DE3911442A1 - Impfstoff-praeparation - Google Patents

Impfstoff-praeparation

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Kitasato Institute
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Description

Die Erfindung betrifft eine Impfstoff-Präparation. Die Erfindung betrifft insbesondere eine Impfstoff-Präparation, die ein Toxin oder seine Subeinheit bzw. Untereinheit (diese Ausdrücke werden synonym verwendet) als wirksamen Bestandteil enthält.
Impfstoffe werden zum Schutz verschiedener Arten von Krankheiten verwendet und ergeben erfolgreiche Ergebnisse. Jedoch wurden manchmal Nebenreaktionen oder eine ungenügende Wirkung des Impfstoffes beobachtet, und daher besteht ein großer Bedarf für Verbesserungen des Impfstoffs. Zur Beseitigung einer Neben­ reaktion des Impfstoffes hat man versucht, gereinigtere Impf­ stoffe herzustellen oder eine geringere Menge an Impfstoff zu verabreichen. Jedoch haben diese Versuche zu einer geringeren Wirkung des Impfstoffes geführt.
Derzeit werden Impfstoffe für Menschen aus Pathogenen oder ihren Komponenten hergestellt. Daher kann eine Verunreinigung mit Komponenten, welche das Pathogen ergeben, oder aus dem Medium, welches zur Kultur des Pathogens verwendet wird, in einem Impfstoff nicht vermieden werden, und dadurch werden bei der Impfung mit einem Impfstoff Nebenwirkungen induziert.
Es sollte daher ein wirksamer Impfstoff entwickelt werden, der eine verbesserte Immunpotenz ohne Nebenwirkung aufweist.
Zur Beseitigung der Nachteile hat man verschiedene Möglichkeiten vorgeschlagen, wie eine Erhöhung in der Inokulumgröße des Impfstoffs und eine Änderung der Verabreichungswege.
Die Anmelderin hat gefunden, daß die Immunpotenz von Impfstoff verstärkt werden kann, wenn der Impfstoff zusammen mit einem Bakterien-Toxin, insbesondere einem Cholera-Toxin, Staphylokokken- α-Hämolysin, Staphylokokken-δ-Hämolysin, thermostabilem direkten Vibrio-Hämolysin, Pertussis-Toxin oder E. coli- wärmelabilem-Toxin oder einer Untereinheit davon, verabreicht wird.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung zu stellen, welche eine verbesserte Immunpotenz aufweist, wobei gleichzeitig die Menge an Impfstoff, die verabreicht wird, erniedrigt wird, ohne daß die Immunpotenz erniedrigt wird.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung gestellt werden, die als wirksame Komponente ein Toxin oder seine Untereinheit enthält.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung gestellt werden, welche ein Bakterien-Toxin enthält.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung gestellt werden, welche ein Bakterien-Toxin, ausgewählt aus der Gruppe Cholera-Toxin, Staphylokokken-α-Hämolysin, Staphylokokken- δ-Hämolysin, thermostabiles direktes Vibrio-Hämolysin, Pertussis-Toxin oder E. coli-wärmelabiles-Toxin, enthält.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung gestellt werden, in der die Untereinheit des Toxins die B- Einheit ist.
Erfindungsgemäß soll ein Impfstoff zur Verfügung gestellt werden, ausgewählt aus der Gruppe Influenza-Impfstoff, Pertussis- Impfstoff, Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit Pertussis-Impfstoff, Japan-Encephalitis-Impfstoff, Hepatitis-B- Impfstoff, Rota-Impfstoff, Masern-Impfstoff, Rubella-Impfstoff bzw. Röteln-Impfstoff, Mumps-Impfstoff, Kombinations-Impfstoff für Masern, Rubella und Mumps und Mycoplasma-Impfstoff.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung gestellt werden, die ein Mischverhältnis von Impfstoff und Toxin oder seiner Untereinheit von 1 : 0,0001∼1 : 10 000 (Gew./ Vol.) enthält.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung gestellt werden, die einen intranasalen Impfstoff enthält.
Erfindungsgemäß soll eine Impfstoff-Präparation zur Verfügung gestellt werden, welche in injizierbarer Form, in Sprayform oder in einer für die orale Verabreichung geeigneten Form vorliegt.
Influenza-Impfstoff ist ein Beispiel eines Impfstoffs, und Cholera-Toxin (welches im folgenden als CT bezeichnet wird) und Cholera-Toxin-B-Subeinheit (welches im folgenden als CTB bezeichnet wird) sind ein Beispiel für ein Bakterien-Toxin und anhand dieser wird die vorliegende Erfindung erläutert.
Die Anmelderin hat das Cholera-Toxin untersucht, ein Protein- Endotoxin, welches durch Vibrio cholera als lokaler Immunmodulator gegen intranasal verabreichten Impfstoff gebildet wird. Cholera-Toxin ist ein wirksames intestinales Immunogen und ist für die Diarrhoe (den Durchfall) bei der Cholere verant­ wortlich. Weiterhin ist es nicht nur als wirksames Immunogen, welches die IgA-Antikörperbildung induziert, bekannt, sondern ebenfalls als immunomodulierendes Mittel, welches die Immun- Antwort bei der gleichzeitigen Verabreichung nichtverwandter Protein-Antigene stimuliert, wenn CT und das nichtverwandte Antigen gleichzeitig verabreicht werden. Eine Wirkung von CT wurde als Wirkung definiert, welche den intrazellularen cAMP- Gehalt in intestinalen mukosalen Zellen erhöht. Ein Mechanismus der Wirkung von CT, welches aus A-Subeinheit und B-Subeinheit besteht, ist der, daß CTB an GM₂-Gangliosid in einer Zellmembran gebunden wird und daß die A-Subeinheit in die Zelle eintritt und die Adenylatcyclase aktiviert. CTB, die nichttoxische Komponente von CT, wurde ebenfalls als Darm- Schleimhaut-Immunogen erkannt, wenn es gleichzeitig mit nichtverwandtem Protein-Antigen verabreicht wird. Diese Tatsachen lassen vermuten, daß sowohl CT als auch CTB an den Atem-Schleimhäuten als auch an den intestinalen Schleimhäuten wirken und die lokale Immun-Antwort gegenüber nichtverwandten koexistierenden Antigenen stimulieren.
Die Anmelderin hat die Wirksamkeit von CT und CTB als Adjuvans bei der lokalen und Serum-Antikörper-Herstellung bei nasaler Impfung bei Mäusen unter Verwendung von Influenza-HA-Impfstoff (im folgenden als HA-Impfstoff bezeichnet) untersucht. Weiterhin wurde die Verwertbarkeit von CT und CTB als Adjuvans bei der Impfungswirkung geprüft.
Erhöhte Impfungswirkung von CTB bei nasaler Impfung unter Verwendung von HA-Impfstoff bei der Immun-Antwort
Die Wirkungen von CTB bei den Antikörper-Antworten gegenüber HA-Impfstoff (A/Yamagata) wurden in Mäusen untersucht, welche den Impfstoff zusammen mit CTB intranasal verabreicht bekamen. Gleichzeitig wurde das Ergebnis der intranasalen Verabreichung mit dem anderer Inokulationswege bzw. Impfwege verglichen.
Vier Wochen nach der nasalen Impfung, welche durch Eintropfen von HA-Impfstoff (2 µg) alleine oder zusammen mit CTB (5 µg) intranasal bei Mäusen erfolgte (oder die durch intraperitoneale oder subkutane Verabreichung erfolgte), wurden die Hämagglutinin- inhibierenden (im folgenden als HI bezeichnet) Anti­ körpergehalte im Serum und die Influenza-spezifischen IgA- Antikörper (im folgenden als Anti-HA-IgA-Antikörper bezeichnet) und die CTB-spezifischen IgA-Antikörper (im folgenden als Anti-CTB-IgA-Antikörper bezeichnet) in der nasalen Spülung analysiert.
Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, wurde bei der Vergleichsgruppe von Mäusen, welchen nur der HA-Impfstoff alleine intranasal verabreicht wurde, nur ein niedriger Gehalt an Serum-Hi-Antikörpern induziert. Die nasale Impfung von CTB zusammen mit HA-Impfstoff führte zu einem 64fach höheren Gehalt an Serum-HI-Antikörpern. Anti-HA-IgA- und Anti-CTB-IgA-Antikörper wurden in der nasalen Spülung ebenfalls beobachtet. Die intra­ peritoneale oder subkutane Impfung von HA-Impfstoff alleine induzierte einen höheren Gehalt an Serum-HI-Antikörper, und die Impfung von HA-Impfstoff zusammen mit CTB induzierte einen wesentlich erhöhten Gehalt, wie einen um das 4-∼8fache höheren Gehalt an Serum-HI-Antikörpern. Jedoch wurden keine nachweisbaren nasalen Anti-HA-IgA- noch Anti-CTB-IgA-Antikörper induziert.
Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß CTB ein wirksames Adjuvans ist, welches die nasale Anti-HA-IgA-Antikörper-Bildung stimuliert, wenn es intranasal zusammen mit HA-Impfstoff verabreicht wird.
Obgleich dies in Tabelle 2 nicht gezeigt wird, konnte kein Serum-Anti-HA-IgA nachgewiesen werden.
Wirkung von CTB auf die primäre Antikörper-Antwort bei HA-Impfstoff nach intranasaler Verabreichung
Eine Erhöhung der Antikörperbildung in Mäusen, welche intranasal HA-Impfstoff (A/Yamagata, 2 µg) zusammen mit CTB (5 µg) erhielten, wurde untersucht.
Wie aus Fig. 1 hervorgeht, wurde die HI-Antikörperbildung bei Serum-Impfstoff zusammen mit CTB während 1 bis 2 Wochen stark erhöht, danach trat eine allmähliche Erhöhung bis zu einer Zeit von 4 Wochen auf. Die Gesamtmenge von IgA in der nasalen Spülung wurde schnell auf einen maximalen Wert nach 1 bis 2 Wochen nach der Impfung erhöht, wobei der Wert ungefähr 6mal so hoch ist wie bei der Vergleichsgruppe. Die Menge an Anti-HA-IgA darin wurde allmählich nach 1 bis 4 Wochen gesteigert.
Anti-HA-Antikörper konnte in der nasalen Spülung ungefähr 2 Wochen nach der gleichzeitigen Verabreichung von CTB als auch Impfstoff nachgewiesen werden.
Wirkung von CTB auf die primären und sekundären Antikörper-Antworten mit HA-Impfstoff
Die Wirkung von CTB (5 µg) und verschiedenen Mengen an HA-Impfstoff (A/Yamagata) auf die HA-Antikörper-Antwort wurde untersucht.
Die primäre Antikörperbildung wurde in Mäusen untersucht, die eine primäre intranasale Imfpung von verschiedenen Dosen von HA-Impfstoff zusammen mit CTB erhielten. 4 Wochen nach der Impfung wurde die sekundäre Antikörperbildung nachgewiesen, wobei die Mäuse 2 Wochen später die zweite intranasale Impfung von HA-Impfstoff (2 µg) alleine erhielten.
Aus Tabelle 3 folgt, daß ein niedriger Gehalt an primärer Antikörperbildung selbst bei einer Impfung mit 8 µg HA-Impfstoff alleine beobachtet wurde. Andererseits beobachtete man sowohl einen hohen nasalen Anti-HI-IgA-Antikörpergehalt als auch einen Serum-HI-Antikörpergehalt mit einer Steigerung in der intranasalen Dosis von HA-Impfstoff selbst bei einer 0,03-µg-Impfung, wenn CTB gleichzeitig verabreicht wurde. Bei Mäusen, die die zweite intranasale Impfung von HA-Impfstoff alleine nach der primären Impfung erhielten, war der Gehalt an Anti-HI- und Anti-HA-IgA-Antikörperbildung enorm erhöht und unabhängig von der primären HA-Impfdosis, welche mit CTB geimpft wurde. Mäuse, die eine primäre Impfung aus CTB- und HA-Impfstoff erhielten, zeigten extrem hohe Gehalte bei der Anti-HI- und Anti-HA-IgA-Antikörperbildung und waren von der Menge der primären HA-Impfstoff-Impfung unabhängig. Insbesondere war der Gehalt an nasalem Anti-HA-IgA-Antikörper etwa 50- bis 100mal so hoch wie der nach der primären Impfung. Diese Ergebnisse zeigen, daß das primär inokulierte CTB die Antikörperbildung bei der sekundären Impfung stark stimuliert, ohne daß die Menge von HA-Impfstoff gleichzeitig bestimmend wirkt. Tatsächlich kann CTB eine immunologische Memory für die Bildung von nasalen IgA-Antikörpern gegenüber HA-Impfstoff bei relativ niedriger Konzentration wirksam erzeugen.
Wirkung von CTB bei der Verstärkung der Immun-Antwort und beim Schutz von Mäusen gegen die Infektion mit Influenza-Virus
Die Immun-Antwort gegenüber HA-Impfstoff wird durch gleichzeitige Verabreichung von CTB bei Mäusen verstärkt. Die Wirksamkeit von CTB als Adjuvans wurde durch Produktionsexperimente unter Verwendung eines der Maus angepaßten Influenza-Virus, Stamm PR8, untersucht. Mäuse wurden intranasal sowohl mit PR8-HA-Impfstoff (1,5 µg) als auch mit CTB (5 µg) geimpft und 4 Wochen später intranasal mit PR8-Virus infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurden die Lungenvirus-Titer als Index für den Schutz bestimmt. Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, erhielt man einen vollständigen Schutz gegen die Herausforderungs- Infektion ohne Nachweis von Viren in der Lunge der Mäuse bei der Inokulation des Impfstoffes mit CTB und eine Bildung von hohen Gehalten von sowohl Serum-HI-Antikörpern als auch nasalen Anti-HA-IgA-Antikörpern bei Mäusen, und keine der Mäuse war infiziert.
Zur Bestimmung des Lungenvirus-Titers nach 3 Tagen der Viren­ infektion als Indikator für die Resistenz gegenüber der Infektion gegenüber Vireninfektion bei Mäusen wurden die Mäuse sowohl mit HA-Impfstoff als auch mit CTB geimpft, und 4 Wochen später wurden sie intranasal mit dem Virus, Stamm PR8, geimpft. Nach der Infektion wurde die Variation der Lungenvirus- Titer bestimmt.
Wie aus Fig. 2 hervorgeht, zeigten Mäuse, welche Lungenvirus <100,5 nach 3 Tagen der Infektion erhielten, keinen nachweisbaren Virus einen Tag nach der Infektion, und der niedrige Gehalt mit dem Überleben blieb mindestens 8 Tage erhalten. Im Gegensatz dazu zeigten die Lungen von Mäusen der Vergleichs­ gruppen, welche keine nachweisbaren Schutz-Antikörper bildeten, das Anzeichen der Infektion, die einen Tag nach der Infektion zunahm und ihr Maximum nach 3 Tagen erreichte. Der Tod von Mäusen in der Vergleichsgruppe wurde 8 Tage nach der Infektion beobachtet. In der nichtimmunisierten Gruppe starben 6 von 9 Mäusen nach 8 Tagen. Die überlebenden 3 Mäuse zeigten starke Läsionen in der Lunge, und man beurteilte sie so, daß sie innerhalb einiger Tage sterben würden. Ähnliche Ergebnisse wie bei der nichtimmunisierten Gruppe wurden bei Mäusen beobachtet, die mit HA-Impfstoff oder CTB alleine geimpft worden waren. Daraus wird geschlossen, daß der Lungenvirus- Titer 3 Tage nach der Infektion ein Indikator für die Resistenz gegenüber der Infektion ist.
Wirkung der Dosis von CTB oder CT auf die Verstärkung der Immun-Antwort und den Schutz von Mäusen gegen die Infektion mit Influenza-Virus
Die Wirkungen der CT- oder CTB-Dosis, welche intranasal mit dem PR8-HA-Impfstoff (1,5 µg) geimpft wurden, beim Schutz gegenüber dem Angriff von PR8-Virus und die Antikörperbildung wurden untersucht. Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, wurde eine mäßige Resistenz gegenüber der Infektion bei einer Dosis von CTB (0,05 µg) beobachtet, und ein vollständiger Schutz gegen die Angriffsinfektion wurde bei der Impfung von Impfstoff mit 5 µg CTB erhalten. Der Grad der Resistenz gegenüber der Infektion scheint direkt dem Gehalt von Anti-HA-IgG-Antikörpern in der nasalen Spülung und dem Gehalt an HI-Antikörpern im Serum nach 4 Wochen nach der Inokulation des Impfstoffes mit CTB proportional zu sein.
Ein vollständiger Schutz gegenüber der Infektion wurde bei Gehalten von CT über 0,05 µg beobachtet, und bei diesen Bedingungen wurde eine Erhöhung der HI-Antikörper im Serum und der Anti-HA-IgA-Antikörper in der nasalen Spülung entsprechend der Erhöhung im Gehalt an CT beobachtet.
Diese Ergebnisse zeigen, daß CT um das 10fache oder mehrfache wirksamer ist als CTB auf Dosisbasis bei der Erhöhung der HI-Antikörperbildung im Serum und der Anti-HA-IgA-Antikörperbildung in der nasalen Spülung, die für den Schutz gegenüber der Infektion erforderlich sind.
CT kann als wirksames Adjuvans bei niedrigen Dosismengen, verglichen mit CTB, verwendet werden, wenn keine Nebenwirkung auftritt.
Man nimmt an, daß der HI-Antikörper um das 32fache der Antikörper- Titer im Serum höher ist und daß die lokalen Antikörper mit mehr als 2 Einheiten von Anti-HA-IgA-Antikörpern für einen Schutz gegenüber PR8-Virusinfektion erforderlich sind.
In der Tabelle 1 werden die Adjuvans-Aktivitäten der verschiedenen Bakterien-Toxine erläutert.
Tabelle 1
Tabelle 2
Verstärkung der antiviralen Antikörper-Antwort bei Influenza-HA-Impfstoff (A/Yamagata) durch CTB
Tabelle 3
Verstärkung der primären und sekundären Antikörper-Antworten durch die nasale Impfung mit Influenza-HA-Impfstoff zusammen mit CTB
Tabelle 4
Schutz gegenüber der Infektion mit Influenza-Virus (PR8) bei der Impfung mit HA-Impfstoff und CTB
Tabelle 5
Wirkung der CTB- oder CT-Dosis beim Schutz gegenüber Infektion
Wie es oben erläutert wurde, wurden die folgenden Tatsachen festgestellt:
  • (1) Die Verabreichung von Influenza-HA-Impfstoff zusammen mit CT oder CTB verstärkt die Immunproduktion.
  • (2) Die Verstärkung der Serum-HI-Antikörperproduktion und der lokalen intranasalen Anti-HA-IgA-Produktion wurde durch intranasale Impfung von HA-Impfstoff mit CTB vergrößert. Fast keine lokale intranasale HA-IgA-Antikörperproduktion wurde nicht beobachtet, wenn eine intraperitoneale und subkutane Impfung erfolgte, es wurden jedoch hohe Gehalte an Antikörperproduktion im Serum festgestellt.
    Als Folge besitzt CTB eine Verstärkungsaktivität bei der Antikörperbildung bei allen Inokulationswegen bzw. bei allen Arten der Verabreichung des Impfstoffes.
    Diese Tatsache bedeutet, daß die kombinierte Verabreichung von CT, CTB, Staphylokokken-α-Hämolysin, Staphylokokken-δ- Hämolysin, thermostabilem direkten Vibrio-Hämolysin, Pertussis- Toxin oder E. coli-wärmelabilem-Toxin mit Pertussis-Impfstoff, Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit Pertussis- Impfstoff, Hepatitis-B-Impfstoff, Japan-Encephalitis- Impfstoff, Masern-Impfstoff, Rubella-Impfstoff, Mumps-Impfstoff, Rubella- und Mumps-Kombinations-Impfstoff, Rota-Impfstoff oder Mycoplasma-Impfstoff höhere Titerwerte ergibt, verglichen mit der einfachen Dosis des Impfstoffes.
    In anderen Worten kann die Impfstoffmenge beim Impfen verringert werden, wenn der Impfstoff gleichzeitig mit Toxin und/oder einer Untereinheit davon verabreicht wird.
  • (3) Der Gehalt an lokalem nasalen Anti-HA-IgA-Antigen wird 2 bis 4 Wochen bei der intranasalen Impfung des Impfstoffes mit CTB erhöht.
  • (4) Die Antikörperbildung nach 4 Wochen nach der intranasalen Impfung des Impfstoffes mit CTB ist der Dosismenge an Impfstoff beim Impfen proportional.
  • (5) Bei Mäusen, welche die zweite intranasale Impfung des Impfstoffes alleine 4 Wochen nach der primären Impfung des Impfstoffes mit CTB erhielten, wurde der Gehalt an sekundärer Antikörperproduktion 2 Wochen nach der zweiten Impfung stark erhöht und war von der primären Impfstoffdosis, die beim Impfen mit CTB verwendet wurde, unabhängig. Daher kann CTB wirksam eine immunologische Memory ergeben.
  • (6) Ein vollständiger Schutz gegenüber Influenza-Virusinfektion wurde bei der intranasalen Inokulation des Impfstoffes mit CTB in Mäusen erhalten, bei denen die Bildung von hohen Gehalten sowohl an Serum-Antikörper-Titern als auch an nasalen Anti-HA-IgA-Antikörpern beobachtet wurde.
    Bei den derzeitigen Versuchsbedingungen konnte bei Mäusen, welche Serum-HI-Antikörper über dem 32fachen des Antikörper- Titers und lokale nasale Antikörper über 2 Einheiten zeigten, ein vollständiger Schutz gegenüber PR8-Virusinfektion erhalten werden.
  • (7) Die Impfstoffmenge von CTB, die für die Induzierung der Antikörperbildung für einen vollständigen Schutz gegenüber der Infektion erforderlich ist, wenn eine intranasale Impfung mit Impfstoff erfolgt, liegt in der Größenordnung von µg. CT kann die Antikörperbildung induzieren, welche für einen vollständigen Schutz gegenüber der Infektion erforderlich ist, bei Mengen unter ¹/₁₀, wie CTB.
Die Toxine oder ihre Untereinheit, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie CT oder CTB, können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden und sind ebenfalls im Handel erhältlich. CT ist, wenn es in großer Menge verabreicht wird, toxisch, es ist jedoch nicht toxisch, wenn es intranasal oder intraperitoneal verabreicht wird, inokuliertes CTB ist weniger toxisch als CT und ergibt bei der intranasalen Verabreichung keine Schwierigkeiten. Beispiele weiterer Toxine sind Staphylokokken-α-Hämolysin, Staphylokokken- δ-Hämolysin, thermostabiles direktes Vibrio-Hämolysin, Pertussis-Toxin und E. coli-wärmelabiles-Toxin.
Beispiele für Impfstoffe sind Influenza-Impfstoff, Pertussis- Impfstoff, Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit Pertussis-Impfstoff, Hepatitis-B-Impfstoff, Japan-Encephalitis- Impfstoff, Masern-Impfstoff, Rubella-Impfstoff, Mumps- Impfstoff, Kombinations-Impfstoff für Masern, Rubella und Mumps, Rota-Impfstoff und Mycoplasma-Impfstoff und andere. Diese können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden. Die Produktion und ihre Herstellungsverfahren werden im folgenden erläutert.
Influenza-Impfstoff:
ein Impfstoff, welcher Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA), Nucleoprotein (NP) und Matrixprotein (M) vollständig oder teilweise enthält, die durch Reinigung des Virus, welcher auf embryonierten Eiern gezüchtet wurde, mit Ether und Detergens oder durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurden.
Pertussis-Impfstoff:
ein Impfstoff, der Pertussis-Toxin (PT), Hämagglutinin (FHA) und K-Agglutin vollständig oder teilweise enthält, die aus einem avirulenten Toxin mit Formalin erhalten werden, wobei das Toxin durch Auswalzen oder Ultrazentrifugation aus der Kulturbrühe oder Bakterienzellen von Bordetella pertussis erhalten wurde oder durch Genetic- Engineering-Verfahren oder chemische Synthese erhalten wurden.
Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit Pertussis-Impfstoff:
ein Kombinations-Impfstoff aus Pertussis-Impfstoff, Diphtherie- und Tetanus-Toxoid.
Japan-Encephalitis-Impfstoff:
ein Impfstoff, der ein antigenes Protein vollständig oder teilweise enthält, welches durch Züchtung eines Virus intracerebral in Mäusen und Reinigung der Virusteilchen durch Zentrifugieren oder mit Ethyl­ alkohol und Inaktivierung oder durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Hepatitis-B-Impfstoff:
ein Impfstoff, der ein antigenes Protein vollständig oder teilweise enthält, welches durch Isolierung und Reinigung des HBs-Antigens unter Auswalzung oder durch Ultrazentrifugation aus Hepatitis B enthaltendem Blut erhalten wurde oder der durch Genetic-Engineering-Verfahren oder chemische Synthese erhalten wurde.
Masern-Impfstoff:
ein Impfstoff, der den Virus, welcher in kultivierten Küken-Embryozellen oder embryonierten Eiern gezüchtet wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder ganz enthält, wobei der Impfstoff gemäß Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Rubella-Impfstoff:
ein Impfstoff, der den Virus, der in kultivierten Küken-Embryozellen oder embryonierten Eiern gezüchtet wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder teil­ weise enthält und der gemäß Genetic-Engineering-Verfahren oder nach der chemischen Synthese erhalten wurde.
Mumps-Impfstoff:
ein Impfstoff, der ein Virus, der in gezüchteten Kaninchenzellen oder embryonierten Eiern gezüchtet wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder ganz enthält und der gemäß Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Kombinations-Impfstoff für Masern, Rubella und Mumps:
ein Impfstoff, der kombiniert Masern-, Rubella- und Mumps- Impfstoffe enthält.
Rota-Impfstoff:
ein Impfstoff, der einen Virus, der in MA-104-Zellen gezüchtet wurde oder aus Faeces der Patienten isoliert wurde, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder teil­ weise enthält, die durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurden.
Mycoplasma-Impfstoff:
ein Impfstoff, der Mycoplasma-Zellen, die in einem flüssigen Kulturmedium für Mycoplasma gezüchtet wurden, oder ein Schutz-Antigen vollständig oder teilweise enthält, die durch Genetic-Engineering-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten wurden.
Die oben erläuterten Impfstoffe liegen in flüssiger oder pulverförmiger Form vor.
Die flüssige Form des Impfstoffes liegt bevorzugt für die intranasale Verabreichung, wie als intranasales Spray, zum Eintropfen oder für die Anwendung oder als Injektion zusammen mit dem Toxin oder seiner Untereinheit, vor. Ein intranasales Versprühen eines Pulvers kann ebenfalls durchgeführt werden. Die Menge der Dosis kann 5 µl∼50 µl intranasal bei Mäusen betragen, und sie beträgt vorzugsweise 0,1∼0,5 ml bei der intranasalen Verwendung oder bei der Injektion bei Menschen. Diese Verabreichungsmengen können je nach Bedarf modifiziert werden.
Das Kombinationsverhältnis von Impfstoff und Toxin oder seiner Untereinheit beträgt 1 : 0,001∼1 : 10 000 (Gew./Vol.-%) und hängt von der Dosismenge beim Menschen ab.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können durch Mischen der oben erläuterten Impfstoffe mit dem Toxin oder der Untereinheit in dem gewünschten Verhältnis hergestellt werden. Die Präparation sollte strikt aseptisch hergestellt werden, und jedes Material sollte ebenfalls aseptisch sein. Pyrogen oder Allergen sollten natürlich so vollständig wie möglich entfernt werden.
Die Impfstoff-Herstellung gemäß der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden, indem man den Impfstoff per se und das Toxin oder seine Untereinheit getrennt herstellt und vor der Impfung vermischt oder indem man beide Stoffe getrennt impft.
Das folgende Bezugsbeispiel erläutert einen erfindungsgemäßen Impfstoff, welcher Influenza-Impfstoff und CT oder CTB enthält, und seine Wirkung.
Bezugsbeispiel
Tier: weibliche Balb/c-Mäuse, 6 bis 8 Wochen alt.
HA-Impfstoff: HA-Impfstoffe wurden aus Influenza-Virus durch Behandlung mit Ether zur Entfernung der Lipid-Bestandteile hergestellt. Die HA-Komponente, ungefähr 30%, ist in dem HA- Impfstoff enthalten. Die Impfstoffmenge, die in den Tabellen 2 bis 5 angegeben wird, wird als Menge an HA angegeben.
CT und CTB: Cholera-Toxin (CT) und seine B-Subeinheit (CTB) wurden von Sigma Chemical Co., USA, gekauft. Die bei den vorliegenden Experimenten verwendete CTB-Präparation zeigt keine nachweisbare Kontamination mit A-Subeinheit, bestimmt gemäß SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
Immunisierung
Eine Impfstoff-Präparation wird durch Verdünnung von HA-Impfstoff oder Adjuvans mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) hergestellt. Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Amobarbital-natrium anästhetisiert und dann durch intranasales Eintropfen mit 20 µl der Impfstoff-Präparation geimpft. Alternativ wurden sie durch subkutane oder intraperitoneale Injektion von 100 µl des Impfstoffes immunisiert.
Serum- und nasale Spülungsproben
Die Serumproben wurden von Mäusen gesammelt, indem Gesamtblut aus ihren Herzen abgezogen wurde. Die nasalen Wasch- bzw. Spülproben wurden durch Waschen der Nasalhöhlen jeweils zweimal mit insgesamt 1 ml PBS erhalten.
Hämagglutinations-Inhibierungs-(HI)-Test
Serum für den HI-Titerassay wurde nach Entfernung der nicht­ spezifischen Inhibitoren durch Rezeptor-Zerstörungsenzym (RED) hergestellt. Das Serum wurde mit der 2fachen Verdünnung auf einer U-Typ-Mikrotiterplatte verdünnt und dann mit Virus von 16 HA-Einheiten vermischt. Die Probe wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurden rote Kükenzellen für die Analyse zugegeben.
Die Ergebnisse wurden nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur während 1 Stunde erhalten.
Assay von Anti-HA-IgA, Anti-CTB-IgA und Gesamt-IgA
Antivirales IgA, Anti-CTB-Antikörper und Gesamt-IgA in der nasalen Spülung und in dem Serum wurden gemäß ELISA gemessen.
Die Vertiefungen einer EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (halbe Fläche, Costar, Cambridge, MA) werden mit entweder 50 µl HA- Impfstoff (5 µg/ml) oder mit CTB (5 µg/ml) beschichtet. Die Platte wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Die PBS-Lösung (100 µl), welche 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% NaN₃ enthielt, wurde in die Vertiefungen zum Beschichten gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS-Tween wurde jede Probe von entweder den Serum- oder nasalen Spülungsproben in die Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit PBS-Tween gewaschen.
Alkalisches-Phosphatase-gekuppeltes Ziegen-Anti-Maus-IgA (α-Kette spezifisch, 1 : 1000, Zymed Laboratories, Inc., USA; 50 µl) wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert und dann mit PBS-Tween gewaschen. Schließlich wurde p-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml, Sigma Co.) in 10%igem Diethanolamin-Puffer bei einem pH-Wert von 9,8 (100 µl) in jede Vertiefung gegeben.
Nach 20 bis 30 Minuten wurde die Absorption der Platten bei 410 nm (OD₄₁₀) in einem SJeia-Auto-Reader (Modell ER-8000, Sanko Junyaku Co., Tokyo) abgelesen. Eine Standardkurve wurde für jede Platte hergestellt. Eine Standard-Regressionskurve, welche durch Logit-Log-Gleichung aufgestellt wurde, wurde für jeden Assay aufgestellt, und die unbekannten Proben wurden unter Verwendung eines Programms an dem SJeia-Auto-Reader interpoliert.
Eine Standard-Anti-HA-IgA-Meßlösung wird als 8-Einheitsstandard für antivirale IgA-Antikörper definiert, die eine nasale Probe von Mäusen ist, welche 5fach wiederholte nasale Impfungen des HA-Impfstoffes mit 2wöchigen Intervallen erhielten. Eine Standard-Anti-CTB-IgA-Meßlösung wird als 8-Einheits­ standard für antivirale IgA-Antikörper definiert, die nasale Proben von Mäusen 4 Wochen nach der nasalen Impfung mit CTB (5 µg) sind.
Das gesamte IgA wurde wie oben erläutert bestimmt, ausgenommen, daß das Ziegen-Anti-Maus-IgA (50 µl, 1 µg/ml) in jede Vertiefung zugegeben wurde. Mäuse-gereinigtes-IgA-Myeloma (Miles Labs. USA) wurde als Standardlösung für die Gesamt- IgA-Messung verwendet.
Infektion mit PR8-Virus in Mäusen
Die Mäuse wurden anästhetisiert und dann durch intranasales Eintropfen von 20 µl Virussuspension, welche 0,01% BSA enthielt, in die linke Nasenhöhle infiziert. Die Virussuspension wurde als 1/5000-∼10 000-Suspension des ursprünglichen Viruspools mit 108,5 EID₅₀ hergestellt, welches durch Inokulation von 148 Übertragungen in Frettchen, 596 Übertragungen in Mäusen und 72 Übertragungen in Mäusen und 72 Übertragungen in embryonierten Eiern hergestellt wurde. Bei diesen Infektions­ bedingungen starben mehr als 90% der nichtimmunisierten Tiere innerhalb von 14 Tagen oder bildeten Konsolidierungen in den Lungen.
Virus-Titration in der Lunge
Drei Tage nach der Infektion wurden die Lungen der Mäuse entfernt, homogenisiert, wobei man eine 10%ige Suspension in PBS erhielt, und dann bei 2500 Upm zentrifugiert. Reihenverdünnungen (1 : 10) des Überstands der einzelnen Lungenhomogenate wurden hergestellt, und jede Verdünnung wurde in 5 embryonierte Eier injiziert. Der Lungenvirus-Titer von jeder Maus wurde gemäß der Hämagglutinationskapazität des allantoischen Fluids bestimmt und durch die niedrigste Verdünnung des Lungen­ homogenats mit EDI₅₀, welches eine Infektion von Eiern ergab, ausgedrückt.
Der Lungenvirus-Titer wurde durch den mittleren ± SD-Wert angegeben. In einigen Versuchen wurden die Lungen von 5 Mäusen in einer Gruppe zur Herstellung der Lungensuspension vereinigt.
Auftreten bzw. Häufigkeit der Infektion
Die Häufigkeit bzw. das Auftreten der Infektion erfolgt durch Werte, die die Zahl der infizierten Mäuse angeben, bei denen der Virus mit <10¹ in dem Lungenhomogenat (10%) pro 5 getesteten Mäusen vorhanden war.
Statistik
Die Wahrscheinlichkeitswerte wurden gemäß dem Studenten-t-Test berechnet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Influenza-HA-Impfstoff-CTB (intranasale Präparation)
Influenza-HA-Impfstoff (1 mg HA/ml) und CTB, welches in PBS gelöst und aseptisch filtriert war, wurden unter Herstellung einer Influenza-HA-Impfstoff-CTB intranasalen Lösung (20 µl), welche Influenza-HA-Impfstoff (1,5∼2 µg) und CTB (3,5∼250 µg) zusammen mit zugegebenen Konservierungsstoffen und Stabilisatoren enthielt, vermischt und in Flaschen gefüllt. Die Impfstoff- Präparation wurde an einem dunklen und kalten Ort unter 10°C gelagert. Die Wirkung der Impfstoff-Präparation wird im folgenden erläutert.
Beispiel 2 Influenza-HA-Impfstoff-CTB (Injektion)
Influenza-HA-Impfstoff (1 mg HA/ml) und CTB, welches in PBS gelöst und aseptisch filtriert war, wurden vermischt, wobei eine Influenza-HA-Impfstoff-CTB injizierbare Lösung (0,5 ml) erhalten wurde, welche Influenza-HA-Impfstoff (1,5∼2 µg) und CTB (2,5∼250 µg) zusammen mit zugesetzten Konservierungs­ stoffen und Stabilisatoren enthielt. Die Lösung wurde in Ampullen abgefüllt. Die Impfstoff-Präparation wird an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert. Die Wirkung der Impfstoff-Präparation wird im folgenden erläutert.
Beispiel 3 Hepatitis-B-Impfstoff-CTB (Injektion)
Hepatitis-B-Impfstoff-CTB für die Injektion wurde durch Ver­ mischen von Hepatitis-B-Impfstoff und CTB, welches in PBS gelöst und aseptisch filtriert war, hergestellt. Es wurde ein Gemisch hergestellt, welches HBs-Antigen (40 µg Protein) und CTB (2,5∼250 µg) in 20 µl Lösung zusammen mit zugegebenen Konservierungsstoffen und Stabilisatoren enthielt. Das Gemisch wurde in Ampullen abgefüllt. Die Impfstoff-Präparation wird an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Die so hergestellte Hepatitis-B-Impfstoff-Präparation und CT werden zum Inokulieren von Mäusen verwendet, und der Serum- Titer wurde 3 Wochen nach der Impfung gemessen.
Aus der Tabelle folgt, daß Mäuse, welche Hepatitis-B-Impfstoff erhielten, einen passiven Hämagglutinations-(PHA)-Titer von 25,6 Einheiten zeigten und Mäuse, welche zusätzlich CT er­ hielten, einen PHA-Titer von 26,6 Einheiten zeigten, und daraus folgt, daß die Antikörperbildung verstärkt war.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von CT bei Hepatitis-B-Impfstoff
Der Antikörper-Titer wurde durch den passiven Hämagglutinationstest gemessen. Die Antikörper-Titer sind von durchschnittlich 5 Mäusen angegeben.
Beispiel 4 Pertussis-Impfstoff-CTB (intranasal)
Pertussis-Impfstoff und CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, wurden vermischt, wobei eine Pertussis-Impfstoff-CTB- Präparation für die intranasale Verabreichung erhalten wurde. Das Gemisch aus Pertussis-Impfstoff (14 µg Protein-Stickstoff) und CTB (25∼250 µg) in 20 µl wurde zusammen mit Konservierungs­ stoffen und Stabilisatoren in eine Flasche abgefüllt. Das Produkt wurde an einem dunklen und kühlen Platz unter 10°C gelagert.
CTB oder CT wurden zu dem Pertussis-Impfstoff, 20 µl (13 µg Protein-Stickstoff), zugegeben, und dann wurden Mäuse intranasal inokuliert. Nach 4 Wochen wurde die gleiche Impfstoffmenge Mäusen intranasal verabreicht, und die Antikörper-Titer wurden bestimmt.
Wie es aus der Tabelle folgt, zeigen Mäuse, welche Pertussis- Impfstoff alleine erhalten haben, einen Anti-PT-Antikörper von <4,1 Einheiten und welche Pertussis-Impfstoff zusammen mit CTB oder CT erhalten haben, zeigen einen Anti-PT-Antikörper von 140,3 Einheiten bzw. 232,5 Einheiten. Anti-FHA- Antikörper von Mäusen, welche mit Impfstoff alleine unter Zugabe von CTB oder CT inokuliert waren, betrugen <2,6 Einheiten, <32,0 Einheiten bzw. 43,9 Einheiten. Die Antikörperbildung wurde bei Mäusen verstärkt, wenn Impfstoff und CTB oder CT verabreicht wurden.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Pertussis-Impfstoff unter Zugabe von CT oder CTB
Beispiel 5 Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit Pertussis-Impfstoff-CTB (intranasal)
Eine Diphtherie- und Tetanus-Toxoid-Pertussis-Impfstoff-CTB- Kombinationspräparation für die intranasale Anwendung wurde durch Vermischen eines Diphtherie- und Tetanus-Toxoids mit einem Pertussis-Impfstoff (im folgenden als Kombinations- Impfstoff bezeichnet) mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) des Kombinations-Impfstoffs (50 µg Protein-Stickstoff) und CTB (2,5∼250 µg) und zugesetzten Konservierungsstoffen und Stabilisatoren hergestellt und in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
CTB wurde dem Kombinations-Impfstoff zugegeben, dann wurden Mäuse intranasal inokuliert bzw. geimpft, und nach 4 Wochen wurde die gleiche Menge Impfstoff verabreicht, dann wurden die Antikörper-Titer gemessen.
Aus der Tabelle folgt, daß Mäuse, die den Kombinations- Impfstoff alleine erhielten, Anti-Pertussis-Toxin-(PT)-Antikörper- <2,0-Einheiten, Anti-Diphtherie-(DT)-Antikörper-<1,5-Einheiten und Anti-Tetanus-Toxoid-(TT)-<1,5-Einheiten enthielten. Die Antikörperbildung wurde durch Zugabe von CTB zu 150,0, 110,5 bzw. 120,0 Einheiten, wie oben angegeben, verstärkt.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von CTB zu dem Kombinations-Impfstoff
Beispiel 6 Japan-Encephalitis-Impfstoff-CTB (Injektion)
Japan-Encephalitis-Impfstoff-CTB (für die Injektion) wurde hergestellt durch Vermischen von Japan-Encephalitis-Virus- Impfstoff mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert. Es wurde ein Gemisch (1 ml) aus inaktivierten Virusteilchen entsprechend Japan-Encephalitis 107,0 PFU und CTB (10,0∼0 µg) und Konservierungsstoffen und Stabilisatoren hergestellt, und dieses wurde in Ampullen abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Japan-Encephalitis-Impfstoff zusammen mit oder ohne CTB oder CT wurde zum 2fachen Impfen von Mäusen mit 1wöchigen Intervallen verwendet, und der Serum-Antikörper-Titer wurde gemessen.
Die Neutralisations-Antikörper-Titer von Japan-Encephalitis- Virus mit oder ohne CTB oder CT betrugen 101,88, <102,58 bzw. <102,20, und die Antikörperbildung wurde durch Zugabe von CTB oder CT zu dem Impfstoff verstärkt.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von CT oder CTB zu dem Japan-Encephalitis-Impfstoff
Beispiel 7 Masern-Impfstoff-CTB (intranasal)
Eine Präparation aus Masern-Impfstoff-CTB für die intranasale Anwendung wurde durch Mischen von Masern-Impfstoff mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend Masern- Impfstoff (20 µl) und CTB (5 µg) und zugegebenem Konservierungs­ mittel und Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Platz unter 10°C gelagert.
Der Masern-Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum 2fachen Inokulieren von Mäusen in einem Intervall von 3 Wochen verwendet. Die Serum-Antikörperbildung wurde gemessen.
Der ELISA-Antikörper-Titer beträgt, wenn der Masern-Impfstoff alleine verwendet wird, 0,144 und der von Impfstoff und zugegebenem CTB beträgt <0,209. Die Verstärkung der Antikörper­ bildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff mit CTB verabreicht wurde.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von CTB zu Masern-Impfstoff
Beispiel 8 Rubella-Impfstoff-CTB (intranasal)
Eine Rubella-Impfstoff-CTB-Präparation für die intranasale Anwendung wurde durch Vermischen von Rubella-Impfstoff mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend Rubella-Impfstoff (20 µl) und CTB (5 µg) und unter Zugabe von Konservierungsstoffen und Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Rubella-Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum zweimaligen Impfen von Mäusen mit einem 3wöchigen Intervall verwendet. Es wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Verabreichung von Rubella-Impfstoff alleine 0,095, und bei der Zugabe von CTB zu dem Impfstoff betrug er <0,920. Die Verstärkung der Antikörperproduktion wurde beobachtet, wenn der Impfstoff mit CTB verabreicht wurde.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von CTB zu Rubella-Impfstoff
Beispiel 9 Mumps-Impfstoff-CTB (intranasal)
Eine Präparation für die intranasale Verabreichung aus Mumps- Impfstoff-CTB wurde durch Mischen von Mumps-Impfstoff mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend dem Mumps-Impfstoff (20 µl) und CTB (5 µg) unter Zugabe von Konservierungs­ stoffen und Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Der Mumps-Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum zweimaligen Impfen von Mäusen mit einem 3wöchigen Intervall verwendet, und dann wurde die Serum-Antikörperproduktion gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver­ abreichung von Mumps-Impfstoff alleine 0,028, und bei der Zugabe von CTB zu dem Impfstoff betrug er <0,045. Die Verstärkung der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn Impfstoff mit CTB verabreicht wurde.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von CTB zu Mumps-Impfstoff
Beispiel 10 Kombinations-Impfstoff für Masern-, Rubella- und Mumps-CTB (intranasal)
Eine Präparation für die intranasale Anwendung aus einem Kombinations- Impfstoff für Masern-, Rubella- und Mumps-CTB wurde durch Mischen des Kombinations-Impfstoffes mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend einem Masern- Impfstoff (7 µg), Rubella-Impfstoff (1 µg) und Mumps-Impfstoff (7 µg) und CTB (5 µg) unter Zugabe von Konservierungs­ stoffen und Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Der Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum zweimaligen Impfen von Mäusen mit einem 3wöchigen Intervall verwendet, und dann wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver­ abreichung des Impfstoffes alleine 0,14, 0,09 bzw. 0,15 für Masern, Rubella und Mumps, und der des Impfstoffes mit zugegebenem CTB betrug 0,29, 0,30 bzw. 0,24. Die Verstärkung der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff mit CTB verabreicht wurde.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von CTB zu einem Kombinations-Impfstoff für Masern, Rubella und Mumps
Beispiel 11 Rota-Impfstoff-CTB (oral und intranasal)
Eine Präparation aus Rota-Impfstoff und CTB für die orale und intranasale Anwendung wurde durch Mischen von Rota-Impfstoff mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend Rota-Impfstoff (3,3 µl) und CTB (5 µg) unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt, und das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Rota-Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum zweimaligen Inokulieren von Mäusen mit einem 3wöchigen Intervall verwendet, und dann wurde die Antikörperproduktion gemessen.
Der ELISA-Antikörper-Titer betrug für den verabreichten Impfstoff alleine 0,089 bei der intranasalen Anwendung, und unter Zugabe von CTB zu dem Impfstoff betrug er 0,281 und 0,018 bei der oralen Verabreichung und 0,277 bei der Zugabe von CTB zu dem Impfstoff bei oraler Verabreichung.
Die Verstärkung der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff mit CTB verabreicht wurde.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von CTB zu Rota-Impfstoff
Beispiel 12 Mycoplasma-Impfstoff-CTB (Injektion)
Eine injizierbare Präparation aus Mycoplasma-Impfstoff und CTB wurde durch Vermischen von Mycoplasma-Impfstoff mit CTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (1 ml) aus Mycoplasma entsprechend dem Impfstoff (2,0 × 10¹⁰ CFU) (koloniebildende Einheit) und CTB (10 µg) unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt, und das Gemisch wurde in eine Ampulle abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Der Impfstoff mit oder ohne CTB wurde zum dreimaligen Inokulieren von Küken mit 2wöchigen Intervallen verwendet. Es wurde die Zahl der Läsionen nach dem Angriff von Mycoplasma- Infektion beobachtet.
Die Verabreichung von Impfstoff und CTB zeigte eine ausgeprägte Schutzwirkung, verglichen mit der Verabreichung von Impfstoff alleine.
Tabelle
Abnahme der Läsionen nach dem Angriff der Mycoplasma-Infektion bei der Verabreichung von Mycoplasma-Impfstoff mit CTB
Beispiel 13 Pertussis-Impfstoff-LTB (intranasal)
Eine Präparation aus Pertussis-Impfstoff-LTB für die intranasale Verabreichung wurde durch Vermischen von Pertussis-Impfstoff mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Pertussis-Impfstoff (14 µg Protein-Stickstoff) und LTB (2,5∼250 µg) unter Zugabe von Konservierungsstoffen und Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Platz unter 10°C gelagert.
LTB oder LT wurde zu dem Pertussis-Impfstoff, 20 µl, (13 µg Protein-Stickstoff) zugegeben, und dann wurden Mäuse intranasal geimpft. Nach 4 Wochen wurde die gleiche Impfstoffmenge intranasal den Mäusen verabreicht, und die Antikörper-Titer wurden bestimmt.
Aus der Tabelle ist erkennbar, daß Mäuse, welche Pertussis- Impfstoff alleine erhielten, einen Anti-PT-Antikörper von <4,2 Einheiten zeigten und solche, welche Pertussis-Impfstoff zusammen mit CTB oder CT erhielten, zeigten einen Anti-PT- Antikörper von 150,3 Einheiten bzw. 230,5 Einheiten. Die Anti-FHA- Antikörper von Mäusen, die mit dem Impfstoff alleine bzw. unter Zugabe von CTB oder CT geimpft wurden, betrugen <2,3 Einheiten, <30,0 Einheiten bzw. 40,5 Einheiten. Die Antikörper­ bildung wurde bei Mäusen verstärkt, wenn der Impfstoff und LTB oder LT verabreicht wurden.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung mittels Pertussis-Impfstoff unter Zugabe von LT oder LTB
Beispiel 14 Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit Pertussis-Impfstoff-LTB (intranasal)
Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, kombiniert mit Pertussis-Impfstoff- LTB-Präparation für die intranasale Anwendung wurde durch Vermischen eines Diphtherie- und Tetanus-Toxoids, kombiniert mit Pertussis-Impfstoff (im folgenden als Kombinations- Impfstoff bezeichnet) mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Kombinations-Impfstoff (50 µg Protein-Stickstoff) und LTB (2,5∼250 µg) unter Zugabe von Konservierungsmitteln und Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
LTB wurde zu dem Kombinations-Impfstoff zugegeben, dann wurden Mäuse intranasal inokuliert, und nach 4 Wochen wurde die gleiche Impfstoffmenge erneut verabreicht, und dann wurden die Antikörper-Titer gemessen.
Aus der Tabelle folgt, daß Mäuse, die den Kombinations-Impfstoff alleine erhielten, Anti-Pertussis-Toxin-(PT)-Antikörper von <1,8 I.E., Anti-Diphtherie-(DT)-Antikörper von <1,4 Einheiten und Anti-Tetanus-Toxoid-(TT) von 1,2 Einheiten zeigten. Die Antikörperbildung wurde um 0,3 durch Zugabe von LTB auf 140,0, 80,5 bzw. 100,5 I.E. vergrößert.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von LTB zu dem Kombinations-Impfstoff
Beispiel 15 Rubella-Impfstoff-LTB (intranasal)
Eine Präparation für die intranasale Anwendung aus Rubella- Impfstoff und LTB wurde durch Mischen von Rubella-Impfstoff mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend dem Rubella-Impfstoff (3 µg) und LTB (5 µg) unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Rubella-Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum zweimaligen Inokulieren von Mäusen mit 3wöchigen Intervallen verwendet. Es wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver­ abreichung von Rubella-Impfstoff alleine 0,133, und bei der Zugabe von LTB zu dem Impfstoff betrug er <0,854. Die Verstärkung der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn Impfstoff mit LTB verabreicht wurde.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von LTB zu Rubella-Impfstoff
Beispiel 16 Masern-Impfstoff-LTB (intranasal)
Eine Präparation für die intranasale Anwendung aus Masern- Impfstoff und LTB wurde durch Mischen von Masern-Impfstoff mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend Masern-Impfstoff (20 µg) und LTB (5 µg) unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Der Masern-Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum zweimaligen Impfen von Mäusen mit 3wöchigen Intervallen verwendet, und dann wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver­ abreichung von Masern-Impfstoff alleine 0,182, und bei der Zugabe von LTB zu dem Impfstoff betrug er <0,332. Die Verstärkung der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff mit LTB verabreicht wurde.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von LTB zu Masern-Impfstoff
Beispiel 17 Mumps-Impfstoff-LTB (intranasal)
Eine Präparation für die intranasale Verabreichung von Mumps- Impfstoff und LTB wurde hergestellt durch Mischen von Mumps- Impfstoff mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend Mumps- Impfstoff (20 µg) und LTB (5 µg) unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Mumps-Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum zweimaligen Inokulieren von Mäusen mit 3wöchigen Intervallen verwendet, und dann wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver­ abreichung von Mumps-Impfstoff alleine 0,023, und bei der Zugabe von LTB zu dem Impfstoff betrug er <0,074. Die Verstärkung der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff mit LTB verabreicht wurde.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von LTB zu Mumps-Impfstoff
Beispiel 18 Kombinations-Impfstoff für Masern-, Rubella- und Mumps-LTB (intranasal)
Es wurde eine Präparation aus einem Kombinations-Impfstoff für Masern, Rubella und Mumps und LTB für die intranasale Ver­ abreichung hergestellt, indem der Kombinations-Impfstoff mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, vermischt wurde. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend Masern-Impfstoff (7 µg), Rubella-Impfstoff (1 µg) und Mumps- Impfstoff (7 µg) und LTB (5 µg) unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt, und das Gemisch wurde in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Der Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum zweimaligen Impfen von Mäusen mit 3wöchigen Intervallen verwendet, und dann wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver­ abreichung des Impfstoffes alleine 0,18, 0,07 bzw. 0,13 für Masern, Rubella und Mumps, und bei der Zugabe von LTB zu dem Impfstoff betrug er 0,34, 0,27 bzw. 0,28. Die Verstärkung der Antikörperbildung wurde beobachtet, wenn der Impfstoff mit LTB verabreicht wurde.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von LTB zu einem Kombinations-Impfstoff für Masern, Rubella und Mumps
Beispiel 19 Rota-Impfstoff-LTB (peroral und intranasal)
Es wurde eine Präparation aus Rota-Impfstoff und LTB für die orale und intranasale Verabreichung hergestellt durch Ver­ mischen von Rota-Impfstoff mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert. Es wurde ein Gemisch (20 µl) aus Virusteilchen entsprechend dem Rota-Impfstoff (3,3 µg) und LTB (5 µg) unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt und in eine Flasche abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Der Rota-Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum zweimaligen Impfen von Mäusen mit 3wöchigen Intervallen verwendet, und dann wurde die Serum-Antikörperbildung gemessen.
Der gemäß ELISA bestimmte Antikörper-Titer betrug bei der Ver­ abreichung des Impfstoffes alleine 0,063 bei der intranasalen Verabreichung, und bei der Zugabe von LTB zu dem Impfstoff betrug er 0,348. Bei der oralen Verabreichung betrug er 0,024 für den Impfstoff alleine 0,177 für den Impfstoff unter Zugabe von LTB bei der oralen Verabreichung.
Die Verstärkung der Antikörperbildung wurde bei der Verabreichung des Impfstoffes mit LTB beobachtet.
Tabelle
Verstärkung der Antikörperbildung durch Zugabe von LTB zu Rota-Impfstoff
Beispiel 20 Mycoplasma-Impfstoff-LTB (Injektion)
Eine injizierbare Präparation aus Mycoplasma-Impfstoff und LTB wurde durch Mischen von Mycoplasma-Impfstoff mit LTB, gelöst in PBS und aseptisch filtriert, hergestellt. Es wurde ein Gemisch (1 ml) aus Mycoplasma entsprechend dem Impfstoff (2,0 × 10¹⁰ CFU) (koloniebildende Einheit) und LTB (10 µg) unter Zugabe von Stabilisatoren hergestellt. Das Gemisch wurde in eine Ampulle abgefüllt.
Die Präparation wurde an einem dunklen und kühlen Ort unter 10°C gelagert.
Der Impfstoff mit oder ohne LTB wurde zum dreimaligen Impfen von Küken mit 2wöchigen Intervallen verwendet. Es wurde die Zahl der Läsionen nach dem Angriff der Mycoplasma-Infektion beobachtet.
Die Verabreichung von Impfstoff unter Zugabe von LTB zeigte eine verbesserte Schutzwirkung, verglichen mit der von dem Impfstoff alleine.
Tabelle
Abnahne der Läsionen nach dem Angriff von Mycoplasma-Infektion bei der Verabreichung von Mycoplasma-Impfstoff mit LTB
Erläuterung der Zeichnungen:
Fig. 1A∼1D: Zeitverlauf der primären Antikörperbildung bei der Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffes; und
Fig. 2: Zahl der Infektions-Läsionen in der Lunge nach der Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffes.

Claims (8)

1. Impfstoff-Präparation, dadurch gekennzeichnet, daß sie als wirksame Komponente ein Toxin oder seine Subeinheit enthält.
2. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Toxin ein Bakterien- Toxin ist.
3. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterien-Toxin Cholera- Toxin, Staphylokokken-α-Hämolysin, Staphylokokken-δ-Hämolysin, thermostabiles direktes Vibrio-Hämolysin, Pertussis-Toxin oder E. coli-wärmelabiles-Toxin ist.
4. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Subeinheit eine B-Subeinheit oder ein Teil einer B-Subeinheit ist.
5. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff ein Influenza- Impfstoff, ein Pertussis-Impfstoff, ein Japan-Encephalitis- Impfstoff, ein Kombinations-Impfstoff für Pertussis-, Diphtherie- und Tetanus-Toxoid, ein Hepatitis-B-Impfstoff, ein Rota-Impfstoff, ein Masern-Impfstoff, ein Rubella- bzw. Röteln-Impfstoff, ein Mumps-Impfstoff, ein Kombinations-Impfstoff für Masern, Rubella und Mumps oder ein Mycoplasma-Impfstoff ist.
6. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mischverhältnis von Impfstoff und Toxin oder seiner Subeinheit 1 : 0,0001∼1 : 10 000 (Gew./Vol.) beträgt.
7. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als intranasaler Impfstoff vorliegt.
8. Impfstoff-Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in injizierbarer Form, in Sprayform oder in einer für die orale Verabreichung geeigneten Form vorliegt.
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