DE4314493A1 - Verfahren und Teststreifen zur Bestimmung eines Analyten - Google Patents

Description

Die Erfindung richtet sich insbesondere auf immunologische Nachweisverfahren wie sie seit vielen Jahren bei qualitativen und quantitativen Bestimmungen von Bestandteilen in Körperflüssigkeiten eine erhebliche Rolle spielen. Sie zeichnen sich durch hohe Spezifität und Empfindlichkeit aus und basieren auf der immunologischen Wechselwirkung zwischen dem Analyten und einem diesen Analyten mit hoher Spezifität bindenden Biomaterial. Durch Markieren eines der Bindungspartner der immunologischen Bestimmung kann der Grad der Umsetzung und damit die Konzentration des Analyten bestimmt werden.

Man unterscheidet verschiedene immunologische Bestimmungsverfahren nach der gewählten Markierung. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf sogenannte Enzymimmunoassays bei denen ein Enzym als Markierung verwendet wird. Der Nachweis des Enzyms verläuft dabei durch Einwirkung des Enzyms auf ein Substrat, das während der durch das Enzym katalysierten Reaktion eine Veränderung erfährt. Diese Veränderung ist im einfachsten Fall eine Änderung der Farbe, die visuell ausgewertet oder photometrisch vermessen werden kann.

Ein besonders wichtiges Verfahren bedient sich eines enzymmarkierten Bindungspartners, beispielsweise eines Antigens, der nicht fixiert und somit im System frei beweglich ist und einem trägerfixierten Bindungspartner, in diesem Fall einem Antikörper. Die Gesamtreaktion enthält einen Reaktionsschritt, bei dem die Bindungspartner miteinander inkubiert werden und die spezifische Bindungsreaktion zwischen ihnen stattfindet. Nach Ablauf der Inkubation ist die Menge des enzymmarkierten Bindungspartners, der an den trägerfixierten Bindungspartner gebunden ist, umgekehrt proportional zur Konzentration des Analyten. Die Menge des gebundenen enzymmarkierten Bindungspartners wird durch Einwirkung des Markierungsenzyms auf ein farbgebendes Substrat bestimmt. Eine Variante des oben beschriebenen Prinzips wird im folgenden beschrieben:

Zur Bestimmung eines Antigens in einer Probe wird ein Teil der Probe gemeinsam mit einer definierten Menge enzymmarkierten Antigens und trägerfixiertem Antikörper inkubiert. Dabei kommt es zu einer Kompetition von Antigen und enzymmarkiertem Antigen um die begrenzte Anzahl Bindungsstellen am fixierten Antikörper. Je mehr nichtmarkiertes Antigen aus der Probe vorhanden ist, desto weniger enzymmarkiertes Antigen wird am trägerfixierten Antikörper gebunden.

Nach Ablauf der Inkubation ist die Menge des enzymmarkierten Antigens, die an den trägerfixierten Antikörper gebunden ist, umgekehrt proportional zur Konzentration des Antigens in der Probe.

Zur Bestimmung des am trägerfixierten Antikörper gebundenen enzymmarkierten Antigens wird die Reaktion des Markierungsenzyms mit einem farberzeugenden Substrat eingesetzt. Da diese Reaktion jedoch nur mit dem Markierungsenzym des an den trägerfixierten Antikörper gebundenen Antigens stattfinden darf, ist vorher eine Trennung vom gleichzeitig noch vorhandenen freien enzymmarkierten Antigen notwendig.

Die Trennung wird in den üblichen Verfahren durch eine Vielzahl von Waschschritten erreicht, da die Genauigkeit der Analyse in erheblichem Umfang von der Qualität der Trennung zwischen gebundenem und ungebundenem enzymmarkierten Antigen abhängig ist.

Die Bestimmungen werden durch die große Anzahl der nötigen Schritte zeitaufwendig, sofern sie manuell durchgeführt werden. Geräte zur mechanisierten Durchführung dieser Bestimmungen sind aufgrund der notwendigen komplizierten Konstruktion wartungsaufwendig und teuer. Sowohl die manuelle als auch mechanisierte Durchführung der Bestimmungen erfordert geschultes Personal.

Demgegenüber besteht ein wachsender Bedarf an entsprechenden einfach handhabbaren Bestimmungsmethoden. Wünschenswert ist die Übertragung der bekannten immunologischen Verfahren auf trägergebundene Testsysteme, wie sie als "Teststreifen" für viele nichtimmunologische Bestimmungen seit langem bekannt sind.

Zu den bisher in der Patentliteratur beschriebenen Verfahren, die mit wenigen Reaktionsschritten auskommen, gehören immunchromatographische Bestimmungsmethoden, wie sie zum Beispiel in EP 143574 A1 beschrieben sind.

Spezifisch für sie ist, daß für den Träger zur Fixierung der Antikörper poröse Materialien verwendet werden, die einen Flüssigkeitstransport durch Kapillarkräfte zulassen. Die Träger sind so gestaltet, daß der Flüssigkeitstransport in ihnen in einer Vorzugsrichtung stattfindet. Wird ein Gemisch aus Probenflüssigkeit und einer definierten Menge enzymmarkiertem Antigen mit dem so konstruierten Testsystem in Verbindung gebracht, wandert die Probenflüssigkeit aufgrund der Kapillarkräfte durch das Testsystem. Während der Wanderung treten Antigen und enzymmarkiertes Antigen aus der Probenflüssigkeit mit dem Antikörper in Wechselwirkung.

Der im Testsystem fixierte Antikörper ist in einem so bemessenen Überschuß vorhanden, daß auch bei maximal möglicher Antigenkonzentration noch keine Absättigung aller vorhandenen Bindungsstellen auftritt. Aufgrund des Flüssigkeitstransports in einer Vorzugsrichtung erfolgt die Besetzung der Bindungsstellen an den fixierten Antikörpern in Richtung des Flüssigkeitstransports. Je mehr Antigen in der Probe vorhanden ist, desto größer ist die Anzahl an besetzten Bindungsstellen am fixierten Antikörper.

Für die quantitative Auswertung der Bindung wird der Träger in einer zweiten Inkubation mit einer Lösung des Substrats für das Markerenzym in Kontakt gebracht. Aufgrund der homogenen Mischung des Antigens mit dem enzymmarkierten Antigen wird sich an allen Stellen, an denen Antigen am Antikörper gebunden ist, eine Färbung entwickeln. Die Größe der entstehenden farbigen Fläche ist proportional zur Konzentration des Antigens in der Probe. Durch Wahl einer gestreckten Form des Trägers mit Vorzugsrichtung des Flüssigkeitstransports in Längsrichtung kann die Messung auf die Länge der gefärbten Fläche beschränkt werden.

Hauptnachteil der beschriebenen Methode ist, daß spezielle Maßnahmen erforderlich sind, um zu gewährleisten, daß die Flüssigkeitsausbreitung im Träger gleichmäßig und reproduzierbar erfolgt, da sie Grundlage der quantitativen Auswertung ist. Weiterhin nachteilig sind die notwendigen zwei getrennten Inkubationen und daß die Probe manuell mit enzymmarkiertem Antigen versetzt werden muß.

Die in den Patentansprüchen definierte Erfindung kombiniert Prinzipien immunologischer Bestimmungen des kompetitiven und des immunchromatographischen Typs zu einer Methode, die mit wenigen Reaktionsschritten auskommt und eine zuverlässige Quantifizierung ermöglicht.

Das wesentliche Element der vorliegenden Erfindung liegt darin, wie bei der immunchromatographischen Technik einen porösen Träger mit kapillarem Flüssigkeitstransport für die Antikörperfixierung zu verwenden, die Menge des fixierten Antikörpers aber analog zur kompetitiven Methode festzulegen.

Weiterhin wesentlich für die Erfindung ist, daß die bisher notwendigen manuellen Schritte dadurch ersetzt werden, daß das Testsystem mehrere sequentiell angeordnete Elemente mit spezifischen Reagenzien enthält. Die Reagenzien werden dort von der kapillar transportierten Probenflüssigkeit gelöst und gehen in die Reaktionen ein.

Dazu wird die Konzentration an fixiertem Antikörper im Testsystem so gewählt, daß sie im Unterschuß im Vergleich zur Summe der Konzentrationen aus Antigen und enzymmarkiertem Antigen liegt. So wird gewährleistet, daß bei der Inkubation des Testsystems mit einem Überschuß an Antigen und enzymmarkiertem Antigen nur ein Teil des markierten Antigen am Antikörper zurückgehalten wird, und der nicht am fixierten Antikörper gebundene Überschuß mit dem kapillaren Flüssigkeitsstrom über die fixierten Antikörper hinweg transportiert wird. Zwischen der Menge des nicht gebundenem enzymmarkierten Antigens und der Konzentration an Antigen in der Probe besteht ein proportionaler Zusammenhang.

Zur Quantifizierung der Menge an ungebundenem enzymmarkierten Antigen im kapillaren Flüssigkeitsstrom wird dieser anschließend in ein Element des Systems geleitet, in der sich in Abhängigkeit von der übergegangenen Menge an markiertem Antigen eine Färbung entwickelt.

Die Erfindung wird im folgenden, anhand des in den schematisierten Abb. 1 und 2 dargestellten Ausführungsbeispiels näher beschrieben. Die Abb. 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Teststreifen. Man erkennt die langgestreckte Basisfolie 1 und den in der Gesamtheit als 2 gekennzeichneten Reaktionsbereich.

Abb. 2 zeigt die einzelnen Elemente des erfindungsgemäßen Teststreifens. Der Reaktionsbereich 2 besteht im wesentlichen aus vier verschiedenen Zonen: Der Kontaktzone 3, der Depotzone 4, der Binderzone 5 und der Indikatorzone 6. Mit der vor dem eigentlichen Reaktionsbereich befestigtigten Kontaktzone 3 wird der Teststreifen in die Probe eingetaucht. Die Zonen 3, 4, 5 und 6 sind durch Klebefolien 7 und 8 so miteinander verbunden, daß sie in einem einen Flüssigkeitstransport ermöglichenden Kontakt stehen. Der gesamte Reaktionsbereich 2 ist mit einer doppelseitigen Klebefolie 9 auf der Basisfolie 1 fixiert.

Die Depotzone 4 enthält ein Konjugat aus dem Antigen und einem Markierungsenzym. Die Binderzone 5 enthält einen für das Antigen spezifischen trägerfixierten Antikörper. In der Indikatorzone 6 ist ein farbgebendes Substrat S_F für das Markierungsenzym, sowie gegebenenfalls ein Hilfsenzym, zur Erzeugung eines weiteren Substrats für die Reaktion zwischen Markierungsenzym und farbgebendem Substrat, enthalten. Weiterhin enthalten Depot- und Binderzone ein Substrat S_H für das Hilfsenzym.

Wenn der in der Abbildung dargestellte Teststreifen durch Eintauchen mit der Kontaktzone 3 mit einer Probe in Berührung gebracht wird, strömt die Probenflüssigkeit durch die Kontaktzone 3 in die Depotzone 4 und löst das Konjugat aus Antigen und Markierungsenzym sowie das Substrat S_H. Da die Depotzone 4 auch mit der Binderzone 5 in Flüssigkeitskontakt steht, dringen die gelösten Substanzen in der Probenflüssigkeit in die Binderzone 5 ein.

In der Binderzone findet eine Kompetition zwischen Antigen aus der Probe und Antigenenzymkonjugat um die Bindung am trägerfixierten Antikörper statt. Je mehr Antigen in der Probe vorhanden ist, desto mehr Antigen wird am trägerfixierten Antikörper gebunden und desto weniger Antigenenzymkonjugat wird am trägerfixierten Antikörper gebunden. In der Binderzone löst die Probenflüssigkeit weiteres Substrat S_H. Das ungebundene Antigenenzymkonjugat und das Substrat S_H treten mit der Probenflüssigkeit in die Indikatorzone 6 über.

In der Indikatorzone 6 reagiert das Substrat S_H mit dem Hilfsenzym und liefert das für die Reaktion zwischen Markierungsenzym und farbgebendem Substrat S_F notwendige weitere Substrat S_R. Das Markierungsenzym reagiert mit dem hier gespeicherten farbgebendem Substrat S_F und dem Substrat S_R zu einer farbigen Substanz. Die Menge der erzeugten farbigen Substanz ist proportional zur übergetretenen Menge an Antigenenzymkonjugat und somit proportional zur Menge an Probenantigen. Die Farbentwicklung kann visuell ausgewertet oder reflexionsphotometrisch gemessen werden.

Beispiel Teststreifen zur Bestimmung der Cortisolkonzentration im Speichel gemäß Abb. 1, 2 Kontaktzone 3

Die Kontaktzone wird aus Filterpapier Typ MN 615 (Macherey-Nagel + Co., Düren, BRD) hergestellt. Es werden Streifen von 10 × 80 mm angefertigt, die ohne weitere Imprägnierung zur Herstellung der Teststreifen verwendet werden.

Depotzone 4

Die Depotzone wird aus Glasfaserpapier Typ 3362 (Schleicher & Schuell, Dassel, BRD) hergestellt. Streifen von 10 × 80 mm werden 30 s in 0,05 M Trispuffer pH 7,2, der 1,5% Glucose und 0,3% Rinderserumalbumin (Fraktion V, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) enthält, eingebracht. Die Trocknung der Zonen erfolgt im Stickstoffstrom bei 20°C. Die Einbettung des Cortisol-Peroxidas-Konjugats (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) erfolgt durch eine Inkubation von 30 s in einer Lösung von Cortisol-Peroxidas-Konjugat in 0,05 M Trispuffer pH 7,2. Nach Abstreifen überschüssiger Lösung werden die Zonen bei 20°C im Stickstoffstrom getrocknet.

Binderzone 5

Streifen aus Filterpapier Typ MN 615 (Macherey-Nagel + Co., Düren, BRD) der Größe 30 × 70 mm werden unter Rühren in einer 0, 1 mol/l Lösung von 1,1′- Carbonyldiimidazol (Fluka Chemie AG, Buchs, CH) in Dichlormethan inkubiert. Die Inkubationsdauer beträgt 3 h bei Raumtemperatur. Pro cm² Papier wird 1 ml Lösung eingesetzt. Nach Beendigung der Inkubation wird die Lösung abgegossen und neunmal mit einem Drittel des Inkubationsvolumens Dichlormethan jeweils 30 Sekunden gewaschen. Die Trocknung der Papierstreifen erfolgt im Stickstoffstrom bei 20°C.

In Petrischalen werden zu, in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,5 rekonstituierten, lyophilisierten Cortisol-Antiserum (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) 1,1′- Carbonyldiimidazol-aktivierte Papierstreifen gegeben. Die Lösung wird 2 h lang auf einem Magnetrührer langsam gerührt. Nach Abschluß der Inkubation wird die Lösung aus der Petrischale abgesaugt. Zur Blockierung verbliebener Bindungsstellen am aktivierten Papier wird eine 0,5%ige Lösung von Rinderserumalbumin (Fraktion V, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,5 zu den Papierstreifen gegeben und weitere 30 Minuten unter Rühren inkubiert. Anschließend wird dreimal mit 0,05 M Trispuffer pH 7,2 gewaschen. Zum Abschluß wird die Depotzone in einer Lösung von 1,5% Glucose und 0,1% Tween 20 in 0,05 M Trispuffer pH 7,2 für 30 Sekunden inkubiert. Die Trocknung erfolgt nach Abstreifen überschüssiger Lösung im Stickstoffstrom bei 20°C.

Indikatorzone 6

Zur Herstellung der Indikatorzone wird vliesunterstützte Cellulosenitratmembran Typ 439 386 (Schleicher & Schuell, Dassel, BRD) verwendet. Streifen der Abmessungen 10 _* 70 mm werden zuerst 30 Sekunden in eine Lösung von 2 mg/ml 3,3′,5,5′- Tetramethylbenzidin (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) in Chloroform eingebracht. Nach Abstreifen überschüssiger Lösung wird im Stickstoffstrom bei 20°C getrocknet. Die getrockneten Cellulosenitratstreifen werden dann 30 Sekunden in eine Lösung von 0,1% Tween 20 (E. Merck, Darmstadt, BRD) in Puffer pH 5,5 (0,05 M Citrat; 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat) eingebracht und nach Abstreifen überschüssiger Lösung erneut im Stickstoffstrom bei 20°C getrocknet. In einer dritten Imprägnierung werden die getrockneten Cellulosenitratstreifen dann 30 Sekunden in eine Lösung von 200 U/ml Glucoseoxidase (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) in Puffer pH 5,5 (0,05 M Citrat; 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat) eingebracht und nach Abstreifen überschüssiger Lösung erneut im Stickstoffstrom bei 20°C getrocknet.

Herstellung der Teststreifen

Die Zonen werden nach den beschriebenen Spezifikationen zugeschnitten und mittels Klebefilm Typ 5526 (Beiersdorf AG, Hamburg, BRD) nach Maßgabe der Abbildung zu Bahnen zusammengefügt. Diese Bahnen werden mit doppelseitigem Klebefilm Typ 5338 (Beiersdorf AG, Hamburg, BRD) nach Maßgabe der Zeichnungen auf Trägerfolien Typ 96019 (Rank Xerox Limited, UK) befestigt. Aus dem Verbund von Reaktionszone und Trägerfolie werden mit einem Rollenschneidegerät Streifen von 4 mm Breite geschnitten. Die Lagerung der Streifen erfolgt bei 4°C unter Ausschluß von Feuchtigkeit.

Claims (11)

1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten aus einer Probe, insbesondere einer Körperflüssigkeit, wobei der Analyt ein Teil eines Paares von spezifischen Bindungspartnern ist. Die Bestimmung findet unter Verwendung eines enzymatisch markierten Analytanalogon und des trägerfixierten anderen Bindungspartners statt. Das Verfahren enthält einen Reaktionsschritt bei dem Analyt, enzymmarkiertes Analytanalogon und trägerfixierter Bindungspartner miteinander inkubiert werden. Nach Ablauf der spezifischen Bindungsreaktion ist die Menge des nicht an den trägerfixierten Bindungspartner gebundenen enzymmarkierten Analytanalogon ein Maß für die Konzentration des Analyten. Diese wird mit Hilfe der enzymatischen Markierung bestimmt, indem man das Markierungsenzym mit einem farbgebenden Substrat reagieren läßt. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungs- und Reaktionspartner im Zusammenhang mit der spezifischen Konstruktion des unter Anspruch 6, beschriebenen Teststreifens so gewählt sind, daß die Bindungs- und sonstigen Reaktionen in ihrer Sequenz allein durch den kapillaren Flüssigkeitstransport festgelegt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der trägerfixierte Bindungspartner sowohl mit dem Analyten als auch mit dem enzymmarkierten Analytanalogon bindungsfähig ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Menge des trägerfixierten Bindungspartners so gewählt ist, daß sie kleiner als die Menge von Analyt und enzymmarkiertem Analytanalogon ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Analyt und das enzymatisch markierte Analytanalogon Antigene sind und der trägerfixierte Bindungspartner ein Antikörper für die Antigene ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Trägermaterial zur Fixierung des einen Bindungspartners kapillaren Flüssigkeitstransport gestattet.

6. Teststreifen für die Bestimmung eines Analyten aus einer Probe, insbesondere einer Körperflüssigkeit, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er die folgenden Reaktionspartner enthält: Ein enzymatisch markiertes Analogon zum Probenanalyten, einen trägerfixierten Bindungspartner, zusätzlich ein farberzeugendes Substrat des Markierungsenzyms sowie Reaktionspartner die für eine optimale Reaktion zwischen Markierungsenzym und farbgebendem Substrat notwendig sind. Der Teststreifen weist eine Einteilung in drei Reaktionszonen auf, die aus porösen Materialien bestehen und kapillaren Flüssigkeitstransport gestatten.

7. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Reaktionszonen so verbunden sind, daß sie in einem Flüssigkeitsaustausch ermöglichendem Kontakt stehen und die Probe, die auf den Streifen aufgetragen wird, durch Kapillarkräfte die drei Reaktionszonen sequentiell durchläuft.

8. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Reaktionszone enzymmarkiertes Analytanalogon in einer solchen Form enthält, daß dieses von der Probenflüssigkeit gelöst werden kann und mit dem kapillaren Flüssigkeitsstrom in die weiteren Reaktionszonen geleitet wird. Im folgenden wird diese Reaktionszone als Depotzone bezeichnet.

9. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Reaktionszone, die nach der Depotzone vom kapillaren Flüssigkeitsstrom erreicht wird, den trägerfixierten Bindungspartner enthält und hier die Bindungsreaktionen zwischen den Bindungspartnern stattfinden. Im folgenden wird diese Reaktionszone als Binderzone bezeichnet.

10. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Reaktionszone, die nach der Binderzone vom kapillaren Flüssigkeitsstrom erreicht wird, das farbgebende Substrat für das Markierungssystem enthält. Im folgenden wird diese Reaktionszone als Indikatorzone bezeichnet.

11. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß Depot- und Binderzone weitere Reaktionspartner für die Reaktion von Markierungsenzym und farbgebendem Substrat enthalten können, die mit dem kapillaren Flüssigkeitsstrom die Indikatorzone erreichen und dann für die Reaktionen zur Verfügung stehen.