DE69104775T2

DE69104775T2 - Verfahren und Vorrichtung zum Durchführen der Kapillarelektroforese.

Info

Publication number: DE69104775T2
Application number: DE1991604775
Authority: DE
Inventors: Martin Fuchs; Michael Merion
Original assignee: Waters Investments Ltd
Current assignee: Waters Investments Ltd
Priority date: 1990-05-29
Filing date: 1991-05-16
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2011-05-17
Also published as: JPH04231863A; EP0459241A1; DE69104775D1; EP0459241B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung einer Kapillarelektrophorese. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Vorrichtung für die Kapillarelektrophorese, welche(s) das Aufkonzentrieren von gelösten Stoffen aus einer Lösung vor der Trennung der gelösten Stoffe durch Kapillarelektrophorese erlaubt.
Kapillarelektrophorese (KE) ist eine wirksame analytische Trenntechnik zur Analyse sehr kleiner Probenmengen. KE-Trennungen werden in einem einen kleinen Durchmesser aufweisenden Kapillarrohr, das mit einem als "Trägerelektrolyt" bezeichneten elektrisch leitenden Medium gefüllt ist, durchgeführt. Über die beiden Enden des Kapillarrohrs wird ein elektrisches Feld angelegt. Die Spezien in der Probe bewegen sich von einer Elektrode in Richtung auf die andere Elektrode, und zwar mit einer Geschwindigkeit, die von der elektrophoretischen Beweglichkeit der jeweiligen Spezies sowie von der Geschwindigkeit der Fluidumbewegung in dem Rohr abhängt. Eine KE kann unter Verwendung von Gelen oder Flüssigkeiten, wie Puffer, in der Kapillare durchgeführt werden. Bei einer flüssigen Variante, die als Freizonenelektrophorese bekannt ist, erfolgen Trennungen auf der Basis von Unterschieden in der Beweglichkeit der Probenspezies in der freien Lösung. Bei einer anderen flüssigen Variante dienen Mizellen dazu, auf Unterschieden in der Hydrophobizität basierende Trennungen herbeizuführen. Diese Variante ist als mizellenelektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC) bekannt.
Die KE ist aus verschiedenen Gründen von Vorteil. Hierzu gehören hohe Trenngeschwindigkeit, eine hohe Auflösung und geringe Probenmengen. So können beispielsweise bei der KE die Trenngeschwindigkeiten 10- bis 20-mal höher sein als bei einer üblichen Gelelektrophorese. Ein Anfärben nach dem Durchgang ist nicht nötig. Eine hohe Auflösung erreicht man teilweise bei Benutzung hoher Spannungen, da die Wärme durch die Kapillare rasch abgeleitet wird. Weiterhin wird infolge des engen (kleinen) Kapillarinnendurchmessers eine Bandverbreiterung auf ein Mindestmaß gesenkt. Bei der Freizonenelektrophorese tritt das Phänomen einer Elektroosmose bzw. eines elektroosmotischen Flusses (EOF) auf. Hierbei handelt es sich um einen Massefluß von Flüssigkeit, der sämtliche Probenmoleküle unabhängig von der Ladung beeinfluß. Ein EOF kann unter bestimmten Umständen einen Beitrag zu verbesserter Auflösung und Trenngeschwindigkeit bei einer Freizonen- KE leisten.
Für die Erzielung der hohen Auflösung, zu der die KE fähig ist, muß die Probe zu Beginn des elektrophoretischen Prozesses auf eine enge Anfangs- oder Startzone begrenzt sein. Hierdurch wird das in die Kapillare einbringbare Probenvolumen auf einen sehr kleinen Bruchteil des Gesamt-Kapillarenvolumens begrenzt. Ferner ist die niedrigste Materialkonzentration, die bei der KE durch Nachweis der Absorption von Ultraviolettstrahlung und sichtbarer Strahlung erfaßt werden kann, durch den kleinen Innendurchmesser der Kapillare stark eingeschränkt, weil der (die) Absorptionsnachweis oder -messung im allgemeinen mittels eines Strahlungsstrahls, der quer zur Achse der Kapillare läuft, durchgeführt wird. Aufgrund all dieser Tatsachen konnten mit der KE Proben mit Konzentrationen, die so niedrig sind, wie sie nach anderen Techniken wie Flüssigchromatographie analysiert werden können, nicht analysiert werden. Eine Möglichkeit zur Überwindung dieser Einschränkung ist von mehreren Forschern beschrieben worden und umfaßt das Auflösen der Probe in einem Puffer oder Elektrolyten einer Ionenstärke, die wesentlich niedriger ist als die des Trägerelektrolyten, der zur Durchführung der elektrophoretischen Trennung eingesetzt wird. Die so aufgelöste Probe wird in normaler Weise in die Kapillare eingeführt, obgleich dabei nun ein größeres Probenvolumen zulässig ist. Wenn zur Einleitung der elektrophoretischen Trennung das elektrische Feld angelegt wird, wird die Feldstärke in der Probenzone höher als im umgebenden Trägerelektrolyten, weil die Ionenstärke und damit die Leitfähigkeit in der Probenzone niedriger ist. Als Folge der höheren Feldstärke in der Probenzone wandern die Ionen in der Probe mit höherer Geschwindigkeit als Ionen im Trägerelektrolyten. Die Probenionen neigen daher dazu, sich an der Grenzfläche (zwischen) der Probenzone niedriger Leitfähigkeit und dem Trägerelektrolyten zu schichten, weil sie sich verlangsamen, sobald sie in den Trägerelektrolyten eintreten. Durch diesen Prozeß wird effektiv eine schmale Probenzone erzeugt, und er ermöglichte eine Verbesserung bezüglich der niedrigsten, analysierbaren Probenkonzentration um möglicherweise den Faktor 5.
Über eine Technik zum Vorkonzentrieren einer Probe vor der elektrophoretischen Trennung wurde von Aebersold und Morrison im Rahmen des High Performance Capillary Electrophoresis Symposium, Januar 1990, berichtet. Die Innenfläche eines kurzen Kapillarrohrstücks wurde mit einer adsorptionsfähigen Beschichtung versehen. Dieses Rohr wurde sodann gegen das Ende eines unbeschichteten Kapillarrohrs angestoßen bzw. angesetzt. Diese Anordnung ermöglichte das Einspritzen eines größeren Probenvolumens (das normalerweise stark erweiterte oder verbreiterte Peaks hervorrufen würde) in das beschichtete Rohrstück und sodann in das unbeschichtete Rohr. Die Probenmoleküle wurden an der Beschichtung adsorbiert, während das Lösungsmittel das Rohr passierte, und wurden mittels des Elektrolyten aus dem Kapillarrohr ausgewaschen. Hierauf wurde ein kleines Volumen eines organischen Lösungsmittels in die (stumpf) gegeneinander anstoßenden Kapillarrohre eingeführt. Dieses Lösungsmittel bewirkte eine Desorption der Probenmoleküle von der Beschichtung, so daß diese Moleküle in konzentrierter Form in das unbeschichtete Rohr eintraten. Da das organische Lösungsmittel eine niedrigere Leitfähigkeit als der Trägerelektrolyt besaß, trat die oben erwähnte Zonenverschmälerung auf. Während sich beide Enden des Kapillarrohrs im Elektrolyten befanden, wurde dann die elektrophoretische Kapillartrennung in normaler Weise durchgeführt. Es wurde berichtet, daß aufgrund dieses Vorkonzentrierschritts die KE mit Proben, deren Konzentration um das 5- bis 10-fache niedriger war als bisher bei der KE möglich, durchgeführt werden konnte.
Gepackte Kapillarsäulen (mit Füllstoff) sind bereits in der Flüssigchromatographie für Probentrennungen eingesetzt worden. Solche Säulen sind in verschiedenartiger Weise ausgestaltet worden. Eine Möglichkeit zur Herstellung einer solchen Säule wurde von Jorgensen und Mitarbeitern in "Journal of Chromatography", Vol. 218 (1981), S. 209-216, beschrieben. Die Säule wird durch Füllen des einen Endes eines Kapillarrohrs mit einem teilchenförmigen Füllstoff gebildet. Das gefüllte Ende wird dann in einer Flamme erwärmt, um den Füllstoff zur Erzeugung einer porösen Fritte zu sintern. Ein(e) Schlamm oder Aufschlämmung chromatographischer Trennteilchen wird in das dem Fritten-Ende gegenüberliegende Ende der Kapillare eingeführt, bis die Kapillare mit diesen Teilchen gefüllt ist. Sodann wird im offenen Ende der Kapillare auf die gleiche Weise wie im Fall der ersten Fritte eine zweite Fritte erzeugt.
Gemäß der US-PS 4 793 920 (Cortes et al.) wird eine gepackte Siliziumdioxid-Kapillarchromatographiesäule durch Gießen (casting) eines Stopfens aus Keramikmaterial im einen Ende der Kapillare zwecks Bildung eines porösen Stopfens, der z.B. mittels Wärme verschmolzen wird, hergestellt. Hierauf wird der chromatographische Füllstoff in den Rest des Rohrs eingeführt. Die US-PS 4 483 773 (Yang) offenbart ebenfalls eine Möglichkeit zur Ausbildung eines Stopfens und eines chromatographischen Füllstoffs innerhalb einer Kapillarchromatographiesäule.
Es wäre wünschenswert, eine Möglichkeit oder Einrichtung bereitzustellen, welche die Analyse einer verdünnten Probenlösung mittels KE bei Konzentrationen, die wesentlich niedriger sind als diejenigen, die nach derzeit verfügbaren KE- Prozessen analysiert werden können, ermöglicht.

ABRISS DER ERFINDUNG

Mit der vorliegenden Erfindung werden ein KE-Vorbehandlungsverfahren und eine -vorrichtung bereitgestellt, welche die Anwendung der KE auf die Analyse von Proben erlauben, deren Konzentration um mindestens eine Größenordnung kleiner ist als diejenige, die mittels derzeit verfügbarer KE-Prozesse analysiert werden kann. Erfindungsgemäß wird eine Probenkonzentriereinrichtung bereitgestellt, in welcher eine Probe eines gelösten Stoffs durch einen festen oder gelförmigen Füllstoff in einem Rohr zurück- oder festgehalten wird, während das Lösungsmittel den Füllstoff durchströmt. Die Teilchen werden in einem Rohr, etwa einem Kapillarrohr, durch mechanische Mittel, z.B. Rohreinschnürungen oder poröse Stopfen an beiden Enden der (des) eingefüllten aufkonzentrierenden Feststoffteilchen oder Gels, eingeschlossen. Die (das) aufkonzentrierende(n) Teilchen oder Gel besitzen (besitzt) im Vergleich zu einer Wandbeschichtung aus einer adsorptionsfähigen Masse eine höhere Adsorptionsleistung und eine längere Nutz-Lebensdauer. Die erfindungsgemäße Probenkonzentriereinrichtung wird entweder materialeinheitlich mit einem für die KE geeigneten Kapillarrohr oder in einem getrennten Rohr geformt, das in Verbindung mit einem für KE geeigneten Kapillarrohr eingesetzt werden kann. Gemäß einer Ausführungsform werden im Rohr eine Einschnürung geformt, ein Füllstoff bis zur Einschnürung in das Rohr eingebracht und im Rohr an einem zweiten Ende des Füllstoffs eine zweite Einschnürung geformt, um damit den Füllstoff innerhalb des Rohrs einzuschließen bzw. festzulegen. Gemäß einer zweiten Ausführungsform werden bei niedriger Temperatur wärmeverschmelzbare Teilchen in das Rohr eingebracht und zur Ausbildung eines porösen Stopfens erwärmt. Sodann werden ein Füllstoff bis zum Stopfen in das Rohr eingefüllt und auf die gleiche Weise ein zweiter Stopfen an einem zweiten Ende des Füllstoffs geformt, um damit den Füllstoff im Rohr einzuschließen bzw. festzulegen.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

In den beigefügten Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 eine (Längs-)Schnittansicht einer einteiligen Ausführungsform dieser Erfindung,
Fig. 2 eine Schnittansicht einer anderen einteiligen Ausführungsform dieser Erfindung,
Fig. 3 eine Schnittansicht einer zweiteiligen Ausführungsform dieser Erfindung,
Fig. 4 eine Schnittansicht einer anderen zweiteiligen Ausführungsform dieser Erfindung,
Fig. 5 eine schematische Darstellung eines Kapillarrohr- Elektrophoreseverfahrens gemäß dieser Erfindung,
Fig. 6 ein Elektropherogramm einer nach dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik erhaltenen Probe,
Fig. 7 ein Elektropherogramm der gleichen Probe wie in Fig. 6, jedoch unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens (erhalten), und
Fig. 8 ein Elektropherogramm der im Beispiel 2 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verarbeiteten Probe.

BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Probenkonzentrationssäule gemäß dieser Erfindung kann als einstückiges Teil eines für Elektrophorese verwendeten Kapillarrohrs oder aus einem getrennten Rohr, dessen Innendurchmesser größer oder kleiner ist als der des für Elektrophorese verwendeten Kapillarrohrs, das aber in Verbindung mit dem bei der Kapillarelektrophorese verwendeten Kapillarrohr eingesetzt werden kann, ausgebildet sein. Der vorliegend benutzte Ausdruck "Kapillarrohr" bezieht sich auf ein Rohr eines Innendurchmessers im Bereich von etwa 1 - 500 um.
Das Probenkonzentrationsrohr enthält einen festen teilchen förmigen oder gelförmigen Füllstoff, der eine Probe durch z.B. Adsorption, Absorption oder chemische Wechselwirkung zurückzuhalten und anschließend bei Kontaktierung mit einem geeigneten Lösungsmittel die Probe freizugeben vermag.
Repräsentative Füllstoffteilchen sind Siliziumdioxid-, Aluminiumoxid- oder Zirkonoxidteilchen mit hydrophoben Oberflächenbeschichtungen bzw. -überzügen, wie C18-, C8- oder C4- Verbindung; Ionenaustauschstoffe, wie Diethylaminoethyl (DEAE), Sulfopropyl (SP) oder quaternäres Aminoethyl (QAE); oder affinitätsbeschichtete Teilchen, wie Protein, Antikörper oder Azofarbstoffe. Wahlweise kann der Füllstoff einen Gel-Füllstoff umfassen, der im Rohr in situ gebildet werden kann, z.B. Polyacrylamid, Agarose, Cellulose und Polyethylenoxide.
Der feste teilchenförmige oder gelförmige Füllstoff wird im Rohr durch poröse Stopfen oder Einschnürungen an Ort und Stelle gehalten. Repräsentative, geeignete teilchenförmige Materialien, die für die Ausbildung eines porösen Stopfens benutzt werden können, umfassen niedrigschmelzende Glasteilchen, wie Borsilikatglasteilchen, die durch Sintern in situ im Rohr in eine Fritte überführt werden können, oder einen porösen Keramikstopfen, der vorgeformt und dann in das Rohr eingesetzt wird. Als poröser Stopfen können auch andere mechanische Mittel, die Flüssigkeit hindurchfließen lassen, den Füllstoff aber zurückhalten, verwendet werden.
Bei der Herstellung einer Probenkonzentrationssäule, bei der der Füllstoff durch Einschnürungen in den Rohren festgehalten wird, werden die Einschnürungen dadurch geformt, daß Wärmeenergie längs eines kurzen Stücks des Rohrs, wo eine Einschnürung gewünscht wird, konzentriert wird. Die Energie reicht aus, um diesen Bereich des Rohrs fließen zu lassen und dadurch einen kleineren Innendurchmesser im Rohr zu bilden. Eine zweckmäßige Möglichkeit zur Ausbildung einer Einschnürung besteht in einem Drehen des Rohrs in einem zwischen Elektroden erzeugten elektrischen Lichtbogen, so daß die auf das Rohr einwirkende Energie um den Umfang des Rohrs herum gleichmäßig zur Einwirkung gebracht wird. Nach der Ausbildung einer Einschnürung und dem Abkühlen des Rohrs zum Erstarrenlassen desselben wird der teilchenförmige Füllstoff bis zur Einschnürung in das Rohr eingebracht. Sodann wird auf die gleiche Weise eine zweite Einschnürung am gegenüberliegenden Ende des Füllstoffs geformt. In einer alternativen Ausführungsform wird ein Abschnitt des Rohrs mit Teilchen gefüllt, deren Schmelzpunkt niedriger ist als der des Rohrs und die beim Verschmelzen einen porösen Stopfen zu bilden vermögen. Die Teilchen werden durch Erwärmen verschmolzen und (dann) zur Bildung des Stopfens abgekühlt. Die mit der Probe in Wechselwirkung tretenden Teilchen werden bis zum porösen Stopfen in das Rohr eingefüllt; darauf wird auf die gleiche Weise am zweiten Ende der aufkonzentrierenden (concentrating) Teilchen in einem Kapillarrohr ein zweiter poröser Stopfen geformt. Die aufkonzentrierenden Teilchen besitzen im allgemeinen einen Durchmesser im Bereich von etwa 1 - 50 um; die gepackte (mit Füllstoff gefüllte) Länge beträgt etwa 0,5 - 10 mm.
Gemäß Fig. 1 ist eine gepackte Konzentrationssäule 10 materialeinheitlich mit (aus) einem für die KE geeigneten Kapillarrohr 12 geformt. Bei der Herstellung der Säule 10 wird zunächst eine Einschnürung 14 so geformt, daß der Durchmesser einer Öffnung 16 im Bereich von etwa 1 - 50 um liegt. Sodann wird der Füllstoff 18 als Aufschlämmung auf beliebige geeignete Weise, etwa, durch Einsaugen der Aufschlämmung mittels eines Unterdrucks oder durch Einpumpen der Aufschlämmung unter Druck, in das Rohr 10 eingeführt. Hierauf wird auf oben beschriebene Weise eine zweite Einschnürung 20 im Rohr 10 so ausgebildet, daß der Durchmesser einer Öffnung 22 im Bereich von 1 - 50 um liegt. Im Gebrauch wird die zu behandelnde Probe in einem Lösungsmittel, wie durch einen Pfeil 26 angedeutet, über einen Rohreinlaß 24 eingeführt; die gelösten Stoffe der Probe werden im Füllstoff 18 zurückgehalten, während das Lösungsmittel in das Kapillarrohr 12 einströmt. Danach wird ein kleines Volumen (1 - 20 nl) eines zweiten Lösungsmittels in den Einlaß 24 eingeführt, um die gelösten Stoffe aus dem Füllstoff freizugeben und in das Kapillarrohr 12 zu transportieren, in welchem sie auf noch näher zu beschreibende Weise durch KE getrennt werden. Die Leitfähigkeit des zweiten Lösungsmittels kann niedriger sein als die des Trägerelektrolyten. Hierdurch wird, wie oben beschrieben, die Probenzone wirksam verschmälert bzw. verengt. Gegebenenfalls kann vor dem Einführen des zweiten Lösungsmittels in das Kapillarrohr ein Elektrolyt in dieses eingeführt werden, so daß das Probenlösungsmittel ausgespült wird und der Elektrolyt zum Zwecke der Durchführung der Kapillarelektrophorese im gesamten Kapillarrohr vorhanden ist.
Gemäß Fig. 2, in welcher gleiche Teile mit den gleichen Bezugsziffern (wie vorher) bezeichnet sind, sind niedrigschmelzende Teilchen, die durch Erwärmen in einen porösen Stopfen umgewandelt werden können, mit Hilfe eines zweckmäßigen Mittels, z.B. eines (nicht dargestellten) Stampfdrahts eines Durchmessers, der gleich groß oder kleiner ist als der Innendurchmesser des Kapillarrohrs 12, in das Kapillarrohr 12 eingebracht. Die niedrigschmelzenden Teilchen werden durch Behandeln des Rohrs 12 mit einer Wärmequelle erwärmt, um die Teilchen, nicht aber das Rohr 12 zu schmelzen; anschließend erfolgt ein Abkühlen zur Bildung des porösen Stopfens 28. Ein Füllstoff aus konzentrierenden Teilchen 18, der einen gelösten Stoff zurückzuhalten vermag, wird dann in das Rohr 12, in Berührung mit dem porösen Stopfen 28, eingefüllt. Die konzentrierenden Teilchen können zweckmäßig als Aufschlämmung in das Rohr eingebracht werden. Hierauf wird auf die gleiche Weise wie im Fall des Stopfens 28 ein zweiter poröser Stopfen 30 geformt. Der Probenkonzentrations- Füllstoff 18 wird sodann durch Einführen eines den (die) gelösten Stoff(e) der Probe enthaltenden Lösungsmittels in die Öffnung 24 benutzt, wobei das Lösungsmittel die Stopfen 28 und 30 sowie den Füllstoff 18 durchströmt, während der (die) gelöste(n) Stoff(e) der Probe durch den Füllstoff 18 zurückgehalten wird (werden). Ein kleines Volumen (1 - 10 nl) eines zweiten Lösungsmittels, das den (die) gelösten Stoff(e) der Probe freisetzt, wird daraufhin für Analyse durch KE durch den Stopfen 28 und 30 sowie den Füllstoff 18 in das Innere 32 des Kapillarrohrs 12 eingeleitet. Im Gebrauch wird der Füllstoff 18 zwischen den Stopfen 28 und 30 zurückgehalten.
In Fig. 3 ist eine in einer Hülse 34 untergebrachte zweiteilige Konstruktion dargestellt, umfassend ein Kapillarrohr 12 und ein Probenkonzentrations-Kapillarrohr 36 mit im wesentlichen dem gleichen Durchmesser wie beim Kapillarrohr 12. Wie in Verbindung mit Fig. 2 erläutert, enthält das Innere des Rohrs 36 zwei poröse Stopfen 28 und 30 sowie einen teilchenförmigen Füllstoff 28 (bzw. 18); die Anordnung wird auf die gleiche Weise wie vorher benutzt. Der Vorteil der zweiteiligen Konstruktion besteht in folgendem: Wenn sich die Nutzbarkeit des Probenkonzentrationsrohrs 36 verringert, kann es aus der Hülse 34 herausgezogen und verworfen werden, während das Kapillarrohr 12 beibehalten wird. Ebenso kann das Kapillarrohr, wenn seine Nutzbarkeit nicht mehr gegeben ist, getrennt verworfen werden.
In Fig. 4 ist eine andere zweiteilige Konstruktion dargestellt, bei welcher das Probenkonzentrationsrohr 40 einen größeren Durchmesser als das Kapillarrohr 12 aufweist und beide Rohre 40 und 12 in einer Hülse 34 festgelegt sind. Ersichtlicherweise kann der Außendurchmesser des Rohrs 40 größer sein als der des Rohrs 12, während die Hülse 34 entsprechend geformt ist, so daß die Rohre 12 und 40 einander kontaktieren (aneinander anstoßen) und ein Fluidstrom zwischen den Rohren 40 und 12 möglich ist. Das Probenkonzentrationsrohr 40 enthält poröse Stopfen 28 und 30 sowie den teilchenförmigen Füllstoff 18 und ist bzw. wird auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, geformt und benutzt. Diese Ausführungsform bietet den Vorteil, daß ein großes Rückhaltevermögen füßr gelöste Stoffe der Probe (solute sample retaining capacity) mit einer gegebenen Länge des Probenkonzentrationsrohrs erreicht wird und daß entweder das Kapillarrohr oder das Probenkonzentrationsrohr, wie oben beschrieben, selektiv verworfen werden kann. Die Ausführungsformen nach den Fig. 3 und 4 können anstelle der porösen Stopfen, wie gezeigt, Rohr-Einschnürungen aufweisen. Ebenso kann das Probenkonzentrationsrohr 40 statt eines größeren Innendurchmessers einen kleineren Innendurchmesser als das Kapillarrohr 12 aufweisen.
Fig., 5 zeigt ein grundsätzliches System, das für die Freizonen-Kapillarelektrophorese (-KE), die Gel-Kapillarelektrophorese oder die mizellenelektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC) verwendet werden kann. Bei der Gel-Kapillarelektrophorese wird das Kapillarrohr anstelle eines flüssigen Elektrolyten, wie bei KE, mit einem elektrisch leitenden Gel gefüllt. Bei allen obigen Mechanismen, wie in Fig. 5 gezeigt, ist oder wird eine in den Fig. 1 bis 4 näher dargestellte Rohranordnung 50 zwischen zwei Reservoirs 52 und 54, die jeweils einen Elektrolyten 56 enthalten, angeordnet. In einem ersten Schritt werden das Reservoir 52 durch ein die Probe enthaltendes Reservoir ersetzt und eine Spannung von einer Stromversorgung 58 zwischen Probenreservoir und Reservoir 54 angelegt. Die Probe wird durch den Vorderabschnitt 51 des Rohrs 50, das den bechriebenen Probenkonzentrationsfüllstoff enthält, geleitet. Nachdem ein Volumen der Probe den Vorderabschnitt 51 des Rohrs 50 durchströmt hat und gelöste Stoffe im Füllstoffabschnitt zurückgehalten worden sind, wird das Reservoir 52 durch ein Reservoir ersetzt, das ein zum Eluieren der zurückgehaltenen Probe aus dem Füllstoff fähiges Lösungsmittel enthält. Dieses Lösungsmittel wird in das Rohr 50 eingeführt, indem ein Potential, typischerweise im Bereich von etwa 5 - 30 kV, für kurze Zeitspannen (1 - 10 s) zwischen das Lösungsmittelreservoir und das Reservoir 54 angelegt wird. Schließlich wird das Lösungsmittelreservoir durch das Elektrolytreservoir 52 ersetzt, worauf zur Durchführung der Trennung ein Potential zwischen die Reservoire 52 und 54 angelegt wird. Die eluierte Probe strömt durch das Kapillarrohr 50 an einem Detektor 60 vorbei in das Reservoir 54. Der Detektor kann ein beliebiger Detektor sein, der die Probe zu analysieren vermag, z.B. ein UV-Absorptions-, Fluoreszenz- oder Leitfähigkeitsdetektor, ein Massenspektrometer, ein Infrarot-Absorptionsdetektor oder dergleichen.
Die folgenden Beispiele sollen diese Erfindung verdeutlichen, ohne sie einzuschränken.

Beispiel 1

Dieses Beispiel verdeutlicht Verfahren zur Herstellung der Probenkonzentrationssäulen nach den Fig. 1 und 2. Die verwendeten Kapillarrohrtypen sind Quarzglas-Kapillarrohre, die ein kurzes Stück (1 - 5 mm) eines chromatographischen Füllstoffs in einem ansonsten leeren Kapillarrohr (Gesamtlänge im Bereich von 10 - 100 cm) enthalten. Dieser chromatographische Füllstoff ist nahe dem Injektionsende des Kapillarrohrs angeordnet.

Verfahren 1

Eine Quarzglas-Kapillare eines Innendurchmessers von 75 um und 60 cm (Länge) wurde mittels eines Kapillarenspaltwerkzeugs aus einem Grundmaterial ausgeschnitten. Ein Ende der Kapillare wurde in einen Elektroden enthaltenden Manipulator eingesetzt, so daß das Ende der Kapillare etwa 1 cm von den Elektroden entfernt war. Das andere Ende der Kapillare wurde an der Achse bzw. Welle eines Motors angebracht; die Kapillare wurde innerhalb des Manipulators (erhältlich von Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona) mit einer Drehzahl von 10 - 1000/min in Drehung versetzt, um eine gleichmäßige Wärmeeinwirkung zu gewährleisten. Der Manipulator wurde mit einer Stromeinstellung von 25 bei jedem Stoß 1- bis 4-mal für (jeweils) etwa 10 s aktiviert (fired). In der Kapillare wurde am Innenpunkt 14 (vgl. Fig. 1) derselben eine Einschnürung (neck) geformt. Der Innendurchmesser betrug an der engsten Stelle etwa 10 um. Sodann wurde die Kapillare vom Motor und vom Manipulator getrennt. Das gegenüberliegende Ende der Kapillare wurde mit einem Unterdruck beaufschlagt; das die Einschnürung aufweisende Ende wurde in eine Suspension chromatographischer Teilchen uBondapak (erhältlich von Waters Division der Fa. Millipore, Milford, MA) mit einer Größenverteilung von 15 - 20 um eingetaucht. Die Perlen (Teilchen) waren in Methanol suspendiert; sie wurden mittels der Krafts eines Unterdrucks in die Kapillare eingesaugt, wodurch ein gepacktes Bett oder Füllstoffbett geformt wurde, das von der Einschnürung ausging und sich zum Ende der Kapillare erstreckte, wie dies in Fig. 1 bei 18 gezeigt ist. Danach wurden das Rohr aus der Füllstoffsuspension herausgenommen und der Unterdruck angelegt, bis das gesamte Methanol entfernt war. Hierauf wurde die Kapillare zum Manipulator zurückgebracht; auf die gleiche Weise (wie beschrieben) wurde eine weitere Einschnürung (20) erzeugt, um den Füllstoff einzuschließen. Die (das) endgültige Kapillare bzw.
Kapillarrohr ist in Fig. 1 dargestellt. Anschließend wurden die Strömungseigenschaften der Kapillare getestet, indem versucht wurde, Methanol mittels einer "Hamilton Gas Tight"- Spritze durch die Kapillare hindurchzutreiben. Wenn das Fluid frei strömte, war die Kapillare gebrauchsbereit.

Verfahren 2

Eine Quarzglas-Kapillare von 100 um x 60 cm wurde mittels eines Kapillarenspaltwerkzeugs aus einem Grundmaterial ausgeschnitten. Ein Ende der Kapillare wurde in trockenen Glasschrot (niedrigschmelzende Borsilikatglasperlen) mit einer Teilchen(größen)verteilung zwischen 1 und 50 um hineingedrückt. Dabei traten einige wenige Glasperlen in die Spitze der Kapillare ein. Sodann wurde mit Hilfe eines Binokularmikroskops für Sichtbetrachtung ein Metalldraht oder eine Quarzglasfaser mit einem Außendurchmesser im Bereich von 75 - 100 um in das Ende der Kapillare eingeführt. Die Glasperlen wurden in die Kapillare hineingeschoben und in einem kleinen Bereich, 3 - 5 mm vom Ende der Kapillare entfernt, konzentriert. Sodann wurde die Kapillare so in den Manipulator eingesetzt, daß sich die Anhäufung der Glasperlen zwischen den Elektroden befand. Hierauf wurde bei einer Stromeinstellung von 10 während 10 s ein Spannungsstoß auf die Kapillare ausgeübt. Dies führte zu einem Anschmelzen der Glasperlen, so daß sie unter Bildung einer porösen Fritte miteinander verschmolzen. (Vgl. Fig. 2, (28)). Das andere Ende der Kapillare wurde hierauf mit einer Unterdruckquelle verbunden, und das die Fritte enthaltende Ende wurde in eine Suspension von C18-beschichteten porösen Siliziumdioxidperlen (Delta Pak C18, erhältlich von Waters Division der Fa. Millipore, Milford, MA) mit einer Teilchen(größen)verteilung von 15 - 20 um eingetaucht. Die Perlen wurden in Methanol suspendiert. Dies führte zur Bildung eines gepackten Betts oder Füllstoffbetts, beginnend an der Fritte (28) und sich bis zum Ende der Kapillare erstreckend. Daraufhin wurden die Kapillare unter das Mikroskop gelegt und der Draht wiederum eingeführt, um die Perlen weiter zu verdichten (to pack) und einen freien Raum von 1 - 2 mm am Ende der Kapillare zu belassen. Das andere Ende der Kapillare wurde hierauf an eine Unterdruckquelle angeschlossen; das gepackte Ende wurde in eine Suspension des gleichen Glasschrots, wie vorher verwendet, in Methanol eingetaucht. Dies führte zu einem endgültigen bzw. vollständigen Füllen des Endes der Kapillare mit Glasschrot. Schließlich wurden die Kapillare wieder in den Manipulator eingesetzt und die Glasperlen am (im) Ende der Kapillare zwischen den Elektroden plaziert. Hierauf wurde 10 s lang bei einer Stromeinstellung von 10 ein Spannungsstoß angelegt. Dies führte zur Ausbildung einer zweiten Fritte (30) zum Einschließen des Füllstoffs (18) (vgl. Fig. 2). Die Kapillare wurde mittels einer "Hamilton Gas Tight"-Spritze zum Hindurchtreiben von Methanol durch die Kapillare auf ihre Strömungseigenschaften getestet. Wenn sich das Fluid frei durch die Kapillare bewegte, war diese gebrauchsbereit. Verwendung
Mittels Ionenwanderung bei 7 kV wurden Proben auf die Kapillaren nach Fig. 1 oder 2 geladen. Sobald die Probe auf den Perlen in der Kapillare geladen war, wurde sie zur Trennung mit nachfolgender Injektion eines 60/40-Gemisches aus Acetonitril/Laufpuffer mit Hilfe der Ionenwanderung bei 3 kV freigesetzt. Der verwendete Laufpuffer bestand aus 10 mM NaPO&sub4; eines pH-Werts von 7,0. Alle Trennungen erfolgen bei 7 kV.

Verwendung 1

Als Referenz ist in Fig. 6 das Peptid Neuromedin dargestellt. Dieses wurde unter Verwendung einer unmodifizierten Quarzglas-Kapillare (ab)getrennt. Der Grenzwert des Nachweises bei 214 nm, wie hier demonstriert, beträgt etwa 1 ug/ml. Kleinere Konzentrationen, sind mittels dieser Geräteanordnung nicht nachweisbar.
Das gleiche Peptid wird unter Verwendung der nach Verfahren 1 hergestellten und in Fig. 1 gezeigten Kapillare getrennt. Die Konzentration der Probe beträgt wiederum 1 ug/ml. Es ist jedoch klar erkennbar, daß der Grenzwert der Ansprechempfindlichkeit ganz drastisch herabgesetzt worden ist. Gemäß Fig. 7 entspricht dies einer etwa 50-fachen Erhöhung der Ansprechempfindlichkeit. Verwendung 2
Das Peptid ACTH 1-4 bei 100 ng/ml wird unter Verwendung der in Fig. 2 gezeigten und nach dem Verfahren 2 hergestellten Kapillare getrennt. Der Nachweisgrenzwert für dieses Peptid ohne Vorkonzentration liegt bei etwa 1 ug/ml. Die hierbei geschätzte Erhöhung der Ansprechempfindlichkeit entspricht etwa dem 400-fachen. Ein Gemisch von Peptiden wurde an (in) der nach Verfahren 2 hergestellten Kapillare getrennt. Die Peptide waren ACTH 1-4 bei 1 ug/ml + ACTH 1-10 bei 50 ng/ml + Neuromedin bei 5 ng/ml. Die Trennung ist in Fig. 8 veranschaulicht. Dies entspricht einer etwa 400-fachen Erhöhung der Ansprechempfindlichkeit.

Claims

1. Vorrichtung zur Durchführung eines Kapillartrennungsprozesses, ausgewählt aus einer Kapillarelektrophorese oder einer elektrokinetischen Mizellarkapillarchromatographie, umfassend:

ein erstes Rohrteil mit einem Rohr, das einen zum Zurückhalten einer Probe eines gelösten Stoffes und zum anschließenden Freigeben der Probe des gelösten Stoffes fähigen Füllstoff enthält, wobei das erste Rohrteil ein Mittel zum Zurück- oder Festhalten des Füllstoffs im ersten Rohrteil unter Ermöglichung eines Strömens einer Flüssigkeit durch das erste Rohrteil aufweist,

wobei das erste Rohrteil einen Einlaß und einen Auslaß aufweist, von denen der Auslaß in Flüssigkeitsverbindung mit einem Kapillarrohrteil steht,

und Mittel zum Bewirken des Kapillartrennungsprozesses im Kapillarrohrteil.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Füllstoff ein teilchenförmiger Füllstoff ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Füllstoff ein Gelfüllstoff ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Mittel zum Zurück- oder Festhalten zwei im ersten Rohrteil vorgesehene Einschnürungen umfaßt und wobei der Füllstoff zwischen den Einschnürungen angeordnet ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Mittel zum Zurück- oder Festhalten zwei im ersten Rohrteil angeordnete poröse Stopfen umfaßt und wobei der Füllstoff zwischen den porösen Stopfen angeordnet ist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5, wobei das erste Rohrteil und das Kapillarrohrteil materialeinheitlich (miteinander) geformt sind.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 5, wobei das erste Rohrteil und das Kapillarrohrteil getrennt geformt sind und durch eine diese Teile umschließende Hülse in Verbindung miteinander gehalten werden.

8. Verfahren zur Durchführung einer Kapillarelektrophorese in der Vorrichtung nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte:

Einführen einer Lösung aus einem ersten Lösungsmittel und einer Probe eines gelösten Stoffes in das erste Rohrteil, um die Probe des gelösten Stoffes mittels des Füllstoffs zurückzuhalten, während das erste Lösungsmittel durch das erste Rohrteil hindurchtreten gelassen wird;

Hindurchleiten eines zweiten Lösungsmittels durch das erste Rohrteil zur Freisetzung der Probe des gelösten Stoffes von dem teilchenförmigen Füllstoff und in das Kapillarrohrteil hinein und

Analysieren der Probe des gelösten Stoffes im Kapillarrohrteil durch Kapillarelektrophorese.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei nach dem Einführen der Probe des gelösten Stoffes in das erste Rohrteil und vor dem Einführen des zweiten Lösungsmittels in das erste Rohrteil ein Elektrolyt in das Kapillarrohrteil eingeführt wird.