DE4341582C1

DE4341582C1 - Verfahren zur Boranalyse von suspendiertem biologischen Zellmaterial durch Atomabsorptionsspektroskopie

Info

Publication number: DE4341582C1
Application number: DE19934341582
Authority: DE
Inventors: Manfred Dr Papaspyrou; Karl-Heinz Beyer
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1993-12-07
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 1995-06-22
Anticipated expiration: 2013-12-08

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Boranalyse von suspendiertem biologischen Zellmaterial durch Atomabsorptionsspektroskopie unter Verwendung eines Inertgasstroms durch eine Graphitküvette.

In den letzten Jahren hat die Analyse von Bor als Bestandteil von chemischen Verbindungen für die Bor-Neutroneneinfangtherapie [Boron Neutron Capture Therapy (BNCT)] von Tumoren stark an Bedeutung gewonnen: Bei dieser Behandlungstechnik wird Bor gekoppelt mit geeigneten Carriermolekülen selektiv in Tumorzellen eingeschleust. Bei einer nachfolgenden Bestrahlung mit thermischen Neutronen erfolgt dann eine Kernreaktion (¹⁰B(n.A)⁷Li) des im natürlichen Bor zu etwa 20% vorhandenen ¹⁰Bor-Isotops. Die ausgesandten Partikel (A, ⁷Li) führen zu einer bevorzugten Abtötung der Tumorzellen, während das gesunde Gewebe wegen der nur geringen mittleren Reichweite von 10 Im (A) bzw. 5 Im (Li) weitgehend geschont wird.

Für die Weiterentwicklung der BNCT ist daher die Auffindung von möglichst selektiv tumorsuchenden Borverbindungen besonders wichtig, was wiederum eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung des Bor-Anreicherungsgrades in kultivierten Tumorzellen voraussetzt.

Bekannt sind Verfahren zur Visualisierung von Bor durch relativ aufwendige Methoden: So erlaubt das Magnetic Resonance Imaging eine exakte Lokalisierung von Bor ohne weiteres in lebenden Organismen. An geeigneten histologischen Präparaten ist ein Nachweis einzelner Boratome im subzellulären Bereich mit Hilfe der Ionen-Mikroskopie der Electron Energy Loss Spectroscopy und der α-Track Autoradiography möglich.

Daneben sind chemische Nachweisverfahren zur quantitativen Erfassung von Bor in biologischem Material bekannt, wie die rein colorimetrischen Methoden, die eine spektrophotometrische Borbestimmung mit Hilfe von komplexbildenden Chemikalien wie 1,1′-Dianthrimid, Curcumin oder Methylenblau erlauben. Die Nachweisgrenzen liegen zwischen 0,1 und 1,0 mg Bor pro 1, wobei die Proben allerdings als homogene Lösung vorliegen müssen und die nachzuweisenden Borverbindungen zuvor zu Borsäure oder ähnlichen, anorganischen Formen oxidiert werden müssen.

Als Analysenmethoden für Serienanalysen bzw. Routine-Bestimmungen von Bor haben sich vornehmlich die Direct Current Plasma-Atomic Emission Spectroscopy [DCP-AES], die Inductive Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy [ICP-AES] und die Inductive Coupled Plasma-Mass Spectrometry [ICP-MS] etabliert. Bei der DCP-AES wird ein 6000-7000°K heißes Argon-Plasma mittels dreier Elektroden erzeugt, wobei ein Plasma entsteht, dessen Konfiguration einem umgedrehten "Y" entspricht. Die (flüssigen) Proben werden dann mittels eines pneumatischen Zerstäubers in das Plasma hineingebracht. Bei der ICP-AES und bei der ICP-MS wird mit einem Hochfrequenzgenerator in einem doppelwandigen Quarzkelch ein Argon-Plasma (T=8000°K) erzeugt und die Proben werden auch hier mit einem Zerstäuber vom Argonstrom in das Plasma transportiert. Die Auswertung erfolgt über die Emissionsspektren oder mittels eines Massenspektrometers.

Für die Analyse nach diesen Verfahren ist ein Aufschluß der Proben notwendig, da selbst kleinste Partikel die Zerstäuberkapillare verstopfen können.

Für die Bestimmung von Bor in biologischen Proben allgemein wurde auch die Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) herangezogen: So wird eine Analyse von Bor in pflanzlichem Material beschrieben (Analytical Proceedings, 25 (1988), 233-235), bei der nach Verkoken und Vermahlen der Proben eine Atomisierung im pyrolytisch beschichteten Graphitrohr des Atomabsorptionsspektrographen (GF-AAS) erfolgt, in das die Proben manuell eingebracht werden.

Selbst über ein Verfahren zur Borverteilungsanalyse an mit unterschiedlichen Borverbindungen behandelten Tumorzellen mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) wurde kürzlich berichtet (Proceedings of the Fourth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer, Dec. 4-7, 1990, in Sydney, Australia; B. J. Allen et al. (Eds.), Plenum Press, New York (1992), 381-385). Die Nachweismethode wird nicht näher beschrieben. Es wird lediglich angegeben, daß gesammelte Zellen (Pellets) unter Zusatz von Wasser durch Ultraschall aufgeschlossen und in den Spektrographen injiziert wurden.

Auch diese Vorschläge zur Borbestimmung in biologischem Material mit AAS gehen von aufgeschlossenem Zellmaterial aus. Versuche zur Ermittlung von Bor unmittelbar in Zellsuspension mit Hilfe der GF-AAS mit verfügbaren Mitteln erweisen sich als problematisch, da bei hohen Zelldichten ein Verklumpen oder Verkleben auftritt, während die Nachweisempfindlichkeit bei hoher Verdünnung nicht ausreicht.

Aufgabe der Erfindung ist daher ein Verfahren, mit dessen Hilfe eine verläßliche und genügend empfindliche Boranalyse in biologischem Probenmaterial relativ einfach mit wenig kostspieligen Geräten erreicht werden kann und das für Routineuntersuchungen tauglich ist.

Das zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Boranalyse von suspendiertem biologischem Zellmaterial durch Atomabsorptionsspektroskopie unter Verwendung eines Inertgasstromes durch eine Graphitküvette, wobei nicht aufgeschlossenes, nicht gemahlenes Probenmaterial mit einer Zelldichte von 5×10⁶ bis 2×10⁷ Zellen/ml mit einer Dosierpipette mit einer Spitze von 0,5 bis 2,5 mm lichter Weite der Auslaßöffnung in eine Probeneinlaßöffnung von 1 bis 3 mm Durchmesser der Graphitküvette mit pyrolytisch beschichteter Innenwand einpipettiert wird, wobei während des Dosiervorgangs eine Unterbrechung des Inertgasstroms mittels eines zeitgesteuerten Bypasses durchgeführt wird, und wobei nach der Dosierung die eigentliche Messung erfolgt.

Basis dieses Verfahrens ist die Feststellung, daß die Borbestimmung in Zellsuspensionen mit Hilfe der GF-AAS bei entsprechender Ausgestaltung hinsichtlich der Nachweisgrenze zu den oben genannten aufwendigen Methoden durchaus konkurrenzfähig ist, wobei insbesondere Serienanalysen auf einfache Weise durchgeführt werden können. Dabei ist insbesondere zwischen den für eine ausreichende Empfindlichkeit notwendigen Zelldichten und ihrer genügenden Handhabung zu optimieren.

Zwar wird über die Bestimmung von Metallspuren in biologischen Proben durch AAS schon seit längerer Zeit berichtet: So wird im Int. Arch. Occup. Environ. Hlth. 39 (1977) 121-126 über die Bestimmung von Blei in Blutproben in unterschiedlichen Techniken berichtet, wobei auch verdünnte Blutproben unmittelbar in den Graphitofen pipettiert werden. Letztere Technik wird als nicht absolut zuverlässig deklariert. So verwundert es nicht, daß diese Technik keinen Eingang in die Boranalytik von Zellmaterial gefunden hat, zumal zum einen die Zellgrößen der verdünnten Blutproben gering und zum anderen das Risiko eines Verklumpens durch Zusätze wie Erdalkaliionen (anders beim Bor) bei der Bleibestimmung entfällt.

Gemäß Anal. Chem. 58 (1986) 2614-2617 werden Blei- und Cadmiumspuren durch AAS in Pflanzenzellen nachgewiesen, indem pulverisiertes Pflanzenmaterial als Aufschlämmung in ein pyrolytisch beschichtetes Graphitrohr pipettiert werden. Ferner wird gefriergetrocknetes tierisches Gewebematerial in methanolischer Suspension analysiert, wobei eine Mischung von Glycerin, Methanol und Salpetersäure sowie ein sogenannter "Matrixmodifikator" zur Anwendung kommen.

Nach Fresenius Z. Anal. Chem. 328 (1987) 346-353 werden Cd, Cu, Mn, Pb, Zn in Gemüse (Spinat) und Einzell-Protein durch AAS nachgewiesen, indem eine Suspension von feingemahlenem Material (1-6 h in einer Zentrifugal-Kugelmühle) insbesondere unter Zumischung eines Thixotropiemittels homogenisiert und dann mittels eines Autosamplers der pyrolytisch beschichteten Graphitküvette zugeführt werden, in der dann Trocknung, Veraschung und Atomisierung nacheinander gemäß bekannter Steuerung ablaufen.

Auch gemäß Fresenius Z. Anal. Chem. 335 (1989) 195-199 erfolgt die Einführung von Probenmaterial in suspendierter Form unmittelbar in das Graphitrohr mit Hilfe eines Autosamplers, wobei die Proben unmittelbar vor der Injektion nochmals einem insbes. durch Ultraschall hervorgerufenen Mischvorgang unterzogen werden. In dieser Weise werden Mo, Ru, Rh, Pd in Kernbrennstoffabfall ohne chemische Vorbehandlung nachgewiesen.

Eine für die vorbeschriebene Prozeßtechnik geeignete Vorrichtung wird in der DE 39 24 839 A1 beschrieben, wobei eine Graphitrohrküvette mit innerem und äußerem Schutzgasstrom näher erläutert wird, deren Besonderheit in der Einregelung eines festen Verhältnisses der beiden Schutzgasströme zueinander besteht, so daß der Expansion der Gaswolke während der Atomisierung (bei der mit Gasstop oder Gasminderung gearbeitet wird) Grenzen gesetzt sind.

Auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Borbestimmung erweist sich eine Anordnung mit einer heizbaren rohrförmigen Küvette zur Atomisierung der Proben als zweckmäßig, die eine inerte Innenwand oder innere Oberfläche - ggf. in Form einer eingeschobenen Hülse - aufweist, mit der die Bildung temperaturstabiler Borverbindungen vermieden werden kann. Diese Anordnung besitzt für den Serienbetrieb einen Autosampler mit Probengefäßen und Einrichtungen zur Probenbewegung, um ein Sedimentieren o. dgl. zu vermeiden, was insbesondere mit einem Magnetrührer und Rührstäbchen in den Probengefäßen erreicht werden kann.

Für den Transport der Proben des Autosamplers in die Küvette sorgt eine Dosierpipette mit ausreichender Öffnungsweite der Spitze, die dafür im Bereich von 0,5-2,5 mm und insbesondere bei ca. 0,8 mm liegen soll. Dem angepaßt hat die Probeneinlaßöffnung der Küvette einen Durchmesser von 1-3 mm, insbesondere einen solchen von etwa 2 mm. Mit diesen geringen Öffnungsweiten werden Empfindlichkeitsverluste durch ein Abblasen von Probenmaterial aus der Öffnung vermieden.

Zusätzlich wird für eine Unterbrechung des internen Inertgasstroms durch die Küvette während des Dosiervorganges gesorgt, was insbesondere mittels eines entsprechend zeitgesteuerten Bypasses erreicht werden kann. Als Inertgasstrom dient insbesondere ein Argonstrom.

Weiterbildungen des Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen. In der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zeigen:

Fig. 1 ein Schema des GF-AAS-Geräts mit Autosampler und Bypass;

Fig. 2 ein Ausführungsdetail des Autosamplers zur Probennahme;

Fig. 3 ein Schema der Probenzubereitung;

Fig. 4-7 Analyseergebnisse der Borbestimmung in Zellmaterial.

Für die Borbestimmungen wurde ein Perkin-Elmer Atomabsorptionsspektrophotometer (AAS) Modell 4000 verwendet, das mit einer Perkin-Elmer HGA-500 Graphitrohrküvette ausgerüstet war. In diesem Fall ist die Küvette rohrförmig, aber selbstverständlich können auch andere Geometrien vorgesehen werden.

Mit Hilfe eines Autosamplers (Fig. 2; Perkins-Elmer AS-1) wurden 20 µl der zu untersuchenden Zellsuspension durch ein Dosierloch in die Mitte des elektrisch beheizbaren Graphitrohres pipettiert. Hier wurde die Zellsuspension in einem mehrstufigen Heizprogramm bei 120°C getrocknet, bei 1000°C verascht und bei 2500°C atomisiert, wie in Tabelle 1 wiedergegeben ist.

Tabelle 1

Fig. 1 zeigt ein Schema für den verwendeten modifizierten Atomabsorptionsspektrographen mit dem Autosampler und der Graphitrohrküvette 1 in Aufsicht. Der Probenteller 2 kann bis zu 30 Probenbecher aufnehmen und zur Position des Dosierrüssels 3 transportieren. Unterhalb des Drehtisches des Probentellers sind zwei Magnetrührer 4 zum Antrieb der Rührstäbchen angebracht. In Position 5 befindet sich der (nicht näher ausgeführte) Schalter für die beiden 3-Wege-Magnetventile 6, die über ein Zeitverzögerungsrelais 7 gesteuert werden. Die Strömungsrichtungen des internen Argonstromes sind durch Pfeilspitzen angedeutet. Die Dosieröffnung 8 des Graphitrohrs 1 befindet sich innerhalb der Ofeneinheit. Zum Betrieb der Magnetventile dient ein 24-V-Netzteil (9).

Während des gesamten Prozesses wurde das Graphitrohr ständig von 300 ml Argon pro Minute um- bzw. durchströmt. Um die Verweildauer der Atomwolke im Strahlengang zu verlängern, wurde der interne Argonstrom für die Dauer der Atomisierung unterbrochen. Durch pyrolytische Beschichtung der Innenwand der Graphitrohre wurde die Bildung von Borcarbiden beim Atomisieren vermieden, die sich in der Graphitrohrküvette praktisch nicht mehr atomisieren lassen und sich somit der Analyse mittels der Atomabsorptionsspektrometrie entziehen würden.

Als Strahlungsquelle diente eine Bor-dotierte Hohlkathodenlampe (Perkin-Elmer), die ein für Bor charakteristisches Linienspektrum emittiert. Bei einer Wellenlänge von 249,7 nm und einer Eintrittsspaltbreite von 0,7 nm wurde die Absorption der im Graphitrohr erzeugten Atomwolke gemessen. Die Untergrundkompensation erfolgte kontinuierlich durch eine Deuterium-Lampe.

Gemäß Fig. 2 arbeitet der Probenteller 2 des zum Autosampler gehörenden Probenwechslers 10 mit dem Dosierrüssel 3 zusammen, der Probenmaterial aus den Probengefäßen 11 zur (nicht dargestellten) Graphitküvette befördert. Das Handrad 12 dient zur manuellen Bewegung des Dosierrüssels 3 zur Justierung der Pipettenspitze in Bezug auf das Dosierloch 8 des Graphitrohres 1. Die Drehknöpfe 13, 14 dienen zur Justierung der Pipettenspitze in Richtung der Längs- bzw. Querachse des Graphitrohres. Die Rändelscheibe 15 dient zur Justierung der Eintauchtiefe der Pipettenspitze im Graphitrohr.

Die Dosierkapillare des Dosierrüssels hatte einen Innendurchmesser von 0,80 mm, so daß auch Suspensionen mit einer hohen Zelldichte problemlos in das Graphitrohr pipettiert werden konnten. Der notwendigerweise möglichst geringe Durchmesser des Dosierlochs der Küvette (im vorliegenden Fall 2,00 mm) führt zu einem schmalen Spalt zwischen der Außenwand der Kapillare (Außendurchmesser: 1,55 mm) und der Wand des Graphitrohrs und damit Problemen beim Dosiervorgang, wobei ggf. ein großer Teil der Probe aus dem Graphitrohr herausgetrieben wird. Um dies zu vermeiden, wird entweder der interne Argonstrom während des Dosiervorganges unterbrochen oder, wie in Fig. 1 dargestellt, mit Hilfe von zwei 3-Wege-Magnetventilen über einen Bypaß geleitet.

Diese Ventile sind so installiert, daß sie in stromlosem Zustand den Argonstrom nicht beeinflussen. Während des Dosiervorgangs wird vom Dosierrüssel 3 der Endschalter 5 betätigt, der beide Ventile 6 so schaltet, daß der Spülgasstrom unterbrochen wird bzw. das Argon ins Freie entweicht. Die Unterbrechungsdauer kann über das Zeitverzögerungsrelais 7 variiert werden. Unter den im vorliegenden Beispiel gewählten Bedingungen erwies sich eine Verzögerung von 5 Sekunden als gut geeignet.

Um ein Sedimentieren der Zellen in den Probenbechern zu verhindern, waren neben und unter dem Probenteller je ein Magnetrührer 4 (Variomag Micro), die beide zusammen 7×2 mm große Magnetrührstäbchen in den Probenbechern antreiben. Dadurch konnten gleichzeitig bis zu 10 der insgesamt 30 auf dem Probenteller befindlichen Becherchen gleichmäßig gerührt und die Zellen somit in Suspension gehalten werden.

Um zu zeigen, daß zwischen der Menge an Bor in den Zellsuspensionen und der gemessenen Atomabsorption ein proportionales Verhältnis besteht, wurden zunächst Eichmessungen sowohl mit Borsäure als auch mit Bor-phenylalanin (BPA) durchgeführt. Dazu wurde bei der Probenzubereitung, wie folgt, verfahren (vgl. Fig. 3):

In 1 ml AAS-Probenbecher wurden zuerst 50 µl 125 mM CaCl₂-Lösung und dann 10 µl konzentrierte 9,5 M HCl vorgelegt. Nach Zugabe von je 0,5 ml Bezugslösung bzw. doppelt destilliertem Wasser wurden alle Probengefäße auf einen Magnetrührer gestellt und je ein 7×2 mm Rührstäbchen eingesetzt. Je 0,45 ml der vorher mit AAS-Medium (handelsübliches Zellkulturmedium ohne Serum und ohne Natriumhydrogencarbonat mit EDTA - oder Wasser) verdünnten und mit einer Pasteurpipette gut gemischten Zellsuspension wurden in die Probenbecher pipettiert. Zuletzt wurden noch 20 µl einer 10%igen Triton-X-100- Lösung zugegeben. Die Eichlösungen wurden mit Borkonzentrationen von 0,5, 1,0 und 1,5 mg/l angesetzt. Für die AAS-Messungen wurden je 20 µl mit dem Dosierrüssel in die Küvette pipettiert.

Fig. 4 zeigt die beiden Eichgeraden in vollständiger Koinzidenz zwischen 0 und 0,75 mg Bor/l Probenlösung. Die Werte sind in Tab. 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

Wie man sieht, spielt es für Absorptionsmessungen in diesem Bereich keine Rolle, in welcher der beiden chemischen Formen das Bor vorliegt. Ebenfalls konnte unter diesen Bedingungen keine Isopendiskriminierung zwischen ¹⁰Bor (BPA) und natürlichem Bor (H₃BO₃; 80% ¹¹Bor und 20% ¹⁰Bor) festgestellt werden.

Anschließend wurde die Inkorporation von Bor via BPA bzw. Borsäure in Zellen mit Hilfe der GF-AAS bestimmt:

Zellen, die 24 Std. lang mit je 1; 2,5; 5 und 10 mMol BPA entsprechend 10, 50 und 100 mg Bor/l Medium kultiviert worden waren, wurden, wie anhand von Fig. 3 beschrieben, für die GF-AAS vorbereitet. Dabei wurde mit Verdünnungsfaktoren für die untersuchten Zellsuspensionen gearbeitet, wie in Tab. 3 angegeben ist.

Tabelle 3

Verdünnungsfaktoren für die BPA-Inkorporationsmessungen

In Fig. 5 sind die Ergebnisse der Standardadditionsmessungen graphisch dargestellt: Bei allen Diagrammen erkennt man sofort den linearen Verlauf der Bezugsgeraden. An dem Schnittpunkt der über die Ordinate hinaus verlängerten Bezugsgeraden mit dem negativen Ast der Abszisse wurde der Betrag der Borkonzentration der betreffenden Probe abgelesen. In Tabelle 4 sind die graphisch bestimmten Borkonzentrationen ± Größtfehler aufgeführt, sowie die durch Multiplikation mit den Verdünnungsfaktoren aus Tab. 3 errechneten Borkonzentrationen pro ml Ausgangszellsuspension und die Borkonzentrationen bezogen auf die Proteinmenge.

Tabelle 4

Tabelle 5 zeigt Mittelwerte (± Standardabweichung) aus drei Versuchsreihen, die - wie Tab. 6 zeigt - in Borkonzentrationen in nmol pro 10³ Zellen, Anzahl Boratome pro Zelle, sowie Borkonzentrationen bezogen auf 1 g B16F1-Melanomzellen umgerechnet wurden.

Tabelle 5

Tabelle 6

Zur Ermittlung der Präzision der Borbestimmung wurde bei einer einzelnen Probe aus einer Zellsuspension des BPA-Versuchs Nr. 1 (2,5 mmol BPA/l, 24 h Inkubationsdauer) die optische Absorption mit 3 und mit 9 Dosierungen bestimmt. Ein Vergleich beider Mittelwerte und der relativen (prozentualen) Standardabweichungen (s. D.) bei 3 Analysen gegenüber 9 Analysen pro Probe ergab folgendes Ergebnis:

Wie man sieht, wird bereits mit 3 Analysen eine Präzision erreicht, die durch Steigung der Analysenzahl auf 9 nur noch geringfügig verbessert wird.

Bei Variation der Zelldichte in den Zellsuspensionen der Probenlösung wurde eine Zelldichte von etwa 5×10⁷ B16-Zellen/2 ml Probenlösung als oberer Grenzwert ermittelt.

Die Inkorporation von Bor in Zellen via Borsäure wurde analog zu den BPA-Messungen ermittelt. Fig. 6 zeigt das erhaltene Ergebnis.

Das Verfahren zur Borbestimmung in Zellmaterial ist von erheblicher Leistungsfähigkeit und läßt z. B. Unterschiede in Meßergebnissen erkennen, die ausgehend von borinkorporierten Zellen ermittelt werden, die vom Kulturträger mechanisch entfernt oder mit Trypsin/EDTA abgelöst wurden (siehe Fig. 7).

Die vorstehenden Versuche und Ergebnisse machen deutlich, daß auf relativ einfache Weise und mit sehr viel geringerem Aufwand Borinkorporationen in Zellmaterialien überwacht werden können als nach den bislang dafür akzeptierten Verfahren der DCP-AES, ICP-AES.

d) Nachweisgrenze von Bor in Zellsuspensionen

Das hier beschriebene Verfahren liefert zuverlässige Ergebnisse bis zu einer Borkonzentration von 0,05 mg/Bor/l AAS-Probenlösung. Im Vergleich dazu werden mit der DCP-AES 0,1 mg Bor/l Zellsuspension (Anal. Chem. 63 (1991) 890-93) und mit der ICP-AES 0,05 mg Bor/l erreicht (Proceedings of the Fourth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer, Dec. 4-7, 1990, in Sydney, Australia, B. J. Allen, ital. (Eds.), Plenum Press, New York (1992), 297-300.

Durch Anwendung des Standardadditionsverfahrens erhöht sich wegen des Verdünnungsfaktors von 2,29 der untere Grenzwert für die Borkonzentration in den Zellsuspensionen auf 0,115 mg Bor/l. Zusätzlich zu der per definitionem festgelegten Nachweisgrenze kann dieser Wert als die in der Routine erreichte Bestimmungsgrenze betrachtet werden.

e) Richtigkeit der Borbestimmungen

Um die Richtigkeit des hier angewendeten Analyseverfahrens zu überprüfen, wurden definierte Mengen an Bor in Form von Borsäure bzw. BPA im selben Verhältnis, wie für die Eichmessungen beschrieben, den Zellsuspensionen zugesetzt. Danach wurde der Borgehalt von denjenigen Suspensionen bestimmt, zu denen vorher schon 0,25 mg Bor/l hinzugegeben worden waren. In allen Fällen wurden 100±5% des hinzugefügten Bors wiedergefunden.

Claims

1. Verfahren zur Boranalyse von suspendiertem biologischen Zellmaterial durch Atromabsorptionsspektroskopie unter Verwendung eines Inertgasstromes durch eine Graphitküvette, wobei nicht aufgeschlossenes, nicht gemahlenes Probematerial mit einer Zelldichte von 5×10⁶ bis 2×10⁷ Zellen/ml mit einer Dosierpipette mit einer Spitze von 0,5 bis 2,5 mm lichter Weite der Auslaßöffnung in eine Probeneinlaßöffnung von 1 bis 3 mm Durchmesser der Graphitküvette mit pyrolytisch beschichteter Innenwand einpipettiert wird, wobei während des Dosiervorgangs eine Unterbrechung des Inertgasstroms mittels eines zeitgesteuerten Bypasses durchgeführt wird, und wobei nach der Dosierung die eigentliche Messung erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zellmaterial vor dem Dosiervorgang mittels eines Magnetrührers vergleichmäßigt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellsuspension mit einer Ca²⁺-Lösung versetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine weitere Unterbrechung des Inertgasstromes während der Atomisierung erfolgt.

5. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Analyse von Tumorgewebe.