relative Fraktions-Wandverdickung, ausgedrückt als Verhältnis ischämischer Zone zu nicht-ischämischer Zone (IZ/NIZ) × 100, bei Ruhe und während des Pacing, zwischen den Gruppen ähnlich (P = 0,86 beziehungsweise 0,96). Vier Wochen nach der intramyocardialen Injektion von AKM trat eine örtlich verbesserte Wandverdickung in Ruhe und während des Pacing auf, was sich aus einer 50 %igen Zunahme der Wandverdickung der kollateral-abhängigen ischämischen lateralen Wand ergab. Es wurden keine signifikanten Veränderungen in den Kontrolltieren beobachtet, obwohl eine Neigung zu einer Verbesserung der Wandverdickung in dem ischämischen Gebiet während des Pacing in der Nachbetreuung festgestellt wurde. Tabelle I. Örtliche Kontraktilität der ischämischen Wand

Grundlinie Nachbetreuung P

Ruhe

AKM (%) 60 ± 32 83 ± 21 0.04

Kontrolle (%) 64 ± 46 69 ± 48 0.74

Pacing

AKM (%) 36 ± 43 91 ± 44 0.056

Kontrolle (%) 37 ± 56 65 ± 56 0.23
AKM bezeichnet autologes Knochenmark.
Myocardiale Perfusionsdaten
Die Bestimmung örtlicher myocardialer Perfusion wird in Tabelle II unten gezeigt. Es gab dort keine Unterschiede zwischen der behandelten und der Kontrollgruppe im Hinblick auf die relative transmurale myocardiale Perfusion, IZ/NIZ, bei Ruhe und während der Adenosininfusion (P = 0,42 beziehungsweise 0,96) vor dem Eingriff. Vier Wochen nach der AKM-Injektion verbesserte sich die relative örtliche transmurale myocardiale Perfusion bei Ruhe und während des Pacing signifikant. Dies ergab sich aus einer absoluten Verbesserung der myocardialen Perfusion in der ischämischen Zone, bei Ruhe (ein Anstieg von 57 %, P = 0,08) und während der Adenosininfusion (37 %, P = 0,09), während keine signifikanten Veränderungen im absoluten Fluss zu der nicht-ischämischen Zone entweder bei Ruhe (Anstieg von 35 %, P = 0,18) oder während der Adenosininfusion (Anstieg von 25 %, P = 0,26) festgestellt wurden. Der örtliche Anstieg des myocardialen Blutflusses, der in den ischämischen Zonen gefunden wurde, setzt sich aus beidem zusammen, der örtlichen endocardialen (73 %) und epicardialen (62 %) Verbesserung bei Ruhe, mit einer etwas geringeren Verbesserung während der Adenosininfusion (40 % in beiden Zonen). Nach vier Wochen zeigte die Kontrollgruppe keine Unterschiede bei transmuraler, endocardialer oder epicardialer Perfusion in den ischämischen und den nicht-ischämischen Zonen verglichen mit Werten vor dem Eingriff. Tabelle II. Örtliche myocardiale Perfusion

Basislinie Nachbetreuung P

Ruhe

AKM (%) 83 ± 12 98 ± 14 0.001

Kontrolle (%) 89 ± 9 92 ± 0.1 0.43

Adenosin

AKM (%) 78 ± 12 89 ± 18 0.025

Kontrolle (%) 77 ± 5 78 ± 11 0.75
AKM bezeichnet autologes Knochenmark.
Beurteilung von Histopathologie und Vaskularität
Die Beurteilung von KM-Abstrichen vor und nach dem Injizieren des filtrierten Aspirats durch den einspritzenden Katheter ergab eine normale Struktur, die Abwesenheit von Makroaggregaten und keinen Beweis von Zellfragmenten oder entstellten Zellumrissen. Am ersten Tag nach den Injektionen wies die Histopathologie auf akute Läsionen hin, charakterisiert durch Fibrin und einen inflammatorischen Tractus mit dispergierten zellulären Infiltrationen. Das Infiltrat war durch mononukleäre Zellen charakterisiert, die morphologisch nicht von einem KM- Infiltrat differenziert werden konnten. Die Zellularität war am dritten und am siebten Tag maximal und fiel anschließend über die Zeit ab. Nach drei Wochen wurde an den Stellen mit 0,5 ml-Injektionen verglichen mit den 0,2 ml-Stellen mehr Fibrose gesehen. Die CD34-Immunfärbung, entwickelt um von KM-abstammende Vorläuferzellen zu identifizieren, wurde an Schnitten durchgeführt, die das maximale zelluläre Infiltrat zeigten. Insgesamt wurde geschätzt, dass 4–6 % des zellulären Infiltrats eine positive Immunreaktivität gegenüber CD34 zeigten.
Das ischämische Gebiet beider Gruppen war durch kleine Flächen mit fleckiger Nekrose charakterisiert, die insgesamt < 10 % des untersuchten ischämischen Myocards belegten. Die nicht-ischämische Fläche zeigte eine normale myocardiale Struktur auf. Veränderungen histomorphometrischer Charakteristika der zwei Gruppen wurden verglichen. Es gab keine Unterschiede bei der Gesamtfläche, die von Blutgefäßen ausgefüllt war, als auch bei der Anzahl an Blutgefäßen mit einem Durchmesser > 50 µm. Jedoch zeigte ein Vergleich der Gesamtflächen, die auf Faktor VIII positiv gefärbt waren (Endothelzellen mit und ohne Lumen), bei den ischämischen Gebieten im Vergleich zu den nicht-ischämischen Gebieten Unterschiede zwischen den zwei Gruppen auf. In der AKM-Gruppe war die gesamte Fläche mit Endothelzellen in der ischämisch kollateral-abhängigen Zone 100 % höher als jene, die in dem nicht-ischämischen Gebiet beobachtet wurde (11,6 ± 5,0 gegenüber 5,7 ± 2,3 % Fläche, P = 0,016), während es keinen signifikanten Unterschied in der Kontrollgruppe (12,3 ± 5,5 gegenüber 8,2 ± 3,1 % Fläche, P = 0,11) gab. Jedoch waren andere Vaskularitätsparameter einschließlich der prozentualen Fläche, die von Blutgefäßen ausgefüllt war, und der Anzahl an Blutgefäßen > 50 µm in den ischämischen und den nicht-ischämischen Gebieten beider Gruppen gleich.
BEISPIEL 5
Die Wirkung von autologem Knochenmark, das in vivo durch die vorherige Verabreichung von GM-CSF stimuliert wurde, in einem Tiermodell myocardialer Ischämie
Es wurde eine chronische myocardiale Ischämie bei 16 Schweinen durch die Implantierung von Ameroid-Konstriktoren rund um die linke koronare Arteria circumflexa ausgelöst. Vier Wochen minus drei Tage nach der Ameroid-Implantierung wurden acht Tiere einer subcutanen Injektion von GM-CSF an drei aufeinander folgenden Tagen (Dosis 10 µg/kg pro Tag) unterzogen, gefolgt (an dem vierten Tag und genau vier Wochen nach der Ameroid-Implantierung) von transendocardialen Injektionen frisch aspirierten AKM in die ischämische Zone unter Verwendung eines transendocardialen Injektionskatheters (2,4 ml pro Tier injiziert an 12 Stellen), und acht Kontrolltieren ohne GM-CSF-Stimulierung wurde heparinisierte Kochsalzlösung injiziert. An der Grundlinie und vier Wochen später wurden die Tiere einem Ruhe- und Pacingechokardiogramm, um die örtliche Kontraktilität (% myocardiale Verdickung) zu bestimmen, und einer Mikrosphären-Studie unterzogen, um die kollateral-abhängige Perfusion bei Ruhe und während einer Adenosininfusion zu bestimmen. Vier Wochen nach der Injektion von AKM verbesserte sich der kollaterale Fluss (ausgedrückt als das Verhältnis von ischämischer/normaler Zone × 100) bei AKM-behandelten Schweinen, nicht aber bei den Kontrollen (AKM: 85 ± 11 gegenüber 72 ± 16 bei Ruhe, P = 0,026; 83 ± 18 gegenüber 64 ± 19 während Adenosin, P = 0,06; Kontrollen: 93 ± 10 gegenüber 89 ± 9 bei Ruhe, P = 0,31; 73 ± 17 gegenüber 75 ± 8 während Adenosin, P = 0,74). In ähnlicher Weise stieg die Kontraktilität bei AKM-behandelten Schweinen, aber nicht bei den Kontrollen (AKM: 93 ± 33 gegenüber 63 ± 27 bei Ruhe, P = 0,009; 84 ± 36 gegenüber 51 ± 20 während Pacing, P = 0,014, Kontrollen: 72 ± 45 gegenüber 66 ± 43 bei Ruhe, P = 0,65; 70 ± 36 gegenüber 43 ± 55 während Pacing, P = 0,18).
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine Katheter-basierte transendocardiale Injektion von AKM, die durch GM-CSF, das an drei Tagen systemisch verabreicht wurde, in vivo vorstimuliert waren, die kollaterale Perfusion und myocardiale Funktion im ischämischen Myocard verstärken kann, wobei diese Erkenntnisse nahe legen, dass diese Methode eine neuartige therapeutische Strategie zum Erhalt einer optimalen therapeutischen Angiogenese darstellen könnte.
BEISPIEL 6
Behandlung eines menschlichen Patienten
Knochenmark (~ 5 ml) wird etwa 60 Minuten vor dem Beginn des cardialen Eingriffes unter Verwendung von konservierungsmittelfreien heparinisierten Glasspritzen (20 Einheiten Heparin/1 ml frischem KM) von der Crista iliaca aspiriert werden. Das aspirierte Knochenmark wird sofort unter Verwendung von 300-µ- und 200-µ-Filter aus rostfreiem Stahl sequentiell makrogefiltert werden. Ein erfahrener Hämatologe wird den Eingriff unter sterilen Bedingungen ausführen. Der Knochenmarkabstrich wird untersucht werden, um eine normale Histomorphologie der Knochenmarkpräparation zu bestätigen.
Jeder der einzelnen Eingriffe zur Zufuhr eines Agens an das Myocard kann verwendet werden. Diese schließen eine direkte trans-epicardiale Zufuhr ein, wie sie durch eine chirurgische Methode (zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, eine transthorakale Inzision oder transthorakale Insertion einer Nadel oder anderer Zufuhrgeräte oder mittels Thorakoskopie), oder durch eines von mehreren perkutanen Eingriffe erreicht werden könnte. Es folgt ein Beispiel der perkutanen Zufuhr. Es sollte hervorgehoben werden, dass das folgende Beispiel nicht so verstanden werden soll, dass es die Möglichkeiten der Zufuhr auf das in dem Beispiel beschriebene spezielle Katheter-basierte Plattformsystem begrenzt, – es kann ein beliebiges Katheter-basiertes Plattformsystem verwendet werden.
Unter Verwendung von Standardeingriffen für eine perkutane koronare Angioplastie wird ein Einführungsschleuse von mindestens 8F in die rechte oder linke Oberschenkelarterie eingeführt. Nach der Insertion der Arterienschleuse wird Heparin verabreicht und je nach Bedarf ergänzt, um eine ACT über 200–250 Sekunden während des LV-Mappings und den AKM-Transplantationteil des Eingriffes aufrechtzuerhalten. Die ACT wird während des Eingriffes in Intervallen von nicht länger als 30 Minuten, als auch am Ende des Eingriffes überprüft werden, um die Konformität mit dieser Anforderung zu bestätigen.
Eine linke Ventrikulographie erfolgt in Standard-RAO- und/oder -LAO-Projektion, um bei der Führung von NOGA-STAR^TM- und Injektionskathetern zu helfen, und eine elektromechanische LV-Karte wird bei Verwendung des NOGA-STAR^TM-Katheters erhalten. Der 8F-INJECTION-STAR-Katheter wird in einer retrograden Weise durch die Oberschenkelschleuse an der Valva aortae platziert. Nach vollständiger Ablenkung der Spitze wird die gerundete distale Spitze vorsichtig die Valva aortae kreuzend vorgerückt („prolappsed") und einmal innerhalb des LV-Hohlraums in geeigneter Weise befestigt.
Der Katheter (schließt einen elektromagnetischen Spitzensensor ein) ist auf eine der Behandlungszonen (z. B. anterior, lateral, inferior-posterior oder andere) gerichtet. Die Sicherheitseigenschaften des NOGA^TM-Systems ausnutzend wird die Nadelinsertion und Injektion nur erlaubt, wenn Stabilitätssignale einen LS-Wert von < 3 zeigen werden. Eine einzige Injektion von 0,2 cc frisch aspiriertem AKM wird durch eine trans-endocardiale Methode zu den Begrenzungen von bis zu zwei Behandlungszonen mit einem Abstand von nicht weniger als 5 mm zwischen jeder Injektionsstelle zugeführt werden. Die Dichte an Injektionsstellen wird von der individuellen endomyocardialen Anatomie des LV des Patienten und der Fähigkeit, eine stabile Position auf der endocardialen Oberfläche ohne Katheter-Verschiebung oder vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen (PVCs) zu erreichen, abhängen.
Jenes frisch aspirierte autologe Knochenmark, das in das ischämische Myocard transplantiert wurde, ist mit verbessertem kollateralen Fluss verbunden, ohne dass, aus mehreren Gründen, gegenteilige Wirkungen von klinischer Relevanz sein könnten. Die vorstehend überlegte Methodik nutzte den Vorteil der natürlichen Fähigkeit von Knochenmark, eine lokalisierte angiogenetische Antwort in einer wirksamen und offensichtlich sicheren Weise herbeizuführen. Solch eine angiogenetische Strategie würde möglicherweise weniger kostenintensiv sein als manche andere, die zur Zeit getestet werden. Sie würde auch potentielle toxizitätsrelevante Probleme vermeiden, die selten, aber definitiv bei verschiedenen genbasierten Methoden unter Verwendung viraler Vektoren auftreten können.
Die Erfindung basiert auf dem Konzept, dass autologes Knochenmark eine optimale Quelle für zelluläre (ein Beispiel würden endotheliale Vorläuferzellen sein, aber die Erfindung ist nicht begrenzt auf solche Zellen, da viele andere Zellen im Knochenmark bedeutsam an der angiogenetische Wirkung mitwirken könnten) und sezernierte, z. B. angiogenetische Wachstumsfaktoren, Elemente sein könnte, die für die Förderung von Wachstum neuer Blutgefäße und zur Wiederherstellung von Funktionen nötig sind, wenn sie auf ein anderes Gewebe übertragen werden, wie beispielsweise ein ischämisches Herz oder ischämische periphere Extremitäten. Das eigene Knochenmark des Patienten kann als die therapeutische Schlüsselquelle verwendet werden, um eine therapeutische Angiogenese und/oder Myogenese im ischämischen Gewebe, z. B. Herzmuskel und/oder ischämischer Extremität, mit beeinträchtigter Blutperfusion aufgrund arterieller Obstruktionen herbeizuführen. Das eigene Knochenmark des Patienten wird aspiriert, d. h. autologe Knochenmarkspende, aufbereitet und direkt in das ischämische und/oder anliegende nicht-ischämische Gewebe, z. B. Herzmuskel und/oder ischämische Extremität, injiziert, um das Wachstum von Blutgefäßen zu fördern.
Das autologe Knochenmark und/oder Knochenmarkprodukte werden in den Herzmuskel injiziert, z. B. das Myocard, indem entweder eine Katheter-basierte trans-endocardiale Injektionsmethode oder eine chirurgische (offener Brustkorb oder über Thorakotomie) trans-epicardiale Thorakotomie-Methode verwendet wird. Diese zwei Zufuhrstrategien können verwendet werden, um durch Förderung der Einlagerung und Integration angiogenetischer Knochenmarkselemente in das Organzielgewebe, z. B. Herzmuskel und/oder ischämische Extremität dasselbe therapeutische Ziel zu erreichen.
Gemäß der Erfindung werden wirksame Mengen autologen Knochenmarks für die Behandlung verabreicht. Wie durch erfahrene Praktiker anerkannt würde, wird die verabreichte Menge von vielen Faktoren abhängen, einschließlich der angestrebten Behandlung, der Schwere des zu behandelnden Leidens, der Größe und des Ausmaßes der zu behandelnden Fläche etc., ohne Beschränkung darauf. Mit Blick auf die Behandlung gemäß der Erfindung würde eine repräsentative Vorschrift sein, Mengen von jeweils etwa 0,2 bis 0,5 ml autologem Knochenmark in etwa 12 bis etwa 25 Injektionen zu verabreichen, so dass insgesamt etwa eine Gesamtmenge von etwa 2,4 bis etwa 6 ml autologem Knochenmark verabreicht wird. Jede verabreichte Dosis könnte vorzugsweise etwa von 1 bis etwa 2 Volumenprozente Heparin oder ein anderes Blutkoagulans wie beispielsweise Kumadin umfassen. Wenn das autologe Knochenmark kultiviert oder stimuliert worden ist und/oder es in Kombination mit anderen Pharmazeutika oder ähnlichem verabreicht wird, sollte die Menge des vorhandenen autologen Knochenmarks näherungsweise pro Dosis dieselbe sein und/oder die Gesamtheit des verabreichten autologen Knochenmarks sollte etwa dieselbe sein, wie vorstehend beschrieben. Es wird angenommen, dass die Gesamtanzahl der Zellen des autologen Knochenmarks, die bei jeder Behandlung verabreicht wird, von etwa 10 bis 5 × 10⁸ sein sollte.
Eine Optimierung der angiogenetischen Genexpression erfordert die gemeinsame Verabreichung von verschiedenen angiogenetischen Stimulantien mit dem autologen Knochenmark. Somit wird gemäß der Erfindung die Transplantation autologen Knochenmarks entweder als ein „alleinstehendes" therapeutisches Agens injiziert oder mit einem beliebigen pharmakologischen Arzneistoff, einem Protein oder Gen oder einer beliebigen anderen Verbindung oder mit einem Eingriff kombiniert, der die Produktion angiogenetischer Wachstumsfaktoren durch Knochenmark erhöhen und/oder die Endothelzellvermehrung, -Migration und Bildung von Blutgefäßen fördern könnte. Das (Die) „kombinierte(n)" Agens(zien) können dem Patienten oder dem Zielgewebe direkt verabreicht werden, oder ex vivo mit Knochenmark vor der Injektion von Knochenmark in den Patienten inkubiert werden. Beispiele dieser „kombinierten" Agenzien (obwohl sie nicht auf diese Agenzien beschränkt sind) sind Granulocyten-Monocytenkoloniestimulierender-Faktor (GM-CSF), Monocyten-Chemoattractant-Protein-1 (MCP-1), EAPS1 oder Hypoxie-induzierbarer Faktor-1 (HIF-1). Die Stimulierung des Knochenmarks könnte sein, indem das Knochenmark Faktoren in Form von Proteinen direkt ausgesetzt wird, oder die Knochenmarkszellen können mit Vektoren transfiziert werden, die relevante Gene tragen. Zum Beispiel kann Knochenmark mit einem Plasmidvektor oder einem Adenovirusvektor, der die HIF-1- oder EPAS1-Transgene trägt, transfiziert werden. Ein Beispiel eines Eingriffs, der die Produktion von angiogenetischen Faktoren durch Knochenmark erhöhen könnte, ist, indem die Knochenmarkszellen ex vivo einer Hypoxie ausgesetzt werden. Dieser Eingriff kann allein bei Knochenmark angewendet werden oder in Kombination mit beliebigen anderen der vorstehend genannten Faktoren. Diese Optimierungsstrategien sind entwickelt worden, um die Produktion von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) und/oder von anderen Cytokinen mit angiogenetischer Aktivität vor der direkten Injektion des Knochenmarks in das Herz oder ein beliebiges peripheres ischämisches Gewebe zu erhöhen. In weitestem Sinn umfasst die Erfindung eine intramyocardiale Injektion autologen Knochenmarks mit einem beliebigen Agens, das verfügbar werden würde, um eine Stimulierung von Knochenmark und/oder eine ex vivo- oder in vivo-Stimulierung der Herstellung eines beliebigen angiogenetischen Wachstumsfaktors durch das Knochenmark oder seine stromalen Mikroumgebung zu verursachen.
Die Verabreichung an Patienten wird variieren, abhängig von der klinischen Situation. Patienten zum Beispiel mit refraktärer Koronararterienerkrankung oder einer ischämischen peripheren Vaskulopathie, die Kandidaten für eine Knochenmarksaspirationsprozedur gefolgt von einer myocardialen oder Extremitätentransplantation autologen Knochenmarks sein werden, die in das ischämische Gewebe oder seine Grenzzonen und/oder normales Gewebe gerichtet ist, das als Quelle für kollaterale oder zelluläre Versorgung für das erkrankte Gewebe dient, zum Zweck einer therapeutischen Angiogenese und/oder Myogenese. Diese Prozedur wird die Verwendung einer Knochenmarkaspirationsprozedur, das Gewinnen und Aufbereiten von Knochenmark, gefolgt von der Verwendung autologen Knochenmarks oder seiner Elemente (Wachstumsfaktoren und/oder zelluläre Elemente, die von dem eigenen Knochenmark des Patienten isoliert werden), mit oder ohne irgendeine ex vivo-Stimulation seiner Zufuhrformen, zur Injektion in das ischämische oder nicht-ischämische Myocard und/oder periphere ischämische Gewebe (wie beispielsweise Extrem itätenischämie), einschließen. Das Knochenmark wird in einer Standard-Antikoagulations-/Antiaggregationslösung (enthält Natriumcitrat und EDTA) und bei 4°C in einem sterilen Medium bis zur Zeit der Verwendung gehalten werden.
Bei Verwendung wird das Knochenmark gefiltert werden, um zu vermeiden, das verbleibende Blutklumpen oder Makroaggregate in das Zielgewebe injiziert werden.
Das Knochenmark, mit oder ohne ein stimulierendes Agens in einer seiner Zufuhrformen oder mit oder ohne zuvoriger Transfektion mit einem Vektor, der ein Transgen trägt, das entwickelt wurde, die Angiogenesewirkung des Knochenmarks zu erhöhen, wird in den Herzmuskel z. B. bei therapeutischer myocardialer Angiogenese oder therapeutischer Myogenese unter Verwendung von entweder einer Katheter-basierten trans-endocardialen Injektionsvorrichtung oder über eine chirurgische (offener Brustkorb) trans-epicardiale Thorakotomie oder über eine andere beliebige Methode, die eine transepicardiale Zufuhr erlaubt, injiziert. In dem Fall der Behandlung von Extremitätenischämie wird das Knochenmark durch eine direkte Injektion des Knochenmarks oder seiner Elemente mit oder ohne ex vivo- oder in vivo-Stimulierung einer seiner Verabreichungsformen in die Muskeln des Beins übertragen.
Das Injektionsvolumen pro Behandlungsstelle wird wahrscheinlich zwischen 0,1–5,0 cc pro Injektionsstelle liegen, abhängig von dem speziellen Knochenmarkprodukt und der Schwere des ischämischen Zustandes und der Injektionsstelle. Die Gesamtanzahl an Injektionen wird wahrscheinlich zwischen 1–50 Injektionsstellen pro Behandlungssitzung liegen.

Claims

Verwendung von Aspirat autologen Knochenmarks, wobei das Knochenmark nicht von einem menschlichem Embryo oder Fötus stammt, für die Herstellung eines Arzneimittels zum Erhöhen der Bildung kollateraler Blutgefäße in ischämischem Herz- oder Extremitätengewebe in einem Individuum, welches in Stellen im ischämischen Herz- oder Extremitätengewebe des Individuums zu injizieren ist, um die Bildung kollateraler Blutgefäße im Gewebe auszulösen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Aspirat autologen Knochenmarks vor der Injektion ex vivo zu stimulieren ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Knochenmarksaspirat ex vivo zu züchten ist, um konditioniertes Kulturmedium vor der Injektion zu produzieren.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, die ferner das Filtern des Mittels vor dem Injizieren umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das angiogenetische Cytokin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus angiogenetischen Cytokinen bestehend aus MCP-1 und GM-CSF.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die Zellen in dem gezüchteten Knochenmarksaspirat mit einem oder mehreren Plasmiden oder adenoviralen Vektoren transfiziert wurden, die eine wirksame Menge eines Gens umfassen, das das angiogenetische Cytokin ausgewählt aus HIF1, EPAS1, MCP-1 und GM-CSF oder eine Kombination davon exprimiert.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Knochenmarksaspirat stimuliert wird, indem es vorübergehend einer Hypoxie oder einer Form von Energie ausgesetzt wird, die ausgewählt ist aus Ultraschall, Radiofrequenz und elektromagnetischen Wellen.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel ferner ein Antikoagulans umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei das Antikoagulans Heparin ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das ischämische Gewebe Myocard ist und das Mittel intramyocardial zu injizieren ist.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die Injektion über einen Katheter erfolgt.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Injektion trans-epicardial oder trans-endocardial erfolgt.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei 0,2 bis etwa 0,5 ml des Mittels in 12 bis etwa 25 Stellen in dem ischämischen Herzgewebe zu injizieren sind.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei HIF-1 oder EPAS1 dem Knochenmarksaspirat vor dem Injizieren hinzugefügt wird.
Zusammensetzung autologen Knochenmarks, wobei das Knochenmark nicht aus einem menschlichem Embryo oder Fötus stammt, umfassend ein konditioniertes Kulturmedium, das (eine) azelluläre Komponente(n) des gezüchteten Knochenmarks umfasst, das aus dem Züchten von Aspirat autologen Knochenmarks stammt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei das Knochenmarksaspirat gefiltert ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, die ferner eine Verbindung umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HIF-1, EPAS1, MCP-1 und GM-CSF.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei das konditionierte Kulturmedium Knochenmarksaspirat mit Zellen umfasst, die darin ein oder mehrere Plasmide oder adenovirale Vektoren umfassen, die ein Gen enthalten, das das HIF1, EPAS1, MCP-1, GM-CSF exprimiert.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei das Knochenmarksaspirat ex vivo stimuliert wurde.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei das Knochenmarksaspirat einer Hypoxie oder einer Form von Energie ausgewählt aus Ultraschall, Radiofrequenz und elektromagnetischen Wellen ausgesetzt wird.