PL206377B1 - Zastosowanie bakterii z rodzaju Salmonella oraz szczepionka do ochrony zwierząt przeciwko salmonellozie - Google Patents
Zastosowanie bakterii z rodzaju Salmonella oraz szczepionka do ochrony zwierząt przeciwko salmonellozieInfo
- Publication number
- PL206377B1 PL206377B1 PL344851A PL34485100A PL206377B1 PL 206377 B1 PL206377 B1 PL 206377B1 PL 344851 A PL344851 A PL 344851A PL 34485100 A PL34485100 A PL 34485100A PL 206377 B1 PL206377 B1 PL 206377B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- flagellin
- bacterium
- vaccine
- salmonella
- bacteria
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 74
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 61
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 53
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 title claims description 15
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 title claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 claims description 78
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 claims description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 33
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 29
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 25
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 22
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 7
- 241001467018 Typhis Species 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 4
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 101000628535 Homo sapiens Metalloreductase STEAP2 Proteins 0.000 description 24
- 102100026711 Metalloreductase STEAP2 Human genes 0.000 description 24
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 20
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 12
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101100238784 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) mtfA gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 4
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 101001072091 Homo sapiens ProSAAS Proteins 0.000 description 3
- 102100036366 ProSAAS Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 3
- 235000006545 Ziziphus mauritiana Nutrition 0.000 description 3
- 240000000038 Ziziphus mauritiana Species 0.000 description 3
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 244000144992 flock Species 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 2
- 241000607356 Salmonella enterica subsp. arizonae Species 0.000 description 2
- 241000607662 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abortusequi Species 0.000 description 2
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 2
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 2
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000773293 Rappaport Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000392514 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin Species 0.000 description 1
- 241000607683 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Pullorum Species 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- PHTAQVMXYWFMHF-QVPNGJTFSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)CO)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O PHTAQVMXYWFMHF-QVPNGJTFSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229960001506 brilliant green Drugs 0.000 description 1
- HXCILVUBKWANLN-UHFFFAOYSA-N brilliant green cation Chemical compound C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 HXCILVUBKWANLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 201000003144 pneumothorax Diseases 0.000 description 1
- 238000007692 polyacrylamide-agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0275—Salmonella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/12—Antidiarrhoeals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bakterii z rodzaju Salmonella oraz szczepionka do ochrony zwierząt przeciwko salmonellozie.
Bakterie z rodzaju Salmonella są uporczywymi patogenami zarówno człowieka jak i zwierząt. W samych tylko USA corocznie liczba osób, które uległy zarażeniu Salmonella przekracza dwa miliony przypadków. W większości przypadków infekcje są wywołane zakażonym pokarmem. Dobrze znanym źródłem zakażeń są jaja (zarówno kacze jak i kurze), produkty zawierające jaja i poddane niedostatecznej obróbce termicznej mięso drobiowe i wieprzowina. Szczególnie niska jest zdolność obrony przed taką infekcją w przypadku noworodków, małych dzieci, młodych osób i pacjentów z niewydolnym układem odpornościowym. Szczególnie w tych grupach, w ciągu roku, ilość przypadków śmierci wywołanych infekcją Salmonella jest wysoka. W ciągu kilku ostatnich dziesięcioleci bardziej wydajna hodowla zwierząt na dużą skalę doprowadziła do niezwykłego zwiększenia zagęszczenia zwierząt. W wyniku tego obserwowane jest zwię kszenie iloś ci przypadków zakaż eń zwierzę cych, a w konsekwencji zakażeń ludzkich wywołanych zakażonym pokarmem. Jest oczywistym, że głównym źródłem zarażeń Salmonella są zwierzęta. Źródło to jest bardzo trudne do kontroli. Po pierwsze zarażenie Salmonella zdrowych zwierząt, w większości przypadków nie powoduje poważnej choroby u zdrowych całkowicie dojrzałych zwierząt; zwierzęta te mogą przez dłuższy czas przenosić bakterię. W tym czasie rozsiewają bakterię w swoich odchodach. Powoduje to, że uniknięcie zarażenia młodych, podatnych zwierząt, jest praktycznie niemożliwe. Po drugie wiele gatunków Salmonella zasiedla szereg różnych, będących dla nich gospodarzami, gatunków zwierząt. Niektóre gatunki Salmonella powodują pierwotne zarażenia u specyficznych gospodarzy, podczas gdy inne gatunki Salmonella wcale nie są tak ograniczone. U człowieka zakażenia często wywołane są pierwotnymi infekcjami S. typhi i paratyphi. S. typhi wywołuje biegunkę i w rezultacie odwodnienie. Zakażenie to często występuje na obszarach tropikalnych. S. dublini jest związana z bydłem, szczególnie z młodymi zwierzętami, u których wywołuje, w ponad 50% przypadków, śmiertelne infekcje. S. abortus-equi powoduje poronienia u koni, S. abortus-ovi powoduje poronienia u owiec. S. choleraesuis wywołuje śmiertelną biegunkę u młodych świń. S. typhimurium i S. enteritidis powodują salmonellozę u drobiu, świń, cieląt i gryzoni. S. arizonae powoduje również chorobę indyków. Również, niebędące pokarmem dla człowieka zwierzęta, takie jak gady, ulegają zakażeniom Salmonella, takim jak S. arizonae.
Oczywistą jest potrzeba skutecznych szczepionek przeciw Salmonella. Szczepionki są potrzebne, aby ochronić ludzi przed zakażeniami Salmonella przenoszącymi się z człowieka na człowieka. Szczepionki są potrzebne również, aby chronić ludzi przed zakażeniami Salmonella przenoszonymi przez żywność. Szczepionki są również potrzebne, aby chronić zwierzęta przez zarażeniami Salmonella.
Obecnie w handlu dostępnych jest kilka szczepionek przeciw różnym gatunkom Salmonella. Chociaż szczepionki te czasami są skuteczne z punktu widzenia szczepionki, to, posiadają takie same poważne wady. Ogólnie indukują wytwarzanie populacji przeciwciał, która jest równa tej po infekcji bakteriami typu dzikiego, ponieważ posiadają takie samo obciążenie antygenowe jak bakteria typu dzikiego. Dlatego badanie przeciwciał w surowicy zwierząt Salmonella pozytywnych nie ujawnia, dlaczego zwierzęta są pozytywne. Może to być wywołane szczepieniem, lecz równie dobrze może być spowodowane infekcją wirulentnym szczepem dzikim. Zatem, jeśli zwierzę jest Salmonella pozytywne to jest uważane za zakażone. Dlatego wskazane byłoby posiadanie tak zwanej szczepionki markerowej. Szczepionką markerową jest szczepionka, która może być odróżniona od infekcji typu dzikiego, np. na podstawie charakterystyki panelu przeciwciał odmiennego od panelu przeciwciał indukowanych przez infekcję typu dzikiego. Odmienny panel przeciwciał jest indukowany np., gdy immunogenne białko obecne na bakterii typu dzikiego nie jest obecne na mutancie, który jest użyty do szczepienia; wtedy gospodarz nie będzie, po szczepieniu, wytwarzał przeciwciał przeciw temu białku.
Antygen znacznikowy ma przynajmniej poniżej podane właściwości:
= > moż e być usunię ty bez istotnej zmiany ż ywotnoś ci bakterii;
= > gdy jest obecny powoduje wytwarzanie przeciwciał ;
= > gdy jest obecny, nie wpł ywa na immunogenność bakterii, = > brak jego korzystnie wspomaga atenuację .
Gdy poszukuje się użytecznych antygenów znacznikowych, rozważane powinny być wszystkie znane antygeny Salmonella. Znanym antygenem znalezionym u wszystkich dzikich szczepów Salmonella, z wyjątkiem niektórych podgatunków S. pullorum i gallinarum, jest wić. Przykładami gatunków Salmonella, których dzikie postacie mają wici są S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi,
PL 206 377 B1 abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi A i B, derby, hadar, heidelberg, agona i arizonae. Wici są wydłużonymi strukturami wystającymi ponad powierzchnię komórki, które odgrywają ważną rolę w ruchliwości i zasiedlaniu określonych komórek gospodarza. Wić zbudowana jest z długich polimerów białka nazywanego flagelliną. Wiadomo, że wić indukuje wysoki poziom przeciwciał. Wiadomo również, że brak wici nie wpływa znacząco na żywotność bakterii poza komórką gospodarza: mutanty pozbawione wici, praktycznie wszystkich gatunków Salmonella, są znane i mogą być hodowane in vitro.
Mimo to białka wici Salmonella nigdy nie były rozważane, jako użyteczne Znaczniki, bowiem nie spełniają one lub tylko częściowo spełniają trzy z czterech stawianych przed znacznikiem wymagań:
-choć nie mają zasadniczego znaczenia dla przeżycia poza gospodarzem, to odgrywają znaczącą rolę w przeżyciu i przetrwaniu bakterii w makrofagach gospodarza biorącym biorących udział w indukowaniu odpornoś ci. (Methner, U. i Barrow, P.A., Beri. Munch. Tierartzl, Wschr. 110: 391-396 (1997), Weinstein i wsp. Infect. Immun. 46: 819-825 (1984))
-silnie wpływają na immunogenność bakterii, powód, dla którego są one używane nawet jako białka nośnikowe dla krótkich, heterologicznych sekwencji aminokwasowych (Joys, T. M., SAAS Bulletin: Biochem. & Biotech, 4: 56-59 (1991), Newton, S.M.C. i wsp., Science 244: 70-72(1989))
- ich brak nie wpływa na atenuację (Lockman, H,A. i Curtiss, R., Infect. & Immun. 58: 137-143 (1990), Methner, U. i Barrow, P.A., Beri. Muinch. Tierartzl. Wschr. 110:391-396 (1997))
-mające wici bakterie Salmonella hamują wiązanie innych posiadających wici Salmonella. Bakterie Salmonella pozbawione wici, chociaż wykazują zmniejszoną zdolność hamowania względem innych posiadających wici Salmonella i co za tym idzie, mogą zwiększać ogólny poziom infekcji Salmonella. (Methner, U, i Barrow, P,A, Beri. Munch. Tierartzl. Wschr, 110: 391-396 (1997), Weinstern i wsp,, Infect. Immun. 46: 819-825 (1984)) Z tych wszystkich powodów wić nigdy nie był a rozważana, jako użyteczny, wykrywalny antygen znacznikowy dla szczepionek Salmonella.
Nieoczekiwanie stwierdzono, w przeciwieństwie do powszechnego założenia, że brak wici nie wpływa na właściwości Salmonella, jako szczepionki. Jest to szczególnie zaskakujące w zestawieniu z faktem, że w przypadku zaraże ń zwierzą t Salmonella typu dzikiego wykryto duże ilości przeciwciał przeciw wici, co jeszcze raz dowodzi jej antygenowości. Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania bakterii z rodzaju Salmonella, która w postaci typu dzikiego niesie wici, przy czym ta bakteria nie jest zdolna do indukowania przeciwciał, przeciw co najmniej jednej determinancie antygenowej flagelliny lub wici, i adiuwanta do wytwarzania inaktywowanej szczepionki do ochrony ludzi i zwierząt przeciwko infekcji bakterią Salmonella lub patologicznym skutkom infekcji.
Korzystnie bakteria nie jest zdolna do indukowania przeciwciał, przeciwko co najmniej jednej determinancie antygenowej flagelliny lub wici z powodu mutacji w genie szlaku biosyntezy wici, korzystniej mutacja jest zlokalizowana w genie flagelliny, a bakteria jest wybrana z grupy składającej się z S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi A i B, derby, hadar, heidelberg, agona i arizonae.
W zakres wynalazku wchodzi ponadto zastosowanie bakterii z rodzaju Salmonella, która w postaci typu dzikiego niesie wici, przy czym ta bakteria nie jest zdolna do indukowania przeciwciał, przeciw co najmniej jednej determinancie antygenowej flagelliny lub wici do wytwarzania żywej atenuowanej szczepionki do ochrony ludzi i zwierząt przeciwko infekcji bakterią Salmonella lub patologicznym skutkom infekcji.
Korzystnie bakteria nie jest zdolna do indukowania przeciwciał, przeciwko co najmniej jednej determinancie antygenowej flagelliny lub wici z powodu mutacji w genie szlaku biosyntezy wici, korzystniej mutacja jest zlokalizowana w genie flagelliny, a bakteria jest wybrana z grupy składającej się z S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi A i B, derby, hadar, heidelberg, agona i arizonae.
Wynalazek dotyczy również szczepionek do ochrony zwierząt przeciwko salmonellozie, które zawierają odpowiednio inaktywowane lub atentowane bakterie jak określone powyżej, adiuwant i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
Korzystnie szczepionki są w postaci liofilizowanej lub wysuszonej rozpyłowo.
Flagelliny są białkami zbudowanymi z około 500 aminokwasów, które zawierają kilka determinant antygenowych, tj. mają kilka regionów we flagelinie, przeciw którym, będące gospodarzem zwierzę, może wzbudzić przeciwciała. Takie determinanty antygenowe zostały określone i zlokalizowane przez T.M. Joys. (Joys, T. M., SAAS Bulletin: Biochem. & Biotech. 4: 56-59 (1991)). Dla celów obecnego wynalazku bakterie, które nie są dalej zdolne indukować przeciwciał przeciw co najmniej jednej determinancie antygenowej flagelliny lub wici, są uważane za bakterie, które nie mają flagelliny lub
PL 206 377 B1 wici posiadających wszystkie determinanty antygenowe. Nie jest konieczne usunięcie wszystkich determinant antygenowych: wystarcza usunięcie jednej determinanty antygenowej. Badanie przesiewowe na przeciwciała przeciw tym determinantom antygenowym surowicy seropozytywnych zwierząt powinno pozwolić na rozróżnienie między zwierzętami zaszczepionymi surowicą ze znacznikiem i zwierzętami z infekcją typu dzikiego. Takie przeciwciała nie powinny być wykryte u zaszczepionych zwierząt, podczas gdy powinny być obecne u zwierząt zarażonych w sposób naturalny. Badania przesiewowe można łatwo przeprowadzić, jak to opisano poniżej, w rutynowy sposób za pomocą prostych narzędzi diagnostycznych.
Obecnie więcej wiadomo o syntezie flagelliny i następnym dojrzewaniu w wić (np. u Escherichia coli i Salmonella typhimitrium. Rozdział 10: Flagella and Motility. Wyd. Frederick C, Neidhardt i wsp., 2 wyd. ISBN 1-55581-084-5 (1996) i w Macnab, RM.; Genetics and biogenesis of bacterial flagella (Annual Review of Genetics 26: 131-158 (1992)). Proces biosyntezy wici wymaga równoczesnego działania dużej liczby genów, nie tylko genu kodującego flagellinę lecz również wielu genów biorących udział w syntezie wici i w napędzaniu wici. Zasadniczo, istnieją dwa sposoby otrzymania bakterii, których zastosowania dotyczy obecny wynalazek. Po pierwsze, mogą być otrzymane mutacje w genie kodującym flagellinę, w celu zmutowania jednej lub więcej determinant antygenowych. Po drugie, może być zmutowanych jeden lub więcej genów włączonych w biogenezę wici flagelli. Będzie to zapobiegać biosyntezie flagelliny lub nawet całej wici, a w wielu przypadkach nawet transportowi flagelliny przez błonę bakterii. W przypadku, w którym nie jest wytwarzana wić, nie będą występowały determinanty antygenowe określone przez specyficzne sfałdowanie flagelliny w wici. Indukcji przeciwciał przeciw flagellinie nie będzie, jeśli sama flagellina nie będzie transportowana przez błonę, a co za tym idzie pozostanie wewnątrz bakterii. Wszystkie rodzaje genów lub znanych w dziedzinie klastrów genowych biorących udział w składaniu i eksporcie, takich jak morfologiczny szlak składania wici i szlak transportu specyficznego dla wici, mogą być celami mutacji. Wszystkie one będą prowadziły do powstania bakterii pozbawionej flagelliny lub przynajmniej wici. Dla jasności, wszystkie te szlaki uczestniczące w procesie pełnej syntezy końcowej wici są dalej określane jako szlak biogenezy wici.
Zatem, w korzystnym wykonaniu, w wyniku mutacji w genie ze szlaku biogenezy wici, bakteria nie jest zdolna do indukcji przeciwciał przeciw co najmniej jednej determinancie antygenowej flagelliny lub wici.
Z praktycznego punktu widzenia, jednakż e mo ż e być celowe usunię cie (części) cał ego genu flagelliny z bakterii przeznaczonej dla zastosowania w szczepionce, przez prostą delecję genu kodującego flagellinę. Znane są geny kodujące flagellinę u różnych gatunków Salmonella. Wszystkie one są ze sobą blisko spokrewnione i co za tym idzie wysoce homologiczne. Geny dla flagelliny zostały opisane dla Salmonella enterica (Li, J i wsp., Proc. Natl. Acad, Sci. 91, 2552-2556 (1994)), Salmonella enteritidis (Selander, R.K. i wsp., J. Bacteriol. 174, 3587-3592 (1992)), Salmonella dublin (Masten, B.J. i Joys, T.M., J. Bacteriol. 175, 5359-5365 (1993)), Salmonella typhimurium (de Vries, N. i wsp., Appl. Environ. Microbiol, 64, 5033-5038 (1998)), Salmonella abortus-equi) Hanafusa, T. i wsp., Mol. Gen. Genet. 236, 260-266 (1993)). Geny dla flagelliny z nowych gatunków Salmonella mogą być łatwo odnalezione na zasadzie ich homologii z istniejącymi i znanymi genami dla flageliny Salmonella: typowa technika hybrydyzacji wystarczająca dla lokalizacji genu dla flagelliny.
U bakterii Salmonella typu dzikiego niosą cej wić , istnieją dwa geny flagelliny. Tylko jeden z tych genów jest włączony, to jest w danej chwili warunkuje wytwarzanie flagelliny, Zależnie od mechanizmu nazywanego zmianą fazy wici w skali czasu rzędu 103 do 105 pokoleń geny zamieniają się rolami, tak, że nieulegający ekspresji staje się aktywny, i vice versa, (np. jak to opisano w Escherichia coli i Salmonella typhimurium. Rozdział 10: Flagella and motility. Wyd. Frederick C, Neidhardt i wsp. 2 wyd. ISBN 1-55581-084-5 (1996)). W celu uniknięcia szczepów według wynalazku, które po kilku pokoleniach zaczynają wyrażać flagellinę, trzeba, sprawić, aby oba geny dla flagelliny były niefunkcjonalne. Alternatywnie, jeśli mechanizm przełączania fazy stanie się niefunkcjonalny, wystarczy wyeliminować gen dla flagelliny, który w danym momencie ulega ekspresji.
Niefunkcjonalny jest gen, który już nie koduje flagelliny. Może być nim gen, z którego usunięto część sekwencji kodującej, która koduje determinantę antygenową.
Jednym z możliwych sposobów przeprowadzenia genu dla flagelliny, lub jakiegokolwiek innego znanego genu uczestniczącego w biosyntezie wici w gen niefunkcjonalny są klasyczne metody, takie jak poddanie bakterii typu dzikiego, wytwarzających wici, działaniu czynników mutagennych, takich jak analogi zasad, działanie ultrafioletem lub temperaturą (Anderson, P. 1995, Mutagenesis, str. 31-58 w Methods in Celi Biology 48. H.F. Epstein D.C. Shakes (wyd.). Inne sposoby wytwarzania mutantów
PL 206 377 B1 pozbawionych wici u różnych bakterii, których szczepy dzikie mają wici opisane są np. przez Liu, S.L. (Infect. Immun, 1988 sierpień 56 (8): 1967-73), Haas, R. i wsp, (Mol. Microbiol., 1993 maj 8 (4): 75360) i Graf, J. i wsp, (J. Bacteriol. 1994 listopad 176 (22): 6986-91).
Selekcja na bakterie pozbawione wici jest bardzo łatwa do przeprowadzenia przez badania przy pomocy mikroskopu świetlnego z uwagi na występowanie lub brak wici. Selekcję bakterii, które utraciły przynajmniej jedną determinantę antygenową wici lub wić można wykonać za pomocą oznaczenia wiązania z monoklonalnymi przeciwciałami przeciw flagellinie lub wici. Takie przeciwciała monoklonalne przeciw wici lub przeciw flagellinie można wytworzyć za pomocą typowych technik np. przez immunizację (przy pomocy wici), wsobnych myszy (Kohler i Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Tak uzyskane przeciwciała monoklonalne można zastosować w oznaczeniach wiązania ze zmutowanymi bakteriami i takie bakterie, które nie wiążą się specyficznie z przeciwciałami monoklonalnymi są bakteriami, które utraciły przynajmniej jedną determinantę antygenową flagelliny lub wici.
Nie jest znany charakter mutacji wywoływanych klasycznymi technikami mutagenezy. Mogą to być mutacje punktowe, które mogą, choć jest to mało prawdopodobne, ewentualnie ulec rewersji do typu dzikiego. Dlatego dobrą alternatywą jest mutageneza transpozonem. Mutageneza przez mutacje transpozonowe jest również dobrze znaną w stanie techniki, techniką mutagenezy. Jest to mutacja uzyskana przez umiejscowienie w określonym miejscu chromosomu.
Możliwość wprowadzenia mutacji we wcześniej określone miejsce, raczej świadomie niż przypadkowo, oferuje technologia rekombinowania DNA. Mutacją taką może być insercja, delecja, zastąpienie jednego nukleotydu przez inny lub kombinacja powyższych, z tym tylko ograniczeniem, że zmutowany gen nie koduje dalej funkcjonalnej flagelliny. Taką mutację można np. uzyskać przez delecję kilku par zasad. Nawet bardzo mała delecja, taka jak delecja fragmentu o długości 10 par zasad, może już sprawić, że flagelina będzie niefunkcjonalna. Nawet, usunięcie jednej pojedynczej pary zasad może już prowadzić do niefunkcjonalnej flageliny, ponieważ, w wyniku takiej mutacji inne pary zasad nie są już dłużej odczytywane w poprawnej ramce odczytu. Każda delecja lub insercja fragmentu zbudowanego z liczby par zasad niepodzielnej przez trzy powoduje przesunięcie ramki odczytu. Bardziej korzystnie, usuwane są dłuższe fragmenty, np. sto par zasad. Jeszcze korzystniej, gdy usunięty jest cały gen flagelliny. Łatwo można dostrzec, że szczególnie mutacje wprowadzające do otwartej ramki odczytu kodon stop, lub mutacje powodujące przesunięcie ramki odczytu są bardzo odpowiednie dla uzyskania szczepu, który już dłużej nie koduje flagelliny. Mutageneza ukierunkowana jest metodą z wyboru do wytwarzania genu flagelliny, któremu brak jednej lub wię cej determinant antygenowych. Opierając się na mapie determinant antygenowych sporządzonych przez Joys (Joys, T. M., SAAS Biuletin: Biochem. & Biotech. 4: 56-59 (1991)), można uzyskać mutanta w genach dla flagelliny może być takim, z którego usunięto jedną lub więcej specyficznych determinant antygenowych. Wszystkie techniki rekombinowania DNA w celu konstrukcji mutantów pozbawionych flagelliny są dobrze znanymi standardowymi technikami. Dotyczą one klonowania genu dla flagelliny, modyfikowania sekwencji genu przez ukierunkowaną mutagenezę, trawienia enzymem restrykcyjnym, po którym następuje religacja, lub metodą PCR i w konsekwencji zastąpienie genu dla flagelliny typu dzikiego genem zmutowanym (wymiana alleliczna lub alleliczne zastąpienie). Standardowe techniki rekombinowania DNA, takie jak klonowanie genu dla flagelliny na plazmidzie, trawienie genu enzymem restrykcyjnym, a następnie działanie endonukleazą, religacja i homologiczna rekombinacja w szczepie gospodarza, są dobrze znane w dziedzinie i opisane np. w Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. i wsp., Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6). Ukierunkowana mutageneza może być, na przykład, przeprowadzona przez in vitro ukierunkowaną mutagenezę z użyciem zestawu Transformer® sprzedawanego przez Clontech. Techniki PCR są szeroko opisane w (Dieffenbach & Dreksler; PCR primers a laboratory manuał . ISBN 0-87969-447-5 (1995)).
Zatem w najbardziej korzystnym wykonaniu wynalazek dotyczy bakterii, które nie są zdolne do wyrażania flageliny z powodu mutacji w genie flagelliny.
Najkorzystniej bakterie są wybrane z grupy obejmującej S. typhimurhim, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortiis-ovi, abortus-equi, paratyphi A i B, derby, hadar, heidelberg, agona i arizonae. Wynalazek dostarcza po raz pierwszy szczepionki markerowej dla ochrony ludzi i zwierząt przed salmonellozą. Cechą charakterystyczną szczepionek, według wynalazku jest to, że zawierają bakterie jak określone powyżej lub opisany powyżej materiał antygenowy i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Główną zaletą szczepionek według niniejszego wynalazku jest fakt, że zaszczepionych nimi ludzi i zwierzęta można odróżnić, na podstawie panelu ich przeciwciał, zarówno od niezaszczepionych ludzi i zwierzą t jak i ludzi i zwierzą t zaraż onych Salmonella typu dzikiego.
PL 206 377 B1
Szczepionki według wynalazku mogą być w postaci żywej atenuowanej lub być w postaci inaktywowanej. W obu przypadkach na skutek braku co najmniej jednej determinanty antygenowej wici lub flagelliny, zestaw przeciwciał uzyskany po szczepieniu może być łatwo odróżniony od wywołanego infekcją typu dzikiego.
Inaktywowane szczepionki mają przewagę nad szczepionkami żywymi gdyż są z założenia bezpieczne. Zatem jedna z postaci według wynalazku dotyczy szczepionek, w których bakterie są w postaci inaktywowanej.
Te szczepionki, które są oparte na żywych bakteriach Salmonella, mają przewagę nad szczepionkami zawierającymi inaktywowane bakterie, ponieważ lepiej naśladują naturalną infekcję, a co za tym idzie lepiej wyzwalają odpowiedź układu odpornościowego. Mają one również dodatkową ważną zaletę, jak to zostanie to wytłumaczone poniżej, Na ogół, otrzymanie żywej atenuowanej szczepionki jest trudne i pochłania wiele czasu. Ponadto, precyzyjne dostosowanie stopnia atenuacji jest skomplikowane: wysoka wirulencja wywołuje chorobę, a niska wirulencja indukuje niewystarczającą ochronę. Nieoczekiwanie, szczepionki według wynalazku nie wykazują znaczących różnic w wirulentności w porównaniu z ich odpowiednikami niosącymi wić. Innymi słowy, usunięcie genu dla flagelliny nie zmienia w znaczący sposób poziomu atenuacji. Ma to tę nieoczekiwaną zaletę, że zarówno uzyskane w przyszł o ś ci jak i istnieją ce, sprawdzone, ż ywe atenuowane szczepy Salmonella odpowiednie do zastosowania w szczepionkach mogą być użyte w obecnym wynalazku tak długo, jak długo nie są one zdolne do indukcji przeciwciał przeciw co najmniej jednej determinancie antygenowej flagelliny lub wici. Zatem, w kolejnej postaci, szczepionka według wynalazku zawiera żywe atenuowane bakterie.
Biorąc pod uwagę dużą ilość szczepionek podawanych obecnie zarówno zwierzętom domowym jak i hodowlanym jest jasne, że będzie celowe połączenie podawania kilku szczepionek, choćby z uwagi na zmniejszenie kosztów szczepienia. Dlatego jest bardzo atrakcyjne zastosowanie żywych atenuowanych bakterii jako zrekombinowanych nośników dla heterologicznych genów kodujących antygeny wybrane z innych, patogennych wirusów i mikroorganizmów. Podanie takiego zrekombinowanego nośnika ma tę zaletę, że w tym samym czasie jest indukowana odporność immunologiczna przeciw dwóm lub więcej chorobom.
Szczepionka według obecnego wynalazku zawiera poza opisanymi wyżej bakteriami, farmaceutycznie akceptowalny nośnik. Nośnik może być tak prosty, jak woda, lecz może również np. zawierać płyn hodowlany, w którym hodowano bakterie. Innym użytecznym nośnikiem jest np. stężony roztwór soli fizjologicznej.
Użyteczna, podawana dawka będzie zależała od wieku, wagi i zwierzęcia, które jest szczepione, sposobu i drogi podania i rodzaju patogenu przeciw któremu szczepionka jest skierowana. Szczepionka, może zawierać dowolną dawkę bakterii, wystarczającą dla wywołania odpowiedzi odpornościowej. Dawki bakterii w zakresie pomiędzy 103 i 1010 bakterii są np. dawkami bardzo odpowiednimi.
Ewentualnie do szczepionki może być dodany jeden lub więcej związków mających aktywność adiuwanta. Adiuwanty niespecyficznie pobudzają układ odpornościowy. Wzmacniają one odpowiedź odpornościową gospodarza na szczepionkę. Przykładami znanych w nauce adiuwantów są Pełny i Niekompletny adiuwant Freund'a, witamina E, niejonowe polimery, muramylodipeptydy, ISCOM (kompleks pobudzający układ odpornościowy, przykładowo znany z europejskiego patentu EP 109942), saponiny, olej mineralny, olej roślinny i Carbopol. Adiuwantami szczególnie odpowiednimi do podawania dośluzówkowego są np. termowrażliwa toksyna z E. coli (LT) lub toksyna Cholery (CT). Innymi użytecznymi adiuwantami są, na przykład, wodorotlenek glinu, fosforan glinu lub tlenek glinu, emulsje olejowe (np. Bayol F® lub Marcol 52®), saponiny lub solubilizowana witamina E.
Zatem w korzystnej postaci szczepionki według obecnego wynalazku zawierają adiuwant.
Inne przykłady farmaceutycznie akceptowalnych nośników, lub rozcieńczalników przydatnych w obecnym wynalazku obejmują substancje stabilizujące, takie jak SPGA, węglowodany (np. sorbitol, mannitol, skrobia, sacharoza, glukoza i dekstran), białka, takie jak albumina lub kazeina, czynniki zawierające białko, takie jak surowica bydlęca lub odtłuszczone mleko i bufory (np. bufor fosforanowy).
Szczególnie, gdy taki stabilizator jest dodany do szczepionki, szczepionka jest bardzo odpowiednie do liofilizacji lub suszenia w postaci rozpyłowej.
Zatem, w bardziej korzystnej postaci, szczepionka jest w postaci zliofilizowanej lub wysuszonej rozpyłowo.
Szczepionka według obecnego wynalazku może być podana zwierzętom lub ludziom, między innymi, donosowo, przez rozpylenie, śródskórnie, podskórnie, doustnie, w postaci aerozolu lub domięśniowo. W przypadku drobiu szczepionkę podaje się do skrzydła i jako krople do oczu.
PL 206 377 B1
Kolejne wykonanie wynalazku dotyczy zastosowania bakterii zgodnie z wynalazkiem dla wytworzenia szczepionki do ochrony ludzi i zwierząt przed infekcją bakteriami Salmonella lub patologicznym skutkom infekcji.
W celu przeprowadzenia badań przesiewowych na brak/obecność przeciwciał przeciw flagellinie lub przeciw wici Salmonella w surowicy stosuje się test diagnostyczny, który może być np. prostym testem ELISA, w którym wić lub oczyszczona flagellina lub krótki polipeptyd zawierający antygenowy jej fragment powleka ścianę studzienek płytki ELISA. Inkubacja z surowicą badanych ludzi lub zwierząt, a następnie np. inkubacja ze znakowanym przeciwciałem przeciw odpowiednim przeciwciałom człowieka lub zwierzęcia może następnie ujawnić obecność lub brak przeciwciał przeciw flagellinie.
Kolejnym przykładem testu diagnostycznego jest np. inkubacja filtru typu Western zawierającego flagellinę z surowicą badanych ludzi lub zwierząt, a następnie analizę tego filtru.
Testy diagnostyczne do wykrycia przeciwciał przeciw flagellinie Salmonella są korzystnie w postaci zestawu zawierającego flagellinę w oczyszczonej postaci. Flagellina może być np. oczyszczona przy pomocy typowych technik rozdziału białka na odpowiedniej kolumnie. Inną możliwością jest rozdział na PAAGE żelu, a następnie przez Western-blotting. Na takim filtrze flagellina będzie tworzyła specyficzne prążki oddzielone od innych prążków białek Salmonella i dlatego jest również uważana za oczyszczoną. Oczyszczoną postać białka można również uzyskać przez ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej flagellinę.
Zasadniczo najprostszym sposobem sporządzenia takiego testu diagnostycznego jest zastosowanie, jak to wyjaśniono powyżej, całej oczyszczonej flagelliny. Jakkolwiek jest bardzo prawdopodobne zastosowanie jedynie części flagelliny. Pod tym warunkiem, że użyty fragment nadal zawiera antygenowe determinanty białka. Z definicji wszystkie antygenowe determinanty flagelliny będą indukowały przeciwciała. Zatem zastosowanie fragmentu flagelliny obejmującego nawet jedną pojedynczą determinantę antygenową flagelliny umożliwi jej związanie z przeciwciałem przeciw flagelinie. Test, który umożliwia rozróżnienie pomiędzy niezakażonymi, zakażonymi i zaszczepionymi ludźmi lub zwierzętami zawiera np. studzienkę A opłaszczoną flagelliną i studzienkę B opłaszczoną innym immunogenem Salmonella lub, co jest możliwe, całymi komórkami Salmonella. Surowica, która reaguje ze studzienką A i B wskazuje na zakażenie lub zaszczepienie klasyczną szczepionką, podczas gdy surowica reagująca tylko ze studzienką B dowodzi, że badane zwierzę jest zaszczepione szczepionką markerową.
P r z y k ł a d 1
Jako wyjściowy materiał dla chemicznej mutagenezy został użyty atenuowany szczep Salmonella typhimurium STMP, który był badany, jako żywa szczepionka u drobiu i świń, i powodował dobrą ochronę.
Mutageneza chemiczna
S. typhimurium STMP hodowano na agarze krwawym i sprawdzano na dodatnią aglutynację antygenu O z grupy B i aglutynację antygenu H typ 2. Pojedynczą kolonią zaszczepiano pożywkę LB i inkubowano przez 20 godz. w 37°C z napowietrzaniem. Dziesięć μΐ całonocnej hodowli rozcieńczano w 10 ml LB (3 hodowle) i inkubowano w 37°C przez 6 godz. z napowietrzaniem, aż hodowla osiągnęła OD przy 600 nm wynoszące 0,5. Dla określenia ilości żywych bakterii pobrano próbkę. Do każdej z trzech 10 ml hodowli dodano 100 μΐ trioksalenu (chemiczny mutagen z Sigma; 3 mg/ml w DMSO) i zawiesinę wysiewano na szalki Petriego o średnicy 10 cm. Zawiesinę naświetlano UV (Transilluminator UVP; długość fali 365 nm) przez 5, 10 lub 15 minut z odległości 20 cm. Dziesięć ul przeniesiono do 10 ml 0,9% NaCl, sporządzono rozcieńczenia 1/10 i 100 μΐ wysiano na płytki z agarem krwawym celem określenia poziomu przeżywalności bakterii w poddanych mutagenezie hodowlach. Hodowle, w których poziom przeżycia wynosił około 3% i 20%, hodowano w 100 ml LB, aż do momentu, gdy OD przy 600 nm wyniosło 0,5. Bakterie zbierano przez wirowanie, zawieszano w 5 ml LB i przechowywano w 30% glicerolu w -70°C.
Selekcja nieruchliwego, bezwiciowego mutanta Zmutagenizowane bakterie (3% przeżywalności; między 5000 i 10 000 niezależnych mutantów) wysiewano z podstawowego roztworu z glicerolem na trzy płytki z agarem krwawym. Bakterie zbierano w LB i OD przy 600 nm ustalano na 2,17. W LB sporządzono 6 dziesięciokrotnych rozcieńczeń, a następnie 50 ul surowicy odpornościowej przeciw H2 (Difco) dodano do 450 ul zawiesiny bakterii. Ten etap selekcji przy pomocy surowicy przeciw H włączono dla wzbogacenia zawiesiny mutantów w bezwiciowe bakterie. Zawiesinę inkubowano w 37°C przez 6 godz. z wytrząsaniem (250 obr./min.) i odwirowywano przez 1 min. przy 1000 obr./min. w mini wirówce Eppendorf w celu usunięcia kompleksów aglutynacyjnych. Na płytki z agarem krwawym wysiewano 1, 10 i 100 ul supernatantu i inkubowano przez 20 godz. w 37°C.
PL 206 377 B1
Wyniki:
Identyfikacja nieruchliwego mutanta S. typhimurium STMP
Selekcja pozbawionej wici bakterii przez inkubację z surowicą przeciw H2 zaowocowała wzrostem około 40 kolonii (rozcieńczenie 106) na płytkach zaszczepionych zawiesiną mutanta poddanego działaniu surowicy (3% przeżycia), podczas gdy żadna kolonia nie urosła na płytkach (106) zaszczepionych zawiesiną STMP poddanych działaniu surowicy. Wyniki te wskazują, że obecne mutanty nie aglutynują z surowicą odpornościową przeciw H2, prawdopodobnie pozbawione są wici. 40 kolonii badano na aglutynację H2 i za pomocą mikroskopu świetlnego na ich ruchliwość. Wszystkie mutanty były negatywne w teście na aglutynację H2, lecz tylko jeden mutant okazał się być nieruchliwym, co zaobserwowano w mikroskopie świetlnym. Nieruchliwy mutant był pozytywny w teście aglutynacji z antygenem O z grupy B. Mutant został nazwany STM2000.
Stabilność in vitro STM2000, nieruchliwego mutanta S. typhimurium STMP Fenotypową stabilność STM2000 badano przez 12 kolejnych pasaży in vitro na płytkach z agarem krwawym. W tym samym doświadczeniu również 12-krotnie pasażowano rodzicielski szczep STMP. Hodowle te obserwowano za pomocą mikroskopu świetlnego i wszystkie bakterie w hodowli mutanta nadal były nieruchliwe. Bakterie STMP były ruchliwe choć nie wszystkie komórki miały ten sam poziom ruchliwości. Obserwacja w mikroskopie elektronowym porównująca STMP i STMP2000 potwierdziła brak wici u zmutowanych bakterii.
Stabilność in vitro STM2001, nieruchliwego mutanta S. typhimurium STMP
W innym doś wiadczeniu S. typhimurium SL3261 (zdeponowany pod numerem SGSC 439, Salmonella Genetic Stock Centre, Uniwersitet of Calgary, Alberta, Kanada) zmutowano chemicznie NTG i nieruchliwe mutanty selekcjonowano, jak to opisano uprzednio. Jeden mutant, STM2001, nie wykazał reakcji z przeciwciałem monoklonalnym specyficznym przeciw flagellinie. Po 2D elektroforezie białka pokazano, że STM2001, w porównaniu ze szczepem rodzicielskim, nie ma flagelliny, której odpowiada plamka o masie 51 kDa i pi 4,7.
Stabilność genetyczną tego szczepu badano hodując go przez 50 pokoleń. Po tym czasie nadal nie zaobserwowano rewertantów: wszystkie bakterie nadal były nieruchliwe. Szczep STM2001 zdeponowano w Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, PO. box 273, 3740 AG Baarn, Holandia pod numerem dostępu CBS 108955.
P r z y k ł a d 2
Projekt doświadczenia
Szczepionki sporządzono z mającego wić i pozbawionego wici szczepu S. enteritidis (S.e.) typu fagowego 4. Bakterie hodowano na pożywce Tryptose Phosphate Broth, inaktywowanej przez dodanie formaliny do końcowego stężenia 0,5%, a następnie komórki bakteryjne zbierano przez wirowanie. Komórki zawieszano ponownie w solance buforowanej fosforanem i szczepionkę formułowano, jako emulsję woda w oleju zawierającą 5 x 109 bakterii/ml. Pięć kurcząt zaszczepiono domięśniowo szczepionką z S.e. fla+ i pięć kurcząt otrzymało szczepionkę S.e. fla-. Zaszczepiano 14- i 18-tygodniowe zwierzęta 0,5 ml szczepionki. W wieku 22 tygodni kurczęta skrwawiano i surowicę badano w układzie blokującym ELISA w teście kanapkowym z podaniem drugorzędowego przeciwciała, specyficznego dla przeciwciał przeciw g,m flagellinie z S. e. (Zijderveld, F.G, van i wsp., (1993) Vet. Quart. 15, 135-137).
Zwierzęta
Kurczęta handlowych kur niosek w wieku około 14 tygodni otrzymano z hodowli stada wolnego od Salmonella.
Wyniki:
Wszystkie pięć kurcząt, które otrzymały szczepionkę S.e fla+ serokonwertowały w ELISA specyficznym dla g,m (procent blokowania> 60%), podczas gdy pięć kurcząt zaszczepionych szczepionką fla- pozostało seronegatywne.
P r z y k ł a d 3
Doświadczenie 1
Projekt doświadczenia
Dla określenia bezpieczeństwa brojlery zaszczepiano doustnie (1 ml), podskórnie (0,5 ml) i domięśniowo (0,5 ml) posiadającym wić szczepem STMP Salmonella typhimurium, szczepem STM 2000 Salmonella typhimurium nie posiadającym wici lub szczepem typu dzikiego S. typhimurium (Salmonella typhimurium). Zwierzęta obserwowano przez tydzień po zaszczepieniu, po czym przeprowadzono pośmiertne badania kurcząt, które przeżyły.
PL 206 377 B1
Zwierzęta
Handlowe trzy tygodniowe brojlery uzyskano ze stada wolnego od Salmonella.
Wyniki:
Po zaszczepieniu zdechło 8 z 10 zwierząt, które otrzymały Salmonella typhimurium typu dzikiego (tabela 1). Sekcja zwłok dwóch kurcząt, które przeżyły a były zaszczepione szczepem typu dzikiego, ujawniła obrzmiałą wątrobę z nekrotycznymi ogniskami, obrzmiałą śledzionę i odmę osierdziową Jedno z kurcząt zaszczepionych STMP miało nieznaczny obrzęk wątroby i jedno z kurcząt zaszczepionych STM 2000 miało nieznacznie obrzękniętą śledzionę. W tych dwóch grupach nie stwierdzono żadnych innych nienormalności.
T a b e l a 1
| Grupa | STMP | STM2000 | Typ dziki |
| Dawka (CFU/ml) | O co o | 107,7 | O co o |
| Śmiertelność | 0/10a | 0/10a | 8/10b |
Grupy z różnymi indeksami górnymi różnią się znacząco (p<0,5 test wiarygodności Fishera). Doświadczenie 2
Schemat doświadczenia
Dla sprawdzenia zarówno bezpieczeństwa jak i skuteczności brojlery w wieku 3 i 15 dni zaszczepiono doustnie STMP lub STM2000, a następnie w wieku 22 dni prowokowano zakażenie szczepem Salmonella typhimurium typu dzikiego opornym na tertacyklinę.
Bezpieczeństwo oceniano przez obserwację kliniczną po szczepieniu i określeniu przybierania na wadze. Pobrano również w 10 i 22 dniu wymazy ze steku celem oznaczenia obecności szczepów szczepionkowych w przewodzie jelitowym. Wymazy zastosowano do zaszczepienia pożywki Brilliant Green Agar (BGA) bezpośrednio i po wzbogaceniu w pożywce Rappaport Vassiliades Broth (RVB). Zwierzęta obserwowano przez tydzień po prowokowanym zakażeniu, a następnie przeprowadzono pośmiertne badania kurcząt, które przeżyły. Zawartość wątrób, śledzion, wymazy ze steku i wymazy z jelita ś lepego hodowano pod ką tem zaraż ającego szczepu przez bezpoś rednie zaszczepienie BGA zawierającej tetracyklinę (BGAtet). Dodatkowo wymazy inkubowano ze wzbogaconym podłożem (zbuforowany pepton zawierający tetracyklinę), a następnie wysiewano na szalki z BGAtet.
Zwierzęta
Trzydniowe handlowe brojlery otrzymano z wolnego od Salmonella stada.
Wyniki:
Nie zaobserwowano klinicznych nienormalności po doustnym szczepieniu w wieku 3 i 15 dni. Również średni przyrost wagi grupy szczepionej nie odbiegał od grupy kontrolnej (tabela 3). Oba szczepy były obecne w wymazach ze steków szczepionych zwierząt pobranych 7 dni po szczepieniu, (tabela 2). Obserwacja, że znaczna część kurcząt w grupie zaszczepionej STMP dawała wymazy, z których otrzymano kolonie po bezpośrednim wysianiu na szalki, wskazuje na to, ż e liczba kolonii szczepu w jelitach jest wyższa niż w przypadku szczepu STM2000.
T a b e l a 2
| Wymazy STMP pozytywne | Wymazy STM2000 pozytywne | |||
| Reizolacja | Bezpośrednio | Wzbogacona | Bezpośrednio | Wzbogacona |
| Dzień 10 | 15/15a | nie wykonano | 7/15b | 14/15 |
| Dzień 22 | 10/15a | 15/15A | 4/15a | 14/15A |
Grupy z różnymi indeksami górnymi różnią się znacząco (p<0,5 test wiarygodności Fishera). Jedno z kurcząt z grupy STMP zdechło po zarażeniu (7%), w porównaniu z grupą STM 2000, gdzie nie zaobserwowano śmierci i z 80% śmiertelnością w nieszczepionej kontroli (tabela 3). Kurczęta z grupy kontrolnej, które przeżyły, również przybrały na wadze mniej niż kurczęta szczepione. Waga, którą przybrała grupa szczepiona STM2000 po ich prowokacyjnym zakażeniu, była znacząco wyższa niż waga, jaką przybrała grupa szczepiona STMP.
PL 206 377 B1
T a b e l a 3
| Grupa | STMP | STM2000 | Kontrola |
| Dawka d3 | O co co | O co tn | |
| Dawka dl5 | O co tn | O co tn | |
| Wzrost wagi d3-d22 | 636±98a | 594±72a | 624±82a |
| Dawka S.t. prowokująca d22 | O co o | O co o | O co o |
| Przyrost wagi d22-d29 | 299±45a | 339±42b | 31±39c |
| Śmiertelność | 1/15a | 0/15a | 8/10b |
Grupy z różnymi indeksami górnymi różnią się znacząco (p<0,5 test 5 wiarygodności Fishera (śmiertelność) lub dwuparametrowy test t (przyrost wagi)).
Jak pokazano w tabeli 4, nie było różnic w poziomach reizolacji organizmu prowokującego ze śledziony i wątroby. Zasiedlenie przewodu pokarmowego, jak to osądzono na podstawie reizolacji z wymazów ze steku i zawartości kątnicy, było znacząco niższe w grupie zaszczepionej STM2000.
T a b e l a 4
| Salmonella typhimurium (tetr) pozytywna | ||||
| Grupa | Zaszczepiona STMP | Zaszczepiona STM2000 | ||
| Reizolacja | Bezpośrednia | Wzbogacona | Bezpośrednia | Wzbogacona |
| Śledziona | 2/14a | nie wykonano | 1/14a | nie wykonano |
| Wątroba | 1/14a | nie wykonano | 0/15a | nie wykonano |
| Stek | 7/14a | 14/14A | 3/15a | 7/15B |
| Kątnica | 13/14a | 14/14A | 5/15b | 9/1 5b |
Grupy z różnymi indeksami górnymi różnią się znacząco (p<0,5 test wiarygodności Fishera).
P r z y k ł a d 4
Schemat doświadczenia
Dla sprawdzenia skuteczności świnie zaszczepiono doustnie STMP (109,0 CFU) lub STM2000 (109,3 cfu), po czym w dwa tygodnie później zarażano doustnie opornym na streptomycynę szczepem Salmonella typhimurium typu dzikiego (1011,0 CFU).
Rozwój szczepu prowokującego mierzono hodując próbki odchodów w piątym i ósmym dniu po prowokacji. Około 5 gramów odchodów umieszczano w wodzie z peptonem i inkubowano przez dwie godziny. Następnie wykonano seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia w pożywce RYB zawierającej streptomycynę, inkubowano przez noc, a następnie wysiewano na szalki z pożywką Tryptose Phosphate Broth zawierającą streptomycynę. Dla obliczenia wyniku reizolacji (odwrotność wartości maksymalnego 10 rozcieńczenia dającego wynik pozytywny) użyto maksymalnego rozcieńczenia, które zawierało prowokujący szczep.
W pierwszym doświadczeniu użyto ośmiu zaszczepionych STMP świń i ośmiu niezaszczepionych świń kontrolnych, W drugim doświadczeniu 9 świń zaszczepiono STM2000, a 9 nieszczepionych użyto, jako kontrolę.
Zwierzęta
W obu doświadczeniach użyto sześciotygodniowych świń SPF
Wyniki:
Jak przedstawiono w tabeli 5, oba użyte szczepy szczepionkowe były w stanie znacząco ograniczyć rozprzestrzenienie się w odchodach szczepu użytego do zarażenia.
PL 206 377 B1
T a b e l a 5
| Średnia punktacja dla reizolacji | ||
| Dzień 5 | Dzień 8 | |
| STMP (n=8) | 100,9a | 101,0a |
| Kontrola (n=8) | 106,4b | 103,8b |
| STM2000 (n-9) | 1040A | 101,3a |
| Kontrola (n-9) | 105,0B | 1049B |
Grupy z różnymi indeksami górnymi różnią się znacząco (p<0,5 test U Mann-Whitney).
Opis do figur:
Fig. 1: analiza profilu białek STM2000 i rodzicielskiego szczepu S. typhimurium STMP. Ścieżki 1, 11 i 12 markery masy cząsteczkowej, jak podano; ścieżki 2, 5 i 8 S. typhimurium STMP 12x wysiane na pożywce z agarem krwawym; ścieżki 3,6 i 9 STM2000 12 x wysiane na pożywce z agarem krwawym; ścieżki 4, 7 i 10 STM2000 2 x 5 wysiane na pożywce z agarem krwawym. Ścieżki 2, 3 i 4, całkowity profil białka, ścieżki 5, 6 i 7 osad po rozbiciu ultradźwiękami i wirowaniu; ścieżki 8, 9 i 10, supernatant po rozbiciu ultradźwiękami i wirowaniu. Białka barwiono Coomassie Brilliant Blue.
Fig. 2: Fotografie wykonane przy pomocy mikroskopu elektronowego dla badania S. typhimurium STMP (A) i nieruchliwego mutanta STM2000 (B).
Claims (12)
1. Zastosowanie bakterii z rodzaju Salmonella, która w postaci typu dzikiego niesie wici, przy czym ta bakteria nie jest zdolna do indukowania przeciwciał, przeciw co najmniej jednej determinancie antygenowej flagelliny lub wici, i adiuwanta do wytwarzania inaktywowanej szczepionki do ochrony ludzi i zwierząt przeciwko infekcji bakterią Salmonella lub patologicznym skutkom infekcji.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że bakteria nie jest zdolna do indukowania przeciwciał, przeciwko co najmniej jednej determinancie antygenowej flageliny lub wici z powodu mutacji w genie szlaku biosyntezy wici.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że mutacja jest zlokalizowana w genie flagelliny.
4. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że bakteria jest wybrana z grupy składającej się z S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi A i B, derby, hadar, heidelberg, agona i arizonae.
5. Zastosowanie bakterii z rodzaju Salmonella, która w postaci typu dzikiego niesie wici, przy czym ta bakteria nie jest zdolna do indukowania przeciwciał, przeciw co najmniej jednej determinancie antygenowej flagelliny lub wici do wytwarzania żywej atenuowanej szczepionki do ochrony ludzi i zwierzą t przeciwko infekcji bakterią Salmonella lub patologicznym skutkom infekcji.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że bakteria nie jest zdolna do indukowania przeciwciał, przeciwko co najmniej jednej determinancie antygenowej flagelliny lub wici z powodu mutacji w genie szlaku biosyntezy wici.
7. Zastosowanie wedł ug zastrz. 6, znamienne tym, ż e mutacja jest zlokalizowana w genie flagelliny.
8. Zastosowanie według zastrz. 5-7, znamienne tym, że bakteria jest wybrana z grupy składającej się z S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi A 1 B, derby, hadar, heidelberg, agona i arizonae.
9. Szczepionka do ochrony zwierzą t przeciwko salmonellozie, znamienna tym, ż e zawiera inaktywowane bakterie jak określone w zastrz. 1-4, adiuwant i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
10. Szczepionka według zastrz. 9, znamienna tym, że jest w postaci liofilizowanej lub wysuszonej rozpyłowo.
11. Szczepionka do ochrony zwierząt przeciwko salmonellozie, znamienna tym, że zawiera atenuowane bakterie jak określone w zastrz. 5-8 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
12. Szczepionka według zastrz. 11, znamienna tym, że jest w postaci liofilizowanej lub wysuszonej rozpyłowo.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99204564 | 1999-12-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL344851A1 PL344851A1 (en) | 2001-07-02 |
| PL206377B1 true PL206377B1 (pl) | 2010-08-31 |
Family
ID=8241112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL344851A PL206377B1 (pl) | 1999-12-28 | 2000-12-28 | Zastosowanie bakterii z rodzaju Salmonella oraz szczepionka do ochrony zwierząt przeciwko salmonellozie |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20010021386A1 (pl) |
| EP (1) | EP1112747B1 (pl) |
| JP (1) | JP5745731B2 (pl) |
| AT (1) | ATE269104T1 (pl) |
| AU (1) | AU783508B2 (pl) |
| BR (1) | BR0006291B1 (pl) |
| CA (1) | CA2329676A1 (pl) |
| DE (1) | DE60011560T2 (pl) |
| DK (1) | DK1112747T3 (pl) |
| ES (1) | ES2222152T3 (pl) |
| HU (1) | HU226192B1 (pl) |
| MX (1) | MXPA00012796A (pl) |
| PL (1) | PL206377B1 (pl) |
| PT (1) | PT1112747E (pl) |
| TR (1) | TR200401569T4 (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014097154A1 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Zakład Badawczo-Wdrożeniowy Ośrodka Salmonella "Immunolab" Sp. Z O.O. | A polyvalent combined immunising and/or therapeutic preparation for use in bacterial infections or food poisoning, particularly salmonellosis, a method for production of this preparation, its use and a vaccine comprising this preparation |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4751570B2 (ja) * | 2002-09-11 | 2011-08-17 | 東レ・ダウコーニング株式会社 | オルガノポリシロキサン変性多糖類およびその製造方法 |
| MY183797A (en) | 2006-09-18 | 2021-03-16 | Univ Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses |
| US7935355B2 (en) * | 2007-04-19 | 2011-05-03 | Nutritional Health Institute Laboratories, Llc | Composition and method for controlling intestinal pathogenic organisms |
| US20080260777A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Sotomayor Konky | Composition and method for controlling intestinal pathogenic organisms |
| CA2704457A1 (en) * | 2007-10-30 | 2009-05-07 | Walter Bottje | Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium |
| CA3156538C (en) | 2007-11-01 | 2023-12-12 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria |
| CA2703621C (en) | 2007-11-09 | 2022-03-22 | The Salk Institute For Biological Studies | Use of tam receptor inhibitors as antimicrobials |
| CA2787661C (en) | 2010-01-21 | 2021-10-12 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Vaccine vectors and methods of enhancing immune responses |
| CA2800830C (en) | 2010-06-09 | 2020-09-08 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Vaccine and methods to reduce campylobacter infection |
| KR101449417B1 (ko) | 2012-06-20 | 2014-10-27 | 한국외국어대학교 연구산학협력단 | 살모넬라 엔테리카의 박테리오파아지 및 그 용도 |
| EP2956165B1 (en) | 2013-02-14 | 2019-09-11 | The Board of Trustees of the University of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria or limiting eimeria infection |
| WO2014164607A1 (en) | 2013-03-11 | 2014-10-09 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Vibro-based delivery system and immune suppression |
| EP2968423A4 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-09 | Univ Arkansas | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING IMMUNE REACTIONS AGAINST ENTERAL PATHOGENES |
| EP3452069A4 (en) | 2016-05-03 | 2020-02-12 | The Board of Trustees of the University of Arkansas | Yeast vaccine vector with immunostimulating and antigenic polypeptides and method for using them |
| CN111374094B (zh) * | 2020-03-02 | 2022-04-19 | 扬州大学 | 驴源马流产沙门氏菌经皮下致非妊娠期小鼠子宫感染模型的建立方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1109179A (en) * | 1964-09-30 | 1968-04-10 | Nat Res Dev | Improvements relating to typhoid and paratyphoid vaccines |
| EP0237045B1 (en) * | 1986-03-11 | 1993-10-20 | Shionogi & Co., Ltd. | DNA encoding flagellin and vector having the same |
| CA1340817C (en) * | 1988-05-05 | 1999-11-09 | Salete Maria Cardozo Newton | Recombinant flagellin vaccines |
| US6130082A (en) * | 1988-05-05 | 2000-10-10 | American Cyanamid Company | Recombinant flagellin vaccines |
| ES2070312T5 (es) * | 1988-12-19 | 2003-05-16 | American Cyanamid Co | Vacuna de proteina de membrana exterior meningococica de clase 1. |
| AU679845B2 (en) * | 1994-02-18 | 1997-07-10 | Solidose L.L.C. | Inoculation of animals with dried, pelleted biological materials |
| GB9621091D0 (en) * | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
| US6190669B1 (en) * | 1998-05-13 | 2001-02-20 | University Of Maryland, Baltimore | Attenuated mutants of salmonella which constitutively express the Vi antigen |
-
2000
- 2000-12-19 DE DE60011560T patent/DE60011560T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-19 EP EP00204630A patent/EP1112747B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-19 PT PT00204630T patent/PT1112747E/pt unknown
- 2000-12-19 AT AT00204630T patent/ATE269104T1/de active
- 2000-12-19 DK DK00204630T patent/DK1112747T3/da active
- 2000-12-19 TR TR2004/01569T patent/TR200401569T4/xx unknown
- 2000-12-19 MX MXPA00012796A patent/MXPA00012796A/es active IP Right Grant
- 2000-12-19 ES ES00204630T patent/ES2222152T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-20 JP JP2000387225A patent/JP5745731B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-21 AU AU72453/00A patent/AU783508B2/en not_active Ceased
- 2000-12-27 HU HU0005010A patent/HU226192B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-12-27 BR BRPI0006291-0A patent/BR0006291B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-12-27 CA CA002329676A patent/CA2329676A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-27 US US09/749,025 patent/US20010021386A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-28 PL PL344851A patent/PL206377B1/pl not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-10-30 US US11/980,864 patent/US20080069843A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014097154A1 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Zakład Badawczo-Wdrożeniowy Ośrodka Salmonella "Immunolab" Sp. Z O.O. | A polyvalent combined immunising and/or therapeutic preparation for use in bacterial infections or food poisoning, particularly salmonellosis, a method for production of this preparation, its use and a vaccine comprising this preparation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TR200401569T4 (tr) | 2004-07-21 |
| HU0005010D0 (pl) | 2001-02-28 |
| DE60011560T2 (de) | 2005-08-18 |
| AU7245300A (en) | 2001-07-05 |
| AU783508B2 (en) | 2005-11-03 |
| US20010021386A1 (en) | 2001-09-13 |
| PT1112747E (pt) | 2004-10-29 |
| BR0006291B1 (pt) | 2014-02-18 |
| HUP0005010A3 (en) | 2004-07-28 |
| US20080069843A1 (en) | 2008-03-20 |
| ATE269104T1 (de) | 2004-07-15 |
| DK1112747T3 (da) | 2004-10-25 |
| BR0006291A (pt) | 2001-11-27 |
| HUP0005010A2 (en) | 2002-06-29 |
| JP5745731B2 (ja) | 2015-07-08 |
| CA2329676A1 (en) | 2001-06-28 |
| EP1112747B1 (en) | 2004-06-16 |
| PL344851A1 (en) | 2001-07-02 |
| EP1112747A1 (en) | 2001-07-04 |
| ES2222152T3 (es) | 2005-02-01 |
| DE60011560D1 (de) | 2004-07-22 |
| HU226192B1 (en) | 2008-06-30 |
| JP2001186874A (ja) | 2001-07-10 |
| MXPA00012796A (es) | 2002-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20080069843A1 (en) | Salmonella vaccine | |
| JP2002521345A (ja) | 鳥類病原体を制御するため生きた弱毒化サルモネラワクチン | |
| US8778655B2 (en) | Modified gram-negative bacteria for use as vaccines | |
| EP2528620B1 (en) | Salmonella vaccine | |
| US20110052635A1 (en) | Live attenuated salmonella vaccine | |
| US20080254062A1 (en) | Use of an avirulent bordetella mutant as a live vaccine vector | |
| Meenakshi et al. | Adjuvanted outer membrane protein vaccine protects poultry against infection with Salmonella enteritidis | |
| US11707515B2 (en) | Modified Brucella vaccine strain for the treatment of brucellosis | |
| US7045122B2 (en) | Salmonella vaccine | |
| Roland et al. | Expression of Escherichia coli antigens in Salmonella typhimurium as a vaccine to prevent airsacculitis in chickens | |
| Zhang et al. | Protection and immune responses induced by attenuatedSalmonella typhimuriumUK-1 strains | |
| Nandre et al. | Cross-protection against Salmonella Typhimurium infection conferred by a live attenuated Salmonella Enteritidis vaccine | |
| EP3166632B1 (en) | Modified bacteria for improved vaccines against brucellosis | |
| AU776864B2 (en) | Compositions and methods for treating and preventing pathogenic bacterial infection based on the essential role of DNA methylation in bacterial virulence | |
| Zhang et al. | Evaluation of safety and protective efficacy of a waaJ and spiC double deletion Korean epidemic strain of Salmonella enterica serovar Gallinarum | |
| Ochoa-Repáraz et al. | Protective ability of subcellular extracts from Salmonella Enteritidis and from a rough isogenic mutant against salmonellosis in mice | |
| KR20080105099A (ko) | 약독화 살모넬라 생백신 | |
| Pumtang-on | Investigation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli colonisation of commercial free-range chickens | |
| US20030149255A1 (en) | Bird diagnostics and treatments | |
| Whitehead | Development and assessment of an attenuated Rhodococcus equi oral vaccine that produces VapA | |
| Shao | Effects of cyclic adenosine monophosphate independent cyclic adenosine monophosphate receptor protein in recombinant attenuated Salmonella vaccines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20111228 |