DE4314493A1 - Verfahren und Teststreifen zur Bestimmung eines Analyten - Google Patents
Verfahren und Teststreifen zur Bestimmung eines AnalytenInfo
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Description
Die Erfindung richtet sich insbesondere auf immunologische Nachweisverfahren wie
sie seit vielen Jahren bei qualitativen und quantitativen Bestimmungen von
Bestandteilen in Körperflüssigkeiten eine erhebliche Rolle spielen. Sie zeichnen sich
durch hohe Spezifität und Empfindlichkeit aus und basieren auf der
immunologischen Wechselwirkung zwischen dem Analyten und einem diesen
Analyten mit hoher Spezifität bindenden Biomaterial. Durch Markieren eines der
Bindungspartner der immunologischen Bestimmung kann der Grad der Umsetzung
und damit die Konzentration des Analyten bestimmt werden.
Man unterscheidet verschiedene immunologische Bestimmungsverfahren nach der
gewählten Markierung. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf sogenannte
Enzymimmunoassays bei denen ein Enzym als Markierung verwendet wird. Der
Nachweis des Enzyms verläuft dabei durch Einwirkung des Enzyms auf ein Substrat,
das während der durch das Enzym katalysierten Reaktion eine Veränderung erfährt.
Diese Veränderung ist im einfachsten Fall eine Änderung der Farbe, die visuell
ausgewertet oder photometrisch vermessen werden kann.
Ein besonders wichtiges Verfahren bedient sich eines enzymmarkierten
Bindungspartners, beispielsweise eines Antigens, der nicht fixiert und somit im
System frei beweglich ist und einem trägerfixierten Bindungspartner, in diesem Fall
einem Antikörper. Die Gesamtreaktion enthält einen Reaktionsschritt, bei dem die
Bindungspartner miteinander inkubiert werden und die spezifische Bindungsreaktion
zwischen ihnen stattfindet. Nach Ablauf der Inkubation ist die Menge des
enzymmarkierten Bindungspartners, der an den trägerfixierten Bindungspartner
gebunden ist, umgekehrt proportional zur Konzentration des Analyten. Die Menge
des gebundenen enzymmarkierten Bindungspartners wird durch Einwirkung des
Markierungsenzyms auf ein farbgebendes Substrat bestimmt. Eine Variante des
oben beschriebenen Prinzips wird im folgenden beschrieben:
Zur Bestimmung eines Antigens in einer Probe wird ein Teil der Probe gemeinsam
mit einer definierten Menge enzymmarkierten Antigens und trägerfixiertem
Antikörper inkubiert. Dabei kommt es zu einer Kompetition von Antigen und
enzymmarkiertem Antigen um die begrenzte Anzahl Bindungsstellen am fixierten
Antikörper. Je mehr nichtmarkiertes Antigen aus der Probe vorhanden ist, desto
weniger enzymmarkiertes Antigen wird am trägerfixierten Antikörper gebunden.
Nach Ablauf der Inkubation ist die Menge des enzymmarkierten Antigens, die an
den trägerfixierten Antikörper gebunden ist, umgekehrt proportional zur
Konzentration des Antigens in der Probe.
Zur Bestimmung des am trägerfixierten Antikörper gebundenen enzymmarkierten
Antigens wird die Reaktion des Markierungsenzyms mit einem farberzeugenden
Substrat eingesetzt. Da diese Reaktion jedoch nur mit dem Markierungsenzym des
an den trägerfixierten Antikörper gebundenen Antigens stattfinden darf, ist vorher
eine Trennung vom gleichzeitig noch vorhandenen freien enzymmarkierten Antigen
notwendig.
Die Trennung wird in den üblichen Verfahren durch eine Vielzahl von
Waschschritten erreicht, da die Genauigkeit der Analyse in erheblichem Umfang
von der Qualität der Trennung zwischen gebundenem und ungebundenem
enzymmarkierten Antigen abhängig ist.
Die Bestimmungen werden durch die große Anzahl der nötigen Schritte
zeitaufwendig, sofern sie manuell durchgeführt werden. Geräte zur mechanisierten
Durchführung dieser Bestimmungen sind aufgrund der notwendigen komplizierten
Konstruktion wartungsaufwendig und teuer. Sowohl die manuelle als auch
mechanisierte Durchführung der Bestimmungen erfordert geschultes Personal.
Demgegenüber besteht ein wachsender Bedarf an entsprechenden einfach
handhabbaren Bestimmungsmethoden. Wünschenswert ist die Übertragung der
bekannten immunologischen Verfahren auf trägergebundene Testsysteme, wie sie
als "Teststreifen" für viele nichtimmunologische Bestimmungen seit langem bekannt
sind.
Zu den bisher in der Patentliteratur beschriebenen Verfahren, die mit wenigen
Reaktionsschritten auskommen, gehören immunchromatographische
Bestimmungsmethoden, wie sie zum Beispiel in EP 143574 A1 beschrieben sind.
Spezifisch für sie ist, daß für den Träger zur Fixierung der Antikörper poröse
Materialien verwendet werden, die einen Flüssigkeitstransport durch Kapillarkräfte
zulassen. Die Träger sind so gestaltet, daß der Flüssigkeitstransport in ihnen in einer
Vorzugsrichtung stattfindet. Wird ein Gemisch aus Probenflüssigkeit und einer
definierten Menge enzymmarkiertem Antigen mit dem so konstruierten Testsystem in
Verbindung gebracht, wandert die Probenflüssigkeit aufgrund der Kapillarkräfte
durch das Testsystem. Während der Wanderung treten Antigen und
enzymmarkiertes Antigen aus der Probenflüssigkeit mit dem Antikörper in
Wechselwirkung.
Der im Testsystem fixierte Antikörper ist in einem so bemessenen Überschuß
vorhanden, daß auch bei maximal möglicher Antigenkonzentration noch keine
Absättigung aller vorhandenen Bindungsstellen auftritt. Aufgrund des
Flüssigkeitstransports in einer Vorzugsrichtung erfolgt die Besetzung der
Bindungsstellen an den fixierten Antikörpern in Richtung des Flüssigkeitstransports.
Je mehr Antigen in der Probe vorhanden ist, desto größer ist die Anzahl an
besetzten Bindungsstellen am fixierten Antikörper.
Für die quantitative Auswertung der Bindung wird der Träger in einer zweiten
Inkubation mit einer Lösung des Substrats für das Markerenzym in Kontakt gebracht.
Aufgrund der homogenen Mischung des Antigens mit dem enzymmarkierten
Antigen wird sich an allen Stellen, an denen Antigen am Antikörper gebunden ist,
eine Färbung entwickeln. Die Größe der entstehenden farbigen Fläche ist
proportional zur Konzentration des Antigens in der Probe. Durch Wahl einer
gestreckten Form des Trägers mit Vorzugsrichtung des Flüssigkeitstransports in
Längsrichtung kann die Messung auf die Länge der gefärbten Fläche beschränkt
werden.
Hauptnachteil der beschriebenen Methode ist, daß spezielle Maßnahmen
erforderlich sind, um zu gewährleisten, daß die Flüssigkeitsausbreitung im Träger
gleichmäßig und reproduzierbar erfolgt, da sie Grundlage der quantitativen
Auswertung ist. Weiterhin nachteilig sind die notwendigen zwei getrennten
Inkubationen und daß die Probe manuell mit enzymmarkiertem Antigen versetzt
werden muß.
Die in den Patentansprüchen definierte Erfindung kombiniert Prinzipien
immunologischer Bestimmungen des kompetitiven und des
immunchromatographischen Typs zu einer Methode, die mit wenigen
Reaktionsschritten auskommt und eine zuverlässige Quantifizierung ermöglicht.
Das wesentliche Element der vorliegenden Erfindung liegt darin, wie bei der
immunchromatographischen Technik einen porösen Träger mit kapillarem
Flüssigkeitstransport für die Antikörperfixierung zu verwenden, die Menge des
fixierten Antikörpers aber analog zur kompetitiven Methode festzulegen.
Weiterhin wesentlich für die Erfindung ist, daß die bisher notwendigen manuellen
Schritte dadurch ersetzt werden, daß das Testsystem mehrere sequentiell
angeordnete Elemente mit spezifischen Reagenzien enthält. Die Reagenzien werden
dort von der kapillar transportierten Probenflüssigkeit gelöst und gehen in die
Reaktionen ein.
Dazu wird die Konzentration an fixiertem Antikörper im Testsystem so gewählt, daß
sie im Unterschuß im Vergleich zur Summe der Konzentrationen aus Antigen und
enzymmarkiertem Antigen liegt. So wird gewährleistet, daß bei der Inkubation des
Testsystems mit einem Überschuß an Antigen und enzymmarkiertem Antigen nur ein
Teil des markierten Antigen am Antikörper zurückgehalten wird, und der nicht am
fixierten Antikörper gebundene Überschuß mit dem kapillaren Flüssigkeitsstrom über
die fixierten Antikörper hinweg transportiert wird. Zwischen der Menge des nicht
gebundenem enzymmarkierten Antigens und der Konzentration an Antigen in der
Probe besteht ein proportionaler Zusammenhang.
Zur Quantifizierung der Menge an ungebundenem enzymmarkierten Antigen im
kapillaren Flüssigkeitsstrom wird dieser anschließend in ein Element des Systems
geleitet, in der sich in Abhängigkeit von der übergegangenen Menge an
markiertem Antigen eine Färbung entwickelt.
Die Erfindung wird im folgenden, anhand des in den schematisierten Abb. 1
und 2 dargestellten Ausführungsbeispiels näher beschrieben. Die Abb. 1
zeigt einen erfindungsgemäßen Teststreifen. Man erkennt die langgestreckte
Basisfolie 1 und den in der Gesamtheit als 2 gekennzeichneten Reaktionsbereich.
Abb. 2 zeigt die einzelnen Elemente des erfindungsgemäßen Teststreifens. Der
Reaktionsbereich 2 besteht im wesentlichen aus vier verschiedenen Zonen: Der
Kontaktzone 3, der Depotzone 4, der Binderzone 5 und der Indikatorzone 6. Mit
der vor dem eigentlichen Reaktionsbereich befestigtigten Kontaktzone 3 wird der
Teststreifen in die Probe eingetaucht. Die Zonen 3, 4, 5 und 6 sind durch
Klebefolien 7 und 8 so miteinander verbunden, daß sie in einem einen
Flüssigkeitstransport ermöglichenden Kontakt stehen. Der gesamte Reaktionsbereich
2 ist mit einer doppelseitigen Klebefolie 9 auf der Basisfolie 1 fixiert.
Die Depotzone 4 enthält ein Konjugat aus dem Antigen und einem
Markierungsenzym. Die Binderzone 5 enthält einen für das Antigen spezifischen
trägerfixierten Antikörper. In der Indikatorzone 6 ist ein farbgebendes Substrat SF
für das Markierungsenzym, sowie gegebenenfalls ein Hilfsenzym, zur Erzeugung
eines weiteren Substrats für die Reaktion zwischen Markierungsenzym und
farbgebendem Substrat, enthalten. Weiterhin enthalten Depot- und Binderzone ein
Substrat SH für das Hilfsenzym.
Wenn der in der Abbildung dargestellte Teststreifen durch Eintauchen mit der
Kontaktzone 3 mit einer Probe in Berührung gebracht wird, strömt die
Probenflüssigkeit durch die Kontaktzone 3 in die Depotzone 4 und löst das
Konjugat aus Antigen und Markierungsenzym sowie das Substrat SH. Da die
Depotzone 4 auch mit der Binderzone 5 in Flüssigkeitskontakt steht, dringen die
gelösten Substanzen in der Probenflüssigkeit in die Binderzone 5 ein.
In der Binderzone findet eine Kompetition zwischen Antigen aus der Probe und
Antigenenzymkonjugat um die Bindung am trägerfixierten Antikörper statt. Je mehr
Antigen in der Probe vorhanden ist, desto mehr Antigen wird am trägerfixierten
Antikörper gebunden und desto weniger Antigenenzymkonjugat wird am
trägerfixierten Antikörper gebunden. In der Binderzone löst die Probenflüssigkeit
weiteres Substrat SH. Das ungebundene Antigenenzymkonjugat und das Substrat SH
treten mit der Probenflüssigkeit in die Indikatorzone 6 über.
In der Indikatorzone 6 reagiert das Substrat SH mit dem Hilfsenzym und liefert das
für die Reaktion zwischen Markierungsenzym und farbgebendem Substrat SF
notwendige weitere Substrat SR. Das Markierungsenzym reagiert mit dem hier
gespeicherten farbgebendem Substrat SF und dem Substrat SR zu einer farbigen
Substanz. Die Menge der erzeugten farbigen Substanz ist proportional zur
übergetretenen Menge an Antigenenzymkonjugat und somit proportional zur
Menge an Probenantigen. Die Farbentwicklung kann visuell ausgewertet oder
reflexionsphotometrisch gemessen werden.
Die Kontaktzone wird aus Filterpapier Typ MN 615 (Macherey-Nagel + Co.,
Düren, BRD) hergestellt. Es werden Streifen von 10 × 80 mm angefertigt, die ohne
weitere Imprägnierung zur Herstellung der Teststreifen verwendet werden.
Die Depotzone wird aus Glasfaserpapier Typ 3362 (Schleicher & Schuell, Dassel,
BRD) hergestellt. Streifen von 10 × 80 mm werden 30 s in 0,05 M Trispuffer pH
7,2, der 1,5% Glucose und 0,3% Rinderserumalbumin (Fraktion V, Sigma Chemie
GmbH, Deisenhofen, BRD) enthält, eingebracht. Die Trocknung der Zonen erfolgt
im Stickstoffstrom bei 20°C. Die Einbettung des Cortisol-Peroxidas-Konjugats
(Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) erfolgt durch eine Inkubation von 30 s in
einer Lösung von Cortisol-Peroxidas-Konjugat in 0,05 M Trispuffer pH 7,2. Nach
Abstreifen überschüssiger Lösung werden die Zonen bei 20°C im Stickstoffstrom
getrocknet.
Streifen aus Filterpapier Typ MN 615 (Macherey-Nagel + Co., Düren, BRD) der
Größe 30 × 70 mm werden unter Rühren in einer 0, 1 mol/l Lösung von 1,1′-
Carbonyldiimidazol (Fluka Chemie AG, Buchs, CH) in Dichlormethan inkubiert. Die
Inkubationsdauer beträgt 3 h bei Raumtemperatur. Pro cm² Papier wird 1 ml Lösung
eingesetzt. Nach Beendigung der Inkubation wird die Lösung abgegossen und
neunmal mit einem Drittel des Inkubationsvolumens Dichlormethan jeweils 30
Sekunden gewaschen. Die Trocknung der Papierstreifen erfolgt im Stickstoffstrom
bei 20°C.
In Petrischalen werden zu, in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,5 rekonstituierten,
lyophilisierten Cortisol-Antiserum (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) 1,1′-
Carbonyldiimidazol-aktivierte Papierstreifen gegeben. Die Lösung wird 2 h lang auf
einem Magnetrührer langsam gerührt. Nach Abschluß der Inkubation wird die
Lösung aus der Petrischale abgesaugt. Zur Blockierung verbliebener Bindungsstellen
am aktivierten Papier wird eine 0,5%ige Lösung von Rinderserumalbumin (Fraktion
V, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,5 zu
den Papierstreifen gegeben und weitere 30 Minuten unter Rühren inkubiert.
Anschließend wird dreimal mit 0,05 M Trispuffer pH 7,2 gewaschen. Zum
Abschluß wird die Depotzone in einer Lösung von 1,5% Glucose und 0,1% Tween
20 in 0,05 M Trispuffer pH 7,2 für 30 Sekunden inkubiert. Die Trocknung erfolgt
nach Abstreifen überschüssiger Lösung im Stickstoffstrom bei 20°C.
Zur Herstellung der Indikatorzone wird vliesunterstützte Cellulosenitratmembran Typ
439 386 (Schleicher & Schuell, Dassel, BRD) verwendet. Streifen der Abmessungen
10 * 70 mm werden zuerst 30 Sekunden in eine Lösung von 2 mg/ml 3,3′,5,5′-
Tetramethylbenzidin (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) in Chloroform
eingebracht. Nach Abstreifen überschüssiger Lösung wird im Stickstoffstrom bei 20°C
getrocknet. Die getrockneten Cellulosenitratstreifen werden dann 30 Sekunden in
eine Lösung von 0,1% Tween 20 (E. Merck, Darmstadt, BRD) in Puffer pH 5,5 (0,05
M Citrat; 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat) eingebracht und nach Abstreifen
überschüssiger Lösung erneut im Stickstoffstrom bei 20°C getrocknet. In einer dritten
Imprägnierung werden die getrockneten Cellulosenitratstreifen dann 30 Sekunden in
eine Lösung von 200 U/ml Glucoseoxidase (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen,
BRD) in Puffer pH 5,5 (0,05 M Citrat; 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat)
eingebracht und nach Abstreifen überschüssiger Lösung erneut im Stickstoffstrom bei
20°C getrocknet.
Die Zonen werden nach den beschriebenen Spezifikationen zugeschnitten und
mittels Klebefilm Typ 5526 (Beiersdorf AG, Hamburg, BRD) nach Maßgabe der
Abbildung zu Bahnen zusammengefügt. Diese Bahnen werden mit
doppelseitigem Klebefilm Typ 5338 (Beiersdorf AG, Hamburg, BRD) nach
Maßgabe der Zeichnungen auf Trägerfolien Typ 96019 (Rank Xerox Limited, UK)
befestigt. Aus dem Verbund von Reaktionszone und Trägerfolie werden mit einem
Rollenschneidegerät Streifen von 4 mm Breite geschnitten. Die Lagerung der Streifen
erfolgt bei 4°C unter Ausschluß von Feuchtigkeit.
Claims (11)
1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten aus einer Probe, insbesondere einer
Körperflüssigkeit, wobei der Analyt ein Teil eines Paares von spezifischen
Bindungspartnern ist. Die Bestimmung findet unter Verwendung eines enzymatisch
markierten Analytanalogon und des trägerfixierten anderen Bindungspartners statt.
Das Verfahren enthält einen Reaktionsschritt bei dem Analyt, enzymmarkiertes
Analytanalogon und trägerfixierter Bindungspartner miteinander inkubiert werden.
Nach Ablauf der spezifischen Bindungsreaktion ist die Menge des nicht an den
trägerfixierten Bindungspartner gebundenen enzymmarkierten Analytanalogon ein
Maß für die Konzentration des Analyten. Diese wird mit Hilfe der enzymatischen
Markierung bestimmt, indem man das Markierungsenzym mit einem farbgebenden
Substrat reagieren läßt. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die
Bindungs- und Reaktionspartner im Zusammenhang mit der spezifischen
Konstruktion des unter Anspruch 6, beschriebenen Teststreifens so gewählt sind, daß
die Bindungs- und sonstigen Reaktionen in ihrer Sequenz allein durch den kapillaren
Flüssigkeitstransport festgelegt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der
trägerfixierte Bindungspartner sowohl mit dem Analyten als auch mit dem
enzymmarkierten Analytanalogon bindungsfähig ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Menge
des trägerfixierten Bindungspartners so gewählt ist, daß sie kleiner als die Menge
von Analyt und enzymmarkiertem Analytanalogon ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Analyt
und das enzymatisch markierte Analytanalogon Antigene sind und der trägerfixierte
Bindungspartner ein Antikörper für die Antigene ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das
Trägermaterial zur Fixierung des einen Bindungspartners kapillaren
Flüssigkeitstransport gestattet.
6. Teststreifen für die Bestimmung eines Analyten aus einer Probe, insbesondere
einer Körperflüssigkeit, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er die folgenden
Reaktionspartner enthält: Ein enzymatisch markiertes Analogon zum
Probenanalyten, einen trägerfixierten Bindungspartner, zusätzlich ein
farberzeugendes Substrat des Markierungsenzyms sowie Reaktionspartner die für
eine optimale Reaktion zwischen Markierungsenzym und farbgebendem Substrat
notwendig sind. Der Teststreifen weist eine Einteilung in drei Reaktionszonen auf,
die aus porösen Materialien bestehen und kapillaren Flüssigkeitstransport gestatten.
7. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die
Reaktionszonen so verbunden sind, daß sie in einem Flüssigkeitsaustausch
ermöglichendem Kontakt stehen und die Probe, die auf den Streifen aufgetragen
wird, durch Kapillarkräfte die drei Reaktionszonen sequentiell durchläuft.
8. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß eine
Reaktionszone enzymmarkiertes Analytanalogon in einer solchen Form enthält, daß
dieses von der Probenflüssigkeit gelöst werden kann und mit dem kapillaren
Flüssigkeitsstrom in die weiteren Reaktionszonen geleitet wird. Im folgenden wird
diese Reaktionszone als Depotzone bezeichnet.
9. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die
Reaktionszone, die nach der Depotzone vom kapillaren Flüssigkeitsstrom erreicht
wird, den trägerfixierten Bindungspartner enthält und hier die Bindungsreaktionen
zwischen den Bindungspartnern stattfinden. Im folgenden wird diese Reaktionszone
als Binderzone bezeichnet.
10. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die
Reaktionszone, die nach der Binderzone vom kapillaren Flüssigkeitsstrom erreicht
wird, das farbgebende Substrat für das Markierungssystem enthält. Im folgenden
wird diese Reaktionszone als Indikatorzone bezeichnet.
11. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß Depot- und
Binderzone weitere Reaktionspartner für die Reaktion von Markierungsenzym und
farbgebendem Substrat enthalten können, die mit dem kapillaren Flüssigkeitsstrom
die Indikatorzone erreichen und dann für die Reaktionen
zur Verfügung stehen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19934314493 DE4314493A1 (de) | 1993-05-03 | 1993-05-03 | Verfahren und Teststreifen zur Bestimmung eines Analyten |
Applications Claiming Priority (1)
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DE19934314493 DE4314493A1 (de) | 1993-05-03 | 1993-05-03 | Verfahren und Teststreifen zur Bestimmung eines Analyten |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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DE4314493A1 true DE4314493A1 (de) | 1994-11-10 |
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ID=6486988
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19934314493 Withdrawn DE4314493A1 (de) | 1993-05-03 | 1993-05-03 | Verfahren und Teststreifen zur Bestimmung eines Analyten |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4314493A1 (de) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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1993
- 1993-05-03 DE DE19934314493 patent/DE4314493A1/de not_active Withdrawn
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Legal Events
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