DE60107576T2

DE60107576T2 - Biologische bekämpfung der wurzelkropfkrankheit

Info

Publication number: DE60107576T2
Application number: DE60107576T
Authority: DE
Inventors: W. Eric TRIPLETT; C. Thomas HERLACHE
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2000-08-11
Filing date: 2001-08-10
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2021-08-11
Also published as: US7141395B2; WO2002013614A3; EP1307103A2; NZ523390A; EP1307103B1; CA2419890A1; AU8328301A; WO2002013614A2; ATE283632T1; US20020090354A1; DE60107576D1

Description

Die Erfindung wurde von der US-Regierung durch das United States Department of Agriculture unterstützt (Grant Number USDA 00-CRHF-0-6055. Die Vereinigten Staaten haben bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Hintergrund der Erfindung
Eine Gattung von pflanzenpathogenen Bakterien ist die Gattung Agrobacterium. Agrobakterien sind natürlich vorkommende gentechnische Pflanzenmanipulatoren. Mitglieder der Gattung Agrobacterium haben von Natur aus die Fähigkeit, ein DNA-Segment aus einem Plasmid, das sich im Bakterium befindet, in das Genom einer Zelle einer lebenden Pflanze zu übertragen. Die in die Pflanze übertragene DNA (die T-DNA) bewirkt die Initiation von zwei Aktivitäten der Pflanzenzellen. Eine Aktivität besteht in der Herstellung einer Klasse von Chemikalien, den sogenannten Opinen, die von den Bakterien als Nahrungsquelle verstoffwechselt werden können. Die andere Aktivität besteht in der Initiation eines Wachstums einer als Wurzelhalsgalle bezeichneten Tumormasse.
Agrobacterium initiiert das Wachstum einer Wurzelhalsgalle, um eine Mikroumgebung, nämlich die Wurzelhalsgalle, zu erzeugen, wo die Bakterien gedeihen und sich vermehren können. Ungünstigerweise entzieht die Wurzelhalsgalle selbst Stoffwechselenergie aus der Pflanze, die sonst der Erzeugung von vegetativem Wachstum oder Früchten dienen könnte. Dadurch wird der Ertrag, den die Pflanze sonst liefern könnte, verringert. Bei einigen perennierenden Pflanzenspezies, bei denen die Pflanze langlebig ist, wie Weinreben, Steinobst und Rosen, kann der Einfluss der Wurzelhalsgallen-Krankheit erheblich sein. Beispielsweise stellen Stämme der Bakterien Agrobacterium vitis, die Weinstöcke angreifen, die Hauptursache der Weinreben-Wurzelhalsgalle dar, die weltweit die Rebenkrankheit mit dem größten wirtschaftlichen Schaden darstellt.
Es gibt eine Anzahl verschiedener Möglichkeiten zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten in der gewerblichen Landwirtschaft. Ein Weg beruht darauf, dass man chemische Mittel, die für den krankheitserregenden Organismus schädlich oder feindlich sind, auf die Pflanzen oder auf den Boden aufbringt. Ein zweiter Weg beruht auf der Entwicklung von Pflanzenvarietäten, die gegenüber einer Infektion durch die spezielle Krankheit oder den speziellen Krankheitsstamm resistent sind. Ein weiterer Weg beruht auf der Verwendung eines biologischen Organismus zur Bekämpfung des krankheitserregenden Organismus. Diese letztgenannte Strategie wird als biologische Bekämpfung bezeichnet.
Biologische Bekämpfungsmittel bekämpfen Pflanzenkrankheiten, indem sie Chemikalien ausscheiden, die eine Hemmung oder Abtötung des krankheitserregenden Organismus bewirken oder indem sie einfach die ökologische Nische besetzen, die ansonsten für den krankheitserregenden Organismus verfügbar wäre. Derartige Mikroorganismen können das Wachstum von konkurrierenden mikrobiellen Stämmen durch Verwendung von Toxinen hemmen. Wenn ein Bakterium ein breites Spektrum eines antibakteriellen Toxins in seine lokale Umgebung emittieren kann, so trifft dieses Bakterium in seiner ökologischen Nische auf geringere Konkurrenz. Daher haben zahlreiche Bakterien und andere Mikroorganismen Gene für Toxine entwickelt. Häufig tragen die Plasmide, die die für diese Toxine kodierenden Gene tragen, auch Gene, die dem Wirt Immunität gegenüber diesem speziellen Toxin verleiht. Dies ist vorteilhaft, da der das Toxin sezernierende Organismus offensichtlich einen Mechanismus aufweisen muss, um die Toxizität seines eigenen Toxins zu vermeiden, wenn der Organismus in erfolgreicher Weise die ökologische Nische, die er für sich freigemacht hat, bevölkern soll.
Man weiß, dass wirksame Strategien zur Bekämpfung von Wurzelhalsgallen unter Verwendung von biologischen Bekämpfungsmitteln zur Bekämpfung des Wachstums von Agrobacterium existieren. Ein Problem, das mit der Bekämpfung von Wurzelhalsgallen-Krankheiten verbunden ist, besteht jedoch darin, dass verschiedene Agrobacterium-Spezies normalerweise Pflanzen in unterschiedlichen ökologischen Mikrozonen der Pflanze sowie unterschiedliche Pflanzenspezies bewohnen und angreifen. Beispielsweise lebt Agrobacterium rhizogenes normalerweise in der Wurzelumgebung (Rhizosphäre) von Pflanzen und greift Pflanzenwurzeln an, während Agrobacterium tumefaciens normalerweise Pflanzenstängel oder – kronen angreift. Daher müssen Strategien zur biologischen Bekämpfung der Wurzelhalsgallen-Krankheit auf die Mikroumgebung der speziellen Pflanzenspezies und auf die Stämme von Agrobacterium, die unterdrückt werden sollen, fokussiert sein.
Folgende Literaturstellen befassen sich mit der Bildung von Wurzelknöllchen (Nodulation) und mit Bakterienstämmen, die an der Wurzelnodulation beteiligt sind: Triplett et al., PNAS, Bd. 85 (1998), S. 3810–3814; Dasong et al., Weisheng wuxue zazhi, Bd. 18, Nr. 2 (1998), S. 7–12, Chemical Abstract Nr. 129:3281198; WO-A-98/50564; und WO-A-90/15138.
Agrobacterium rhizogenes Stamm K84, stellt beispielsweise den am häufigsten untersuchten Stamm zur biologischen Bekämpfung von Wurzelhalsgallen dar. Er wird weltweit gewerblich zur Bekämpfung von Krankheiten an Steinobst eingesetzt. Man nimmt an, dass die biologische Bekämpfung mit dem Stamm K84 vorwiegend auf die Bildung von zwei plasmidkodierten Antibiotika, den Agrocinen 84 und 434, die durch die Gene pAgK84 bzw. pAgK434 kodiert werden, zurückzuführen ist, wobei jedes dieser Antibiotika für einen Teil der festgestellten Krankheitsbekämpfung verantwortlich ist. Agrocin 84, ein Adenin-Analoges, wirkt gegen tumorigene Stämme, die die Nopalin/Agrocinopin-pTi-Plasmide tragen und erfordert das accC-Gen im Zielstamm für seine Aktivität. EP-A-0 313 333 befasst sich mit Agrocin 84. Agrocin 434, ein disubstituiertes Cytidin-Analoges, entfaltet seine Wirksamkeit und Spezifität auf einem breiten Bereich von A. rhizogenes-Stämmen. Die gewerbliche Anwendung des biologischen K84-Bekämpfungssystems ist jedoch auf Steinobst beschränkt, da pathogene Agrobacterium-Stämme von anderen Fruchtsorten nicht durch K84 gehemmt werden.
In Bezug auf Agrobacterium vitis-Stämme, Verursacher von Weinreben-Wurzelhalsgallen, sind keine wirksamen präventiven Bekämpfungsmaßnahmen gewerblich verfügbar. Ein früherer Versuch zur Anwendung einer biologischen Bekämpfungstechnik gegen Wurzelhalsgallen bei Weinreben beruht auf dem bakteriellen Agrobacterium vitis-Stamm F2/5. Beim Stamm F2/5 handelt es sich um einen nicht-tumorigenen Agrobacterium-Stamm, der auf Weinreben zur Besetzung von ökologischen Nischen, die ansonsten durch tumorigene Stämme besetzt würden, angewandt werden kann. Dieser Strategie war ein gewisser Erfolg beschieden, jedoch ist der Erfolg für Weinreben spezifisch, d. h. er tritt bei anderen Pflanzenspezies nicht ein und variiert je nach der Identität des die Krankheit verursachenden, virulenten A. vitis-Stammes. Beispielsweise ist F2/5 bei von Weinreben abweichenden Wirtspflanzen, wie Nicotiana glauca, Sonnenblumen oder Tomaten unwirksam und ist ferner gegen verschiedene pathogene A. vitis-Stämme, wie CG78, sowie andere A. tumefaciens-Biovarietäten unwirksam. Herlache et al., Abstract Nr. 2000-87646, Phytopathology, Bd. 90, Nr. 6 (2000), suppl. S. 535, befasst sich mit A. vitis.
Es besteht ein Bedürfnis nach einem biologischen Bekämpfungsmittel mit einem breiteren Zielbereich, um die Bekämpfung der Wurzelhalsgallen-Krankheit, insbesondere die Wurzelhalsgallen-Krankheit bei Weinreben, zu bekämpfen.
Kurze zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung besteht zusammenfassend in einem Verfahren zur Bekämpfung der Wurzelhalsgallen-Krankheit bei Pflanzen unter Verwendung einer wirksamen Menge eines α-Proteobakteriumstammes, der Trifolitoxin (TFX) erzeugt. Beim α-Proteobakterienstamm kann es sich um eine biologisch reine Kultur eines isolierten, TFX-erzeugenden α-Proteobakterienstammes sowie um einen α-Proteobakterienstamm, der gentechnisch so bearbeitet ist, dass er TFX erzeugt, handeln. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das biologische Bekämpfungsmittel des vorstehenden Verfahrens sowie eine mit dem biologischen Bekämpfungsmittel behandelte Pflanze.
Das biologische Bekämpfungsmittel (Pflanzenschutzmittel) ist als ein α-Proteobakterienstamm charakterisiert, der gentechnologisch so verändert worden ist, dass er Trifolitoxin (TFX) bildet. Der verwendete α-Proteobakterienstamm kann einen beliebigen der zahlreichen Stämme von Agrobacterium umfassen, einschließlich Agrobacterium vitis und insbesondere A. vitis F2/5. Der verwendete α-Proteobakterienstamm kann gentechnologisch zur Erzeugung von TFX verändert worden sein, indem man ein genetisches Konstrukt in das Agrobacterium einführt, das bewirkt, dass das Agrobacterium das tfx-Operon aus Rhizobium trägt und exprimiert. Das Bakterium kann auch zur Erzeugung von TFX durch Einführung eines pT2TFXK-Plasmids in das Agrobacterium verändert worden sein. Das biologische Bekämpfungsmittel kann ferner den Stamm Agrobacterium vitis F2/5 (pT2TFXK), ATCC Patent-Hinterlegungsnummer PTA-2356, enthalten.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein biologisches Bekämpfungsmittel bereitzustellen, das das Auftreten der Wurzelhalsgallen-Krankheit bei Pflanzen und insbesondere bei Weinreben-Spezies hemmt.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass erstmals ein neues und wirksames Verfahren zur Hemmung der durch zahlreiche Stämme verursachten Wurzelhalsgallen-Krankheit bereitgestellt wird.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass ein neues und wirksames Verfahren zur Hemmung der Wurzelhalsgallen-Krankheit über dem Boden bei Weinreben-Spezies bereitgestellt wird.
Weitere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung und der Zeichnung. Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Bekämpfung der Wurzelhalsgallen-Krankheit bei Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren den Einbringungsschritt einer wirksamen Menge einer biologisch reinen Kultur eines α-Proteobakterienstammes, der Trifolitoxin herstellt, auf die Pflanze umfasst.
Die Erfindung betrifft ferner einen α-Proteobakterienstamm, der gentechnologisch so verändert worden ist, dass er Trifolitoxin zur Bekämpfung der Wurzelhalsgallen-Krankheit erzeugt, wenn er auf eine Pflanze aufgebracht wird.
Erfindungsgemäß wird ferner Agrobacterium vitis F2/5 (pT2TFXK), ATCC Patenthinterlegungsnummer PTA-2356, bereitgestellt.
Erfindungsgemäß wird ferner ein biologisches Bekämpfungsmittel (Pflanzenschutzmittel) zur Bekämpfung der Wurzelhalsgallen-Krankheit, das einen erfindungsgemäßen α-Proteobakterienstamm umfasst, bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der verschiedenen Darstellungen der Zeichnung
1 ist eine Darstellung der Struktur des tfx-Operons.
2 zeigt die mutmaßliche chemische Struktur des Trifolitoxin-Peptids.
3 ist eine graphische Darstellung einiger Ergebnisse der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Versuche.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bekämpfung der Wurzelhalsgallen-Krankheit bei Pflanzen bereit, indem man eine wirksame Menge eines α-Proteobakterienstammes, der Trifolitoxin (TFX) herstellt, verwendet.
Beim α-Proteobakterienstamm kann es sich um eine biologisch reine Kultur eines isolierten, TFX erzeugenden α-Proteobakterienstammes sowie um einen α-Proteobakterienstamm, der gentechnologisch zur Erzeugung von TFX verändert worden ist, handeln. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner das biologische Bekämpfungsmittel des vorstehenden Verfahrens und eine mit dem biologischen Bekämpfungsmittel behandelte Pflanze.
Trifolitoxin ist ein Peptid-Antibiotikum, das nativ durch Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii T24 erzeugt wird und nativ die Rhizosphäre von Bohnenpflanzen hemmt. Die Bildung und die Resistenzfunktionen des Antibiotikums werden durch ein Siebengen-tfx-Operon und ein unverknüpftes tfuA-Gen kodiert; Breil et al., "DNA sequence and mutational analysis of genes involved in the production and resistance of the antibiotic peptide trifolitoxin", J. Bacteriol., Bd. 175 (12) (1993), S. 3693–3702; und Breil et al., "A newly discovered gene, tfuA, involved in the production of the ribosomally synthesized peptide antibiotic trifolitoxin", J. Bacteriol., Bd. 178 (14) (1996), S. 4150–4156 (diese Druckschriften werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). TFX leitet sich von einer posttranslationalen Spaltung und Modifikation des tfxA-Genprodukts ab und hemmt in wirksamer Weise das Wachstum von Mitgliedern der α-Proteobakterien, einschließlich der Stämme von Ochrobactrum, Rhodobacter, Rhodospeudomonas, Brucella und Rhizobium. TFX ist für diese Gruppe hochgradig spezifisch, wie früher durch das Fehlen einer feststellbaren Wirkung auf Nicht-Rhizobiaceae-Bakterien in der Bohnen-Rhizosphäre gezeigt wurde; Robleto et al., "Effects of bacterial antibiotic production on rhizosphere microbial communities from a culture-independent perspective", Appl. Environ. Microbiol., Bd. 74 (1998), S. 5020–5022. Eine mutmaßliche Struktur von aktivem TFX ist in 2 dargestellt.
Wir haben festgestellt, dass es möglich ist, ein genetisches Konstrukt, das für die Bildung von TFX und die Resistenz dagegen kodiert, in einen α-Proteobakterienstamm, z. B. Agrobacterium, zu übertragen, und dass derartig gentechnologisch veränderte Bakterien als wirksame biologische Bekämpfungsmittel für die Wurzelhalsgallen-Krankheit bei Pflanzen wirken können. Ferner haben wir festgestellt, dass TFX eine Hemmwirkung gegen ein breites Spektrum von Agrobacterium vitis-Stämmen ausübt, einschließlich mehrerer Stämme, die durch den Stamm A. vitis F2/5 nur schlecht bekämpfbar sind. Ferner verstärkt die Bildung von TFX, das aus dem stabilen Plasmid pT2TFXK exprimiert wird, die biologische Bekämpfungswirkung von A. vitis F2/5, indem es diesem Stamm sowohl eine Wirksamkeit gegen Stämme, die normalerweise durch A. vitis F2/5 nicht bekämpft werden, verleiht, als auch dessen wirksames Wirtspflanzenspektrum erweitert.
Das erfindungsgemäße biologische Bekämpfungsmittel ist allgemein so definiert, dass es einen α-Proteobakterienstamm, der TFX herstellt, umfasst. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich beim biologischen Bekämpfungsmittel um einen α-Proteobakterienstamm, der gentechnologisch zur Bildung von TFX modifiziert worden ist. Stämme von α-Protobakterien sind aus dem Stand der Technik bekannt. Geeignete Stämme von α-Proteobakterien werden ferner von Triplett et al., "Expression of tfx and Sensitivity to the Rhizobial Peptide Antibiotic Trifolitoxin in a Taxonomically Distinct Group of α-Proteobacteria Including the Animal Pathogen Brucella abortus", App. Environ. Microbiol., Bd. 60 (11) (1994), S. 4163–4166, beschrieben, wobei diese Druckschrift durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht wird. Agrobacterium stellt eine Wahl von α-Proteobakterien dar, deren Wirksamkeit als biologische Bekämpfungsmittel in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gezeigt worden ist. Ein Beispiel für eine wirksame Agrobacterium-Spezies ist Agrobacterium vitis und insbesondere der A. vitis-Stamm F2/5.
Die verwendeten α-Proteobakterien können gentechnologisch zur Herstellung von TFX durch Einführung einer Nucleotidsequenz in die Bakterien, die die Bakterien veranlassen, das tfx-Operon zu tragen und zu exprimieren, verändert werden. Die Struktur des tfx-Operons ist in 1 dargestellt. Das Operon umfasst sieben Gene mit der Bezeichnung tfxA bis tfxG. Die Sequenz des tfx-Operons von Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Das tfxA-Gen umfasst die Nucleotidbasen 597 bis 725. Seine abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 2 dargestellt. Das tfxB-Gen umfasst die Nucleotidbasen 794 bis 1915. Seine abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt. Das tfxC-Gen umfasst die Nucleotidbasen 1908 bis 2978. Seine abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 8 dargestellt. Das tfxD-Gen umfasst die Nucleotidbasen 2982 bis 4232. Seine abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 4 dargestellt. Das tfxE-Gen umfasst die Nucleotidbasen 4213 bis 4971. Seine abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 9 dargestellt. Das tfxF-Gen umfasst die Nucleotidbasen 4968 bis 5744. Seine abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 5 dargestellt. Das tfxG-Gen umfasst die Nucleotidbasen 5996 bis 6781. Seine abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 6 dargestellt.
Es ist bekannt, dass Kopien von Genen von Stamm zu Stamm innerhalb einer Spezies variieren. Derartige Variationen werden hier als allele Variationen bezeichnet. Demzufolge gibt es wahrscheinlich tfx-Operons in anderen Bakterienspezies, die eine mit SEQ ID NO: 1 an jedem Nucleotid identische Sequenz aufweisen können oder nicht. Derartige allele Variationen zu SEQ ID NO: 1, die existieren können, beeinträchtigen nicht die Fähigkeit des Operons zur wirksamen Bildung von TFX in genau der gleichen Weise wie SEQ ID NO: 1.
Zahlreiche Verfahren zur Einführung von genetischen Konstrukten in Bakterien, mit denen die Bakterien dazu veranlasst werden können, spezielle Gene von Interesse zu tragen und zu exprimieren, sind aus dem Stand der Technik bekannt und können erfindungsgemäß herangezogen werden. Beispielsweise kommt es in Betracht, ein genetisches Konstrukt, das das tfx-Operon enthält, in ein Bakterium einzuführen, um damit mindestens eine Kopie des tfx-Operons in das Genom des Bakteriums zu integrieren. Alternativ kommt es in Betracht, in ein Bakterium ein Plasmid, das das tfx-Operon trägt und exprimiert, einzuführen. Im letztgenannten Fall kann das Plasmid ohne Beschränkung hierauf das in Triplett et al., "Expression of tfx and Sensitivity to the Rhizobial Peptide Antibiotic Trifolitoxin in a Taxonomically Distinct Group of α-Proteobacteria Including the Animal Pathogen Brucella abortus", App. Environ. Microbiol., Bd. 60 (11) (1994), S. 4163–4166, beschriebene pT2TFXK-Plasmid umfassen (diese Literaturstelle wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Obgleich von Plasmiden eingebrachte Merkmale häufig instabil sind, enthält pT2TFXK den RK2-Plasmid-Partitionierungslocus, der sowohl in vitro als auch unter Feldbedingungen ein hohes Maß an Stabilität verleiht. Die Stabilität der TFX-Expression ist von Vorteil, wenn das biologische Bekämpfungsmittel nur zur Pflanzzeit auf die Pflanze inokuliert wird, z. B. wenn die Wurzeln vor dem Pflanzen in eine bakterielle Suspension getaucht werden.
Bei einer Ausführungsform handelt es sich beim biologischen Bekämpfungsmittel um den Stamm Agrobacterium vitis F2/5 (pT2TFXK), der bei der American Type Culture Collection am 8. August 2000 hinterlegt worden ist und die Patent-Hinterlegungsnummer PTA-2356 erhalten hat. Mehrere Merkmale von F2/5 (pT2TFXK) lassen darauf schließen, dass es sich um ein sicheres Mittel zur biologischen Bekämpfung von Wurzelhalsgallen handelt. Zunächst übt die bakterielle TFX-Herstellung aufgrund des engen Toxizitätsbereiches von TFX nur eine geringe Wirkung auf Nicht-Zielorganismen aus. Ferner ist A. vitis selbst wirtspflanzenspezifisch und wurde nur aus der Weinreben-Rhizosphäre, Weinbergböden und befallenen Rebstöcken isoliert. Außerdem überlebt A. vitis schlecht im Erdreich und in Nicht-Weinbeeeren-Rhizosphären, was darauf schließen lässt, dass es unwahrscheinlich ist, dass auf Rebstöcke aufgebrachtes F2/5 (pT2TFXK) den Weinberg verlassen könnte oder die Rhizosphären von anderen Weinbergpflanzen befallen könnte. Dies steht im Gegensatz zum handelsüblich verwendeten A. radiobacter K84-Stamm, von dem gezeigt worden ist, dass er sich im brachliegenden Boden ausbreitet und die Rhizosphäre zahlreicher Pflanzenspezies kolonisiert. Außerdem fehlen bei pT2TFXK tra-Gene, so dass es nicht selbst-mobilisierbar ist. Ein Derivat von A. radiobacter K84, K1026, trägt ein Δtra-Derivat des selbsttransmittierbaren pAgK84, das in Australien zur Bekämpfung von Wurzelhalsgallen verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist allgemein so definiert, dass es den Einbringungsschritt einer Menge des TFX herstellenden α-Proteobakterienstammes, die in wirksamer Menge das Wachstum von Wurzelhalsgallen im Vergleich zu einer nicht mit den TFX herstellenden α-Proteobakterien behandelten Pflanzen hemmt oder verringert, auf die Pflanze. Beim TFX herstellenden α-Proteobakterienstamm kann es sich um einen α-Proteobakterienstamm, der auf die vorstehend beschriebene Weise gentechnologisch zur Herstellung von TFX verändert worden ist, oder um eine im wesentlichen reine Kultur eines α-Proteobakterienstammes, der von Natur aus TFX erzeugt, handeln. Der Ausdruck "eine im wesentlichen reine" Kultur soll eine Kultur von TFX herstellenden α-Proteobakterien umfassen, die keine anderen bakteriellen Spezies in Mengen enthält, die zu einer Beeinträchtigung der Replikation oder TFX-Bildung der Kultur ausreichen oder die zu einem Nachweis durch normale bakteriologische Techniken ausreichen. Pflanzen, bei denen die vorliegende Erfindung angewandt werden kann, umfassen allgemein Pflanzen, die für die Wurzelhalsgallen-Krankheit empfänglich sind, z. B. Weinbeerenpflanzen, Obstbäume oder Rosenpflanzen.
Es fällt unter den breiten Umfang der Erfindung, dass das biologische Bekämpfungsmittel auf die Pflanze aufgebracht oder in den Boden zusammen mit der Pflanze oder Pflanzensamen eingebracht wird, so dass sich eine Kultur des biologischen Bekämpfungsmittels in der Nähe oder innerhalb des empfindlichen Gewebes der Pflanze beim Wachsen entwickelt. Um dies zu erleichtern, wird das biologische Bekämpfungsmittel vorzugsweise mit einem geeigneten Streckmittel oder Trägerstoff verdünnt, entweder auf die Samen oder Pflanzen vor dem Pflanzen aufgebracht oder in die Furchen eingebracht, wenn die Samen oder Pflanzen gepflanzt werden. Alternativ kann das biologische Bekämpfungsmittel mit oder ohne einen Träger zubereitet und als getrenntes Inokulationsmittel vertrieben werden, das direkt auf die Pflanze oder direkt in die Furchen, in die die Samen oder Pflanzen gepflanzt werden, eingeführt wird. Derartige Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Eine vorteilhafte Technik kann das Aufbringen des biologischen Bekämpfungsmittels auf die Pflanze oder die Samen unter Verwendung eines geeigneten Beschichtungsmechanismus oder eines Bindemittels, bevor die Samen oder Pflanzen für den Pflanzvorgang in den Handel gebracht werden, umfassen. Verfahren zum Beschichten von Samen und Pflanzen sind dem Fachmann geläufig. Beispielsweise kann das biologische Bekämpfungsmittel mit einem porösen, chemisch inerten, granulierten Träger gemäß US-Patent 4 875 921 vermischt werden.
Unabhängig davon, ob das biologische Bekämpfungsmittel direkt in Form eines Überzugs auf den Samen oder die Pflanze aufgebracht wird oder nicht, wird das biologische Bekämpfungsmittel vorzugsweise mit einem geeigneten Trägerstoff oder Streckmittel verdünnt, um die Kultur leichter handhabbar zu machen und eine ausreichende Menge an Material bereitzustellen, um eine einfache Handhabung durch den Menschen zu ermöglichen. Beispielsweise kann ein Träger auf Torfbasis gemäß den Angaben von Bosworth et al, "Alfalfa yield response to inoculation with recombinant strains of Rhizobium meliloti carrying an extra copy of dct and/or modified nifA expression", Appl. Environ. Microbiol., Bd. 60 (1994), S. 3815–3832, verwendet werden (diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Ferner wurde festgestellt, dass Perlit-, Vermiculit- und Aktivkohle-Materialien geeignete Trägersubstanzen darstellen. Es wird angenommen, dass zahlreiche weitere nicht-toxische und biologisch inerte Substanzen von getrockneter oder granulierter Beschaffenheit ebenfalls als Träger für das biologische Bekämpfungsmittel dienen können.
Die Dichte, mit der das biologische Bekämpfungsmittel auf die Pflanze oder den Pflanzensamen oder in die Furchen inokuliert wird, soll ausreichend sein, um ein lebensfähiges bakterielles Wachstum im Bereich des Samens oder der Pflanze oder im unteren Bodenbereich neben den Wurzeln des Samens oder der Pflanze zu ermöglichen. Dabei soll eine wirksame Menge des biologischen Bekämpfungsmittels verwendet werden. Bei einer wirksamen Menge handelt es sich um eine Menge, die ausreicht, ein ausreichendes bakterielles Wachstum zu gewährleisten, so dass eine Infektion durch Wurzelhalsgallen induzierende Bakterien gehemmt oder vermindert wird, und zwar im Vergleich mit einer Infektion durch Wurzelhalsgallen induzierende Bakterien in Abwesenheit des biologischen Bekämpfungsmittels.
Das Projekt, dessen Ergebnisse nachstehend beschrieben sind, wurde in dem Bemühen begonnen, einen Bakterienstamm zu entwickeln, der als biologisches Bekämpfungsmittel zur Bekämpfung der Wurzelhalsgallen-Krankheit bei Weinpflanzen, wie Weinbeerenpflanzen, verwendet werden kann. Die Idee bestand darin, einer Agrobacterium-Spezies die Fähigkeit zur Bildung des TFX-Antibiotikums zu verleihen, um tumorigene Agrobacterium-Spezies, die ansonsten empfindliche Pflanzen befallen könnten, zu bekämpfen. Zu Beginn dieser Bemühungen war es nicht bekannt, ob das TFX-Toxin innerhalb des für Wurzelhalsgallen empfindlichen Pflanzengewebes sowie bei den über dem Boden herrschenden Umgebungsbedingungen bei Einwirkung von Sonnenlicht, Luft und anderen destabilisierenden Mitteln wirksam ist oder nicht. Das Toxin tritt normalerweise nur in der Rhizosphäre von wachsenden Pflanzen auf, wobei es sich dabei um die einzige Umgebung handelt, in der früher die Wirksamkeit des TFX-Toxins nachgewiesen wurde. Wir haben festgestellt, dass die Fähigkeit zur Herstellung des TFX-Toxins in erfolgreicher Weise gentechnologisch der Agrobacterium-Spezies verliehen werden kann, so dass sie als biologisches Bekämpfungsmittel zur Bekämpfung der Ausbreitung von tumorigenen Agrobacterium-Spezies innerhalb von für Wurzelhalsgallen empfindlichem Gewebe verwendet werden kann.
Es war unsicher, ob die für die Wurzelhalsgallen-Krankheit verantwortliche Spezies von Agrobacterium gegenüber dem TFX-Toxin empfindlich ist. Wie nachstehend ausgeführt, ergaben Tests, deren Ziel darin bestand, festzustellen, ob die Agrobacterium vitis-Stämme gegenüber TFX empfindlich sind oder nicht, dass ein Grad der Empfindlichkeit vorlag, der aber angesichts früherer TFX-Empfindlichkeitsmessungen mit anderen Agrobacterium-Spezies geringer als erwartet war. Bei Tests mit Rhizobium leguminosarum T24-Kolonien wurden nur relativ kleine Hemmzonen um das TFX erzeugende Rhizobium beobachtet. Für einen Agrobacterium-Stamm, dem Stamm F2/5 zur biologischen Bekämpfung, wurde eine TFX-Resistenz festgestellt. Trotzdem wurde festgestellt, dass dann, wenn das für die Herstellung von TFX kodierende Plasmid in den A. vitis-Stamm F2/5 eingeführt wurde, ein wirksames Mittel zur biologischen Bekämpfung von Wurzelhalsgallen geschaffen wurde, das gegen die meisten tumorigenen Stämme von A. vitis wirksam ist, wenn es zusammen mit dem tumorigenen Stamm inokuliert wird. Es wurde festgestellt, dass das biologische Bekämpfungsmittel wirksam ist, wenn das Verhältnis des biologischen Bekämpfungsmittels zu den tumorigenen Stämmen 1:1 oder mehr beträgt.
Vor Durchführung dieser Arbeit war es auch nicht klar, ob die TFX-Bildung eine Hemmung der Gallenbildung durch tumorigenes Agrobacterium in planta wirksam ist, da TFX in situ rasch abgebaut wird. Bei früheren Untersuchungen wurde der Abbau von antimikrobiellen Peptiden, wie Cecropin B und Attacin E in apoplastischen Pflanzenflüssigkeiten beobachtet. Dies war vermutlich auf apoplastische Proteinasen zurückzuführen. Somit führte die Expression von antimikrobiellen Peptiden in Pflanzen zu gemischten Ergebnissen in Bezug auf die Verstärkung der Krankheitsresistenz. Beispielsweise verlieh eine Cecropin-Expression in transgenem Tabak keine Resistenz gegenüber P. syringae pv tabaci, was vermutlich auf niedere apoplastische Peptidkonzentrationen aufgrund von Proteolyse zurückzuführen war; Jones and Kerr, "Agrobacterium radiobacter strain K1026, a genetically engineered derivative of strain K84 for biological control of crown gall", Plant Disease, Bd. 73 (1989), S. 15–18; Mills et al., "Evidence for the breakdown of cecropin B by proteinases in the intercellular fluid of peach leaves", Plant Sci., Bd. 104 (1999), S. 17–22.
Ferner wurde angenommen, dass es Schwierigkeiten bereiten würde, die TFX-Bildung gentechnologisch in Pflanzen zu erreichen, was auf den komplizierten Mechanismus zurückzuführen ist, gemäß dem sich aktives TFX von tfxA ableitet. Wir haben festgestellt, dass Agrobacterium rhizogenes zur Herstellung von TFX befähigt ist, indem man das pT2TFXK-Plasmid, das das tfx-Operon, jedoch nicht tfuA enthält, addiert. Dieser Befund ließ darauf schließen, dass die TFX-Bildung durch Wurzelhalsgallen biologisch bekämpfende Stämme von Agrobacterium, wie A. rhizogenes K84 und A. vitis F2/5, durch TFX-Bildung verstärkt werden kann und ausgezeichnete Transportträger für TFX zur Infektionsstelle bilden.
Durch die Bildung des TFX-Toxins im A. vitis-Stamm F2/5 ergeben sich weitere Vorteile. Beispielsweise wird die biologische Bekämpfung auf andere Nicht-Rebstockwirte von Agrobacterium, wie Nicotiana glauca, ausgedehnt. Die Verstärkung der biologischen Bekämpfung durch den F2/5-Stamm aufgrund der Fähigkeit zur Bildung von TFX erstreckt sich auf die Fähigkeit des F2/5-Stammes zur Bekämpfung von solchen A. vitis-Stämmen an Rebstöcken, die ohne die Fähigkeit zur Bildung von TFX nicht anderweitig bekämpft werden könnten. Dieses Ergebnis zeigt, dass die TFX-Herstellung die biologische Wurzelhalsgallen-Bekämpfung bei sämtlichen anderen Stämmen zur biologischen Bekämpfung, insbesondere von Agrobacterium-Stämmen, die auf anderen Wirtspflanzen verwendet werden können, verstärken kann. Die Fähigkeit zur Herstellung von TFX in Agrobacterium bietet die Möglichkeit, einem Stamm eine biologische Bekämpfungswirkung zu verleihen, sofern der Erzeugerstamm gegenüber dem tumorigenen Stamm im Überschuss vorliegt. Hohe Verhältnisse des eine biologische Bekämpfung bewirkenden Stammes zum pathogenen Stamm lassen sich unter Feldbedingungen leicht erreichen, indem man die Wurzel des Pflanzenmaterials in eine Suspension des Stammes zur biologischen Bekämpfung eintaucht oder indem man direkt bakterielle Suspensionen des die biologische Bekämpfung bewirkenden Stammes auf die Pflanzbetten oder die Pflanzen selbst aufbringt.
Somit ist die Fähigkeit zur Verstärkung des biologischen Bekämpfungsstatus von Agrobacterium-Stämmen nicht auf die vorstehend und in den folgenden Beispielen beschriebenen, speziellen beispielhaften Stämme beschränkt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Wirkung von TFX zur Hemmung von Pathogenen in von der Rhizosphäre abweichenden Umgebungen erreicht werden kann und dass die Strategie auch in einer Umgebung oberhalb des Bodens erfolgreich ist. Somit ist es möglich, diese toxinerzeugende Aktivität auf beliebige Agrobacterium-Stämme, deren Verwendung als biologisches Bekämpfungsmittel angestrebt wird, zu übertragen. Die nachstehend beschriebenen Plasmide eignen sich zur Einführung einer derartigen Aktivität in andere, Wurzelhalsgallen bildende Bakterienstämme, einschließlich andere Agrobacterium-Stämme.
[0038] Obgleich die nachstehenden Beispiele an Agrobacterium vitis durchgeführt wurden, lässt sich erwarten, dass die gleiche Technik auch bei anderen Wurzelhalsgallen bildenden Bakterienstämmen, wie anderen Stämmen von Agrobacterium, erfolgreich ist. Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung der Aspekte der vorliegenden Erfindung und schränken den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise ein.
Beispiele
Wachstumsbedingungen für Bakterien und Pflanzen, Stammkonstruktion
Die untersuchten bakteriellen Stämme sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt. Die A. vitis-Stämme (ohne pT2TFXK oder pT2TX3K) wurden von Dr. T. J. Burr, Cornell University, erhalten. Die Bakterien wurden bei 27 °C auf BSM-Agarmedium gezüchtet. A. vitis F2/5 (pT2TFXK) und F2/5 (pT2TX3K) wurden durch triparentale Paarung unter Anwendung üblicher Verfahren konstruiert. Transkonjuganten wurden auf BSM-Medium, das mit 50 ppm Kanamycin ergänzt war, selektiert. Trimethoprim (10 ppm) wurde zugesetzt, um eine Selektion gegen die E. coli-Donator- und Helferstämme vorzunehmen. Stämme, die die Plasmide pT2TFXK und pT2TX3K enthielten, wurden durch routinemäßige Vermehrung auf BSM unter Zusatz von 50 ppm Kanamycin gezüchtet. Vor der Verwendung bei der Herstellung von Inokulumsuspensionen für Tests auf biologische Bekämpfung wurden diese Stämme über Nacht auf BSM-Agar ohne Kanamycin gezüchtet. Die Plasmide pT2TFXK und pT2TX3K enthalten beide das vollständige Operon, das für das TFX-Peptidtoxin kodiert, einschließlich der Gene tfxA bis tfxG.
Pflanzen (Nicotiana glauca) wurden in einem Gewächshaus mit zusätzlicher Beleuchtung gezüchtet und je nach Bedarf mit einer Nährlösung mit der Bezeichnung CNS, die folgende Bestandteile enthält, gedüngt: 2 mM CaCl₂·2H₂O, 0:5 mM MgSO₄·7H₂O, 2 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 2,5 mM NH₄NO₃, 0,065 mM FeSO₄·7H₂O, 2,3 μM H₃BO₃, 0,9, μM MnSO4·H₂O, 0,6 μM ZnSO₄·7H₂O, 0,1 μM NaMoO₄·2H₂O, 0,11 μM NiCl₂·6H₂O, 0,01 μM CoCl₂·6H₂O, 0,15 μM CuSO₄·5H₂O.
Tabelle 1 Bakterielle Stämme
In vitro-Antibiosetest
Agrobacterium vitis-Stämme (Tabelle 1) wurden auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Trifolitoxin (TFX) getestet. 10 μl des Trifolitoxin erzeugenden Stammes Rhizobium leguminosarum T24 oder dessen Tfx-Derivat wurden direkt aus einem eingefrorenen Vorrat auf BSM-Agarplatten (Difco) punktförmig aufgesetzt. Die Bakterien wurden 2 bis 3 Tage bei 27 °C gezüchtet, um die Anreicherung von TFX im Medium zu ermöglichen. Diese Platten wurden sodann mit einem leichten Nebel entweder des hochgradig TFX-empfindlichen Rhizobium 128Cl-Stammes (positive Kontrolle) oder eines Agrobacterium vitis-Teststammes unter Verwendung einer Preval-Sprühpistole (Precision Valve Company Teil #267) besprüht.
Sprühsuspensionen von Teststämmen wurden hergestellt, indem man mit Bakterien gefüllte Ösen in 15 ml steriles destilliertes Wasser tauchte, bis die Suspension kaum sichtbar trüb war. Die besprühten Platten wurden 2 bis 4 Tage bei 27 °C inkubiert. Wenn Wachstum des Teststammes auf den Platten mit kein TFX bildenden Stämmen sichtbar wurde, wurden die Platten einer Bewertung auf Zonen ohne Wachstum um den TFX-bildenden Stamm unterzogen. Das Fehlen einer Zone um die kein TFX bildenden Stämme zeigte, dass die Zonenbildung nicht auf andere Faktoren als die TFX-Bildung zurückzuführen war. Die gleiche Vorgehensweise wurde für Rhizobium CE3 (pT2TFXK) und (PT2TX3K) als TFX-bildende bzw. nicht-bildende Stämme eingehalten.
Wie auf der Basis früherer Versuche zu erwarten war, waren die getesteten Agrobacterium vitis-Stämme gegenüber TFX-bildenden Stämmen empfindlich. Jedoch war der Grad der Empfindlichkeit geringer, als auf der Basis früherer TFX-Empfindlichkeitsmessungen mit CG-48 und CG-74 vorhergesagt worden war. Keine Zonen der Wachstumshemmung von A. vitis wurden um R. leguminosarum T24-Kolonien beobachtet und nur relativ kleine Zonen wurden um R. etli CE3 (pT2TFXK), das mehr TFX als T24 bildet, beobachtet. Ferner war ein A. vitis-Stamm, F2/5, gegenüber TFX resistent.
Da A. vitis F2/5 ein Agrocin bildet, gegenüber dem die meisten tumorigenen Stämme empfindlich sind, wurde die Wirkung von TFX auf A. vitis gegen TFX-bildende und nicht-bildende Rhizobium-Stämme getestet. Keiner der getesteten Stämme war gegenüber R. leguminosarum T24, das nur relativ geringe Mengen an TFX bildet, empfindlich. Sämtliche A. vitis-Stämme mit Ausnahme von F2/5 waren gegenüber R. etli CE3 (pT2TFXK) empfindlich, wie sich durch Zonen der Wachstumshemmung um die CE3 (pT2TFXK)-Kolonien zeigt. Das Wachstum von A. vitis wurde durch einen Nicht-TFX-Metaboliten oder durch Nährstoffkonkurrenz durch CE3 (pT2TFXK) nicht gehemmt, wie sich durch das Fehlen einer Zone um die nahezu isogene tfxA-Mutanten-CE3 (pT2TX3K)-Kolonie zeigte.
Nachweis der TFX-Herstellung durch den Stamm A. vitis F2/5 (pT2TFXK)
Der Stamm A. vitis F2/5 (pT2TFXK) wurde getestet, um festzustellen, ob der Stamm TFX bildet. Der Test wurde gemäß den vorstehenden Angaben mit F2/5 (pT2TFXK) bei Züchtung in einer einzelnen Kolonie im Zentrum der Platte durchgeführt. Nach 1-tägiger Züchtung bei 28 °C wurden die Platten mit einer verdünnten Suspension von ANU794 (pT2TX3K) oder ANU794 besprüht.
Es wurde festgestellt, dass der Stamm F2/5 (pT2TFXK) TFX-empfindliches R. leguminosarum bv. trifolii ANU794 hemmte, jedoch im Anschluss an eine Addition der TFX-Resistenzgene, die durch pT2TX3K zur Verfügung gestellt werden, keine Wirkung auf ANU794 hatte. Die Plasmide pT2TFXK und pT2TX3K verleihen Resistenz gegenüber TFX, Tetracyclin und Kanamycin, wobei pT2TFXK bei einem Wirtsstamm auch für TFX-Bildung sorgt. Da jedoch die Stämme F2/5 und F2/5 (pT2TX3K) keine Hemmzonen gegen ANU794 oder ANU794 (pT2TX3K) bildeten, erzeugt F2/5 (pT2TFXK) TFX.
Biologische in planta-Bekämpfung von Wurzelhalsgallen durch TFX erzeugende Stämme
Agrobacterium vitis-Stämme wurden vor der Bestimmung der kolonienbildenden Einheiten (CFU) pro ml in sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Diese Suspensionen wurden unter Verwendung eines Shimadzu UV-160-Spektrophotometers und von sterilem destilliertem Wasser auf einen OD₆₅₀-Wert von 0,10 (etwa 108 CFU/ml) eingestellt und bis zur Inokulation bei 4 °C aufbewahrt. Die tatsächliche Inokulum-Lebensfähigkeit und die Zelldichte wurden durch Verdünnungsausstrich auf BSM-Agarmedium an dem Tag, an dem die Pflanzen inokuliert waren, gemessen.
Vor der Inokulation wurden tumorigene Stämme 10-fach mit sterilem destilliertem Wasser auf etwa 10⁷ CFU/ml verdünnt. Vorratsprodukte zur biologischen Bekämpfung wurden unverdünnt belassen oder 10-fach verdünnt (für CG49- und CG435-Versuche) oder 100-fach verdünnt (für CG78-Versuche). Somit betrugen die CFU-Verhältnisse etwa 10:1 und 1:1 oder 1:10 avirulenter : tumorigener Stamm. Unmittelbar vor der Pflanzeninokulation wurden tumorigene Stämme 1:1 (Vol./Vol.) mit dem entsprechenden Teststamm für die biologische Bekämpfung vermischt. Positive Kontrollen wurden 1:1 (Vol./Vol.) mit Wasser verdünnt. Somit enthielten sämtliche Pflanzeninokula etwa 5 × 10⁶ CFU/ml der tumorigenen Stämme.
Pflanzen (Nicotiana glauca) wurden inokuliert, indem man den Stamm mit einer Schneidenadel verletzte. 3 oder 4 Inokulationen wurden pro Inokulumgemisch an jeder von 2 Pflanzen vorgenommen. Somit umfasste jeder der beiden Versuche 6 bis 8 Wiederholungen pro Behandlung. Ein 5 μl-Tropfen der bakteriellen Suspension wurde auf die Wunde gebracht und an der Luft getrocknet. Die Inokulationsstellen wurden lose mit Parafilm (American National Can) 1 Woche nach der Inokulation umwickelt. Der Gallendurchmesser senkrecht zum Stamm wurde 4 bis 7 Wochen nach der Inokulation unter Verwendung eines Greifzirkels gemessen. Sämtliche Messungen wurden in die statistische Analyse einbezogen. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung von ANOVA auf dem Signifikanzniveau α= 0,05 analysiert.
Erwartungsgemäß hemmte F2/5 nicht die Gallenbildung durch tumorigene A. vitis-Stämme an N. glauca. Ein 10:1-Verhältnis von A. vitis F2/5 (pT2TFXK) : Pathogen verursachte eine signifikante Verringerung der durchschnittlichen Gallengröße im Vergleich zu den kein TFX bildenden Kontrollen an den N. glauca-Stämmen bei allen drei getesteten tumorigenen Stämmen (3). Hohe Konzentrationen an F2/5 (pT2TFXK) verminderten ebenfalls das Auftreten von Gallen für CG435 und CG78, jedoch nicht für CG49 (Tabelle 2). Ein 1:1-Verhältnis von F2/5 (pT2TFXK) : CG435 führte ebenfalls zu einer erheblichen Verringerung der Gallengröße und dem Auftreten von Gallen im Vergleich zu Kontrollen. Ein 1:1-Verhältnis von F2/5 (pT2TFXK) : CG49 oder F2/5 (pT2TFXK) : CG78 beeinflusste weder das Auftreten von Gallen noch verringerte es die Gallengröße. Gleichermaßen führte ein Überschuss (ein 1:10-Verhältnis) von einem der virulenten Stämme gegenüber F2/5 (pT2TFXK) zu einem hohen Krankheitsbefall und zu großen Gallenabmessungen.
Tabelle 2 Einfluss von (pT2TFXK) auf das Auftreten von Gallen
Es wurden zwei Hauptvorteile der TFX-Bildung durch F2/5 nachgewiesen. Die biologische Bekämpfung wurde auf den Nicht-Rebstock-Wirt N. glauca ausgedehnt und die biologische Bekämpfung wurde auf einen Stamm, den F2/5 an Rebstöcken nicht bekämpfen konnte (CG78), ausgedehnt. Diese Wirkungen sind auf die TFX-Bildung zurückzuführen, wie durch den Wirksamkeitsmangel von F2/5 gegen CG49, CG435 und CG78 sowie durch den Wirksamkeitsmangel des nahe isogenen, TFX nicht-bildenden F2/5 (pT2TX3K) gegen CG78 dargelegt wird. TFX sorgte auch für eine biologische Bekämpfung, wenn der TFX bildende Stamm in einem Überschuss des tumorigenen Stammes vorlag. Somit hemmte F2/5 (pT2TFXK) in wirksamer Weise die Gallenbildung durch alle drei getesteten tumorigenen Stämme bei Koinokulation in einem etwa 10-fachen Überschuss.
Bei 1:1- oder 1:10-Inokulumverhältnissen von F2/5 (pT2TFXK). Pathogen war die biologische Bekämpfung verringert oder verschwunden. Dies könnte durch Anwendung hoher Verhältnisse von biologischem Bekämpfungsmittel zu Pathogen auf dem Feld überwunden werden, die sich leicht erreichen lassen sollten, indem man die Wurzeln des Pflanzenmaterials in Suspensionen des Stammes zur biologischen Bekämpfung taucht oder indem man direkt die bakterielle Suspension auf das Pflanzbett aufbringt.
Ferner wurde festgestellt, dass TFX gegenüber sämtlichen getesteten Spezies von Agrobacterium hemmend wirkt. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die TFX-Bildung die biologische Bekämpfung von Wurzelhalsgallen für andere biologische Bekämpfungsstämme, wie A. rhizogenes K84, und auf anderen Wirtspflanzen verstärken würde, insbesondere in Fällen, wo ein gemischtes Inokulum von verschiedenen tumorigenen Agrobacterium-Spezies auftritt.
Der Einfluss der TFX-Bildung auf die Gallengröße und die wirksamen Inokulumverhältnisse sind ferner in 3 graphisch dargestellt. Der Gallendurchmesser in Millimeter in senkrechter Richtung zum Stamm wurde 1 Monat nach der Inokulation gemessen. Die Wundstellen wurden mit 5 μl gemischten bakteriellen Suspensionen inokuliert. Jedes Inokulumgemisch wurde in 3 Wundstellen an jeder von zwei Pflanzen inokuliert, bei insgesamt 6 Inokulationen pro Behandlung.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Bekämpfen der Wurzelhalsgallen-Krankheit bei Pflanzen, wobei das Verfahren den Einbringungsschritt einer wirksamen Menge einer biologisch-reinen Kultur eines α-Proteobakterienstamms, der Trifolitoxin herstellt, auf die Pflanze umfasst.
Verfahren zum Bekämpfen der Wurzelhalsgallen-Krankheit bei Pflanzen, wobei das Verfahren den Einbringungsschritt einer wirksamen Menge eines α-Proteobakterienstamms, der zur Herstellung von Trifolitoxin verändert ist, auf die Pflanze umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der α-Proteobakterienstamm ein Stamm von Agrobacterium-Bakterien ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Stamm von Agrobacterium-Bakterien Agrobacterium vitis ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Stamm von Agrobacterium-Bakterien der Stamm Agrobacterium vitis F2/5 (pT2TFXK), ATCC Patenthinterlegungsnummer PTA-2356, ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, 3 oder 4, wobei der α-Proteobakterienstamm gentechnologisch verändert wurde, um das tfx-Operon zu exprimieren.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der α-Proteobakterienstamm gentechnologisch verändert wurde, um ein pT2TFXK-Plasmid zu exprimieren.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der α-Proteobakterienstamm gentechnologisch verändert wurde, um SEQ ID Nr.1 zu exprimieren.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Pflanze entweder eine Weinbeerenpflanze, ein Obstbaum oder eine Rosenpflanze ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Pflanze ein Samen ist.
Bakterien eines α-Proteobakterienstamms, der zum Herstellen von Trifolitoxin zum Bekämpfen der Wurzelhalsgallen-Krankheit, wenn auf die Pflanze eingebracht, gentechnologisch verändert wurde.
α-Proteobakterienstamm gemäß Anspruch 11, der gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7 definiert ist.
Agrobacterium vitis F2/5 (pT2TFXK), als ATCC Patenthinterlegungsnummer PTA-2356 hinterlegt.
Biologisches Pflanzenschutzmittel zum Bekämpfen der Wurzelhalsgallen-Krankheit, umfassend einen α-Proteobakterienstamm gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13.