DE2423129A1

DE2423129A1 - Verfahren zur herstellung temperaturempfindlicher, nicht pathogener mutantenstaemme von rinder-adeno-virusstaemmen und diese virusstaemme enthaltende lebendvakzine

Info

Publication number: DE2423129A1
Application number: DE2423129A
Authority: DE
Inventors: Constant Huygelen; Nathan Zygraich
Original assignee: Recherche Et Industrie Therapeutiques Rit Genval (belgien); RIT RECH IND THERAPEUT
Current assignee: Smithkline Beckman - Animal Health Products Sa
Priority date: 1973-05-14
Filing date: 1974-05-13
Publication date: 1974-12-05
Also published as: AR203646A1; JPS5052226A; ES426215A1; GB1430711A; JPS5710845B2; DE2423129C2; CA1039186A; US3927208A; IE40924L; AU6888474A; DD112663A5; HU169758B; IE40924B1; NL7406407A; CH589141A5; FR2229398B1; DE2463143C2; FR2229398A1

Description

Case: Zygraich-Huygelen Case 2-3

RECHERCHE ET INDUSTRIE THERaPEUTIQUES, R.I.T., . Genval, Belgien

¹¹ Verfahren zur Herstellung temperaturempfindlicher, nichtpathogener Mutantenstämme von Rinder-Adeno-Virusstämmen und diese Virusstämme enthaltende Lebendvakzine "

Priorität: 14. Mai 1973, V.St.A., Nr. 360 219· 31. Januar 197.4, V.St.A., Nr. 438 503

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung temperaturempfindlicher, nicht-pathogener Mutantenstämmen aus einem pathogenen Rinder-Adeno-Virusstamm und Lebendvakzine, die diese temperaturempfindlichen Mutantenstämme enthalten.

Im wesentlichen wird die in vitro Vermehrungsfähigkeit bzw.

Virus-Replikation eines temperaturempfindlichen (ts)/?'Iutantenstammes durch die Temperatur begrenzt, die unterhalb des Temperaturwertes (cut off temperature; Hemmtemperatur) liegt, bei der die Infektiosität v/esentlich vermindert ist. Obwohl in vitro erhaltene Ergebnisse nicht ohne weiteres auf in vivo Bedingungen übertragen werden können, wird in einigen Veröffentlichungen angedeutet, daß ts-Mutanten sich in vivo anders verhalten als Wildviren-; vgl. B.R. Murphy, E.G. Chalhud,. S.R. Nusinoff und

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R.M. Chanock, J.of Inf.Dis., Bd. 126, Nr. 2 (1972) Seiten 170 bis 178.

Dieses Phänomen wurde bei der Entwicklung einiger Lebendvirusvakzine gegen Erkrankungen der Atmungswege angewendet. Unter besten ts-Bedingungen sollte eine ts-Mutante mit einer Hemmtemperatur im Bereich der normalen Körpertemperatur fähig sein, sich in der Schleimhaut der oberen Atmungswege (in denen die Temperatur mehrere C° niedriger ist als in den unteren Atmungswegen und im Körper) zu vermehren, während ihre Vermehrung teilweise oder völlig in den unteren Atmungswegen und im Körper inhibiert würde. Versuche mit Labortieren und mit Menschen haben gezeigt, daß - wenigstens für einige Viren, die für die Erkrankung der Atemwege verantwortlich sind - diese theoretische Überlegung durch Versuche bestätigt wurden; vgl. z.B. N. Zygraich, M. Lobmann und C. Huygelen, J. Hyg. Camb., Bd. (1972), Seiten 229 bis 234. Trotzdem und insbesondere wegen der hohen Spezifizität, die auf diesem Gebiet existiert, war es keineswegs naheliegend, daß das gleiche Prinzip auch auf andere Viren angewendet werden könnte, insbesondere für Rinder-Adeno-Viren, wie Adeno-3-Virus, um Mutanten-Stämme zu bilden, die für die Herstellung von immunogenen und nicht-pathogenen Rinder-Adeno-Virus-Lebendvakzinen von Wichtigkeit sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die bisher mit der Herstellung von Rinder-Adeno-Virus-Lebendvak-zinen verbundenen Schwierigkeiten, d.h. die Pathogenität und die Nebenwirkungen, die durch die Rinder-Adeno-Viren in den Atmungswegen und im Verdauungstrakt ader im Auge hervorgerufen wurden, zu vermeiden.

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Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß durch, mutagene Behandlung unter sehr spezifischen Bedingungen von Rinder-Adeno-Viren, beispielsweise Rinder-Adeno-3-Virus, Rinder-Adeno-Viren-Mutantenstämme mit einer Hemmtemperatur von 39 bis 40⁰C isoliert werden können, die insbesondere für die Verwendung oder Herstellung von Vakzinen geeignet sind, da sie gleichzeitig genetisch stabil, immunogen und nichtpathogen sind und weil bei Verabreichung an empfindliche Tiere keine nachweisbaren Nebeneffekte auftreten.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vakzine liegt in der Art ihrer Verabreichung. Die erfindungsgemäßen Vakzine werden intranasal verabreicht; die verwendeten Rinder-Adeno-Virus-· stamme vermehren sich nur lokal, in den oberen Atmungswegen der Tiere, ohne daß eine nachweisbare VirusVermehrung im Organismus in den wärmeren Temperaturbereichen, d.h. in den inneren Organen der Tiere auftritt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung teraperaturempfindlicher, nicht-pathogener Mutantenstämme aus einem pathogenen Rinder-Adeno-Virusstamm, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Rinder-Adeno-Virusstamm bei Raumtemperatur mit einer gepufferten wäßrigen Lösung von salpetriger Säure mit einem pH-Wert von 4,2 bis 5 behandelt und aus der Lösung durch wenigstens eine Endverdünnungspassage in einer üblichen Gewebekultur, die sowohl für das Wachstum des Virus und auch als Substrat für die Vakzinherstellung geeignet ist, einen temperaturempfindlichen Stamm von Rinder-Adeno-Virus mit

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'- 4 einer Hemmtemperatur von 39 bis 40°C isoliert.

Zur Herstellung der nicht-pathogenen Mutantenstämme, die gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Vakzinen geeignet sind, wird entweder ein Rinder-Adeno-Virusstamm, wie ein Rinder-Adeno-3-Virusstamm, direkt aus einem klinischen Material isoliert oder es kann ein Rinder-Adeno-Virusstamm verwendet werden, der am Ende von Serienpassagen in Gewebekulturen von beispielsweise primären Rindernieren (PBK)-Zellkulturen, z.B. dem WBR I Stamm, der von J.H. Darbyshire et al., Nature, Bd. 208 (1965), S. 307 bis 308, beschrieben ist, oder primären foetalen Rindernieren (PFBK)-Zellkulturen als Ausgangsmaterial erhalten wird.

Erfindungsgemäß wird die' zur Induktion der temperaturempfindlichen Mutantenstämme erforderliche mutagene Behandlung so durchgeführt, daß man einen Rinder-Adeno-Virus, wie einen Adeno—3-Virusstamm, bei Raumtemperatur mit einer gepufferten wäßrigen Lösung von salpetriger Säure mit einem pH-Wert von 4,2 bis 5 behandelt. Die gepufferte wäßrige Lösung der salpetrigen Säure ist vorzugsweise salpetrige Säure in Acetaipuffer. Die Konzentration der salpetrigen Säure ist vorzugsweise 1 normal und der Acetationen im Reaktionsmedium 0,25 normal. Die Behandlung wird 2 bis 5 + 1 Minuten bei einem pH-Wert von 4,2 j_ 0,1 bis 15 bis 25 + 1 Minuten bei einem pH-Wert von 5 ± o,l durchgeführt. Beispielsweise beträgt die Behandlung 15 + 1 Minuten bei einem pH-Wert von 4,6 +^ 0,1.

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Es ist offensichtlich, daß die pH-Werte und Temperaturbedingungen voneinander abhängen, aber die Grenzen der vorgenannten Bedingungen sind so, daß eine anfängliche Viruspopulation

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von etwa 10 auf etwa 10 nach der mutagenen Behandlung vermindert wird und daß' die Induktion der temperaturempfindlichen Mutantenstämme mit einer Hemmtemperatur von 39 bis 40⁰C eintritt.

Die so erhaltenen temperaturempfindlichen (ts) Mutantenstämme werden durch wenigstens eine Endverdünnungspassage in einer üblichen Gewebekultur isoliert, die sowohl das Wachstum des Virus als auch als Substrat für die Vakzinherstellung geeignet ist, wie beispielsweise Rindernieren-Zellkulturen.

Beispielsweise kann die Isolierung durch wenigstens eine Endverdünnungspassage in primären foetalen Rindernieren (PFBK)-Zellkultüren bei 30 + 1⁰C während eines Zeitraums von 10 bis 20 Tagen, vorzugsweise während 14 ± 1 Tagen durchgeführt v/erden.

Die isolierten Stämme werden dann gegebenenfalls in einer üblichen Gewebekultur weiterpassagiert, die das Wachstum des Rinder- Adeno-Virus begünstigt, wie beispielsweise Rindernieren-Zellkulturen und insbesondere primäre foetale Rindernieren-Zellkulturen, beispielsweise 2 oder 3mal in primären foetalen Rindernieren (PFBK)-Zellkulturen, um dabei eine wesentliche Menge der temperaturempfindlichen Mutantenstämme zu erhalten.

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Als Ausgangsmaterial eignet sich beispielsweise ein pathogener Stamm von Rinder-Adeno-3-vicus, der aus dem Y/BR.1-Stamm nach 7 Reihenpassagen in primären foetalen Rindernieren-Zellkulturen erhalten wurde und der nachstehend als WBR i/7-Stamm bezeichnet wird. Ein genetisch stabiler nicht-pathogener Stamm von Rinder-Adeno-j5-Virus, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde, hat in der Sammlung der Anmelderin die Bezeichnung Eunice-Stamm erhalten.

Die temperaturempfindlichen Rinder-Adeno-Virusstärame, die erfindungsgemäß erhalten werden, wie der Eunice-Stamm, zeigen keinen wesentlichen Verlust an Immunogenität gegenüber dem als Ausgangsmaterial verwendeten Rinder-Adeno-Virusstamm; sie sindtemperaturempfindlich und nicht-pathogen und sind zur Herstellung und zur Verwendung von Rinder-Adeno-Virus-Lebendvakzine geeignet, wobei jedes bekannte Verfahren zur Herstellung und Stabilisierung von Vakzinen angewendet werden kann. Demgemäß betrifft die Erfindung Rinder-Adeno-Virus-Lebendvakzine, wie beispielsweise Adeno-3-Virusvakzine, die wenigstens einen Rinder-Adeno-Virusstamm enthalten, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Induktion erhalten und als temperaturempfindlicher Rinder-Adeno-Virus-Mutantenstamm isoliert wurde, sowie ein Verfahren zur Herstellung der Vakzine aus diesem Mutantenstamm.

Gemäß dieser Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Rinder-Adeno-Virus-Lebenüvakzins, beispielsweise eines Adeno-J5-Virus vakzins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen temperaturempfindlichen Rinder-

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Adeno-Virus mit einer Hemmtemperatur von 39 his 40⁰C in einer üblichen Gewebekultur, die für das Wachstum von Rinder-Adeno- · Virus geeignet ist, wie primäre foetale Rindernieren (PFBK)-Zellkultüren, bei einer Temperatur von höchstens 37 £ 1⁰C und vorzugsweise etwa 35 +, 1⁰C inkubiert und das erhaltene Virusmaterial erntet. Vorzugsweise wird der temperaturempfindliche und nicht-pathogene Rinder-Adeno-3-Virus verwendet.

Um die Herstellung der Vakzine in industriellem Umfange und in vielen Ansätzen durchzuführen, kann der vorgenannte Verfahrensschritt zur Herstellung einer großen Menge des Virusmaterials offensichtlich mehr als eine Passage umfassen, wobei eine oder mehrere Zwischenstufen durchgeführt werden, um die Herstellung von Virus-Einsaatmaterial zur Herstellung von Vakzinansätzen durchzuführen.

Die erhaltenen Rinder-Adeno-Virus-Leberidvakzine v/erden lokal in den Nasen-Rachen-Raum in einer Dosis von wenigstens 10 ' TCIDcq (Gewebekultur-infektiöse Dosis 50 Prozent) und vorzugsweise von wenigstens 1Cr' ^J TCID™ für Adeno-3-Virus verabreicht.

Zur Herstellung von Impfstoff wird das Virus vorzugsweise in lyophilisierter Form aufbewahrt. Aus dem lyophilisierten Produkt erfolgt die Wiederherstellung der Vakzine unter Zugabe von V/asser oder jedem anderen bekannten pharmaktflogisch verträglichen Verdünnungsmittel, das zur Herstellung von in die Nase verabreichbaren Präparaten, wie Sprühmittel, verwendet werden kann.

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Die Erfindung betrifft somit

(1) Rinder-Adeno-Virus-Lebendvakzine, wie Rinder-Adeno~3-Virus-Lebendvakzine, die als aktiven Bestandteil ein temperaturempfindliches Rinder-Adeno-Virus mit einer Hemmtemperatur von 39 bis 40⁰C enthalten, wie den Rinder-Adeno-3-Virus-Eunice-Stamm, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden ist, und

(2) polyvalente Rindervirus-Lebendvakzine für die Behandlung der Atemwege, die intranasal verabreicht werden und die als aktive Bestandteile das temperaturempfindliche Rinder-Adeno-Virus-Lebendvakzin und wenigstens ein anderes lebendes Rindervirus für die Atmungsorgane, v/ie infektiöses Rinder-Rhinotracheitis-Virus und/oder Rinder-Parainfluenza-3-Virus-Vakzin, das für intranasale Verabreichung geeignet ist, enthalten .

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Rinder-Adeno-3-Virus WBR i/7-Stamm v/ird in Gewebekulturen in Eagle-Minimalerhaltungsmedium (MEM) zu einer Virussuspension suspendiert, die 1O⁶'⁵ TCID₅₀ enthält.

1 ml dieser Virussuspension wird mit 0,5 ml einer 4molaren wäßrigen Natriumnitritlösung in 0,5 ml einer Imolaren Essigsäure/Natriumacetatpufferlösung vermischt. Dieser Puffer wurde durch * Vermischen von 6 g Eisessig mit destilliertem Wasser bis zu einem Volumen von 100 ml und 3 Volumina einer Lösung von 13,6 g Natriumacetat in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Beide

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Lösungen wurden 30 Minuten bei 121⁰C sterilisiert. Der End-pH-Wert beträgt 4,6.

Das Gemisch wird 15 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Die ' Reaktion wird dann durch tropfenweise Zugabe von 1n Natronlauge unter Rühren bis zu einem pH-Wert von 7»5 ±0,5 beendet. Die pH-Einstellung wird mit· Hilfe der Farbänderung des in der Virussuspension enthaltenen Phenolrot-Indikators verfolgt.

Das Medium wird dann sofort 5 Stunden bei +4 +.1⁰C gegen phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung dialysiert. (Diese Lösung besteht aus 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO^, 0,2 g KH₂PO^ in destilliertem Wasser (bis auf 800 ml), vermischt mit einer Lösung von MgCl₂ ¹OH₂O in 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaCl₂ in 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration sterilisiert; der End-pH-Wert liegt bei 7,2 bis 7,4). Die phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung wird mehrmals bis zur Entfernung der Nitritionen erneuert. Eine Probe wird titriert und das Virusmaterial bei -70⁰C aufbewahrt. Die Titration wird mittels der Röhrchen-Endpunkt-Verdünnungsmethode in primären foetalen Rindernieren-Gewebekulturen bei der unerlaubten Temperatur von 39 + '1⁰C unter Verwendung von 2 Röhrchen pro Verdünnung durchgeführt.

Nach 2wöchiger Inkubation wird der Titer bestimmt und die bei -70°C aufbewahrte Probe wird soweit verdünnt, bis sie 1 TCID₅₀/ 0,2 ml enthält. Diese verdünnte Probe wird in 28 Röhrchen mit primären foetalen Rindernieren-Gewebekulturen unter Verwendung

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- ίο -

von 0,1 ml Inoculum/Röhrchen beimpft. Die Röhrchen werden bei der erlaubten Temperatur von 30 +1⁰C inkubiert. Nach verschiedenen Inkubationszeiten von 7 bis 17 Tagen zeigen 10 beimpfte Röhrchen einen typischen Rinder-Adeno-j5-Virus-cytopathogenen Effekt; diese Röhrchen werden mit den Nummern 1 bis 10 markiert und bei -7O⁰C aufbewahrt. Es werden Paralleltitrationen dieser 10 positiven Proben bei der erlaubten Temperatur von 30⁰C und bei der unerlaubten Temperatur von 39°C durchgeführt. Die Proben, die einen signifikanten Unterschied im Titer zwischen der erlaubten und der nichterlaubten Temperatur aufweisen, werden durch Grenzverdünnungs-Passagen zwei Mal weiter geklont.

Das so erhaltene Virusmaterial wird dann durch 2 Passagen in primären foetalen Rindernieren (PFBK) Zellkulturen wie folgt vermehrt: Rinderfoeten werden als Nierenspender verwendet. Die Nieren werden unter aseptischen Bedingungen entfernt. Zerkleinertes Nierengewebe wird mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen (diese Lösung besteht aus 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO₄, 0,2 g KH₂PO₄ in destilliertem Wasser (bis auf 800 ml), vermischt mit einer Lösung von MgCl₂.6H₂O in 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaCl₂ in 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration sterilisiert; der End-pH-Wert liegt .zwischen 7,2 und 7_tk). Anschließend wird das Nierengeweben mit einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung von Trypsin (2,5 g/Liter) trypsiniert. Das Gemisch wird dann 10 Minuten ohne Unterbrechung bei 37⁰C gerührt. Sodann wird die Flüssigkeit abgegossen und durch dasselbe Volumen an frischer Trypsinlösung ersetzt. Die Trypsinbehandlung wird dann unter Rühren bis zur Er-

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Schöpfung des Gewebes fortgesetzt. Die in der Flüssigkeit suspendierten Zellen werden von Zeit zu Zeit entfernt und dann bei 1000 UpM zentrifugiert. Das Zellsediment wird in einem Wachstumsmedium (Eagle's Basalmedium, das mit 10 Prozent auf Virus geprüftes Kalbsserum versetzt ist und pro ml 100 Einheiten Penicillin G-Natrium und 10Oy Streptomycin-sulfat enthält) suspendiert, daß auf 1 ml etwa 200 000 Zellen kommen.

1 ml Proben der Zellsuspension werden in sterile Röhrchen gegeben und 4 bis 5 Tage bei 37⁰C inkubiert, Am Ende dieser ersten Inkubationsperiode wird das Wachstumsmedium entfernt und pro Röhrchen durch 1,5 ml Eagle's Basalmedium ersetzt, das lediglich 2 Prozent y-globulinfreie's, auf Virus geprüftes Kalbsserum· enthält (hergestellt von HYLAND.TRAVENOL Labs., Los Angeles, California, U.S.A.), 10 Röhrchen werden mit 0,2 ml der vorstehend erhaltenen Virussuspension beimpft und bei 35⁰C während 7 bis 14 Tagen inkubiert. Das Wachstum des Virus zeigt sich an dem typischen cytopathogenen Effekt. Die Passage des Virus auf eine zweite primäre foetale Rindernieren-(PFBK)-Gewebekultur wird durchgeführt, wenn etwa 50 Prozent der Zellen den cytopathogenen Effekt aufweisen. Die überstehende Flüssigkeit wird dann geerntet; eine 0,2 ml Probe des Überstands wird als Inoculum für die nächstePassage verwendet.

Die überstehenden Flüssigkeiten der zweiten Passage werden geerntet, vereinigt und im Volumenverhältnis 1:2 mit einer Stabilisierlösung verdünnt, die aus 60 g Casiton, 100 g Rohrzucker, 75 ml (m/15) dibasisches Natriumphosphat, 25 ml(m/i5) monobasischem Kaliumphosphat, 20 g Monokaliumglutamat und einer zur Her-

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Stellung von 4,25 Liter ausreichenden Menge an destilliertem Wasser besteht. Das Gemisch wird lyophilisiert, wobei ein Rinder-Adeno-3-Virus-Eunice-Stamm erhalten wird.

ts-Charakter des Eunice-Stammes

Das Viruswachstum bei verschiedenen Temperaturen wird durch Titration bestimmt. Die Ergebnisse sindin der Tabelle I zusammengefaßt, aus der hervorgeht, daß die Hemmtemperatur, also die Temperatur, bei welcher die Infektiosität auf etwa 3 log₁₀ reduziert wird) 39,5 ±0,5°C beträgt. Die Ausbeutedifferenz zwischen dem Eunice-Stamm und dem Ausgangsstamm Y/BR 1/7 ist ebenfalls in Tabelle I angegeben und zeigt di_e geringe VermehrbarteLt(low leakiness) des Eunice-Stammes.

Tabelle I

Stamm WBR 1/7 Eunice	Virusausbeute TCIDc₀ (ausgedrückt in Iog₁₀/0,1 ml) bei	39,5⁰C	Unterschied zwischen 39,5°C und 35°C
35°C	6,5 1,7	O 2,8
6,5

Die Stabilität des ts-Charakters des Eunice-Stammes wird in vitro, wie nachstehend beschrieben, gezeigt:

Der Eunice-Stamm wird in primären foetalen Rindernieren (PFBK)-Zellkulturen bei einer erlaubten Temperatur von 30 bis 35°C passagiert. Die in Tabelle II zusammengefaßten Ergebnisse zei-

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gen, daß der ts-Charakter während 7 Passagen bei 30 bis 35 C stabil bleibt, während das Wachstum des Stammes bei 39,5°C beträchtlich vermindert ist.

Tabelle II -

Passage 1 k 7	Virustiter TCID,_₀, ausgedrückt in Iog₁₀/O,1 mi,	"bei unerlaubter Tem peratur (39,5°C)
"bei erlaubter Tem peratur (3O-35°C)	0,5 1.5
5 6,25 6,3

Außerdem wurde der ts-Charakter des Virus, das bei der unerlaubten Temperatur von 39,5⁰C hergestellt wurde, getestet. Wie aus Tabelle II ersichtlich ist, zeigt der Eunice-Stamm bei der unerlaubten Temperatur ein schlechtes Wachstum und die in Tabelle III zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß das so hergestellte Virus seinen ts-Charakter beibehalten hat.

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- 14 Tabelle III

Titer (log ₀ TCID /0,1 ml bei erlaubten und uner laubten Temperaturen) des Virus, das bei 39»5 C ' hergestellt vurde	Titer
Inkubationstemperatur der' Virus-Titration	3
35°C 39,5°C

Beispiel 2

Foetale Rindernieren werden unter aseptischen Bedingungen entfernt, zerkleinert und in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. (Diese Lösung besteht aus 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO^, 0,2 g KH₂PO^ in destilliertem Wasser (bis auf 800 ml), vermischt mit einer Lösung von MgCl₂*6HpO in 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaCl₂ in 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration sterilisiert; der End-pH-Wert liegt bei 7,2 bis 7,4). Die gewaschenen, zerkleinerten Nieren werden mit einer Lösung von Trypsin (2,5 g/Liter) in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung behandelt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei einer Temperatur von 37^C ohne Unterbrechung gerührt. Die Flüssigkeit wird dann abgegossen und durch das gleiche Volumen an frischer Trypsinlösung ersetzt. Die Trypsinbehandlung wird unter Rühren bis zur Erschöpfung des Gewebes fortgesetzt. Die in der Flüssigkeit suspendierten Zellen werden von Zeit zu Zeit entfernt und dann

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5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Das Zellsediment wird in einem Wachstumsmedium (Hank's basische Salzlösung, die mit 10 Prozent Virus geprüftem Kalbsserum, 0,5 Prozent Lactalbuminhydrolysat, 0,1 Prozent Hefeextrakt und 50 y Neomycin-sulfat/ml versetzt ist) so suspendiert, daß auf 1 ml etwa 200 000 Zellen kommen.

Aliquotteile von 1 ml der Zellsuspension werden in Roux-Kolberi (500 cm ) gegeben und 4 bis 5 Tage bei 37°C inkubiert. Am Ende dieser ersten Inkubationsperiode wird das Wachstumsmedium entfernt und die Zeilmonoschicht zweimal mit einem Erhaltungsmedium gewaschen, das aus Earle's basischer Salzlösung besteht, die 0,5 Prozent Lactalbuminhydrolysat, 0,1 Prozent Hefeextrakt, Q,1 Prozent Tryptosephosphat-Brühe und 50 γ Neomycin-sulfat/ml enthält.

Jeder Kolben mit foetaler Rindernieren-Zellkultur wird mit 1 ml einer Suspension des Rinder-Adeno—3-Virus-Eunice-Stammes. in destilliertem V/asser beimpft. Die Suspension enthält etwa 2,10 TCID₅₀/ml (d.h. beim Multiplizitätsindex von 0,1). Jeder Kolben wird mit Erhaltungsmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie das vorstehend zum Via sehen verwendete Medium versetzt. Die Kultur wird bei 35⁰C während einer solchen Zeitspanne inkubiert, die zum Wachsen einer großen Virusmerige ausreichend ist, d.h. mindestens 5 bis 10 Tage, wie sich mittels des typischen cytopathogenen Effektes des Rinder-Adeno-3-Virus nachweisen läßt.

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Die überstehenden Flüssigkeiten werden dann geerntet, vereinigt und im Volumenverhältnis von 1:2 mit einer Stabilisierlösung verdünnt. Diese Lösung besteht aus 60 g Casiton, 100 g Rohrzucker, 75 ml (m/15) dibasischem Natriumphosphat, 25 ml (m/15) monobasischem Kaliuraphosphat, 20 g Monokaliumglutamat und einer zur. Herstellung einer Lösung von 1 Liter ausreichenden Menge an destilliertem Wasser.

Das Präparat wird in Glasampullen abgefüllt, die wenigstens 2.10 TCIDj-Q oder ein Vielfaches davon enthalten. Der Inhalt der Ampullen wird lyophilisiert. Die Ampullen werden abgeschmolzen und enthalten entweder Einfach- oder Vielfachdosen. Nach der Wiederherstellung durch Zugabe von 4 ml V/asser/Dosis wird das Vakzin dem Tier als Sprühmittel intranasal verabreicht.

(a) Impfschema

Die Vakzine werden in einer Dosis von 2.10 TCID^₀ (2 ml/ Nasenloch) intranasal an 9 Tiere (6 Monate alte Kälber) verabreicht. Die Tiere werden aufgrund ihrer unterschiedlichen, den serologischen Status reproduzierenden Bedingungen, wie sie in Rindern in Europa existieren, ausgewählt; vgl. Beispielsweise Ch. Ludwig und H. Liebermann, Monatseh. Vet. Med.,Bd. 25 (1970) 229 und G. Wellemans und j. Leimen, Vlaams Diergen. Tijdschr., Bd. 3 (1968) 125.

(b) Virusrückisolierung nach der Impfung

Durch Reinigung der Nasen erhaltene Proben wurden auf dio Gegenwart von Viren in den Nasenhöhlen untersucht.

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Das aus der Nase wieder isolierte Virusmaterial der geimpften Tiere wird in Kulturgefäßen mit primärem foetalem Rindergewebe passagiert, 14 Tage lang bei 35⁰C inkubiert; alle negativen Proben werden unter den. gleichen Bedingungen und im gleichen Kultursystem subpassagiert. Die Endergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Num mer des	Tierstatus	Tag der Rückisolierung nacti der Impfung	3	k	5	6	7	10	11
Tie res		—	—	_	—	—	—	—
70	indirekte Kontrolle		-	-	-	-	-	-
72	Il - Il	-	-	-	-		-	-
71	direkte Kontrolle		-	-	-	-	-. -	-
73	Il It	-	-	+ ·	-	-		-
lh	geimpft	-	-	-	-	-	-	-
75	H	+	+	-	+	-	-	-
76	Il	( + )	-	-	-	-	-	-
77	ti	-	+	-	+	-	-	-
78	It	-	+	- -	-	-	-	-
79	Il	( + )	-	-	-	-	-	-
80	Il	+	( + )	-		-	-	-
81	Il	⁺	⁺		⁺	—	—	—
82	Il -

( + ) = positiv in Su"bpassage

Diese Ergebnisse zeigen, daß Vakzinevirus aus allen geimpften Tieren, mit Ausnahme von Kalb 75, wieder isoliert wurde. Die Wiederisolierung erfolgte 3 bis 6 Tage nach der Impfung. Unter den 15 Rückisolierungen v/urden 4 durch Subpassagieren erhalten. Wie sich aus den virologischen Prü-

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fungen ergibt, die 11 Tage lang nach der Impfung durchgeführt wurden, sind die Direktkontrollen nicht durch die geimpften Tiere infiziert worden. Proben der Rückisolierung aus Exkrementen sind alle negativ und zeigen die Harmlosigkeit der erfindungsgemäßen Vakzine infolge der begrenzten Vermehrung des Virusstammes in den oberen Atmungsorganen.

(c) ts-Charakter des nach der Impfung wiederisolierten Vakzinevirus

Die Titrierungbestimmung des ts-Charakters wird in sekundären foetalen Rindernieren-Gewebekulturen ausgeführt, wobei
diese Kulturen vor dem Beimpfen gewaschen werden, um restliches Rinderserum auszuschließen. Für jede Verdünnung werden 4 bis 5 Röhrchen mit 0,1 ml beimpft. Die Kulturen werden bei 35°C inkubiert und die Titer durch Schätzung des cytopathogenen Effektes nach einer Inkubationszeit von 14 Tagen bestimmt.

Aus Tabelle V geht die Stabilität des ts-Charakters des
aus der Nase der geimpften Tiere wiederisolierten Vakzinevirus-Eunice-Stammes nach in vivo-Passage hervor.

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-.19 -

	lh	Tag der	Vi	Tabelle V	°C	ml	) '	°C	38,5°C	in	39	,5⁰C
	76	Wieder-		75	Temperatur von:	7 5	3,25	Dex einer	40	,5
	78	isolie—		75	38	75	3,5		S°	,5
	82	nach der Impfung		VJl	' 3,	25	3,25	39°C		,5
	/7	5		,75	h,	,25.	14,25	2,25	£°	,5
	Eunice	6		,25	3',	,75	5 -	2,75	.5	,25
		6	rustiter TCID _n (ausgedrückt	,25	k	,50	nb	2,5	1	,5
	6	log_in/0,1	k	3,25
	-		5	5
Virus ur- sprung	—	35	nb
Tief	3,
Tier
Tier	3
Tier	U
WBR 1	U
⁵

nb = nicht bestimmt

(d) yirusrück/yewinniin/a: nach BelastunKsinfektion (Challenge) Alle Tiere werden 27 Tage nach der Impfung mit WBR 1/7-

Stamm unter Verwendung von 10' TCID₁-Q pro Nasenloch infiziert. Das aus der Nase von geimpften Tieren v/iedergewonnene Virus wird in Kulturbehältern an sekundären foetalen Rindernierengewebe passagiert, 14 Tage bei 39,5°C inkubiert, und alle negativen Proben werden unter den gleichen Bedingungen und im gleichen Kultursystem subpassagiert. Die Ergebnisse sind.in Tabelle VI zusammengefaßt.

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Tabelle VI

Nummer des Tieres	Tierstatus	Tag der Wiederisolierung nach der .Belastungs infektion	3	+	6	7	10
TO	indir. Kontr.	+	+	+		—
T2	It Il	. +	-	-	■ -	+
71	direkte Kontr.	+	-	-	- -	-
73	η Ii	+ .	-	-	--	+
Ik	geimpft	-	-	-	-	-
75	It	-	-	-	-	-
76	- Il	-	-	-	-	-
77	Il	-( + )	-	-	-	-
78	It	-	-	-	-	-
' 79	Il	-	-	-	-	-
80	II	-	-	-	-	-
81	II	-	—	-	-	-
" 82	Il	+	—	—	—

(+) ^ positiv in der Subpassage

Die Ergebnisse aus Tabelle VI zeigen, daß das Belastungsvirus nur aus 2 unter 9 geimpften Tieren isoliert wird und nur am 3. Tag nach der Infektion. Im Gegensatz dazu wurde ein Virus aus allen Nasen aller Kontrolltiere isoliert. Insbesondere die indirekten Kontrollen (70 und 72) hatten 3 von 5 positiven Proben während der 10 Tage, die der Infektion folgten.

Tabelle VI zeigt, daß keine Vermehrung des Belastungsvirus in den Nasenhöhlen der geimpften Tiere erfolgt.

409849/10

(e) Serokonversion nach der Impfung

Der Serum-Neutralisationstest wird nach der konstanten Virus (100 TCID₁-Q)/Serum-Verdünnungstechnik durchgeführt. Die erste Verdünnung ist 1/4.

Die Seren werden vorher durch 30minütiges Erhitzen bei 56⁰C inaktiviert und jede Serumverdünnung wird mit dem Virus
1 Stunde bei 35°C zusammengebracht, bevor es in die Kulturröhrchen (0,2 ml/Gefäß) verteilt wird. Es werden 4 Röhrchen für jede Serumverdünnung verwendet. Die beimpften Röhrchen
werden bei 35°C inkubiert und die Serumtiter nach einer Inkubationszeit von 14 Tagen bestimmt.

Die Ergebnisse des Neutralisationstestes sind· in Tabelle
VII zusammengestellt, in denen der Titer als reziproker Wert der höchsten Verdünnung, bei der 50 Prozent der Röhrchen
völlig neutralisiert waren, ausgedrückt ist.

409849/1020

- 22 Tabelle VII

Num	Tierstatus	Virustiter . .	13	27 Infek- tions- : datum	*2(15 Tage lach dem Cnfektions- latum)
mer			<8	<k	16
des • Tie	indir.Kontrolle			6k	256
res	Il It	Tag der Probenentnahme nach dein Impf t ap;	128	$256	512
70	direkte Kontr.		128	128	102I1
72	Il Il	k	$256	512	512
71	geimpft	6k	S256	»102U	>2OU8
73	Il	128	$256	512	102^
lh	Il	*128	$256	256	256
75	Il	32	>256	256	256
76	Il	128	?256	S1.02lt	20^8
77	Il	32	*256	512	512 .
78	Il	»128	S256	256	20U8
79	Il	32	128	128	128
•80	Il	32
81	16
82	$"128
	8

Diese Ergebnisse zeigen, daß Tiere mit einem Antikörpertiter von 128 oder weniger bei der Impfung schon 13 Tage nach der Impfung reagierten. Im Gegensatz dazu zeigen die direkten oder indirekten Kontrolltiere (mit Ausnahme von Tier Nr. 71) keinen wesentlichen Anstieg des Titers während der gleichen Beobachtungsperiode.

Die Ergebnisse nach der Belastungsinfektion zeigen einen wesentlichen Anstieg der Antikörpertiter unter all den Kontrolltieren (mit Ausnahme von Tier Nr. 71), während kein

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wesentlicher Anstieg unter allen geimpften Tieren (mit Ausnahme von Tier Nr. 81) beobachtet wird.

Die Ergebnisse zeigen die große Antigenität der erfindungsgemäßen Vakzine.

(f) Serologische Charakteristiken der nasalen Sekretionen

Das Bestimmen der Neutralisationsstärke der nasalen Sekretionen unter Verwendung der konstanten nasalen Probendosis/ Virusverdünnungstechnik.

Das Einsammeln der nasalen Sekretionen wird durchgeführt,
indem die Nasenhöhlen mit ^O ml 1n Salzlösung/Nasenloch gewaschen werden. Die Waschlösungeri werden dann beschallt und dann durch Ultrafiltration auf 1/10 ihres ursprünglichen
Volumens konzentriert.

Die Neutralisationsstärke der nasalen Sekretionen ist in Tabelle VIII angegeben, in der sie durch ihren Neutralisationsindex für 0,1 ml der konzentrierten Probe ausgedrückt sind.

^09849/1020

- 24 Tabelle VIII

Num	Tierstatus	Neutralisationsindex	-1	11	17	27
mer			1	0	1	1
des			0	0	nb	nb
Tie	indir.Kontrolle	Tage der Probeentnahme nach dem	3	0	0	0
res	Il It	ImöftacT	0	0	0	0
TO	direkte Kontr.	0	* 3	3	3
72	It It	1	>k	>k	>h
71	geimpft	0	2	: nb	2
73	I!	0	3	3	0
lh	Il	0	1	1	2
75	Il	0	3	3	1
76	Il	0	3	1	2
77	Il	0	3	n_b	3
"78	Il	0	1	1	0
79	It
80	Il
81
82

nb = nicht bestimmt

Die Ergebnisse von Tabelle VIII zeigen, daß 11 Tage nach der Impfung mit einem erfindungsgemäßen Vakzin 6 von 9 Tieren einen erheblichen Antikörpergrad (der einem Neutralisationsindex von 3 oder mehr entspricht) zeigen, während die Neutralisationsindices von 3 anderen geimpften Tieren den Wert 1 oder 2 haben. Diese Antikörper bleiben während der ganzen, 27 Tage dauernden Beobachtungsperiode bestehen, mit Ausnahme von den Tieren Nr. 77 und 82.

Keine lokalen Antikörper wurden in den Direktkontrolltieren Nr. 71 und 73 gefunden.

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Antikörper wurden vor der Impfung in 3 Tieren, von denen
eines geimpft wurde, festgestellt. Lediglich das geimpfte
Tier Nr. 75 zeigte einen wesentlichen Anstieg des Neutralisationsindexes 11 Tage nach der Impfung.

Diese Ergebnisse zeigen in Verbindung mit jenen der Tabelle VI, daß die Immunogenität der erfindungsgemäßen Vakzine sehr wertvoll ist.

(g) Spezifität der lokalen Antikörper, die durch Impfung induziert wurden

Die Spezifizität der durch Impfung induzierten lokalen Antikörper wird an konzentrierten Mustern der nasalen Proben am 11., 17. und 27.Tag nach der Impfung bestimmt. Die Neutralisationsteste dieser Proben werden gegen Rinder-Adeno-*·
1-Virus und Rinder-Adeno-3-Virus durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengefaßt.

Tabelle IX

Num mer	Tierstatus	Neutralisationsindex der Proben nach Impjfung	Rinder- Adeno—1- Virus
des Tie res	direkte Kontrolle	Rinder- Adeno~3-Vi rus	0
71	Il Il	0	0
73	geimpft	0	0
lh	Il	2	0
75	Il	>u ■ .	0
77	Il	3	0
79	Il	3	0
80	Il	. 2	0
81	Il	3	0
82	1

^09849/1020

Wie in Tabelle IX gezeigt wird, sind die in den nasalen Sekretionen gefundenen Antikörper spezifisch für Rinder-Adeno 3-Virus. Es gibt keine Kreuzreaktion mit Rinder-Adeno-1-Virus.

(h) Symptomatologie

Beginnend mit dem Impftag, werden alle Tiere täglich beobachtet, und zwar auf Körpertemperatur.

Klinische Untersuchung wegen eventueller Symptome an den Augen, im Atmungssystem und im Verdauungssystem.

Alle Ergebnisse waren normal und die Abwesenheit von jeglichen klinischen Symptomen, trotz der aktiven Vermehrung des Vakzinstammes, zeigt die Unschädlichkeit der erfindungsgemäßen Vakzine.

Beispiel 3

Es wird die in Beispiel 2 beschriebene Methode angewendet, wobei jedoch die geernteten überstehenden Flüssigkeiten, die mit der Stabilisierlösung verdünnt v/erden, mit dem RLB 103 temperaturempfindlich Mutantenstamm von Rinder-Parainfluenza 3 (PI-,)-Virus, beschrieben von N. Zygraich, M. Lobmann und C. Kuygelen in j.Hyg.Camb., Bd. 70 (1972), 229-234 und dem RLB 106 temperaturempfindlichen Mutantenstamm des infektiösen Rindcr-Rhinotracheitis (IBR)-Virus (beschrieben in Research in Veterinary Science) ergänzt v/erden. Das Gemisch wird in Glasampullen abgefüllt, die 10 '⁵ TCIDf-« an Rinder-Adeno-S-Virus-Eunice-Stamm. 10⁷»² TCID_r~

f O

an Rindcr-PIj-Virus und 10 ' TCID₅₀ an IBR-Virus oder ein vielfaches jeder dieser Dosen enthalten. Der Inhalt dieser Awpullen

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wird lyophilisiert, und die Ampullen werden abgeschmolzen. Auf diese Weise werden entweder Einfach- oder Vielfachdosen erhalten. Nach der Wiederherstellung durch Zugabe von 4 bis 5 ml V/asser/Dosis wird die Vakzine dem Tier intranasal als Nasenspray verabreicht.

3 bis

Klinische Prüfung

Die Prüfung wird an vier/6 Monate alten Kälbern (Friesischei Milchrind) durchgeführt.

Eine Einheitsdosis des erhaltenen trivalenten Vakzins wird in die Nasenlöcher jedes Tieres eing.e sprüht. Blutproben für serologische Untersuchungen werden vor"und 6 Wochen nach der Impfung abgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengefaßt.

Tabelle X

Num mer des Tie res	Serologische Reaktion, ausgedrückt in	nach der Imp fung	vor • der Imp fung	nach der Imp fung	Haemagglutina- tions-Hemmungsti- ter für PI^5-Virus	nach der Imp fung
1 2 3 Ii	Seroneutralisätions-Ariti- körpertiter für Adeno-3-Virus IBR-Virus	1'6 32 32 6k	O O O O	2 2 8 1	vor der Imp fung	128 32 128 32
vor der Imp fung	<8 8 . <8 32
< h <16 " '■< k 8

4Ü9849/102G

Die zusätzlichen Rinder-PI^-und IBR-Viren störten die Impfung mit Adeno-3-Vakzinen nicht; umgekehrt störte das Adeno-3-Virus nicht die Serokonversion der Tiere für die Rinder Pl^-und ' IBR-Viren.

Beispiel 4

Ein Test zur Bestimmung des Antigenabbruchs wird an 2 Gruppen von drei empfindlichen Kälbern durchgeführt. Dabei wird das Vakzin aus Beispiel 1 mit einer Dosierungseinheit von ₁₀5,25 TCID₅₀ oder 10⁴'²⁵ TCID₅₀ intranasal verabreicht.

Die Ergebnisse des Seroneutralisationstestes sind in der Tabel-.le XI zusammengefaßt.

10 2 0

- 29 Tabelle XI

Num

Tierstatus

vakziniert

Serologische Reaktion,

ausge-

•

<8

6k

-

16

21

■

32

mer

10 »²⁵ TCID

drückt als Seroneutralisations-

nach dem

des

Direkt

verdünnungstitei

16

Tie

kontrolle

<8

6k

32

res

0 Ak

6k

vakziniert

Tage der Probeentnahme

<8

16

32

ς 25

ImDf tae:

636

10 » TCID₅₀

6k

32

vakziniert

8

32

To^²⁵ TCID₅₀

16

6k6

vakziniert

<8

ιοί·²⁵ _TCTD
50

6kl

vakziniert

mit

16

1*97

10 ' ^ TCID

vakziniert

¹⁶ ■

10 ^t>2^ TCID,.„

50lf

50

635

510

Diese Ergebnisse zeigen, daß eine gewisse Serumkonversion noch bei einer Dosis von 10⁴'²⁵ TCID₅₀'auftritt.

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Claims

- 30 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung temperaturempfindlicher, nichtpathogener Mutantenstämme aus einem pathogenen Rinder-Adeno-Virusstamm, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Rinder-Adeno-Virusstamm bei Raumtemperatur mit einer gepufferten wäßrigen Lösung von salpetrige.r Säure mit einem pH-Wert von 4,2 bis 5 behandelt und aus der Lösung durch wenigstens eine Endverdunnungspassage in einer üblichen Gewebekultur, die sowohl für das Wachstum des Virus und auch als Substrat für die Vakzinherstellung geeignet ist, einen temperaturempfindlichen Stamm von Rinder-Adeno-Virus mit einer Hemmtempe-

o
ratur von 39 bis 40 C isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit einer wäßrigen Lösung von salpetriger Säure in Acetatpuffer, in der die Konzentration der salpetrigen Säure 1n und der Acetationen im Reaktionsmedium 0,25 η ist, und während eines Zeitraums von 2 bis 5 +1 Minuten bei einem pH-Wert von 4,2 +.1 bis 15 bis 25 + 1 Minuten bei einem pH-Wert von 5+0,1 durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung 15 Minuten (+1) bei Raumtemperatur und bei einem pH-Wert von 4,6 (+0,1) durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3_t dadurch gekennzeichnet, daß man den temperaturempfindlichen Mutantenstamm durch wenigstens eine geklonte Passage in primären foetalen Rindernieren-

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zellkulturen isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial einen Rinder-Adeno-3-Virusstamm verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 5,' dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial einen Rinder-Adeno~3-Virus-WBR 1/7-Stamm verwendet.

7. Verfahren zur Herstellung von Rinder-Adeno-Virus-Lebendvakzinen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6,hergestellten, temperaturempfindlichen Rinder-Adeno-Virusstamm mit einer Hemmtemperatur von bis 40⁰C in einer üblichen Gewebekultur, die für das Wachstum von Rinder-Adeno-Virus geeignet ist, bei einer Temperatur von höchstens 37 +, 1°C inkubiert und das erhaltene Virusmaterial erntet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gewebekultur'eine primäre foetale RindernierenzeTJ kultur verwendet.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Adeno-3-Virus-Eunice~Stamrn vermehrt.

10. Rinder-Adeno-Virus-Lebendvakzine zur intranasalen Verabreichung, enthaltend als aktiven Bestandteil einen gemäß Anspruch 1 Mg "6 hergestellten temperaturempfindlichen Rinder-

40 9'8 49/1020

- 32 Ädeno-Virusstamm mit einer Hemmtemperatur von 39 bis 40⁰C.

11. Lebendvakzine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Vakzin der temperaturempfindliche Adeno-3-Virus-Eunice-Stamm ist.

12. Polyvalente Rinder-Lebendvirusvakzine zur intranasalen Verabreichung, enthaltend als aktive Bestandteile ein Vakzin gemäß Anspruch 10 und 11 und wenigstens ein weiteres intranasal verabreichbares Rinder-Lebendvirusvakzin für die Behandlung der Atemwege.

13. Lebendvakzine nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktive Bestandteile ein Rinder-Adeno-Lebend-Virusvakzin gemäß einem der Ansprüche 10 und 11 ein infektiöses Rinder-Rhinotracheitis-Virus-Lebendvakzin und ein Rinder-Parainfluenza-Virus-Lebendvakzin enthalten.

14. Lebendvakzine nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,

daß das Rinder-Adeno-Virusvakzin das Rinder-Adeno-3-Virus-Lebendvakzin gemäß Anspruch 11 ist und das Rinder-Parainfluenza-Virus-Lebendvakzin ein Rinder-Parainfluenza-3-Virus-Lebendvakzin ist.

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