DE3239863A1

DE3239863A1 - Verfahren zur herstellung von subkultivierbaren lymphokin-bildenden human-t-zellenhybridomas

Info

Publication number: DE3239863A1
Application number: DE19823239863
Authority: DE
Inventors: Makoto Fuchu Tokyo Asada; Masahiro Machida Tokyo Higuchi; Yoshiro Funabashi Chiba Kobayashi; Toshiaki Tokyo Osawa
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1981-10-28
Filing date: 1982-10-27
Publication date: 1983-05-05
Also published as: JPS5872520A; FR2515208B1; GB2108528B; DE3239863C2; FR2515208A1; JPS6011889B2; GB2108528A; CA1202917A

Description

HOFFMAN2SP - 3EITIJ3 '& PARTNER 3 23 9 863

PAT K N TAN WALT K

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . Dl PL.-I NG. W. EITLE · DR. R ER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEU N

DIPL.-ING. K. FOCHSLE . DR. RER. NAT. D. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 . D-8000 MDNCMEN 81 . TELEFON (08?) 911087 .' TELEX 05-29619 (PATHE)

_ Cf- _

Verfahren zur Herstellung von subkultivierbaren Lymphokin-bildenden Human-T-Zellenhybridomas

Die Erfindung betrifft subkultivierbare Lymphokin-bilden-Human-T-Zellenhybridomas und ein Verfahren zu deren Herstellung. Sie betrifft insbesondere subkultivierbare Lymphokin-bildende Human-T-Zellenhybridoinas, die man durch ZeIlfusion von Proteinsyntheseinhibitor- und/oder einem RNA-Syntheseinhibitor behandelten humanen akuten Leukämiezellen und Mitogen- oder Äntigen-aktivierten Human-T-Zellen in Gegenwart eines Fusionsbeschleunigers erhält. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Das Phänomen der Zellfusion wurde von Y. Okada unter Verwendung von Sendai-Virus (HVJ) (Y. Okada, Biken J., 1:103 .(1858)) entdeckt. Seit der Entdeckung der Sendai Virusvermittelten Zellfusion wird diese Methode in großem Umfang auf dem Gebiet der somatischen Zellgenetik verwendet.

1975 gelang es Kohler und Milstein die Zeilfusionstechnik auf dem Gebiet der Immunologie anzuwenden. Es wurde von G. Kohler und C. Milstein in iqature,, 256: S. 495 (1975) zum ersten Male berichtet,, daß die Fusion von Milzzellen, die man aus mit HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin)-empfindlichen Mäusemyelomzellen immunisierten Mäusen erhalten hatte, die Bildung von Hybridomas, die in der Lage

sind, permanent einen monoklonalen Antigen-spezifischen Antikörper zu bilden, ergab.

Lymphocyten, die in Human- und Tierimmunsystemen enthalten sind, werden grob in Zellen von Thymus (T-Zellen) und in Zellen aus Knochenmark (B-Zellen) eingeteilt.

B-Zellen sind Antikörper-produzierende Zellen. Die von G. Kohler et al. berichtete Zellfusion fand zwischen von Mäusen stammenden B-Zellen und HAT-sensitiven Mäusemyelomzellen statt. Andererseits werden T-Zellen durch Differenzierung und Reifen von Starnmzellen aus dem Knochenmark in Thymus gebildet. Weiterhin zirkulieren T-Zellen im Blutstrom durch die peripheren Organe wie Lymphknoten ! 15 und Milz.

! T-Zellen spielen eine bedeutende Rolle bei der überwachung

des Immunverhaltens eines lebenden Körpers. Es ist bekannt,

daß man die Immunverhaltens-kontrollierende "Funktion von T-ZeI-len durch einen löslichen Mediator, den man im allgemeinen als Lymphokin bezeichnet, und der von den T-Zellen abgegeben wird, beschleunigen kann (H. G. Kunkel und F. J. Dixon, Advances in Immunology, 29: S, 56 (1980), Academic Press),

25

Es sind verschiedene Versuche bisher unternommen worden, verschiedene Krankheiten wie Krebs, Allergie und Infektionskrankheiten durch Kontrolle des Immunverhaltens eines lebenden Körpers zu heilen. Lymphokin, das spezifisch für verschiedene Immunzellen ist, kann als ein wirksameres

immunotherapeutisches Mittel verwendet werden und man erwartet, daß es in großem Maße in der Medizin als klini--

sches Diagnostikum verwendet wird (Bernstein, I.D., D.E. Thor, B. Zbar und H.J. Rapps Science 172 729 (1971) und Piessens, W.F. und W.H. Churchill; J. Immunol. 114 293 (1975)). Deshalb ist Lymphokin eine medizinisch sehr wichtige Substanz.

In Übereinstimmung mit üblichen Methoden ist es jedoch unmöglich, große Mengen an Lymphokin herzustellen, und darüber hinaus war die Reinheit des in üblicher Weise hergestellten Lymphokin in der Vergangenheit nur gering. Infolgedessen ist die Anwendbarkeit von Lymphokin auf dem medizinischen Gebiet sehr zurückgeblieben.

Lymphokine sind Nicht-Äntlkörper-Proteinfaktorgruppen, die von den Lymphozyten z. B. aufgrund eines Antigenspezifischen Stimulus oder eines Mitogen-Stimulus prO'-duziert werden. Weiterhin werden Lymphokine hauptsächlich von den T-Zellen gebildet. Typische Lymphokine und deren Wirkung werden nachfolgend gezeigt; 20

1. Lymphokine, die auf Phagozyten wirken

(1) Migrationsinhibierender Faktor (MIF)

Wirkung: verhindert die Wanderung von Phagozyten

in vitro

(2) Phagozyt-aktivierende Faktoren (MAF)

Wirkung: stimuliert Phagozytosls,, die bakterizid de Wirkung etc. von Phagozyten

(3) Monozyt-Phagozyt-chemotaktischer Faktor (MCF) Wirkungs verursacht Chemotaxis von Monozytphagozyten

2. Lymphokine, die auf polymorphonukleare Leukozyten wirken

(1) Leukozyten-Migration-inhibierender Faktor (LIF) Wirkung: verhindert die Migration von polymorphonuklearen Leukozyten in vitro

<2) Chemotaktischer Faktor

Wirkung: verursacht Chemotaxis von neutrophilen, eosinophilen und basophilen Leukozyten

3. Lymphokine, die auf Lymphozyten wirken

(1) Interleukin II (IL-II)

Wirkung: stimuliert die Teilung und Proliferation von T-Zellen, die durch ein Antigen oder Mitogen aktiviert sind.

4. Lymphokine, die auf andere Zellen wirken

(1) Lymphoto xin (LT)

Wirkung: schädigt und schält L-Zellen und HeLa-Zellen in vitro
25

(2) ^T-Interferon (IFN-^)

Wirkung: greift in die Viruspathogenizitat ein

(3) Kolonie-stimulierender Faktor (CSF)

Wirkung: wirkt auf Knochenmarklymphozytvorläuferzellen (GFU-C), beschleunigt deren Differenzierung und Proliferation zu Granulozyten oder Phagozyten

— Q ~-

Die Aktivität der vorerwähnten Lymphokine wird in vitro gemessen. Es wurde jedoch berichtet, daß es Lymphokine gibt, deren Aktivität, wie sie in vitro gezeigt wird, der in vivo gezeigten Aktivität entspricht. Beispielsweise inhibieren MIF's wahrscheinlich die Migration von Phagozyten (Takeo Kuroyanagi et al.: "Lymphokine" Shin Meneki Kagaku Sosho, Band 5_r. Seite 33, Igakushoin Co., Ltd„_r Tokyo (1979))„

Weiterhin wird ein teleangiektatisches ödem, das durch einen chemischen Mediator auf dem Gebiet von z„ B. der Tufaerkulinreaktion verursacht wird, unter Ausbildung einer großen Akkumulation von Phagozyten beobachtet. Dies liegt

daran, daß die Phagozyten, die als Ergebnis von MCF₇ das sich, von sensibxlisierten T-Zellen ableitet, wandern und sammeln, weiter durch MIF fixiert werden. Dies zeigt den Zusammenhang zwischen MCF und MIF bei der immunologischen Abwehr eines lebenden Körpers und erlaubt eine wirksame

Behandlung von Fremdsubstanzen durch wirksame Akkumulation und Aktivierung von Phagozyten.

Lymphokine,, von denen man erwartet, daß sie in Zukunft in der Medizin Verwendung finden, sind MAF, Lymphotoxin, Interleukin II, IFN-tf", und CSF sowie auch MCF und MIF.

Typische Methoden zur Herstellung von Lymphokinen sind: (1) ein Verfahren zum Kultivieren von peripheren Blutlympho· zyten, die mit einem Antigen sensibilisiert worden sind, zusammen mit dem Antigen (D. J₀ Cameron und W.H. Churchill, J. Clin. Invest. 63, S. 977 (1979)); (2) ein Verfahren zum Kultivieren von peripheren Blutlymphozyten oder Milzzellen zusammen mit einem Mitogen (Weiser, W.Y., Greineder, D.K., Remold, H.G. et als J„ Immunol. 126, S. 1958 (1981)

und (3) eine Methode zur Bildung eines Antigen-spezifischen T-Zellklons unter Verwendung des T-Zellwachstumsfaktors (IL-II) und Kultivierung des Klons (J_k A. Green, S. R. Cooperband und S. Kibrick: Science 164, S. 1415 (1969). 5

Die Methoden (1) und (2) benötigen eine große Blutmenge und ermöglichen es nur, begrenzte Mengen an Lymphokin zu gewinnen. Deshalb ist es schwierig, große Mengen an reinem Lymphokin nach den Methoden (1) und (2) herzustellen. Nach der Methode (3) kann man spezifische Lymphokine in Gegenwart von IL-II herstellen. Methode (3) hat jedoch den Nachteil, daß die Produktion von Lymphokinen aus T-Zellen schlecht ist, und daß es schwierig und teuer ist, Human-IL-II zu erhalten.

Die vorerwähnten Probleme treten ein, wenn man die üblichen Methoden anwendet, weil Lymphokin-bildende T-Zellen nicht subkultiviert werden können und deren Wachstum nur schlecht ist, selbst wenn man sie in Gegenwart eines Wachstumsfaktors, wie IL-II, kultiviert. Daher ist es z.Z. sehr schwierig, ausreichende Mengen an Lymphokin für den klinischen Gebrauch zu produzieren.

Als Mittel zum Lösen der vorerwähnten Probleme unter Ver-Wendung der Zellhybridisierungstechnik hat man bereits T-Zellenhybridomas für Mäuse verwendet (M. Tanuguchi, T. Saito und T. Tada: Nature 278, S. 555-558 (1979)). Daher ist es jetzt möglich, die durch diese Zellen gebildeten Lymphokine zu analysieren. Die von Maus-T-Zellen-Hybridomas gebildeten Lymphokine können jedoch nicht für klinische Zwekke beim Menschen verwendet werden. Aus Gründen der Humanimmunologie und der Notwendigkeit einer klinischen Anwendung ist es wünschenswert, Lymphokin-bildende Human-T-Zel-

len-Hybridomas, die subkultivierbar sind, zur Verfügung zu haben.

Man kann vernünftigerweise annehmen, daß die gleiche Methode_r die man für die Mäuse-T-Zellen-Fusion verwendet, auch für die Fusion von Human-T-Zellen angewendet werden kann. Tatsächlich gibt es eine Methode, bei der man Lymphokinbildende T-Zellen (nicht subkultivierbar) und HAT {Hypoxanthin-Aminopfcerin-Thymidin)-empfindliche T-Tumorzellen (subkulfcivierbar) in Gegenwart eines Fusionsbeschleunigers fusionierte» Anschließend wurden nur solche Zellen, die auf einem HAT-Medium wachsen konnten, isoliert und geklont, wobei man die gewünschten Lymphokin-bildenden T-ZeIlen-Hybridoxnas erhielt (s„ G. Catherine et al=, Nature, 292;

S. 842 (1981)).

Es bedarf jedoch eines sehr komplizierten und schwierigen Verfahrens, um HAT-Sensibilität gegenüber Human-T-Tumorzellen zu erzielen.
20

Deshalb ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen zur Herstellung von Human-T-Zellhybridomas,. die subkultivierbar sind und Lymphokine bilden.

Gründliche Untersuchungen für die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von subkultivierbaren Lymphokinbildenden Human-T-Zellen-Hybridomas haben nun zu dem Ergebnis geführt, daß solche Human-T-Zellen-Hybridomas erhältlich sind durch die Zellfusion eines Proteinsyntheseinhibitors oder einer Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors und einer RNA-Syntheseiähibitor-behandelten human-akuten Leukämiezelle mit Mitogen- oder Äntigen-aktivierten Human~T-Zellen in Gegenwart eines Fusionsbeschleunigers -

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines subkultivierbaren Lymphokin-bildenden Human-T-Zellen-Hybridoms und ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine humane akute Leukämiezelle mit einem Proteinsyntheseinhibitor oder eine Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors und einen RNA-Syntheseinhibitor behandelt und dabei unabhängig eine Human-T-Zelle mit einem Mitogen oder einem Antigen aktiviert und die so gebildeten humanen akuten Leukämiezellen mit den so aktivierten humanen T-Zellen in Gegenwart eines Fusionsbeschleunigers fusioniert und anschließend das so gebildete Hybridom isoliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt allgemein die Stufen (A) , (B) , (C) , (D) und (E) .
15

Stufe A

Lymphozyten, die von humanem peripheren Blut abgetrennt waren und die Milz oder Thymus, die aseptisch operativ exzisiert worden waren, werden mit einem Mitogen oder Antigen aktiviert. Anschließend wird das an die Zellen gebundene Mitogen oder Antigen entfernt, so daß ein möglichst niedriges Niveau an Mitogen oder Antigen vorliegt.

Jedes Antigen oder Mitogen kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange es eine Substanz ist, die in der Lage ist, die Transformation von Human-T-Zellen zu induzieren, und es wird deshalb in geeigneter Weise je nach dem Typ des gewünschten Lymphokins ausgewählt.

Beispiele für solche Mitogene schließen Phytohämagglutinin-P (PHA-P) und Concanavalin A (Con A) ein. Beispiele

für geeignete Antigene schließen PPD (gereinigtes Proteinderivat, z. B. gereinigtes Tuberculinprotein, bakterielles Toxoid, virale Antigene und SK-KD (Streptokinase-Streptodornase) ein.

Stufe B

Humane akute Leukämiezellen werden mit einem Proteinsyntheseinhibitor oder einer Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors und einem RNA-Syntheseinhibitor behandelt. Anschließend wird der in dem Kulturmedium enthaltene Inhibitor durch Zentrifugieren entfernt«

Humane akute Leukämiezellen, die bei der vorliegenden Srfindung verwendet werden können, sind beispielsweise T-Tumorzellen wie CEM (ATCC Nr. CCL-119)., TALL (The Pharmaceutical Department of Tokyo University, Tokyo, Japan) und MOLT-4 (The Pharmaceutical Department of Tokyo, Japan).

-dft

Als Proteinsyntheseinhibitoren können bekannten Proteinsyntheseinhibitoren für eukaryotische Zellen, die die Proteinsynthese irreversibel inhibieren, verwendet werden. Emetin*H€:l raid · Pactamycin sind -bei der vorliegenden Erfindung bevorzugte Proteininhibitoren. Die Proteinsyntheseinhibitoren können alleine oder in Kombination mit RNA-Syntheseinhibitoren verwendet werden. Beispiele für solche RNA-Syntheseinhibitoren sind OC-Amanitin, Adriamycin und dgl, Ein bevorzugter RNA-Syntheseinhibitor ist bei der vorliegenden Erfindung Actinomycin D".'""■

Die Behandlung von humanen akuten Leukämiezellen mit den Protein- oder RNA-Syntheseinhibitoren wird unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß sowohl die Teilung als auch das Wachstum der Zellen vollständig verhindert wird. Wird beispielsweise CEM (2x10 Zellen/ml) bei 37⁰C während 2 h mi=t Emetin-HCl allein behandelt,

-4 beträgt die Konzentration des Salzes zwischen 10 bis 10 M, und wenn das Salz in Kombination mit Actinomycin D verwendet wird, betragen die Konzentrationen

-4 des Salzes und von Actinomycin D vorzugsweise 10 bis

10~⁵ M bzw. 0,05 bis 2,0 μg/ml.

Stufe C

Die oben hergestellten Lymphokin-bildenden humanen T-Zellen und humane akute Leukämiezellen, deren Wachstum mittels eines Proteinsyntheseinhibitors oder einer Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors und eines RNA-Syntheseinhibitors inhibiert wurde, werden in Gegenwart eines geeigneten Fusionsbeschleunigers fusioniert.

Das Verhältnis der Anzahl der Zellen von Human-T-Zellen zu humanen akuten Leukämiezellen bei der Fusionsstufe beträgt 1:1 bis 20:1 und vorzugsweise 2:1 bis 15:1.

Geeignete Fusionsbeschleuniger, die man erfindungsgemäß verwenden kann, sind Polyethylenglykol (PEG), Polyvinylalkohol und Viren mit einer Zellfusionsfähigkeit, insbesondere Paramyxoviren, zu denen Sendai-Virus (HVJ) gehört und dessen inaktiviertes Produkt. Im allgemeinen wird PEG mit einem Molekulargewicht zwischen 1 000 bis 4 000 verwendet.

Stufe D

Lebend-Zellen der oben erhaltenen fusionierten Zellen werden auf eine Konzentration von 10 bis 2x10 Zellen/ml gebracht und auf einer "96 Loch "-Kulturplatte enthaltend ein Nährmedium mit einer zugeführten Beschickungsschicht inkubiert.

Als Beschickungsschicht werden Humanzellen, deren Wachstum durch Antibiotika, wie Mitomycin C, oder durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen inhibiert wurde, verwendet.

Man kann jedes Nährmedium verwenden, solange es ein Medium darstellt, auf dem humane akute Leukämiezellen wachsen können. Beispielsweise ist ein Medium-geeignet, das man erhält, indem man 10 %iges fötales Kalbsserum (FCS),

5x10~⁵ M 2-Mercaptoethanol und 2 mMol Glutamin zu RPMI 1640 (Nissui Seiyaku'Co., Ltd.) gibt*

Eine Wochen nach der Kultivierung sterben die humanen akuten Leukämiezellen und die Äufgabeschicht, die mit dem Inhibitor behandelt wurde, vollständig ab, und die fusionierten Zellen bleiben zurück, &.; h. sie wachsen weiter.

Um die Bildung von fusionierten Zellen zu bestätigen, werden bekannte Methoden angewendet, nämlich (1) eine Analyse des Zelloberflächenantigens und (2) eine Analyse von ZeIIkaryotypen.

Stufe E

Die überstehende Flüssigkeit über der Kultivierung, in welcher die fusionierten Zellen gewachsen sind, wird analysiert, um zu bestätigen, daß das gewünschten Lymphokin

gebildet wurde.

Die so hergestellten fusionierten Zellen können während einer langen Zeit unter Aufrechterhaltung der Lymphokinaktivität subkultiviert werden. Durch Klonen ist es weiterhin möglich, ein eine "subline" wirksam bildendes Lymphokin zu erhalten.

Lymphokine erhält man durch Kultivierung der Subline entweder in vitro oder in vivo. Diese Kultivierung kann in bekannter Weise durchgeführt werden. Beispiele für eine in vivo-Kultivierung schließen eine Rührkultiviermethode und eine stationäre Kultiviermethode unter Verwendung von Petrischalen und Rouxkolben ein.

Beispiele für eine in vivo-Kultivierung schließen Methoden ein, bei denen nackte Mäuse, nackte Ratten oder andere Tiere, denen man humane Tumorzellen transplantiert hatte, mit Hybridoma inokuliert unter Ausbildung eines festen Tumors oder eines Aszitentumors. Nach einer geeigneten Wachstumsperiode werden die Asziten und/oder Blut gesammelt. Bei einer weiteren Methode, die in der US-PS 4 276 282 beschrieben wird, wird ein Hamster, dessen Immunansprechung geschwächt ist, mit den Hybridomas inokuliert, die dann in dem Hamster sich vervielfältigen.

Subkultivierbare Lymphokin-bildende Human-T-Zellen-Hybridomas sind für die Massenherstellung von Lymphokinen geeignet, und weil die gewünschten Lymphokin-bildenden Zellen in großen Mengen verfügbar sind, kann man sie als Extraktionsquelle für Lymphokinproduktion-bezogene Gene (z. B. darin enthaltenen Messenger RNA (mRNA)) anwenden. Es ist auch

möglich, daß nach der Herstellung von Komplement DNA (cDNA) aus dem extrahierten mRNA durch die Anwendung von Umkehrtranskriptase die Lymphokine unter Anwendung von Mikroorganismen (z„ B„ Bakterien, Hefe, Actinomyceten und Fungi) nach der üblichen genetischen Rekombinationstechnik zu gewinnen=

Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung ausführlich.
1.0

Beispiel 1

(1) Herstellung von Lymphokin-bildenden Human-T-Zellen-Hybridomas

Humane periphere Blutlymphozyten (PBL)(HLA-A2, -Aw24, -B7, -Bw35, -Cw3, -CwT)(1O⁶ Zellen/ml) wurden mit 5 μg/ml PHA-P in einem RPMI-1640 Medium (Nissui Seiyaku Co., Ltd.), enthaltend 10 % fötales Kalbsserum, 4x1 θ" M 2-Mercaptoethanol und 2 HiMoI Glutamin (nachfolgend als RPMI-Medium bezeichnet) 2 Tage aktiviert. Anschließend wurde das an die Zellen gebundene PHA-P entfernt, so daß das Niveau des vorliegenden PHA-P so niedrig wie möglich war»

10 M Emetin"HCl wurde zu den humanen akuten Leukämiezellen, CEM .(HLA-A1 , -ÄW30, -B8, -B40) (2x10⁶ Zellen/ml), die auf dem RPMI-1640-Medium (enthaltend 10 % Serum von neugeborenem Kalb) gezüchtet worden sind, zugegeben. Nach einer 2-stündigen Behandlung bei 37⁰C wurde das in dem Medium enthaltende Emetin·HCl durch Zentrifugieren entfernt„

Das oben hergestellte PBL und CEM wurden in einem Verhältnis von 10:1 abgemischt, und die Mischung wurde dann unter Erhalt von Zellpellets zentrifugiert.

Die Zellfusion wurde bei 37⁰C während 45 s durch Zugabe von 0,5 ml 46 %igen Polyethylenglykols (PEG 1540 (Wako Chemical Co., Ltd.))/ 15 % Dimethylsulfoxid (Wako Chemical Co., Ltd.) und 5 μg/ml Poly-L-arginin (Molekulargewicht: 60 000, Sigma, St. Louis, MO) durchgeführt. Anschließend wurden 10 ml MEM-Medium enthaltend 25 mMol N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES, Wako Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)-puffer langsam zugegeben, und die Mischung wurde zentrifugiert und resuspendiert mit einem RPMI-

Medium bis zu einer Zelldichte von 2x10 Zellen/ml.

Nach der Zellfusion wurde die Anzahl der Lebendzellen auf 2x10 Zellen/ml konzentriert und auf einer "96-Lochkulturplatte" enthaltend 0,2 ml RPMI-Medium pro Loch kultiviert, wobei das RPMI-Medium als Aufgabeschicht CEM

(8x10⁴ Zellen/ml), die mit 25 ug/ml Mitomycin C bei 37°C während 30 min behandelt worden waren, enthielt. Eine Woche nach Beginn der Kultivierung wurde das Medium täglich gewechselt, um die Einflüsse, die durch die abgegebenen Substanzen verursacht wurden, auszuschalten.

Lymphokinaktivität wurde nach dem nachfolgend (2) beschriebenen Verfahren gemessen unter Verwendung von Hybridomas aus einer der Vertiefungen in der Kulturplatte, bei denen man eine Proliferation beobachtet hatte.

Emetin-behandeltes CEM und Mitomycin-behandeltes CEM, die als Kontrolle verwendet wurden, starben innerhalb einer Woche vollständig ab.

(2) Kultivierung von Hybridomas und Lymphotoxinaktivität

Hybridomas, die gemäß (1) erhalten worden waren, wurden in einem RPMI-Medium 1 Tag in Gegenwart von 20 μg/ml PHA-P kultiviert. Die Messung der Lymphotoxinaktivität in der überstehenden Flüssigkeit mit L-P3 (Subline von L-Zellen) als Targetzellen zeigte,, daß zwei Hybridomas (E-10, F-8) aktiv waren. Diese Aktivitäten wurden länger als 3 Monate aufrechterhalten. Die Lymphotoxinaktivität wurde gemessen nach der von Y. Kobayashi, J. Immunology, 122s 791 (1979) beschriebenen Methode. Hierzu wird eine Probe (25 μΐ)

4 und 25 μΐ Actinomycin D (4 μg/ml) zu 50 μΐ von L-P3 (3x10 Zellen) _t die zuvor auf einer Mikroplatte gebildet worden waren, gegeben und 20 bis 24 h bei 37⁰C kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit Glutaraldehyd fixiert und gefärbt und die morphologisch normalen Zellen wurden gezählt.

(3) Eigenschaften von Hybridomas E-10 und F-8 (A) Analyse von Zelloberflächenantigen

(1) Es ist bekannt, daß eine Analyse unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers CEM nicht mit monoklonalem Antikörper OKT3 reagiert, daß jedoch humane T-Zellen mit OKT3 reagieren. Aufgrund dieser Feststellung wurde die OKT3-Reaktivität von Human-T-Zellhybridomas (E-10 und F-8) durch eine Zweistufenbindungsassay und einen Immu-

1 25

nofluoreszenztest untersucht unter Verwendung von J-Protein A. Als Ergebnis wurde gefunden,, daß CEM keine Reakti-

vität hatte, während E-10 und F-8 Reaktivitäten aufwiesen, die jeweils nahezu gleich der von PBL-T-Zellen und etwa 50 % von PBL-T-Zellen betrug.

(2) Das HLA-Antigen für E-10 und F-8 wurde durch Zwei-

1 25 Stufenbindungsassay unter Verwendung von J-Protein A

untersucht. Es wurde festgestellt, daß PBL HLA-A2 und -Bw35 positiv war und daß CEM HLA-A1 und -B8 positiv war, daß jedoch beide E-10 und F-8 HLA-A1, -A2 und -B8 positiv waren.

(B) Karyotyp-Analyse

Die Anzahl der Chromosomen in CEM, E-10 und F-8 wurde bei 50 bis 80 Metaphasekernen gemessen. CEM enthielt 84,3 _+ 0,9 (Mittelwert _+ Standard) (Mittel aus 85) Chromosome. E-10 enthielt 95,5 + 1,7 (Mittel aus 94) Chromosome.

F-8 enthielt 81,5 +_ 1,7 (Mittel aus 93) Chromosome. Es wurde somit sowohl bei E-10 als auch bei F-8 eine Erhöhung der Anzahl der Chromosomen um etwa 10 festgestellt.

Beispiel 2

Lymphokin-bildende Hybridoma-Zellen E-10 (10 Zellen/ml), die wie im Beispiel 1 erhalten wurden, wurden 1 Tag auf einem RPMI-Medium kultiviert. Die über der Kultur stehende Flüssigkeit wurde dann auf das Vierfache verdünnt. Die MIF-Aktivität der vierfach verdünnten Lösung wurde nach der Harrington-Methode, die von J.T. Harrington, Jr. et al. in J. Immunology, 110: S. 752 (1973) beschrieben

wird, gemessen. Die Phagozytenmigrationsinhibierungsrate betrug für E-IO 29,9 %. Es wurde keine Aktivität für die über der Kultur stehenden Flüssigkeit von CEM, das unter den gleichen Bedingungen kultiviert worden war, festgestellt. Die über der Kultur stehende Flüssigkeit, die durch eintägige Kultivierung von PBL (.10 Zellen/ml) auf einem HEPES-Puffer enthaltend Con A (10 pg/inl) MEM-Medium erhalten worden war, zeigte eine Phagozytenmigrationsinhibierungsrate von 25,2 %. Die MIF-Aktivität 1.0 bei E-10 hielt langer als 6 Monate an.

Beispiel 3

5x10 M Emetin-HCl und 0,,1 Mg/ml Äctinomycin D wurden bei 37°C im Laufe von 2 h zu CEM gegeben. Das so behandelte CEM wurde mit PBL, das in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, fusioniert, und dann wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 kultiviert. Emetin· HCl und Actinomycin D-behandeltes CEM starb vollständig ab, und man stellte nur eine Vervielfältigung von Hybridzellen fest.

Die so erhaltenen Hybridomazellen wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1-(2) kultiviert, und die Lymphotoxinaktivitat der überstehenden Flüssigkeit wurde gemessen. Man stellte fest, daß zwei Hybridomazellinien (C-5, D-9) eine LT-Aktivität aufwiesen.

Beispiel 4

Lymphokin-bildende Hybridoma-ZeIlinie E-10, erhalten wie in Beispiel 1, wurde durch die limitierte Verdünnungsmethode (0,5 Zellen/Vertiefung) in einem RPMI-1640-Medium, enthaltend eine Zugabeschicht CEM (2x10 Zellen/ml), die mit Mitomycin C wie in Beispiel 1 behandelt worden war· und auch 20 % Concanavalin Α-aktiviertes PBL als überstehende Flüssigkeit enthielt, subkloniert untier Erhalt der Sublinie E-10-20.

Die so erhaltenen E10-20-Zellen wurden auf einem RPMI-Medium (10 Zellen/ml) 1 Tag kultiviert, und die gebildete überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat (50 bis 100 % gesättigt) ausgefällt und gegen Natriumphosphatpuffer, enthaltend 0,15 M NaCl (PBS, pH 7,2) dialysiert unter Erhalt einer Testprobe. Die MIF-Aktivität der Probe wurde wie im Beispiel 1 gemessen. Die Phagozytenmigrationsinhibierungsrate betrug 2 9,9 %^.

Weiterhin wurde die MAF-Aktivität der Probe nach einem Verfahren gemessen, das eine Modifizierung der Methode von H.W. Murray et al. (J. Exp. Med. 153, S. 1690 (1981)) ist, also einem Verfahren, bei dem humane Phagozyten-ähnliehe Zellinie U937 .(«The· Pharmaceutical Department of Tokyo University, Tokyo, Japan) umgesetzt wird und die Freigabe von O~ (Superoxidanion) nachgewiesen wird. D. h., daß im wesentlichen das gleiche Verfahren wie die Murray et al.-Methode wiederholt wurde mit der Ausnähme, daß 100 μΐ humane Phagozyten-ähnliche Zellinie U937 (5x10 Zellen/ml) 48 h in Gegenwart oder in Abwesenheit der Testprobe inkubiert wurden. Es stellte sich heraus, daß 30 % der gesamten U937-Zellen O₂" in den Zellen abgaben, wodurch gezeigt wird, daß diese Testprobe

MAF enthielt.

In gleicher Weise wie oben wurde CEM-Zellinie kultiviert und die über der Kultur stehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat (50 bis 100 %ige Sättigung) ausgefällt und gegen PBS dialysiert unter Erhalt einer weiteren Probe. Die MIF-Aktivität dieser Probe wurde in gleicher Weise wie oben gemessen und betrug 9,9 %„ Ebenso wurde die MAF-Aktivität gemessen wie oben, wobei 21 % der gesamten U937-Zellen 0 ~ in den Zellen freigaben.

Claims

PATE WTAN WALTK DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · Dl PL.-ING. W. EITLE . D R. R ER. NAT. K. HOFFMAN N . DI PL.. IN G. W. LEHM DIPL.-ING. K. FOCHSLE · D R. R E R. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 - D-8000 MON CH EN 81 ■ TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-?9il9 (PATHE) 37 719 o/sm Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha, Tokyo / Japan Verfahren zur Herstellung von subkultivierbaren Lymphokin-bildenden Human-T-Zellenhybridomas Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines subkuL.tivierbaren Lymphokin-bildenden Human-T-Zell-Hybridoms., gekennzeichnet durch folgende Stufen: 1) Behandeln einer humanen akuten Leukämiezelle mit einem Proteinsyntheseinhibitor oder einer Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors und einem RNA-Syntheseinhibitor, so daß das Wachstum der humanen akuten Leukämiezellen vollständig verhindert wird; 2) unabhängig davon Aktivieren einer humanen T-Zelle mit einem Mito-0 gen oder Antigen unter Erythro-yten-Transformation der humanen T-Zellen und Bildung des gewünschten Lymphokins; 3) Fusionieren der so behandelten humanen akuten Leukämiezelle mit der so aktivierten humanen T-Zelle in Gegenwart eines Fusionsbeschleunigers und 4) Isolieren des so gebildeten Hybridoms.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Proteinsyntheseinhibitor

in der Lage ist, die Proteinsynthese von eukaryotischen Zellen zu inhibieren.
5

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch g e! k e η η zeichnet , daß der Proteinsyntheseinhibitor Emetin oder ein Derivat davon oder das Hydrochloridsalz davon und/oder Pactamycin ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der RNA-Syntheseinhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe Actinomycin D, Gi-Amanitin und Adriamycin.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Proteinsyntheseinhibitor Emetin oder ein Derivat davon oder ein Hydrochloridsalz davon und der RISJA-Syntheseinhibitor Actinomycin D ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die humane akute Leukämiezelllinie T Tumorzellen sind.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die humanen akuten Leukämiezellen CEM, TALL oder MOLT-4-Zellinien sind,

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch g e k e η η ~ zeichnet , daß das Mitogen Phytohämagglutinin-P oder Koncanavalin A ist.

9. Verfahren gemäß Ansprüchen 1, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet , daß 10 bis 10 Zellen/ml der humanen akuten Leukämiezellinie mit 10 bis 10~ M des Proteinsyntheseinhibitors behandelt werden. 5

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet , daß 10 bis 10 Zellen/ml

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der akuten Leukämiezellen mit 10 bis 10 M des Proteinsyntheseinhibitors und 0>05 bis 0,2 μg/ml Actinomycin D behandelt werden,

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Zellfusionsbeschleuniger ein PolyethylengIykol mit einem Molekulargewicht von 1 000 bis 4 000 ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet , daß bei der Zellfusion die Antigen- oder Mitogen-behandelte Human-T-Zelle mit der humanen akuten Leukämiezellinie in einem Zellanzahlverhältnis von 1:1 bis 20:1 behandelt wird.

13. Verfahren gemäß Ansprüchen 1, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Zellfusion die Antigen- oder Mifcogen-behandelte Human-T-Zelle mit der humanen akuten Leukämiezellinie in einem Zellanzahlverhältnis von 2:1 bis 15:1 behandelt wird.

14. Verfahren gemäß Ansprüchen 1, 11 oder 13, dadurch

gekennzeichnet, daß nach der Zellfusion die gebildeten Hybridomzellen in einem Medium kultiviert werden, in welchem nicht Protein und/oder RNA-Syntheseinhibitor-behandelte humane akute Leukämiezell-

linien proliferieren, und daß dadurch die Isolierung der Hybridomzellen ermöglicht wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß der Zellfusionsbeschleuniger Sendai virus (HVJ) oder dessen inaktiviertes Produkt ist.

16. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das durch das so gebildeten Hybridom-gebildete Lymphokin ein migrationsinhibierender Faktor (MIF) ist.

17. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das durch das so gebildete

Hybridom-gebildete Lymphokin Lymphotoxin (LT) ist.

18. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das so gebildete Hybridom

in vitro oder in vivo subkultiviert wird.

19. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das gebildete Hybridom
eine Zellinie aus der Gruppe E-10, F-8, C-5 oder

D-9 ist.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet,, daß das Hybridom eine Zellinie E-10 ist.