DE60110925T2

DE60110925T2 - Gegen pflanzenkrankheiten verwendbare pseudomycine

Info

Publication number: DE60110925T2
Application number: DE60110925T
Authority: DE
Inventors: A. Gary STROBEL; J. Michael RODRIGUEZ
Original assignee: Research and Development Institute Inc of Montana State University; Eli Lilly and Co
Current assignee: Montana State University
Priority date: 2000-08-18
Filing date: 2001-08-17
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2021-08-18
Also published as: RU2285403C2; CR6591A; CA2419819C; CN1279819C; WO2002015696A2; AU8342001A; CN1536963A; DE60110925D1; US20040029797A1; AP2003002741A0; ES2243539T3; CN100448354C; US20080090731A1; MXPA03001493A; US7326689B2; HUP0302653A3; HUP0302653A2; JP2004517044A; NO20030745L; EP1326494A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Pseudomycinen als wirksame Fungizide gegen Pflanzen- und Getreideerkrankungen und betrifft insbesondere die Verwendung von Pseudomycinen gegen bestimmte Klassen von Pilzen, die Erkrankungen in Pflanzen und Getreiden verursachen.
HINTERGRUND
Eine Klasse von neuen Antipilzmitteln, die Pseudomycine, ist für die Behandlung von Pilzinfektionen in einer Vielzahl von Patienten vielversprechend (siehe z.B. Harrison, L., et al., "Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal acitivity", J. Gen. Microbiology, 137(12), 2857–65 (1991) und US Patente Nr. 5,576,298 und 5,837,685). Pseudomycine sind natürliche Produkte, die von Isolaten von Pseudomonas syringae abgeleitet sind. P. syringae ist eine große Gruppe von pflanzenassoziierten Bakterien, welche die Quelle von verschiedenen bioaktiven Substanzen sind, wie Bacitracin und den Syringomycinen. Natürliche Stämme und durch Transposons gebildete Mutanten von P. syringae bilden Verbindungen mit Antipilz Aktivität. Eine durch ein Transposon gebildete regulatorische Mutante des Wildtypstamms von P. syringae MSU 174, bekannt als MSU 16H (ATCC 67028) bildet verschiedene Pseuomycine. Die Pseudomycine A, B, C und C' wurden isoliert, chemisch charakterisiert, und sie zeigen den Besitz eines breiten Spektrums von Antipilz Aktivität, einschließlich Aktivität gegenüber wichtigen Pilzpathogenen in sowohl Menschen als auch Pflanzen. Die Pseudomycine sind strukturell mit Sy ringomycin und anderen Antimykotika von Isolaten von P. syringae verwandt, aber sie sind davon verschieden. Der Peptidrest für Pseudomycine A, B, C, C' entspricht L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl), wobei die terminale Carboxylgruppe einen makrozyklischen Ring auf der OH Gruppe des N-termialen Ser schließt. Die Analoga unterscheiden sich durch die N-Acylseitenkette, d.h. Pseudomycin A ist N-acyliert durch 3,4-Dihydroxytetradeconoat, Pseudomycin B durch 3-Hydroxytetradecanoat, Pseudomycin C durch 3,4-Dihydroxytetradecanoat und Pseudomycin C' durch 3-Hydroxyhexadecanoat (siehe z.B., Ballio, A., et al., "Novel bioactive lipodepsipeptides from Pseudomonas syringae: the pseudomycins", FEBS Letters, 355(1), 96–100, (1994) und Corio, V. M. et al., "Solution conformation of the Pseudomonas syringae MSU 16H phytotoxic lipodepsipeptide Pseudomycin A determined by computer simulations using distance geometry and molecular dynamics from NMR data", Eur. J. Biochem., 257(2), 449–456 (1998).)
Die vorliegende Erfindung liefert eine Gruppe von Pseudomycinen, die insbesondere nützlich sind, um Pflanzen und Getreide gegenüber Pilzerkrankungen zu schützen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Behandlung oder den Schutz von Pflanzen und Getreiden gegenüber Erkrankungen bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren für die Behandlung oder den Schutz von Pflanzen und Getreiden durch Anwendung von bestimmten Pseudomycinen bereitzustellen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Verwendung von bestimmten Pseudomycinen, um Pflanzen oder Getreide gegenüber Erkrankungen zu schützen oder zu behandeln, die durch Pilze verursacht werden.
Andere Ziele und Vorteile der Erfindung werden deutlich, wenn die Beschreibung der Erfindung fortschreitet.
Zur Erfüllung der zuvor genannten Ziele und Vorteile stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Schutz oder Behandlung von Pflanzen und Getreiden gegenüber Erkrankungen bereit, die von Pilzen abgeleitet sind, das Verabreichen einer wirksamen Menge von einem oder mehreren Pseudomycinprodukt(en) an diese Pflanzen oder Getreide umfasst.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGFORMEN
Die vorliegende Offenbarung betrifft die Entdeckung von neuen, zuvor unerwarteten Verwendungen für die Klasse von Lipopeptiden, die zusammen als die Pseudomycine, als Fungizide oder antimykotische Mittel bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Pseudomycine einzeln oder als eine Gruppe insbesondere nützlich in der Behandlung oder dem Schutz von Pflanzen, die durch eine Gruppe von ascomycetösen Pilzen bedroht sind, die zu Mycosphaerella asp. (vollständiger oder sexueller Zustand des Pilzes) und verschiedenen Imperfektstadien dieses Pilzes, die bekannt sind, einschließlich Septoria sp. und Cercospora sp. gehören. Zusätzlich wird eine Vielzahl von anderen ökonomisch extrem wichtigen pflanzenpathogenen Pilzen einschließlich Tapesia yallundae, Ustilago maydis, Penicillum roqueforti, Monilinia sp. und Geotrichum candidum durch die Pseudomycine abgetötet. Somit besitzen die Pseudomycine alleine oder einzeln eine Verwendung in der Behandlung von Pflanzen, um sie vor Schäden, die durch diese Pilze verursacht werden, zu schützen.
Diese Arten von Erkrankungen, die durch diese Organismen verursacht werden, reichen von Pflanzen während der Lagerung (Früchte und Gemüse) bis zu extrem wichtigen Felderkrankungen, wie Black Sigatoka von Banane und Straw breaker und gefleckter Weizen (engl.: blotch of wheat).
Diese Entdeckung betrifft eine zuvor unerwartete Reihe von extrem wichtigen pflanzenpathogenen Pilzen, die biologisch miteinander verwandt zu sein scheinen und die extrem empfindlich gegenüber einem oder mehreren der Pseudomycine sind und die sowohl durch diese inhibiert und abgetötet werden. Diese Pilze und einige andere, zuvor noch nicht offenbarte, verursachen einige der wichtigsten Pflanzenerkrankungen auf der Erde. Gegenwärtig werden durch diese Pilz verursachten Erkrankungen durch einfache oder komplexere Mischungen von Fungiziden, die durch den Menschen hergestellt werden, kontrolliert, die Umweltschäden verursachen und die eine unerwartete Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellen können. Andererseits bieten die Pseudomycine eine sichere und wirksame Alternative zu der Verwendung von Chemikalien, die durch den Menschen hergestellt werden, für die Kontrolle von bestimmten Pflanzenerkrankungen. Zusätzlich besitzt die Verwendung der Pseudomycine in der Kontrolle von Pflanzenerkrankungen bestimmte Vorteile, weil die Verwendung von natürlichen Produkten für Erkrankungskontrolle es dem Erzeuger erlauben würde, anzugeben, dass das Getreide unter biologischen/organischen Umständen angezogen wurde, was einen höheren Gewinn, der mit dem Produkt erzielt werden kann, erlaubt. Dies ist bemerkenswert, weil bisher auf keines der wichtigen Getreide in der Welt irgendein natürlich hergestelltes Fungizid für die Kontrolle von Pflanzenerkrankung aufgebracht wurde. Die Pseudomycine bieten sicher viele Vorteile für sowohl den landwirtschaftlichen Erzeuger als auch den Verbraucher.
Als ein Beispiel, wie und warum die Pseudomycine in der Landwirtschaft der Welt nützlich sein können, liegen die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (engl.: minimum inhibitory concentrations) (MICs) für einige der Pseudomycine, z.B. Pseudo A, A', B, B', C und C' im Bereich von 1 mg oder weniger pro ml. Dies ist eine extrem gewünschte Konzentration für wirksame Verabreichung in landwirtschaftlichen Situationen. Diese Verbindungen liefern sogar noch eine größere Wirkung (weniger als 1,0 mg) wenn sie gegenüber M. fijiensis Isolat 8088/88 getestet werden. M. fijiensis ist der verursachende Organismus der Black Sigatoka Erkrankung von Bananen und Wegerichen (engl.: plantains). Gegenwärtig müssen die Erzeuger dieser Getreide weltweit eine Mischung von drei Fungiziden (durch den Menschen hergestellt) in einer Rate von 30 mal pro Jahr versprühen, um ein Bananengetreide zu erhalten. Diese eine Erkrankung alleine stellt den größten Verbrauch von Fungizid pro Getreide in der gesamten Welt dar. Die Nachteile der Verwendung dieser synthetischen Fungizide sind zahlreich, einschließlich: 1. ihre extrem hohen Kosten (Millionen $); 2. die Unfähigkeit des Erzeugers, organisch gewachsenes Erzeugnis zu verkaufen, weil Fungizide darauf angewendet wurden; und 3. die Ungewissheit gegenüber Menschen ebenso wie Umweltgesundheitsrisiken, die in die ständige Verwendung dieser Fungizide über Dekaden eingeschlossen sind. Der Boden unter dem Bananendach in den Plantagen scheint von tierischem Leben steril zu sein und zeigt eine Anreicherung von Fungizidresten. Andererseits erscheinen die natürlich hergestellten Pseudomycine wirksamer in der Kontrolle der Sigatoka Erkrankung, während sie gleichzeitig Vorteile gegenüber der Umwelt und der menschlichen Gesundheit liefern.
Zusätzlich sind die Pseudomycine gegen eine Vielzahl von anderen Pflanzenerkrankungen, die durch Pilze verursacht werden, wirksam, einschließlich jener Pilze, die Pflanzenerzeugnisse während der Lagerung zerstören, z.B. Penicillium sp., Monilinia sp. und Geotrichum sp. Eine Mischung von Pseudomycinen, die auf geerntete Früchte aufgetragen wird, würde Pilzinfektionen und Lagerungsfäulnis verhindern.
Noch weitere Möglichkeiten für die Anwendung der Pseudomycine schließen Verwendungen für die Kontrolle von Erkrankungen ein, die durch Septoria sp., insbesondere S. nodurum und S. triticii auf Weizen, aber auch, basierend auf der biologischen Aktivität von diesen Molekülen – nahezu irgendeine Septoria sp., die irgendeine Pflanzenerkrankung in der Welt verursacht. Genauso sind andere Pilze, die mit Mycosphaerella sp. verwandt sind, betroffen, und sie schließen Pflanzenerkrankungen ein, die durch Cercospora sp. verursacht werden, die Blattflecken auf Zuckerrüben und vielen anderen Getreiden verursacht. Andere Organismen, die Erkrankungen verursachen, sind ebenfalls durch die Pseudomycine beeinflusst, und sie schließen Dreschslera portulaceae ein.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, dass die hier beschriebenen Pseudomycine enorme antimykotische Aktivität gegenüber einer zuvor nicht vermuteten und einer nahe verwandten Gruppe von pflanzenpathogenen Pilzen besitzen. Diese Hauptgruppe wird durch den vollständigen Zustand Fungus sp., Mycosphaerella sp. und ihre Vertreter im Imperfektzustand (asexueller Zustand), wie Septoria sp. und Cercospora sp. vertreten. Im Allgemeinen können die Pseudomycine alleine oder als eine Mischung in einer Formulierung verwendet werden, um Pflanzen gegenüber Pilzinfektion zu schützen. Anwendungen an Pflanzen im Feld ebenso wie in der Lagerung werden als die möglichen Verwendungen dieser Verbindungen erachtet.
So ist es ein Zweck dieser Erfindung zu zeigen, dass eine Vielzahl von ökologisch wichtigen, pflanzenpathogenen Pilzen für die Wirkungen eines oder mehrerer Pseudomycine empfänglich sind, die ursprünglich aus dem pflanzenassoziierten Bakterium Pseudomonas syringae isoliert wurden.
Die Pseudomycine, die in dem vorliegenden Verfahren nützlich sind, sind vorzugsweise Pseudomycine, die durch den Pseudomonas syringae gebildet werden, einschließlich der Pseudomycine, die als Pseudomycine A, A', B, B', C und C' ebenso wie Derivate, wie Pseudomycin A-PO4, ein Phosphatderivat und Pseudomycin A-FB, von denen beide bekannt sind, identifiziert wurden.
Diese Pseudomycine werden gegen eine große Vielzahl von Pflanzen und Getreiden angewendet, die für parasitische Erkrankungen, die durch Pilze verursacht werden, empfänglich sind. In diesem Zusammenhang sind die erfindungsgemäßen Pseudomycin-Zusammensetzungen primär nützlich, um den Beginn von parasitischen Erkrankungen, die durch Pilze verursacht werden, zu verhindern, so dass die Behandlung der Pflanzen und Getreide vor dem Beginn der Erkrankung bevorzugt ist. Jedoch sind die Pseudomycin-Zusammensetzungen auch nützlich in der Behandlung von infizierten Pflanzen.
Die erfindungsgemäßen Pseudomycin-Zusammensetzungen sind bei sehr niedrigen Konzentrationen in der Größenordnung von 1 bis zu 100 μg Pseudomycin pro ml wässriger Lösung wirksam. In dieser Hinsicht ist ein bevorzugtes Verfahren zum Aufbringen der erfindungsgemäßen Pseudomycin-Zusammensetzung durch Behandlung, wie durch direktes Sprühen auf die Pflanze oder das Getreide, die/das behandelt werden soll, unter Verwendung der angegebenen Konzentrationen. Die erfindungsgemäßen Pseudomycin-Zusammensetzungen können in der Form von Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen oder in irgendeiner anderen Form, die für das Sprühen auf Pflanzen und Getreide geeignet ist, vorliegen.
Die bevorzugten Pseudomycine, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden und ihre Verfahren zur Herstellung sind bekannt oder werden vollständig offenbart und beschrieben in den gleichzeitig anhängigen Anmeldungen PCT/US00/08728, eingereicht am 14. April 2000 und PCT/US00/08727, eingereicht am 14. April 2000, wobei in beiden Anmeldungen die Vereinigten Staaten benannt sind.
So wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Pseudomycin" Verbindungen mit der folgenden Formel I:
wobei R ein lipophiler Rest ist. Die Pseudomycin-Verbindungen A, A', B, B', C, C' sind durch die Formel I oben dargestellt, wobei R wie unten definiert ist.
So wie hier verwendet, betrifft Pseudomycin eines oder mehrere Mitglieder einer Familie von Antipilzmitteln, das von dem Bakterium Pseudomonas syringae isoliert wurde. Ein Pseudomycin ist ein Lipodepsipeptid, a zyklisches Peptid einschließlich einer oder mehreren ungewöhnlichen Aminosäuren und mit einer oder mehreren angehängten hydrophoben oder Fettsäureseitenketten. Insbesondere sind die Pseudomycine Lipodepsinonapeptide, mit einem zyklischen Peptidanteil, der durch eine Lactonbindung geschlossen ist und welche die ungewöhnlichen Aminosäuren 4-Chlorthreonin, 3-Hydroxyasparaginsäure, Dehydro-2- Buttersäure und 2,4-Diaminobuttersäure einschließen. Es wird angenommen, dass diese ungewöhnlichen Aminosäuren in biologische Charakteristika der Pseudomycine, wie Stabilität in Serum und ihre abtötende Wirkung involviert sind. Pseudomycine schließen Pseudomycin A, Pseudomycin A', Pseudomycin B, Pseudomycin B', Pseudomycin C und Pseudomycin C' ein. Jedes dieser Pseudomycine besitzt denselben zyklischen Peptidkern, aber sie unterscheiden sich in der hydrophoben Seitenkette, die an diesen Kern angeheftet ist.
Die Pseudomycine A, A', B, B', C und C' wurden jeweils isoliert und gereinigt, und ihre Strukturen wurden durch Verfahren einschließlich Aminosäuresequenzierung, NMR und Massenspektrometrie charakterisiert. Die Pseudomycine A, B, C und C' werden in dem US Patent Nr. 5,576,298, erteilt am 19. November 1996 an G. Strobel et al.; Harrison et al., "Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity", J. Gen. Microbiology 137, 2857–2865 (1991); und Ballio et al., "Novel bioactive lipodepsipeptides from Pseudomonas syringae: the pseudomycins", FEBS Lett. 355, 96–100 (1994) beschrieben. Die Pseudomycine A' und B' sind in der US Patentanmeldung Serial Nr. PCT/US00/08727 durch Palaniappan Kulanthaivel, et al., bezeichnet als "Pseudomycin Natural Products", gleichzeitig hiermit eingereicht und in den Beispielen dargestellt, beschrieben. Die Antipilz Aktivität aufgrund von einigen Pseudomycinen wurde in P. syringae, das ein Transposon trägt, das als Tn 903 bekannt ist, nachgewiesen, das Faktoren einschließlich Kanamycin Resistenz kodiert. Die Sequenz von und Verfahren zur Manipulation von Transposon Tn 903 sind bekannt. Oka et al., "Nucleotide sequence of the kanamycin resistance transposon Tn 903", J. Mol. Biol. 147, 217–226 (1981).
Die Pseudomycine variieren in Struktur und Eigenschaften. Die bevorzugten Pseudomycine A, B, C und C' zeigen Aktivität gegenüber einer Vielzahl von Pilzen und zeigen auch eine allgemein verträgliche Toxizität. Verglichen mit den anderen bevorzugten Pseudomycinen besitzt Pseudomycin B eine größere Wirksamkeit gegenüber gewissen Pilzen und eine niedrige Toxizität. Deshalb ist für die vorliegenden Verfahren Pseudomycin B bevorzugter. Jedes Pseudomycin besitzt einen zyklischen Nonapeptid Ring mit der Sequenz Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr (Serin; 2,4-Diaminobuttersäure; Asparaginsäure; Lysin; 2,3-Diaminobuttersäure; Allo-threonin; Dehydro-2-Aminobuttersäure; 3-Hydroxyasparaginsäure; 3-Chlorthreonin), insbesondere L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl), wobei die Carboxylgruppe von der ClThr und der Hydroxylgruppe desselben Serins den Ring mit einer Lactonbindung schließen. Die Pseudomycine unterscheiden sich in der Natur des lipophilen Rests, der an die Aminogruppe des N-terminalen Serins angeheftet ist. Die Aminogruppe des Serins bildet eine Amidbindung mit dem Carboxyl eines 3,4-Dihydroxytetradecanoyl Rests in Pseudomycin A, einem 3-Monohydroxytetradecanoyl Rest in Pseudomycin B, einem 3,4-Dihydroxyhexadecanoyl Rest in Pseudomycin C und einem 3-Monohydroxyhexadecanoyl Rest in Pseudomycin C'. Die Carboxylgruppe des Serins bildet eine Amidbindung mit dem Dab des Rings.
Die Pseudomycine, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können als ihre verträglichen Salze verwendet werden. Der Begriff "verträgliches Salz", so wie er hier verwendet wird, betrifft die Salze der Verbindungen, die oben beschrieben sind, die im Wesentlichen nicht toxisch gegenüber lebenden Organismen sind. Typische verträgliche Salze schließen jene Salze ein, die durch Umsetzung der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer Mineral- oder organischen Säure oder einer anorganischen Base hergestellt werden. Solche Salze sind als Säureadditions- und Basenadditionssalze bekannt.
Säuren, die für gewöhnlich verwendet werden, um Säureadditionssalze zu bilden, sind Mineralsäuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und organische Säuren, wie p-Toluolsulfon-, Methansulfonsäure, Oxalsäure, p-Bromphenylsulfonsäure, Kohlensäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure und Essigsäure. Beispiele von solchen pharmazeutisch verträglichen Salzen sind das Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfit, Bisulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Format, Isobutyrat, Caproat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butyl-1,3-dioat, Hexyl-1,6-dioat, Benzoat, Chlorbenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Lactat, Gamma-Hydroxybutyrat, Glykolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalen-1-sulfonat, Naphthalen-2-sulfonat und Mandelat. Bevorzugte pharmazeutisch verträglich Säureadditionssalze sind jene, die mit Mineralsäuren wie Salzsäure und Bromwasserstoffsäure gebildet werden, und jene, die mit organischen Säuren, wie Maleinsäure und Methansulfonsäure gebildet werden.
Basenadditionssalze schließen jene ein, die von anorganischen Basen abgeleitet sind, wie Ammonium oder Alkali oder alkalische Erdmetallhydroxide, Carbonate und Bicarbonate. Solche Basen, die in der Herstellung von Salzen in dieser Erfindung nützlich sind, schließen somit Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbicarbonat, Calciumhydroxid und Calciumcarbonat ein. Die Kalium- und Natriumsalzformen sind besonders bevorzugt.
Es sollte erkannt werden, dass das bestimmte Gegenion, das einen Teil irgendeines Salzes dieser Erfindung bildet, nicht kritischer Natur ist, solange das Salz als ein Ganzes pharmazeutisch verträglich ist und solange das Gegenion zu dem Salz als Ganzes keine ungewünschten Eigenschaften beiträgt.
Die vorliegende Erfindung kann besser verstanden werden mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele. Diese Beispiele sollen repräsentativ für spezifische Ausführungsformen der Erfindung sein, und sie beabsichtigen nicht, den Schutzbereich der Erfindung zu beschränken.
Hinterlegtes biologisches Material
P. syringae MSU 16H ist von der American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, MD, USA und der Zugangs Nr. ATCC 67028 öffentlich erhältlich. Die P. syringae Stämme 25-B1, 7H9-1 und 67 H1 wurden bei der American Type Culture Collection am 23. März 2000 hinterlegt, und ihnen wurden die folgenden Zugangsnummern zugewiesen:
Die Pseudomycine wurden aus Flüssigkulturen von Pseudomonas syringae isoliert. Pseudomonas syringae ist eine pflanzenassoziierte Mikrobe, die eine Vielzahl von Phytotoxinen und anderen komplexen Peptiden^1–3 bildet. In den späten 80er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde gezeigt, dass P. syringae Antipilzmittel bildet. Es ist das zugrundeliegende Konzept, dass Endosymbionten, die auf der Pflanze wachsen, Antipilzmittel bilden, um die Pflanze vor Pilzerkrankungen zu schützen. Die Pseudomycine wurden als die bioaktiven Antipilzmittel identifiziert. Von einer Transposon gebildeten Mutante von P. syringae Wildtyp wurde gezeigt, dass sie diese natürlichen Produkte übermäßig herstellt. Diese Transposon Mutantenstämme⁴, die an der Montana State University entwickelt wurden, wurden erfolgreich verwendet, um Ulmen zu inokulieren, um die holländische Ulmenerkrankung^5–6 zu kontrollieren. Zusätzlich wurde von diesen natürlichen Produkten gezeigt, dass sie eine selektive Antipilz Aktivität gegenüber Erkrankungen, die auf Feldgetreiden, Früchten und anderen Pflanzen (Tabellen 1–3) gefunden werden, besitzen. Beispielsweise zeigen die Pseudomycine vielversprechende Aktivität gegenüber M. fijiensis (M. fijiensis verursacht Black Sigatoka auf Bananen, benötigt mehr Fungizide und Fungizidanwendungen als irgendeine andere Pflanzenerkrankung auf der Welt heute). Von den Pseudomycinen wurde auch gezeigt, dass sie das vorzeitige Verderben von Mangos verhindern.
BEISPIEL 1
Die wiederholbare Herstellung im großen Maßstab (Kilogramm) von diesen natürlichen Produkten wurde erfolgreich gezeigt. Gereinigte Proben von freier Base und alternativen Salzformen wurden hergestellt. Es wurden ungefähr 34 pflanzenpathogene Pilze verwendet, um die Antipilz Eigenschaften von Pseudomycin A, B, B', C, C' zu bewerten. Die inhibitorischen Konzentrationen wurden an zwei Zeitpunkten am zweiten und fünften Tag gemessen.
Tabelle 1:
Materialien und Methoden
Die zu untersuchenden Pilze wurden auf Kartoffeldextroseagar (engl.: potato dextrose agar) (PDA) Platten bei Raumtemperatur angezogen. Stocklösungen von Pseudomycinen und Depsipeptiden wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma) bei 5 mg/ml suspendiert und bei –20°C gelagert. Am Tag des Experiments wurden Reihenverdünnungen von Verbindungen hergestellt. Alle Reihenverdünnungen wurden in DMSO hergestellt. Anmerkung: Es wurde ein Anfangsexperiment von Pseudomycinen B und B' in Methanol an einigen der Pilze durchgeführt, und einige Pilze zeigten inhibiertes Wachstum in der Anwesenheit von Methanol. Diese sind in dem Rohdatenabschnitt angegeben.
Die Assays wurden in 24-Vertiefungs Zellkulturclustern (Costar 3524) mit 990 μl Kartoffeldextrosebrühe (PDB, Difco) und 10 μl der zu untersuchenden Verbindung in jeder Vertiefung durchgeführt. Die untersuchten Anfangskonzentrationen waren 50–1,56 μg/ml (Endkonzentration von Pseudomycin). Die tatsächlichen Konzentrationen von untersuchten Pseudomycinen waren 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 und 1,56 μg/ml. Jede Vertiefung wurde mit dem geeigneten Pilz inokuliert. Außer es ist anders angegeben, bestand das Pilzinokulum aus einem ~4 mm² Stück PDA mit Pilzmycel. Die Ausnahmen waren wie folgt. Ustilago maydis: dieser Pilz wächst sehr ähnlich wie eine Hefe auf PDA, und die Zellen wurden von der PDA Stockplatte abgekratzt, in PDA resuspendiert, und 10 μl Inokulum wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Monilinia sp.: dieses Pilzmycel wächst als eine sehr lose Schicht oben auf PDA und würde nicht an Agarblocks anheften. Pilzmycel wurde mit einem Metallstäbchen in 500 μl PDA gemahlen, und 10 μl Inokulum wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Mycosphaerella fijiensis, Septoria passerinii, Septoria triticii: diese Pilze wachsen alle sehr langsam und die Ergebnisse waren schwer zu bewerten, wenn ein kleines Stück Agar mit Pilzmycel darauf als ein Inokulum verwendet wurde. Für diese Pilze wurde das Mycel mit einem Metall stäbchen in 500 μl PDA gemahlen, und 10 μl Inokulum wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt.
Die Vertiefungen wurden hinsichtlich Pilzwachstum am zweiten und am fünften Tag bewertet. Einige langsam wachsende Pilze wurden an späteren Tagen hinsichtlich des Wachstums bewertet, weil eine Bewertung am zweiten und fünften Tag nicht möglich war. Das Wachstum wurde durch Vergleich mit einer Kontrolle bewertet, die aus Pilz bestand, der in 990 μl Kartoffeldextrosebrühe und 10 μl DMSO (Dimethylsulfoxid) inokuliert wurde. Eine zusätzliche Kontrolle, die nur aus Pilzinokulum in PDA bestand, wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass das DMSO nicht inhibitorisch auf das Pilzwachstum war. DMSO beeinflusste keinen der getesteten Pilze, mit der Ausnahme von Drechslera portulacae, wo etwas Inhibition bemerkt wurde.
Alle Pilze, die Inhibition zeigten, wurden erneut getestet. Für die Assays, die wiederholt wurden, wurden neue Stocklösungen von einer zweiten Charge von Pseudomycinen hergestellt. Es sei angemerkt, dass Pseudomycin B' und Depsipeptid Stocklösungen erneut aus den Materialien der ersten Charge hergestellt wurden, weil diese nicht bei der zweiten Charge dabei waren. Einige von diesen Pilzen zeigten kein Wachstum, selbst bei den niedrigsten Mengen der hinzugefügten Pseudomycine, und sie wurden ein drittes Mal unter Verwendung geringerer Mengen an Pseudomycinen (2–0,0625 μg/ml Endkonzentration Pseudomycin) getestet. Die tatsächlichen Konzentrationen der getesteten Pseudomycine waren 2,1, 0,5, 0,25, 0,125 und 0,0625 μg/ml. A-PO₄ und A-FB = Pseudomycin A Phosphatsalz bzw. freie Base.
Tabelle 2:
Tabelle 2: (Fortsetzung)
Tabelle 3:
Tabelle 3: (Fortsetzung)
Eine Übersicht über die obigen Experimente zeigt, dass die getesteten Pilze am besten durch eines oder einige der Pseudomycine inhibiert werden, anstelle dass sie in derselben Weise auf alle die getesteten Verbindungen ansprechen. Sechs Pilze zeigten kein Wachstum selbst bei der niedrigsten der anfänglich getesteten Konzentration von Pseudomycinen, nämlich 1,56 μg/ml. Diese Pilze wurden erneut mit noch niedrigeren Konzentrationen von Pseudomycinen getestet. Z.B.: Drechslera portulacae schien kein Wachstum selbst bei 0,0625 μg/ml Pseudomycin A (PO4), B und C (9 Tage) zu besitzen. Zwei verschiedene Isolate von Mycosphaerella fijiensis sprachen unterschiedlich auf die geringere Dosis von Pseudomycinen an. Das Sigatoka Isolat schien durch jedes der Pseudomycine bis zu ungefähr 5 μg/ml inhibiert zu werden. Jedoch wurde das 8088/88 Isolat am besten durch Pseudomycin B inhibiert, mit keinem Wachstum mit 0,125 μg/ml bei 21 Tagen. Septoria tritici und Septoria passerinii wurden stark durch alle die Pseudomycine inhibiert, wobei S. tritici kein Wachstum bei 5 Tagen bei 0,0625 μg/ml Pseudomycin B und S. passerinii kein Wachstum bei 5 Tagen bei 0,0625 μg/ml Pseudomycin A (freie Base), B, C und C' zeigte. Ustilago maydis wurde am besten durch entweder Pseudomycin C oder C' inhibiert, mit keinem Wachstum bei 0,25 μg/ml nach 5 Tagen. Einige dieser Pilzen zeigten nur geringe Wachstumsinhibition bei den höchsten Mengen an getesteten Pseudomycinen (z.B. Alternaria helianthi, Aphanomyces sp., Botrytis alli, Sclerotinia sclerotiorum, Tapesia acuformis, Tapesia yallundae und Verticillium dahliae). Einige Pilze zeigten gute Inhibition mit einem oder einigen Pseudomycinen, aber nicht mit allen. Diese schloss Rhizocotnia solani ein, der am besten durch B' inhibiert wurde (kein Wachstum bei 6,25 μg/ml nach 5 Tagen); Monilinia sp., am besten inhibiert durch B und C' (kein Wachstum bei 6,25 μg/ml nach 5 Tagen), Geotrichum candidum, am besten inhibiert durch B (kein Wachstum bei 3,12 μg/ml nach 5 Tagen) und Penicillium roqueforti, am besten inhibiert durch B' (kein Wachstum bei 1,56 μg/ml nach 5 Tagen).
Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass die Pseudomycine eine Gruppe von selektiven "natürlichen" Fungiziden sind. Einige Pilze, die Infektionen verursachen, die in Getreiden nach der Ernte oder anderen Pflanzenspezies auftreten, sind empfindlich gegenüber den Pseudomycinen (z.B. Penicillium und Geotrichum). Pseudomycin zeigt beeindruckende Aktivität gegenüber M. fijiensis (Bananen). Rohpräparationen ebenso wie gereinigte Materialien spielen eine potenzielle Rolle in der Kontrolle von Pflanzenerkrankungen. Die Herstellung in gro ßem Maßstab von Pseudomycinen ist machbar und relativ günstig in der Herstellung. Es ist wahrscheinlich, dass natürliche Produkte umweltverträglich und wahrscheinlich sicher sind.
Referenzen

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Claims

Verfahren zur Prävention oder zum Behandeln einer Infektion von Pflanzen und Getreiden durch einen oder mehrere ascomycetösen Pilz(e) der Gattung Mycoshaerella sp. oder seiner Imperfektstadien Septoria sp. oder Cercospora sp., welches das Verabreichen einer wirksamen Menge von einer oder mehreren Pseudomycin-Zusammensetzung(en) an diese Pflanzen oder Getreide umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der/die Pilz(e) Mycoshaerella fijiensis ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Pseudomycin aus dem mit Pflanzen assoziierten Bakterium Pseudomonas syringae isoliert ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Pseudomycin aus der Gruppe, bestehend aus Pseudomycin A, Pseudomycin A', Pseudomycin B, Pseudomycin B', Pseudomycin C und Pseudomycin C', ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Pseudomycin auf die Pflanze oder das Getreide als eine wäßrige Suspension, Lösung oder Emulsion mit einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis 100 Mikrogramm pro ml aufgetragen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzen und Getreide aus der Gruppe, bestehend aus Bananen, Kochbananen, Sonnenblume, Zuckerrüben, Gerste, Zwiebel, Mais, Trauben, Portulak, Weizen, Tomate und Mais, ausgewählt sind.
Verwendung von einer oder mehreren Pseudomycin-Zusammensetzung(en) für die Prävention oder die Behandlung der Black Sigatoka-Erkrankung bei Pflanzen und Getreiden.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Pseudomycin-Zusammensetzung Pseudomycin, das von dem mit Pflanzen assoziierten Bakterium Pseudomonas syringae isoliert wurde, umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Pseudomycin aus der Gruppe, bestehend aus Pseudomycin A, Pseudomycin A', Pseudomycin B, Pseudomycin B', Pseudomycin C und Pseudomycin C', ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Pseudomycin-Zusammensetzung auf die Pflanze oder das Getreide als eine wäßrige Suspension, Lösung oder Emulsion mit einer Konzentration des Pseudomycins in einem Bereich von etwa 1 bis 100 Mikrogramm pro ml aufgetragen wird.