DE3889417T2

DE3889417T2 - Methode für die Kontrolle von chronischer Atmungskrankheit und nekrotischer Enteritis bei Vögeln.

Info

Publication number: DE3889417T2
Application number: DE3889417T
Authority: DE
Inventors: Donald Bruce Borders; Guy Thomas Carter; Joseph Jacob Goodman; Michael Greenstein; William Michael Maiese; Raymond Thomas Testa
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1987-10-29
Filing date: 1988-09-29
Publication date: 1994-12-01
Anticipated expiration: 2008-09-30
Also published as: DK601788D0; DE3889417D1; ATE105192T1; ZA888122B; AU2448688A; IL87889A0; IE883260L; EP0313846A2; DK601788A; EP0313846A3; IE64520B1; AU637947B2; HUT48682A; EP0313846B1; AU1382292A; JPH01149731A; NZ226645A; JP2522528B2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Behandeln von Vögeln, die mit einem nekrotische Enteritis oder chronische Atmungskrankheit verursachenden Mittel infiziert sind, um die Infektionen in diesen Vögeln zu vermindern und/oder zu beseitigen. Mehr im besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum oralen Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge des Antibiotikums LL-E19020α, des Antibiotikums LL-E19020β oder eines physiologisch akzeptablen Salzes davon an Geflügel, in Gefangenschaft gezüchtete Jagdvögel, Hausvögel oder Vögel in zoologischen Gärten, die mit Clostridium perfringens oder Mycoplasma gallisepticum infiziert sind, um diese Infektionen in den Vögeln zu vermindern und/oder zu beseitigen. Diese Antibiotika und ihre medizinische Verwendung als antibakterielle, Protozoen bekämpfende oder anthelmintische Mittel sind in der EP-A-0 252 380 beschrieben.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Figur I zeigt ein UV-Absorptionsspektrum von LL-E19020α.
Figur II zeigt ein IR-Absorptionsspektrum von LL-E19020α.
Figur III zeigt ein Protonen-NMR-Spektrum von LL-E19020α.
Figur IV zeigt ein ¹³C-NMR-Spektrum von LL- E19020α.
Figur V zeigt UV-Absorptionsspektren von LL- E19020β.
Figur VI zeigt ein IR-Absorptionsspektrum von LL-E19020β.
Figur VII zeigt ein Protonen-NMR-Spektrum von LL-E19020β.
Figur VIII zeigt ein ¹³C-NMR-Spektrum von LL- E19020β.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Strukturen der Antibiotika LL-E19020α und β wurden noch nicht aufgeklärt, doch werden sie in Verbindung mit ihren physikochemischen Eigenschaften unten beschrieben:
Die physikochemischen Eigenschaften von LL- E19020α sind folgende:

LL-E19020α

1. Etwaige Elementaranalyse: C 62,73; H 7,60; N 1,00; O 28,67 (durch Unterschied);
2. Molekulargewicht: 1225 (FABMS);
3. Anscheinende Molekülformel: C&sub6;&sub5;H&sub9;&sub5;NO&sub2;&sub1;;
4. Spezifische Drehung: [α]²&sup6;D = 0 (Konzentration 0,385, Methanol);
5. UV-Absorptionsspektren: wie in Figur I gezeigt

CH&sub3;OH

UV = 233nm (&epsi; 49.800)
MAX 290nm (&epsi; 36.600)

0,1N HCl

UV = 234nm (&epsi; 51.500)
MAX 300nm (&epsi; 38.900)

0,1 NaOH

UV = 217nm (&epsi; 82.700)
MAX 290nm (&epsi; 45.900)
6. IR-Absorptionsspektrum: wie in Figur II gezeigt (KBr-Scheibe): 3420, 2970, 2925, 1717, 1695, 1647, 1617, 1525, 1445, 1365, 1092, 1018 cm&supmin;¹;
7. Protonen-NMR-Spektrum: wie in Figur III gezeigt (300 MHz, CDCl&sub3;);
8. ¹³C-NMR-Spektrum: wie in Figur IV gezeigt (75 MHz, CDCl&sub3;, ppm feldabwärts von TMS), bemerkenswerte Peaks sind unten aufgeführt: 2x = zwei überlappende Signale

LL-E19020β

1. Etwaige Elementaranalyse: C 63,33; H 7,72; N 1,16; O 27,79 (durch Unterschied);
2. Molekulargewicht: 1225 (FABMS);
3. Anscheinende Molekülformel: C&sub6;&sub5;H&sub9;&sub5;NO&sub2;&sub1;;
4. Spezifische Drehung: [α]²&sup6;D = -17±2 (Konzentration 0,455, Methanol);
5. UV-Absorptionsspektren: wie in Figur I gezeigt

CH&sub3;OH

UV = 233nm (&epsi; 47.000)
MAX 290nm (&epsi; 34.100)

0,1N HCl

UV = 234nm (&epsi; 46.000)
MAX 301nm (&epsi; 32.800)

0,1 NaOH

UV = 217nm (&epsi; 77.800)
MAX 290nm (&epsi; 39.700)
6. IR-Absorptionsspektrum: wie in Figur VI gezeigt (KBr-Scheibe): 3430, 2970, 2930, 1712, 1648, 1620, 1543, 1454, 1367, 1265, 1098, 1020, 980 cm&supmin;¹;
7. Protonen-NMR-Spektrum: wie in Figur VII gezeigt (300 MHz, CDCl&sub3;);
8. ¹³C-NMR-Spektrum: wie in Figur VIII gezeigt (75 MHz, CDCl&sub3;, ppm fällt abwärts von TMS), bemerkenswerte Peaks sind unten aufgeführt: 2x = zwei überlappende Signale
Die neuen antibakteriellen Mittel LL-E19020α und LL-E19020β werden gebildet während des Züchtens eines neuen Stammes von Streptomyces lydicus ssp. tanzanius unter kontrollierten Bedingungen.
Dieser Mikroorganismus wird in der Kultursammlung der Medical Research Division, American Cyanamid Company, Pearl River, NY als Kulturnummer LL-E19020 aufbewahrt. Eine lebensfähige Kultur dieses neuen Mikroorganismus wurde beim Patent Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604 hinterlegt und zu seiner permanenten Sammlung hinzugefügt. Er hat von dieser Hinterlegungsstelle die Stammbezeichnung NRRL 18036 erhalten.
Die Kultur LL-E19020 wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in einem Weideland nahe dem Manyarasee, Tanzania, Afrika, entnommen worden ist.
Die Kultur LL-E19020 erzeugt kurze spiralförmige Sporenketten, die 10 bis 50 Sporen lang sind, gelegentlich längere Ketten. Diese neigen zum Zusammenballen unter Bildung trockener schwärzlicher Massen auf solchen ISP-Medien, wie Hafermehl und anorganische Salze-Stärke. Die Sporen haben glatte Oberflächen, wie mit dem Elektronenmikroskop festgestellt. Der Stamm enthält das L-Isomer von Diaminopimelinsäure, und er kann so der Gattung Streptomyces zugeordnet werden.
In den ISP-Tests zur Nutzung von Kohlenhydraten zeigt LL-E19020 Wachstum auf Arabinose, Fructose, Inosit, Mannit, Raffinose, Rhamnose, Saccharose und Xylose. Cellulose wird nicht genutzt.
Die Reaktionen von LL-E19020 in der physiologischen Gordon-Reihe wurden in der folgenden Tabelle I mit solchen von Streptomyces lydicus ISP 5461 verglichen, dem er morphologisch und physiologisch am meisten ähnelt.
Weil LL-E19020 sich von ISP 5461 in fünf Eigenschaften unterscheidet (Xanthin-Hydrolyse, Decarboxylierung von Oxalat, Säure aus Erythrit, Rhamnose und β-Methyl-D-xylosid), wird es als eine Unterart von Streptomyces lydicus bezeichnet. TABELLE I Gordontest-Reaktionen von LL-E19020 und Streptomyces lydicus ISP 5461 Reaktion Abbau/Umwandlung von Casein Xanthin Hypoxanthin Thyrosin Adenin Produktion von Amylase Gelatinase Phosphatase Nitrat-Reduktase Urease Esculinase Wachstum auf/in 5% Natriumchlorid Salicylat Lysozym-Brühe Nutzung von Acetat Benzoat Citrat Lactat Malat Muscat Oxalat Propionat Pyrovat Succinat Tartrat Spur TABELLE I (Fortsetzung) Reaktion Wachstum bei Säure aus Adonit Arabinose Cellobiose Dextrin Dulcit Erythrit Fructose Galactose Glucose Glycerin Inosit Lactose Maltose Mannit Mannose Melibiose α-Methyl-D-Glucosid Raffinose Rhamnose Salicin Sorbit Saccharose Trehalose Xylose β-Methyl-D-Xylosid
Es sollte klar sein, daß für die Herstellung dieser neuen antibakteriellen Mittel die vorliegende Erfindung nicht auf diesen speziellen Organismus oder auf Organismen beschränkt ist, die die obigen Eigenschaften haben, die nur zur Veranschaulichung angegeben sind. In der Tat ist es erwünscht und beabsichtigt, die Verwendung von Mutanten einzuschließen, die aus diesem Organismus auf verschiedene Weise erzeugt werden, wie durch Aussetzen gegenüber Röntgenstrahlung, UV-Strahlung, N'-Methyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Actinophagen und ähnlichen.
Die antibakterielle in vitro-Aktivität von LL- E19020α und β wurde gegenüber einem Spektrum von gram-positiven und gram-negativen Bakterien nach einem standardgemäßen Agar-Verdünnungsverfahren bestimmt. Mueller-Hinton-Agar, enthaltend 5% Schafsblut und zweifach abnehmende Konzentrationen von entweder LL-E19020α oder β, wurde in Petrischalen gegossen. Die Agar-Oberflächen wurden mittels der Reproduktionsvorrichtung von Steers mit 1 bis 5 x 10&sup4; Kolonien bildenden Einheiten von Bakterien beimpft. Die geringste Konzentration des Antibiotikums, die das Wachstum eines Bakterienstammes nach 18-stündiger Inkubation verhinderte, wurde als die minimale Hemmkonzentration für diesen Stamm aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben. TABELLE II Antibakterielle Aktivität von LL-E19020α und β in vitro Organismus Minimale Hemmkonzentration (mcg/ml) Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Smith Staphylococcus epidermidis saprophyticus Streptococcus sp. (β-hämolytisch) Streptococcus pneumoniae Enterococcus Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Morganella morganii Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa Bacteroides fragilis Clostridium difficile Clostridium perfringens Peptococcus magnus
Die antibakterielle Aktivität des Antibiotikums LL-E19020α und β in vivo wurde bestimmt durch intraperitoneales Infizieren weiblicher CD-1-Mäuse von den Charles River Laboratories, die jeweils 20±2 g wogen, mit entweder 1,7x10² CFU/0,5 ml der Brühe von Streptococcus pyogenes C203 oder 6,5x10&sup5; CFU/0,5 ml der Brühe von Staphylococcus aureus Smith. Den Mäusen wurde 30 Minuten vor der Infektion die angegebene Dosis der Testverbindung in 0,5 ml von 0,2%igem wässerigem Agar subcutan verabreicht. Die Ergebnisse dieses Tests erscheinen in Tabelle III. TABELLE III In vivo-Aktivität von LL-E19020α und β Überlebensverhältnisse 7 Tage nach der Infektion Einzelne subcutane Dosis (mg/kg) S. pyogenes C203 S. aureus Smith Nichtbhandelte infizierte Vergleichstiere NT = nicht getestet
Die Antibiotika LL-E19020α und LL-E19020β leiten ihre Brauchbarkeit von ihrer antibakteriellen Aktivität ab. So können diese Antibiotika zum Beispiel bei der Unterdrückung bzw. Hemmung bakterieller Infektionen als örtliche antibakterielle Mittel oder als allgemeine Desinfektionsmittel für Laboratorien eingesetzt werden.
Überraschenderweise wurde auch festgestellt, daß diese Antibiotika brauchbar sind zur Behandlung bakterieller Infektionen bei Vögeln. Im besonderen sind die oben genannten Antibiotika brauchbar bei der Milderung oder Beseitigung nekrotischer Enteritis oder chronischer Atmungskrankheit von infizierten Vögeln.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß eine erfolgreiche Behandlung infizierter Vögel allgemein durch die orale Verabreichung von LL-E19020α, LL-E19020β oder eines physiologisch akzeptablen Salzes davon in oder mit dem Futter oder Trinkwasser der infizierten Vögel erfolgen kann. Üblicherweise sind etwa 0,5 ppm bis 1000 ppm und vorzugsweise 1,0 ppm bis 50 ppm von LL-E19020α, LL-E19020β oder des physiologisch akzeptablen Salzes davon zur Verminderung oder Beseitigung der Infektion bei Vögeln wirksam.
Zusätzlich wurde gefunden, daß die Antibiotika LL-E19020α, LL-E19020β oder physiologisch akzeptable Salze davon, oral in pharmazeutisch wirksamen Mengen an Vögel verabreicht werden können, die mit Clostridium perfringens oder Mycoplasma gallisepticum infiziert sind, um diese Infektionen bei Vögeln zu vermindern oder zu beseitigen.
Die obigen Pathogene sind die verursachenden Mittel für nekrotische Enteritis und chronische Atmungskrankheit, Krankheiten, die die Geflügelindustrie kontinuierlich plagen und die jährlich für viele Millionen Dollar Verluste von Geflügelzüchtern und Eiproduzenten verantwortlich sind.
Während die hauptsächlichen wirtschaftlichen Verluste aus diesen Krankheiten allgemein bei Geflügel auftreten, wie Hühnern, Truthähnen, Gänsen und Enten, wurde nun festgestellt, daß diese Krankheiten auch in Jagdvögeln, die in Gefangenschaft gezüchtet worden sind, wie Wachteln und Fasanen, in Wasservögeln und Raubvögeln, die in zoologischen Gärten gehalten werden, und in exotischen und wildlebenden Vögeln auftreten können, die als Gefährten oder Haustiere gehalten werden. Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zum Behandeln von Vögeln zu schaffen, die mit den verursachenden Mitteln der nekrotischen Enteritis, chronischen Atmungskrankheit oder Geflügelcholera infiziert sind, um die Infektionen in diesen Vögeln zu mildern oder zu beseitigen.

Allgemeine Züchtungsbedingungen

Die Züchtung von Streptomyces lydicus ssp. tanzanius NRRL 18036 kann in eine weiten Vielfalt flüssiger Kulturmedien ausgeführt werden. Medien, die für die Produktion von LL-E19020α und LL-E19020β brauchbar sind, schließen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Dextrin, Saccharose, Melassen, Glycerin usw., eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Mais-Tränkflüssigkeit usw. sowie anorganischen Anionen und Kationen, wie Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid usw. ein. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän, Kupfer usw. werden als Verunreinigungen anderem Bestandteile den Medien zugeführt. Die Belüftung in Tanks und Flaschen kann erfolgen durch Hindurchdrücken steriler Luft durch die oder auf die Oberfläche des Züchtungsmediums. Das Rühren in Tanks erfolgt durch einen mechanischen Rührer. Ein Antischäummittel, wie Siliconöl, kann erforderlichenfalls hinzugegeben werden.

Allgemeines Verfahren zur Isolation von LL-E19020α und β

Das LL-E19020α und LL-E19020β wird aus der Züchtungsbrühe durch pH-Einstellung auf 4,5 bis 5,5, Filtration durch Diatomeenerde, Extraktion in ein Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Konzentrieren, Auflösen in einem Lösungsmittel, wie Dichlormethan und Reinigung durch Säulenchromatographie an Siliciumdioxidgel unter Anwendung von Dichlormethan und Methanol:Dichlormethan (1:4) nacheinander gewonnen, wobei ein Rohprodukt anfällt.
Das Rohprodukt wird dann in die α- und β-Komponenten aufgetrennt und weiter durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie auf einer Umkehrphasensäule gereinigt werden, wobei das System Acetonitril, 0,1 M Ammoniumacetat-Puffer, pH 4,3 (1:1) benutzt wird.
Die Erfindung wird weiter in Verbindung mit den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen beschrieben:

Beispiel 1

Herstellung des Inoculums

Ein typisches Medium, das zum Züchten des primären Inoculums bzw. Impfmaterials benutzt wurde, wurde nach der folgenden Zubereitung hergestellt:
Dextrose ... 1,0%
Dextrin ... 2,0%
Hefeextrakt ... 0,5%
NZ-Amin A 1 ... 0,5%
Calciumcarbonat ... 0, 1 %
Wasser bis ... 100,0%
¹ [Produkt der pankreatischen Verdauung von Kasein, eingetragene Handelsmarke von Sheffielt Chemical, Norwich, NY]
Dieses Medium wurde auf pH 7,0 eingestellt und dann sterilisiert. Eine 100 ml-Portion dieses sterilen Mediums in einem 500 ml-Kolben wurde mit von einer schrägen Agarfläche von Streptomyces lydicus ssp. tanzanius NRRL 18036 abgekratztem Mycel beimpft. Das Medium wurde dann in einem Rotationsschüttler angeordnet und 48 Stunden lang bei 28ºC inkubiert. Dieses primäre Inoculum wurde dann zum Beimpfen von 10 Litern des gleichen sterilen Mediums in einer Flasche benutzt. Dieses Medium wurde 24 Stunden lang gezüchtet und ergab ein sekundäres Impfmaterial. Dieses sekundäre Impfmaterial wurde dann zum Beimpfen von 52 Litern des gleichen sterilen Mediums in einem Tank benutzt. Man züchtete dieses Medium 48 Stunden lang bei 28ºC mit einer Strömung von 200 Litern steriler Luft pro Liter Brühe pro Minute und Rühren mit einem Rührer bei 220 U/min, wobei man ein tertiäres Inoculum erhielt.

Beispiel 2

Züchtung

Ein Züchtungsmedium der folgenden Zubereitung wurde hergestellt:
Dextrin ... 3,0%
Melassen ... 2,0%
Sojapepton ... 0,75%
Hefeextrakt ... 0,25%
Calciumcarbonat ... 0,2%
Wasser bis zu ... 100,0%
Dieses Medium wurde sterilisiert und dann wurden 2.700 Liter mit 300 Litern des tertiären Impfmaterials von Beispiel 1 beimpft. Die Züchtung wurde bei 28ºC unter einer Strömung von 55 Litern steriler Luft pro Liter Brühe pro Minute und Rühren mit einem mit 100 U/min angetriebenen Rührer 113 Stunden lang ausgeführt, woraufhin der Brei geerntet wurde.

Beispiel 3

Isolation und Reinigung von LL-E19020α und β

Der Erntebrei von 2 Züchtungen bzw. Fermentationen, die, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgeführt wurden, wurden kombiniert, wobei insgesamt 6.000 Liter erhalten wurden, mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 5 eingestellt und durch Diatomeenerde filtriert. Das Filtrat wurde mit Ethylacetat extrahiert und der Extrakt zu einem Sirup konzentriert.
Dieser Sirup wurde in Dichlormethan gelöst und auf 1.000 g Siliciumdioxid (60 bis 200 Maschen) auf einem Trichter aus Sinterglas aufgebracht. Die Siliciumdioxid- Säule wurde zuerst mit Dichlormethan eluiert, wobei vier 2 Liter-Fraktionen gesammelt wurden und dann mit Methanol:Dichlormethan (1:4), wobei eine 4 Liter-Fraktion gesammelt wurde. Diese 4 Liter-Fraktion wurde zur Trockne verdampft und ergab 120 g Rückstand. Der Rückstand wurde in 4 Liter Dichlormethan wieder gelöst und auf 500 g Siliciumdioxid auf einem Trichter aus Sinterglas aufgebracht. Das Siliciumdioxid wurde mit Methanol: Dichlormethan (1:4) eluiert, wobei 2 Liter-Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 1 und 2 wurden kombiniert und verdampft, wobei 99 g rohes LL-E19020α und β erhalten wurden.
Dieses Rohprodukt wurde in Methanol gelöst und auf eine 12 Liter-Umkehrphasensäule (C18 gebundene Phase 40 um) aufgebracht. Die Säule wurde mit Acetonitril, 0,1 M Ammoniumacetat-Puffer, pH 4,3 (1:1) mit einer Geschwindigkeit von 1,0 l/min eluiert: Es wurden dreizehn 24 Liter-Fraktionen gesammelt. Die Fraktion 7 enthielt LL- E19020α, und die Fraktionen 11 bis 13 enthielten LL- E19020β.
Die Antibiotika wurden aus der beweglichen Phase unter Verwendung von Dichlormethan extrahiert, gefolgt von einer Verdampfung und einem Gefriertrocknen aus t-Butanol, wobei man 10 g von LL-E19020α und 14 g LL-E19020β, beide als weiße Feststoffe, erhielt.

Beispiel 4

PASTEURELLA-SCHEIBENTEST

Sterile Papierscheiben (etwa 6 mm Durchmesser) wurden in einer Lösung getränkt, die 2,5 mg/ml der Testverbindung enthielt und über Nacht in einem Brutschrank bei 37ºC getrocknet. Es wurden Vergleichsscheiben aus standardgemäßen Antibiotika hergestellt, um diese zusammen mit den Testverbindungs-Scheiben zu testen. Die getrockneten Scheiben wurden bei 2 bis 4ºC gelagert, bis sie benutzt wurden. Es wurden zwei Testorganismen, Pasteurella multocida 31081B und Pasteurella haemolytica 30660, in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe 5 Stunden lang bei 37ºC gezüchtet. Eine 1:10-Verdünnung jeder Kultur wurde in Mueller-Hinton-Brühe hergestellt. 200 ml Mueller-Hinton-Agar wurden mit 1 ml der verdünnten Kultur beimpft und aseptisch in 9 Zoll x 9 Zoll große Bioassay-Platten gegossen, die von Nunc hergestellt waren. Der Gebrauch der 9 Zoll x 9 Zoll großen Platten gestattet das Testen von 36 Scheiben pro Platte. Geeignete Scheiben wurden auf die beimpften Agarplatten aufgebracht und 18 bis 20 Stunden bei 37ºC inkubiert. Hemmzonen wurden aufgezeichnet.

T. HYODYSENTERIAE-SCHEIBENTEST

Sterile Papierscheiben (etwa 6 mm Durchmesser) wurden in einer Lösung getränkt, die 2,5 mg/ml der Testverbindung enthielt und über Nacht in einem Brutschrank bei 37ºC getrocknet. Es wurden Vergleichsscheiben aus standardgemäßen Antibiotika hergestellt, um diese zusammen mit den Testverbindungs-Scheiben zu testen. Die getrockneten Scheiben wurden bei 2 bis 4ºC gelagert, bis sie benutzt wurden. Zwei T. hyo.-Stämme, B78 (ATCC 27164) und B204 (ATCC 31212) wurden 24 Stunden lang bei 38ºC in Hungate-Züchtrohren, enthaltend 5 ml Gehirn-Herz-Infusionsbrühe, ergänzt mit 2% fötalem Kalbsserum (anaerob hergestellt), gezüchtet. 200 ml von Trypticase-Soja-Agar, enthaltend 5% defibriniertes Rinderblut, wurden mit 1 ml der Kultur beimpft und aseptisch in 9 Zoll x 9 Zoll große Bioassay-Platten gegossen, die von Nunc hergestellt waren. Der Gebrauch der 9 Zoll x 9 Zoll großen Platten gestattet das Testen von 36 Scheiben pro Platte. Geeignete Scheiben wurden auf die Agarplatten aufgelegt, die dann 24 bis 48 Stunden bei 38ºC in einer 80% Stickstoff, 10% Kohlendioxid und 10% Wasserstoff enthaltenden anaeroben Kammer inkubiert wurden, bis die Haemolyse vollständig war. Zonen gehemmter Haemolyse wurden aufgezeichnet.

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER MINIMALEN HEMMKONZENTRATION DURCH AGARVERDÜNNUNG

1. Es wurden serielle Zwei-Strömungs-Verdünnungen des Mittels in Mueller-Hinton-Brühe in einem Bereich von 2560 ug/ml bis 0,15 ug/ml und zusätzlich eine Lösungsmittel-Vergleichsprobe zubereitet.
2. Zwei ml der Mittelverdünnung (10-fach) wurden in sterile Schraubkappen-Flaschen gegeben, zu denen 18 ml Mueller-Hinton-Agar, enthaltend 5,6% defibriniertes Schafsblut, hinzugegeben wurden. Die Endkonzentration des Mittels lag im Bereich von 256 ug/ml bis 0,015 ug/ml in 5% Schafsblut enthaltendem Agar.
3. Einige isolierte Kolonien jedes Testorganismus wurden in 5 ml Trypticase-Soja-Brühe oder Gehirn-Herz- Infusionsbrühe geimpft. Die Kulturen wurden 5 Stunden lang bei 35ºC geschüttelt.
4. Jede Kultur wurde 1:50 (10-1,7) in Mueller-Hinton- Brühe verdünnt und unter Anwendung der Reproduziereinrichtung von Steers auf Agarplatten aufgebracht. Die Vergleichsplatten sollten zuletzt beimpft werden, um sicherzustellen, daß während des ganzen Verfahrens lebensfähige Organismen vorhanden waren. Beimpfte Agarplatten ließ man ungestört stehen, bis die Inoculumflecken vollständig absorbiert waren.
5. Die Platten wurden umgedreht und 18 Stunden ohne CO&sub2; bei 35ºC inkubiert.
6. Die minimale Hemmkonzentration (MIC) wurde als die geringste Konzentration des antimikrobiellen Mittels genommen, bei der eine vollständige Hemmung auftrat. Eine sehr feine, kaum sichtbare Trübung oder eine einzelne Kolonie wurde unbeachtet gelassen.

MIC-TESTORGANISMEN

Staphylococcus aureus ATCC 25923
Staphylococcus aureus 52 "Smith-Stamm"
Staphylococcus aureus 14 ATCC 6538P
Staphylococcus aureus 335 Mastitis-Absonderung
Staphylococcus aureus 336 Mastitis-Absonderung
Staphylococcus aureus 344 Mastitis-Absonderung
Staphylococcus aureus Penicillin-resistent
Streptococus pyogenus ATCC 19615
Streptococus pyogenus 41
Streptococus agalactiae 341
Streptococus agalactiae 342
Streptococus agalactiae 343
Streptococus dysgalactiae 340
Streptococus faecalis 42 Dr. Juke's Nr. 8043
Streptococus uberis Cornell Mastitis Center
Escherichia coli ATCC 25922
Escherichia coli 81
Escherichia coli 80-654 Tetracylin-resistent
Pasteurella multocida 31081B (in vitro Scheibenteststamm)
Pasteurella multocida 80-3548 (in vivo Maus-Modellstamm)
Pasteurella multocida 31451
Pasteurella multocida 32301
Pasteurella multocida 30170B
Pasteurella multocida 80-5945
Pasteurella haemolytica 30660 (in vitro Scheibenteststamm)
Pasteurella haemolytica L-101 National Animal Disease Center
Pasteurella haemolytica 80-6744
Salmonella choleraesuis Variation Kunzendorf I-3
Salmonella choleraesuis Variation Kunzendorf 4
Bordetella bronchiseptica "B"-Stamm
Bordetella bronchiseptica 11266
Bordetella bronchiseptica 31068B
Bordetella bronchiseptica 11948A

MINIMAL-HEMMKONZENTRATIONSVERSUCH FÜR Mycoplasma gallisepticum

1. Es wurden serielle Zweifach-Verdünnungen von Arzneimittel-Ausgangslösungen in Mycoplasma-Brühe in einer Kozentration von 2560 ug/ml bis 0,015 ug/ml zusammen mit einem Lösungsmittel-Vergleich zubereitet. Diese Konzentrationen sind das 10-fache der endgültigen Testkonzentration.
2. Eine gefrorene (-80ºC) Ausgangskultur von Mycoplasma gallisepticum "R"-Stamm wurde aufgetaut und ein 0,5 ml-Teil in 5 ml der Mycoplasma-Kulturbrühe inoculiert. Gleichzeitig wurde 0,1 ml auf eine Mycoplasma-Agarplatte zur Reinheitsüberprüfung aufgebracht. Beide Kulturen wurden bei 37ºC incubiert. Das Wachstum in der Brühe wird durch eine Farbänderung von rot zu gelb angezeigt. Das Wachstum auf Agar wird mittels eines Stereoskops beobachtet.
3. Der MIC-Versuch wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bzw. Bohrungen ausgeführt. In jede Bohrung wurden 25 ul der 10-fachen Arzneimittellösung hinzugegeben. Es sind auch geeignete Lösungsmittel- Vergleichsversuche eingeschlossen.
4. Das Mycoplasma-Inoculum wurde zubereitet durch Übertragen einer positiven Kulturbrühe in frisches Medium unter Anwendung eines Verhältnisses von 0,2 ml Kultur zu 5,0 ml Medium. Unter Anwendung der obigen Formulierung würden große Mengen Impfmaterial zubereitet.
5. Ein 225 ul-Teil der vorher inoculierten Mycoplasma- Brühe wurde zu jeder Testbohrung hinzugegeben und gemischt. Es wurde ein Kunststoff-Dichtband aufgebracht und über dem Zentrum jeder Testbohrung unter Anwendung steriler Nadeln von 25 Gauge (0,45 mm) ein kleines Löchelchen angeordnet. Um eine gegenseitige Verunreinigung der Bohrungen zu vermeiden, wurden die Nadeln für jedes Mittel geändert. Außerdem erfolgte das Durchstechen des Bandes von der geringsten zur höchsten Konzentration des Arzneimittels. Die endgültigen Testkonzentrationen lagen im Bereich von 256 ug/ml bis 0,0015 ug/ml, bei einem Gesamtvolumen von 250 ul. Bohrungen, die nur 250 ul inoculiertes Medium bzw. nicht inoculiertes Medium enthielten, wurden als weitere Vergleichsproben hinzugefügt.
6. Die Versuchsplatte wurde bei 37ºC incubiert, bis eine Farbänderung der Brühe von rot nach gelb zuerst gleichmäßig durch die Testplatte erscheint. Der MIC- Wert wird als die Konzentration aufgezeichnet, bei der die Farbe (rot) unverändert bleibt. TABELLE IV ANTIBAKTERIELLE DATEN FÜR E19020-α & E19020-β **PRIMÄRER IN VITRO SCHEIBEN-DIFFUSIONSTEST** Zonengröße (mm) Pasteurella multocida 31081B Pasteurella haemolytica 30660 Treponema hyodysenteriae B78 (ATCC 27164) Treponema hyodysenteriae B204 (ATCC 31212) TIAMULIN N/T = nicht getestet TABELLE V MINIMALE HEMMKONZENTRATIONEN DURCH AGARVERDÜNNUNG E19020 ALPHA E19020 BETA Staphylococcus aureus (7) Streptococcus pyogenes (2) Streptococcus agalactiae (4) Streptococcus faecalis (1) Streptococcus uberis (1) Escherichia coli (2) Salmonella choleraesuis (2) Bordetella bronchiseptica (4) Pasteurella multocida (6) Pasteurella haemolytica (3) Bemerkung: Zahlen in Klammern zeigen die Anzahl der getesteten Stämme. TABELLE VI MINIMUM-HEMMKONZENTRATION DURCH MIKROVERDÜNNUNG E19020 ALPHA E19020 BETA CARBADOX TIAMULIN TYLOSIN Treponema hyodysenteriae B78 (ATCC 27164) Treponema hyodysenteriae B204 (ATCC 31212) Mycoplasma gallisepticum "R" N/T = nicht getestet

Beispiel 5

Bewertung der Antibiotika LL-E19020α und LL-E19020β zur Behandlung von mit Clostridium perfringens infiziertem Geflügel

Bei diesen Tests wurden 1 Tag alte Brathähnchen-Küken in Batterie-Brutapparate gesetzt und unter Standardbedingungen mit nicht mit Medikament versehenem Futter aufgezogen, bis sie 12 Tage alt waren. Am Tage 12 wurden die Küken an den Flügeln ergriffen, gewogen und in Gruppen von 10 Vögeln/Verschlag in Wachstums-Batterien gesetzt. Alle Behandlungen, einschließlich der sowohl infizierten als auch nicht infizierten Vergleichsgruppen, wurden viermal wiederholt.
Am Tage 12 wurden alle Vögel in der infizierten Vergleichsgruppe und in den Behandlungsgruppen, die 5 und 10 ppm von E19020α oder E19020β erhalten sollen, mild mit Eimeria acervulina infiziert.
An den Tagen 14 bis 18 (fünf aufeinanderfolgende Tage) wurden allen Vögeln, ausgenommen denen in der nicht infizierten Köntrollgruppe, 5 ml einer über Nacht angesetzten Kulturbrühe von Clostridium perfringens Typ C durch ein Magenrohr verabreicht.
Am Tage 19 wurden alle Vögel gewogen und 3 vorausgewählte Vögel jeder Gruppe getötet und obduziert. Der Grad der Pathologie des Verdauungs- bzw. Darm-Traktes wurde folgendermaßen bewertet:
0 = keine starken Läsionen
1 = dünnwandiger oder zerreibbarer kleiner Darm
2 = Nekrose- und/oder Geschwürherd
3 = große Nekroseflecken
4 = schwere ausgedehnte Nekrose
Die übrigen Vögel wurden weitere 7 Tage gehalten und dann getötet und die Messungen und Daten aufgezeichnet.

DATEN-MESSUNGEN UND AUFZEICHNUNGEN

Einzelne Körpergewichte wurden an den Tagen 12, 19 und 26 bestimmt.
Der Futterverbrauch wurde an den Tagen 12 bis 19 und 26 gemessen.
Zählungen von Darmläsionen an drei Vögeln pro Gruppe wurden am Tage 19 vorgenommen.
Tägliche Beobachtungen der Gesundheit in jedem Verschlag wurden an den Tagen 12 bis 26 vorgenommen.
Die Ergebnisse werden unten angegeben. Bewertung der Antibiotika LL-E19020α und LL-E19020β für die Behandlung von mit Clostridium perfringens infizierten Vögeln BEHANDLUNGSMITTEL Behandlung Infiziert Läsionen % Sterblichkeit Endgewicht Futter/Gewichtszunahme Vergleich

Beispiel 6

Bewertung des Antibiotikums LL-E19020α zur Behandlung von durch Mycoplasma gallisepticum in Geflügel verursachter chronischer Atmungskrankheit

Diese Untersuchung wurde ausgeführt, um die Wirksamkeit des Antibiotikums LL-E19020α gegen durch Mycoplasma gallisepticum verursachte chronische Atmungskrankheit in Geflügel zu bewerten. Das Antibiotikum wurde kontinuierlich in einer Menge von 10 und 50 g/Tonne für 7 Tage vor der Infizierung und 7 Tage nach der Infizierung gegeben. Vögel, die in ähnlicher Weise mit einer Diät gefüttert wurden, die 100 g Tetracyclin/Tonne enthielt, dienten als eine positive Vergleichsgruppe. Infizierte und nicht infizierte, nicht mit Arzneimittel versehene Vergleichsgruppen wurden auch eingeschlossen. Nach 7 Tagen auf der jeweiligen Behandlungsdiät, wurden die Vögel mit M. gallisepticum (MG) in die rechten und linken Post- Thorax-Luftsäcke infiziert. Die Luftsäcke aller nach der Infektion sterbenden Vögel wurden auf die Anwesenheit von Mycoplasma gezüchtet. Die Luftsäcke aller Vögel wurden durch Obduktion beim Tode oder am Ende der Untersuchung auf der Grundlage starker Läsionen ausgewertet. Die am Ende der Untersuchung überlebenden Vögel wurden vor der Obduktion für eine Mycoplasma gallisepticum - Serologie- Untersuchung ausgeblutet. Messungen des Körpergewichtes und der Futteraufnahme wurden zu angegebenen Intervallen während der Untersuchung ausgeführt. Arzneimittel in Futter Menge (g/Tonne) Mycoplasma-Infektion Anzahl der Versuchskäfige Anzahl Vögel pro Versuch Gesamtzahl der Vögel pro Behandlung Chlortetracyclin Keine

Klinische Beobachtungen:

Es wurden allgemeine klinische Zeichen für die Vögel in jedem Käfig an jedem Tag nach der Infizierung aufgezeichnet. Die Zeichen schlossen Atmungsgeräusche (Rassein), Einschnitte und gesträubte Federn ein

Bewertung der Luftsack-Läsionen:

Die Luftsäcke wurden folgendermaßen bewertet:
0 = normal, sauber, keine Läsionen
1 = leichte Trübung und Verdickung
2 = leicht sichtbares graues bis gelbes Exsudat und verdickt
3 = sehr exsudativ und verdickt Gesamtzusammenfassung der Leistungsfähigkeit und der Läsionsdaten Behandlung Mittleres Endgewicht (g) der Überlebenden Gesamtfutter zu Gewichtszunahme Gesamt-% Sterblichkeit Mittlere Anzahl von Luftsach-Läsionen 1 10 g LL-E19020α/Tonne 5 100 g Chlortetracyclin/Tonne 6 Infiziert, ohne Arzneimittel 7 Nicht infiziert, ohne Arzneimittel
Aus den obigen Daten ist ersichtlich, daß mit Mycoplasma gallisepticum infizierte Küken, die 50 g des Antibiotikums LL-E19020α pro Tonne Futter erhielten, eine bessere Gewichtszunahme, ein besseres Verhältnis von Futter zu Gewichtszunahme und wenigen Sterblichkeit zeigten, als infizierte, nicht mit Medikament versehene Küken.

Claims

1. Verwendung des Antibiotikums LL-E19020α, LL-E19020β oder eines physiologisch akzeptablen Salzes davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung nekrotischer Enteritis und chronischer Atmungskrankheit in infizierten Vögeln.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Vögel Geflügel, in Gefangenschaft gezüchtete Jagdvögel, Hausvögel oder Vögel in zoologischen Gärten sind, die mit Clostridium perfringens oder Mycoplasma callisepticum infiziert sind.

3. Verwendung nach Anspruch 1 zur oralen Verabreichung des Medikamentes an die Vögel in Konzentrationen von 0,5 ppm bis 1.000 ppm in oder mit dem Futter oder Trinkwasser für die Vögel.

4. Verwendung nach Anspruch 1, worin die infizierten Vögel Hühner oder Truthähne sind und das Medikament zur Verabreichung im Futter ist, das 1,0 ppm bis 50 ppm von LL-E19020α, LL-E19020β oder eines physiologisch akzeptablen Salzes davon enthält.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin die infizierten Vögel Hühner oder Truthähne sind und das Medikament zur Verabreichung im Trinkwasser ist, das 1,0 ppm bis 50 ppm von LL-E19020α, LL-E19020β oder eines physiologisch akzeptablen Salzes davon enthält.