DE4300222A1 - Phosphopeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Phosphopeptide und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Phosphopeptide aus Kalbsthymuszellker
nen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung.
Es ist bereits bekannt, daß DNA aus Kalbsthymuszellkernen trotz
aufwendiger Reinigungsverfahren einen Restgehalt an Phosphopeptiden
aufweist, der von unterschiedlichen Autoren im Bereich zwischen
0,7 bis etwa 2% angegeben wird. Dieses restliche Proteinmaterial
ist so fest an die DNA gebunden, daß man davon ausgeht, daß diese
Proteine nicht als Verunreinigung anzusehen sind, sondern mindestens
teilweise mit der DNA in kovalent gebundener Form vorliegen. DNA
aus Kalbsthymuszellkernen, im folgenden N-DNA genannt, ist sehr
eng, sei es chemisch oder physikalisch, mit Peptiden verbunden,
die durch ihren hohen Gehalt an Phosphoaminosäuren auffallen.
Allerdings lassen sich diese Phosphopeptide aus der N-DNA nur
in äußerst kleinen Mengen gewinnen, so daß eine nähere Untersuchung
bisher noch nicht durchgeführt werden konnte.
Es ist aber bekannt, daß eine andere Gruppe relativ niedermolekula
rer Peptide, die als Deprimerone bezeichnet werden, sich aus Kalbs
thymus und aus der DNA der Zellkerne durch alkalische Extraktion
isolieren lassen. Diese Deprimerone sind aber nicht phosphoriliert,
aber sie zeigen Antitumoraktivität, nämlich eine negative Wirkung
auf Transkription, Translation und Replikation.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, zu versuchen, aus Zellker
nen aus Kalbsthymus weitere Peptide zu isolieren, die eine Antitu
moraktivität zeigen.
Zur Lösung der Aufgabe werden Phosphopeptide mit den im Hauptanspruch
angegebenen kennzeichnenden Merkmalen sowie Verfahren zu deren
Herstellung vorgeschlagen.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß sich Phopsphopeptide
nicht nur aus der N-DNA, sondern direkt aus den ganzen Zellkernen
von Kalbsthymus isolieren lassen und daß bestimmte Fraktionen
dieser Phosphopeptide selektiv gegen die Proliferationen von Tu
morzellen wirksam sind, aber dabei keine Auswirkungen auf die
normale Zellpopulation zeigen.
Die Isolierung der Phosphopeptide aus Kalbsthymusgewebe erfolgt
nach Isolierung und Reinigung der Zellkerne bei Temperaturen um
etwa -10 bis -15°C durch Dialyse, nachdem die Zellkerne in an
sich bekannter Weise durch Zugabe von EDTA und Natrium-dodecylsul
fat lysiert worden waren. Die Dialyse wird bei 40 bis 0°C gegenü
ber 30%-igem Glycerin mehrfach wiederholt. Die vereinigten Dialy
sate werden durch Anionenaustauscherchromatographie gereinigt
und schließlich zur Entfernung von zweiwertigen Metallionen mit
Ionenaustauscher und Natrium-nitrilotriacetat behandelt.
Im Vergleich zu der Extraktion von Phopsphopeptiden aus N-DNA
ergibt die Extraktion aus Zellkernmaterial eine etwa um das 50
fach höhere Ausbeute.
Die so erhaltenen Phosphopeptide lassen sich durch Anionenaus
tauscherchromatographie fraktionieren und desgleichen kann eine
Fraktionierung nach dem Molekulargewicht durch Gelchromatographie
erfolgen.
Bei der Anionenaustauscherchromatographie stellt sich heraus,
daß die gewonnene Peptidmischung im wesentlichen aus zwei größeren
Fraktionen besteht, die im folgenden als P1 und P5 bezeich
net werden. Gelchromatographie ergibt, daß die Fraktion P1 in
wäßriger Lösung ein Molekulargewicht von etwa 9950 aufweist.
Qualitative und quantitative Analyse der Aminosäurezusammensetzung
ergibt, daß die Fraktion P1 einen Gehalt an Phosphoserinkomplexen,
Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin,
Valin, Isoleucin, Leucin, Lysin und Arginin im Mol-Verhältnis
von 31 : 6 : 1 : 2 : 8 : 13 : 4 : 2 : 1 : 3 : 1 : 1 aufweist. Die Summe der Molgewich
te dieser Aminosäuren beträgt theoretisch 10262; die Differenz
ist exmperimentell begründet.
Für die Fraktion P5 ergibt sich praktisch die gleiche Zusammensetzung
in den entsprechenden Mol-Verhältnissen, außer daß die Phosposerin
komplexe doppelt so hoch sind wie in der Fraktion P1. Bei den
Untersuchungen hat sich herausgestellt, daß Phosphoserin zu einem
Teil nicht in freier Form, sondern als Komplex mit zweiwertigen
Metallionen vorliegen muß. Wenn man nämlich Phosphoserin und Mag
nesiumsulfat 3 Wochen bei 4°C stehen läßt und anschließend mit
6 N HCL hydrolisiert, ergibt eine Fraktionierung vergleichbare
Rf-Werte wie sie auch bei der Fraktionierung der Phosphoserinkomplexe
selbst erhalten werden. Diese Komplexe werden durch Behandlung
mit Ionenaustauscher und NTA wieder zerstört, so daß freies Phospho
serin nachweisbar ist. Interessant ist in diesem Zusammenhang,
daß freies Phosphoserin im Hydrolyseversuch mit 6 N HCL zerstört
wird, während die Magnesiumkomplexe selbst nach 24 Stunden bei
130°C stabil sind.
Die erfindungsgemäßen Phosphopeptide weisen eine deutliche Anti
tumorwirkung auf, wobei in Vorstudien festgestellt wurde, daß
die Wirkung bei Zugabe von Magnesiumsulfat und Magnesium ATP deut
lich ansteigt. Bei der Messung der Reduktion der Zellproliferation
von L-1210 Tumorzellen wurde daher mit einer Mischung der jeweili
gen Substanzmenge in 4,45 mM ATP und 8,9 mM Magnesiumsulfat gear
beitet. Es wird vermutet, daß die Zugabe der Magnesiumverbindungen
den Eintritt der Phosphopeptide in die Zellen erleichtert, da
bekannt ist, daß Magnesium-ATP die Zellwandpermeabilität steigert.
Die Versuche wurden mit den nativen Phopsphopeptidfraktionen durch
geführt sowie auch mit solchen, die vorher mit 1 M HCL behandelt
worden waren. In den Walker Carcinoma Zellen führte die Behandlung
mit nativer Fraktion P1 mit Magnesiumzusatz zu einer Verringerung
der Aufnahme von 3H-Thymidin, ausgedrückt in Prozent Aufnahme
der Probe im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, zu 76,7%;
bei mit 1 N HCL behandelter Fraktion P1 wurde die Aufnahme von
3H-Thymidin auf 63,6% gesenkt. Eine Zugabe von Peptiden der Fraktion
5 zu der mit Salzsäure behandelten Fraktion 1 verringerte die
Aufnahme von 3H-Thymidin auf 46,8%. Ähnliche Werte wurden bei
Parallelversuchen bei L-5178Y Tumorzellen festgestellt.
Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß die Fraktion P1 nachbe
handelt mit 1 N Salzsäure bei 95°C während einer Zeitdauer von
10 Minuten und anschließender Fraktionierung an einer Anionenaustau
schersäule einen Aufbau aus 4 Untereinheiten, und zwar 3 großen
und einer kleinen, aufweist. Die Molgewichte der 3 großen
Untereinheiten betragen etwa 4095, 4442 und 4106 einschließlich
und etwa 2800, 2592 und 2256 ohne Phosphoserine. Eine Behandlung
mit diesen Untereinheiten der Fraktion P1, also nach einer Salz
säurebehandlung, ist wirksamer als mit der nicht vorbehandelten
Fraktion P1 bei Carcinomzellen. Die Feststellung, daß die Repli
kation in normalen Zellen durch Zugabe der Untereinheiten der
Fraktion P1 nicht beeinflußt wird, läßt den Schluß zu, daß die
Spaltung des Phosphopeptidkomplexes P1 in normalen Zellen deutlich
höher ist als in Turmorzellen, so daß die Menge an Untereinheiten
ausreicht, die normale Zellproliferation zu kontrollieren. Tumor
zellen, die vielleicht einen Defekt an einem entsprechenden Enzymsystem
aufweisen, sind zu dieser Spaltung nicht oder nur verringert
in der Lage und dies würde zu einer entsprechenden Verringerung
der inhibitorischen Effekte der Untereinheiten und damit zu einer
Zunahme des Zellwachstums führen. Dieses entartete Zellwachstum
kann dann aber durch Zugabe der gespaltenen Fraktionen P1 bzw.
der Untereinheiten reguliert bzw. reduziert werden.
Die Ergebnisse der Impulscytophotometrie zeigen, daß sowohl die
behandelte wie auch die nicht vorbehandelte Fraktion P1 und Frak
tion P5 im Vergleich zur Kontrolle ohne Phopsphopeptide die An
zahl der Zellen in der frühen 5-Phase sehr stark und im geringe
ren Ausmaß in der G2-Phase verringern. Dieses Resultat zeigt,
daß die Phosphopeptide die DNA-Synthese primär am Beginn der S-
Phase verhindern oder, mit anderen Worten, daß die Phosphopeptide
an den Stellen des Beginns der DNA-Replikation wirksam sind.
Aufgrund der bisherigen Ergebnisse und der Tatsache, daß Phospho
peptide aus der DNA nur mit Hilfe eines Chelatisierungsmittels
und einer wirksamen Dialyse entfernt werden können, ist anzuneh
men, daß die Phosphopeptide, und zwar ohne Unterbrechung des
DNA-Rückgrates mit großer Affinität nach außen hin an einem Strang
der DNA gebunden sind und eine starke Brückenbildung durch zwei
wertige Metallionen zwischen den negativen Gruppen der Phosphopep
tide und jener der DNA zur Stabilisierung erfolgt. Die Analyse
von N-DNA hat ergeben, daß diese Ionen der Übergangsmetalle Zink
und Mangan im zweiwertigen Zustand enthält. Außerdem ist anzunehmen,
daß die Phosphopeptide sich an bestimmte Stellen anlagern und
der DNA die für die Replikation notwendigen Polymerasen, Enzyme
und andere Faktoren zuführen. Die einzelnen Untereinheiten der
Phosphopeptidfraktionen scheinen sich fest an bestimmten Stellen
der Initiation der Replikation der DNA in den Tumorzellen zu bin
den und damit diese Stellen für die Proliferation zu blockieren.
Im Gegensatz zu Adriamycin, das als bekanntes Antitumormittel
als Vergleichssubstanz mit untersucht wurde, und das die Cytostase
durch einen mit den Proteinen assoziierten Mechanismus der direkten
Brüche im DNA Einzelstrang verursacht, zeigen die Phosphopeptide
und ihre Untereinheiten einen Mechanismus, der keine DNA Schädi
gung oder letale toxische Effekte auslöst, sondern eine Normali
sierung der Proliferationsgeschwindigkeit bewirkt.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele näher erläu
tert:
Thymusgewebe vom Kalb wird unmittelbar nach der Schlachtung in
flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Nach der Zerkleinerung des
Gewebes im gefrorenen Stadium werden die Zellkerne bei Tempera
turen zwischen -10 bis -15°C im SGC-Medium (Saccharose/Glycero
phosphat/Citrat) in 40% Glycerin (V/V) isoliert und gereinigt.
Nach dem Abzentrifugieren der Kerne aus dem Lagermedium bei 18 000
rpm für eine Zeitspanne von 10 Minuten werden die Kerne disper
giert und von locker gebundener RNA und Eiweißen durch Extraktion
bei -2 bis -5°C gereinigt. Der Bodensatz der Kerne wird zu diesem
Zweck mit 0,06 M NACL Lösung in 30%-igem Glycerin gewaschen, in
120 ml dieser Lösung suspendiert und 10 Minuten bei 10 000 rpm
zentrifugiert. Der Bodensatz wird dann in 240 ml 0,055 M Phosphat/1
mM EDTA in 30%-igem Glycerin bei pH 7 dispergiert. Die Dispersion
läßt man 1 Stunde stehen und zentrifugiert dann 10 Minuten bei
10000 rpm. Der Bodensatz wird erneut in 50 ml 0,055 M Phosphat/1
nM EDTA/30% Glycerin aufgenommen und wird dann in eine Dialyse
tasche zusammen mit 6 ml des obengenannten Waschwassers einge
bracht, wobei die Membran in einen doppelwandigen Zylinder einge
setzt wird. Die Temperatur der Kühlflüssigkeit in der äußeren
Wandung des Zylinders wird auf -4°C einreguliert.
Die Kerne werden dann durch Zugabe von 6,2 ml 0,5 M EDTA mit pH
8,8 (Endkonzentration EDTA 0,05 M) und 0,63 ml einer 30%-igen
Lösung von Natrium-dodecylsulfat in Ethanol/Wasser im Verhältnis
1 : 1 (Endkonzentration 0,3%) unter ständigem Rühren lysiert. Die
Suspension wird dann 2 Tage bei -4°C ohne Dialyse stehengelassen.
Die erste Extraktion erfolgt bei -4°C gegen 700 ml 30%-iges Gly
cerin über Nacht. Das Dialysat wird dann aus der Kammer absipho
niert und durch den gleichen Schlauch eine 500 ml Portion frisches
Wasser zugegeben. Die Temperatur der Kühlflüssigkeit wird auf
0°C eingestellt. Dieser Vorgang wird in gleicher Weise 7 × wieder
holt.
Die Dialysate werden dann auf eine Anionenaustauschersäule (Dowex
2 Säule) aufgebracht und chromatographiert. Nach dem Chromatogra
phieren wird jede Dialysatfraktion mit 0,01 M Natrium-nitrilotri
acetat (NTA) in Gegenwart eines chelatbildenden Ionenaustauschers
(Chelex-100) bei einem pH von 1,5 versetzt. Die Suspension wird
über Nacht stehengelassen und die Phosphopeptide vom Ionenaustauscher
durch Elution mit 1 M NH4OH bei pH 9 abgetrennt.
Die so erhaltene Peptidmischung wurde dann in an sich bekannter
Weise durch Anionenaustauscherchromatographie weitergereinigt.
Die Rf-Werte der Fraktion P1 liegen bei 0,203 und die Fraktion
P5 bei 0,246.
Die Molekulargewichtsbestimmungen dieser beiden Fraktionen wurden
mit Hilfe der Gelchromatographie durchgeführt (Säule 60×1 cm
mit Sephadex G 10; destilliertes Walser mit Fließgeschwindigkeit
von 0,5 ml/Minute). Zur Kalibrierung der Säule wurden die Peptide
Angiotensin I, Eledoisin, Kallidin und reines Phosphoserin unter
gleichen Bedingungen benutzt. Das Molekulargewicht ergab sich
für die Fraktion P1 mit 9950 und für die Fraktion PS mit 18630
Dalton.
Nach der Entionisierung der Dialysate mit Ionenaustauscher und
NTA wurde der qualitative und quantitative Aminosäuregehalt in
an sich bekannter Weise nach dem Verfahren von Welsh in Biochem.
Biophys. Res. Comm. 163, 1135-1142 bestimmt. Bei der Auswertung
der Mol-Verhältnisse aus den Flächen unter den Peaks im Fraktio
nierungsdiagramm (A440 als Funktion der Zeit) unter Verwendung
von Ninhydrin wurde die Bewertungstabelle von Moore et al. Analyt.
Chem. 30, 421 zugrunde gelegt.
Die Fraktion P1 wies einen Gehalt an Phosphoserinkomplexen, Aspa
raginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin,
Isoleucin, Leucin, Lysin und Arginin im Mol-Verhältnis von 31 : 6 : 1:
2 : 8 : 13 : 4 : 2 : 1 : 3 : 1 : 1 auf. Hierbei werden unter Phosphoserinkomplexe
freie Aminosäure und deren Verbindungen mit zweiwertigen Kationen
zusammengefaßt.
Bei der Fraktion P5 ergab sich praktisch die gleiche Zusammensetzung
und das gleiche Mol-Verhältnis, allerdings mit der Ausnahme, daß
der Gehalt an Phosphoserinkomplexen doppelt so hoch lag.
Die biologische Aktivität der beiden Fraktionen wurde an transplan
tierten Walker Carcinoma-256 und gesunden Knochenmarkzellen getestet.
Die Walker Carcinomazellen wurden nach dem Verfahren von Volm
et al., Blut 35, 65-74, isoliert. Als Kontrolle dienten Knochenmark
zellen aus dem Sternum von weiblichen schwarzen C47 Mäusen. Als
Standardlösung wurde eine Mischung aus der Fraktion P1, behandelt
mit IN HCL 10 Minuten im siedenden Wasserbad, und die Fraktion
P5 in 4,45 mM MgATP und 8,9 mM MgSO4 verwendet, wobei das Gewichts
verhältnis von Fraktion 1 zu Fraktion 5 3,27 betrug.
Die Zellen wurden in Hanks Lösung homogenisiert und die Zellkon
zentration des Homogenisates auf 500 000 Zellen/ml eingestellt.
Ein Cephalosporinantibiotikum (Cephalotin der Fa. Lilly) wurde
in einer Endkonzentration von 50 µg/ml eingesetzt. Die Mischung
wurde dann im rotierenden Wasserbad bei 37°C 15 Minuten reinku
biert. Die Standardpeptidmischung hatte eine Konzentration von
12,9 µg/ml, bestimmt aus der UV-Absorption unter Annahme eines
Extinktionskoeffizienten von 70 A195/mg/ml.
Die Zellsuspensionen wurden dann auf 3 Reihen von Reagenzgläsern
in aliquoten Mengen von 0,1 ml verteilt; zur ersten Reihe mit
12 Reagenzgläsern (Kontrollreihe) wurde 0,1 ml TCM-199 (Difco)
Kulturmedium zugegeben. Zu der zweiten Reihe (4 Proben, 6 Reagenz
gläser für jede Probe) wurden verschiedene Volumina der Standard
phophopeptidmischung und ein Anteil an TCM-199 bis zu einem Ge
samtvolumen von 0,1 ml zugesetzt. Zu der dritten Reihe (4 Proben,
6 Reagenzgläser jeweils) wurde Adriamycin, gelöst in TCM-199 in
verschiedenen Konzentrationen zugefügt. Nach zweistündiger Inkuba
tion bei 37°C unter Schütteln wurden alle Proben in zwei Teile
geteilt, von denen ein Teil für die Impulscytophotometrie verwen
det wurde, während zu dem anderen Teil 50 µl 3H-Thymidin (mit
einem Gehalt an 2,5 µCi) zugesetzt wurde. Nach einer weiteren
Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37°C wurde ein 100 µl Aliquot
jeder der mit 3 H-Thymidin versetzten Proben auf drei Rundfilter
papiere (Watman Filter, 3 mm, 2,3 cm der Fa. Balston) pipettiert.
Die Filterpapiere wurden dann mit Warmluft getrocknet und die
nicht inkorperierte Radioaktivität mit eiskalter 5%-iger Trichlor
essigsäure für 30 Minuten ausgezogen. Anschließend wurden die
Filter mit Ethanol/Ether im Verhältnis 1 : 1 20 Minuten gespült.
Hieran anschließend wurde für 10 Minuten mit Ether gespült, an
der Luft getrocknet und in einem Scintillationsglas wurde dann
zu jedem Filter 5 ml Scintillationsflüssigkeit (85 ml Scintil
3 Koch-Light Laboratories Ltd. zu 2,5 l Toluol) zugesetzt und
die Flüssigscintillationsmessung durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgelistet und in Fig. 3 gra
fisch dargestellt. In der Grafik wird das Ausmaß der Inhibierung
durch Phosphopeptide auf die Zellproliferation ausgedrückt als
Prozent der 3H-Thymidin-Aufnahme in Walker-Carcinoma Zellen und
normalen Knochenmarkszellen im Vergleich zu der Aufnahme der ent
sprechenden Kontrollen als Funktion der totalen Konzentration
der zugesetzten Phosphopeptide. Zum Vergleich dient die Inhibie
rung in Walker Carcinoma- und normalen Knochemarkszellen durch
Adriamycin (ADR) als Funktion der ADR-Konzentration. Die Einheit
(1 x) der Phosphopeptidkonzentration entspricht 0,987 µg/ml der
mit 1 N HCL behandelten Peptidfraktion P1 + 0,302 µg/ml der Frak
tion 5, so daß sich eine Gesamtkonzentration von 1,289 µg/ml er
gibt. Die ADR-Konzentrationseinheit entspricht 0,86 µg/ml. Alle
Konzentrationen beziehen sich auf 0,1 ml Zugaben von Phosphopep
tiden oder ADR zur Reaktionsmischung.
Kurve 1 zeigt normale Knochenmarkzellen unter Zusatz von vorbe
handelter Fraktion 1 + Fraktion 5.
Kurve 2 zeigt normale Knochenmarkzellen + ADR
Kurve 3 zeigt Walker-Carcinoma Zellen + vorbehandelter Fraktion 1 + Fraktion 5
Kurve 4 zeigt Walker Carcinoma Zellen + ADR.
Kurve 2 zeigt normale Knochenmarkzellen + ADR
Kurve 3 zeigt Walker-Carcinoma Zellen + vorbehandelter Fraktion 1 + Fraktion 5
Kurve 4 zeigt Walker Carcinoma Zellen + ADR.
Zur Feststellung der Verteilung der Zellen in den verschiedenen
Phasen des Zellteilungszyklus wurden alle Proben mit Hilfe der
Impulscytophotometrie analysiert. Hierfür wurden die inkubierten
Proben 5 Minuten bei 200 g zentrifugiert, dann der Rückstand 2
x mit isotonischer NaCl Lösung gewaschen und im kalten Ethanol
fixiert. Die Zellen wurden dann 5 Minuten bei 200 g zentrifugiert
und der Rückstand wurde mit 0,25 ml Pepsinlösung (0,5 g Pepsin/100
ml 0,2%-ig HCl) versetzt und 5 Minuten geschüttelt. Anschließend
wurde mit 1 ml einer RNAse-Lösung (0,1 g) und mit Ethidiumbromid
in Trispuffer pH 7,5 bis zur Endkonzentration von 0,01 mg/ml ver
setzt. Die Fluoreszenzhistogramme (Anzahl der Impulse/Fluoreszenz
intensität) wurden unter Verwendung eines ICP-11 der Fa. Phyde,
Göttingen hergestellt. Die Auswertung der Histogramme erfolgte
nach dem prozentualen Anteil der Zellen in den Phasen G1, S und
(G2 + M).
Die Auswertung ist in Fig. 2 grafisch dargestellt. Die Kurve 1
zeigt die Kontrollkurve mit einer Gesamtzählung von 21165 bei
Pulsgeschwindigkeit 40. In Kurve 2 sind die Werte für die behan
delte Probe mit vorbehandelter Fraktion P1 und Fraktion 5 bei
einer Gesamtkonzentration von 0,451 µg/l dargestellt. Gesamt
zählung 16677, Pulsgeschwindigkeit 80 bis 100. Der anfänglich
scharfe Peak ist durch die somatischen Zellen bedingt, wie beispiels
weise aus Stöhr et al. in Beitr. Path. Band 155, 36-43 bekannt.
Claims (4)
1. Phosphopeptide aus Kalbsthymuszellkernen, gekennzeichnet
durch ein mittleres Molekulargewicht von 9950 Dalton, Rf-
Werte bei der Anionenaustauscherchromatographie von 0,203
und 0,246 in Gradient A (bei einem linearen Gradienten von
0 bis 4 m HCOOH) sowie ein Mol-Verhältnis von Phosphoserinkomplexen,
Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin,
Valin, Isoleucin, Leucin, Lysin und Arginin von 31 : 6 : 1 : 2 : 8 : 13 : 4 :
2 : 1 : 3 : 1 : 1.
2. Phosphopeptide aus Kalbsthymuszellkernen, gekennzeichnet
durch ein mittleres Molekulargewicht von 9950 Dalton, Rf-
Werte bei der Anionenaustauscherchromatographie bei 0,031,
0,077 und 0,131 in Gradient B (bei einem linearen Gradienten
von 0 bis 2 m HCOONH4 in 4 m HCOOH) sowie einem Aminosäuren
molverhältnis von Phosphoserinkomplexen, Asparaginsäure, Threonin,
Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin,
Lysin und Arginin von 62 : 6 : 1 : 2 : 8 : 13 : 4 : 2 : 1 : 3 : 1 : 1.
3. Verfahren zur Herstellung der Phosphopeptide nach Anspruch
1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Kalbsthymusgewebe im
gefrorenem Zustand von anhaftenden Proteinen und RNA gereinigt,
die Zellkerne isoliert und in an sich bekannter Weise lysiert
und dann bei Temperaturen zwischen -4 bis 0°C mehrfach gegen
30%-iges Glycerin dialysiert, die Dialysate in an sich bekann
ter Weise durch Anionenaustauscherchromatographie fraktioniert,
die Fraktionen ein den Rf-Werten zwischen 0,203 und 0,246 in
Gradient A bzw. 0,0031, 0,077 und 0,131 in Gradient B gesammelt
und in an sich bekannter Weise deionisiert werden.
4. Verwendung der Phosphopeptide nach Anspruch 1 und/oder
2 als Cytostatikum.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19934300222 DE4300222C2 (de) | 1993-01-07 | 1993-01-07 | Phosphopeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19934300222 DE4300222C2 (de) | 1993-01-07 | 1993-01-07 | Phosphopeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4300222A1 true DE4300222A1 (de) | 1994-07-14 |
DE4300222C2 DE4300222C2 (de) | 1998-08-13 |
Family
ID=6477820
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19934300222 Expired - Fee Related DE4300222C2 (de) | 1993-01-07 | 1993-01-07 | Phosphopeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4300222C2 (de) |
-
1993
- 1993-01-07 DE DE19934300222 patent/DE4300222C2/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Beitr. Path. Band 155, S.36-43 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE4300222C2 (de) | 1998-08-13 |
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