FR2681944A1 - Procede de determination des mobilites et des quantites relatives de solutes. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne à la détermination des mobilités et des quantités relatives de solutés. Elle se rapporte à un procédé qui comprend (a) la détection de variations du coefficient d'absorption de lumière en fonction du temps à plusieurs points de détection (23 à 26) espacés le long du capillaire, (b) à chaque point de détection (23 à 26), l'identification de pics de variation du coefficient d'absorption, (c) pour chaque pic de la séquence, la formation de la moyenne de la distance parcourue divisée par le temps nécessaire pour que le pic atteigne le point de détection, et (d) pour chaque pic de la séquence, la formation de la moyenne des surfaces délimitées par les pics à une même position. Application à l'électrophorèse et à la chromatographie dans un capillaire.

Description

La présente invention concerne le domaine de l'élec-

trophorèse dans un capillaire et de la chromatographie dans un capillaire, et elle concerne en particulier des procédés

de détection en continu.

L'électrophorèse dans un capillaire et la chromato- graphie dans un capillaire présentent un certain nombre d'avantages très nets comme procédés de séparation des mélanges biochimiques Un premier avantage est le petit

volume de l'intérieur d'un capillaire Il permet l'exécu-

tion de séparations sur des échantillons extrêmement

petits, et à grande vitesse Un autre avantage qui concerne-

plus spécifiquement l'électrophorèse dans des capillaires, est la vitesse élevée à laquelle la chaleur se dissipe à l'extérieur d'un capillaire étant donné la petite dimension du capillaire Ceci permet l'utilisation d'une tension élevée pour le pilotage de l'électrophorèse, et assure des

séparations à grande vitesse et avec un rendement élevé.

Tous ces avantages rendent les capillaires particulièrement utiles pour l'analyse d'échantillons d'intérêt biologique, notamment de mélanges de peptides, de protéines et d'acides nucléiques. Le procédé le plus avantageux pour la détection des solutés séparés dans des séparations dans un capillaire est une détection en continu L'un des avantages qu'offre cette détection en continu est la possibilité d'obtenir de multiples chromatogrammes et électrophérogrammes au cours d'une seule séparation par électrophorèse continue Le

procédé le plus courant à cet effet est le balayage plu-

sieurs fois du capillaire lorsque la séparation est en cours Ceci permet à l'opérateur de suivre le déroulement d'une séparation, de déterminer les mobilités des solutés et les régions de crête en fonction de quelques mesures plutôt qu'une seule, et de sélectionner un chromatogramme et un électrophérogramme ayant la plus grande séparation de

crête avec le moindre élargissement.

Une difficulté présentée par le balayage est qu'il faut déplacer un détecteur mobile ou utiliser un capillaire mobile, et utiliser une corrélation précise entre les positions relatives du détecteur et du capillaire lorsque

les pics sont observés Une autre difficulté est l'utilisa-

tion nécessaire d'un capillaire formé de quartz qui est usiné et poli à la fois intérieurement et extérieurement afin que les variations de diamètre interne et d'épaisseur de paroi, qui pourraient provoquer des fluctuations de la référence, soient réduites au minimum Une troisième difficulté est la nécessité pour le capillaire, et le milieu placé à l'intérieur, d'être transparents à un faisceau de détection tel que de la lumière ultraviolette, sur toute la longueur du capillaire le long de laquelle le balayage est réalisé Dans de nombreux cas, des revêtements sont appliqués aux parois externes des capillaires afin que le capillaire soit plus souple et risque moins de se rompre De nombreux revêtements de ce type sont opaques à

la lumière ultraviolette et ne permettent pas un balayage.

L'utilisation de deux détecteurs montés à une distance fixe l'un de l'autre est décrite par Beckers J L. et al dans "Use of a Double- Detector System for the Measurement of Mobilities in Zone Electrophoresis", J. Chromatog, 452, 591-600, ( 1988) Un tel système est cependant loin d'être pleinement satisfaisant Le coût de l'appareillage d'un système à deux détecteurs comprend évidemment le coût de deux détecteurs qui est un élément essentiel du coût de l'ensemble du système En outre, deux

détecteurs ont rarement la même sensibilité, et les diffé-

rences de sensibilité provoquent des différences de surface

de crête pour un soluté particulier En outre, l'utilisa-

tion de deux détecteurs impose des restrictions sur le positionnement des détecteurs les uns par rapport aux autres, c'est-à-dire une limite au rapprochement des détecteurs à moins qu'ils n'utilisent des optiques à fibres. La présente invention concerne une solution apportée

à ces problèmes ainsi qu'à d'autres.

Un procédé a été mis au point grâce auquel des chromatogrammes et des électrophérogrammes représentant des étapes successives d'une séparation par chromatographie ou par électrophorèse dans un capillaire peuvent être obtenus sans balayage longitudinal du capillaire et sans qu'il soit

nécessaire d'utiliser plusieurs détecteurs Selon l'inven-

tion, les variations du coefficient d'absorption de la lumière en fonction du temps sont détectées à plusieurs emplacements espacés le long du capillaire, mais avec un seul détecteur Cette caractéristique est obtenue selon

l'un de deux procédés.

Dans le premier, une fenêtre de détection du capil-

laire est alignée sur le faisceau de détection d'un détec-

teur, la fenêtre faisant partie de plusieurs fenêtres de

détection placées à certains intervalles le long du capil-

laire Lorsque les pics de tous les solutés sont passés devant la fenêtre de détection et ont ainsi été détectés par le détecteur, le capillaire est déplacé vers l'arrière, en sens opposé au sens de migration des solutés, afin que la fenêtre suivante de détection soit alignée sur le faisceau du détecteur Ceci est répété un nombre suffisant de fois pour que toutes les fenêtres de détection aient été placées dans le faisceau du détecteur et que les pics de soluté passant dans le capillaire à l'emplacement de chaque

fenêtre aient été détectés.

Dans le second procédé, le capillaire contient

plusieurs fenêtres de détection placées à certains inter-

valles suivant sa longueur, comme dans le système décrit dans le paragraphe précédent Le capillaire forme une boucle entre ces fenêtres de détection cependant, les

fenêtres adjacentes de chaque paire de fenêtres de détec-

tion étant séparées par au moins une boucle Des boucles sont disposées afin que les fenêtres de détection se trouvent toutes suffisamment proches les unes des autres

pour se trouver sur le trajet d'un seul faisceau détecteur.

Les boucles peuvent toutes être disposées dans le même sens si bien que les solutés passent devant le faisceau dans le même sens à chaque fois, ou les boucles peuvent avoir des sens qui alternent, si bien que les solutés passent en face du faisceau en alternance dans un sens et dans l'autre d'une boucle à la suivante, ou les boucles peuvent être une combinaison de ces dispositions Dans tous les cas, la détection continue enregistre tous les pics passant par toutes les fenêtres de détection, et l'ordre de détection des pics est utilisé comme moyen d'identification de la fenêtre de détection par laquelle un pic particulier a été

détecté.

Quel que soit le procédé utilisé, les surfaces moyennes de pics pour chaque élément du mélange échantillon peuvent être obtenues par simple formation de la moyenne

des surfaces des pics correspondants des divers chromato-

grammes ou électrophérogrammes, et la mobilité de chaque

élément peut être déterminée avec un degré élevé de préci-

sion par tracé des distances de l'extrémité d'injection du capillaire à chaque fenêtre en fonction des temps auxquels

les pics sont détectés dans la fenêtre.

D'autres caractéristiques et avantages de l'inven-

tion ressortiront mieux de la description qui va suivre,

faite en référence aux dessins annexés sur lesquels: la figure 1 est un schéma d'un exemple d'ensemble d'électrophorèse selon la présente invention; la figure 2 est un schéma d'un second exemple d'ensemble d'électrophorèse selon l'invention; la figure 3 est un schéma d'un exemple d'ensemble de chromatographie selon l'invention; la figure 4 est une courbe relevée sur enregistreur à bande de papier obtenu au cours d'un essai expérimental mettant en oeuvre l'ensemble de la figure 1;

la figure 5 est une courbe relevée sur un enregis-

treur à bande de papier pendant un essai expérimental de mise en oeuvre de l'ensemble de la figure 2; et

la figure 6 est un graphique représentant la varia-

tion de la distance de migration en fonction du temps pour

quatre peptides tirés du relevé de la figure 5.

Les tubes capillaires destinés à être utilisés selon la présente invention peuvent être formés de tout matériau dans lequel l'électrophorèse ou la chromatographie peut être exécutée sans interférence par le matériau lui-même, et dans lequel des fenêtres de détection peuvent être incorporées, ou dans lequel de courts segments peuvent être

réalisés sous forme de fenêtres de détection, à des dis-

tances spécifiées le long du capillaire Les fenêtres de détection ont toute composition ou construction qui permet le passage d'un faisceau de détection et elles sont donc choisies ou adaptées en fonction de la nature du faisceau et de l'ensemble de détection utilisés, qui dépendent à leur tour de la nature des solutés qui sont séparés Les ensembles de détection mettant en oeuvre l'absorption de lumière ultraviolette sont les plus courants et sont particulièrement commodes pour l'électrophorèse dans un capillaire des mélanges biologiques, par exemple de petits peptides, protéines et acides nucléiques Les fenêtres de détection de ces ensembles sont donc transparentes à la

lumière ultraviolette.

Comme la transparence à la lumière ultraviolette de ces ensembles est nécessaire uniquement dans les fenêtres

de détection, l'invention peut être réalisée par utilisa-

tion de tubes capillaires formés d'autres matières que le quartz Les segments du tube capillaire compris entre les fenêtres de détection peuvent en fait être formés de tout

matériau qui est inerte et qui ne perturbe pas la sépara-

tion Ce matériau comprend par exemple le verre et d'autres matériaux contenant de la silice, des matières plastiques et des métaux tels que l'acier inoxydable Les capillaires

dont la construction est la plus facile et la moins coû-

teuse sont cependant ceux dans lesquels la totalité du capillaire est formée d'un même matériau Un exemple

particulièrement commode est la silice fondue.

Les capillaires de silice fondue sont en général fournis avec un revêtement d'un polyimide placé à la surface externe du capillaire afin que sa résistance à la rupture soit accrue Comme le revêtement de polyimide n'est pas transparent à la lumière ultraviolette, une fenêtre de détection peut être formée par enlèvement du revêtement afin qu'il reste une étroite bande de la surface exposée de silice fondue, suffisamment large pour permettre le passage d'une quantité suffisante du faisceau de détection pour que la lecture soit possible Dans un capillaire ayant un diamètre interne d'environ 0,1 mm ou moins, la bande peut avoir une largeur comprise entre environ 0,01 et 1,0 mm environ L'enlèvement du revêtement peut être réalisé par tout dispositif classique, un exemple étant l'oxydation par

une sonde chauffée, par exemple un fil sous tension élec-

trique Il n'est pas nécessaire de retirer les revêtements qui sont transparents à la lumière ultraviolette Un tube de silice fondue muni d'un tel revêtement est disponible auprès de Polymicro Technologies Inc, Phoenix, Arizona,

E.U A.

Lorsque des traitements de la surface de la paroi interne du capillaire sont souhaitables pour la suppression de l'adsorption et, dans le cas de l'électrophorèse de

l'électroendosmose, des agents de traitement qui ne per-

turbent pas le faisceau de détection peuvent être utilisés.

Un agent de traitement de ce type peut être choisi parmi divers matériaux connus des hommes du métier pour être

utilisé pour la suppression de l'adsorption et de l'élec-

troendosmose, et il est en général formé d'une monocouche d'un composé à faible masse moléculaire ou d'un polymère dont des exemples sont un polyacrylamide linéaire, le dextrane et la méthylcellulose L'agent de traitement peut être déposé par des procédés classiques bien connus dans la fabrication des capillaires L'utilisation d'un agent de traitement n'est cependant qu'éventuelle; l'invention

s'applique aussi à des capillaires qui n'ont pas de revête-

ment interne aussi bien qu'à ceux qui en ont.

Le nombre de fenêtres de détection utilisées dans un seul capillaire n'est pas primordial et peut beaucoup varier Le nombre est au moins égal à deux et, pour la plupart des applications, il ne dépasse pas six Des capillaires ayant trois à cinq fenêtres de détection sont préférables Dans certains cas, le nombre de fenêtres de détection est limité par la longueur du capillaire et par la nécessité d'un espacement suffisant des fenêtres pour que tous les solutés puissent passer dans une fenêtre avant d'atteindre la suivante, comme décrit plus en détail dans

la suite.

La disposition, le nombre et l'espacement des fenêtres de détection ne sont pas primordiaux et peuvent

beaucoup varier Les résultats interprétés le plus commodé-

ment et le plus facilement sont cependant obtenus lorsque les pics des solutés sont détectés sous forme de groupes

séparés qui ne se recouvrent pas, c'est-à-dire de chromato-

grammes ou d'électrophérogrammes, chaque groupe correspon-

dant à une seule fenêtre de détection De préférence, en conséquence, les fenêtres de détection sont suffisamment espacées pour qu'un relevé continu d'un détecteur indique

tous les chromatogrammes ou électrophérogrammes successive-

ment sans recouvrement Si un recouvrement se produit en réalité entre les deux ou trois derniers chromatogrammes ou électrophérogrammes, les pics et la séquence dans laquelle ils sont détectés peuvent encore être identifiés pourvu que les séquences de pics qui se recouvrent soient précédées par au moins une séquence et de préférence deux séquences de pics qui ne se recouvrent pas Les temps de retenue relatifs déterminés d'après ces séquences de pics qui ne se recouvrent pas peuvent alors être utilisés pour le tri des séquences ultérieures de pics et l'identification des pics

correspondants.

Les fenêtres de détection peuvent être disposées à

intervalles égaux ou à intervalles croissants successi-

vement, la sélection dépendant de la gamme de mobilités des solutés Dans le cas des mélanges de solutés dans lesquels le temps nécessaire pour que tous les solutés passent devant une fenêtre de détection est faible par rapport au temps nécessaire pour qu'un soluté donné migre d'une

fenêtre de détection à la suivante, les fenêtres de détec-

tion sont de préférence placées à intervalles égaux les unes des autres Dans le cas des mélanges de solutés dans lesquels l'étalement des pics augmente beaucoup lorsque les pics migrent d'une première extrémité du capillaire à l'autre, l'espacement des fenêtres de détection augmente de préférence dans le sens de migration afin que chaque

fenêtre successive permette le passage de largeur crois-

sante de l'étalement des pics avant que l'étalement des

pics n'atteigne la fenêtre suivante.

On peut réduire au minimum les fluctuations ou la dérive de la ligne de référence de l'enregistreur utilisé pour la détection des solutés passant à chaque fenêtre par réglage de la température des éléments de l'ensemble tels

que le capillaire (dans les régions des fenêtres de détec-

tion) et le détecteur L'opération est réalisée facilement

par utilisation de fluides de refroidissement qui cir-

culent, de ventilateurs, de doubles enveloppes ou de gaines chauffantes, ou d'autres mesures analogues qui sont bien connues des hommes du métier et qui sont utilisées avec des thermostats ou des dispositifs équivalents de réglage de la température Ceci évite de très petites variations des positions relatives du faisceau lumineux, des fenêtres de

détection et de la photodiode.

Les dimensions du capillaire, en longueur et en diamètre interne, ne sont pas primordiales et l'invention s'applique à une large gamme de dimensions de capillaires,

et notamment aux microcapillaires En général, les capil-

laires ont un diamètre interne compris entre environ 5 et

300 pim, une plage de 20 à 100 pim environ étant préférable.

La longueur du capillaire est en général comprise entre 100 et 3 000 mm environ, et de préférence entre 300 et 1 000 mm environ. Dans le cas des séparations par électrophorèse, la tension utilisée n'est pas primordiale dans le cas de l'invention et peut beaucoup varier Des exemples de tension sont compris entre environ 500 et 30 000 V et de préférence entre environ 1 000 et 10 000 V.

Le milieu de séparation n'est pas non plus primor-

dial selon l'invention, et il peut être formé d'un liquide, d'un gel ou de granulés (par exemple des perles), suivant

la nature de la séparation réalisée Le milieu de sépara-

tion peut être d'un type qui permet le passage d'un fais-

ceau de détection et il peut ainsi être continu au niveau des fenêtres de détection ainsi que dans les segments de capillaires compris entre les fenêtres de détection Dans une variante, le milieu de séparation peut être d'un type qui ne permet pas le passage du faisceau et il peut donc comporter des espaces au niveau des fenêtres de détection pour le passage du faisceau Ceci se produit le plus souvent dans le cas des séparations par chromatographie, surtout lorsque les granulés sont utilisés comme milieu de séparation Dans les séparations par électrophorèse, des solutions tampons liquides classiques sont utilisées très couramment, bien que la sélection optimale pour un essai

particulier dépende de la nature des solutés séparés.

En général, la séparation, qu'il s'agisse de la chromatographie ou de l'électrophorèse, peut être réalisée par mise en oeuvre des techniques classiques, avec les matériaux et procédures connus comme utiles ou adaptables aux séparations dans un capillaire Ceci s'étend aux procédés d'introduction de l'échantillon dans le capillaire avant la séparation, d'exécution de la séparation, de maintien du réglage de température, de l'exécution de la

détection en continu, et du traitement ou de l'interpréta-

tion des résultats.

Comme indiqué précédemment, la détection est de

préférence réalisée par absorption de lumière ultravio-

lette, mais tout type de détection en continu dans un tube capillaire peut cependant être utilisé L'absorption de la lumière est préférable pour des raisons de commodité et de simplicité, mais la longueur d'onde à laquelle l'absorption est mesurée peut varier sur une large plage La sélection de la longueur d'onde optimale dépend encore du coefficient

d'absorption des solutés par rapport au milieu de sépara-

tion Un appareillage classique de détection du type couramment utilisé dans les ensembles de chromatographie ou d'électrophorèse dans un capillaire peut être utilisé. La dimension du faisceau de détection (section du faisceau) par rapport au diamètre du milieu de séparation (c'est-à-dire le diamètre interne du capillaire) affecte dans de nombreux cas le degré de dérive observé sur la

ligne de référence des signaux détectés Lorsqu'un détec-

teur tel qu'une photodiode est utilisé, de petits change-

ments ou de petites variations du mode de position du capillaire par rapport à la photodiode ou au faisceau lumineux peuvent avoir un effet notable sur la sensibilité de la détection Cet effet peut être réduit au minimum ou

éliminé par réglage de la température à l'aide d'un thermo-

stat, puisque la photodiode, le capillaire et le faisceau lumineux peuvent changer de position lors d'un changement de température L'effet peut aussi être réduit au minimum ou éliminé par utilisation d'un faisceau lumineux plus grand que le diamètre interne du capillaire, c'est-à-dire ayant une dimension plus grande en direction transversale à

l'axe longitudinal du capillaire Dans des modes de réali-

sation préférés de l'invention cependant, la dimension transversale du faisceau de détection peut être comprise entre environ 1,1 et 3,0 fois le diamètre interne du capillaire et de préférence entre environ 1,3 et 1,8 fois

ce diamètre.

On considère maintenant les dessins sur lesquels les figures 1, 2 et 3 représentent des schémas de modes de réalisation précités, correspondant à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention Les dessins sont donnés

à titre purement illustratif de l'invention.

Sur la figure 1, un ensemble 11 d'électrophorèse est représenté avec un capillaire rectiligne 12 Les éléments de l'ensemble sont le capillaire 12, les réservoirs 13, 14 d'électrodes, les électrodes 15, 16, une source d'énergie il 17, une source de lumière ultraviolette 18, un détecteur à photodiode 19, un intégrateur 20 et un enregistreur 21 Le capillaire 12, dans cet exemple, est formé de silice fondue, et la surface externe du capillaire est revêtue d'un polyimide 22 représenté en hachures sur le dessin Le revêtement de polyimide est discontinu et laisse quatre

courts segments non revêtus 23, 24, 25, 26 qui sont trans-

parents à la lumière ultraviolette et Jouent le rôle de fenêtres de détection La migration des solutés se produit

dans le sens de la flèche 27 Dans la disposition représen-

tée sur le dessin, les éléments de l'ensemble sont disposés afin qu'ils permettent la détection des solutés au niveau de la première fenêtre 23 de détection Lorsque tous les solutés sont passés devant cette fenêtre, le capillaire 12 se déplace dans le sens de la flèche 28 par rapport à la source de lumière ultraviolette 18 et au détecteur 19 à photodiode jusqu'à ce que la seconde fenêtre de détection

24 soit alignée sur la source lumineuse et la photodiode.

Lorsque tous les pics passant devant la seconde fenêtre de détection ont été enregistrés, le capillaire 12 est déplacé à nouveau dans le même sens afin que la troisième et la quatrième fenêtre soient placées successivement dans l'alignement de la source lumineuse et du détecteur Le déplacement du capillaire peut être réalisé manuellement ou par un mécanisme convenable d'entraînement de construction

classique, synchronisé de manière préréglée ou en coordina-

tion avec des signaux provenant de l'enregistreur et

indiquant qu'un nombre prédéterminé de pics a été détecté.

La figure 2 représente un ensemble 41 d'électropho-

rèse ayant un capillaire 42 en boucle qui est maintenu fixe Le capillaire est formé de silice fondue comme indiqué précédemment, la surface externe étant revêtue d'un

polyimide sauf sur trois fenêtres de détection 43, 44, 45.

Les trois fenêtres sont cependant alignées sur la source 46 de lumière ultraviolette et le détecteur 47 à photodiodes

si bien qu'aucun déplacement de l'un quelconque des élé-

ments de l'ensemble n'est nécessaire pour la lecture des trois fenêtres Les segments de tube qui comportent les fenêtres peuvent être regroupés en un faisceau ou dans un plan, et la disposition plane peut être transversale au

faisceau de détection si bien que le faisceau passe simul-

tanément dans toutes les fenêtres, ou ils peuvent être parallèles au faisceau de détection afin que le faisceau passe en série dans les fenêtres Toutes les parties

restantes de l'ensemble sont identiques aux parties res-

tantes de l'ensemble de la figure 1 Le sens de migration des solutés pendant l'électrophorèse est indiqué par la

flèche 48.

Un réglage de température destiné à éviter une dérive de la ligne de référence et des fluctuations est réalisé à l'aide d'un ensemble comprenant des thermostats et des unités-de réglage de température Ces éléments sont

indiqués par les traits interrompus 49 sur la figure 2.

L'invention présente aussi l'avantage de permettre des séparations par électrophorèse d'échantillons dans lesquels plusieurs éléments de l'échantillon migrent très

lentement par rapport aux autres En pratique, les sépara-

tions de ce type nécessitent en général deux expériences, une dans des conditions qui favorisent une faible vitesse de migration convenant aux éléments les plus mobiles, et l'autre dans des conditions qui favorisent une grande vitesse de migration convenant aux éléments les moins mobiles Cependant, l'application de la présente invention permet l'utilisation de deux fenêtres de détection, l'une proche de l'extrémité de l'organe d'injection du capillaire

et l'autre relativement éloignée de cette extrémité d'in-

jection Dans cette disposition, le temps nécessaire à la

détection de tous les éléments constituants est considéra-

blement réduit, puisque la détection des éléments qui

migrent plus rapidement n'est enregistrée que lorsque ceux-

ci passent par la fenêtre de détection la plus éloignée de l'extrémité d'injection alors que la détection des éléments migrant plus lentement est enregistrée lors de leur passage à la fenêtre de détection la plus proche de l'extrémité d'injection Dans ce mode de réalisation de l'invention, il n'est pas nécessaire qu'une fenêtre de détection quelconque

enregistre la totalité d'un électrophérogramme.

La figure 3 représente un ensemble de chromatogra-

phie plutôt qu'un ensemble d'électrophorèse Cet ensemble a une configuration identique à celle de l'ensemble de la figure 2, mais le capillaire 51 de cet ensemble est rempli d'un milieu de séparation chromatographique, par exemple un gel ou un lit de garnissage L'ensemble représenté met en oeuvre un véhicule liquide qui est pompé dans le capillaire par une pompe classique 52 de chromatographie L'ensemble a par ailleurs un fonctionnement et une mise en oeuvre analogues à ceux qu'on a décrits précédemment en référence à la figure 2 Un ensemble de chromatographie qui est une contrepartie de la configuration de la figure 1 peut aussi être réalisé et peut fonctionner de manière analogue Dans tous les cas, le type particulier de chromatographie peut beaucoup varier Des exemples sont la chromatographie d'adsorption, la chromatographie avec filtration sur gel, la chromatographie par échange d'ions et la chromatographie

de séparation.

Les exemples qui suivent sont donnés à titre d'il-

lustration et ne sont nullement destinés à limiter ni

restreindre l'invention d'une manière quelconque.

EXEMPLE 1

Un tronçon rectiligne de tube de silice fondue de 540 mm de longueur ayant un diamètre interne de 0,075 mm et dont la surface externe était revêtue d'un polyimide non

transparent aux ultraviolets a été utilisé comme capil-

laire Les tronçons de revêtement de polyimide à quatre emplacements le long du capillaire ont été supprimés par

combustion avec un fil de tungstène chauffé électriquement.

Ces fenêtres transparentes aux rayons ultraviolets formées dans le capillaire se trouvaient à 12 cm, 17 cm, 27 cm et 37 cm respectivement de l'extrémité du capillaire par laquelle l'échantillon a été introduit Chacune des fenêtres avait une longueur d'environ 2 mm L'intérieur du

tube, sur toute la longueur, y compris les fenêtres trans-

parentes aux ultraviolets, a alors été revêtu d'une mono-

couche d'un polyacrylamide linéaire afin que l'adsorption etl'électroendosmose soient éliminées L'efficacité de ce revêtement était vérifiée par observation du fait qu'aucun changement des vitesses de migration ne s'est produit pendant quatre semaines, temps pendant lequel le capillaire

a été conservé à un p H égal à 11.

Le capillaire de silice fondue a été monté dans une

gorge en V afin que le capillaire puisse reposer en posi-

tion fixe par rapport au faisceau d'un détecteur par

absorption de lumière, mais il a pu être déplacé longitudi-

nalement La gorge en V a été refroidie par un courant d'eau Une fente (ouverture transversale) formée dans la gorge en V a été alignée sur le faisceau détecteur, la fente ayant une hauteur approximativement égale au diamètre externe du capillaire et une largeur de 0,15 mm (dans la direction longitudinale du capillaire, transversalement au trajet du faisceau détecteur) La détection a été réalisée avec un appareil de contrôle à longueur d'onde variable "HPLC 2141 " de LKB/Pharmacia (Uppsala, Suède), modifié afin qu'il permette une détection des solutés sur le tube à une longueur d'onde de 260 nm L'électrophérogramme a été enregistré avec un enregistreur "REC 61 Servograph" de

Radiometer, Copenhague, Danemark.

Une séparation par électrophorèse d'ADN X a été réalisée dans le capillaire Le milieu de séparation placé dans le capillaire était un tampon TBE ( 0,009 M de tris,

0,09 M d'acide borique et 0,002 M d'acide éthylènediamine-

tétracétique), ayant un p H égal à 8,2 L'ADN X a été

injecté dans le capillaire par un dispositif d'électropho-

rèse à 2 000 V pendant 30 S et, après injection, il a subi la même tension afin que la séparation par électrophorèse soit réalisée Ces conditions de fonctionnement et la disposition des fenêtres transparentes aux ultraviolets ont été choisies sur la base d'une détermination antérieure selon laquelle tous les pics représentant l'ADN X de l'échantillon passaient par une fenêtre avant d'atteindre

la suivante.

L'enregistrement de la séparation a commencé à la

première fenêtre transparente aux ultraviolets du capil-

laire, alignée sur l'ouverture de la gorge en V, la fenêtre

étant placée à 12 cm de l'extrémité d'injection du capil-

laire Lorsque tous les pics sont passés en face du détec-

teur, le capillaire a été déplacé vers l'arrière dans la gorge en V afin que la seconde fenêtre transparente aux ultraviolets soit alignée sur l'ouverture de la gorge en V. L'opération a été répétée jusqu'à ce que tous les pics

passant au niveau de chacune des quatre fenêtres transpa-

rentes aux ultraviolets aient été détectées, intégrées et enregistrées. La figure 4 représente des tronçons de courbes obtenues sur l'enregistreur, montrant que l'ordre et l'identité des pics est plus complexe que ne l'indique un

seul électrophérogramme.

EXEMPLE 2

Un tronçon de tube de silice fondue de 580 mm de longueur et de 0, 05 mm de diamètre interne a été utilisé comme capillaire, sa surface externe étant revêtue d'un polyimide non transparent aux ultraviolets Des tronçons du revêtement de polyimide ont été retirés par combustion de la manière décrite dans l'exemple 1, et ont formé des fenêtres transparentes aux ultraviolets à des emplacements se trouvant à 4,0 cm, 14,0 cm et 44,0 cm de l'extrémité d'injection, chaque fenêtre ayant une longueur d'environ 2 mm, l'intérieur du tube sur toute la longueur comprenant des fenêtres transparentes aux ultraviolets, étant revêtu comme dans l'exemple 1 d'une monocouche d'un polyacrylamide linéaire. Deux boucles ont été formées dans le capillaire, l'une entre la première et la seconde fenêtre transparente aux ultraviolets et une autre entre la seconde et la troisième, afin que les parties de capillaire contenant les fenêtres soient placées parallèlement dans une gorge en V dans la disposition représentée sur la figure 2, les fenêtres étant placées côte à côte Les boucles ont été refroidies par le ventilateur et la gorge en V par une

circulation d'eau La gorge en V contient une fente ana-

logue à celle de l'exemple 1, mais sa hauteur était légère- ment supérieure à la somme des diamètres externes des trois segments du capillaire La largeur de la fente était de

0,15 mm comme précédemment.

On a utilisé le même détecteur, avec un intégrateur "Spectra Physics" SP 4270, et la détection a été réalisée à nm Le faisceau détecteur est passé simultanément dans

les trois fenêtres transparentes aux ultraviolets.

La séparation par électrophorèse a été réalisée avec le mélange classique suivant de peptides obtenu auprès de Bio-Rad Laboratories Inc Hercules, Californie, E U A. (dans l'ordre d'élution) 1 Bradykinine 2 Angiotensine 3 Hormone de stimulation d'a-mélanocyte 4 Hormone de libération de thyrotropine Hormone de libération de l'hormone de lutéinisa- tion 6 l 2-5 lleucine encéphaline 7 Bombesine 8 Méthionine encéphaline 9 Oxytocine Le milieu de séparation utilisé dans le capillaire était un tampon de phosphate de sodium 0,1 M de p H= 2,5 L'injection de l'échantillon a été réalisée par électrophorèse à 8 000 V pendant 10 s, et la tension mise en oeuvre était aussi de 8 000 V. La courbe formée sur l'enregistreur est représentée sur la figure 5, et trois répétitions de la séquence d'élution sont identifiées La première répétition est désignée par la référence "a" et représente la réponse du détecteur au soluté passant par la fenêtre se trouvant à l'emplacement de 4,0 cm, la seconde répétition est désignée par la référence "b" et représente la fenêtre qui est à 14 cm et la troisième répétition est désignée par la référence "c" et représente la fenêtre qui se trouve à

l'emplacement de 44,0 cm Le numéro de l'élément consti-

tuant est placé au-dessus de chaque pic dans la troisième répétition Dans la séquence d'élution de chacune des répétitions, la bradykinine, l'hormone de libération d'hormone de lutéinisation, la l 2-5 lleucine encéphaline et l'oxytocine sont identifiés sous forme des pics 1, 5, 6 et 9 respectivement, d'après le comportement d'élution connu

du mélange de référence.

Les surfaces intégrées des pics sont indiquées dans le tableau 1 qui suit Les surfaces des pics ont été normalisées par rapport à la bradykinine afin que les

variations d'intensité lumineuse dans la section du fais-

ceau détecteur ultraviolet et d'autres facteurs tels que les variations du diamètre du capillaire d'une fenêtre à la

suivante, soient compensés.

TABLEAU 1

Surfaces relatives des pics à différents points de détection Peptides Hormone de l 2-5 l

Emplacement libération leucine-

de d'hormone de encépha-

fenêtre Bradykinine lutéinisation line Oxytocine 4,0 cm 1,00 1,30 0,91 0,90 14,0 cm 1,00 1,28 0,94 0,91 44,0 cm 1,00 1,33 0, 94 0,90 Sur la figure 6, la distance de migration exprimée en centimètres (c'est-à-dire la distance de la fenêtre à l'extrémité d'injection du capillaire) est indiquée en fonction du temps, en secondes, auquel chaque pic apparaît au niveau du détecteur Les cercles noirs représentent la bradykinine, les croix l'hormone de libération de l'hormone de lutéinisation, les cercles clairs représentant la

leucine encéphaline et les triangles représentent l'oxyto-

cine Les points se trouvent sur des droites indiquant que les valeurs des mobilités (c'est-à-dire la vitesse de migration exprimée en cm/s divisée par l'intensité du champ exprimé en V/cm) sont facilement déterminées avec une grande précision Ces valeurs sont données dans le

tableau 2.

TABLEAU 2

Mobilités de quatre peptides Mobilité Peptide x 104 (cm 2/s V) Bradykinine 1,61 Hormone de libération d'hormone de lutéinisation 1,17 l 2-5 lleucine encéphaline 0,96 Oxytocine 0,69 Les exemples précédents ne sont donnés qu'à titre illustratif Les hommes du métier peuvent noter que les conditions de fonctionnement, les matières utilisées, les étapes de traitement et les autres paramètres de l'ensemble décrit précédemment peuvent être modifiés ou remplacés de

diverses manières sans sortir du cadre de l'invention.

Claims (7)

REVEND ICAT IONS

1 Procédé de détermination de valeurs représenta-

tives des mobilités et des quantités relatives de solutés subissant une séparation par électrophorèse dans un milieu de séparation placé dans un capillaire, caractérisé en ce qu'il comprend (a) à l'aide d'un seul détecteur ( 19), la détection de variations du coefficient d'absorption de lumière par le milieu de séparation en fonction du temps à plusieurs points de détection ( 23 à 26) espacés le long du capillaire,

(b) à chaque point de détection ( 23 à 26), l'identi-

fication de pics de variation du coefficient d'absorption de la lumière ainsi détectés, une séquence d'apparition des pics étant pratiquement la même à tous les points de détection, (c) pour chaque pic de la séquence, la formation de la moyenne, pour tous les points de détection, de la distance parcourue par le pic au point de détection divisée par le temps nécessaire pour que le pic atteigne ce point de détection, et (d) pour chaque pic de la séquence, la formation de la moyenne parmi tous les points de détection, des surfaces

délimitées par les pics à la même position de la séquence.

2 Procédé d'obtention de plusieurs diagrammes représentant des pics de solutés correspondant à des étapes successives d'une séparation continue de solutés par un procédé de séparation choisi dans le groupe comprenant les séparations par chromatographie et par électrophorèse, exécutées dans un milieu de séparation retenu dans un capillaire, lorsque les solutés migrent dans une direction de migration à l'intérieur du capillaire, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend (a) l'alignement d'un premier emplacement ( 23) dans

le capillaire ( 12) à l'aide d'un détecteur ( 19) du coeffi-

cient d'absorption de lumière, et l'obtention d'un premier diagramme des pics de solutés par détection des variations du coefficient d'absorption de lumière par le milieu de séparation en fonction du temps au premier emplacement, (b) le déplacement du capillaire ( 12) par rapport au détecteur ( 19) afin que celui-ci soit aligné sur un second emplacement ( 24) placé plus loin le long du capillaire dans le sens de migration, et l'obtention d'un second diagramme

de pics de solutés par détection des variations du coeffi-

cient d'absorption de lumière en fonction du temps au second emplacement, et

(c) la répétition de l'étape (b) à un nombre suffi-

sant d'emplacements ( 25, 26) pour que les diagrammes des

pics de solutés soient obtenus.

3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'opération de séparation est une électrophorèse,

les diagrammes des pics des solutés sont des électrophéro-

grammes, et le procédé comporte en outre

(d) pour chacun des électrophérogrammes, l'identifi-

cation des pics et d'une séquence dans laquelle appa-

raissent les pics, cette séquence étant pratiquement la même dans tous les électrophérogrammes, (e) pour chaque pic de la séquence, la formation de la moyenne, pour tous les électrophérogrammes, de la distance parcourue par le pic à l'emplacement auquel l'électrophérogramme est obtenu divisée par le temps nécessaire pour que le pic atteigne cet emplacement, et (f) pour chaque pic de la séquence, la formation de la moyenne, pour tous les électrophérogrammes, des surfaces

délimitées par les pics à la même position de la séquence.

4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le capillaire ( 12) est un tronçon de silice fondue dont la surface externe est revêtue d'un polyimide de

manière pratiquement continue, mis à part des discontinui-

tés se trouvant à chacun des emplacements alignés sur le détecteur du coefficient d'absorption de lumière dans les

étapes (a) et (b).

Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la surface interne du capillaire ( 12) est revêtue d'une substance choisie dans le groupe qui comprend un

polyacrylamide linéaire, le dextrane et la méthylcellulose.

6 Procédé d'obtention de plusieurs diagrammes de pics de solutés représentant les étapes successives d'une séparation continue de solutés par un processus de sépara- tion choisi dans le groupe qui comprend les processus de chromatographie et d'électrophorèse, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend:

(a) l'application aux solutés de conditions favori-

sant le processus de séparation dans un milieu de sépara-

tion retenu dans un capillaire ( 42), le capillaire formant au moins une boucle afin que plusieurs emplacements ( 43 à ) de la longueur du capillaire soient placés en des points de détection suffisamment proches les uns des autres pour que les points de détection interceptent un même faisceau de détection d'un détecteur ( 47) d'absorption de lumière, chaque paire de points de détection étant séparée par au moins une boucle du capillaire, et (b) la détection des variations de l'absorption de

lumière du faisceau de détection par le milieu de sépara-

tion en fonction du temps, dues à la migration des solutés dans le milieu de séparation en face des points de détection. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le procédé de séparation est une électrophorèse, les

diagrammes des pics des solutés sont des électrophéro-

grammes, et le procédé comporte en outre: (c) l'identification des pics dans les variations

ainsi détectées, et les regroupements des pics en électro-

phérogrammes, correspondant chacun à un point de détection, (d) l'identification d'une séquence dans laquelle apparaissent les pics dans chacun des électrophérogrammes, la séquence étant pratiquement la même dans tous les électrophérogrammes, (e) pour chaque pic de la séquence, la formation de la moyenne, parmi tous les électrophérogrammes, de la distance parcourue par le pic jusqu'au point de détection auquel l'électrophérogramme est obtenu, divisée par le temps nécessaire pour que le pic atteigne le point de détection, et (f) pour chaque pic de la séquence, la formation de la moyenne parmi tous les électrophérogrammes, des surfaces délimitées par les pics ayant la même position dans la séquence.

8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le capillaire ( 42) est un tronçon de silice fondue dont la surface externe est revêtue d'un polyimide de

manière pratiquement continue, mis à part des disconti-

nuités à chacun des points de détection.

9 Procédé selon la revendication 8, dans lequel la surface interne du capillaire ( 42) est revêtue d'une

substance choisie dans le groupe qui comprend un polyacryl-

amide linéaire, le dextrane et la méthylcellulose.