DE4314493A1 - Method and test strips for determining an analyte - Google Patents

Abstract

Immunological detection methods with enzyme labels have been of considerable importance in quantitative determinations of analytes for many years. The determinations are, owing to the large number of steps necessary, time-consuming and costly, and they require trained users to carry them out. The test strip according to the novel method makes it possible to carry out quantitative immunological determinations in a short time and without special knowledge. The test strip consists of four zones made of porous material which are fixed on a common base element and are in liquid contact. After entry of the sample liquid into the test strips it flows through the individual elements and there dissolves the reagents necessary for the reactions. An enzyme-labelled analyte analogue and an antibody against the sample analyte are used for the determination. Sample analyte and enzyme-labelled analogue compete for binding to the antibody. The unbound enzyme-labelled analogue is passed into a zone in which a substrate is converted by the labelling enzyme. The reacted amount of substrate is proportional to the amount of the analyte. Test strips for determining cortisol in saliva.

Description

Die Erfindung richtet sich insbesondere auf immunologische Nachweisverfahren wie sie seit vielen Jahren bei qualitativen und quantitativen Bestimmungen von Bestandteilen in Körperflüssigkeiten eine erhebliche Rolle spielen. Sie zeichnen sich durch hohe Spezifität und Empfindlichkeit aus und basieren auf der immunologischen Wechselwirkung zwischen dem Analyten und einem diesen Analyten mit hoher Spezifität bindenden Biomaterial. Durch Markieren eines der Bindungspartner der immunologischen Bestimmung kann der Grad der Umsetzung und damit die Konzentration des Analyten bestimmt werden.The invention is particularly directed to immunological detection methods such as for many years with qualitative and quantitative determinations of Ingredients in body fluids play a significant role. You stand out characterized by high specificity and sensitivity and are based on the immunological interaction between the analyte and one of these Analytes with high specificity binding biomaterial. By marking one of the Binding partner of the immunological determination can be the degree of implementation and thus the concentration of the analyte can be determined.

Man unterscheidet verschiedene immunologische Bestimmungsverfahren nach der gewählten Markierung. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf sogenannte Enzymimmunoassays bei denen ein Enzym als Markierung verwendet wird. Der Nachweis des Enzyms verläuft dabei durch Einwirkung des Enzyms auf ein Substrat, das während der durch das Enzym katalysierten Reaktion eine Veränderung erfährt. Diese Veränderung ist im einfachsten Fall eine Änderung der Farbe, die visuell ausgewertet oder photometrisch vermessen werden kann.A distinction is made between different immunological methods of determination according to selected marker. The present invention is directed to so-called Enzyme immunoassays in which an enzyme is used as a label. Of the Detection of the enzyme is carried out by the action of the enzyme on a substrate, which undergoes a change during the reaction catalyzed by the enzyme. In the simplest case, this change is a change in color that is visual can be evaluated or measured photometrically.

Ein besonders wichtiges Verfahren bedient sich eines enzymmarkierten Bindungspartners, beispielsweise eines Antigens, der nicht fixiert und somit im System frei beweglich ist und einem trägerfixierten Bindungspartner, in diesem Fall einem Antikörper. Die Gesamtreaktion enthält einen Reaktionsschritt, bei dem die Bindungspartner miteinander inkubiert werden und die spezifische Bindungsreaktion zwischen ihnen stattfindet. Nach Ablauf der Inkubation ist die Menge des enzymmarkierten Bindungspartners, der an den trägerfixierten Bindungspartner gebunden ist, umgekehrt proportional zur Konzentration des Analyten. Die Menge des gebundenen enzymmarkierten Bindungspartners wird durch Einwirkung des Markierungsenzyms auf ein farbgebendes Substrat bestimmt. Eine Variante des oben beschriebenen Prinzips wird im folgenden beschrieben:A particularly important method uses an enzyme-labeled one Binding partner, for example an antigen that does not fix and thus in the System is freely movable and a carrier-fixed binding partner, in this case an antibody. The overall reaction contains a reaction step in which the Binding partners are incubated with each other and the specific binding reaction between them. After the incubation period, the amount of enzyme-labeled binding partner, the binding partner fixed to the carrier is bound, inversely proportional to the concentration of the analyte. The amount of the bound enzyme-labeled binding partner is by the action of Labeling enzyme determined on a coloring substrate. A variant of the The principle described above is described below:

Zur Bestimmung eines Antigens in einer Probe wird ein Teil der Probe gemeinsam mit einer definierten Menge enzymmarkierten Antigens und trägerfixiertem Antikörper inkubiert. Dabei kommt es zu einer Kompetition von Antigen und enzymmarkiertem Antigen um die begrenzte Anzahl Bindungsstellen am fixierten Antikörper. Je mehr nichtmarkiertes Antigen aus der Probe vorhanden ist, desto weniger enzymmarkiertes Antigen wird am trägerfixierten Antikörper gebunden. To determine an antigen in a sample, a part of the sample is combined with a defined amount of enzyme-labeled antigen and carrier-fixed Antibody incubated. This results in competition between antigen and enzyme-labeled antigen around the limited number of binding sites on the fixed Antibody. The more unlabeled antigen from the sample, the more less enzyme-labeled antigen is bound to the carrier-fixed antibody.  

Nach Ablauf der Inkubation ist die Menge des enzymmarkierten Antigens, die an den trägerfixierten Antikörper gebunden ist, umgekehrt proportional zur Konzentration des Antigens in der Probe.At the end of the incubation, the amount of enzyme-labeled antigen is the the carrier-fixed antibody is bound, inversely proportional to Concentration of the antigen in the sample.

Zur Bestimmung des am trägerfixierten Antikörper gebundenen enzymmarkierten Antigens wird die Reaktion des Markierungsenzyms mit einem farberzeugenden Substrat eingesetzt. Da diese Reaktion jedoch nur mit dem Markierungsenzym des an den trägerfixierten Antikörper gebundenen Antigens stattfinden darf, ist vorher eine Trennung vom gleichzeitig noch vorhandenen freien enzymmarkierten Antigen notwendig.To determine the enzyme-labeled enzyme bound to the carrier-fixed antibody The reaction of the labeling enzyme with a color-generating agent is antigenic Substrate used. However, since this reaction only occurs with the labeling enzyme of Antigen bound to the carrier-fixed antibody may take place beforehand a separation from the free enzyme-labeled antigen still present at the same time necessary.

Die Trennung wird in den üblichen Verfahren durch eine Vielzahl von Waschschritten erreicht, da die Genauigkeit der Analyse in erheblichem Umfang von der Qualität der Trennung zwischen gebundenem und ungebundenem enzymmarkierten Antigen abhängig ist.The separation is done in the usual way by a variety of Wash steps achieved because the accuracy of the analysis to a significant extent on the quality of the separation between bound and unbound enzyme-labeled antigen.

Die Bestimmungen werden durch die große Anzahl der nötigen Schritte zeitaufwendig, sofern sie manuell durchgeführt werden. Geräte zur mechanisierten Durchführung dieser Bestimmungen sind aufgrund der notwendigen komplizierten Konstruktion wartungsaufwendig und teuer. Sowohl die manuelle als auch mechanisierte Durchführung der Bestimmungen erfordert geschultes Personal.The provisions are determined by the large number of steps required time consuming if they are done manually. Devices for mechanized Implementation of these provisions are complicated due to the need Construction is maintenance-intensive and expensive. Both manual and Mechanized implementation of the regulations requires trained personnel.

Demgegenüber besteht ein wachsender Bedarf an entsprechenden einfach handhabbaren Bestimmungsmethoden. Wünschenswert ist die Übertragung der bekannten immunologischen Verfahren auf trägergebundene Testsysteme, wie sie als "Teststreifen" für viele nichtimmunologische Bestimmungen seit langem bekannt sind.In contrast, there is a growing need for corresponding simple manageable methods of determination. It is desirable to transfer the known immunological methods on carrier-bound test systems, such as has long been known as a "test strip" for many non-immunological determinations are.

Zu den bisher in der Patentliteratur beschriebenen Verfahren, die mit wenigen Reaktionsschritten auskommen, gehören immunchromatographische Bestimmungsmethoden, wie sie zum Beispiel in EP 143574 A1 beschrieben sind.To the processes described so far in the patent literature, the few Reaction steps require immunochromatographic Determination methods, as described for example in EP 143574 A1.

Spezifisch für sie ist, daß für den Träger zur Fixierung der Antikörper poröse Materialien verwendet werden, die einen Flüssigkeitstransport durch Kapillarkräfte zulassen. Die Träger sind so gestaltet, daß der Flüssigkeitstransport in ihnen in einer Vorzugsrichtung stattfindet. Wird ein Gemisch aus Probenflüssigkeit und einer definierten Menge enzymmarkiertem Antigen mit dem so konstruierten Testsystem in Verbindung gebracht, wandert die Probenflüssigkeit aufgrund der Kapillarkräfte durch das Testsystem. Während der Wanderung treten Antigen und enzymmarkiertes Antigen aus der Probenflüssigkeit mit dem Antikörper in Wechselwirkung.It is specific to them that the porous support for fixing the antibodies Materials are used that allow fluid transport by capillary forces allow. The carriers are designed so that the liquid transport in them in one Preferred direction takes place. If a mixture of sample liquid and a defined amount of enzyme labeled antigen with the test system thus constructed in Connected, the sample liquid migrates due to the capillary forces through the test system. During the walk, antigen and  enzyme-labeled antigen from the sample liquid with the antibody in Interaction.

Der im Testsystem fixierte Antikörper ist in einem so bemessenen Überschuß vorhanden, daß auch bei maximal möglicher Antigenkonzentration noch keine Absättigung aller vorhandenen Bindungsstellen auftritt. Aufgrund des Flüssigkeitstransports in einer Vorzugsrichtung erfolgt die Besetzung der Bindungsstellen an den fixierten Antikörpern in Richtung des Flüssigkeitstransports. Je mehr Antigen in der Probe vorhanden ist, desto größer ist die Anzahl an besetzten Bindungsstellen am fixierten Antikörper.The antibody fixed in the test system is in such an excess present that none at maximum possible antigen concentration Saturation of all existing binding sites occurs. Because of the Liquid transport in a preferred direction takes place in the Binding sites on the fixed antibodies in the direction of fluid transport. The more antigen in the sample, the greater the number of occupied binding sites on the fixed antibody.

Für die quantitative Auswertung der Bindung wird der Träger in einer zweiten Inkubation mit einer Lösung des Substrats für das Markerenzym in Kontakt gebracht. Aufgrund der homogenen Mischung des Antigens mit dem enzymmarkierten Antigen wird sich an allen Stellen, an denen Antigen am Antikörper gebunden ist, eine Färbung entwickeln. Die Größe der entstehenden farbigen Fläche ist proportional zur Konzentration des Antigens in der Probe. Durch Wahl einer gestreckten Form des Trägers mit Vorzugsrichtung des Flüssigkeitstransports in Längsrichtung kann die Messung auf die Länge der gefärbten Fläche beschränkt werden.For the quantitative evaluation of the binding, the carrier is used in a second Incubation contacted with a solution of the substrate for the marker enzyme. Due to the homogeneous mixture of the antigen with the enzyme-labeled Antigen will be found wherever the antigen is bound to the antibody. develop a color. The size of the resulting colored area is proportional to the concentration of the antigen in the sample. By choosing one stretched shape of the carrier with preferred direction of liquid transport in In the longitudinal direction, the measurement can be limited to the length of the colored area become.

Hauptnachteil der beschriebenen Methode ist, daß spezielle Maßnahmen erforderlich sind, um zu gewährleisten, daß die Flüssigkeitsausbreitung im Träger gleichmäßig und reproduzierbar erfolgt, da sie Grundlage der quantitativen Auswertung ist. Weiterhin nachteilig sind die notwendigen zwei getrennten Inkubationen und daß die Probe manuell mit enzymmarkiertem Antigen versetzt werden muß.The main disadvantage of the method described is that special measures are required to ensure that the spread of liquid in the carrier takes place evenly and reproducibly, since it is the basis of the quantitative Evaluation is. Another disadvantage is the need for two separate ones Incubations and that the sample is manually added with enzyme-labeled antigen must become.

Die in den Patentansprüchen definierte Erfindung kombiniert Prinzipien immunologischer Bestimmungen des kompetitiven und des immunchromatographischen Typs zu einer Methode, die mit wenigen Reaktionsschritten auskommt und eine zuverlässige Quantifizierung ermöglicht.The invention defined in the claims combines principles immunological determinations of the competitive and the immunochromatographic type to a method with few Reaction steps and reliable quantification.

Das wesentliche Element der vorliegenden Erfindung liegt darin, wie bei der immunchromatographischen Technik einen porösen Träger mit kapillarem Flüssigkeitstransport für die Antikörperfixierung zu verwenden, die Menge des fixierten Antikörpers aber analog zur kompetitiven Methode festzulegen. The essential element of the present invention lies in how the immunochromatographic technique a porous support with capillary Liquid transport to use for antibody fixation, the amount of fixed antibody but analogous to the competitive method.  

Weiterhin wesentlich für die Erfindung ist, daß die bisher notwendigen manuellen Schritte dadurch ersetzt werden, daß das Testsystem mehrere sequentiell angeordnete Elemente mit spezifischen Reagenzien enthält. Die Reagenzien werden dort von der kapillar transportierten Probenflüssigkeit gelöst und gehen in die Reaktionen ein.It is also essential for the invention that the previously necessary manual Steps to be replaced by making the test system several sequential contains arranged elements with specific reagents. The reagents are there detached from the capillary transported sample liquid and go into the Reactions.

Dazu wird die Konzentration an fixiertem Antikörper im Testsystem so gewählt, daß sie im Unterschuß im Vergleich zur Summe der Konzentrationen aus Antigen und enzymmarkiertem Antigen liegt. So wird gewährleistet, daß bei der Inkubation des Testsystems mit einem Überschuß an Antigen und enzymmarkiertem Antigen nur ein Teil des markierten Antigen am Antikörper zurückgehalten wird, und der nicht am fixierten Antikörper gebundene Überschuß mit dem kapillaren Flüssigkeitsstrom über die fixierten Antikörper hinweg transportiert wird. Zwischen der Menge des nicht gebundenem enzymmarkierten Antigens und der Konzentration an Antigen in der Probe besteht ein proportionaler Zusammenhang.For this purpose, the concentration of fixed antibody in the test system is selected so that they in deficit compared to the sum of the concentrations of antigen and enzyme-labeled antigen. This ensures that when the Test system with an excess of antigen and enzyme-labeled antigen only one Part of the labeled antigen is retained on the antibody and not on the fixed antibody bound excess with the capillary fluid flow over the fixed antibody is transported away. Between the amount of not bound enzyme-labeled antigen and the concentration of antigen in the Sample there is a proportional relationship.

Zur Quantifizierung der Menge an ungebundenem enzymmarkierten Antigen im kapillaren Flüssigkeitsstrom wird dieser anschließend in ein Element des Systems geleitet, in der sich in Abhängigkeit von der übergegangenen Menge an markiertem Antigen eine Färbung entwickelt.To quantify the amount of unbound enzyme-labeled antigen in the capillary fluid flow this is then into an element of the system headed in depending on the amount passed labeled antigen develops a color.

Die Erfindung wird im folgenden, anhand des in den schematisierten Abb. 1 und 2 dargestellten Ausführungsbeispiels näher beschrieben. Die Abb. 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Teststreifen. Man erkennt die langgestreckte Basisfolie 1 und den in der Gesamtheit als 2 gekennzeichneten Reaktionsbereich.The invention is described in more detail below on the basis of the exemplary embodiment shown in the schematic FIGS. 1 and 2. Fig. 1 shows a test strip according to the invention. One recognizes the elongated base film 1 and the reaction area, which is identified as a whole as 2 .

Abb. 2 zeigt die einzelnen Elemente des erfindungsgemäßen Teststreifens. Der Reaktionsbereich 2 besteht im wesentlichen aus vier verschiedenen Zonen: Der Kontaktzone 3, der Depotzone 4, der Binderzone 5 und der Indikatorzone 6. Mit der vor dem eigentlichen Reaktionsbereich befestigtigten Kontaktzone 3 wird der Teststreifen in die Probe eingetaucht. Die Zonen 3, 4, 5 und 6 sind durch Klebefolien 7 und 8 so miteinander verbunden, daß sie in einem einen Flüssigkeitstransport ermöglichenden Kontakt stehen. Der gesamte Reaktionsbereich 2 ist mit einer doppelseitigen Klebefolie 9 auf der Basisfolie 1 fixiert. Fig. 2 shows the individual elements of the test strip according to the invention. The reaction area 2 essentially consists of four different zones: the contact zone 3 , the depot zone 4 , the binder zone 5 and the indicator zone 6 . With the contact zone 3 attached in front of the actual reaction area, the test strip is immersed in the sample. Zones 3 , 4 , 5 and 6 are connected to one another by adhesive films 7 and 8 in such a way that they are in contact which enables liquid to be transported. The entire reaction area 2 is fixed on the base film 1 with a double-sided adhesive film 9 .

Die Depotzone 4 enthält ein Konjugat aus dem Antigen und einem Markierungsenzym. Die Binderzone 5 enthält einen für das Antigen spezifischen trägerfixierten Antikörper. In der Indikatorzone 6 ist ein farbgebendes Substrat S_F für das Markierungsenzym, sowie gegebenenfalls ein Hilfsenzym, zur Erzeugung eines weiteren Substrats für die Reaktion zwischen Markierungsenzym und farbgebendem Substrat, enthalten. Weiterhin enthalten Depot- und Binderzone ein Substrat S_H für das Hilfsenzym.The depot zone 4 contains a conjugate of the antigen and a labeling enzyme. Binder zone 5 contains a carrier-fixed antibody specific for the antigen. The indicator zone 6 contains a coloring substrate S _F for the labeling enzyme, and optionally an auxiliary enzyme, for producing a further substrate for the reaction between the labeling enzyme and the coloring substrate. The depot and binder zone also contain a substrate S _H for the auxiliary enzyme.

Wenn der in der Abbildung dargestellte Teststreifen durch Eintauchen mit der Kontaktzone 3 mit einer Probe in Berührung gebracht wird, strömt die Probenflüssigkeit durch die Kontaktzone 3 in die Depotzone 4 und löst das Konjugat aus Antigen und Markierungsenzym sowie das Substrat S_H. Da die Depotzone 4 auch mit der Binderzone 5 in Flüssigkeitskontakt steht, dringen die gelösten Substanzen in der Probenflüssigkeit in die Binderzone 5 ein.When the test strip shown in the figure is brought into contact with a sample by immersion in the contact zone 3 , the sample liquid flows through the contact zone 3 into the depot zone 4 and dissolves the conjugate of antigen and labeling enzyme and the substrate S _H. Since the depot zone 4 is also in liquid contact with the binder zone 5 , the dissolved substances in the sample liquid penetrate into the binder zone 5 .

In der Binderzone findet eine Kompetition zwischen Antigen aus der Probe und Antigenenzymkonjugat um die Bindung am trägerfixierten Antikörper statt. Je mehr Antigen in der Probe vorhanden ist, desto mehr Antigen wird am trägerfixierten Antikörper gebunden und desto weniger Antigenenzymkonjugat wird am trägerfixierten Antikörper gebunden. In der Binderzone löst die Probenflüssigkeit weiteres Substrat S_H. Das ungebundene Antigenenzymkonjugat und das Substrat S_H treten mit der Probenflüssigkeit in die Indikatorzone 6 über.In the binder zone there is competition between antigen from the sample and antigen enzyme conjugate for binding to the antibody fixed to the support. The more antigen in the sample, the more antigen is bound to the carrier-fixed antibody and the less antigen enzyme conjugate is bound to the carrier-fixed antibody. The sample liquid dissolves further substrate S _{H in} the binder zone. The unbound antigen enzyme conjugate and the substrate S _H pass into the indicator zone 6 with the sample liquid.

In der Indikatorzone 6 reagiert das Substrat S_H mit dem Hilfsenzym und liefert das für die Reaktion zwischen Markierungsenzym und farbgebendem Substrat S_F notwendige weitere Substrat S_R. Das Markierungsenzym reagiert mit dem hier gespeicherten farbgebendem Substrat S_F und dem Substrat S_R zu einer farbigen Substanz. Die Menge der erzeugten farbigen Substanz ist proportional zur übergetretenen Menge an Antigenenzymkonjugat und somit proportional zur Menge an Probenantigen. Die Farbentwicklung kann visuell ausgewertet oder reflexionsphotometrisch gemessen werden.In the indicator zone 6 , the substrate S _H reacts with the auxiliary enzyme and supplies the further substrate S _R necessary for the reaction between the labeling enzyme and the coloring substrate S _F. The labeling enzyme reacts with the coloring substrate S _F stored here and the substrate S _R to form a colored substance. The amount of colored substance produced is proportional to the amount of antigen enzyme conjugate that has been transferred and thus proportional to the amount of sample antigen. The color development can be evaluated visually or measured by reflection photometry.

Beispielexample Teststreifen zur Bestimmung der Cortisolkonzentration im Speichel gemäß Abb. 1, 2Test strips for determining the cortisol concentration in saliva according to Fig. 1, 2 Kontaktzone 3 Contact zone 3

Die Kontaktzone wird aus Filterpapier Typ MN 615 (Macherey-Nagel + Co., Düren, BRD) hergestellt. Es werden Streifen von 10 × 80 mm angefertigt, die ohne weitere Imprägnierung zur Herstellung der Teststreifen verwendet werden.The contact zone is made of filter paper type MN 615 (Macherey-Nagel + Co., Düren, FRG). Strips of 10 × 80 mm are made, the without further impregnation can be used to produce the test strips.

Depotzone 4 Depot zone 4

Die Depotzone wird aus Glasfaserpapier Typ 3362 (Schleicher & Schuell, Dassel, BRD) hergestellt. Streifen von 10 × 80 mm werden 30 s in 0,05 M Trispuffer pH 7,2, der 1,5% Glucose und 0,3% Rinderserumalbumin (Fraktion V, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) enthält, eingebracht. Die Trocknung der Zonen erfolgt im Stickstoffstrom bei 20°C. Die Einbettung des Cortisol-Peroxidas-Konjugats (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) erfolgt durch eine Inkubation von 30 s in einer Lösung von Cortisol-Peroxidas-Konjugat in 0,05 M Trispuffer pH 7,2. Nach Abstreifen überschüssiger Lösung werden die Zonen bei 20°C im Stickstoffstrom getrocknet.The depot zone is made of glass fiber paper type 3362 (Schleicher & Schuell, Dassel, FRG). Strips of 10 × 80 mm are placed in 0.05 M Tris buffer pH for 30 s 7.2, the 1.5% glucose and 0.3% bovine serum albumin (Fraction V, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, FRG) contains. The zones are dried in a stream of nitrogen at 20 ° C. Embedding the cortisol-peroxidas conjugate (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Germany) is carried out by incubation in 30 s a solution of cortisol-peroxidas conjugate in 0.05 M Tris buffer pH 7.2. To Wipe off excess solution at 20 ° C in a nitrogen stream dried.

Binderzone 5 Binder zone 5

Streifen aus Filterpapier Typ MN 615 (Macherey-Nagel + Co., Düren, BRD) der Größe 30 × 70 mm werden unter Rühren in einer 0, 1 mol/l Lösung von 1,1′- Carbonyldiimidazol (Fluka Chemie AG, Buchs, CH) in Dichlormethan inkubiert. Die Inkubationsdauer beträgt 3 h bei Raumtemperatur. Pro cm² Papier wird 1 ml Lösung eingesetzt. Nach Beendigung der Inkubation wird die Lösung abgegossen und neunmal mit einem Drittel des Inkubationsvolumens Dichlormethan jeweils 30 Sekunden gewaschen. Die Trocknung der Papierstreifen erfolgt im Stickstoffstrom bei 20°C.Strips of filter paper, type MN 615 (Macherey-Nagel + Co., Düren, Germany) Size 30 × 70 mm with stirring in a 0.1 mol / l solution of 1,1'- Carbonyldiimidazole (Fluka Chemie AG, Buchs, CH) incubated in dichloromethane. The Incubation time is 3 h at room temperature. 1 ml of solution per cm² of paper used. After the incubation has ended, the solution is poured off and nine times with a third of the incubation volume dichloromethane 30 each Washed seconds. The paper strips are dried in a stream of nitrogen at 20 ° C.

In Petrischalen werden zu, in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,5 rekonstituierten, lyophilisierten Cortisol-Antiserum (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) 1,1′- Carbonyldiimidazol-aktivierte Papierstreifen gegeben. Die Lösung wird 2 h lang auf einem Magnetrührer langsam gerührt. Nach Abschluß der Inkubation wird die Lösung aus der Petrischale abgesaugt. Zur Blockierung verbliebener Bindungsstellen am aktivierten Papier wird eine 0,5%ige Lösung von Rinderserumalbumin (Fraktion V, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,5 zu den Papierstreifen gegeben und weitere 30 Minuten unter Rühren inkubiert. Anschließend wird dreimal mit 0,05 M Trispuffer pH 7,2 gewaschen. Zum Abschluß wird die Depotzone in einer Lösung von 1,5% Glucose und 0,1% Tween 20 in 0,05 M Trispuffer pH 7,2 für 30 Sekunden inkubiert. Die Trocknung erfolgt nach Abstreifen überschüssiger Lösung im Stickstoffstrom bei 20°C.In Petri dishes, pH 9.5 reconstituted in 0.1 M carbonate buffer, lyophilized cortisol antiserum (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Germany) 1,1′- Carbonyldiimidazole-activated paper strips are given. The solution is left on for 2 hours slowly stirred with a magnetic stirrer. After the incubation is complete, the Aspirated solution from the Petri dish. To block remaining binding sites a 0.5% solution of bovine serum albumin (fraction V, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Germany) in 0.1 M carbonate buffer pH 9.5 added the paper strip and incubated for a further 30 minutes with stirring. It is then washed three times with 0.05 M Tris buffer pH 7.2. To the Finally, the depot zone is in a solution of 1.5% glucose and 0.1% Tween 20 incubated in 0.05 M Tris buffer pH 7.2 for 30 seconds. The drying takes place after stripping off excess solution in a nitrogen stream at 20 ° C.

Indikatorzone 6 Indicator zone 6

Zur Herstellung der Indikatorzone wird vliesunterstützte Cellulosenitratmembran Typ 439 386 (Schleicher & Schuell, Dassel, BRD) verwendet. Streifen der Abmessungen 10 _* 70 mm werden zuerst 30 Sekunden in eine Lösung von 2 mg/ml 3,3′,5,5′- Tetramethylbenzidin (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) in Chloroform eingebracht. Nach Abstreifen überschüssiger Lösung wird im Stickstoffstrom bei 20°C getrocknet. Die getrockneten Cellulosenitratstreifen werden dann 30 Sekunden in eine Lösung von 0,1% Tween 20 (E. Merck, Darmstadt, BRD) in Puffer pH 5,5 (0,05 M Citrat; 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat) eingebracht und nach Abstreifen überschüssiger Lösung erneut im Stickstoffstrom bei 20°C getrocknet. In einer dritten Imprägnierung werden die getrockneten Cellulosenitratstreifen dann 30 Sekunden in eine Lösung von 200 U/ml Glucoseoxidase (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) in Puffer pH 5,5 (0,05 M Citrat; 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat) eingebracht und nach Abstreifen überschüssiger Lösung erneut im Stickstoffstrom bei 20°C getrocknet.Non-woven cellulose nitrate membrane type 439 386 (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) is used to manufacture the indicator zone. Strips measuring 10 _* 70 mm are first placed in a solution of 2 mg / ml 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Germany) in chloroform. After stripping off excess solution, the mixture is dried in a stream of nitrogen at 20 ° C. The dried cellulose nitrate strips are then placed in a solution of 0.1% Tween 20 (E. Merck, Darmstadt, Germany) in buffer pH 5.5 (0.05 M citrate; 0.1 M sodium dihydrogen phosphate) for 30 seconds and excess after stripping Solution dried again in a stream of nitrogen at 20 ° C. In a third impregnation, the dried cellulose nitrate strips are then introduced into a solution of 200 U / ml glucose oxidase (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Germany) in buffer pH 5.5 (0.05 M citrate; 0.1 M sodium dihydrogen phosphate) for 30 seconds after stripping off excess solution again dried in a stream of nitrogen at 20 ° C.

Herstellung der TeststreifenProduction of the test strips

Die Zonen werden nach den beschriebenen Spezifikationen zugeschnitten und mittels Klebefilm Typ 5526 (Beiersdorf AG, Hamburg, BRD) nach Maßgabe der Abbildung zu Bahnen zusammengefügt. Diese Bahnen werden mit doppelseitigem Klebefilm Typ 5338 (Beiersdorf AG, Hamburg, BRD) nach Maßgabe der Zeichnungen auf Trägerfolien Typ 96019 (Rank Xerox Limited, UK) befestigt. Aus dem Verbund von Reaktionszone und Trägerfolie werden mit einem Rollenschneidegerät Streifen von 4 mm Breite geschnitten. Die Lagerung der Streifen erfolgt bei 4°C unter Ausschluß von Feuchtigkeit.The zones are cut according to the described specifications and using adhesive film type 5526 (Beiersdorf AG, Hamburg, FRG) in accordance with the Figure put together into strips. These tracks are with double-sided adhesive film type 5338 (Beiersdorf AG, Hamburg, FRG) Specification of drawings on type 96019 carrier film (Rank Xerox Limited, UK) attached. The combination of reaction zone and carrier film are combined with a Roll cutter cuts strips of 4 mm width. Storage of the strips takes place at 4 ° C with exclusion of moisture.

Claims (11)

1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten aus einer Probe, insbesondere einer Körperflüssigkeit, wobei der Analyt ein Teil eines Paares von spezifischen Bindungspartnern ist. Die Bestimmung findet unter Verwendung eines enzymatisch markierten Analytanalogon und des trägerfixierten anderen Bindungspartners statt. Das Verfahren enthält einen Reaktionsschritt bei dem Analyt, enzymmarkiertes Analytanalogon und trägerfixierter Bindungspartner miteinander inkubiert werden. Nach Ablauf der spezifischen Bindungsreaktion ist die Menge des nicht an den trägerfixierten Bindungspartner gebundenen enzymmarkierten Analytanalogon ein Maß für die Konzentration des Analyten. Diese wird mit Hilfe der enzymatischen Markierung bestimmt, indem man das Markierungsenzym mit einem farbgebenden Substrat reagieren läßt. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungs- und Reaktionspartner im Zusammenhang mit der spezifischen Konstruktion des unter Anspruch 6, beschriebenen Teststreifens so gewählt sind, daß die Bindungs- und sonstigen Reaktionen in ihrer Sequenz allein durch den kapillaren Flüssigkeitstransport festgelegt werden.1. Method for determining an analyte from a sample, in particular a body fluid, the analyte being part of a pair of specific binding partners. The determination takes place using an enzymatically labeled analyte analog and the carrier-fixed other binding partner. The method contains a reaction step in which analyte, enzyme-labeled analyte analog and carrier-fixed binding partner are incubated with one another. After the specific binding reaction has elapsed, the amount of the enzyme-labeled analyte analog which is not bound to the binding partner is a measure of the concentration of the analyte. This is determined with the aid of the enzymatic labeling, by allowing the labeling enzyme to react with a coloring substrate. The method is characterized in that the binding and reaction partners are chosen in connection with the specific construction of the test strip described in claim 6, so that the binding and other reactions are determined in their sequence solely by the capillary liquid transport. 2. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der trägerfixierte Bindungspartner sowohl mit dem Analyten als auch mit dem enzymmarkierten Analytanalogon bindungsfähig ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the carrier-fixed binding partners with both the analyte and the enzyme-labeled analyte analog is capable of binding. 3. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Menge des trägerfixierten Bindungspartners so gewählt ist, daß sie kleiner als die Menge von Analyt und enzymmarkiertem Analytanalogon ist.3. The method according to claim 1, characterized in that the amount of the carrier-fixed binding partner is chosen so that it is smaller than the amount of analyte and enzyme-labeled analyte analog. 4. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Analyt und das enzymatisch markierte Analytanalogon Antigene sind und der trägerfixierte Bindungspartner ein Antikörper für die Antigene ist.4. The method according to claim 1, characterized in that the analyte and the enzymatically labeled analyte analog are antigens and the carrier-fixed one Binding partner is an antibody for the antigens. 5. Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Trägermaterial zur Fixierung des einen Bindungspartners kapillaren Flüssigkeitstransport gestattet.5. The method according to claim 1, characterized in that the Carrier material for fixing the one binding partner capillary Liquid transport allowed. 6. Teststreifen für die Bestimmung eines Analyten aus einer Probe, insbesondere einer Körperflüssigkeit, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er die folgenden Reaktionspartner enthält: Ein enzymatisch markiertes Analogon zum Probenanalyten, einen trägerfixierten Bindungspartner, zusätzlich ein farberzeugendes Substrat des Markierungsenzyms sowie Reaktionspartner die für eine optimale Reaktion zwischen Markierungsenzym und farbgebendem Substrat notwendig sind. Der Teststreifen weist eine Einteilung in drei Reaktionszonen auf, die aus porösen Materialien bestehen und kapillaren Flüssigkeitstransport gestatten.6. Test strips for the determination of an analyte from a sample, in particular a body fluid which is characterized by the following Reaction partner contains: An enzymatically labeled analogue of Sample analyte, a carrier-fixed binding partner  color-generating substrate of the labeling enzyme and reaction partners for an optimal reaction between the labeling enzyme and the coloring substrate are necessary. The test strip is divided into three reaction zones, which are made of porous materials and allow capillary liquid transport. 7. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Reaktionszonen so verbunden sind, daß sie in einem Flüssigkeitsaustausch ermöglichendem Kontakt stehen und die Probe, die auf den Streifen aufgetragen wird, durch Kapillarkräfte die drei Reaktionszonen sequentiell durchläuft.7. Test strip according to claim 6, characterized in that the Reaction zones are connected so that they are in a liquid exchange enabling contact and the sample applied to the strip is passed through the three reaction zones sequentially by capillary forces. 8. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Reaktionszone enzymmarkiertes Analytanalogon in einer solchen Form enthält, daß dieses von der Probenflüssigkeit gelöst werden kann und mit dem kapillaren Flüssigkeitsstrom in die weiteren Reaktionszonen geleitet wird. Im folgenden wird diese Reaktionszone als Depotzone bezeichnet.8. Test strip according to claim 6, which is characterized in that a Reaction zone contains enzyme-labeled analyte analog in such a form that this can be detached from the sample liquid and with the capillary Liquid flow is passed into the other reaction zones. The following will this reaction zone is called the depot zone. 9. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Reaktionszone, die nach der Depotzone vom kapillaren Flüssigkeitsstrom erreicht wird, den trägerfixierten Bindungspartner enthält und hier die Bindungsreaktionen zwischen den Bindungspartnern stattfinden. Im folgenden wird diese Reaktionszone als Binderzone bezeichnet.9. Test strip according to claim 6, which is characterized in that the Reaction zone that reaches the capillary liquid flow after the depot zone , contains the binding partner and here the binding reactions between the binding partners. The following is this reaction zone referred to as the binder zone. 10. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Reaktionszone, die nach der Binderzone vom kapillaren Flüssigkeitsstrom erreicht wird, das farbgebende Substrat für das Markierungssystem enthält. Im folgenden wird diese Reaktionszone als Indikatorzone bezeichnet.10. Test strip according to claim 6, characterized in that the Reaction zone that reaches the capillary liquid flow after the binder zone contains the coloring substrate for the marking system. Hereinafter this reaction zone is called the indicator zone. 11. Teststreifen nach Anspruch 6, der dadurch gekennzeichnet ist, daß Depot- und Binderzone weitere Reaktionspartner für die Reaktion von Markierungsenzym und farbgebendem Substrat enthalten können, die mit dem kapillaren Flüssigkeitsstrom die Indikatorzone erreichen und dann für die Reaktionen zur Verfügung stehen.11. Test strip according to claim 6, characterized in that depot and Binderzone further reactants for the reaction of labeling enzyme and can contain coloring substrate with the capillary liquid flow reach the indicator zone and then for the reactions be available.