DE69823188T2

DE69823188T2 - Klonierung der upd-galaktose-epimerase

Info

Publication number: DE69823188T2
Application number: DE69823188T
Authority: DE
Inventors: Morten Jorsboe; Janne Brunstedt; Guldager Steen PETERSEN
Original assignee: BIOLOG AS FREDERIKSBERG; BioLogic AS
Current assignee: BIOLOG AS FREDERIKSBERG; BioLogic AS
Priority date: 1997-05-28
Filing date: 1998-05-27
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2018-05-28
Also published as: GB9710991D0; EP0983368B1; DE69823188D1; GB2341391B; GB9927196D0; AU7446198A; ES2217554T3; EP0983368A1; GB2341391A; WO1998054334A1; NZ500635A; US6372477B1; CA2291859A1; ATE264394T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleotidsequenz, welche das Enzym codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine oder mehrere Verwendungen des Enzyms.
Es ist bekannt, daß es erwünscht ist, die Expression einer interessierenden Nukleotidsequenz ("NOI") in bestimmten Geweben eines Organismus, wie einem filamentösen Pilz (z. B. Aspergillus niger) oder sogar einer Pflanzenkultur, zu steuern. Das resultierende Protein oder Enzym kann dann in der Industrie verwendet werden. Alternativ kann das resultierende Protein oder Enzym für den Organismus selbst nützlich sein. Zum Beispiel kann es erwünscht sein, Anbaupflanzenproteinprodukte mit einer optimierten Aminosäurezusammensetzung herzustellen und so den Nährwert einer Anbaupflanze zu erhöhen. Zum Beispiel kann die Anbaupflanze als ein Futter nützlicher gemacht werden. Alternativ kann es erwünscht sein, das resultierende Protein oder Enzym zu isolieren und das Protein oder Enzym dann zur Herstellung z. B. von Nahrungsmittelzusammensetzungen zu verwenden. In diesem Zusammenhang kann das resultierende Protein oder Enzym ein Bestandteil der Nahrungsmittelzusammensetzung sein oder es kann zur Herstellung von Nahrungsmittelzusammensetzungen verwendet werden, einschließlich der Veränderung der Eigenschaften oder des Erscheinungsbildes von Nahrungsmittelzusammensetzungen. Es kann sogar erwünscht sein, den Organismus, wie einen filamentösen Pilz oder eine Anbaupflanze, dazu zu verwenden, nicht-pflanzliche Nukleotidsequenzen, wie beispielsweise für die gleichen Zwecke, zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung möchte ein Enzym bereitstellen, das für die Industrie nützlich ist, und auch eine Nukleotidsequenz, welche dieses codiert.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein UDP-Galaktose-Epimeraseenzym, erhältlich aus Guar, bereitgestellt, wobei das Enzym wenigstens die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt oder eine Aminosäuresequenz ist, welche wenigstens 98% homolog dazu ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein UDP-Galaktose-Epimeraseenzym, erhältlich aus Guar, bereitgestellt, wobei das Enzym von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die wenigstens die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz umfaßt, oder von einer Nukleotidsequenz, welche wenigstens 98% homolog dazu ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleotidsequenz bereitgestellt, welche wenigstens die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz oder eine Nu kleotidsequenz, welche wenigstens 98% homolog dazu ist, oder eine dazu komplementäre Sequenz umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein UDP-Galaktose-Epimeraseenzym bereitgestellt, welches mit einem Antikörper immunologisch reaktiv ist, der gegen ein gereinigtes UDP-Galaktose-Epimeraseenzym gemäß der vorliegenden Erfindung gerichtet ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, welches das Exprimieren einer Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Enzyms der vorliegenden Erfindung oder eines Enzyms, hergestellt nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, zur Herstellung eines Nahrungsmittels (wie eines Futters) bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, die funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Nahrungsmittel bereitgestellt, welches das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein Enzym, hergestellt nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, umfaßt.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung umfassen folgendes: ein Konstrukt, das die vorliegende Erfindung umfaßt oder in der Lage ist, diese zu exprimieren; ein Vektor, der die vorliegende Erfindung umfaßt oder in der Lage ist, diese zu exprimieren; ein Plasmid, das die vorliegende Erfindung umfaßt oder in der Lage ist, diese zu exprimieren; ein Gewebe, das die vorliegende Erfindung umfaßt oder in der Lage ist, diese zu exprimieren; ein Organ, das die vorliegende Erfindung umfaßt oder in der Lage ist, diese zu exprimieren; einen transgenen Organismus, der die vorliegende Erfindung umfaßt oder in der Lage ist, diese zu exprimieren.
Vorzugsweise umfaßt das Enzym die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz oder eine Variante, ein Homologes oder ein Fragment davon, und die Nukleotidsequenz, welches dieses codiert, umfaßt die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz oder eine Variante, ein Homologes oder ein Fragment davon.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung umfassen Verfahren des Exprimierens oder des Zulassens der Expression oder des Transformierens von einem unter der Nukleotidsequenz, dem Konstrukt, dem Plasmid, dem Vektor, der Zelle, dem Gewebe, dem Organ oder dem Organismus sowie die Produkte davon.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung umfassen Verwendungen des Enzyms zur Herstellung oder Behandlung von Nahrungsmitteln, einschließlich Tierfutter.
Einige der Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung sind, daß sie ein Enzym mit UDP-Galaktose-Epimeraseaktivität bereitstellt. UDP-Galaktose-Epimerase ist ein wichtiges Enzym, da es unter anderem die Umwandlung von UDP-D-Glucose in UDP-D-Galaktose katalysiert. Darüber hinaus kann das Enzym der vorliegenden Erfindung in bestimmten oder spezifischen Zellen oder Geweben, wie in nur einer spezifischen Zelle oder einem spezifischen Gewebe, eines Organismus, wie einer Pflanze oder, um ein weiteres mögliches Beispiel zu nennen, einem Mikroorganismus, hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Nukleotidsequenz, die das Enzym UDP-Galaktose-Epimerase codiert, welches vorzugsweise in spezifischen Zellen oder Geweben, wie solchen eines Organismus, wie einer Pflanze oder, um ein weiteres mögliches Beispiel zu nennen, eines Mikroorganismus, exprimiert werden.
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung Konstrukte, Vektoren, Plasmide, Zellen, Gewebe, Organe und Organismen, welche die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfassen, und Verfahren zum Exprimieren derselben, vorzugsweise in spezifischen Zellen oder Geweben, wie Expression in nur einer spezifischen Zelle oder einem spezifischen Gewebe, einem Organismus, wie einer Pflanze oder, um ein weiteres mögliches Beispiel zu nennen, einem Mikroorganismus.
Vorzugsweise wird das Enzym der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Nahrungsmittels verwendet. Typische Nahrungsmittel können Milchprodukte, Fleischprodukte, Geflügelprodukte, Fischprodukte und Backwaren umfassen.
Die Begriffe "Variante", "Homologes" oder "Fragment" in Bezug auf die Aminosäuresequenz für das bevorzugte UDP-Galaktose-Epimeraseenzym der vorliegenden Erfindung umfassen jede Substitution, Varriation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Hinzufügung einer (oder mehrerer) Aminosäure(n) aus oder zu der Sequenz, vorausgesetzt, daß das resultierende Enzym UDP-Galaktose-Epimeraseaktivität, vorzugsweise mit wenigstens der gleichen Aktivität des Enzyms, welches die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz umfaßt, besitzt. Insbesondere umfaßt der Begriff "Homologes" eine Homologie in Bezug auf die Struktur und/oder die Funktion. In Bezug auf Sequenzhomologie besteht vorzugsweise wenigstens 75%, besonders bevorzugt wenigstens 85%, ganz besonders bevorzugt wenigstens 90% Homologie zu einem Enzym, welches die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz umfaßt. Bevorzugter besteht wenigstens 95% und noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu einem Enzym, welches die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz umfaßt.
Die Begriffe "Variante", "Homologes" oder "Fragment" in Bezug auf die Nukleotidsequenz, welche das UDP-Galaktose-Epimeraseenzym der vorliegenden Erfindung codiert, umfassen jede Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Hinzufügung von einer (oder mehreren) Nukleinsäure(n) aus oder zu der Sequenz, vorausgesetzt, daß die resultierende Nukleotidsequenz ein Enzym mit UDP-Galaktose-Epimeraseaktivität, vorzugsweise mit wenigstens der gleichen Aktivität des Enzyms, das die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz umfaßt, codiert oder in der Lage dazu ist, dieses zu codieren. Insbesondere umfaßt der Begriff "Homologes" eine Homologie in Bezug auf Struktur und/oder Funktion, vorausgesetzt, daß die resultierende Nukleotidsequenz ein Enzym mit UDP-Galaktose-Epimeraseaktivität codiert oder in der Lage ist, es zu codieren. In Bezug auf Sequenzhomologie besteht vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu einer Sequenz, welche die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz umfaßt. Bevorzugter besteht wenigstens 95% und noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu einer Sequenz, welche die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz umfaßt.
Die oben genannten Begriffe sind synonym zu allelischen Variationen der Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Sequenzen, die zu den oben genannten Nukleotidsequenzen komplementär sind. Der Begriff "komplementär" bedeutet, daß die vorliegende Erfindung Nukleotidsequenzen umfaßt, die an die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, wie sie oben definiert ist, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren können.
Der Begriff "Nukleotid" in Bezug auf die vorliegende Erfindung umfaßt genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und RNA. Vorzugsweise bedeutet er DNA, besonders bevorzugt bedeutet er cDNA.
Der Begriff "Konstrukt" – welcher synonym zu Begriffen, wie "Konjugat", "Kassette" und "Hybrid", ist – umfaßt die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in direkter oder indirekter Anbindung an einen Promotor. Ein Beispiel für eine indirekte Anbindung ist das Vorsehen einer geeigneten Abstandshaltergruppe, wie einer Intron-Sequenz, wie das Sh1-Intron oder das Adh-Intron, zwischen dem Promotor und der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung. Das gleiche gilt für den Begriff "vereinigt" in Bezug auf die vorliegende Erfindung, welcher eine direkte oder indirekte Anbindung umfaßt. In jedem Fall umfassen die Begriffe nicht die natürliche Kombination der Nukleotidsequenz, die das Enzym codiert, welche normalerweise mit dem Wildtyp-Genpromotor assoziiert ist und wenn sie beide in ihrer natürlichen Umgebung sind. Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, die funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft ist.
Das Konstrukt kann sogar einen Marker enthalten oder exprimieren, welcher die Selektion des genetischen Konstrukts in z. B. einem filamentösen Pilz, vorzugsweise der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus niger, oder Pflanzen, wie Kartoffeln, Zuckerrübe etc., in welche es überführt wurde, erlaubt. Alternativ oder zusätzlich kann das Konstrukt sogar einen Marker enthalten oder exprimieren, welcher die Selektion des genetischen Konstrukts in z. B. einem Pflanzensamen, wie Mais, Weizen oder Gerste, in welchen es überführt wurde, erlaubt. Es existieren viele Marker, die verwendet werden können, wie z. B. solche, die Mannose-6-Phosphatisomerase (insbesondere für Pflanzen) codieren, oder solche Marker, die eine Antibiotikaresistenz bereitstellen – z. B. Resistenz gegen G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin und Gentamycin.
Der Begriff "Vektor" umfaßt Expressionsvektoren und Transformationsvektoren.
Der Begriff "Expressionsvektor" bedeutet ein Konstrukt, das zur Expression in vivo oder in vitro in der Lage ist.
Der Begriff "Transformationsvektor" bedeutet ein Konstrukt, das von einer Spezies zu einer anderen übertragen werden kann – wie von einem E. coli-Plasmid auf einen filamentösen Pilz, vorzugsweise der Gattung Aspergillus. Es kann auch ein Konstrukt sein, das von einem E. coli-Plasmid auf ein Agrobacterium und auf eine Pflanze übertragen werden kann.
Der Begriff "Gewebe" umfaßt isoliertes Gewebe und Gewebe innerhalb eines Organs.
Der Begriff "Organismus" umfaßt in Bezug auf die vorliegende Erfindung jeden Organismus, der die Nukleotidsequenz, die das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder das davon erhaltene Expressionsprodukt enthalten könnte und worin die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert werden kann, wenn sie in dem Organismus vorhanden ist.
Der Organismus kann eine Pflanze sein.
Der Organismus kann ein filamentöser Pilz sein, vorzugsweise der Gattung Aspergillus, besonders bevorzugt Aspergillus niger.
Andere bevorzugte Organismen umfassen alle geeigneten anderen Mikroorganismen, wie beispielsweise einen unter Bacillus, Aspergillus oryzae, A. tubigensis, A. awamori, Trichoderma reesei, T. viride und T. longibrachiatum.
Der Begriff "transgener Organismus" umfaßt in Bezug auf die vorliegende Erfindung jeden Organismus, der die Nukleotidsequenz, welche das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder das davon erhaltene Expressionsprodukt umfaßt, wobei die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in dem Organismus exprimiert werden kann. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz in das Genom des Organismus aufgenommen.
Daher umfaßt der transgene Organismus der vorliegenden Erfindung einen Organismus mit irgendeinem von oder Kombinationen aus der Nukleotidsequenz, die das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, Konstrukten gemäß der vorliegenden Erfindung, Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung, Plasmiden gemäß der vorliegenden Erfindung, Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung, Geweben gemäß der vorliegenden Erfindung oder die Produkte davon. Zum Beispiel kann der transgene Organismus auch die Nukleotidsequenz umfassen, die das Enzym der vorliegenden Erfindung unter der Kontrolle eines Promotors codiert.
Der Begriff "transgener Organismus" umfaßt nicht die native codierende Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in ihrer natürlichen Umgebung, wenn sie unter der Kontrolle ihres nativen Promotors ist, und welche auch in ihrer natürlichen Umgebung vorliegt. Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung nicht das native Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn es in seiner natürlichen Umgebung vorliegt und wenn es von seiner nativen codierenden Nukleotidsequenz, welche auch in ihrer natürlichen Umgebung vorliegt, exprimiert wurde und wenn diese Nukleotidsequenz unter der Kontrolle ihres nativen Promotors, welcher auch in seiner natürlichen Umgebung vorliegt, ist.
Die transformierte Zelle oder der transformierte Organismus könnte annehmbare Mengen des gewünschten Expressionsprodukts herstellen, welches von der Zelle oder dem Organismus einfach erhältlich wäre.
Vorzugsweise umfaßt das Konstrukt der vorliegenden Erfindung die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und einen Promotor.
Der Begriff "Promotor" wird in dem auf dem Gebiet üblichen Sinne verwendet, z. B. eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle in der Jacob-Monod-Theorie der Genexpression.
Beispielhaft kann der Promotor der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung ein α-Amy 1-Promotor (auch bekannt als der Amy 1-Promotor, der Amy 637-Promotor oder der α-Amy 637-Promotor) sein, wie er in der PCT-Patentanmeldung PCT/EP95/02195 (welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist) beschrieben ist. Alternativ kann der Promotor für die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung der α-Amy 3-Promotor (auch bekannt als der Amy 3-Promotor, der Amy 351-Promotor oder der α-Amy 351-Promotor) sein, wie er in der PCT-Patentanmeldung PCT/EP95/02196 (welche durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist) beschrieben ist. Alternativ könnte der Promotor der Glucanase-Promotor – manchmal bezeichnet als der egla-Promotor – sein, wie er in der PCT-Patentanmeldung PCT/EP96/01008 (welche durch Bezugnahme hierin aufge nommen ist) beschrieben ist. Alternativ könnte der Promotor der Arabinofuranosidase-Promotor sein, wie er in der PCT-Patentanmeldung PCT/EP96/01009 (welche durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist) beschrieben ist.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Nukleotidsequenzen könnte der Promotor für die Verwendung bei der Expression der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich Merkmale umfassen, um die Expression in einem geeigneten Wirt sicherzustellen oder zu erhöhen. Zum Beispiel können die Merkmale konservierte Bereiche sein, wie eine Pribnow-Box oder eine TATA-Box. Die Promotoren können auch andere Sequenzen enthalten, um die Expressionsniveaus der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung zu bewirken (wie aufrechterhalten, verstärken oder erniedrigen). Zum Beispiel umfassen geeignete andere Sequenzen das Sh1-Intron oder ein Adh-Intron. Andere Sequenzen umfassen induzierbare Elemente – wie durch Temperatur, chemisch, durch Licht oder durch Streß induzierbare Elemente. Andere geeignete Elemente zur Verstärkung der Transkription oder Translation können vorhanden sein. Ein Beispiel für das letztgenannte Element ist die TMV-5'-Signalsequenz (siehe Sleat Gene 217 [1987] 217–225 und Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Kombinationen von Promotoren und/oder Nukleotidsequenzen, die Proteine oder rekombinante Enzyme und/oder Elemente codieren.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung von Promotoren zum Exprimieren einer Nukleotidsequenz, welche das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, wobei ein Teil des Promotors inaktiviert ist, worin der Promotor aber nach wie vor als ein Promotor funktionieren kann. Eine teilweise Inaktivierung eines Promotors ist in manchen Fällen vorteilhaft. Insbesondere ist es bei dem Amy 351-Promotor, der oben erwähnt wurde, möglich, einen Teil davon zu inaktivieren, so daß der teilweise inaktivierte Promotor die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in einer spezifischeren Art und Weise exprimiert, wie beispielsweise in nur einem spezifischen Gewebetyp oder Organ.
Der Begriff "teilweise Inaktivierung" bedeutet, daß das Expressionsmuster des Promotors modifiziert ist, wobei aber der teilweise inaktivierte Promotor nach wie vor als ein Promotor funktioniert. Jedoch, wie es oben erwähnt ist, ist der modifizierte Promotor in der Lage, das Nukleotid der vorliegenden Erfindung in wenigstens einem (aber nicht allen) spezifischen Gewebe des ursprünglichen Promotors zu exprimieren. Ein solcher Promotor ist der Amy 351-Promotor, welcher oben beschrieben ist. Beispiele für eine teilweise Inaktivierung umfassen Veränderung des Faltungsmusters der Promotorsequenz oder das Binden von Spezies an Teile der Nukleotidsequenz, so daß ein Teil der Nukleotidsequenz von z. B. RNA-Polymerase nicht erkannt wird. Ein weiterer und bevorzugter Weg der teilweisen Inaktivierung des Promotors besteht darin, ihn unter Ausbildung von Fragmenten davon zu verkürzen. Ein weiterer Weg bestünde darin, wenigstens einen Teil der Sequenz zu mutieren, so daß die RNA-Polymerase an diesen Teil oder einen anderen Teil nicht binden kann. Eine weitere Modifikation besteht darin, die Bindungsstellen für regulatorische Proteine, z. B. das CreA-Protein, welches aus filamentösen Pilzen dafür bekannt ist, eine Unterdrückung eines Produkts des Kohlenstoffabbaus auszuüben, zu mutieren und damit die Abbauproduktunterdrückung des nativen Promotors aufzuheben.
Die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung kann vor, während oder nach der Expression eines weiteren NOI exprimiert werden. Hierin kann die andere NOI jede geeignete interessierende Nukleotidsequenz (oder -sequenzen) sein. Die andere NOI kann jedes Nukleotid sein, das für den in Frage kommenden Organismus (z. B. filamentöser Pilz, vorzugsweise der Gattung Aspergillus, oder eine Pflanze) entweder fremd oder natürlich ist. Typische Beispiele anderer NOIs umfassen Nukleotidsequenzen, die Proteine und Enzyme codieren, welche metabolische und katabolische Prozesse modifizieren. Die andere NOI kann ein Mittel zum Einbringen oder Verstärken einer Pathogenresistenz codieren. Die andere NOI kann auch ein Antisense-Konstrukt zum Modifizieren der Expression von natürlichen Transkripten, die in den relevanten Geweben vorhanden sind, sein. Die andere NOI kann auch ein nicht-natives Protein eines filamentösen Pilzes oder eine Verbindung, die für Tiere oder Menschen vorteilhaft ist, codieren. Beispiele für andere NOIs umfassen Pektinasen, Pektindepolymerasen, Polygalakturonasen, Pektatlyasen, Pektinlyasen, Rhamno-Galakturonasen, Hemizellulasen, Endo-β-Glucanasen, Arabinasen oder Acetylesterasen oder Kombinationen davon sowie Antisense-Sequenzen davon. Die andere NOI kann ein Protein sein, das einem Nahrungsmittel oder einer Anbaupflanze Nährwert verleiht. Typische Beispiele umfassen Pflanzenproteine, welche die Bildung von Anti-Ernährungsfaktoren hemmen, und Pflanzenproteine, die eine bevorzugtere Aminosäurezusammensetzung haben (z. B. einen höheren Lysingehalt als eine nicht-transgene Pflanze).
Die andere NOI kann auch ein Enzym codieren, das bei der Nahrungsmittelverarbeitung verwendet werden kann, wie Chymosin, Thaumatin und α-Galaktosidase. Die andere NOI kann eine Nukleotidsequenz sein, die irgendeines unter einem Pesttoxin, einem Antisense-Transkript, wie demjenigen für Patatin oder α-Amylase, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (z. B. siehe EP-A-0 455 316), einem Proteaseenzym, einer Glucanase oder genomischer β-1,4-Endoglucanase codiert.
Die andere NOI kann die Nukleotidsequenz sein, die das Arabinofuranosidaseenzym codiert, welches Gegenstand der PCT-Patentanmeldung PCT/EP96/01009 (welche durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist) ist. Die andere NOI kann irgendeine der Nukleotidsequenzen sein, welche die ADP-Glucosepyrophosphorylaseenzyme codieren, welche Gegenstand der PCT-Patentanmeldung PCT/EP94/01082 (welche durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist) sind. Die andere NOI kann irgendeine der Nukleotidsequenzen sein, welche das α-Glucanlyaseenzym codieren, welches in der PCT-Patentanmeldung PCT/EP94/03397 (welche durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist) beschrieben sind. Die andere NOI kann irgendeine der Nukleotidsequenzen sein, welche das Gluca naseenzym codieren und die in der PCT-Patentanmeldung PCT/EP96/01008 (welche durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist) beschrieben sind.
Der Wirtsorganismus kann ein prokaryontischer oder ein eukaryontischer Organismus sein. Beispiele für geeignete prokaryontische Wirte umfassen E. coli und Bacillus subfilis. Lehren bezüglich der Transformation von prokaryontischen Wirten sind auf dem Gebiet gut dokumentiert, siehe beispielsweise Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Wenn ein prokaryontischer Wirt verwendet wird, dann kann es notwendig sein, die Nukleotidsequenz vor einer Transformation in geeigneter Weise zu modifizieren – wie beispielsweise durch Entfernen von Introns.
Vorzugsweise ist in einem, ausgewählt unter dem Plasmid, dem Vektor, wie einem Expressionsvektor oder einem Transformationsvektor, der Zelle, dem Gewebe, dem Organ, dem Organismus oder dem transgenen Organismus, der Promotor in Kombination mit wenigstens einer NOI vorhanden.
Vorzugsweise werden der Promotor und die NOI in dem transgenen Organismus stabil aufrechterhalten. Zum Beispiel können der Promotor und die NOI (wie beispielsweise wenigstens die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung) in dem transgenen Organismus in einem stabilen extrachromosomalen Konstrukt aufrechterhalten werden. Dies ist für transgene Bakterien und Hefen oder auch für einige filamentöse Pilze bevorzugt. Alternativ können der Promotor und die NOI (wie beispielsweise wenigstens die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung) in das Genom des transgenen Organismus stabil aufgenommen sein. Dies ist für einige transgene Bakterien und Hefe und für die meisten filamentösen Pilze bevorzugt.
Ein möglicher bevorzugter transgener Organismus ist ein filamentöser Pilz, vorzugsweise der Gattung Aspergillus, besonders bevorzugt Aspergillus niger. Alternativ kann der transgene Organismus eine Hefe sein. Der transgene Organismus kann auch eine Pflanze sein, wie beispielsweise eine monokote oder dikote Pflanze.
Ein möglicher bevorzugter Wirtsorganismus für die Expression der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und/oder für die Herstellung des Enzyms der vorliegenden Erfindung ist ein Organismus der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus niger. In diesem Zusammenhang kann ein transgener Aspergillus gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem man den Anleitungen von Rambosek, J. und Leach, J. 1987 (Recombinant DNA in filamentous fungi: Progress and Prospects. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6: 377–393), Davis, R. W. 1994 (Heterologous gene expression and protein secretion in Aspergillus. In: Martinelli S. D., Kinghorn, J. R. (Herausgeber) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology, Band 29. Elsevier Amsterdam 1994. S. 525–560), Balance, D. J. 1991 (Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview of Fungal Gene structure. In: Leong, S. A., Berka, R. M. (Herausgeber) Molecular Industrial Mycology. Systems and Appli cations for Filamentous Fungi. Marcel Dekker Inc. New York 1991. S. 1–29) und Turner, G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli, S. D., Kinghorn, J. R. (Herausgeber) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology Band 29, Elsevier Amsterdam 1994. S. 641–666) folgt. Die folgende Erläuterung liefert eine Zusammenfassung dieser Lehren zur Herstellung von transgenem Aspergillus gemäß der vorliegenden Erfindung.
Für fast ein Jahrhundert wurden filamentöse Pilze in breitem Maße in vielen Industriezweigen für die Herstellung von organischen Verbindungen und Enzymen verwendet. Zum Beispiel verwendeten traditionelle japanische Koji- und Soja-Fermentationen Aspergillus sp. Darüber hinaus wurde Aspergillus niger in diesem Jahrhundert zur Herstellung von organischen Säuren, insbesondere Zitronensäure, und zur Herstellung verschiedener Enzyme für die Verwendung in der Industrie eingesetzt.
Es gibt zwei Hauptgründe, warum filamentöse Pilze in der Industrie in so breitem Maße verwendet wurden. Erstens können filamentöse Pilze hohe Mengen an extrazellulären Produkten herstellen, z. B. Enzyme und organische Verbindungen, wie Antibiotika oder organische Säuren. Zweitens können filamentöse Pilze auf preiswerten Substraten wachsen, wie Getreiden, Kleie, Rübenpulpe etc. Aus den gleichen Gründen wurden filamentöse Pilze interessante Organismen als Wirte für heterologe Expression gemäß der vorliegenden Erfindung.
Zur Herstellung des transgenen Aspergillus werden Expressionskonstrukte durch Einsetzen eines NOI in ein Konstrukt, das für eine Expression in filamentösen Pilzen ausgelegt ist, hergestellt.
Es wurden verschiedene Arten von Konstrukten, die für heterologe Expression verwendet wurden, entwickelt. Die Konstrukte enthalten einen Promotor und die NOI, welche in Pilzen aktiv ist. Beispiele für Promotoren umfassen einen Pilzpromotor für ein in hohem Maße exprimiertes extrazelluläres Enzym, wie den Glucoamylasepromotor oder den α-Amylasepromotor. Die NOI kann mit einer Signalsequenz vereinigt sein, welche das Protein, das von der NOI codiert wird, so steuert, daß es ausgeschieden wird. Üblicherweise wird eine Signalsequenz mit Pilzursprung verwendet. Ein Terminator, der in Pilzen aktiv ist, schließt das Expressionssystem ab.
Es wurde eine weitere Art eines Expressionssystems in Pilzen entwickelt, bei dem die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem kleineren oder größeren Teil einer Pllznukleotidsequenz, die ein stabiles Protein codiert, vereinigt ist. Dieser Aspekt kann das Protein, welches von der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung codiert wird, stabilisieren. In solch ein System kann eine Spaltstelle, die von einer spezifischen Protease erkannt wird, zwischen das Pilzprotein und das Protein, das von der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung (oder auch einer anderen NOI) codiert wird, eingesetzt werden, so daß das hergestellte Fusionsprotein an dieser Position von der spezifischen Protease gespalten werden kann, wodurch das Protein, das von der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung (oder auch einer anderen NOI) codiert wird, freigesetzt wird. Zum Beispiel kann man an einer Stelle, welche von einer KEX-2-artigen Peptidase erkannt wird, die man in wenigstens einigen Aspergilli findet (Broekhuijsen et al. 1993 J Biotechnol 31 135–145), eingesetzt werden. Solch ein Fusionsprotein führt zu einer Spaltung in vivo, was in der Herstellung des exprimierten Produkts und nicht eines größeren Fusionsproteins resultiert.
Heterologe Expression in Aspergillus wurde für mehrere Nukleotidsequenzen, die Bakterien-, Pilz-, Vertebraten- und Pflanzenproteine codieren, beschrieben. Die Proteine können intrazellulär deponiert werden, wenn die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung (oder eine andere NOI) nicht mit einer Signalsequenz vereinigt ist. Solche Proteine werden sich in dem Cytoplasma ansammeln und werden üblicherweise nicht glycosyliert, was für einige Bakterienproteine ein Vorteil sein kann. Wenn die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung (oder einer anderen NOI) mit einer Signalsequenz ausgestattet ist, wird sich das Protein extrazellulär ansammeln.
In Bezug auf Produktstabilität und Wirtsstammodifikationen sind einige heterologe Proteine nicht sehr stabil, wenn sie in die Kulturflüssigkeit von Pilzen ausgeschieden werden. Die meisten Pilze produzieren mehrere extrazelluläre Proteasen, welche heterologe Proteine abbauen. Um dieses Problem zu vermeiden, wurden spezielle Pilzstämme mit verminderter Proteaseproduktion als Wirt für eine heterologe Produktion verwendet.
Für die Transformation von filamentösen Pilzen wurden mehrere Transformationsprotokolle für viele filamentöse Pilze entwickelt (Ballance 1991, ibid). Viele von diesen basieren auf einer Herstellung von Protoplasten und dem Einbringen von DNA in die Protoplasten unter Verwendung von PEG und Ca²⁺-Ionen. Die transformierten Protoplasten regenerieren dann, und die transformierten Pilze werden unter Verwendung verschiedener Selektionsmarker selektiert. Unter den für eine Transformation verwendeten Markern gibt es eine Anzahl von auxotrophen Markern, wie argB, trpC, niaD und pyrG, Antibiotikaresistenzmarkern, wie Benomylresistenz, Hygromycinresistenz und Phleomycinresistenz. Ein allgemein verwendeter Transformationsmarker ist das amdS-Gen von A. nidulans, welches es in einer hohen Kopienzahl dem Pilz erlaubt, mit Acrylamid als der einzigen Stickstoffquelle zu wachsen.
In einer weiteren Ausführungsform kann der transgene Organismus eine Hefe sein. In diesem Zusammenhang wurde Hefe auch in breitem Maße als ein Vehikel für heterologe Genexpression verwendet. Die Spezies Saccharomyces cerevisiae hat eine lange Geschichte der industriellen Verwendung, einschließlich ihrer Verwendung für heterologe Genexpression. Die Expression von heterologen Nukleotidsequenzen in Saccharomyces cerevisiae wurde von Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D. R. Berry et al., Herausgeber, S. 401–429, Allen und Unwin, London) und King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E. F. Walton und G. T. Yarronton, Herausgeber, S. 107–133, Blackie, Glasgow) besprochen.
Aus mehreren Gründen ist Saccharomyces cerevisiae für eine heterologe Nukleotidsequenzexpression gut geeignet. Erstens ist sie nicht pathogen für den Menschen, und sie ist nicht in der Lage, bestimmte Endotoxine herzustellen. Zweitens hat sie eine lange Geschichte der sicheren Verwendung nach Jahrhunderten der kommerziellen Ausnutzung für verschiedene Zwecke. Dies führte zu einer breiten öffentlichen Akzeptanz. Drittens hat die umfangreiche kommerzielle Verwendung und Forschung, die auf den Organismus angewendet wurde, zu einer Fülle an Kenntnissen über die Genetik und Physiologie sowie die Fermentationseigenschaften von Saccharomyces cerevisiae in großem Maßstab geführt.
Eine Übersicht der Prinzipien von heterologer Genexpression in Saccharomyces cerevisiae und Abscheidung von Genprodukten wird von Hinchclifte E. Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Band 5, Anthony H. Rose und J. Stuart Harrison, Herausgeber, 2. Auflage, Academic Press Ltd.) gegeben.
Es stehen mehrere Arten von Hefevektoren zur Verfügung, einschließlich integrativer Vektoren, welche für ihre Aufrechterhaltung eine Rekombination mit dem Wirtsgenom erfordern, und autonom replizierender Plasmidvektoren.
Zur Herstellung der transgenen Saccharomyces werden Expressionskonstrukte hergestellt, indem man die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in ein Konstrukt einsetzt, das für eine Expression in Hefe ausgelegt ist. Es wurden mehrere Arten von Konstrukten entwickelt, die für eine heterologe Expression verwendet werden. Die Konstrukte enthalten einen in Hefe aktiven Promotor, der mit der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung vereinigt ist, wobei üblicherweise ein Promotor mit Hefeursprung, wie der Gal1-Promotor, verwendet wird. Üblicherweise wird eine Signalsequenz mit Hefeursprung, wie die Sequenz, die das SUC2-Signalpeptid codiert, verwendet. Ein in Hefe aktiver Terminator schließt das Expressionssystem ab.
Für die Transformation von Hefe wurden mehrere Transformationsprotokolle entwickelt. Zum Beispiel kann eine transgene Saccharomyces gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem man den Lehren von Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929), Beggs, J. D. (1978, Nature, London, 275, 104) und Ito, H. et al. (1983, J Bacteriology 153, 163–168) folgt.
Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung verschiedener Selektionsmarker selektiert. Unter den für die Transformation verwendeten Markern gibt es eine Anzahl auxotropher Marker, wie LEU2, HIS4 und TRP1, und dominanter Antibiotikaresistenzmarker, wie Aminoglycosidantibiotikamarker, z. B. G418.
Ein weiterer Wirtsorganismus ist eine Pflanze. Obwohl das Enzym und die Nukleotidsequenz, welche dieses codiert, in der EP-B-0 470 145 und der CA-A-2 006 454 nicht offenbart sind, liefern diese zwei Dokumente einige nützliche Hintergrunderläuterungen bezüglich der Arten von Techniken, die zur Herstellung von transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Einige dieser Hintergrundlehren sind nun in der folgenden Erläuterung enthalten.
Das Grundprinzip bei der Konstruktion von genetisch veränderten Pflanzen besteht darin, genetische Information in das Pflanzengenom einzufügen, so daß man eine stabile Aufrechterhaltung des eingefügten genetischen Materials erhält.
Es gibt mehrere Techniken zum Einfügen der genetischen Information, wobei die zwei Hauptprinzipien ein direktes Einbringen der genetischen Information und das Einbringen der genetischen Information unter Verwendung eines Vektorsystems sind. Eine Besprechung der allgemeinen Techniken kann man in den Artikeln von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–255) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994 17–27) finden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Vektorsystem, welches eine Nukleotidsequenz oder ein Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung trägt und welches in der Lage ist, die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt in das Genom eines Organismus, wie einer Pflanze, einzuführen.
Das Vektorsystem kann einen Vektor umfassen, aber es kann auch zwei Vektoren umfassen. Im Falle von zwei Vektoren wird das Vektorsystem normalerweise als ein binäres Vektorsystem bezeichnet. Binäre Vektorsysteme sind ausführlicher bei Gynheun An et al. (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1–19 beschrieben.
Ein umfangreich verwendetes System für die Transformation von Pflanzenzellen mit einer vorgegebenen Nukleotidsequenz oder einem Konstrukt basiert auf der Verwendung eines Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens oder eines Ri-Plasmids von Agrobacterium rhizogenes, An et al., (1986), Plant Physiol, 81, 301–305 und Butcher, D. N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, Herausgeber: D. S. Ingrams und J. P. Helgeson, 203–208. Es wurden mehrere verschiedene Ti- und Ri-Plasmide konstruiert, die für die Konstruktion der oben beschriebenen Pflanzen- oder Pflanzenzellkonstrukte geeignet sind. Ein nicht beschränkendes Beispiel für solch ein Ti-Plasmid ist pGV3850.
Die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt der vorliegenden Erfindung sollten vorzugsweise in das Ti-Plasmid zwischen die terminalen Sequenzen der T-DNA oder in der Nähe einer T-DNA-Sequenz eingesetzt werden, um eine Zerstörung der Sequenzen, welche die T-DNA-Grenzen unmittelbar umgeben, zu vermeiden, da wenigstens eine dieser Regionen für das Einsetzen von modifizierter T-DNA in das Pflanzengenom wichtig zu sein scheint.
Wie es aus der vorangegangenen Erläuterung klar wird, ist, wenn der Organismus eine Pflanze ist, das Vektorsystem der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein solches, welches die Sequenzen enthält, die notwendig sind, um die Pflanze zu infizieren (z. B. die vir-Region), und wenigstens ein Grenzstück einer T-DNA-Sequenz, wobei das Grenzstück auf dem gleichen Vektor wie das genetische Konstrukt angeordnet ist.
Vorzugsweise ist das Vektorsystem ein Ti-Plasmid des Agrobacterium tumefaciens oder ein Ri-Plasmid des Agrobacterium rhizogenes oder ein Derivat davon, da diese Plasmide gut bekannt sind und in breitem Maße bei der Konstruktion von transgenen Pflanzen verwendet werden und viele Vektorsysteme bestehen, welche auf diesen Plasmiden und Derivaten davon basieren.
Bei der Konstruktion einer transgenen Pflanze kann die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt der vorliegenden Erfindung zuerst in einem Mikroorganismus konstruiert werden, in welchem der Vektor replizieren kann und welcher vor dem Einsetzen in die Pflanze leicht zu manipulieren ist. Ein Beispiel für einen geeigneten Mikroorganismus ist E. coli, aber es können auch andere Mikroorganismen mit den oben genannten Eigenschaften verwendet werden. Wenn ein Vektor eines Vektorsystems, wie es oben definiert ist, in E. coli konstruiert wurde, wird er, wenn dies erforderlich ist, in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, z. B. Agrobacterium tumefaciens, übertragen. Das Ti-Plasmid, welches die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt der Erfindung beherbergt, wird somit vorzugsweise in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, z. B. A. tumefaciens, überfährt, um eine Agrobacterium-Zelle zu erhalten, welche die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt der Erfindung beherbergt, wobei die DNA anschließend in die zu modifizierende Pflanzenzelle überführt wird.
Wie es in der CA-A-2 006 454 berichtet wird, ist eine große Menge an Klonierungsvektoren verfügbar, welche ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt, enthalten. Die Vektoren umfassen z. B. pBR322, die pUC-Reihe, die M13 mp-Reihe, pACYC 184 etc.
Auf diese Weise kann die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt der vorliegenden Erfindung in einer geeigneten Restriktionsposition in dem Vektor eingebracht werden. Das enthaltene Plasmid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird dann gewonnen und anschließend analysiert – wie beispielsweise durch eine oder mehrere der folgenden Techniken: Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse, Elektroforese und weitere biochemische und molekularbiologische Methoden. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz geschnitten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Sequenz kann in das gleiche oder ein anderes Plasmid kloniert werden.
Nach jedem Verfahren des Einbringens des gewünschten Konstrukts oder der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in die Pflanzen kann das Vorhandensein und/oder Einsetzen von weiteren DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wenn z. B. für die Transformation das Ti- oder Ri-Plasmid der Pflanzenzellen verwendet wird, kann wenigstens die rechte Grenze und häufig jedoch die rechte und die linke Grenze der Ti- und Ri-Plasmid-T-DNA als flankierende Bereiche der eingeführten Nukleotidsequenzen verbunden werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen wurde intensiv untersucht und ist in der EP-A-120 516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Alblasserdam, 1985, Kapitel V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1–46; und An et al., EMBO J. (1985) 4: 277–284, beschrieben.
Direkte Infektion von Pflanzengeweben mittels Agrobacterium ist eine einfache Technik, welche in breitem Maße verwendet wurde und bei Butcher, D. N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, Herausgeber: D. S. Ingrams und J. P. Helgeson, 203–208 beschrieben ist. Für weitere Lehren zu diesem Thema siehe Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994 17–27). Mit dieser Technik kann eine Infektion einer Pflanze an einem bestimmten Teil oder Gewebe der Pflanze, d. h. an einem Teil eines Blattes, einer Wurzel, eines Stamms oder einem anderen Teil der Pflanze, durchgeführt werden.
Bei direkter Infektion von Pflanzengeweben durch Agrobacterium, welches den Promotor und die NOI trägt, wird eine zu infizierende Pflanze typischerweise verwundet, z. B. durch Schneiden der Pflanze mit einer Rasierklinge oder Punktieren der Pflanze mit einer Nadel oder Reiben der Pflanze mit einem Schleifmaterial. Die Wunde wird dann mit dem Agrobacterium inokuliert. Die inokulierte Pflanze oder der Pflanzenteil wird dann auf einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet und zu reifen Pflanzen entwickeln gelassen.
Wenn Pflanzenzellen konstruiert werden, können diese Zellen nach gut bekannten Gewebekulturverfahren gezüchtet und aufrechterhalten werden, wie beispielsweise durch Kultivieren der Zellen in einem geeigneten Kulturmedium, das mit den notwendigen Wachstumsfaktoren, wie Aminosäuren, Pflanzenhormonen, Vitaminen etc., versetzt ist. Eine Regenerierung der transformierten Zellen zu genetisch modifizierten Pflanzen kann unter Anwendung bekannter Verfahren für die Regenerierung von Pflanzenzellen aus Zell- oder Gewebekulturen erreicht werden, z. B. durch Auswählen transformierter Triebe unter Verwendung eines Antibiotikums und durch Subkultivierung der Triebe auf einem Medium, welches die geeigneten Nährstoffe, Pflanzenhormone etc. enthält.
Weitere Lehren bezüglich Pflanzentransformation kann man in der EP-A-0 449 375 finden.
Zusammengefaßt liefert die vorliegende Erfindung ein UDP-Galaktose-Epimeraseenzym und eine Nukleotidsequenz, welche dieses codiert.
Die folgenden Proben wurden nach dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle "The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd." (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Schottland, Vereinigtes Königreich, AB2 1RY, am 23. Mai 1997 hinterlegt:

1. E. coli DH5αpGEPl42. Die Hinterlegungsnummer ist NCIMB 40881. NCIMB 40881 enthält den Klon GEPI42, welcher SEQ ID NO: 1 umfaßt.
2. E. coli DH5αpGEPI48. Die Hinterlegungsnummer ist NCIMB 40882. NCIMB 40882 enthält den Klon GEPI48, welcher SEQ ID NO: 2 umfaßt.

Besonders bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen daher codierende Nukleotidsequenzen, die von diesen Hinterlegungen erhältlich sind, einschließlich Expressionsvektoren, Konstrukte, Organismen und transgene Organismen, welche diese gleichen Sequenzen oder Plasmide enthalten.
Somit ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung erhältlich von der Hinterlegung mit der Nummer NCIMB 40881 oder NCIMB 40882, oder sie ist eine Variante, ein Homologes oder ein Fragment davon.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung von der Hinterlegung mit der Nummer NCIMB 40881 oder NCIMB 40882 erhältlich.
Die vorliegende Erfindung wird nun nur beispielhaft beschrieben.
Klonierung und teilweise Charakterisierung von UDP-Galaktose-Epimerase-Nukleotidsequenzen von Guar (Cyamopsis tetragonoloba)
Biochemische Untersuchungen an UDP-Galaktose-4-Epimerase (EC 5.1.3.2.) in Guar haben gezeigt, daß, obwohl man eine ziemlich hohe Aktivität dieses Enzyms findet, die Menge an UDP-Galaktose-Epimeraseprotein sehr gering war, was eine präparative Reinigung für eine Aminosäureanalyse verhinderte. Daher war die Klonierungsstrategie der Wahl die funktionale Komplementierung in einer galE-E. coli-Mutante.
cDNA-Bibliothek
Eine cDNA-Expressionsbibliothek, welche mRNA von unreifen Guarsamen repräsentierte, wurde in dem Plasmid pcDNAII (Invitrogen Corporation) konstruiert und in den E. coli-Stamm Top10F' transformiert. Die Qualität der cDNA-Bibliothek wurde durch Reinigung des Plasmids aus einer Anzahl separater Top10F'-Kolonien, die in zufälliger Weise aufgenommen wurden, kontrolliert. Restriktionsenzymanalyse zeigte, daß alle untersuchten Plasmide rekombinant waren.
Bezüglich UDP-Galaktose-Epimerase defizienter E. coli-Stamm
Der E. coli-Stamm PL-2 war aufgrund eines defekten galE-Gens nicht in der Lage, Galaktose zu metabolisieren, während die zwei anderen Gene des gal-Operons, galK und galT intakt sind (Buttin, J Mol Biol, 7, 164–182 (1963); Wu und Kalckar, Proc Nat Acad Sci, USA 55, 622–629 (1966). Daher würde das Einsetzen eines aktiven UDP-Galaktose-Epimerasegens in PL-2 diesem Stamm ermöglichen, auf Galaktose zu wachsen.
Transformation von PL-2 und Selektion
PL-2-Zellen wurden nach dem Verfahren von Hanahan kompetent gemacht (Techniques for transformation of E. coli. IRL Press, Oxford (ISBN 0-947946-18-17), 109–135 (1985). Es wurde ein Titer von 5 × 10⁶ transformierten Zellen/μg Bibliotheksplasmid erhalten.
Das Selektionsmedium war im wesentlichen ein Minimalmedium mit hinzugefügter Galaktose, bestehend aus M9-Salzen (Maniatis et al., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor, New York (ISBN 0-87969-136-0) (1982)) und hinzugefügtem 0,05 g/l Threonin, 0,05 g/l Leucin, 0,05 g/l Methionin, 1,0 g/l Thiamin-HCl, 50 mg/l Ampicillin, 0,8 g/l Fructose, 0,9 g/l Agarose und 6 oder 8 g/l Galaktose. Die Medien werden nachfolgend M9-ES6 (mit 6 g/l Galaktose) oder M9-ES8 (mit 8 g/l Galaktose) bezeichnet.
Kompetente PL-2-Zellen wurden mit der Guar-cDNA-Bibliothek transformiert, und die Zellen wurden auf das selektive Substrat M9-ES6 oder M9-ES8 ausplattiert. Nach zwei Tagen bei 37°C erschienen Kolonien (ungefähr 0,1% der Gesamtzahl an Transformanden). Insgesamt wurden 48 Kolonien selektiert.
UDP-Galaktose-Epimerasetest an selektierten Kolonien
Um zu bestimmen, ob die erworbene Fähigkeit, auf Galaktose zu wachsen, auf das Vorhandensein von UDP-Galaktoseaktivität zurückzuführen war, wurden alle selektierten Kolonien hinsichtlich UDP-Galaktose-Epimeraseaktivität getestet, wobei Rohextrakte verwendet wurden, die durch Ultraschallbehandlung und anschließende Klärung durch Zentrifugation hergestellt wurden. Die UDP-Galaktose-Epimerasetests wurden im wesentlichen gemäß Dey (Phytochem, 23, 729–732 (1984)) durchgeführt. Die UDP-Galaktose-Epimeraseaktivität in Extrakten von PL-2 war Null (Negativkontrolle), wogegen signifikante Niveaus an Aktivität in DH5a (Positivkontrolle) gefunden wurden, wie erwartet. Transformierte PL-2-Kolonien, welche hohe Niveaus an UDP-Galaktose-Epimeraseaktivität zeigten, wurden für eine weitere Analyse ausgewählt.
Retransformation mit Plasmid-DNA aus den Kolonien 42 und 48
Plasmide aus der Kolonie 42 und der Kolonie 48 wurden gereinigt und erneut in kompetente PL-2-Zellen transformiert und auf M9-ES6 oder M9-ES8 ausplattiert. In beiden Retransformationsexperimenten erschien eine große Anzahl an Kolonien nach zwei Tagen bei 37°C. Ungefähr zehn unabhängige Kolonien von jedem wurden hinsichtlich UDP-Galaktose-Epimeraseaktivität analysiert, und alle Extrakte enthielten ähnlich hohe Niveaus an UDP-Galaktoseaktivität, wie sie in den ursprünglichen Kolonien 42 und 48 gefunden wurden. Dieses Experiment demonstriert, daß die UDP-Galaktose-Epimeraseaktivität, die in den von PL-2 abgeleiteten Kolonien 42 und 48 festgestellt wird, von den cDNA-Inserts codiert wird.
DNA-Sequenzanalyse der Inserts in den Kolonien 42 und 48
Teilnukleotidsequenzen der die UDP-Galaktose-4-Epimerase enthaltenden Klone, pGEPI42 und pGEPI48, wurden unter Verwendung eines Thereto-Sequenase-Fluoreszenzzyklussequenzierungskits (Amersham) und eines ALF DNA-Sequenzierers (Pharmacia) bestimmt.
Die Sequenzen mit ID NO: 1 und NO: 2 zeigen die Teilnukleotidsequenzen der Inserts in den Kolonien 42 bzw. 48 zusammen mit den abgeleiteten Aminosäuresequenzen.
Antikörperherstellung
Antikörper wurden gegen das Enzym der vorliegenden Erfindung gerichtet, indem Kaninchen mit dem gereinigten Enzym injiziert und die Immunglobuline aus Antiserum isoliert wurden gemäß Verfahren, beschrieben bei N. Harboe und A. Ingild ("Immunization, Isolation of Immunoglobulins, Estimation of Antibody Titre" In A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and Applications, N. H. Axelsen, et al. (Herausgeber), Universitetsforlaget, Oslo, 1973) und T. G. Cooper ("The Tools of Biochemistry", John Wiley & Sons, New York, 1977).
Andere Modifikationen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann auf dem Gebiet deutlich werden.
Übersetzung einer Nukleinsäuresequenz
Durchgeführt an der DNA-Sequenz GEPI42.
Gesamtzahl der Basen: 381
SEQ ID NO: 1
Übersetzung einer Nukleinsäuresequenz
Durchgeführt an der DNA-Sequenz GEPI48.
Gesamtzahl der Basen: 351
SEQ ID NO: 2

Claims

UDP-Galaktose-Epimeraseenzym, erhältlich aus Guar, wobei das Enzym wenigstens die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt oder eine Aminosäuresequenz ist, welche wenigstens 98% homolog dazu ist.
UDP-Galaktose-Epimeraseenzym, erhältlich aus Guar, wobei das Enzym von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die wenigstens die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz umfaßt, oder von einer Nukleotidsequenz, welche wenigstens 98% homolog dazu ist.
Nukleotidsequenz, welche wenigstens die als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz oder eine Nukleotidsequenz, welche wenigstens 98% homolog dazu ist, oder eine dazu komplementäre Sequenz umfaßt.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 3, die funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft ist.
Konstrukt, welches die Erfindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt oder in der Lage ist, diese zu exprimieren.
Vektor, welcher die Erfindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt oder in der Lage ist, diese zu exprimieren.
Plasmid, welches die Erfindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt oder in der Lage ist, diese zu exprimieren.
Nicht-menschlicher, transgener Organismus, welcher die Erfindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt oder in der Lage ist, diese zu exprimieren.
Verfahren zur Herstellung eines Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches Exprimieren einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 4 umfaßt.
Verwendung eines Enzyms nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder eines Enzyms, hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 9, zur Herstellung eines Nahrungsmittels (wie eines Futters).
Nahrungsmittel, welches das Enzym nach einem der Ansprüche 1 und 2 oder ein Enzym, hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 9, enthält.