DE60027564T2

DE60027564T2 - Tek-antagonisten

Info

Publication number: DE60027564T2
Application number: DE60027564T
Authority: DE
Inventors: P. Douglas Seattle CERRETTI; G. Luis Seattle BORGES; C. William Normandy Park FANSLOW
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1999-06-07
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2020-06-08
Also published as: WO2000075323A1; NZ516258A; EP1187918A1; JP2003501090A; DE60027564D1; IL146482A; DE60027564T3; AU5328200A; EP1187918B9; ES2262518T3; IL146482A0; EP1187918B1; CY1105078T1; ES2262518T5; US20070025993A1; PT1187918E; DK1187918T3; US6413932B1; CA2374851A1; ATE324444T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Tek Antagonisten und die Verwendung von Tek Antagonisten, um die Angiogenese oder andere Tek-vermittelte Reaktionen in einem Säugetier zu inhibieren.
Stand der Technik
A. Angiogenese
Angiogenese, die Erzeugung neuer Blutgefäße, ist ein räumlich und zeitlich regulierter Prozess, in welchem Endothelzellen als Reaktion auf endogene positive und negative regulatorische Moleküle sich vermehren, migrieren, und sich zu Röhren zusammenlagern. Angiogenese spielt eine wesentliche Rolle in normaler als auch pathologischer Physiologie.
Unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Angiogenese in die fötale und embryonale Entwicklung, Wundheilung, Organ-Regeneration, und weibliche reproduktive Umbauprozesse einschließlich der Bildung des Endometriums, Corpus luteum und der Plazenta, eingebunden. Die Angiogenese wird unter normalen Bedingungen, insbesondere in erwachsenen Tieren, strikt reguliert und die Störung der regulatorischen Kontrolle kann zu der pathologischen Angiogenese führen.
Die pathologische Angiogenese wurde mit der Manifestation und/oder Progression von entzündlichen Krankheiten, bestimmten Augenkrankeiten und Krebs in Zusammenhang gebracht. Insbesondere unterstützen mehrere Beweislinien das Konzept, dass die Angiogenese für das Wachstum und Persistenz von festen Tumoren und ihren Metastasen wesentlich ist (siehe, z.B., Folkman, N. Engl. J. Med. 285: 1182, 1971; Folkman et al., Nature 339: 58, 1989; Kim et al., Nature 362: 841, 1993; Hori et al., Cancer Res., 51: 6180, 1991). Angiogenese-Inhibitoren werden deshalb für die Prävention (z.B., Behandlung prämaligner Zustände), Intervention (z.B., Behandlung kleiner Tumore) und die Regression (z.B., Behandlung von großen Tumoren) von Krebs untersucht (siehe z.B., Bergers et al., Science 284: 808, 1999).
Obwohl mehrere Anti-angiogene Substanzen gegenwärtig in Entwicklung sind und als Therapeutika getestet werden, gibt es einen Bedarf für zusätzliche Verfahren zum Inhibieren der Angiogenese für die Prävention, Aufhebung, und Linderung von Krankheitsprozessen, die von der pathologischen Angiogenese abhängig sind.
B. Tek Polypeptide
Die Rezeptor Tyrosinkinasen (RTKs) sind eine große und evolutionär konservierte Familie von Proteinen, die an der Übertragung von extrazellulären Signalen an das Zytoplasma beteiligt sind. Unter den RTKs, von denen geglaubt wird, dass sie in die vaskuläre Morphogenese und Erhaltung eingebunden sind, sind die vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF)-Rezeptoren und Tek (siehe Hanahan, Science 277: 48, 1997).
Tek, welches auch Tie2 und ork genannt wurde, ist eine RTK, die hauptsächlich in vaskulärem Endothelium exprimiert wird. Die molekulare Klonierung des menschlichen Tek (ork) wurde von Ziegler, U.S. Patent Nr. 5.447.860, beschrieben. Vier Tek-Liganden, Angiopoietin-1, Angiopoietin-2, Angiopoietin-3, und Angiopoietin-4 (Ang1, Ang2, Ang3, und Ang4) sind beschrieben worden (Davis et al., Cell 87: 1161, 1996; Maisonpierre et al., Science 277: 55, 1997; Valenzuela et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1904, 1999). Diese Liganden haben eindeutige Expressionsmuster und Aktivitäten bezüglich Tek. „Tie Ligand-Homologa", als NL1, NL5, NL8 und NL4 bezeichnet, sind im U.S. Patent Nr. 6,057,435 beschrieben.
Tek-Knockout-Mäuse weisen Mängel in der vaskulären Entwicklung auf, und sterben während der Embryogenese (siehe Dumont, Genes Dev. 8: 1897, 1994; Sato, Nature 376: 70, 1995), was darauf hinweist, dass Tek eine Rolle in der Entwicklung der embryonalen Vaskulatur spielt.
Peters et al. haben einen löslichen Tek (Tie2) Inhibitor, der als ExTek.6His bezeichnet ist, beschrieben, der aus dem gesamten extrazellulären Abschnitt der murinen Tek, welche mit einem sechs-Histidin Tag fusioniert ist, besteht (J. Clin. Invest. 199 (8): 2072, 1997; WO 98/18914). ExTek.6His inhibierte das Wachstum und die Tumor-Vaskularisation in einem Ratten-Hautfenster-Kammermodell, und blockierte die durch Tumorzellen-konditionierte Medien stimulierte Angiogenese in einer Ratten kornealen Mikrotaschen-Untersuchung. Peters et al. haben auch einen Replikations-defekten adenoviralen Vektor, der als AdExTek bezeichnet ist, beschrieben, welcher die Tek extrazelluläre Domäne exprimiert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8829, 1998: WO 98/18914). AdExTek inhibierte das Wachstum und die Metastasierung eines murinen Brustkarzinoms und eines murinen Melanoms.
Während ExTek.6His und AdExTek sich als Anti-angiogene Substanzen als nützlich erweisen können, gibt es einen Bedarf für zusätzliche und verbesserte Tek Antagonisten und zusätzliche und verbesserte Verfahren zum Inhibieren der Angiogenese oder anderer Tek-vermittelter Reaktionen unter Verwendung von Tek Antagonisten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Tek Antagonisten und die Verwendung der Tek Antagonisten bereit, um die Angiogenese oder anderer Tek-vermittelter Reaktionen in einem Säugetier, welches einer solchen Behandlung bedarf, zu inhibieren. Die Erfindung basiert teilweise auf der unerwarteten Entdeckung, dass Fragmente der Tek-extrazellulären Domäne, denen die gesamte oder Teile der Fibronectin Typ III (FNIII)-Motive enthaltenden Regionen fehlt, eine höhere Bindungsaffinität für Tek-Liganden aufweisen können, als Polypeptide, die die Tek-extrazelluläre Domäne mit voller Länge aufweisen.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Tek-extrazelluläre Domäne, welche als Reste 19–745 der SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, aufweist, wobei dem Polypeptid die Reste 473–745 der SEQ ID Nr. 1, die die Fibronectin Typ III (FNIII)-Motive enthalten, fehlen und wobei das Polypeptid eine höhere Bindungsaffinität für Angiopoietin-1 oder Angiopoietin-2 oder Angiopoietin-4 aufweist, als ein Polypeptid, welches die Tek extrazelluläre Domäne mit voller Länge aufweist.
Die Tek extrazelluläre Domäne kann aus einer Gruppe, bestehend aus:

(a) den Resten 23–472 der SEQ ID Nr. 2;
(b) Varianten die zumindest zu 95% identisch sind zu (a);
(c) Varianten die zumindest zu 98% identisch sind zu (a);
(d) Varianten die zumindest zu 99% identisch sind zu (a); und
(e) den Resten 19–472 der SEQ ID Nr. 2

Das Polypeptid kann aus den Resten 19–704 oder 23–704 der SEQ ID Nr. 2 bestehen.
Die Erfindung umfasst auch Nukleinsäuren, die Polypeptide gemäß der Erfindung kodieren und Polypeptide, die durch Exprimieren einer solcher Nukleinsäure in einer rekombinanten Wirtszelle und Bedingungen, die die Expression des Polypeptids zulassen, hergestellt werden.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der Tek Antagonist ein lösliches Tek-Multimer des Polypeptids der Erfindung, vorzugsweise ein Dimer oder Trimer, und weist am bevorzugtesten ein Fc Polypeptid oder ein Leucin-Zipper auf. Das Tek ist vorzugsweise ein humanes Tek.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Polypeptides der Erfindung oder ein lösliches Tek-Multimer der Erfindung bei der Herstellung eines Medikamentes für die Verwendung beim Inhibieren der Angiogenese in einem Säugetier bereit. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist das Tek ein humanes Tek und das Medikament weist weiters einen pharmazeutisch-akzeptablen Träger auf.
Das Medikament kann bei der Behandlung einer Krankheit oder eines Zustandes verwendet werden, die durch Angiogenese vermittelt sind, vorzugsweise eines festen Tumors oder einer Krankheit oder eines Zustandes, die durch eine okulare Neovaskularisierung gekennzeichnet sind.
In einigen Ausführungsformen weist das Medikament weiters einen zweiten chemotherapeutischen Wirkstoff auf oder ist für die Verwendung in Zusammenhang mit Bestrahlung nützlich. Der zweite chemotherapeutische Wirkstoff kann aus der Gruppe bestehend aus alkylierenden Mitteln, Antimetaboliten, Vinca-Alkaloide und anderen von Pflanzen-abgeleiteten Chemotherapeutika, Nitrosoharnstoffe, Antitumor-Antibiotika, Antitumor-Enzyme, Topoisomerase Inhibitoren, Platin-Analoga, Adrenocorticales Suppressiva, Hormone, Hormonagonisten, Hormonantagonisten, Antikörper, Immuntherapeutika, Blutzellenfaktoren, Radiotherapeutika, und biologische Reaktionmodifikatoren ausgewählt sein, und werden bevorzugter aus der Gruppe bestehend aus Cisplatin, Cyclophosphamid, Mechloretamin, Melphalan, Bleomycin, Carboplatin, Fluoruracil, 5-Fluordeoxyuridin, Methotrexat, Taxol, Asparaginase, Vincristin, und Vinblastin, Lymphokine und Cytokine wie z.B. Interleukine, Interferone (einschließlich alpha, beta, oder delta), und TNF, Chlorambucil, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Semustin, Streptozocin, Dacarbazin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Vindesin, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin, Mitomycin, L-Asparaginase, Hydroxyharnstoff, Methylhydrazine, Mitotan, Tamoxifen und Fluoxymesteron, Flt3 Ligand, CD40 Ligand, Interleukin-2, Interleukin-12, 4-1BB Ligand, Anti-4-1BB Antikörper, TNF Antagonisten und TNF Rezeptor Antagonisten, TRAIL, CD148 Agonisten, VEGF Antagonisten, und VEGF Rezeptor Antagonisten ausgewählt.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch die Bezugnahme zu den folgenden Zeichnungen und detaillierten Beschreibung klar.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Inhibierung der Endothelzell-Migration durch Tek472/Fc in einer Wundabschluss-Untersuchung.
2 zeigt die Inhibierung der Angiogenese durch Tek472/Fc in einer kornealen Taschen-Untersuchung.
3 zeigt das Tumorwachstum nach der Behandlung mit Tek472/Fc, Flt3L und Kombinationen von Tek472/Fc und Flt3L in Mäusen mit 87 Fibrosarcom-Tumoren.
4 zeigt das Tumorwachstum nach der Behandlung mit Tek472/Fc, Flt3L, und Kombinationen von Tek472/Fc und Flt3L in Mäusen mit B10.2 Fibrosarcom-Tumoren.
5 zeigt die Bindung von Tek472/Fc und Tek745/Fc an humanes Angiopietin-2.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf Tek-Antagonisten und auf die Verwendung von Tek-Antagonisten gerichtet, um die Angiogenese oder andere Tek-vermittelte Reaktionen in einem Säugetier zu inhibieren. Tek-Antagonisten sind Verbindungen oder Zusammensetzungen, die mit einer oder mehreren biologischen Aktivitäten von Tek, einschließlich der Ligandenbindung und Signalübertragung interferieren, und können als Verwendung von Verfahren, wie jene die unten beispielhaft erläutert sind, charakterisiert werden. Tek Antagonisten beinhalten Fragemente der Tek extrazellulären Domäne und lösliche Tek-Multimere. Die molekulare Klonierung einer cDNA, die das humane Tek (ork, Tie2) kodiert, ist in U.S. Patent Nr. 58.447.860 beschrieben.
A. Abkürzungen und Terminologie, die in der Spezifikation verwendet werden
„4-1BB" und „4-1BB Ligand" (4-1BB-L) sind Polypeptide, die unter anderem, in der U.S. Patent Nr. 5.674.704 beschrieben sind, einschließlich löslicher Formen davon.
„bFGF" ist der basische Fibroblast-Wachstumsfaktor.
„BSA" ist bovines Serumalbumin
„CD40 Ligand" (CD40L) ist ein Polypeptid, welches unter anderem in U.S. Patent Nr. 5.716.805 beschrieben wurden, einschließlich löslicher Formen davon.
„CHO" ist die chinesische Hamster-Ovariumzelllinie.
„DMEM" ist Dulbecco's Modified Eagle Medium, ein kommerziell-erhältliches Zellkutur-Medium.
„ELISA" ist eine enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung.
„Flt3L" ist ein Flt3 Ligand, ein Polypeptid, welches unter anderem in U.S. Patent Nr. 5.554.512 beschrieben wurde, einschließlich löslicher Formen davon.
„HMVEC-d" sind primäre dermale humane mikrovaskuläre Endothelzellen.
„HRMEC" sind primäre humane renale mikrovaskuläre Endothelzellen.
„HUVEC" ist eine Linie der humanen Nabelvenen-Endothelzellen.
„mAb" ist ein monoklonaler Antikörper.
„MSA" ist Maus-Serumalbumin.
„PBS" ist Phosphat-gepuffete Salzlösung.
„PE" ist Phycoerythrin.
„PMA" ist Phorbol-12-Myristat-13-acetat.
„RTKs" sind Rezeptor-Tyrosinkinasen.
„TNF" ist ein Tumornekrosefaktor. „TNFR/Fc" ist ein TNF-Rezeptor-Fc-Fusionspolypeptid.
„TRAIL" ist ein TNF-verwandter, Apoptose-induzierender Ligand, ein Typ II Transmembran-Polypeptid in der TNF Familie, das unter anderem, in U.S. Patent Nr. 5.763.223 beschrieben ist, einschließlich löslicher Formen davon.
„VEGF" ist der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor.
B. Lösliche Tek Polypeptide
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein lösliches Tek Polypeptid als ein Tek Antagonist verwendet, um die Angiogenese oder um die Bindung eines Tek-Liganden an Tek zu inhibieren.
Lösliche Polypeptide sind in der Lage von den Zellen, in welchen sie exprimiert werden, sezerniert zu werden. Die Verwendung löslicher Polypeptid-Formen ist für bestimmte Anwendungen vorteilhaft. Die Reinigung der Polypeptide von den rekombinanten Wirtszellen wird erleichtert, da die Polypeptide sezerniert werden, und lösliche Proteine sind im Allgemeinen für die parenterale Verabreichung geeignet. Ein sezerniertes lösliches Polypeptid kann identifiziert werden (und von seinen nicht-löslichen Membran-gebundenen Gegenstücken unterschieden werden) indem intakte Zellen, welche das gewünschte Polypeptid exprimieren, vom Kulturmedium getrennt werden, z.B. durch Zentrifugation, und das Medium (Überstand) auf das Vorhandensein des gewünschten Polypeptids untersucht wird. Das Vorhandensein des gewünschten Polypeptids im Medium weist darauf hin, dass das Polypeptid von den Zellen sezerniert wurde und somit eine lösliche Form des Polypeptids ist. Lösliche Polypeptide können durch eine Vielzahl von herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Eine DNA Sequenz, die ein gewünschtes lösliches Polypeptid kodiert, kann in einen Expressionsvektor für die Herstellung des Polypeptids subkloniert werden, oder das gewünschte kodierende DNA Fragment kann chemisch synthetisiert werden.
Lösliche Tek-Polypeptide weisen die gesamte oder Teile der Tek-extrazellulären Domäne auf, aber es fehlt ihnen im Allgemeinen die Transmembrandomäne, die die Rückhaltung des Polypeptids an der Zelloberfläche verursachen würde. Lösliche Polypeptide können Teile der Transmembrandomäne oder die gesamte oder Teile der cytoplasmatischen Domäne aufweisen, solange das Polypeptid von der Zelle, in welcher es hergestellt wird, sezerniert wird. Lösliche Tek Polypeptide weisen vorteilhafterweise ein natives oder heterologes Signalpeptid auf, wenn es anfänglich synthetisiert wird, um die Sekretion aus den Zellen zu fördern, allerdings wird die Signalsequenz bei der Sekretion abgespalten. Der Begriff „Tek extrazelluläre Domäne" ist beabsichtigt, die gesamte oder Teile der nativen Tek extrazellulären Domäne aufzuweisen, sowie verwandte Formen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: (a) Fragmente, (b) Varianten, (c) Derivate, und (d) Fusionspeptide. Die Fähigkeit dieser verwandten Formen die Angiogenese oder andere Tek-vermittelte Reaktionen zu inhibieren, kann in vitro oder in vivo unter Verwendung von Verfahren, wie jenen die unten beispielhaft erläutert sind, oder unter Verwendung anderer im Stand der Technik bekannter Untersuchungen bestimmt werden.
Beispiele von löslichen Tek-Polypeptiden sind in den Beispielen unten gegeben. Wie in den Beispielen beschrieben ist, entdeckten die Erfinder unerwarteterweise, dass bestimmte Fragmente der Tek-extrazellulären Domäne Tek-Liganden besser binden, als die Tek-extrazelluläre Domäne mit voller Länge, und dass diese Fragemente deshalb als Antagonisten verwendet werden können, um die Bindung von Tek-Liganden an Tek zu blockieren (zum Beispiel, das auf der Zelloberfläche gefundene Tek), und dass Antikörper zu diesen Fragmenten ebenfalls als Antagonisten verwendet werden können, um die Bindung von Tek-Liganden an Tek zu blockieren. Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird zur Inhibierung der Angiogenese oder anderer Tek-vermittelter Reaktionen eine multimere Form eines löslichen Tek Polypeptids („lösliches Tek-Multimer") als Antagonist verwendet, um die Bindung von Tek-Liganden an Tek zu inhibieren.
C. Lösliche Tek-Multimere
Lösliche Tek-Multimere sind kovalent-verbundene oder nicht-kovalent-verbundene Multimere, einschließlich Dimere, Trimere, oder höhere Multimere. Multimere können durch Disulfidbindungen zwischen Cystein-Resten auf unterschiedlichen löslichen Tek-Polypeptiden verbunden sein. Eine Ausführungsform der Erfindung ist auf Multimere gerichtet, die mehrere lösliche Tek-Polypeptide, die über kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen Peptidanteilen verbunden sind, die mit den löslichen Tek-Polypeptiden fusioniert sind, aufweisen. Solche Peptide können Peptidlinker (Spacers), oder Peptide sein, die die Eigenschaft aufweisen, die Multimerisation zu fördern. Leucin-Zipper und bestimmte Polypeptide, die von Antikörpern abgeleitet sind, sind unter den Peptiden, die die Multimerisation von daran angelagerten löslichen Tek-Polypeptiden fördern, wie unten detaillierter beschrieben ist. In besonderen Ausführungsformen weisen die Multimere von zwei bis vier lösliche Tek-Polypeptide auf.
Bei einigen Ausführungsformen wird das lösliche Tek Multimer unter Verwendung von Polypeptiden hergestellt, die von Immunglobulinen abgeleitet sind. Die Herstellung von Fusionsproteinen, die bestimmte mit verschiedenen Abschnitten von Antikörper-abgeleiteten Polypeptiden (einschließlich der Fc-Domäne) fusionierte heterologe Polypeptide aufweisen, wurde, z.B. von Ashkenazi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535, 1991); Byrn et al. (Nature 344: 677, 1990); und Hollenbaugh and Aruffo („Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins" in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, Seiten 10.19.1–10.19.11, 1992) beschrieben.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf ein Tek/Fc-Dimer gerichtet, welches zwei Fusionsproteine aufweist, welche durch Fusionieren von löslichem Tek mit einem Fc-Polypeptid erzeugt wurden. Eine Genfusion, die das Tek/Fc Fusionsprotein kodiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt. Tek/Fc-Fusionsproteine werden in einer Wirtszelle exprimiert, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor transformiert ist, und ähnlich wie Antikörper-Moleküle zusammenlagern gelassen, worauf sich zwischen den Fc-Resten Interketten-Disulfid-Bindungen bilden, um divalentes lösliches Tek zu ergeben. Der Begriff „Fc-Polypeptid" wie er hierin verwendet wird, umfasst native und Mutein-Formen von Polypeptiden, die von der Fc-Region eines Antikörpers abgeleitet sind. Verkürzte Formen von solchen Polypeptiden, die die Dimerisation fördernde Hinge-Region enthalten, sind auch eingeschlossen.
Ein geeignetes Fc-Polypeptid, beschrieben in PCT-Anmeldung WO 93/10151, ist ein einkettiges Polypeptid, das sich von der N-terminalen Hinge-Region bis zu dem nativen C-Terminus der Fc Region eines menschlichen IgG1-Antikörpers erstreckt. Ein anderes nützliches Fc-Polypeptid ist das im U.S. Patent 5.457.035 und von Baum et al., EMBO J. 13: 3992, 1994 beschriebene Fc-Mutein. Die Aminosäure-Sequenz dieses Muteins ist mit der in WO 93/10151 dargelegten nativen Fc-Sequenz identisch, außer das die Aminosäure 19 von Leu zu Ala, die Aminosäure 20 von Leu zu Glu, und die Aminosäure 22 von Gly zu Ala verändert wurden. Das Mutein zeigte eine reduzierte Affinität für Fc-Rezeptoren. Fc-Reste aufweisende Fusions-Polypeptide und davon gebildete Multimere bieten einen Vorteil einer leichten Reinigung mittels Affinitätschromatographie gegenüber Protein A oder Protein G-Säulen, und Fc-Fusions-Polypeptide können in vivo eine längere Halbwertszeit bereitstellen, welche bei therapeutischen Anwendungen von Nutzen ist, als unveränderte Polypeptide.
Bei anderen Ausführungsformen kann das lösliche Tek-Polypeptid durch den variablen Abschnitt einer schweren oder leichten Kette eines Antikörpers substituiert werden. Wenn Fusionsproteine mit sowohl schweren als auch leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich ein lösliches Multimer mit bis zu vier löslichen Tek-Polypeptiden zu bilden.
Alternativ ist das lösliche Tek-Multimer ein Fusionsprotein, das mehrere lösliche Tek-Polypeptide aufweist, mit oder ohne Peptidlinker (Spacers), oder Peptide, die die Eigenschaft haben, die Multimerisation zu fördern. Unter den geeigneten Peptidlinkern sind jene, die in U.S. Patenten 4.751.180, 4.935.233, und 5.073.627 beschrieben sind. Eine DNA Sequenz, die den gewünschten Polylinker kodiert, kann zwischen und in denselben Leserahmen, wie die DNA-Sequenzen, die Tek kodieren, unter Verwendung von herkömmlichen, im Stand der Technik bekannter Verfahren eingefügt werden. Zum Beispiel kann ein chemisch-synthetisiertes Oligonukleotid, dass den Linker kodiert, zwischen die Sequenzen, die lösliches Tek kodieren, ligiert werden. In besonderen Ausführungsformen weist ein Fusionsprotein zwei bis vier lösliche Tek-Polypeptide, die durch Peptidlinkers getrennt sind, auf.
Ein anderes Verfahren zum Herstellen löslicher Tek-Multimere beinhaltet die Verwendung einer Leucin-Zipper-Domäne. Leucin-Zipper-Domänen sind Peptide, die die Multimerisation der Proteine, in welchen sie gefunden werden, fördern. Leucin-Zippers wurden ursprünglich in mehreren DNA-Bindungsproteinen identifiziert (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988), und wurden seit dann in einer Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen gefunden. Zu den bekannten Leucin-Zippern zählen natürlich vorkommende Peptide und Derivate davon, die dimerisieren oder trimerisieren. Beispiele von Leucin-Zipper-Domänen, die für das Herstellen von löslichen multimeren Proteinen geeignet sind, sind in der PCT-Anmeldung WO 94/10308 beschrieben, und der in Hoppe et al. FEBS Lett. 344: 191, 1994 beschriebene Leucin-Zipper, der vom Lungen-Surfactant-Protein D (SPD) abgeleitet ist. Die Verwendung eines modifizierten Leucin-Zippers, der die stabile Trimerisation eines daran fusionierten heterologen Proteins ermöglicht, ist in Fanslow et al., Semin. Immunol. 6: 267, 1994 beschrieben. Rekombinante Fusionsproteine, die ein mit einem Leucin-Zipper Peptid fusioniertes lösliches Tek-Polypeptid aufweisen, werden in geeigneten Wirtszellen exprimiert, und das sich bildende lösliche Tek Multimer wird aus dem Kulturüberstand gewonnen.
Für einige Anwendungen wird angenommen, dass die löslichen Tek-Multimere der vorliegenden Erfindung bestimmte Vorteile gegenüber der Verwendung von monomeren Formen bieten, einschließlich des Vorteils des Nachahmens der natürlichen Interaktion zwischen einem Ligand und einer Rezeptor Tyrosinkinase (RTK). Im Allgemeinen wird ein Dimer-Ligand RTK binden und die Dimerisation von RTK hervorrufen (van der Geer et al., Ann. Rev. Cell. Biol. 10: 251, 1994). Diese Hochaffinitätsbindung bewirkt die Transphosphorylierung der RTK und den Beginn des Signalübertragungsprozesses. Die Bindung eines löslichen Tek-Multimers kann bei einer höheren Affinität als mit einem löslichen Tek-Monomer auftretten. Fc-Fusionspolypeptide bieten insofern einen zusätzlichen Vorteil, da diese Form üblicherweise eine erhöhte in vivo Halbwertszeit im Vergleich zu einem unveränderten Polypeptid zeigt.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von verschiedenen Formen von löslichen Tek-Multimeren, welche die Fähigkeit die Angiogenese oder andere Tek-vermittelte Reaktionen zu inihibieren, beibehalten. Der Begriff „lösliches Tek-Multimer" ist vorgesehen Multimere, die die gesamte oder Teile der nativen Tek-extrazellulären Domäne enthalten, sowie verwandte Formen zu umfassen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der Multimere von (a) Fragmenten, (b) Varianten, (c) Derivaten, und (d) Fusionspolypeptiden von löslichem Tek. Die Fähigkeit von diesen verwandten Formen, die Angiogenese oder andere Tek-vermittelte Reaktionen zu inhibieren, kann in vitro oder in vivo unter Verwendung von Verfahren, wie jene die in den Beispielen erläutert sind oder unter Verwendung von anderen im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden.
Zu den löslichen Tek-Polypeptiden und löslichen Tek-Multimeren, die beim Ausführen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, zählen Tek-Varianten, die die Fähigkeit beibehalten, den Ligand zu binden, und/oder die Angiogenese oder andere Tek-vermittelte Reaktionen zu inhibieren. Solche Tek-Varianten beinhalten Polypeptide, die im Wesentlichen homolog zu nativem Tek sind, die jedoch eine Aminosäure-Sequenz aufweisen, die aufgrund von einer oder mehreren Deletionen, Insertionen oder Substitutionen zu nativem Tek unterschiedlich ist. Besondere Ausführungsformen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Tek-Polypeptide, die von einer bis zehn Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Amionsäureresten im Vergleich zu einer nativen Tek-Sequenz aufweisen. Als Varianten eingeschlossen sind jene Varianten, die natürlich vorkommen, wie allelische Formen und alternativ gespleißte Formen, sowie Varianten, die durch Modifizieren der Aminosäure-Sequenz eines Tek-Polypeptids oder einer Nukleotidsequenz einer ein Tek-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure erzeugt wurden.
Im Allgemeinen sollten die Substitutionen für eine oder mehrere in dem nativen Polypeptid-vorkommenden Aminosäuren konserviert gemacht werden. Beispiele für konservierte Substitutionen beinhalten Substitutionen von Aminosäuren außerhalb der aktiven Domäne(n), und Substitutionen von Aminosäuren, die die Sekundär und/oder Tertiärstruktur von Tek nicht ändern. Zusätzliche Beispiele beinhalten das Substituieren eines aliphatischen Restes mit einem anderen, wie etwa Ile, Val, Leu, oder Ala, für einander, oder Substitutionen eines polaren Restes für einen anderen, wie zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asp, oder Substitutionen eines aromatischen Restes für einen anderen, wie Phe, Trp, oder Tyr für einander. Andere solche konservative Substitutionen, zum Beispiel, Substitutionen von ganzen Regionen mit ähnlichen Hydrophobizitätseigenschaften sind im Stand der Technik bekannt.
Die native Sequenz der Tek extrazellulären Domäne mit voller Länge ist als Reste 23–745 der SEQ ID Nr. 1 dargelegt. Die prozentuelle Identität kann sowohl im Fall der Polypeptide als auch der Nukleinsäuren durch eine visuelle Untersuchung bestimmt werden. Die prozentuelle Identität kann auch durch das Ausrichtungsverfahren von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970) bestimmt werden, wie von Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981) besprochen. Vorzugsweise wird die prozentuelle Identität mittels eines Computer-Programms, wie zum Beispiel, das GAP Computer-Programm Version 10.x, welches von der Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI, siehe auch Devereux et al., Nucl. Acids, Res. 12: 387, 1984) erhältlich ist, bestimmt. Die bevorzugten voreingestellten Parameter für das GAP-Programm beinhalten: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (enthält einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten) für Nukleotide, und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, wie von Schwartz and Dayhoff, Hrsg. Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, S. 353–358. 1979 für Aminosäuren beschrieben wurde: (2) 30 Strafpunkte (Aminosäuren) oder 50 Strafpunkte (Nukleotide) für jeden Spalt und zusätzlich 1 (Aminosäure) oder 3 (Nukleotide) Strafpunkte für jedes Symbol in jedem Spalt; (3) keine Strafpunkte für Endspalten; und (4) keine Maximalstrafpunkte für lange Spalten. Andere Programme, die von Fachleuten auf dem Gebiet des Sequenzvergleichs verwendet werden, können auch verwendet werden. Für Tek-Fragmente wird die prozentuelle Identität basierend auf dem Tek-Abschnitt berechnet, der im Fragment vorhanden ist.
Die vorliegende Erfindung weist weiters die Verwendung von löslichen Tek-Polypeptiden, mit oder ohne assoziierter Glycosylierung nativen Musters auf. In Hefe- oder Säugetier-Expressionssystemen (z.B., COS-1 oder COS-7 Zellen) exprimiertes Tek kann in Abhängigkeit von der Wahl des Expressionssystems ähnlich zu oder signifikant unterschiedlich von einem nativen Tek Polypeptid hinsichtlich Molekulargewicht und Glycosylierungsmuster sein. Die Expression von Tek-Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen, wie E. coli, stellt nicht glycosylierte Moleküle bereit. Unterschiedliche Wirtszellen können die Polypeptide unterschiedlich behandeln, was zu einer heterologen Mischungen von Polypeptiden mit unterschiedlichen N- oder C-Termini führt.
Die primäre Aminosäurestruktur von löslichen Tek-Polypeptiden kann modifiziert werden, um Derivate durch Bilden von kovalenten oder aggregativen Konjugaten mit anderen chemischen Resten, wie eine Glycosyl-Gruppe, Lipiden, Phosphat, Acetyl-Gruppen und dergleichen, zu erzeugen. Kovalente Derivate von Tek können durch Binden von bestimmten funktionellen Gruppen an Tek Aminosäuren-Seitenketten oder an den N-Terminus oder C-Terminus eines tek-Poypeptids hergestellt werden.
Fusions-Polypeptide von löslichem Tek, die zum Ausführen der Erfindung nützlich sind, beinhalten auch kovalente oder aggregative Konjugate eines Tek-Polypeptids mit anderen Polypeptiden, die hinzugefügt werden, um neuartige polyfunktionale Einheiten bereitzustellen.
D. Rekombinante Herstellung eines Tek Polypeptids.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Tek Polypeptide, einschließlich löslicher Tek Polypeptide, Fragmente, und Fusions-Polypeptide, können unter Verwendung eines rekombinanten Expressionssystems hergestellt werden. Mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der das Tek-Polypeptid kodiert, transformierte Wirtszellen („rekombinante Wirtszellen") werden unter Bedingungen kultiviert, die die Expression von Tek fördern und das Tek wird gewonnen. Die Tek Polypeptide können auch in transgenen Pflanzen oder Tieren oder durch chemische Synthese hergestellt werden.
Die Erfindung beinhaltet Nukleinsäure-Moleküle, die die Tek-Polypeptide kodieren, die in der Erfindung verwendet werden, einschließlich Nukleinsäuren, die die Reste 23–472 der SEQ ID Nr. 2 kodieren. Die Nukleinsäure kann weiters eine Signalpeptid-Sequenz kodieren und kann die SEQ ID Nr. 2 kodieren.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann es eine beträchtliche Variation in den Nukleotidsequenzen, die dieselbe Aminosäure-Sequenz kodieren, geben. Ebenfalls offenbart sind Nukleinsäure-Sequenzen, die in der Lage sind, unter mäßig stringenten Bedingungen (z.B. Vorwaschlösung von 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von 50°C, 5 × SSC, über Nacht) mit Tek-kodierenden DNA Sequenzen zu hybridisieren. Der Fachmann kann zusätzliche Kombinationen von Salz und Temperatur bestimmen, die eine mäßige Hybridisierungsstingenzität darstellen (siehe auch Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982; und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1989 und spätere Versionen). Höhere Stringenzbedingungen beinhalten höhere Temperaturen für die Hybridisierung und Waschungen nach der Hybridisierung und/oder niedere Salzkonzentrationen. Die prozentuelle Identität von Nukleinsäuren kann unter Verwendung der oben für die Polypeptide beschriebenen Verfahren bestimmt werden, d.h. durch Verfahren einschließlich der visuellen Untersuchung und der Verwendung von Computer-Programmen wie GAP.
Jedes geeignete Expressionssystem kann für die Herstellung von rekombinanten Tek verwendet werden. Rekombinante Expressionsvektoren beinhalten DNA, die ein Tek Polypeptid kodieren, welches wirkend mit geeigneten transkriptionalen und translatorischen regulatorischen Nukleotid-Sequenzen, wie jene die von Säugetier-, mikrobiellen, viralen, oder Insektengene abgeleitet sind, verbunden ist. Nukleotidsequenzen sind wirkend verbunden, wenn sich die regulatorische Sequenz funktionell auf die Tek DNA Sequenz bezieht. Folglich ist eine Promotor Nukleotidsequenz wirkend mit einer Tek DNA Sequenz verbunden, wenn die Promotor Nukleotidsequenz die Transkription der Tek DNA-Sequenz steuert. Beispiele von regulatorischen Sequenzen beinhalten Transkriptionspromotoren, -operatoren, oder -enhancer, eine mRNA ribosomale Bindungsstelle, und entsprechende Sequenzen, die die Transkription und Translation-Initiation und Termination steuern. Eine Sequenz, die ein entsprechendes Signalpeptid (nativ oder heterolog) kodiert, kann in Expressionsvektoren eingefügt werden. Eine DNA Sequenz für ein Signalpeptid (wird mit einer Vielzahl von Namen, einschließlich sekretorisches Signalpeptid, Leitpeptid, oder Leitsequenz bezeichnet) kann innerhalb des Rahmens mit der Tek-Sequenz fusioniert werden, so dass das Tek-Polypeptid anfänglich als Fusionsprotein translatiert wird, welches das Signalpeptid aufweist. Ein Signalpeptid, welches in den geplanten Wirtszellen funktional ist, fördert die extrazelluläre Sekretion des Tek-Polypeptids. Das Signalpeptid wird von dem Tek-Polypeptid bei der Sekretion von Tek aus der Zelle abgespalten.
Zu geeigneten Wirtszellen für die Expresseion von Tek-Polypeptiden zählen Prokaryoten, Hefe und höhere eukaryotische Zellen, einschließlich Insekten- und Säugetierzellen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit Bakterien-, Pilz-, Hefe-, Insekten-, und Säugtierzellwirten sind zum Beispiel in Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985, beschrieben.
Zu Prokaryoten zählen Gram-negative und Gram-positive Organismen, wie zum Beispiel, E. coli oder Bacilli. Zu geeigneten prokaryotischen Wirtszellen für die Transformation zählen zum Beispiel, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces, und Staphylococcus. In einer prokaryotischen Wirtszelle, wie E. coli, können Tek-Polypeptide einen N-terminalen Methionin-Rest aufweisen, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu erleichtern. Das N-terminale Met kann von dem exprimierten rekombinanten Polypeptid abgespalten werden.
Expressionsvektoren für die Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen weisen im Allgemeinen einen oder mehrere phenotypisch-selektionierbare(s) Markergene auf. Ein phenotypisch-selektierbares Markergens ist zum Beispiel ein Gen, welches ein Protein kodiert, das eine Antibiotika-Resistenz verleiht oder das ein autotrophe Erfordernis bereitstellt. Beispiele von nützlichen Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen beinhalten jene, die von kommerziell erhältlichen Plasmiden wie der Klonierungsvektotr pBR322 (ATCC 37017) abgeleitet sind. pBR322 enthält Gene für die Ampicillin und Tetracyclin Resistenz und stellt somit einfache Mittel für das Identifizieren von transformierten Zellen bereit. Ein geeigneter Promotor und eine Tek DNA Sequenz werden in den pBR322 Vektor eingeführt. Zu anderen kommerziell erhältlichen Vektoren zählen, zum Beispiel, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Für die rekombinanten prokaryotischen Wirtszell-Expressionsvektoren verwendete Promotor-Sequenzen beinhalten β-Lactamase (Penicillinase), Lactose Promotor-System (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), Tryptophan (trp) Promotor-System (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; EP-A-36776) und tac Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 412, 1982). Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtszell-Expressionssystem verwendet einen Phagen λ P_L-Promotor und eine cI857ts thermolabile Repressor-Sequenz. Zu den Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, welche Derivate des λ P_L-Promotors eingebaut haben, zählen Plasmid pHUB2 (in E. coli Stamm JMB9, ATCC 37092 resident) und pPLC28 (in E. coli RR1, ATCC 53082 resident).
Tek Polypeptide können auch in Hefe-Wirtszellen exprimiert werden, vorzugsweise der Gattung Saccharomyces (z.B., S. cerevisiae). Andere Hefe-Gattungen, wie Pichia oder Kluyveromyces, können auch verwendet werden. Hefe-Vektoren enthalten oft eine Replikationsursprungssequenz des 2 μ Hefeplasmids, eine autonom-replizierende Sequenz (ARS), eine Promotor-Region, Polyadenylierungssequenzen, Transkriptionsterminationssequenzen, und ein selektierbares Markergen. Zu geeigneten Promotor-Sequenzen für Hefevektoren zählen unter anderem die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978) wie Enolase, Glyceraldahyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phospho-Glucose-Isomerase, und Glucokinase. Andere geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung in der Hefe-Expression sind weiters in Hitzeman, EPA-73.657 beschrieben. Eine andere Alternative ist der Glucose-reprimierbare ADH2-Promotor, der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300: 724, 1982) beschrieben wurde. In sowohl Hefe als auch E. coli replizierbare Shuttle-Vektoren können durch Einfügen von DNA Sequenzen aus pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Amp^r-Gen und Replikationsursprung) in den obenbeschriebenen Hefe-Vektor, konstruiert werden.
Die Hefe α-Faktor Leitsequenz kann für die direkte Sekretion von rekombinanten Polypeptiden verwendet werden. Die α-Faktor Leitsequenz wird oft zwischen die Promotorsequenz und die Strukturgensequenz eingefügt. Siehe z.B., Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. Andere Leitsequenzen, die für das Erleichtern der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefewirten geeignet sind, sind den Fachleuten bekannt. Eine Leitsequenz kann in der Nähe ihrem 3' Ende modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies wird die Fusion der Leitsequenz mit dem Strukturgen erleichtern.
Hefe-Transformationsprotokolle sind den Fachleuten bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978 beschrieben. Das Hinnen et al. Protokoll selektiert für Trp+ Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefe-Stickstoffbase, 0,5% Casamino Säuren, 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die mit Vektoren transformiert sind, die eine ADH2-Promotor-Sequenz enthalten, können für die Expressionsinduktion in einem „reichen" Medium gezüchtet werden. Ein Beispiel für ein reiches Medium ist eines, welches aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, und 1% Glucose, ergänzt mit 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil besteht. Die Aushebung der Unterdrückung des ADH2-Promotors tritt ein, wenn die Glucose im Medium erschöpft ist.
Insekten-Wirtszellen-Kultursysteme können auch verwendet werden, um rekombinante Tek-Polypeptide zu exprimieren, einschließlich löslicher Tek Polypeptide. Bacculovirus-Systeme für die Herstellung von heterologen Polypeptiden in Insektenzellen werden von Luckow and Sommers. Bio/Technology 6: 47, 1988 beschrieben.
Säugetierzellen sind besonders für die Verwendung als Wirtszellen bevorzugt. Zu Beispielen von geeigneten Säugetier-Wirtszelllinien zählen die COS-7 Linie von Affennieren-Zellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), L-Zellen, C 127 Zellen, 3T3 Zellen (ATCC CCL 163), chinesische Hamsterovarium-Zellen (CHO), HeLa Zellen, und BHK (ATCC CRL 10) Zelllinien, und die CV1/EBNA Zelllinie, die von der aus Nierenzellen der Afrikanischen Meerkatzen gewonnenen CV1 (ATCC CCL 70) abgeleitet ist, wie von Mc Mahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben ist. Für die Herstellung von therapeutischen Polypeptiden ist es besonders vorteilhaft eine Säugetier-Wirtszelllinie zu verwenden, die so angepasst wurde, dass sie in einem Medium wachsen kann, das keine tierischen Proteine enthält.
Etablierte Verfahren, um DNA in Säugetierzellen einzuführen wurden beschrieben (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, Seiten 15–69). Zusätzliche Protokolle unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Reagenzien, wie etwa Lipofectamin (Gibco/BRL) oder Lipofectamin-Plus, können verwendet werden, um Zellen zu transfizieren (Felger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413, 1987). Zusätzlich kann die Elektroporation verwendet werden, um Säugetierzellen unter Verwendung konventioneller Verfahren zu transfizieren, wie jene in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Band 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Die Selektion von stabilen Transformanten kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren durchgeführt worden, wie zum Beispiel, Resistenz gegen zytotoxische Arzneimitteln. Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185: 487, 1990, beschreiben mehrere Selektionsschemata, wie Dihydrofolat-Reductase (DHFR)-Resistenz. Ein geeigneter Wirtsstamm für die DHFR Selektion kann der CHO Stamm DX-B11 sein, welcher DHFR-defizient ist (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216, 1980). Ein Plasmid, das die DHFR cDNA exprimiert, kann in den Stamm DX-B11 eingeführt werden, und nur Zellen, die das Plasmid enthalten, können in den entsprechenden selektiven Medien wachsen. Andere Beispiele von selektierbaren Markern, die in einen Expressionsvektor eingebaut werden können, beinhalten cDNAs, die Antibiotika- Resistenz verleihen, wie G418 und Hygromycin B. Zellen, die den Vektor enthalten, können auf der Basis der Resistenz gegenüber diesen Verbindungen selektiert werden.
Transkriptionale und translatorische Kontrollsequenzen für Säugetier-Wirtszell-Expressionsvektoren können von viralen Genomen herausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotor-Sequenzen und Enhancer-Sequenzen sind von Polyoma-Virus, Adenovirus-2, Simian-Virus 40 (SV40), und humanem Cytomegalievirus abgeleitet. DNA Sequenzen, die vom SV40 viralen Genom abgeleitet sind, wie zum Beispiel, SV40 Ursprung, frühe und späte Promotor, Enhancer, Spleiß, und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression einer Strukturgensequenz in einer Säugetierwirtszelle bereitzustellen. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, da beide leicht aus einem viralen Genom als Fragment erhalten werden können, das ebenfalls den viralen Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978; Kaufman, Meth in Enymology, 1990). Kürzere oder längere SV40 Fragmente können auch verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bp-Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle in Richtung BglI-Stelle erstreckt, die im SV40 viralen Replikationsursprung lokalisiert ist, ist eingeschlossen.
Zusätzliche Kontrollsequenzen, die gezeigt haben, die Expression von heterologen Genen von Säugetier-Expressionsvektoren zu verbessern, beinhalten solche Elemente wie das Expression-Anreicherungs-Sequenz-Element (EASE), welches von CHO-Zellen abgeleitet ist (Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, S. 529–534) und den dreiteiligen Leiter (TPL) und VA Gen RNAs vom Adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257: 13475, 1982). Die internen Ribosomeneintrittsstellen (IRES)-Sequenzen viralen Ursprungs erlauben die effektive Translation von dicistronischer mRNA (Oh and Sarnow, Current Opinion in Genectics and Development 3: 295, 1993; Ramesh et al., Nucleic Acids Research 24: 2697, 1996). Es wurde gezeigt, dass die Expression einer heterologen cDNA als Teil einer dicistronischer mRNA, gefolgt von einem Gen für einen selektierbaren Marker (z.B., DHFR) die Transfizierbarkeit des Wirtes und die Expression der heterologen cDNA verbessert (Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990). Beispielhafte Expressionsvektoren, die dicistronische mRNAs verwenden, sind pTR-DC/GFP, beschrieben von Mosser et al. Biotechniques 22: 150, 1997, und p2A5I, beschrieben von Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, S. 529–534.
Ein nützlicher Hochexpressionsvektor, pCAVNOT, ist von Mosley et al., Cell 59: 335, 1989 beschrieben worden. Andere Expressionsvektoren für Verwendung in Säugetier Wirtszellen können wie von Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) offenbart, konstruiert werden. Ein nützliches System für die stabile Expression auf hohem Niveau von Säugetier cDNAs in C127 murinen Brustepithelzellen können im Wesentlichen wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) beschrieben, konstruiert werden. Ein nützlicher Hochexpressionsvektor, PMLSV N1/N4, von Cosman et al. Nature 312: 768, 1984, beschrieben, wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säugetier-Expressionsvektoren sind im Stand der Technik bekannt.
Hinsichtlich der Signalpeptide, die beim Herstellen von Tek-Polypeptiden verwendet werden können, kann das native Tek-Signalpeptid verwendet werden oder es kann, wenn gewünscht, durch ein heterologes Signalpeptid oder eine Leitsequenz ersetzt werden. Die Wahl des Signalpeptids oder der Leitsequenz hängt von Faktoren wie z.B. der Art der Wirtszellen, in welchen das rekombinante Tek produziert wird, ab. Zu Beispielen von heterologen Singalpeptiden, die in Säugetier-Wirtszellen funktionell sind, zählen die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), beschrieben im U.S. Patent 4.965.195, die Signalsequenz für Interleukin-2-Rezeptor, beschrieben von Cosman et al., Nature 312: 768 (1984); das Interleukin-4 Rezeptor-Siganlpeptid, beschrieben im EP 367.566 ; das Typ I Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid, beschrieben im U.S. Patent 4.968.607; und das Typ II Interleukin-I Rezeptor-Signalpeptid, beschrieben in EP 460.846 .
Unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken, einschließlich Mutagenese und die Polymerase Kettenreaktion (PCR) kann der Fachmann DNA Sequenzen herstellen, die Tek Polypeptide kodieren, die verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäurenreste oder Sequenzen, oder Deletionen von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen, einschließlich Tek-Fragmente, Varianten, Derivate und Fusionspeptide, aufweisen.
Transgene Tiere, einschließlich Mäuse, Ziegen, Schafe, und Schweine, und transgene Pflanzen, einschließlich Tabak, Tomaten, Leguminosen, Gräser, und Getreide, können auch als Bioreaktoren für die Herstellung von Tek-Polypeptiden, einschließlich löslicher Tek-Polypeptide verwendet werden. Im Falle von transgenen Tieren, ist es besonders vorteilhaft, eine chimäre DNA zu konstruieren, die eine Tek Kodiersequenz enthält, die wirkend mit cis-agierenden regulatorischen Sequenzen verbunden ist, die die Expression von löslichem Tek in Milch und/oder anderen Körperflüssigkeiten fördern (siehe, zum Beispiel, U.S. Patent Nr. 5.843.705; U.S. Patent Nr. 5.880.327). Im Falle von transgenen Pflanzen ist es besonders vorteilhaft das Tek in einer besondern Zellart, Gewebe oder Organ zu erzeugen (siehe zum Beispiel, U.S. Patent Nr. 5.639.947; U.S. Patent Nr. 5.889.189).
Der Fachmann wird erkennen, dass die Verfahren zum Reinigen von exprimierten löslichen Tek-Polypeptiden in Abhängigkeit des verwendeten Wirtsystems variieren, und ob das rekominbante Polypeptid sezerniert wird oder nicht, variieren. Lösliche Tek-Polypeptide können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren gereinigt werden, einschließlich eines oder mehrerer Konzentrations-, Aussalzungs-, Ionenaustauschs-, hydrophobe Wechselwirkungs-, Affinitätsreinigungs-, HPLC-, oder Größenausschlußchromatographie-Schritte(s). Fusionspolypeptide, welche Fc-Anteile (und davon gebildete Multimere) aufweisen, bieten den Vorteil, die Reinigung durch Affinitätschromatographie gegenüber Protein A oder Protein G-Säulen zu erleichtern.
E. Tek-Antikörper
Antigene Epitope der Tek extrazellulären Domäne sind für das Züchten von Antikörpern nützlich, und insbesondere der monoklonale Blockierungsantikörper, der unten detaillierter beschrieben ist. Solche Epitope oder Varianten davon können unter Verwendung im Stand der Technik bekannter Verfahren, wie Festphasen-Synthese, chemische oder enzymatische Spaltung von Polypeptiden, oder unter Verwendung rekombinanter DNA Technologie produziert werden. Wie unter erläutert, haben die Erfinder herausgefunden, dass die Tek extrazelluläre Domäne zumindest drei Epitope aufweist, und dass gegen eine deletiere Form der Tek extrazellulären Domäne erzeugte Antikörper, mit Tek Liganden um die Bindung an Tek konkurrieren können.
Zusammensetzungen und Verwendungen von Antikörpern, die mit Tek-Polypeptiden immunreaktiv sind, werden hierin beschrieben. Solche Antikörper „binden spezifisch" an Tek-Polypeptide, was bedeutet, dass sie über Antigen-Bindungsstellen dieser Antikörper binden, im Gegensatz zu nicht spezifischen Bindungsinteraktionen. Die Begriffe „der Antikörper" und „die Antikörper" werden hierin in ihrem weitesten Sinn verwendet, und beinhalten, ohne Einschränkung, intakte monoklonale und polyklonale Antikörper sowie Fragmente wie Fv, Fab, und F(ab')2 Fragmente, einkettige Antikörper wie scFV, und verschiedene Kettenkombinationen. Die Antikörper können humanisiert sein, und können human sein. Die Antikörper können unter Verwendung einer Vielzahl von bekannten Verfahren, einschließlich, ohne Einschränkung, Immunisierung von Tieren mit nativen oder transgenen Immunrepertoires, Phagendisplay, Hybridom- und rekombinante Zellkultur, und transgene Pflanzen- und tierische Bioreaktoren.
Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper können mittels herkömmlicher Techniken hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyse, Kennet et al., (Hrsg.), Plenum Press, New York (1980); und Antikörper: A Laboratory Manual, Harlow and Land (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).
Hybridom-Zelllinien, die gegen die Polypeptide der Erfindung spezifische monoklonale Antikörper erzeugen, werden ebenfalls hierin beschrieben. Solche Hybridome können durch herkömmliche Techniken hergestellt und identifiziert werden. Ein Verfahren zum Herstellen einer solchen Hybridom-Zelllinie weist das Immunisieren eines Tieres mit einem Polypeptid, das Ernten der Milzzellen aus dem immunisierten Tieren, das Fusionieren der besagten Milzzellen mit einer Myelom-Zelllinie, dadurch Erzeugen von Hybridom-Zellen, und das Identifzieren einer Hybridom-Zelllinie auf, die einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der an das Polypeptid bindet. Die durch die Hybridome hergestellten monoklonalen Antikörper können mittels herkömmlicher Techniken gewonnen werden.
Die monoklonalen Antikörper beinhalten chimäre Antikörper, wie z.B., „humanisierte" Versionen von Antikörpern, die ursprünglich in Mäusen oder anderen nicht-humanen Spezien hergestellt wurden. Ein humanisierter Antikörper ist ein biotechnisch-hergestellter Antikörper, der typischerweise die variable Region eines nicht-humanen (z.B murinen) Antikörpers, oder zumindest die komplementäre bestimmende Regionen (CDRs) davon, und die restlichen Immunglobulin-Abschnitte, die von einem humanen Antikörper abgeleitet sind, aufweist. Verfahren für die Herstellung von chimären und weiteren biotechnisch-hergestellten monoklonalen Antikörpern beinhalten jene, die in Richmann et al. (Nature 332: 323, 1988), Liu et al. (PNAS 84: 3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7: 934, 1989) und Winter and Harris (TIPS 14: 139, Mai 1993) beschrieben sind. Solche humanisierte Antikörper können durch bekannte Techniken hergestellt werden und bieten den Vorteil einer reduzierten Immunogenität, wenn die Antikörper einem Menschen verabreicht werden.
Verfahren, die für das Herstellen von humanen Antikörpern in nicht-humanen Tieren entwickelt wurden, können für das Herstellen von Antikörpern verwendet werden. Die Antikörper können teilweise human oder vorzugsweise vollständig human sein. Zum Beispiel können transgene Mäuse verwendet werden, in welche genetisches Material eingeführt wurde, welches eine oder mehrere humane Immunglobulin-Ketten kodiert. Solche Mäuse können in vielfältiger Weise genetisch verändert sein. Die genetische Manipulation kann zu humanen Immunglobulin-Polypeptidketten führen, die in zumindest einigen oder vorzugsweise in fast allen der durch die Tiere nach der Immunisierung produzierten Antikörper, die endogenen Immunglobulinketten ersetzen.
Mäuse, in welchen ein oder mehrere endogene Immunglobulin-Gene mittels verschiedener Mittel inaktiviert wurden, wurden hergestellt. Humane Immunglobulin-Gene wurden in die Mäuse eingeführt, um die inaktivierten Maus-Gene zu ersetzten. In den Tieren erzeugte Antikörper enthalten humane Immunglobulin-Polypeptidketten, die durch das humane genetische Material kodiert werden, welches in das Tier eingeführt wurde. Beispiele von Techniken für die Herstellung und die Verwendung von solche transgenen Tieren, um Antikörper herzustellen (welche manchmal als „transgene Antikörper" bezeichnet werden) sind in U.S. Patent Nrn. 5.814.318, 5.569.825, und 5.545.806 beschrieben.
F. Therapeutische Verfahren
Die offenbarten Polypeptide können verwendet werden, um die Angiogenese oder andere Tek-vermittelte Reaktionen in einem Säugetier zu inhibieren, welche eine solche Behandlung benötigen. Der Begriff „Tek-vermittelte Reaktion" beinhaltet jede zelluläre, physiologische oder andere biologische Reaktion, die zumindest teilweise durch die Bindung eines Tek-Liganden an Tek verursacht wird, oder welche zur Gänze oder teilweise durch Blockieren der Bindung eines Tek-Liganden an Tek inhibiert oder unterdrückt wird. Die Behandlung wird vorteilhafterweise angewendet, um den Ausbruch oder das Wiederauftreten einer Krankheit oder eines Zustandes, welcher durch Angiogenese vermittelt wird, zu verhindern, oder um ein Säugetier, welches eine Krankheit oder einen Zustand aufweist, der durch Angiogenese vermittelt ist, zu behandeln. Zu Krankheiten und Zuständen, die durch Angiogenese vermittelt sind zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, okulare Krankheiten, maligne und metastatische Zustände, und entzündliche Krankheiten.
Unter den okularen Krankheiten, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, befinden sich Augenkrankheiten, die durch eine okulare Neovaskularisation gekennzeichnet sind, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, diabetische Retinopathie (eine Hauptkomplikation von Diabetes), prämature Retinopathie (diese verheerende Augenkrankheit, die häufig zu chronischen Sehproblemen führt und ein hohes Risko trägt, zur Blindheit zu führen, ist eine schwerwiegende Komplikation während der Pflege von prämaturen Kindern), neovaskuläres Glaucoma, Retinoblastom, retrolentale Fibroplasie, Rubeose, Uveitis, Makuladegeneration, und korneale Transplantat-Neovaskularisation. Andere entzündliche Augenkrankeiten, okulare Tumore, und mit choroideale oder Iris-Neovaskularisation-assoziierte Krankheiten können auch gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um maligne und metastatische Zustände, wie feste Tumore zu behandeln. Feste Tumore beinhalten sowohl primäre als auch metastatische Sarkome und Karzinome.
Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls verwendet werden, um entzündliche Krankheiten, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Arthirits, Rheumatismus und Psoriasis.
Andere Krankheiten und Zustände, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen benigne Tumore und präneoplastische Zustände, myokardiale Angiogenese, Blutergelenke, Skleroderm, vaskuläre Adhäsionen, Neovaskularistion atherosklerotischer Plaques, Teleangiektasie, und Wundgranulation ein.
Zusätzlich zu ein Fragment der Tek extrazellulären Domäne aufweisenden Polypeptiden, löslichen Tek-Multimeren und Antikörpern, die an die Tek extrazelluläre Domäne binden, können auch andere Formen von Tek Antagonisten verabreicht werden, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Beispiele von anderen Formen von Tek Antagonisten beinhalten andere Antikörper, wie Antikörper gegen einen Tek-Ligand, Antisense-Nukleinsäuren, Ribozyme, Muteine, Aptamere, und kleine Moleküle, die gegen Tek oder gegen einen oder mehrere Tek-Liganden gerichtet sind.
Die Polypeptide oder Multimere gemäß der vorliegenden Erfindung können auch in in vivo Tiermodellen getestet werden, um die gewünschte prophylaktische oder therapeutische Aktivität zu bestätigen, sowie um die optimale therapeutische Dosis, vor der Verabreicherung an Menschen zu bestimmen.
Die Menge eines bestimmten Tek-Antagonisten, die in einem bestimmten Behandlungsverfahren wirksam sein wird, hängt vom Alter, der Art und Schwere des zu behandelnden Zustandes, dem Körpergewicht, der gewünschte Behandlungsdauer, der Verabreichungsart und von anderen Parametern ab. Wirksame Dosierungen werden durch einen Arzt oder ein anderes qualifiziertes medizinisches Personal bestimmt. Typische effektive Dosierungen sind etwa 0,01 mg/kg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosierung etwa 0,1–50 mg/kg, bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosierung etwa 0,5–10 mg/kg. Die Dosierung für die örtliche Verabreichung ist üblichweise geringer als für die systemische Verabreicherung. Bei einigen Ausführungsformen ist eine Einzelverabreichung ausreichend, bei einigen Ausführungsformen wird der Tek-Antagonist als mehrfache Dosen über einen oder mehrere Tage verabreicht.
Die Tek-Antagonisten werden üblicherweise in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche einen oder mehrere pharmakologisch-akzeptable Träger aufweist, verabreicht. Pharmazeutisch-akzeptable Träger beinhalten Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Adjuvantien, Exzipienten und Vehikel, welche für den Verabreichungsweg pharmazeutisch-akzeptabel sind, und können wässrige oder ölige Suspensionen sein, die unter Verwendung geeigneter Dispergier-, Benetzungs-, und Suspendiermittel formuliert werden.
Pharmazeutisch-akzeptable Träger sind im Allgemeinen sterile und Pyrogen-freie Mittel, und können Wasser, Öle, Lösungsmittel, Salze, Zucker und andere Kohlenhydrate, Emulgatoren, Puffersubstanzen, antimikrobielle Wirkstoffe und Chelatbildner beinhalten. Der bestimmte pharmazeutisch akzeptable Träger und das Verhältnis des Wirkstoffs zu Träger werden durch die Löslichkeit und chemischen Eigenschaften der Zusammensetzung, die Verabreichungsart, und die pharmazeutische Standardpraxis bestimmt.
Die Tek-Antagonisten werden einem Patienten in einer Art und Weise verabreicht, die für die Indikation geeignet ist. Somit kann zum Beispiel ein Tek-Antagonist, oder eine pharmazeutische Zusammensetzung davon, intravenös, transdermal, intradermal, intraperitoneal, intramuskulär, intranasal, epidural, oral, topisch, subkutan, intrakavitär, verzögerte Freisetzung aus Implantaten, auf peristaltischem Werg, oder durch jede andere geeignete Technik verabreicht werden. Die parenterale Verabreichung wird bevorzugt.
Das Säugetier kann mit einem oder mehreren zusätzlichen chemotherapeutischen Wirkstoffen behandelt werden. Die zusätzlichen chemotherapeutischen Wirkstoffe können vor der, gleichzeitig mit, oder nachfolgend an die Verabreicherung des Tek-Antagonisten verabreicht werden. Die Verwendung von mehr als einem chemotherapeutischen Wirkstoff ist besonders vorteilhaft, wenn das zu behandelnde Säugetier einen festen Tumor aufweist. Das Säugetier kann mit Bestrahlung behandelt werden. Bestrahlung, einschließlich Brachytherapie und Teletherapie, kann vor der, gleichzeitig mit, oder nachfolgend an die Verabreicherung des(r) zweiten chemotherapeutischen Wirkstoffs(e) und/oder Tek-Antagonist verabreicht werden.
Wenn das zu behandelnde Säugetier einen festen Tumor aufweist, können zusätzlich zu einem Tek-Antagonist, ein oder mehrere chemotherapeutische Wirkstoffe verabreicht werden, die aus der Gruppe bestehend aus Alkylanzien, Antimetaboliten, Vinca-Alkaloide und anderen von Pflanzen-abgeleiteten Chemotherapeutika, Nitrosoharnstoffe, Antitumor-Antibiotika, Antitumor-Enzyme, Topoisomerase Inhibitoren, Platin-Analoga, Adrenocorticales Suppressiva, Hormone, Hormonagonisten, Hormonantagonisten, Antikörper, Immuntherapeutika, Blutzellenfaktoren, Radiotherapeutika, und biologische Reaktionsmodifikatoren ausgewählt sind.
Zusätzlich zu einem Tek-Antagonist können ein oder mehrere chemotherapeutische Wirkstoffe verabreicht werden, die aus der Gruppe bestehend aus Cisplatin, Cyclophosphamid, Mechloretamin, Melphalan, Bleomycin, Carboplatin, Fluoruracil, 5-Fluordeoxyuridin, Methotrexat, Taxol, Asparaginase, Vincristin, und Vinblastin, Lymphokine und Cytokine wie z.B. Interleukine, Interferone (einschließlich alpha, beta, oder delta), und TNF, Chlorambucil, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Sernustin, Streptozocin, Dacarbazin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Vindesin, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin, Mitomycin, L-Asparaginase, Hydroxyharnstoff Methylhydrazine, Mitotan, Tamoxifen und Fluoxymesteron ausgewählt sind.
Zusätzlich zu einem Tek-Antagonist können ein oder mehrere chemotherapeutische Wirkstoffe, einschließlich verschiedener löslicher Formen davon verabreicht werden, die aus der Gruppe bestehend aus Flt3 Ligand, CD40 Ligand, Interleukin-2, Interleukin-12, 4-1BB Ligand, Anti-4-1BB Antikörper, TNF Antagonisten und TNF Rezeptor Antagonisten, TRAIL, VEGF Antagonisten, und VEGF Rezeptor (einschließlich VEGF-R1 und VEGF-R2, die auch als Flt1 und Flk1 oder KDR bekannt sind)-Antagonisten und CD148 (auch als DEP-1, ECRTP, und PTPRJ bezeichnet, siehe Takahashi et al., J. Am. Soc. Nephrol. 10: 2135–45, 1999) Agonisten, ausgewählt sind.
Die Tek-Antagonisten der Erfindung können als Komponente einer, oder in Kombination mit einer metronomischen Therapie verwendet werden, wie jene von Browder er al. und Klement et al. (Cancer Research 60: 1878, 2000; J. Clin. Invest. 105 (8): R15, 2000; siehe auch Barinaga, Science, 288: 245, 2000)
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können als Behandlung in erster Linie, für die Behandlung einer Rest-Krankheit, im Anschluss and die Primärtherapie, oder als ein Zusatz für andere Therapien, einschließlich Chemotherapie, Chirurgie, Bestrahlung, und andere im Stand der Technik bekannte therapeutische Verfahren, verwendet werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, bestimmte Ausführungsformen zu erläutern, und nicht um den Umfang der Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1
Rekombinante Herstellung von löslichen Tek/Fc Fusionspolypeptiden
Die molekulare Klonierung einer cDNA, die die humane Rezeptor Tyrosinkinase (RTK) Tek (ork, Tie2) kodiert, ist in U.S. Patent Nr. 5.447.860 beschrieben. Die Tek cDNA (hinterlegt bei der American Type Culture Collection unter den vertraglichen Bedingungen des Budapesters Vertrags am 28 Mai 1992, Zugangsnummer ATCC 69003) kodiert 1124 Aminosäuren, einschließlich einem Signalpeptid, einer N-terminalen extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne, und einer C-terminale cytoplasmatische Domäne. Basierend auf der Sequenzanalyse wird vorausgesagt, dass das Signalpeptid die Reste 1–18 umfasst, dass die N-terminale extrazelluläre Domäne die Reste 19–745 umfasst, dass die Transmembrandomäne die Reste 746–772 umfasst, und dass die C-terminale cytoplasmatische Domäne die Reste 773–1124 umfasst. Die extrazelluläre Domäne beinhaltet zwei Immunglobulin (Ig)-artige Schleifen, eine Region, die drei EGF-artige Cystein-Wiederholungen enthält (zwischen den Resten 211–340) und eine Region, die drei Fibronectin-Typ III-(FNIII) Motive (zwischen den Resten 440–733) enthält. Die Tek cDNA wurde verwendet, um rekombinante Expressionsvektoren für die Herstellung von verschiedenen Tek/Fc Fusionspolypeptiden zu konstruieren.
Um eine Nukleinsäure zu konstruieren, die die mit einem Fc fusionierte Tek extrazellulären Domäne mit voller Länge kodiert, wurde eine Nukleinsäure, die die 745 N-terminalen Aminosäuren, einschließlich der Tek-Leitsequenz (Signalpeptid) und der extrazellulären Domäne, kodiert mit einer Nukleinsäure, die einen 232 Aminosäure Fc-Abschnitt des humanen IgG1 kodiert, fusioniert. Die durch dieses Konstrukt kodierte Aminosäure-Sequenz des Tek/Fc-Fusionspolypeptids ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. In SEQ ID Nr. 1 sind die Reste 1–18 das vorhergesagte Signalpeptid (es wird vorhergesagt, dass dieses bei der Sekretion aus der Zelle abgespalten wird, die tatsächliche Spaltungsstelle wurde durch N-terminale Sequenzanalyse bestimmt, siehe unten), die Reste 19–745 sind die Tek extrazelluläre Domäne, und die Reste 746–977 sind der Fc-Abschnitt. Nach Einführung in den Säugetier Expressionsvektor, und Expression in und Sekretion aus der Säugetier-Wirtszelle, erzeugte dieses Konstrukt ein als Tek745/Fc bezeichnetes Polypeptid. Basierend auf der vorhergesagten Signalpeptid-Spaltungsstelle, wurde vorausgesagt, dass die Aminosäure-Sequenz von Tek745/Fc die Reste 19–977 der SEQ ID Nr. 1 sind.
Um eine Nukleinsäure zu konstruieren, die ein Fragment der mit Fc fusionierten Tek extrazellulären Domäne mit voller Länge kodiert, wurde eine Nukleinsäure, die die 472 N-terminalen Aminosäuren von Tek, einschließlich der Tek-Leitsequenz (Signalpeptid) und der extrazellulären Domäne, kodiert mit einer Nukleinsäure, die einen 232 Aminosäure Fc-Abschnitt des humanen IgG1 kodiert, fusioniert. Die durch dieses Konstrukt kodierte Aminosäure-Sequenz des Tek/Fc-Fusionspolypeptids ist in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. In SEQ ID Nr. 2 sind die Reste 1–18 das vorhergesagte Signalpeptid (es wird vorhergesagt, dass dieses bei der Sekretion aus der Zelle abgespalten wird, die tatsächliche Spaltungsstelle wurde durch N-terminale Sequenzanalyse bestimmt, siehe unten), die Reste 19–472 sind die Tek extrazelluläre Domäne, und die Reste 473–704 sind der Fc-Abschnitt. Nach Einführung in den Säugetier Expressionsvektor, und Expression in und Sekretion aus der Säugetier-Wirtszelle, erzeugte dieses Konstrukt ein als Tek472/Fc bezeichnetes Polypeptid. Basierend auf der vorhergesagten Signalpeptid-Spaltungsstelle, wurde vorausgesagt, dass die Aminosäure-Sequenz von Tek472/Fc die Reste 19–704 der SEQ ID Nr. 2 sind.
Nukleinsäuren, die jede der Tek/Fc-Fusionspolypeptide kodiert, wurden in Säugetier-Expressionsvektoren eingefügt, und jeder Vektor wurde in CHO-Zellen transfiziert. Nach der Amplifikation wurden stabil-transfizierte CHO-Zelllinien unter Bedingungen, die die Expression und Sekretion des rekombinanten Fusion-Polypeptids fördern, kultiviert und die Tek/Fc- Fusionspolypeptide wurden gewonnen und aus dem Kulturmedium isoliert. Die N-terminale Sequenzanalyse bestimmte, dass das als Tek745/Fc bezeichnete sezernierte Polypeptid einen N-Terminus aufweist, der dem Rest 23 (Alanin) der SEQ ID Nr. 1 entspricht. N-terminale Sequenzanalyse bestimmte, dass das als Tek472/Fc bezeichnete sezernierte Polypeptid einen N-Terminus aufweist, der dem Rest 23 (Alanin) der SEQ ID Nr. 2 entspricht.
Die anti-angiogene Aktivität der Tek/Fc Fusionspolypeptide wird in den in vitro und in vivo Systemen, die in Beispielen 2–6 beschrieben sind, gezeigt.
Beispiel 2
Aktivität von Tek/Fc in einer Wundabschluss-Untersuchung
Eine planare Endothelzellmigrations (Wundabschluss)-Untersuchung wurde verwendet, um die Inhibierung der Angiogenese durch Tek/Fc in vitro zu quantifizieren. In dieser Untersuchung wird die Endothelzellmigration als die Verschlussrate einer zirkulären Wunde in einer kultivierten Zelleinzelschicht gemessen. Die Wundabschlussrate ist linear, und wird dynamisch durch Substanzen reguliert, die die Angiogenese in vivo stimulieren oder inhibieren.
Primäre humane renale mikrovaskuläre Endothelzellen, HRMEC, wurden isoliert, kultiviert, und nach dem dritten Durchgang nach dem Auftauen verwendet, wie in Martin et al., In Vitro Cell Dev Biol 33: 261, 1997 beschrieben. Wiederholte zirkuläre Läsionen, „Wunden" (600–800 Mikron Durchmesser) wurde in konfluenten HRMEC-Einzelschichten unter Verwendung einer Silikon-bestückten Bohrmaschine erzeugt. Zum Zeitpunkt des Verwundens wurde das Medium (DMEM + 1% BSA) mit 20 ng/ml PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat), 10 μg/ml Tek472/Fc, oder Kombinationen von 20 ng/ml PMA und 0,001–10 μg/ml Tek472/FC ergänzt. Die restliche Wundfläche wurde als eine Funktion der Zeit (0–12 Stunden) unter Verwendung eines Mikroskops und Bildanalysen-Software (Bioquant, Nashville, TN) gemessen. Die relative Migrationsrate wurde für jede Substanz und Substanzkombinationen durch lineare Regression der restlichen Wundfläche, die über die Zeit dargestellt ist, berechnet. Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Tek472/Fc inhibierte die PMA-induzierte endotheliale Migration in einer auf die Dosis reagierenden Art und Weise, wodurch die Migrationsrate zu den unstimulierten Niveaus bei 10 μg/ml zurückging.
Beispiel 3
Aktivität von Tek/Fc in einer Hornhauttaschen-[Corneal-Pocket] Untersuchung
Eine Maus-Corneal-Pocket-Untersuchung wurde verwendet, um die Inhibierung der Angiogenese durch Tek/Fc in vivo zu quantifizieren. Bei dieser Untersuchung werden die auf angiogene oder anti-angiogene Aktivität zu testende Substanzen in einer langsam-freisetztenden Form in einem Hydron-Pellet immobilisiert, die in Mikropockets in dem kornealen Epithelium von betäubten Mäusen implantiert werden. Die Vaskularisation wird als das Erscheinen, die Dichte, und das Ausmaß des Gefäßeinwuchses von dem vaskularisierten kornealen Limbus in die normale avaskuläre Cornea.
Hydronpellets, wie in Kenyon et al., Invest Opthamol. & Visual Science 37: 1625, 1996, beschrieben, enthielten Sucralfat mit bFGF (90 ng/Pellet), bFGF und IgG (11 μg/Pellet, Kontrolle), oder bFGF und Tek472/Fc (12,8 μg). Die Pellets wurden in die kornealen, stromalen Mikropockets, die durch Mikrodisektion 1 mm medial zu dem lateralen kornealen Limbus von 6–8 Wochen alten männlichen C57BL Mäuse chirurgisch implantiert. Nach fünf Tagen, an der Spitze der der neovaskulären Reaktion zu bFGF, wurden die Korneae unter Verwendung einer Zeiss Spaltlampe bei einem Einfallswinkel von 35–50° von der Polarachse des Meridians, welcher das Pellet enthält, photographiert. Die Bilder wurden digitalisiert und durch subtraktive Farbfilter bearbeitet (Adobe Photoshop 4.0), um etablierte Mikrogefäße durch den Hämoglobin-Inhalt zu beschreiben. Bildanalyse-Software (Bioquant, Nashville, TN) wurde verwendet, um den Anteil des kornealen Bildes, welches vaskularisiert war, die Gefäßdichte innerhalb des vaskularisierten Bereiches, und die Gefäßdichte innerhalb der gesamten Kornea zu berechnen. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Tek472/Fc (50 pmol) inhibierte die bFGF (3 pmol) induzierte korneale Angiogenese, und reduzierte die vaskuläre Dichte auf 30% von jener, die durch FGF allein induziert wird.
Beispiel 4
Inhibierung der Neovaskularisation durch Tek/Fc in einem Maus-Transplantat-Modell
Das Überleben des heterotopisch-transplantierten Herzgewebes eines Mausdonators auf die Ohrhaut einer anderen genetisch-ähnlichen Mause erfordert die adäquate Neovaskularisation durch das transplantierte Herz und des umgebenden Gewebes, um das Überleben und die Energie für die Herzmuskelfunktion zu fördern. Inadäquate Vaskulatur an der Transplantationsstelle verursacht eine übermäßige Ischämie des Herzens, Gewebeschädigung und das Versagen des Gewebes einzupflanzen. Substanzen, die den Angiopoietinen und endothelial-spezifischen Faktoren entgegenwirken, die in die Endothelzellmigration und Gefäßbildung eingebunden sind, können die Angiogenese an der Transplantationsstelle verringern, und dadurch die Gewebetransplantatfunktion und letztendlich die Verpflanzung selbst, beschränken.
Die folgenden Studien wurden unter Nutzung eines heterotop-kardialen Maus-Isograft-Modells durchgeführt, um die antagonistischen Wirkungen von Tek/Fc auf die Neovaskularisation zu demonstrieren. In allen Experimenten erhielten weiblichen BALB/c (≈ 12 Wochen alt) neonatale Herztransplantate von Donatormäusen des selben Stammes.
A. Tek/Fc bei 500 μg/Tagesdosis
In jedem der drei Experimente wurde das Donatorherzgewebe auf die linke Ohrmuschel des Empfängers am Tag 0 transplantiert und die Mäuse wurden in zwei Gruppen aufgeteilt. Die Kontrollgruppe erhielt humanes IgG (Hu IgG), während die andere Gruppe humanes Tek/Fc erhielt, wobei beide intraperitoneal mit 500 μg pro Tag verabreicht wurden. Alle Behandlungen begannen am Tag 0 und wurden für fünf aufeinanderfolgende Tage fortgesetzt. Die Funktionalität der Transplantate wurde durch Überwachen der sichtbaren pulsierenden Aktivität 7 und 14 Tage nach der Transplantation bestimmt. Tabelle 1 zeigt die kumulativen Ergebnisse von den drei Experimenten.
Tabelle 1 Funktionale Verpflanzung nach 7 und 14 Tage
Alle 8 Mäuse, die Hu IgG erhielten, wiesen funktionsfähige Transplantate nach 7 und 14 Tagen auf, was auf eine 100% Verpflanzung hinweist. Die Tek472/Fc behandelten Mäuse demonstrierten anfänglich keine funktionale Aktivität, was auf eine verminderte Einpflanzung hinweist, wobei am 7 Tag nur 36% funktionsfähige Transplantate aufwiesen. Nach 14 Tagen, zehn Tage nach der Beendigung der Tek472/Fc Behandlung wiesen 82% der Mäuse funktionsfähige Transplantate auf.
Histologische Untersuchungen der transplantierten Herzen von Mäusen, die Tek/Fc erhielten, zeigten an der Transplantationsstelle ein erhöhtes Ödem, was auf eine vaskuläre Undichtigkeit, und verringerte Wirt und Donatorgewebe-Vaskulaturfärbung (Faktor VIII) hinweist, im Vergleich zu jenen, die in transplantierten Herzen von Mäusen, die das Kontrollprotein IgG erhielten, beobachtet wurden.
Dieses Experiment zeigte, dass die Behandlung mit Tek472/Fc die Herz-Isograft-Funktion ernsthaft beeinträchtigt und die Gewebsverpflanzung in 64% der Mäuse am 7 Tag nach einer 5 tägigen Therapie verhinderte.
B. Tek/Fc-Dosistitration
Drei unterschiedliche Dosen von Tek/Fc wurden im oben beschriebenen Herz-Isograft-Modell getestet. Jede Testgruppe enthielt vier weibliche BALB/c Mäuse. Die Kontrollgruppe erhielt humanes IgG (Hu IgG), intraperitoneal, 500 μg pro Tag für fünf aufeinanderfolgende Tage. Die Tek/Fc-Gruppen erhielten humanes Tek472/Fc, intraperitoneal, u.zw. 90, 250, oder 500 μg pro Tag für fünf aufeinanderfolgende Tage. Die Funktionalität der Transplantate wurden durch Überwachen der sichtbaren pulsierenden Aktivität 7, 11, 14, 17 und 21 Tage nach der Verpflanzung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Funktionale Verpflanzung im Anschluss an die Dosis-Titration mit Tek

* alle Ergebnisse werden als Prozentsatz von Mäusen mit pulsierenden Herztransplantaten angegeben.

Eine ähnliche Größenordnung der Herz-Isograft-Einpflanzungstörung wurde sowohl mit 250 μg als auch mit 500 μg Tek/Fc-Dosen beobachtet, im Vergleich zu Hu IgG Kontrolle, wo keine Wirkungen auf die Verpflanzung beobachtet wurde. Eine kleine, obgleich signifikant bedeutungslose Abnahme der Verpflanzung wurde mit der 90 μg Dosis beobachtet.
Beispiel 5
Behandlung von Tumoren mit Tek472/Fc
Tek472/Fc wurde alleine, und in Kombination mit Flt3L verabreicht, um 87 Fibrosarkom oder B10.2 Fibrosarkom-Tumor tragende Mäuse zu behandeln. Die B10.2 und 87 Tumore sind vom Progressor-Phänotyp, d.h. sie wachsen in normalen Mäusen progressiv. Das B10.2 Fibrosacrom wurde durch subkutane Implantation eines Parafin-Pellets, welches 5 mg Methylcholanthren in C57BL Mäusen enthält, ausgelöst (Lynch and Miller, Eur. J. Immunol. 21: 1403, 1991). Das 87 Fibrosacrom ist eine Progressor-Variante eines Tumors, welcher durch die chronische Bestrahlung von C3H/HeN Mäusen mit UVB-Strahlung ausgelöst wird. Um die Tumore in Mäusen für diese Experimente einzuimpfen, wurden 5 × 10⁵ Zellen intradermal in das Abdomen injiziert (Tag 0) (siehe auch Borges et al., J. Immunol. 163: 1289, 1999).
Die 87 Fibrosarkom Tumore in C3H/HeN Mäusen wurden mit MSA (Maus-Serumalbumin, Kontrolle), Tek/Fc (312 μg/Tag, Tage 4–19 nach der Tumorzellinjektion), Flt3L (10 μg/Tag, Tage 1–19 nach der Tumorzellinjektion), oder einer Kombination von Tek/Fc und Flt3L (Fek/Fc bei 312 μg/Tag, Tage 4–19; Flt3L bei 10 μg/Tag, Tage 1–19 nach Tumorzellinjektion) behandelt. Jede Behandlungsgruppe bestand aus zehn Mäusen. Die Tumorhäufigkeit und Tumorgröße wurde wöchentlich für fünf Wochen gemessen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Mäuse, die mit der Tek/Fc und Flt3L-Kombination behandelt wurden, zeigten die niedrigsten Tumorwachstumsraten. In der 6 Woche wies ein zusätzliches Tier in der Tek/Fc plus Flt3L Gruppe den Tumor zurück, wodurch sich die Tumorhäufigkeit auf 68% verringerte. Basierend auf den Ergebnissen dieses Experiments, wurde die Tek/Fc und Flt3L-Kombination verwendet, um die vorher vorhandenen B10.2 Fibrosarkom-Tumore zu behandeln.
Die B10.2 Fibrosarkom Tumore in C57BL/10 Mäusen wurden mit MSA (Maus-Serumalbumin, Kontrolle), Tek/Fc (625 μg/Tag, Tage 7–32 nach der Tumorzellinjektion), Flt3L (10 μg/Tag, Tage 7–26 nach der Tumorzellinjektion), oder einer Kombination von Tek/Fc und Flt3L (Fek/Fc bei 625 μg/Tag, Tage 7–32; Flt3L bei 10 μg/Tag, Tage 7–26 nach Tumorzellinjektion) behandelt. Jede Behandlungsgruppe bestand aus zehn Mäusen. Die Tumorhäufigkeit und Tumorgröße wurde wöchentlich sechs Wochen hindurch gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Mäuse, die sowohl mit der Tek/Fc und Flt3L-Kombination als auch mit Flt3L behandelt wurden, zeigten reduzierte Tumorwachstumsraten; Mäuse die mit 625 μg/Tag Tek/Fc in Kombination mit Flt3L behandelt wurden, zeigten die niedrigsten Tumorwachstumsraten.
Beispiel 6
Bindung von Tek/Fc Fusionspolypeptide an Angiopoietin
Sowohl Tek745/Fc als auch Tek472/Fc wurde unter Verwendung einer auf zeitaufgelöster Fluoreszenz basierenden Festphasen-Plattenbindungsuntersuchung auf die Fähigkeit den humanen Tek Ligand Angiopoietin 2 (Ang2) zu binden, untersucht. Der Vergleich der Bindung an humanes Ang2 mit den zwei unterschiedlichen Formen der löslichen Tek/Fc's zeigte, dass Tek472/Fc signifikanter besser an Ang2 band (21 fach besser) als Tek745/Fc.
Nieder-Fluoreszenz 8 × 12 Streifen Mikrotiterplatten-Kammern (Perkin-Wallac, Ackron, Ohio) wurden mit 500 ng/ml humanem Ang2 (R&D systems) (100 μl) über Nacht bei 2–8°C inkubiert. Die Kammern wurden dann durch den Zusatz von 100 μl 1% BSA/PBS-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Im Anschluss an eine 4 × PBS-T (PBS-Tween 20 0,05%) Waschung, wurden die Proben, die Tek745/Fc, Tek472/Fc oder TNFR/Fc (Kontrolle/Fc) in verdünntem (1%BSA/PBS) enthielten, zweifach, beginnend mit 30 μg/ml in einer 3fachen Verdünnung, titriert. Den Proben wurde es unter sanftem Agitieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur ermöglicht zu binden und dann wurde ungebundenes Material mit PBS-T 4× weggewaschen. Gebundenes Tek/Fc wurde durch Hinzufügen von Ziege-anti-Human IgG- Europium-Konjugat (Perkin-Wallac), auf 100 ng/ml in Untersuchungspuffer verdünnt, zu den Kammern und Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur nachgewiesen. Ungebundenes Ziege-anti-Human IgG-Europium wurde durch eine 4 × PBS-T Waschung entfernt. Im Anschluss an die Waschung wurde l50 μl-Verstärker-Lösung (Perkin Wallac) zu jeder Kammer hinzugefügt und der Platte wurde es erlaubt, für ein Minimum von 5 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Die Bindung wurde durch Messen der von jeder Kammer emittierten Fluoreszenz mittels eines Victor II Mulitlabel-Zählers bestimmt, welcher mit Software und Lichtanregungs/emissionsvorrichtungen ausgestattet ist, um die Europium-abgeleitete Fluoreszenz zu messen. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Fluoreszenzzählungen, sind in 5 gezeigt.
Die TNFR/Fc-Kontrolle zeigte keine nachweisbare Bindung (über jener, die für den Hintergrund beobachtet wird) an humanes Ang2. Sowohl Tek472/Fc als auch Tek745/Fc banden an humanes Ang2 in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise, allerdings wies Tek472/Fc eine höhere Bindungsaffinität auf. Tek472/Fc band mehr als 20fach besser als Tek745/Fc, basierend auf der Massenkonzentration. Viel höhere Tek745/Fc-Konzentrationen waren notwendig, um das gleiche Bindungsniveau zu erreichen, welches bei niederen Tek472/FC-Konzentrationen beobachtet wurde. Die BC40K (die Konzentrationen an Tek/Fc, die notwendig sind, um 40.000 Fluoreszenzzählungen der huAng-2 Bindung zu erzielen) für Tek745/Fc war 20.596 ng/ml, im Gegensatz zu der BC40K für Tek472/Fc, die 994 ng/ml war.
Beispiel 7
Tek-spezifische monoklonale Blockierungsantikörper
A. Antikörper gegen Tek472/Fc
Antikörper gegen „rekombinante Tie2 extrazelluläre Domäne-Fc-Fusion" wurde von Holmes et al., WO 00/18437 beschrieben. Die vorliegenden Erfinder haben im Gegensatz einen Antikörper gegen das deletierte Tek-extrazelluläre Domän-Fusionspolypeptid Tek472/Fc erzeugt. Wie in Beispiel 6 gezeigt ist, bindet der Tek472/Fc Tek-Ligand mit einer höheren Affinität als Tek745/Fc.
BALB/c-Mäuse wurden mit dem Tek/Fc Fusionspolypeptid Tek472/Fc, welches in Beispiel 1 beschrieben ist, immunisiert. Milzzellen wurden gesammelt und verwendet, um Hybridome unter Verwendung von Standardverfahren zu erzeugen. Die Hybridomaüberstände wurden mittels ELISA auf die Fähigkeit (a) Tek472/Fc und (b) CV1 Zelle, die humanes Tek exprimieren, zu binden, gescreent. Positive wurden zweimal kloniert, um die Monoklonalität sicherzustellen, dann isotypisiert und nochmals auf Reaktivität gegen Tek untersucht.
Drei Antikörper wurden für die weiteren Experimente ausgewählt: M530 (IgG2b Isotyp), M531 (IgG2b Isotyp) und M532 (IgG1 Isotyp). M530 und M531 schienen das gleiche Epitop zu erkennen und M532 erkannte ein zweites (unterschiedliches) Epitop. M530 und M532 wurden deshalb als ein Antikörper-Paar (z.B., für Einfang und Nachweis) in verschiedenen Immununtersuchungen verwendet. Es wurde gezeigt (durch Immunpräzipitation und Festphasen-Plattenbindungsuntersuchungen), dass M530 Tek745/Fc, Tek472/Fc und natürlich vorkommendes Tek, wie es auf der Oberfläche von humanen Endothelzellen exprimiert wird, bindet. Der M530 Antikörper wurde weiters in den Bindungs- und Epitopkartierungsstudien, die unten in Beispiel 8 beschrieben sind, charakterisiert.
B. Zusätzliche Tek-Antikörper
Ein Workshop-Gruppe von mutmaßlichen Endothelzell-spezifischen Antikörpern, welche noch nicht gruppiert sind, wurden von dem Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA) Workshop erhalten. Einige der Antikörper wurden durch Immunisieren der Mäuse mit humanen Endothelzellen erzeugt. Ein Antikörper in der Gruppe war bekannt dafür, dass er mit humanem Tek reagiert. Diese Antikörper wurden weiters in den Bindungs- und Epitopkartierungsstudien, die unten in Beispiel 8 beschrieben sind, charakterisiert
Beispiel 8
Tek Antikörper Bindung an Tek und an humane mikrovaskuläre Endothelzellen
A. Antikörper-Bindung an Tek extrazelluläre Domäne mit voller Länge und an Endothelzellen.
Unter Verwendung einer Festphasen-Bindungsuntersuchung (zeitaufgelöste Fluoreszenz, wie in Beispiel 6 beschrieben), band der huTek monoklonale Antiköper M530, beschrieben in Beispiel 7A, und acht monoklonale Antikörper, beschrieben in Beispiel 7B (Endothelzell-spezifischen Antikörper, die mit WS#70098, #70099, #70100, #70101, #70104, #70108, #70112, und mutmaßlicher Tek-spezifischer Antikörper #70637 nummeriert sind) spezifisch an das Tek extrazelluläre Fusionspeptid Tek745/Fc voller Länge. Ein IgG1 negativ Kontroll-mAb (MOPC21) band nicht an Tek745/Fc über Hintergrund. Zwei andere Endothelzellen-spezifische Workshop Antikörper (WS#70110 und #70115) banden nicht nachweisbar an Tek745/Fc.
Es wurde unter Verwendung der Durchfusszytometrie gezeigt, dass die humanen Tek monoklonalen Antiköper M530, M531, und M532, beschrieben in Beispiel 7A, und acht monoklonale Antikörper, beschrieben in Beispiel 7B (Endothelzell-spezifischen Antikörper, die mit WS#70098, #70099, #70100, #70101, #70104, #70108, #70112, Tek-spezifischer Antikörper #70637 nummeriert sind) an natürlich vorkommendes Tek, wie es auf humanen Endothelzellen (human mikrovaskuläre Endothelzellen sowohl von Erwachsenenhaut als auch HUVEC) exprimiert wird, binden.
B. Antikörper-Bindung an Tek extrazelluläre Domäne, der die FN3-Motive fehlen
Der in Beispiel 7A beschriebene monoklonale Antikörper M530 und sieben monoklonale Antikörper, beschrieben in Beispiel 7B (Endothelzell-spezifischen Antikörper, die mit WS#70098, #70099, #70100, #70101, #70104, #70108, und #70112 nummeriert sind) banden spezifisch an das deletierte Tek-extrazelluläres Fusionspolypeptid Tek472/Fc. Workshop-Antikörper #70637 (welcher an Tek745/Fc band), #70110 und #70115 banden nicht an Tek472/Fc.
C. Kompetitive Inhibierung der Antikörper-Bindung durch Tek-Liganden
Angiopoietin-1 (Ang1, Davis et al., Cell 87: 1161, 1996) und Angiopoietin-2 (Ang2, Maisonpierre et al., Science 277: 55, 1997) sind zwei eng-verwandte Tek-Liganden. Sowohl Ang1 als auch Ang2 binden mit ähnlicher Affinität an menschliches Tek. Es wurde gezeigt, dass die Zugabe eines molaren Überschusses von Ang2 zu EC-Kulturen in der Gegenwart von Ang1 die Ang1-induzierte Aktivierung von Tek auf Endothelzellen über die Kompetititon der Ang1-Bindung an Endothelzellen inhibiert (Maisonpierre et al., Science 277: 55, 1997). Eine rekombinante humane Angiopoietin-2-Zubereitung wurde von R&D-Systems, Inc. (Minneapolis, MN) erhalten. Gemäß dem Hersteller wandert die Angiopoietin-2-Zubereitung als ein 66 kDa Protein in einer SDS-PAGE sowohl unter reduzierenden als auch nicht-reduzierenden Bedingungen. Basierend auf der N-terminalen Aminosäuresequenzierung enthält die Zubereitung zwei Peptide: ein Hauptpolypeptid (75% des Gesamten) mit Asp68 als sein N-Terminus und ein Nebenpolypeptid (25% des Gesamten) mit Tyr19 als sein N-Terminus.
Die Fähigkeit dieser Ang2-Zubereitung die Bindung von Tek-Antikörpern an Tek, welches auf humanen mikrovaskulären Hautendothelzellen exprimiert wird, kompetitiv zu inihibieren wurde mittels Durchflusszytometrie getestet.
Jeder mAb wurde zu 500.000 HMVEC-d mit 5 μg/ml in 12 × 75 Falcon-Röhrchen, zweifach, hinzugefügt und ermöglicht für 15 Minuten bei 4°C in Bindungsmedium zu inkubieren. Zu einem Satz der Duplikate wurde 10 μg/ml humanes Ang2 (fünffacher molarer Überschuss) für weitere 30 Minuten hinzugefügt. Die Zellen mit dem gebundenen Tek mAb wurden dann in 20 Volumen PBS-enthaltendem Waschpuffer gewaschen. Nach dem Waschschritt, wurde gebundener Maus mAB durch den Zusatz von F(ab'2) Schaf-anti-Maus IgG-PE Fluoreszenzkonjugat zu den Zellen nachgewiesen, gefolgt von einer 30 Minuten Inkubation bei 4°C und einer zusätzlichen 20 Volumen Waschung. Die Bindung des Tek mAB wurden durch Durchflusszytometrie-Analyse auf einem Einzellaser-FACSCAN (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) gemessen. Die prozentuelle Inhibierung der Antikörper-Bindung wurde mittels folgender Formel berechnet: MFI(kein Ang2) – MFI(+Ang2)/MFI(kein Ang2) × 100.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 Inhibierung der Tek Antikörper-Bindung durch Ang2
Diese Ergebnisse, die Inhibierung der Tek Antikörper-Bindung durch Ang2, weisen darauf hin, dass die M530, #70098, #70099, #70100, #70101, #70104, #70108 und #70112 Antikörper an oder in der Nähe der Tek-Lingandenbindungsstelle binden. Die mAbs M530, WS#70099 und #70112 waren auch in der Lage die Ang2 Bindung (100 ng/ml) an rekombinantes humanes Tek472/Fc, bei mehr als 50% für mAb M530 und #70112 bei Konzentrationen von 10 μg/ml oder höher und für mAb 70099 bei Konzentrationen von 3 μg/ml oder höher, zu inhibieren.
In Kombination definieren die in diesem Beispiel beschriebenen Bindungsergebnisse zumindest drei Antikörper-Epitope in der humanen Tek extrazellulären Domäne, und erläutern den Nutzen der Herstellung von Antikörpern unter Verwendung eines Fragments der Tek extrazellulären Domäne, der die gesamte oder Teile der Region fehlt, die die Fibronectin Typ III (FNIII) Motive enthält, als ein Immunogen/Ziel.
Sequenzprotokoll

Claims

Polypeptid das die Tek extrazelluläre Domäne, die als Reste 19–745 der SEQ ID Nr. 1 gezeigt werden, aufweist, worin dem Polypeptid die Reste 473–745 der SEQ ID Nr. 1 fehlen die die Fibronectin Typ III (FNIII) Motive beinhalten und worin das Polypeptid eine höhere Bindungsaffinität für Angiopoietin-1 oder Angiopoietin-2 oder Angiopoietin-4 hat als Polypeptide die die Tek extrazelluläre Domäne in voller Länge aufweisen.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin die Tek extrazelluläre Domäne aus einer Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (f) den Resten 23–472 der SEQ ID Nr. 2; (g) Varianten die zumindest zu 95% identisch sind zu (a); (h) Varianten die zumindest zu 98% identisch sind zu (a); (i) Varianten die zumindest zu 99% identisch sind zu (a); und (j) den Resten 19–472 der SEQ ID Nr. 2
Polypeptid nach Anspruch 2, welches aus den Resten 19–704 oder 23–704 der SEQ ID Nr. 2 besteht.
Nukleinsäure die ein Polypeptid nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3 kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, die weiters eine Signalpeptidsequenz kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 5, welche die SEQ ID Nr. 2 kodiert.
Polypeptid durch eine Verfahren hergestellt wird, welches das Exprimieren einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 4, 5 oder 6 in einer rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen die die Expression des Polypeptides zulassen, aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 7, worin das Verfahren das Exprimieren einer Nukleinsäure nach Anspruch 5 oder Anspruch 6 aufweist und weiters das Sammeln das von der Wirtszelle sekretierte Polypeptid aufweist.
Lösliches Tek-Multimer das eine Vielzahl an Polypetiden gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 7 oder 8 aufweist.
Lösliches Tek-Multimer nach Anspruch 9, worin das Multimer ein Dimer oder ein Trimer ist
Lösliches Tek-Multimer nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin das Multimer ein Fc Polypeptid, einen Leucine Zipper, oder einen Peptidlinker aufweist.
Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 7 oder 8 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Inhibierung der Angiogenese in einem Säugetier.
Die Verwendung eines löslichen Tek Multimers wie gemäß einem der Ansprüche 9–11 beansprucht bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Inhibierung der Angiogenese in einem Säugetier.
Verwendung gemäß Anspruch 13, worin Tek humanes Tek ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 12–14 worin das Medikament weiters einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 12–15 worin das Medikament zur Behandlung einer Krankheit oder eines Zustandes die/der durch Angiogenese vermittelt wird.
Verwendung nach Anspruch 16 worin die Krankheit oder der Zustand durch okuläre Neovaskularisation gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 16 worin die Krankheit oder der Zustand ein solider Tumor ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 12–18 worin das Medikament weiters einen zweiten chemotherapeutischen Wirkstoff aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 12–19 worin das Medikament geeignet zur Verwendung in Kombination mit Strahlung ist.
Verwendung gemäß Anspruch 19 oder Anspruch 20, worin der zweite chemotherapeutische Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Alkylanzien, Antimetaboliten, Vinca-Alkaloide und anderen von Pflanzen-abgeleiteten Chemotherapeutika, Nitrosoharnstoffe, Antitumor-Antibiotika, Antitumor-Enzyme, Topoisomerase Inhibitoren, Platin-Analoga, Adrenocorticales Suppressiva, Hormone, Hormonagonisten, Hormonantagonisten, Antikörper, Immuntherapeutika, Blutzellenfaktoren, Radiotherapeutika, und biologische Antwortmodifikatoren besteht.
Verwendung nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, worin der zweite chemotherapeutische Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Cisplatin, Cyclophosphamid, Mechloretamin, Melphalan, Bleomycin, Carboplatin, Fluoruracil, 5-Fluordeoxyuridin, Methotrexat, Taxol, Asparaginase, Vincristin, und Vinblastin, Lymphokine und Cytokine wie z.B. Interleukine, Interferone (einschließlich alpha, beta, oder delta), und TNF, Chlorambucil, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Semustin, Streptozocin, Dacarbazin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Vindesin, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin, Mitomycin, L-Asparaginase, Hydroxyharnstoff, Methylhydrazine, Mitotan, Tamoxifen und Fluoxymesteron besteht.
Verwendung nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, worin der zweite chemotherapeutische Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Flt3 Ligand, CD40 Ligand, Interleukin-2, Interleukin-12, 4-1BB Ligand, Anti-4-1BB Antikörper, TNF Antagonisten und TNF Rezeptor Antagonisten, TRAIL, CD 148 Agonisten, VEGF Antagonisten, und VEGF Rezeptor Antagonisten besteht.
Verwendung eines Tek Antagonisten der aus der Gruppe ausgewählt die aus: (a) einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 7 oder 8, und (b) einem löslichen Tek Multimer gemäß einem der Ansprüche 9–11 besteht; bei der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Bindung eines Tek Liganden an Tek in einem Säugetier.
Verfahren zur Bestimmung ob ein Antikörper, der an ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 7 oder 8 bindet ein Tek-Antagonist ist, welches Verfahren das Bestimmen enthält ob der Antikörper ein Tek Antagonist durch seine Fähigkeit die Bindung des Tek-Liganden an Tek zu inhibieren ist.