DE3587168T2

DE3587168T2 - Glucoamylasegen.

Info

Publication number: DE3587168T2
Application number: DE8585115910T
Authority: DE
Inventors: Toshihiko Ashihari; Norihisa Nakamura; Yuji Shibano; Yoshikazu Tanaka; Hajime Yoshizumi
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1984-12-15
Filing date: 1985-12-13
Publication date: 1993-09-09
Anticipated expiration: 2005-12-14
Also published as: CA1267372A; MX165920B; US4863864A; EP0186066B1; JPS61141888A; BR8506273A; ATE86663T1; EP0186066A1; JPH0630586B2; DE3587168D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Strukturgen von Glucoamylase, abgeleitet von einem Pilz Rhizopus oryzae, einen neuen rekombinanten Vektor der dieses Gen umfaßt, und einen durch diesen Vektor transformierten Mikroorganismus. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren unter Verwendung des transformierten Mikroorganismus zur Herstellung von Glucoamylase von Rhizopus oryzae durch Kultivieren des transformierten Mikroorganismus, insbesondere Hefe, in einem flüssigen Medium.
Über Klonierung von Glucoamylasegenen aus Aspergillus niger (The EMBO Journal, Vol. 3, No. 5, Seiten 1097-1102, 1984) und von Aspergillus awamori (Yeast Genetics and Molecular Biology Abstracts, Seite 142, 1984) ist bereits berichtet worden.
Glucoamylase (EC 3.2.1.3) ist ein Enzym, das die α-1,4-Glycosidkette schrittweise vom nicht-reduzierenden Ende her hydrolysiert. Dieses Enzym hydrolysiert auch die α-1,6-Glycosidkette. Glucoamylase wird von Pilzen der Gattungen Aspergillus, Rhizopus und Mucor sekretiert und zur Glucoseherstellung und quantitativen Bestimmung von Glycogen und Stärke verwendet. Eine ihrer Hauptanwendungen liegt in ihrer Verwendung als Zucker-bildendes Mittel bei Herstellung von Ethylalkohol aus Stärkehaltigen Materialien. Die aus der Gattung Rhizopus abgeleitete Glucoamylase wird in besonders hoher Produktivität und enzymatischer Aktivität hergestellt. Ferner weist im Vergleich zu aus anderen Organismen abgeleiteten Glucoamylasen die Rhizopus abgeleitete Glucoamylase eine starke Wirkung auf Rohstärke auf, und ihre enzymologischen und chemischen Eigenschaften inklusive PH-Optimum sind besonders geeignet zur Verzuckerung von Getreidestärke. Wegen dieser Eigenschaften wird die von Rhizopus abgeleitete Glucoamylase als zur Alkoholherstellung unter Verwendung nicht-gekochter oder unter niedriger Temperatur gekochter Stärke am geeignetsten angesehen (siehe US-Patent Nr. 4 514 496 und 4 092 434).
J. Biochem. 92, 1623-1633 (1982) beschreibt, daß Glucoamylase, hergestellt von Rhizopus sp, gereinigt und charakterisiert wurde.
Ein Problem bei der Herstellung von Rhizopus Glucoamylase ist, daß hohe enzymatische Aktivität nur erzielt werden kann, indem man Kultivierung auf einem festen Medium unter Verwendung von Weizenkleie als Hauptsubstrat durchführt. Diese steigert die Kosten der Enzymproduktion und daher der Alkoholproduktion im Vergleich zum aus Aspergillus abgeleiteten Enzym, welches durch Kultivierung in einem flüssigen Medium hergestellt werden kann. Ferner unterliegt die durch die Gattung Rhizopus hergestellte Glucoamylase einer teilweisen Zersetzung durch Protease und kann die zur Hydrolyse von Rohstärke geforderte Wirksamkeit verlieren.
EP-126 206 beschreibt Gast-Organismen, die mit einer Glucoamylase cDNA-Sequenz, die aus der Gattung Aspergillus erhalten wurde, transformiert waren. Glucoamylase von Aspergillus unterscheidet sich jedoch bemerkenswert in ihrer Aminosäuresequenz von aus der Gattung Rhizopus erhaltener Glucoamylase.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Herstellungsmethode von Glucoamylase zu realisieren, die preiswert und geeignet zur Herstellung von Alkohol ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Glucoamylasegen zur Verfügung zu stellen, das von einem Pilz Rhizopus oryzae abgeleitet ist und zur Expression in der zur Alkoholherstellung aus stärkehaltigen Materialien, wie Getreide, durch einen nicht-kochenden oder bei Niedertemperatur-kochenden Prozeß in der Lage ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen dieses Gen umfassenden Vektor zur Verfügung zu stellen, und einen Mikroorganismus wie Hefe, der durch solch einen Vektor transformiert ist, insbesondere einen transformierten Mikroorganismus, der in einem flüssigen Medium kultiviert werden kann.
Ein noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer Rhizopus oryzae abgeleiteten Glucoamylase zur Verfügung zu stellen, ohne daß diese der Zersetzung durch Protease unterliegt.
Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz des Intron-freien Glucoamylase- Strukturgens der Erfindung zusammen mit der Signalpeptidregion;
Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz eines Glucoamylasegens, das aus der chromosomalen DNA von Rhizopus oryzae kloniert wurde;
Fig. 3 zeigt die Nucleotidsequenz der C-terminalen Region eines Glucoamylasegens, das aus der cDNA kloniert wurde, die von der mRNA von Rhizopus oryzae erhalten wurde;
Fig. 4 vergleicht das Glucoamylasegen, das aus der chromosomalen DNA von Rhizopus oryzae kloniert wurde, mit dem Glucoamylasegen, das aus der mRNA von Rhizopus oryzae hergestellt wurde; (die gestrichelte Sektion von pCGA239 in Fig. 4 stellt einen Teil der Glucoamylase-kodierenden cDNA dar, welcher dem intron-enthaltenden Teil des genomischen Glucoamylasegens im Plasmid pRGA39 entspricht; jede der gepunkteten Sektionen von pcGA239 und pRGA39 stellt einen Teil des Glucoamylase-kodierenden Gens dar, worin die DNA-Sequenzen in pCGA239 und pRGA39 identisch sind; die durchbrochene Linie auf der linken Seite von Fig. 4 stellt den Ort der in vitro Mutagenese dar, der in Fig. 5 beschrieben wird);
Fig. 5, 6A, 6B und 6C sind Fließbilder, die die Schritte zur Konstruktion einer Intron-freien cDNA der vollen Länge durch Konjugation der zwei in Fig. 4 gezeigten Gene und zur Einführung eines Promoters und eines Schwanzes im Hinblick auf die Sicherstellung einer effizienten Genexpression in Hefe zeigt, wobei Fig. 5 die Schritte zur Herstellung von pCGA469 zeigt, Fig. 6A die Schritte zur Herstellung von pYGA2149 und pYGA2169 darstellt, während Fig. 6B die Schritte zur Herstellung von pYGIFLm222 abbildet - (die gestrichelten und die kreuzweise gestrichelten Sektionen der Fig. 6B stellen Strukturgene für gamma-Interferon und respektive Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase dar); und
Fig. 6C stellt die Schritte zur Herstellung von pYGA2269 und pYGA195 dar;
Fig. 7 ist ein Graph, der das Profil der Glucoamylaseproduktion unter Verwendung von transformierten Hefen, wie in Beispiel 1 aufgeführt, zeigt;
Fig. 8 ist ein Elektrophoresediagramm für Glucoamylaseproben, die durch die transformierten Hefen in Beispiel 1 hergestellt wurden;
Fig. 9 ist ein Graph, der Wachstumskurven für transformierte Hefen zeigt, die in Beispiel 1 unter Verwendung von Stärke als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert wurden;
Fig. 10 ist ein Graph, der das Profil der Alkoholproduktion durch eine der transformierten Hefen, die in Beispiel 1 hergestellt wurden, zeigt; und
Fig. 11 ist ein Graph, der die Produktion von Glucoamylase durch die in Beispiel 2 erhaltenen transformierten Hefen zeigt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben zum erstenmal ein Glucoamylasegen aus einem Pilz der Gattung Rhizopus isoliert und seine Struktur bestimmt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung stellten dann aus diesem Gen Vektoren her, die zur Expression in E. coli oder Hefe in der Lage sind, und verwendeten die Vektoren dazu, um solche Mikroorganismen zu transformieren. Die Erfinder bestätigten, daß die transformierten Mikroorganismen tatsächlich Glucoamylase herstellten und zur direkten Produktion von Alkohol aus nicht-gekochten, rohen, Stärkehaltigen Materialien oder Niedertemperatur-gekochten Stärkehaltigen Materialien befähigt waren. Die Erfinder bestätigten auch, daß die Glucoamylase, die durch solche transformierten Mikroorganismen hergestellt worden war, eine hohe Hydrolysierfähigkeit von Rohstärke aufwies, da sie nicht der Zersetzung durch die von Rhizopus produzierte Protease unterlag.
Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Befunde erreicht. Ein Rhizopus oryzae-Pilz, der zur Produktion von Glucoamylase in der Lage ist, wird in der vorliegenden Erfindung verwendet, um das gewünschte Gen zu erhalten. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bestätigt, daß Rhizopus oryzae SAM0034 (FERM P-7960; FERM BP-929) eine Glucoamylase produziert, die besonders geeignet zur Hydrolyse von Rohstärke ist.
Der vorliegende Stamm (SAM0034) hat die folgenden mykologischen Eigenschaften.
Kolonien auf Kartoffelstärke-Agarmedium erzielen einen Durchmesser von 5-5,5 mm in einem Tag bei 28ºC und bedecken 90 mm Petrischalen von Kartoffelstärke-Agarmedium in zwei Tagen, weiß.
Die Kolonien werden im Alter grau.
Stolonen sind glasig oder gelblich braun; Rhizoide braun. Sporangiophoren bilden sich gewöhnlich von den Rhizoiden aus, gelegentlich direkt von den Stolonen, entweder allein oder in Gruppen, gelegentlich geteilt, 220-1200 um lang. Sporangien sind kugelförmig oder fast kugelförmig, dunkelbraun, 60-150 um im Durchmesser; Kolumellen kugelförmig oder fast kugelförmig. Sporangiosporen kugelförmig, fast kugelförmig oder gewinkelt, Striatae auf der Oberfläche, 5-15·3-7 um Chlamydosporen fast kugelförmig oder zylindrisch, 6-13·4-19 um.
Keine Zygosporen wurden beobachtet.
Bei 37ºC geschieht Wachstum.
Der vorliegende Stamm (SAM0034) kann der Pilzgattung Rhizopus zugeordnet werden, weil: (1) die Sporangiosporen werden innerhalb des kolumellatischen Sporangiums produziert; (2) die Sporangiosporen sind braun; und (3) Rhizoide werden gebildet.
Die mykologischen Eigenschaften des vorliegenden Stammes (SAM0034) wurden mit denen von bekannten Spezies der Gattung Rhizopus verglichen, unter Bezugnahme auf Inui, T., Y. Takeda & H. Iizuka, 1965. Taxonomical Studies on Genus Rhizopus (Journal of General and Applied Microbiology, Vol. 11, Supplement, 121 ff. Zycha, H., R. Siepmann & G. Linnemann, 1969. Mucorales. Eine Beschreibung aller Gattungen und Arten dieser Pilzgruppe. 335 ff. J. Cramer, Lehre. Domsch, K.H., W. Gams and T. H. Ahderson, 1980. Compendium of Soil Fungi, Vol. 1, 859 ff. Academic Press. London). Das Ergebnis dieses Vergleiches ergab, daß der vorliegende Stamm als Rhizopus oryzae identifiziert werden konnte, weil (1) der vorliegende Stamm bei 37ºC wachsen kann; (2) die Sporangiosporen gestreift sind und das Maß 5- 15·3-7 um haben; (3) die sporangiophoren an Länge 220-1200 um messen; und (4) die Sporangien 60-150 um im Durchmesser messen.

Glucoamylasegen:

Das Glucoamylasegen der vorliegenden Erfindung hat die Nucleotidsequenz, die in den Klammern in Fig. 1 gezeigt ist. Das Glucoamylasegen kann in der Form der cDNA, hergestellt aus der mRNA von Rhizopus, oder durch Klonieren der chromosomalen DNA von Rhizopus unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotids, das einem Teil der Aminosäuresequenz von Rhizopus-Glucoseamylase entspricht, isoliert werden.
Für gewöhnlich ist es nicht leicht, das vollständige Glucoamylasegen durch die erstere Methode zu erhalten, während das durch die letztere Methode erhaltene Gen für gewöhnlich Intron-Sequenzen enthält und somit in den Wirten E. coli oder Hefe nicht exprimiert werden kann. Um ein Glucoamylasegen zu erhalten, das zur Expression in diesen Wirten in der Lage ist, kann ein geeigneter Teil der cDNA aus mRNA konjugiert werden mit dem Intron-freien Teil der DNA-Sequenz des chromosomalen Gens. Wenn eine oder beide DNA-Fraktionen keine geeigneten Plätze für die Spaltung durch Restriktionsenzyme aufweisen, kann eine in vitro Mutagenese-Technik angewandt werden, um geeignete Spaltstellen für Konjugationszwecke einzuführen.
Der Bereich des Glucoamylasegens der vorliegenden Erfindung enthält nicht nur dieselbe Nucleotidsequenz, die die eingeklammerte Aminosäuresequenz in Fig. 1 kodiert, sondern auch eine Nucleotidsequenz, die einer Aminosäuresequenz mit einer enzymatischen Aktivität, die der der eingeklammerten Aminosäuren vergleichbar ist, entspricht.
Das von Rhizopus abgeleitete Glucoamylasestrukturgen ist ein DNA-Fragment, das die Sequenz von 26-604 Aminosäuren vom N-Terminus in Fig. 1 kodiert, oder es entspricht den Nucleotidsequenzzahlen 190-1926, die in Fig. 1 bezeichnet sind. Die Region von 1-25 Aminosäuren vom N-Terminus ist eine Signalpeptid-kodierende Region, die an der extrazellulären Sekretion von Glucoamylase aus der Wirtszelle beteiligt ist. Wenn, wie unten beschrieben, Glucoamylase durch eine Hefe unter Verwendung dieser Signalpeptid-kodierenden Region produziert wurde, werden mehr als 90% der produzierten Glucoamylase in das Kulturmedium sekretiert. Diese sekretierte Glucoamylase wurde durch eine Routinemethode gereinigt und die Aminosäuresequenz am N-Terminus wurde überprüft; die Aminosäuresequenz der Glucoamylase begann bei der 26. Aminosäure der in Fig. 1 gegebenen Sequenz, und dies bedeutet, daß die Region, die durch 125 Aminosäuren vom N- Terminus aus definiert ist, als Signalpeptid ebenso in einer Hefe fungiert.
Daher, wenn eine Signalsequenz, die die folgende Aminosäuresequenz kodiert:
MET GLN LEU PHE ASN LEU PRO LEU LYS VAL SER
PHE PHE LEU VAL LEU SER TYR PHE SER LEU LEU
VAL SER ALA
kombiniert wird mit einem DNA-Fragment, das eine geeignete proteinhaltige Substanz (z. B. Interferone, Lymphokine und Interleukine 2) in einem DNA- Expressionsvektor kodiert, und wenn dieser Vektor verwendet wird, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, dann kann die gewünschte proteinhaltige Substanz extrazellulär ausgeschieden werden.
Eine Methode, die mit Vorteil zum Zwecke der Isolierung des oben gezeigten Glucoamylasegens verwendet werden kann, wird im folgenden beschrieben. Die gesamte DNA wird aus einem Glucoamylase-produzierenden Pilz der Gattung Rhizopus durch eine modifizierte Version der Methode von Cryer et al. abgetrennt. Der Mikroorganismus wird zuerst sporuliert und die produzierten Sporen werden gesammelt. Die chromosomale DNA kann aus den Pilzsporen präpariert werden, indem man sie zuerst durch Glaskugeln aufbricht, wie später in Beispiel 1 (a-i) beschrieben wird; die Mischung wird dann nach der Methode von Cryer et al., Method in Cell Biology, 12, 39-44 (1975) extrahiert, und der Extrakt wird schließlich der Gelfiltration unterworfen. Die resultierende DNA-Fraktion wird mit HindIII verdaut und an den HindIII- Platz eines bekannten Vektors pBR322 kloniert, wodurch eine Rhizopus-Gen- Bibliothek in E. coli erhalten wird. Die Genbibliothek kann in Form einer Ampicillin-resistenten Transformante wiedergewonnen werden.
Eine Probe (DNA-Oligomer), die in Beispielen 1 und 2 beschrieben ist, zur Detektion des Glucoamylasegens wird hergestellt und zur Koloniehybridisierung verwendet. Kolonien, die mit der Probe hybridisieren, werden gezüchtet, und die Plasmid-DNA wird extrahiert.
Das Gen der vorliegenden Erfindung kann in einen geeigneten Plasmidvektor eingeführt werden und in einem Wirts-Mikroorganismus wie Hefe oder Bacillus subtilis zur Produktion der Rhizopus-Glucoamylase und von Alkohol exprimiert werden. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch den Plasmidvektor, der das vorher erwähnte Glucoamylasegen umfaßt, ebenso wie einen Mikroorganismus (z. B. Hefe und Bacillus subtilis) der durch solch einen Vektor transformiert wurde.
Um das Glucoamylasegen in einem Mikroorganismus zu exprimieren, wird es vorgezogen, daß ein Promoter und/oder ein Schwanz (3' nicht-translationale Region), die für diesen Mikroorganismus geeignet sind, verwendet werden (siehe ungeprüft veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 146281/1983). Um beispielsweise das Glucoamylasegen in einer Hefe zu exprimieren, können die Promoterregion (PGAP) und die Schwanzregion (TGAP) (offengelegt durch Holland & Holland in J. Biological Chem., 254 (19) 9839 (1979)) des Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegens (GAP-DH), die Promoterregion (Ppho5) des saure Phosphatasegens (PHO5) und die Promoterregion (PPGK) der 3-Phosphoglycerokinase (PGK), wie in den Beispielen 1 und 2 gezeigt, verwendet werden. Ein Plasmidvektor, der diese Promoter und/oder Schwanzregionen zusammen mit dem Gen der vorliegenden Erfindung umfaßt, ebenso wie ein Mikroorganismus, der durch solch einen Vektor transformiert ist, sind vorgezogene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden in größerem Detail unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

(a-i) DNA-Herstellung und ihre Klonierung

Die gesamte DNA aus Glucoamylase-produzierendem Rhizopus oryzae wurde isoliert. Die DNA-Isolierung wurde durch eine modifizierte Version der Methode von Cryer et al., die beschrieben wurde in Method in Cell Biology, Vol. 12, Seiten 39-44, 1975, und ursprünglich an Hefen angewandt wurde, durchgeführt. Eine dünne Kartoffelscheibe wurde in einem Autoklaven sterilisiert und die Zellen von Rhizopus oryzae wurden zur Sporulierung gezüchtet. Die produzierten Sporen wurden gesammelt, in einer Lösung von 0,15M NaCl und 0,05M EDTA suspendiert und durch eine 15 Sekunden lange Behandlung in einer Dyno-Mühle unter Verwendung von Glaskugeln aufgebrochen. Die folgenden Verfahrensschritte waren dieselben wie die in der Methode von Cryer et al. verwendeten, mit der Ausnahme, daß im letzten Schritt Gelfiltration unter Verwendung von Biogel A5m® (Handelsname von Bio-Rad für ein Molekularsieb) ausgeführt wurde, um die ganze DNA zu isolieren. Diese DNA- Fraktion wurde mit HindIII verdaut und an den HindIII-Platz von pBR322 kloniert, wodurch eine Rhizopus-Gen-Bibliothek im E. coli-Stamm WA802 erhalten wurde. Der Stamm wurde durch eine Routinemethode transformiert. Die Bibliothek wurde als Ampicillin-resistente Transformante erhalten.

(a-ii) Selektion der Transformante und Charakterisierung des Glucoamylasegens

Die Selektion der Transformante wurde durch eine Methode vorgenommen, die im allgemeinen als Kolonie-Hybridisierung bezeichnet wird, wobei ein Nitrozellulose-Filterpapier verwendet wurde. Der erste Schritt beginnt mit der Herstellung einer Probe zur Detektion der Glucoamylase DNA. Zu diesem Zweck wurde die gereinigte Rhizopus-Glucoamylase durch eine Vielzahl von Proteasen zersetzt und die resultierenden Peptide wurden separiert und gereinigt. Diese Peptide wurden der Aminosäureanalyse zugeführt und die Primärstrukturen wurden durch Routinemethoden bestimmt. Als Resultat wurde eine Aminosäuresequenz mit der Partialstruktur Asp-Leu-Thr-Trp-Ser-His-Ala- Ser erhalten. Es wurde auch gefunden, daß dieser Glucoamylase eine N- terminale Aminosäuresequenz von Ala-Ser-Ile-Pro und eine C-terminale Sequenz von Ala-Ala hatte. Um die gewünschte Probe zu präparieren, wurden 32 verschiedene synthetische DNA-Oligomere, jeweils bestehend aus 14 Basen (5'-ACNTGGTCNCAQGC-3'), hergestellt durch die Triester-Festphasenmethode aus der Aminosäuresequenz von Thr-Trp-Ser-His-Ala, die Teil der oben identifizierten Sequenz war, und worin N eine beliebige Base ist und Q ist T oder C aus Pyrimidin. Diese DNA-Oligomere wurden mit [γ-³²p]ATP und T4- Polynucleotidylkinase markiert und als Proben zur Detektion des Glucoamylasegens verwendet. Transformierte E. coli-Kolonien, die mit diesen Proben durch Kolonie-Hybridisierung hybridisierten, wurden gezüchtet, und Plasmid- DNAs wurden extrahiert. Der Extrakt wurde mit Restriktionsenzymen behandelt, und die resultierenden DNA-Fragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Bei den Kolonien, die mit den Proben hybridisierten, hatte das in das Plasmid insertierte DNA-Fragment eine Größe von 4,3 kb, ebenso wie jeweils eine Spaltstelle für BamHI, KpnI, MluI und SacI, zwei Stellen für DraI und drei Stellen für BglII, doch hatte keine Spaltstellen für AccI, BalI, ClaI, EcoRI, HpaI, PstI, PvuII, ScaI oder XhoI. Das Plasmid, das dieses DNA-Fragment beinhaltete, wurde pRGA39 genannt.

(b-i) RNA-Herstellung und cDNA-Klonierung

Die gesamte RNA wurde aus den Lufthyphen von Rhizopus oryzae isoliert. Zu diesem Zweck wurden bekannte Verfahren einschließlich der Verwendung von Guanidiniumthiocyanat befolgt. Polyadenylierte RNA wurde aus der gesamten RNA als eine mRNA-Fraktion mittels Chromatographie auf Oligo-dT-Zellulose wiedergewonnen. Unter Verwendung dieser mRNA wurde eine cDNA-Gen-Bibliothek in E. coli WA802 nach der Methode von Okayama und Berg gebildet, die in Okayama H. & Berg, P., Mol. Cell Biol., 2, 161, 1982 beschrieben ist.

(b-ii) Transformantenselektion und Charakterisierung der Glucoamylase cDNA

Selektion der Transformanten mit der cDNA des Zielenzyms wurde durch die oben erwähnte Methode der Koloniehybridisierung erzielt. Ein DraI- Fragment (2,0 kb) des in (a-ii) erhaltenen Glucoamylasegens wurde als Probe zur Detektion der Glucoamylase cDNA verwendet. Zu diesem Zweck wurde dieses Fragment durch die Nick-Translationstechnik unter Verwendung von [α-³²P]dCTP, DNA-Polymerase I und DNase I markiert. Die transformierten Kolonien, die mit dieser Probe hybridisieren würden, durften wachsen, und die Plasmid-DNA wurde extrahiert. Der Extrakt wurde mit Restriktionsenzymen behandelt und die resultierenden DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese auf Agarosegel analysiert. Das DNA-Fragment, das in das Plasmid der Kolonien, die mit der Probe hybridisierten, eingefügt worden war, hatte eine Größe von 1,7 kb. Dieses Plasmid wurde pCGA239 genannt.

(c) Nucleotid-DNA-Sequenzanalyse

Die Plasmide pRGA39 und pCGA239 wurden mit Restriktionsenzymen verdaut, und DNA-Fragmente wurden auf Agarosegel isoliert. Ihre Nucleotidsequenzen wurden durch die Dideoxymethode unter Verwendung des rekombinanten Phagen M13 bestimmt. Die Analyse von pRGA39 enthüllte, daß dieses Gen vier Introns enthielt, jedes mit einer Länge von einigen zehn bp (zu den Intronstellen siehe Fig. 2). Das Plasmid pCGA239 war nicht eine cDNA, die der vollen Länge der Glucoamylase entsprach, sondern enthielt etwa 50 Aminosäuren weniger. Restriktionskarten von pRGA39 und pCGA239 werden in Fig. 4 verglichen.

(d) Zusammenbau des zu exprimierenden Glucoamylasegens

Die klonierte rekombinante DNA hatte nicht die volle Länge. Eine rekombinante DNA der vollen Länge, die zusätzlich einen Glucoamylase-Promoter (abgeleitet aus Rhizopus) enthielt, wurde hergestellt, indem man geeignete Teile von pCGA239 und pRGA39 konjugierte. Da die Plasmide keine geeigneten Restriktionsstellen, die zu Konjugierungszwecken zur Verfügung gestanden hätten, aufwiesen, wurde die SalI-Stelle an den entsprechenden Orten von pCGA239 und pRGA39 durch die Methode der in vitro Mutagenese eingeführt, bevor die Konjugierung ausgeführt wurde (siehe Fig. 5). Zur Methode der in vitro Mutagenese siehe Morinaga, Y. et al., BIO TECHNOLOGY, 2, 636-639 (1984).
Wegen der Einführung der SalI-Stelle war das 53. Aminosäurekodon vom N-Terminus des behandelten Plasmids pCGA439 Asparaginsäure anstelle von Lysin, das ursprünglich vorlag. Daher wurde das Plasmid wiederum einer in vitro Mutagenese unterworfen, wobei Plasmid pCGA449 (niedergelegt im Fermentation Research Institute unter der Zugangsnummer FERM BP-673) enthaltend Glucoamylase-DNA der vollen Länge mit der inhärenten Nucleotidsequenz erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde am Fermentation Research Institute, an der Agency of Industrial Science and Technology, unter der Bezeichnung SAM0039 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag niedergelegt und erhielt die Zugangsnummer FERM BP-673.
Das Glucoamylasegen mit der vollen Länge in pCGA449 ist die Kombination der Sequenz, die vor dem Pfeil in Fig. 2(a) erscheint und der Sequenz die nach dem Pfeil in Fig. 3 erscheint.

(e) Konstruktion des Expressionsvektors in Hefe

(e-i) Im Hinblick auf die Sicherstellung einer effizienten Expression von pCGA449 in einer Hefe, wurde ein Fragment (ca. 8,3 kb) mit dem sauren Phosphatase-Promoter (Ppho5), offengelegt in der japanischen Patentanmeldung Nr. 157037/1984, verwendet, das mittels EcoRI-SalI aus pYGIFLm212 ausgeschnitten worden war. Um pCGA449 an der EcoRI-SalI-Stelle einzubinden, wurde die PvuII-Stelle von pCGA449 in eine XhoI-Stelle mit einem XhoI-Linker umgewandelt, wobei das Plasmid pCGA450 hergestellt wurde (Fig. 6(a)). Dieses Plasmid wurde mit XhoI und EcoRI gespalten, und ein 2,2 kb Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt. Dieses Fragment wurde an das oben erhaltene 8,3 kb EcoRI-SalI-Fragment mit einer T4-DNA-Ligase gebunden. Das resultierende Plasmid, das Ppho5 als Promoter enthielt, wurde pYGA2149 genannt, wobei der Pho5-Promoter offenbart ist in K. Arima et al., in Nucleic Acid Research 11(6)f 1657 (1983). Dieses Plasmid wurde in E. coli-Stamm WA802 gezüchtet und dann abgetrennt (siehe Fig. 6(a)).
(e-ii) Im Hinblick auf die Sicherstellung einer effizienten Expression von pCGA469 in einer Hefe, wurde ein Fragment (ca. 8,9 kb) mit dem Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promoter (PGAP), offengelegt in der japanischen Patentanmeldung Nr. 184291/1982, verwendet, das mit EcoRI-SalI aus pYGIFLm222 (Zugangsnummer FERM BP-2216) ausgeschnitten worden war. Um pCGA469 an der EcoRI-SalI-Stel1e einzufügen, wurde die PvuII-Stelle von pCGA469 in eine XhoI-Stelle mit einem XhoI-Linker umgewandelt, wodurch Plasmid pCGA470 hergestellt wurde (Fig. 6(c)). Dieses Plasmid wurde mit XhoI und EcoRI gespalten und ein 2,2 kb Fragment wurde durch Agarosegel- Elektrophorese abgetrennt. Dieses Fragment war an das zuvor erhaltene 8,9 kb EcoRI-SalI-Fragment mit einer T4-DNA-Ligase gebunden. Das resultierende Plasmid, das PGAP als Promoter enthielt, wurde pYGA2269 genannt. Dieses Plasmid wurde in E. coli-Stamm WA802 gezüchtet und dann abgetrennt (siehe Fig. 6C). Das oben verwendete Plasmid pYGIFLm222 wurde hergestellt (Fig. 6B) durch Ersetzen des Expressions-Promoters Ppho5 in pYGIFLm212 mit einem Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promoter (PGAP: siehe japanische Patentanmeldung Nr. 184291/1982). Im Detail war das Verfahren wie folgt: Die einzige BamHI-Stelle in pYGIFLm212 wurde mit BamHI gespalten, mit DNA-Polymerase I aufgefüllt, und mit einem HindIII-Linker behandelt, wodurch die BamHI-Stelle in eine HindIII-Stelle umgewandelt wurde, wobei Plasmid pYGIFLm212H erhalten wurde. Unter Verwendung der in vitro Mutagenese-Technik wurde eine EcoRI-Stelle in pYgap87 unmittelbar oberhalb von ATG (das Initiationskodon für die Replikation des Strukturgens von Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase) eingefügt, wobei Plasmid pYgap87E hergestellt wurde. Das Plasmid pYGIFLm212H wurde mit EcoRI gespalten, ferner teilweise mit HindIII gespalten und dann der Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, wodurch ein 8,0 kb Fragment isoliert werden konnte. Das Plasmid pYgap87E wurde mit EcoRI und HindIII gespalten und der Agarosegel- Elektrophorese unterworfen, wodurch ein 1,1 kb Fragment isoliert wurde. Dieses Fragment wurde mit dem vorhergehenden 8,0 kb Fragment von pYGIFLm212H verbunden, und das resultierende rekombinante Plasmid pYGIFLm222 wurde aus dem transformierten E. coli wiedergewonnen.
pYGA2169 wurde aus pYGIFLm212 unter Verwendung von pCGA469 und Wiederholung der selben Verfahren wie oben beschrieben hergestellt und das Plasmid wurde abgetrennt (Fig. 6A).
pYGA2249 (nicht gezeigt) wurde ebenfalls mit denselben Methoden wie oben beschrieben hergestellt und abgetrennt.

(f) Expression des Glucoamylasegens in Hefe

Das Plasmid pYGA2149 wurde verwendet, um Hefe [Saccaromyces cerevisiae-Stämme XS-30-2A (MATα, leu2, his3, trp1, ura3) und XS-30-2B (MAT α, leu2, his3, trp1, ura3)] zu transformieren, und die transformierten Kolonien wurden auf der Basis des Nahrungsbedarfs für Tryptophan als Marker selektiert. Die Transformierung wurde nach der Methode von Ito et al. (Ito, H. et al., J. Bacteriol., 153, 1983) unter Verwendung von LiCl durchgeführt. Die Menge einer Platinöse der transformierten Kolonien wurde in 5 ml YPD-Medium eingeimpft (1% Hefeextrakt, 2% Polypepton und 2% Glukose) und Probenahme wurde nach 48 Stunden durchgeführt. Zentrifugierung (10.000 Upm·5 Min) wurde in einem Eppendorf-Rohr durchgeführt, wodurch die Probe in Überstand und Pellet getrennt wurde. Die Aktivität der Glucoamylase im Überstand wurde durch die folgenden Verfahrensschritte gemessen: 200 ul des Überstandes wurden zu 800 ul einer löslichen Stärkelösung zugegeben (1,0% lösliche Stärke in 20 mM Acetatpufferlösung, pH 5,0), und die Mischung wurde bei 37ºC stehengelassen. Die Menge der freigesetzten Glucose wurde mittels eines Glucostaten bestimmt (Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.). Die Aktivitätsdaten für die 2-stündige Reaktion waren wie folgt: 0,004 U/ml für pYGA2149 in XS-30-2A und 0,008 U/ml in XS-30-2B, hinweisend auf einen Geschlechts-abhängigen Unterschied um den Faktor 2 (siehe Fig. 7). Die Aktivität einer Unit (U) entspricht 1 uMol Glucose freigesetzt in 1 Minute. Keine Aktivität wurde in den aus Hefe erhaltenen Überständen beobachtet, welche kein pYGA2149 enthielten.
Die Glucoamylaseaktivität für das Plasmid unter Verwendung von PGAP als Promoter war 0,40 U/ml, was 50-100 mal den Wert für den Fall, wo solch ein Promoter nicht vorlag, entsprach. Die Glucoamylaseaktivität des Plasmids, das den saure Phosphatasegen-Promoter Ppho5 verwendete, war abhängig von der Phosphatkonzentration des Mediums. Z. B. wurde keine Glucoamylaseaktivität nach 48-stündiger Kultivierung im normalen YPD-Medium bei 30ºC beobachtet, doch eine Aktivität vergleichbar zu der bei der Verwendung von PGAP trat auf, wenn das Medium durch ein YPD-Medium ersetzt wurde, von welchem Phosphat durch Behandlung mit Magnesiumsulfat und Ammoniakwasser entfernt worden war (Rubin, G. M., Eur. J. Biochem., 41, 197-202, 1974). Der Überstand der Kultur wurde einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen und nicht weniger als 50% des gesamten extrazellulären Proteins war Glucoamylaseprotein.
Es wurde durch die folgenden immunologischen Techniken bestätigt, daß die oben aufgeführten Aktivitäten der Rhizopus-abgeleiteten Glucoamylase zuzuschreiben sind. Ein Kaninchen-Antikörper wurde unter Verwendung einer gereinigten Glucoamylase hergestellt. Dieser Antikörper wurde zur Analyse durch eine Methode verwendet, die man gemeinhin als Western-Blotting bezeichnet, wobei ein Konzentrat von 1,5 ml desselben Überstands der 48- Stunden-Kultur verwendet wurde, die in den vorhergehenden Aktivitätsmessungen eingesetzt wurde. Ein Drittel des Konzentrats wurde einer 10% Polyacrylamidelektrophorese unterworfen, und das Protein im Gel wurde übertragen und auf einem Nitrozellulose-Filterpapier elektrophoretisch immobilisiert. Die Glucoamylase auf dem Nitrozellulose-Filterpapier wurde dann durch die bekannte Technik der Enzymimmunologie unter Verwendung der Reaktion mit Peroxidase detektiert. Eine Bande, die mit dem Glucoamylase- Antikörper reagieren würde, trat an einer im wesentlichen gleichen Stelle auf wie die Rhizopus-Glucoamylase, bezogen auf das Molekulargewicht. Diese Tatsache bedeutete die Expression der Rhizopus-abgeleiteten Glucoamylase in Hefen. Die Daten, die diese Tatsache zeigen, sind in Fig. 8 gegeben.

(g) Hefewachstum unter Verwendung von Stärke als einziger Kohlenstoffquelle

Der Effekt von pYGA2149 auf das Wachstum des Hefestammes XS-30-2B wurde unter Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen untersucht. Zunächst wurde XS-30-2B in einer Schüttelkultur im YPD-Medium 24 Stunden lang bei 30ºC gezüchtet und XS-30-2B (pYGA2149) wurde in einer Schüttelkultur unter den selben Bedingungen in einem minimalen Nährstoffmedium (0,67% Difco-Hefe-Stickstoffbase und 2% Glucose) enthaltend 1% Casaminosäuren und Uracil gezüchtet. Ein 100 ml-Anteil jeweils von YPD-Medium oder YPS-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Polypepton und 2% lösliche Stärke) wurde in einer 500 ml-Sakaguchi-Flasche vorgelegt und in einem Autoklaven sterilisiert. Jede der Vorkultursuspensionen (1,0 ml) wurde zu diesen Medien bei 30ºC zugegeben, und das nachfolgende Wachstum wurde durch die Absorption bei 660 nm gemessen. Der Stamm XS-30-2B der kein Plasmid pYCA2149 beherbergte, war zu geringem Wachstum im YPS-Medium fähig, doch der pYGA2149 beherbergende Stamm wuchs mit gleicher Geschwindigkeit sowohl auf YPS- wie YPD-Medien. Diese Tatsache zeigt klar, daß XS-30-2B (pYGA2149) Glucoamylase produzierte und die durch das Enzym hydrolysierte Stärke nutzte (siehe Fig. 9).

(h) Alkoholproduktion durch transformierte Hefe

(h-i) Alkoholfermentation mit löslicher Stärke

Das zu diesem Experiment verwendete Medium wurde hergestellt durch Autoklavieren (121ºC, 15 Minuten) von 200 ml YPS-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Polypepton und 1, 2 oder 5% lösliche Stärke) in einer 500 ml-Erlenmeyer- Flasche. Die folgenden Hefestämme wurden eingesetzt.
(1) XS-30-2B (Kontrolle ohne Glucoamylasegen);
(2) XS-30-2B (transformiert durch pYGA2149) mit einem Rhizopus- Promoter;
(3) XS-30-2B (transformiert durch pYGA2169) mit dem Promoter Ppho5; und
(4) XS-30-2B (transformiert durch pYGA2269) mit dem Promoter PGAP.
Die anfängliche Vorkultur wurde hergestellt, indem eine Platinöse der Hefe in ein minimales Nährstoffmedium (5 ml) enthaltend 1% Casaminosäuren, Uracil und Adenin eingeimpft wurde und eine Schüttelkultur bei 28ºC während 20 Stunden angelegt wurde. Diese anfängliche Vorkultur wurde in ein YPD-Medium in einer Menge von 2% eingeimpft und stationärer Kultivierung bei 28ºC während 24 Stunden unterworfen, um eine schlußendliche Vorkultur zu erhalten. Die schlußendliche Vorkultur wurde in YPS-Medium zu 5% eingeimpft und stationärer Kultivierung bei 28ºC zum Zwecke der Untersuchung der Ethanolproduktion unterworfen. Die Kultivierung von Hefestrang (3) in oder nach der schlußendlichen Vorkultur wurde in einem YPD- respektive YPS- Medium mit wenig Phosphat im Hinblick auf die Induktion von Ppho5 durchgeführt. Dasselbe Experiment wurde für drei verschiedene Stärkekonzentrationen durchgeführt (1, 2 und 5%). Die Ergebnisse für die Ethanolproduktion und das Hefewachstum sind in Tabellen 1 und 2 gezeigt. Tabelle 1 Nr. Hefe Stärke Zeit (Std.) GA: Glucoamylase EtOH: Ethanol Tabelle 2 Ausnutzung für 2% Stärke bei 48 Stunden Hefe Ausbeute (%)

(h-ii) Alkoholfermentation mit bei niedriger Temperatur gekochter Stärke

Gemahlener Mais (140 g) wurde zu 402 ml Wasser zugegeben und nach Zugabe von 0,5 g α-Amylasezubereitung (Termamil) als Viskositäts-reduzierendes Mittel und 160 ppm Kaliumdisulfit als Germicid, wurde die Mischung bei 80-82ºC für 5 Minuten lang gehalten und dann schnell abgekühlt.
Anfängliche und schlußendliche Vorkulturen wurden unter Verwendung desselben Stammes wie in (h-i) eingesetzt hergestellt, und die schlußendliche Vorkultur wurde zu der bei niedriger Temperatur gekochten Stärke zugegeben, und die Mischung wurde bei 28ºC unter drei verschiedenen Bedingungen kultiviert, d. h. in Abwesenheit irgendeiner Zusatzkomponente, in Anwesenheit von Casaminosäuren, Uracil und Adenin und in Anwesenheit von Casaminosäuren, Uracil, Adenin und 0,4% Glucose. Der Fortschritt der Fermentation (gemessen durch die Abnahme an CO&sub2;) und der Alkoholproduktion wurden untersucht. Eine nicht-transformierte Hefe unter Verwendung der Routinemenge von Rhizopus-Glucoamylase wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Resultate sind in Tabellen 3 und 4 und in Fig. 10 gezeigt, woraus man ersehen kann, daß die Hefen die erfindungsgemäß erhalten wurden, zur direkten Alkoholproduktion aus nicht-gekochter oder bei niedriger Temperatur gekochter (LTC) Stärke ohne Zugabe eines Rhizopus-Glucoamylasepräparats in der Lage war. Tabelle 3 CO&sub2; Reduktion (g) Nr. Hefe Casaminosäure Glucose Enzym* Zeit (Std.) Nährlösung: 500 ml *: Rhizopus-Glucoamylase Tabelle 4 Alkoholproduktion (v/v%) Nr. Hefe Casaminosäure Glucose Enzym* Zeit (Std.) Nährlösung: 500 ml *: Rhizopus-Glucoamylase

Beispiel 2

(a) Ein 2,0 kb DNA-Fragment, enthaltend Glucoamylasegen aus pYGA2269, hergestellt in Beispiel 1(e), wurde in die HindIII-Stelle eines bekannten Vektors YCp19 insertiert, wobei pYGA195 erhalten wurde (Fig. 6C). Plasmid YCp19 ist offenbart durch Stinchemb D.T. et al., in J. Mol. Biol. 158, 157 (1982). Dieses Plasmid mit einem Centromeren lag in Hefe mit einer Kopienzahl von 1 vor.

(b) Expression des Glucoamylasegens in Hefe

Die Plasmide pYGA2269 und pYGA195 wurden verwendet, um den Hefestamm XS-30-2B (MATα, leu2, his3, trp1, ura3) zu transformieren, und die transformierten Kolonien wurden durch den Nährmittelbedarf für Tryptophan als Marker selektiert. Die Transformierung wurde nach der Methode von Ito et al., (ibid) unter Verwendung von LiCl durchgeführt. Die selektierten, transformierten Kolonien wurden über Nacht bei 30ºC in 5 ml eines minimalen Nährstoffmediums kultiviert (0,67% Hefestickstoffbase, 2% Glucose, 0,001% Uracil, 0,0054% Adenin, 0,0026% Leucin und 0,0038% Histidin). Die Kulturlösung wurde zu einem Prozent in 400 ml des minimalen Nährstoffmediums in einen Erlenmeyer-Kolben (1.000 ml) eingeimpft und bei 30ºC unter Schütteln kultiviert.
In Abständen von ungefähr 3 Stunden wurden Proben gezogen, und die Absorption bei 660 nm und die Glucoamylase-Aktivitätswerte nach 24 und 48 Stunden wurden durch Messung der freien Glucose bestimmt, die durch Reaktion bei 37ºC einer Mischung des Überstands der Kultur (50 ul) und 950 ul einer löslichen Stärkelösung (0,5% lösliche Stärke in 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5) freigesetzt wurde. Die Glucosemenge wurde durch einen Glycostaten von Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. bestimmt. Eine Unit (U) Glucoamylaseaktivität entspricht 1 uMol Glucose, freigesetzt in einer Minute. Die durch pYGA2269 und pyGA195 transformierten Hefen produzierten Glucoamylaseaktivitäten in Mengen von 0,2 U/ml und 0,5 U/ml respektive nach 48 Stunden (siehe Fig. 11). Dieses Enzym kann in einer adäquaten Menge sogar von einem Plasmiden mit einer Kopienzahl von 1 sekretiert werden, indem man es in Anwesenheit eines starken Promoters, wie etwa dem GAPDH-Promoter, exprimiert.

(c) Reinigung des durch die rekombinante DNA-Technologie erhaltenen Enzyms

S. Cerevisiae XS-30-2B, transformiert durch pYGA2269, wurde 3 Tage lang bei 30ºC in einem Medium enthaltend 0,67% Hefe-Stickstoffbase, 2% Casaminosäuren, 2% Glucose, 0,001% Uracil, 0,0054% Adenin, 0,0026% Leucin und 0,0038% Histidin kultiviert. Der Überstand der Kultur wurde durch einen Amicon-Konzentrator auf das über 20-fache konzentriert, gegen einen Acetatpuffer (20 mM CH&sub3;COONa, pH 4,6) dialysiert und an eine mit demselben Puffer equilibrierte SP-Sephadex C-50-Säule adsorbiert. Ein linearer Gradient von 0 bis 200 mMol wurde an die Säule angelegt, wobei die aktiven eluierten Fraktionen wiedergewonnen wurden, dialysiert wurden gegen Wasser, gefriergetrocknet und für die folgenden Experimente aufbewahrt.

(d) Enzymeigenschaften

Die Aminosäurezusammensetzung der durch die rekombinante Hefe produzierten Glucoamylase war in guter Übereinstimmung mit dem Gluc 1 mit dem höchsten Molekulargewicht der drei Glucoamylasemoleküle, die vom Rhizopus hergestellt wurden; die N-terminale Sequenz und der isoelektrische Punkt der Glucoamylase waren ebenfalls dieselben wie die der von Rhizopus produzierten Glucoamylase. Das apparente Molekulargewicht der Glucoamylase, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese, war etwas höher als das von Gluc 1. Das Molekulargewicht der Glucoamylase wurde durch Verdauung durch Endoglycosidase H, welche befähigt ist, eine bestimmte Zuckerkette, die an einem Asparaginrest anhängt, abzuschneiden, herabgesetzt. Hingegen ist die von Rhizopus hergestellte Glucoamylase auf die Wirkung von Endoglycosidase H nicht empfindlich. Der Unterschied zwischen den zwei Glucoamylasemolekülen bezüglich des Molekulargewichts wäre demnach den Unterschieden an Menge und Art der anhängenden Zuckerketten zuzuschreiben.
Kein Unterschied wurde bezüglich der pH-Abhängigkeit, Hitzestabilität oder anderen Parametern wie z. B. Vmax und Km bezüglich löslicher Stärke, beobachtet. Die von Rhizopus hergestellte Glucoamylase hatte einen r/s-Wert (r: Aktivität bezüglich Rohstärke, s: Aktivität bezüglich gelatinisierter löslicher Stärke) von 0,47, während der Wert für die von rekombinanter Hefe hergestellte Glucoamylase 0,56 betrug. Es wird daher geschlossen, daß soweit die Fähigkeit, Rohstärke zu zersetzen, betroffen ist, ein besseres Glucoamylasepräparat aus der rekombinanten Hefe produziert werden kann als aus Rhizopus.

(e) Adsorptionsstelle auf Stärke

Die von Rhizopus hergestellte Glucoamylase enthält drei Moleküle mit verschiedenen Molekulargewichten, Gluc 1, 2 und 3, wobei die zwei letzteren das Produkt von beschränkter Proteolyse der N-terminalen Aminosäuresequenz von Gluc 1 sein dürften.
Das Verhalten dieser drei Moleküle bezüglich der Adsorption an Stärke wurde untersucht. Eine Probe der Enzymlösung wurde mit einem gleichen Volumen von Rohstärke gemischt und, nachdem die Mischung in Eiswasser 30 Minuten lang stehengelassen wurde, zentrifugiert. Der Überstand wurde als eine Enzymfraktion wiedergewonnen, die nicht an Stärke adsorbiert war, während der Niederschlag als Fraktion erhalten wurde, der an Stärke adsorbiert war. Beide Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert; Gluc 1 und die durch rekombinante Hefe produzierte Glucoamylase wurden im Niederschlag gefunden, während Gluc 2 und 3 im Überstand gefunden wurden. Die Mischung von Gluc 2 und 3 hatte einen r/s-Wert von 0,23, damit anzeigend, daß die Rhizopus-Glucoamylase ihre Fähigkeit, an Rohstärke adsorbiert zu werden, durch Verlust der N-terminalen Sequenz verloren hat. Es wird daher geschlossen, daß der N-terminale Anteil eine Stelle hat, die an Rohstärke adsorbiert wird. Die Rhizopus-Glucoamylase war in der Lage, gelatinisierte lösliche Stärke ebenso effektiv zu hydrolysieren wie die Glucoamylase der vollen Länge, selbst wenn sie den N-terminalen Anteil verloren hatte. Als eine Mischung von Glucoamylaselösung mit gelatinisierter löslicher Stärke der Säulenchromatographie auf Ultrogel AcA 44 unterworfen wurde, wurden sowohl Gluc 1 wie auch die von der rekombinanten Hefe hergestellte Glucoamylase in die Leervolumen in der Säule zusammen mit der Stärke eluiert, doch weder Gluc 2 noch Gluc 3 wurden an die Stärke adsorbiert, und sie wurden in die entsprechenden Elutionsvolumen eluiert. Dies schuf eine Basis für die Schlußfolgerung, daß Gluc 1 und die von rekombinanter Hefe produzierte Glucoamylase nicht nur zur Adsorption an Rohstärke sondern auch an gelatinisierte Stärke in der Lage sind.

Claims

1. Das Strukturgen der von einem Rhizopus oryzae-Pilz abgeleiteten Glucoamylase, worin das Gen unten gezeigte Aminosäuresequenz (I) kodiert:

2. Strukturgen der Glucoamylase gemäß Anspruch 1, welches durch die folgende Nucleotidsequenz (II) dargestellt ist:

3. Glucoamylasegen gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in der stromaufwärts gelegenen Region ein Signalpeptid enthält, das von einem Rhizopus oryzae-Pilz abgeleitet ist.

4. Glucoamylasegen gemäß Anspruch 3, welches die folgende Aminosäuresequenz (III) kodiert:

5. Glucoamylasegen gemäß Anspruch 4, welches durch folgende Nucleotidsequenz (IV) dargestellt ist:

6. Vektor, umfassend ein Glucoamylase kodierendes Strukturgen, dadurch gekennzeichnet, daß er das gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 Strukturgen von Glucoamylase, das von einem Rhizopus oryzae-Pilz abgeleitet ist, umfaßt.

7. Vektor gemäß Anspruch 6, worin das Strukturgen von Glucoamylase unten gezeigte Aminosäuresequenz (I) kodiert:

8. Vektor gemäß Anspruch 6, umfassend das Strukturgen von Glucoamylase, das die DNA-Sequenz (II) oder (IV), gegeben in den Ansprüchen 2 respektive 5, hat.

9. Vektor gemäß Anspruch 8, der aus der folgenden Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:

a) Plasmid pCGA449 (Zugangsnummer FERM BP-673) mit einem Glucoamylasegen von Rhizopus oryzae unter Einschluß der DNA Sequenz, die das Signalpeptid kodiert;

b) Plasmid pCGA469, worin eine DNA-Sequenz TCTCTA im Plasmid pCGA449 unmittelbar vor dem Initiationskodon ATG ersetzt wurde durch eine DNA-Sequenz GAATTC, was eine EcoRI-Stelle schafft;

c) Plasmid pYGA2169, welches aus Plasmid pCGA469 hergestellt wird, indem man darin einen Pho5-Promoter vom saure-Phosphatasegen der Hefe an der EcoRI-Stelle, die unmittelbar stromaufwärts des Initiationskodons ATG des Glucoamylasegens geschaffen wurde, und einen GAP-Terminator vom Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegen der Hefe in der 3'-Region des Glucoamylasegens einführt;

d) Plasmid pYGA2149, welches aus Plasmid pCGA449 hergestellt wird, indem man darin einen Pho5-Promoter vom saure-Phosphatasegen der Hefe in der 5' stromaufwärts gelegenen Region des Initiationskodons ATG des Glucoamylasegens und einen GAP-Terminator vom Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegen der Hefe in der 3'-Region des Glucoamylasegens einführt;

e) Plasmid pYGA2269, welches aus Plasmid pCGA469 hergestellt wird, indem man darin einen GAP-Promoter vom Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegen der Hefe unmittelbar stromaufwärts des Initiationskodons ATG des Glucoamylasegens und einen GAP-Terminator vom Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegen der Hefe in der 3'-Region des Glucoamylasegens einführt; und

f) Plasmid pYGA195, welches aus Plasmid pYGA2269 hergestellt wird, indem man das ARS-Gen und das CEN4-Gen einführt, welche beide aus dem Plasmid YCp19 stammen.

10. Mikroorganismus, transformiert durch einen Vektor gemäß der Ansprüche 6 bis 9, umfassend das von einem Rhizopus oryzae-Pilz abgeleitete Strukturgen der Glucoamylase.

11. Transformierter Mikroorganismus gemäß Anspruch 10, welcher durch einen Vektor transformiert worden ist, der ein Strukturgen umfaßt, das eine die unten gezeigte Aminosäuresequenz (I) kodierende Nucleotidsequenz darstellt:

12. Transformierter Mikroorganismus gemäß Anspruch 10, welcher durch einen Vektor transformiert worden ist, der ein Strukturgen umfaßt, das durch die folgende Nucleotidsequenz (II) dargestellt ist:

13. Transformierter Mikroorganismus gemäß Anspruch 10, welcher durch einen Vektor transformiert worden ist, der aus der Plasmidgruppe ausgewählt worden ist, welche besteht aus:

a) Plasmid pCGA449 (Zugangsnummer FERM BP-673) mit einem Glucoamylasegen von Rhizopus oryzae einschließlich der DNA Sequenz, die das Signalpeptid kodiert;

d) Plasmid pYGA2149, welches aus Plasmid pCGA449 hergestellt wird, indem man darin einen Pho5-Promoter vom saure-Phosphatasegen der Hefe (Zugangsnummer FER BP-2216) an der 5' stromaufwärts des Initiationskodons ATG des Glucoamylasegens gelegenen und einen GAP-Terminator vom Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegen der Hefe in der 3'-Region des Glucoamylase einführt;

e) Plasmid pYGA2269, welches hergestellt wird aus Plasmid pCGA469, indem man darin einen GAP-Promoter vom Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegen der Hefe unmittelbar stromaufwärts des Initiationskodons ATG des Glucoamylasegens und einen GAP-Terminator vom Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegen der Hefe in der 3'-Region des Glucoamylasegens einführt; und

f) Plasmid pYGA195, welches hergestellt wird aus Plasmid pYGA2269, indem man das ARS-Gen und das CEN4-Gen einführt, welche beide aus dem Plasmid YCp19 stammen.

14. Verfahren unter Verwendung des transformierten Mikroorganismus gemäß Anspruch 10 zur Herstellung von Glucoamylase von Rhizopus oryzae, welche zur effizienten Hydrolyse von Rohstärke in der Lage ist, umfassend die Schritte der Herstellung einer solchen Glucoamylase durch Kultivierung des Mikroorganismus in einem flüssigen Medium und Gewinnung der Glucoamylase aus der Kultur.