CN101090729B - ***干细胞抗原(psca)变体及其序列 - Google Patents

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Abstract

描述了PSCA及其编码的蛋白和变体，其中PSCA在正常成人组织中显示组织特异性表达而在表I所列癌症中异常表达。因此PSCA可为癌症提供诊断、预后、预防和/或治疗的靶标。PSCA基因或其片段、或其编码蛋白、或其变体、或其片段可用来诱导体液或细胞免疫应答；与PSCA反应的抗体或T细胞可用于主动免疫或被动免疫。

Description

***干细胞抗原(PSCA)变体及其序列
技术领域
本文描述的本发明涉及称为PSCA的基因以及它们编码的蛋白质，在某些癌症中表达，并涉及用于表达PSCA的癌症的诊断和治疗方法及组合物。
背景技术
癌症是仅次于冠心病的第二大人类死亡原因。世界范围内每年有数百万人死于癌症。仅在美国，如美国癌症协会的报告，癌症每年造成50万以上的人死亡，同时每年有120万人被新诊断患有癌症。虽然死于心脏病的人数明显较多，但死于癌症的人数正在逐渐上升。在下世纪初，预计癌症将称为首号死亡原因。
世界范围内，有几种癌症是主要的杀手。尤其是肺癌、***癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和卵巢癌，它们是癌症死亡的主要原因。这些癌症以及事实上所有其它癌症都具有致命特征。几乎没有例外地，转移性癌疾病是致命的。此外，即便对于那些在原发性癌中存活下来的癌症患者而言，yi,gif般经验显示，他们的生活都发生了显著的改变。许多癌症患者由于担心复发或治疗失败而产生了强烈的焦虑感。许多癌症患者在治疗后身体虚弱。此外，许多癌症患者会经历复发。
世界范围内，***癌是男性第四大流行癌症。在北美和北欧，它几乎是男性中最常见的癌症，同时是造成男性癌症死亡的第二大原因。仅在美国，每年有30,000以上的男性死于这种疾病—仅次于肺癌。除了这些数字数值巨大，还没有转移性***癌的有效治疗方法。外科***切除术、放疗、激素注射治疗、手术***和化疗仍然是主要的治疗手段。不幸的是，这些治疗方法对于许多人无效，并且常常会带来不希望的结果。
就诊断而言，缺乏能准确检测早期局限性肿瘤的***肿瘤标记仍旧是这种疾病诊断和治疗中的yi,gif个重要限制。尽管血清***特异性抗原(PSA)检测已经成为yi,gif种有效工具，但广泛认为它在һ些重要方面缺乏特异性和通用性。
通过产生可再现小鼠中疾病不同阶段的***癌异种移植物促进了其它***癌特异性标记的鉴定。LAPC(洛杉矶***癌)异种移植物是在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中有存活传代的***癌异种移植物，并显示出模拟从雄激素依赖转变为雄激素不依赖性(Klein等，1997，Nat.Med.3：402)。最近鉴定的***癌标记包括PCTA-1(Su等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：7252)、***特异性膜(PSM)抗原(Pinto等，Clin Cancer Res1996-9-2(9)：1445-51)、STEAP(Hubert等，Proc Natl AcadSciUSA.1999-12-7；96(25)：14523-8)和***干细胞抗原(PSCA)(Reiter等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：1735)。
尽管以前鉴定的标记如PSA、PSM、PCTA和PSCA具有有助于诊断和治疗***癌的作用，但还需要鉴定出***癌和相关癌症的其它标记和治疗靶以进一步促进诊断和治疗。
肾细胞癌(RCC)占到成人恶性肿瘤的约3％。一旦腺瘤的直径达到2-3cm就可能恶化。在成人中，两种主要的恶性肾肿瘤是肾细胞腺癌和肾盂或输尿管移行细胞癌。估计在美国肾细胞腺癌的发病率超过29,000例，并且1998年有超过11,600名患者死于这种疾病。移行细胞癌较为少见，其在美国的发病率约为每年500例。
数十年来，手术一直是肾细胞腺癌的主要治疗方法。直到最近，转移性疾病还很难用任何全身疗法来控制。随着最近全身疗法尤其是免疫疗法的发展，持续性应答可能会在合适的患者中进攻转移性肾细胞癌。不过，仍然需要治疗这些患者的有效方法。
在美国所有的新癌症病例中，膀胱癌在男性中约占5％(第五种最常见的瘤)，在女性中占3％(第八种最常见的瘤)。该发病率缓慢增加，且随着老年人口的增加这一数字也在升高。在1998年，估计有54,500病例，其中包括39,500名男性和15,000名女性。在美国，这种年龄调整发病率为每100,000男性32人，每100,000女性8人。历史上男性/女性3:1的比例可能会由于女性吸烟而降低。估计1998年有11,000人死于膀胱癌(7,800名男性和3,900名女性)。膀胱癌的发病率和死亡率随着年龄增加而急剧上升，并且随着人口老龄化而成为日益严重的问题。
大多数膀胱癌在膀胱中会复发。膀胱癌通过经尿道膀胱切除术(TUR)和膀胱内化疗或免疫疗法的组合来治疗。膀胱癌的多病灶和复发特性指出了TUR的局限性。大多数肌肉浸润性癌症不能仅通过TUR治愈。根治性膀胱切除术和尿流改道术是最有效的根治这种癌症的方法，但会对泌尿和性功能造成不可否认的影响。显然还需要对膀胱癌患者有益的治疗方法。
估计2000年美国共发生130,200例结肠直肠癌，包括93,800例结肠癌和36,400例直肠癌。结肠直肠癌是男性和女性中的第三大癌症。在1992-1996年间其发病率显著减低(每年降低2.1％)。研究表明，这些降低是由于检查和息肉切除增加，从而防止了息肉发展成浸润性癌症。估计2000年有56,300人死亡(47,700人死于结肠癌，8,600人死于直肠癌)，占美国癌症死亡总人数的约11％。
目前，外科手术是最常见的治疗结肠直肠癌的方法，对于还未扩散的癌症经常采用这种方法。对于大多数已经深度肠壁穿孔或已经扩散到***的癌症患者，通常在手术前或手术后进行化疗，或化疗加放疗。对结肠癌有时也需要永久性结肠造口术(在腹部形成一开口以排除人体废物)，同时直肠癌也偶尔需要这种手术。仍需要有效的诊断和治疗结肠直肠癌的方法。
估计2000年新增164,100例肺和支气管癌症，占美国总癌症诊出人数的14％。肺和支气管癌症症的发病率在男性中显著降低，从1984年的86.5/100,000降低到1996年的70.0。在20世纪90年代，女性中发病率的增加势头开始放慢。在1996年，女性中的发病率为42.3/100,000。
估计2000年肺和支气管癌症造成156,900人死亡，占总癌症死亡人数的28％。1992-1996年间，肺癌的死亡率在男性中显著降低(每年降低1.7％)，而在女性中该比例却显著上升(每年0.9％)。从1987年以来，相比乳腺癌，每年有更加多的女性死于肺癌，而乳腺癌在过去40年中都是女性癌症死亡的主要原因。肺癌发病率和死亡率降低很大可能与过去30年吸烟率降低有关；然而，女性吸烟率的降低滞后于男性。需要关注的是，尽管成年人的吸烟率已经慢慢降低，但青年人的吸烟率却又在升高。
肺和支气管癌症的治疗方案是由癌症的类型和阶段决定的，其中包括手术、放疗和化疗。对许多局限性癌症而言，通常选择手术治疗。由于这种疾病通常随发现时间而扩散，放疗和化疗通常需要与手术联合使用。可选择化疗本身或与结合放疗来治疗小细胞肺癌；采用这种方案时，大多数患者的症状会缓解，其中有些是长效的。然而，仍旧需要有效的治疗和诊断肺和支气管癌症的方法。
2000年，估计美国妇女中有182,800例新发乳腺癌病例。此外，估计2000年在男性中新诊断出约1,400例乳腺癌病例。在20世纪80年代，女性中乳腺癌的发病率每年增加约4％，而在90年代该发病率比较平稳，约为每100,000人110.6例。
仅在美国，估计2000年有41,200人(40,800名女性，400名男性)死于乳腺癌。乳腺癌在女性癌症死亡中位居第二位。根据最新数据，无论是白人还是黑人，该死亡率在1992-1996年间显著降低，同时在年轻妇女中降低程度最大。这些降低可能是由于早期检查和治疗方法改进的结果。
考虑到医疗环境和患者的状况，乳腺癌的治疗方法可包括局部病灶切除术(局部切除肿瘤)并除去手臂下的***；***切除术(手术切除***)并除去手臂下的***；放疗；化疗；或激素疗法。通常可联合使用两种或多种方法。大量研究显示，对于早期疾病，局部病灶切除术加放疗后的长期存活率与***改良根治术后的存活率类似。重建技术的重大进步能够在***切除术后提供一些关于***再造术的选项。最近，这种再造术已经与***切除术同时进行。
局部切除导管原位癌(DCIS)及周围适量正常***组织可防止DCIS复发。照射***和/或他莫昔芬治疗可降低剩余***组织发生DCIS的机会。这是重要的，因为如果DCIS不治疗的话将发展成浸润性乳腺癌。而且，这些治疗方法有严重的副作用或后遗症。因此，需要有治疗乳腺癌的有效方法。
估计2000年在美国新发23,100例卵巢癌。这占所有妇科癌症的4％并且是第二大妇科癌症。1992-1996年间，卵巢癌发病率显著降低。卵巢癌的结果是，估计2000年有14,000人死亡。相比妇女生殖***的其它癌症，卵巢癌造成更多人死亡。
治疗卵巢癌的方法有手术、放疗和化疗。手术通常包括除去一侧或两侧的卵巢、输卵管(输卵管-卵巢切除术)以及子宫(子宫切除术)。在一些非常早期的肿瘤中，只有有关卵巢会被切除，尤其是对于那些希望生孩子的年轻女性。在发展的疾病中，需要除去腹内所有疾病部位以增强化疗效果。有效治疗卵巢癌的方法仍是重要需求。
估计2000年在美国新发28,300例胰腺癌。在过去20年中，男性胰腺癌的发病率有所降低。女性发病率仍保持几乎恒定，但也可能开始减低。估计2000年在美国胰腺癌造成28,200人死亡。在过去20年中，男性中死亡率有轻微但明显的降低(每年约降低0.9％)，而该比例在女性中轻微升高。
可通过手术、放疗和化疗来治疗胰腺癌。在大多数患者中，这些治疗方法可延长存活时间和/或缓解症状，但不可能全部治愈。迫切需要有其它治疗和诊断胰腺癌的方法。
发明内容
本发明涉及一种称为PSCA的基因，现在已发现这种基因在表I所列的癌症中过度表达。PSCA基因在正常组织中表达的Northern印迹表达分析显示了限于在成人组织中的表达模式。本发明提供了PSCA的核苷酸(图2)和氨基酸(图2和图3)序列，正常成人组织中PSCA的组织相关表达情况以及在表I所列组织中观察到的过度表达现象，显示PSCA在至少一些癌症中异常过度表达，因此可作为癌症组织(如表I所列的那些组织)的一种有用的诊断、预防、预后和/或治疗靶标。
本发明提供了与全部或部分PSCA基因、mRNA和/或编码序列相对应或互补的多核苷酸，优选以分离形式，包括编码PSCA相关蛋白及其4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或25个以上毗连氨基酸的片段；编码PSCA相关蛋白的至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100或100个以上毗连氨基酸，以及多肽/蛋白质本身的多核苷酸；DNA、RNA、DNA/RNA杂合体以及相关分子，与PSCA基因或mRNA序列或其部分互补或具有至少90％同源性的多核苷酸或寡核苷酸，以及能与PSCA基因、mRNA或PSCA编码多核苷酸杂交的多核苷酸或寡核苷酸。还提供了分离cDNA和PSCA编码基因的方法。还提供了含有PSCA多核苷酸的重组DNA分子、用这种分子转化或转导的细胞以及用来表达PSCA基因产物的宿主-载体***。本发明还提供了能结合PSCA蛋白及其多肽片段的抗体，包括多克隆和单克隆抗体、鼠科和其它哺乳动物抗体、嵌合抗体、人源化和完全的人抗体以及用可检测标记标记的抗体或治疗剂。在某些实施方案中，前提是未编码图2的全部核酸序列和/或未制造图2的整个氨基酸序列。在某些实施方案中，图2的整个氨基酸序列被编码和/或图2的整个氨基酸序列被制造，其中任一各自为人单位剂量形式。
本发明还提供了检测各种生物样品中PSCA多核苷酸和蛋白质的存在及状态的方法，以及鉴定表达PSCA的细胞的方法。本发明的一个典型实施方案提供了监测含有或疑有某些生长失调形式如癌症的组织或血液样品中的PSCA基因产物的方法。
本发明还提供了各种免疫原性或治疗性组合物以及治疗表达PSCA的癌症(如表I中列出的组织的癌症)的方法，包括针对抑制PSCA转录、翻译、加工或发挥功能的疗法，以及癌症疫苗。一方面，本发明提供了组合物和包含组合物的方法，以治疗病人表达PSCA的癌症，其中所述组合物包含适合人使用的载体和人单位剂量的一种或多种抑制PSCA制造或功能的试剂。优选所述载体是单一人载体。在本发明的另一方面，所述试剂是与PSCA蛋白发生免疫反应的部分。这种部分的非限制性例子包括但不限于抗体(如单链、单克隆、多克隆、人源化、嵌合或人抗体)、其功能等价物(包括天然产生或合成的)以及它们的组合。所述抗体可与诊断性或治疗性部分偶联。在另一方面，所述试剂是上面定义的小分子。
在另一方面，所述试剂包括含有结合于人HLAI类分子的细胞毒T淋巴细胞(CTL)表位以引发针对PSCA的CTL应答的一种或多种肽，和/或含有结合人HLAII类分子的辅助性T淋巴细胞(HTL)表位以引发HTL应答的一种或多种肽。本发明的肽可(结合)在相同的多肽分子或在一种或多种分离的多肽分子上。在本发明的再一个方面，所述试剂含有表达上述一种或多种CTL或HTL应答刺激肽的一种或多种核酸分子。在本发明的再一个方面，所述一种或多种核酸分子可表达与上述PSCA发生免疫反应的部分。所述一种或多种核酸分子还可以是，或编码，抑制PSCA产生的分子。这种分子的非限制性例子包括但不限于与产生PSCA所必需的核苷酸序列互补的分子(例如与产生PSCA所必需的核苷酸双螺旋形成三螺旋的反义序列或分子)或有效裂解PSCAmRNA的核酶。
需要注意的是，为确定表VIII-XXI和XXII-XLIX(HLA肽汇总表)中所列任何肽在其母体蛋白质(例如变体1、变体2等)中的起始位置，需要考虑三个因素：具体变体、HLA肽表中肽的长度和表VII中的检索肽。通常用独特检索肽来获得具体变体的特定HLA肽。每个检索肽相对于其各自母体分子的位置列于表VII。因此，如果一检索肽开始于位置“X”，必需在表VIII-XXI和XXII-XLIX中每个位置上加上“X-1”的值以得到HLA肽在它们母体分子中的实际位置。例如，如果某具体检索肽开始于其母体分子的第150位，必需在HLA肽每个氨基酸位置加上150-1，即149，以计算该氨基酸在母体分子中的位置。
本发明的一个实施方案包括在汇总表VIII-XXI和XXII-XLIX中至少出现两次的HLA肽，或编码HLA肽的寡核苷酸。本发明的另一个实施方案包括在表VIII-XXI中至少出现一次并在表XXII-XLIX中至少出现一次的HLA肽，或编码HLA肽的寡核苷酸。
本发明的另一个实施方案是包括肽区域的抗体表位或编码该肽区域的寡核苷酸，所述肽区域具有以下特征中的至少两个、三个、四个或五个：
i)图3中各肽的至少5个氨基酸的肽区域，以任何整数递增至图3中蛋白质的全长，包括图5亲水性图谱中数值等于或大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或等于1.0的氨基酸位置；
ii)图3中各肽的至少5个氨基酸的肽区域，以任何整数递增至图3中蛋白质的全长，包括图6亲水性(hydropathicity)图谱中数值等于或小于0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或等于0.0的氨基酸位置；
iii)图3中各肽的至少5个氨基酸的肽区域，以任何整数递增至图3中蛋白质的全长，包括图7可接触残基百分比图谱中数值等于或大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或等于1.0的氨基酸位置；
iv)图3中各肽的至少5个氨基酸的肽区域，以任何整数递增至图3中蛋白质的全长，包括图8的平均屈曲性图谱中数值等于或大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或等于1.0的氨基酸位置；或
v)图3中各个肽的至少5个氨基酸的肽区域，以任何整数递增至图3中蛋白质的全长，包括图9的β-转角图谱中数值等于或大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或等于1.0的氨基酸位置。
附图简述
图1。故意省略。
图2。A)图2A显示了PSCA变体1(也称为“PSCAv.1”或“PSCA变体1”)的cDNA和氨基酸序列。下划线表示起始甲硫氨酸。开放读框位于核酸18-389，其中包括终止密码子。
B)图2B显示了PSCA变体2(也称为“PSCAv.2”)的cDNA和氨基酸序列。下划线表示起始甲硫氨酸密码子。开放读框位于核酸56-427，其中包括终止密码子。
C)图2C显示了PSCA变体3(也称为“PSCAv.3”)的cDNA和氨基酸序列。下划线表示起始甲硫氨酸密码子。开放读框位于核酸423-707，其中包括终止密码子。
D)图2D显示了PSCA变体4(也称为“PSCAv.4”)的cDNA和氨基酸序列。下划线表示起始甲硫氨酸密码子。开放读框位于核酸424-993，其中包括终止密码子。
E)图2E显示了PSCA变体5(也称为“PSCAv.5”)的cDNA和氨基酸序列。下划线表示起始甲硫氨酸密码子。开放读框位于核酸910-1479，其中包括终止密码子。
F)图2F显示了PSCA变体6(也称为“PSCAv.6”)的cDNA和氨基酸序列。下划线表示起始甲硫氨酸密码子。开放读框位于核酸83-427，其中包括终止密码子。
G)PSCAv.2、PSCAv.7至v.18的SNP变体。PSCAv.7至v.18蛋白质含有123个氨基酸。变体PSCAv.7至v.18是有一个核苷酸不同于PSCAv.2的变体，并编码与v.2相同的蛋白质。虽然分别显示了这些SNP变体，但它们也可以上面图2A-2F中列出的任何组合和任何转录变体存在。
H)PSCAv.4、PSCAv.19至v.30的SNP变体。PSCAv.19至v.30蛋白质含有189个氨基酸。变体PSCAv.19至v.30是有一个核苷酸不同于PSCAv.4的变体。PSCAv.9、v.10、v.11、v.24和v.25蛋白质只有一个氨基酸不同于PSCAv.1。PSCAv.23、v.28、v.29和v.30编码与v.4相同的蛋白质。虽然分别显示了这些SNP变体，但它们也可以任何组合和以任何转录变体v.3和v.4存在。
图3。
A)图3A显示PSCAv.1的氨基酸序列；含有123个氨基酸。
B)图3B显示PSCAv.3的氨基酸序列；含有94个氨基酸。
C)图3C显示PSCAv.4的氨基酸序列；含有189个氨基酸。
D)图3D显示PSCAv.6的氨基酸序列；含有114个氨基酸。
E)图3E显示PSCAv.19的氨基酸序列；含有189个氨基酸。
F)图3F显示PSCAv.20的氨基酸序列；含有189个氨基酸。
G)图3G显示PSCAv.21的氨基酸序列；含有189个氨基酸。
H)图3H显示PSCAv.22的氨基酸序列；含有189个氨基酸。
I)图3I显示PSCAv.24的氨基酸序列；含有189个氨基酸。
J)图3J显示PSCAv.25的氨基酸序列；含有189个氨基酸。
K)图3K显示PSCAv.26的氨基酸序列；含有189个氨基酸。
L)图3L显示PSCAv.27的氨基酸序列；含有189个氨基酸。
在本文中，除非另有说明，当提及PSCA时包括其所有变体，包括图2、3、10、11和12中示出的那些变体。
图4。PSCAv.4与人***干细胞抗原(gi27482160)的排列对比。
图5.图5(a)-(c)：采用Hopp和Woods的方法(Hopp T.P.，Woods K.R.，1981.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828)通过计算机算法序列分析确定的PSCAv.1、v.3和v.4的亲水性氨基酸图谱，通过ExPasy分子生物学服务器在万维网的Protscale站点获得(expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)。
图6。图6(a)-(c)：采用Kyte和Doolittle的方法(Kyte J.，Doolittle R.F.，1982.J.Mol.Biol.157：105-132)通过计算机算法序列分析确定的PSCAv.1、v.3和v.4的氨基酸亲水性图谱，通过ExPasy分子生物学服务器在万维网的Protscale站点获得(expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)。
图7。图7(a)-(c)：采用Janin方法(Janin J.，1979Nature277：491-492)通过计算机算法序列分析确定的PSCAv.1、v.3和v.4的氨基酸可接触残基百分比图谱，通过ExPasy分子生物学服务器在万维网的Protscale站点获得(expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)。
图8。图8(a)-(c)：采用Bhaskaran和Ponnuswamy的方法(Bhaskaran R.和Ponnuswamy P.K.，1988.Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255)通过计算机算法序列分析确定的PSCAv.1、v.3和v.4的氨基酸平均屈曲性图谱，通过ExPasy分子生物学服务器在万维网的Protscale站点获得(expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)。
图9。图9(a)-(c)：采用Deleage和Roux的方法(Deleage，G.，Roux B.1987ProteinEngineering1:289-294)通过计算机算法序列分析确定的PSCAv.1、v.3和v.4的氨基酸β转角图谱，通过ExPasy分子生物学服务器在万维网的Protscale站点获得(expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)。
图10。PSCA转录变体的外显子组成。变体PSCAv.2、v.3、v.4和v.5是v.1是转录变体。相比v.1，变体v.2在距离5’末端47bp处开始转录。相比v.2，变体v.3有一个较短的外显子2。变体v.4和v.5具有可选的第一外显子。相比v.4，变体5保留第二个内含子。人类基因组中可能的外显子的顺序显示在底部。图中未显示聚腺苷酸尾。外显子的两端用框显示。框下“()”中的数字与PSCAv.2中的数字相对应。内含子和外显子的长度不成比例。
图11。图11(a)：PSCA蛋白变体排列对比的示意图。蛋白变体与核苷酸变体相对应。核苷酸变体PSCAv.2、v.7至v.18编码与v.1相同的蛋白质。变体v.5编码与v.4相同的蛋白质，蛋白质v.3是v.4的一部分。核苷酸变体PSCAv.2、v.3、v.4和v.5是v.1的转录变体，如图10所示。v.2中的SNP在v.2中不造成密码子改变，但在v.3、v.4和v.5中造成密码子改变。在框上方标出了单个氨基酸差异。黑框表示与PSCAv.1相同的序列。框下的数字与PSCAv.1相对应。图11(b)：从PSCAv.4的SNP变体翻译的蛋白变体排列对比的示意图。蛋白变体与核苷酸变体相对应。核苷酸变体PSCAv.23、v.28、v.29和v.30编码与v.4相同的蛋白质。v.4中的SNP在v.4中导致一氨基酸改变，也在v.4中导致一氨基酸改变，如果发生在aa96-189之间也在v.3中导致一氨基酸改变。在框上方标出了单个氨基酸差异。黑框表示与PSCAv.4相同的序列。框下的数字与PSCAv.4相对应。
图12。图12(a)：PSCAv.2的SNP变体排列对比示意图。相比变体v.2，变体PSCAv.6-v.18是有单个氨基酸差异的变体。变体v.6改变了从56-427到83-427的ORF发生改变。尽管分别显示出了这些SNP变体，但他们也可以发生在任何组合在任何含有碱基对的转录变体中出现，如图12所示的v.4。数字与PSCAv.2的那些数字相对应。黑框显示与PSCAv.2相同的序列。在框上示出了SNP。图12(b)：PSCAv.4SNP变体排列对比的示意图。相比变体v.4(ORF：424-993)，变体PSCAv.19至v.30是有单个氨基酸差异的变体。尽管分别显示出了这些SNP变体，但他们也可以发生在任何组合和任何含有该碱基对的转录变体中，如图10所示的v.5。数字与PSCAv.4的那些数字相对应。黑框显示与PSCAv.4相同的序列。在框上示出了SNP。
图13。PSCA蛋白变体的次要结构和跨膜结构域预测。图13A、13B、13C和13D：预测的PSCA蛋白变体1(SEQ ID NO：6532)、变体3(SEQ ID NO：6536)、变体4(SEQ IDNO：6540)和变体6(SEQ ID NO：6546)(分别为图A-D)的次要结构，采用HNN-分级神经网络法(NPS@：Network Protein Sequence Analysis TIBS2000-03，第25卷，No3[291]：147-150CombetC.、BlanchetC.、GeourjonC.和DeléageG.，http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_nn.html)，可从位于万维网的ExPasy分支生物学服务器获得(.expasy.ch/tools/)。该方法从蛋白质主要序列预测了α螺旋、延伸链和随机卷曲的存在和定位。列出了每个蛋白质给定次要结构的百分比。图13E、13G、13I和13K：PSCA变体1、3、4和6中跨膜区存在概率的示意图，分别基于Hofmann和Stoffel的TMpred算法，这种算法利用TMBASE(K.Hofmann，W.Stoffel.TMBASE-蛋白跨膜节段数据库，Biol.Chem.Hoppe-Seyler374:166，1993)。图13F、13H、13J和13L：PSCA变体1中跨膜区存在概率的示意图，基于Sonnhammer、von Heijne和Krogh的TMHMM算法(Erik L.L.Sonnhammer、Gunnar vonHeijne和Anders Krogh：《预测蛋白质序列中跨膜螺旋的隐藏Markov模型》(AhiddenMarkov model for predicting transmembrane helices in protein sequences)，选自分子生物学智能***，第6届国际会议论文集，p175-182，J.Glasgow、T.Littlejohn、F.Major、R.Lathrop、D.Sankoff和C.Sensen编，Menlo Park，CA：AAAI Press，1998)。TMpred和TMHMM算法可从ExPasy分子生物学服务器获得(http://www.expasy.ch/tools/)。
图14。PSCA变体的表达。图14(A)：设计引物来区分PSCAv.1/v.2/v.4、PSCAv.3和PSCAv.5。PSCAv.1/v.2/v.4得到425bp的PCR产物，PSCAv.3得到300bp的PCR产物，而PSCAv.5得到大小为910bp的PCR产物。图14(B)：制备的第一链cDNA得自正常膀胱、脑、心、肾、肝、肺、***、脾、骨骼肌、睾丸、胰、结肠、胃、***癌混合物、膀胱癌、肾癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、转移癌症和胰腺癌制备。通过PCR用肌动蛋白的引物进行标准化。使用变体的特异性引物经30轮扩增进行半定量PCR。结果显示，PSCAv.5主要在乳腺癌、转移癌和胰腺癌中表达，且在结肠癌和肺癌表达水平较低。在***癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、转移癌和胰腺癌中检出PSCAv.1/v.2/v.4的PCR产物。在正常组织中，仅在***和胃中检出PSCAv.1/v.2/v.4的PCR产物，在肾和肺中水平较低，而未在任何正常组织中检出PSCAv.5。PSCAv.3的PCR检测产物未在任何测试样品中被检出。
图15。PSCAv.4和PSCAv.5的表达。图15(A)：设计引物来区分PSCAv.4和PSCAv.5。PSCAv.4得到460bp的PCR产物，而PSCAv.5得到大小为945bp的PCR产物。图15(B)：制备的第一链cDNA得自正常膀胱、脑、心、肾、肝、肺、***、脾、骨骼肌、睾丸、胰、结肠、胃、***癌混合物、膀胱癌和多种异种移植物混合物(***癌、肾癌和膀胱癌异种移植物)。通过PCR用肌动蛋白的引物进行标准化。使用变体特异性引物经30轮扩增进行半定量PCR。结果显示，PSCAv.4在***癌、膀胱癌以及多种异种移植物混合物、正常肾脏和***中表达。仅在正常***和膀胱癌中检出PSCAv.5。
实施本发明的方法
章节概述
I.)定义
II.)PSCA多核苷酸
II.A.)PSCA多核苷酸的用途
II.A.1.)监测遗传异常
II.A.2.)反义实例
II.A.3.)引物和引物对
II.A.4.)分离编码PSCA的核酸分子
II.A.5.)重组核酸分子和宿主-载体***
III.)PSCA相关蛋白
III.A.)带有基序的蛋白质的实例
III.B.)PSCA相关蛋白的表达
III.C.)PSCA相关蛋白的修饰
III.D.)PSCA相关蛋白的用途
IV.)PSCA抗体
V.)PSCA细胞免疫应答
VI.)PSCA转基因动物
VII.)检测PSCA的方法
VIII.)监测PSCA-相关基因状态及其产物的方法
IX.)鉴定与PSCA相互作用的分子
X.)治疗方法和组合物
X.A.)抗癌疫苗
X.B.)PSCA作为抗体疗法的靶标
X.C.)PSCA作为细胞免疫应答的靶标
X.C.1.小基因疫苗
X.C.2.CTL肽和辅助肽的组合
X.C.3.CTL肽和T细胞引发剂的组合
X.C.4.含有用CTL和/或HTL肽脉冲的DC的疫苗组合物
X.D.)过继免疫治疗
X.E.)出于治疗或预防目的的疫苗接种
XI.)PSCA的诊断和预后实施方案
XII.)抑制PSCA蛋白的功能
XII.A.)用胞内抗体抑制PSCA
XII.B.)用重组蛋白抑制PSCA
XII.C.)抑制PSCA转录或翻译
XII.D.)治疗方法的总体考虑
XIII.)PSCA调节剂的鉴定、特性分析和用途
XIV.)试剂盒/制造物品
I.)定义：
除非另有说明，本文所用的所有技术术语、符号以及其它科学名词或术语具有本发明所属技术领域的熟练技术人员常规理解的含义。一些情况下，具有常规理解的术语在这里被定义以便澄清和/或用来参考，本文在的这种定义不应该被解释为它与本领域的通常理解的含义有实质性区别。这里描述或引用的许多技术和方法是容易理解的并且通常可由精通本领域的技术人员使用常规方法来进行，例如广泛采用的在Sambrook等的《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉港，纽约)中所述的分子克隆法。除非另有说明，使用市售试剂盒和试剂的方法宜通常按照制造商规定的过程和/或参数进行。
术语“晚期***癌”、“局部晚期***癌”、“晚期疾病”和“局部晚期疾病”是指已经扩展突破***包膜的***癌，包括美国泌尿学会(AUA)***定义的第C期疾病、Whitmore-Jewett***定义的第C1-C2期疾病和TNM(肿瘤、结节、转移)***定义的第T3-T4期及N+期疾病。通常不推荐对局部晚期疾病患者进行手术，相比临床局限性(器官局限性)***癌患者，这些患者的手术结果基本上都不好。在临床上可通过***的外侧缘上有可触及的硬化或***底部不对称或硬化来确定局部晚期疾病。如果肿瘤侵入或透过***包膜，扩展到手术边缘或侵入精囊，局部晚期***癌目前通过根治性***切除术进行病理学检查作出诊断。
“改变天然糖基化模式”在这里是指删除在天然PSCA序列上发现的一个或多个糖部分(通过除去潜在的糖基化位点或通过化学和/或酶方法删除糖基化位点)，和/或加入一个或多个天然PSCA序列中不存在的糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白质糖基化的性质改变，包括存在的各种糖部分的性质和比例的改变。
术语“类似物”是指与另一分子(例如PSCA相关蛋白)结构类似或共同具有类似或相应属性的分子。例如，PSCA蛋白的类似物可被特异性结合PSCA的抗体或T细胞特异性结合。
术语“抗体”以最广泛含义使用。因此，“抗体”可以是天然产生的或人造的，如通过常规杂交瘤技术制造的单克隆抗体。抗-PSCA抗体包括单克隆和多克隆抗体，以及含有这些抗体的抗原结合域和/或一个或多个互补决定区的片段。
“抗体片段”被定义为与其靶分子结合的免疫球蛋白分子的至少部分可变区，即抗原结合区。在一个实施方案中，它特别包括单个抗-PSCA抗体及其克隆(包括激动、拮抗和中和抗体)和具有多表位特异性的抗-PSCA抗体组合物。
术语“密码子优化序列”是指通过置换在特定种类宿主中使用频率低于约20％的密码子而优化的核苷酸序列。除密码子最优化之外，通过去除假聚腺苷化序列、去除外显子/内含子剪接信号、去除转座子样重复序列和/或优化GC含量而最优化在给定的宿主中的表达的核苷酸序列在这里被称为“表达增强序列”。
“组合文库”是通过化学合成或生物合成将许多化学“构件”(如试剂)组合而产生的不同化合物的集合。例如，线性组合化学文库，如多肽(如突变蛋白)文库，是用所有可能的方法将一组叫做氨基酸的化学构件组合成给定的化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数目)而形成的。大多数化合物是通过这种化学构件的组合混合合成的(Gallop等，J.Med.Chem.37(9)：1233-1251(1994))。
组合文库的制备和筛选是精通精通本领域是技术人员熟知的。这种组合化学文库包括但不限于，肽文库(见例如美国专利第5,010,175号，Furka，Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)，Houghton等，Nature，354：84-88(1991))、类肽(PCT公布WO91/19735)、编码肽(PCT公布WO 93/20242)、随机生物寡聚物(PCT公布WO92/00091)、苯并二氮杂草(美国专利号5,288,514)、diversomers如乙内酰脲、苯并二氮杂草和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA90：6909-6913(1993))、插烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))，具有β-D-葡萄糖支架的非肽的肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))、小化合物的类似有机综合体文库(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))、oligocarbarnate(Cho等，Science261：1303(1993))，和/或肽酰膦酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59：658(1994))。通常可见Gordon等，J.Med.Chem.37：1385(1994)，核酸文库(见例如Stratagene，Corp.)、肽核酸文库(见例如美国专利5,539,083)、抗体文库(见例如Vaughn等，Nature Biotechnology14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)、糖类文库(见例如Liang等，Science274：1520-1522(1996)和美国专利号5,593,853)，以及小有机分子文库(见例如苯并二氮杂草，Baum，C&EN，1-18，第33页(1993)；类异戊二烯，美国专利号5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinone)和间噻嗪烷酮(metathiazanone)，美国专利号5,549,974；吡咯烷，美国专利号5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利号5,506,337；苯并二氮杂草，美国专利号5,288,514；等等)。
制备组合文库的装置可通过商业获得(见例如357NIPS，390NIPS，AdvancedChem Tech，Louisville KY；Symphony，Rainin，Woburn，MA；433A，Applied Biosystems，Foster City，CA；9050，Plus，Millipore，Bedford，NIA)。还开发了许多熟知的机器***来解决相化学(phase chemistry)问题。这些***包括自动工作站，如TakedaChemical Industries，LTD.(日本大阪)开发出的自动合成仪，以及采用模拟化学家手工合成操作的机器臂的机器***(Zymate H，Zymark Corporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett-Packard，Palo Alto，Calif.)。上述任何装置都适用于本发明。对精通本领域的技术人员而言，改进这些装置(如果需要的话)的特性和运行方式使它们能够按本文所述进行运作。此外，许多组合文库自身可通过商业获得(见例如ComGenex，Princeton，NJ；Asinex，Moscow，RU；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；ChemStar，Ltd，Moscow，RU；3D Pharmaceuticals，Exton，PA；Martek Biosciences，Columbia，MD；等等)。
术语“细胞毒剂”是指抑制或阻止细胞表达活性、细胞功能和/或造成细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素化学治疗剂，以及毒素，如细菌、真菌植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。细胞毒剂的例子包括但不限于auristatin、金霉素、maytansinoid、钇、铋、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、combrestatin、duocarmycins、dolostatins、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、mitogellin、retstrictocin、酚霉素、酚霉素、curicin、巴豆毒素、刺孢霉素、Sapaonaria officinalis抑制剂以及糖皮质激素和其它化学治疗剂，以及放射性同位素，如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32和Lu的放射性同位素，包括Lu177。抗体也可与能够将前药转化成其活性形式的抗癌前药活化酶偶联。
“基因产物”在这里有时是指蛋白质或mRNA。例如，“本发明的基因产物”在这里有时是指″癌的氨基酸序列″、″癌蛋白″、“表1所列癌的蛋白质”、″癌的mRNA″、“表1所列癌的mRNA”等等。在一个实施方案中，癌蛋白由图2的核酸编码。所述癌蛋白可以是片段，或者可以是由图2的核酸编码的全长蛋白质的片段。在一个实施方案中，癌氨基酸序列被用来确定序列的相同性或类似性。另一实施方案中，该序列是天然发生的由图2的核酸编码的蛋白质的等位变体。另一实施方案中，该序列是这里进一步描述的序列变体。
用来测定特定核酸或蛋白质产物的存在、不存在、定量或其它性质的“高通量筛选”试验是精通本领域的技术人员熟知的。类似地，结合试验和报告基因试验也是熟知的。因此，例如美国专利号5,559,410揭示了蛋白质的高通量筛选法；美国专利号5,585,639揭示了检测核酸结合的高通量筛选法(即用阵列检测)；而美国专利号5,576,220和5,541,061揭示了检测配体/抗体结合的高通量筛选法。
此外，高通量筛选***可通过商业获得(见例如Amersham Biosciences，Piscataway，NJ；Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA；等等)。这些***通常自动完成全部过程，包括所有样品和试剂的吸取、液体分配、定时培育以及最后在适合检测的检测器上阅读微板。这些可配制***提供高通量并能快速启动，并且是高度灵活和客户定制。这种***的制造商提供了各种高通量***的详细方案说明。因此，例如Zymark Corp.提供了描述用来检测对基因转录、配体结合等进行调节的筛选***的技术说明小册子。
术语“同系物”是指通过例如在相应位置具有化学性质相同或类似的残基的序列而显示与另一分子同源的分子。
“人白细胞抗原”或“HLA”是I类或II类人主要组织相容性复合体(MHC)蛋白(见例如Stites等，IMMUNOLOGY，第八版，Lange Publishing，Los Altos，CA(1994)。
术语“杂交”用于多核苷酸时是指常规杂交条件，优选例如在50％甲酰胺/6XSSC/0.1％SDS/100μg/ml ssDNA中杂交，其中，杂交温度高于37℃，同时用0.1XSSC/0.1％SDS洗涤的温度高于55℃。
短语″分离的″或″生物纯的″是指基本上或完全不含在天然状态时通常所伴随物质的成分。因此，本发明所述的分离的肽优选不含在天然环境中通常伴随该肽的物质。例如，一种多核苷酸当与PSCA基因之外的基团或编码PSCA基因产物或其片段之外的多肽的基因相对应或互补的污染性多核苷酸基本分离时则称为是“分离的”。熟练的技术人员可方便地采用核酸分离方法来获得分离的PSCA多核苷酸。例如，当采用物理、机械或化学方法除去细胞成分中PSCA蛋白中通常伴随的蛋白质，则称为PSCA蛋白是“分离的”。熟练的技术人员可方便地采用标准纯化方法以获得分离的PSCA蛋白。或者可通过化学方法制备分离的蛋白质。
术语“哺乳动物”是指任何分类为哺乳动物的生物，包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马和人。在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物是小鼠。在本发明的另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。
术语“转移性***癌”和“转移性疾病”指已经扩散到局部***或扩散到远处部位的***癌，包括AUA***的第D期疾病和TNM***的第TxNxM+期疾病。对于局部晚期***癌病例，通常不对转移性疾病患者进行手术，而激素(雄激素消融)疗法是优选的治疗方法。转移性***癌患者最终会在治疗开始后的12-18个月内发展成雄激素难治状态。这些雄激素难治患者中几乎有半数会在发展到这一阶段后6个月内死亡。***癌转移的最常见部位是骨。***癌骨转移通常是成骨性而不是溶骨性(即导致净骨形成)。骨转移最常见在脊柱中，然后是股骨、骨盘，肋架，颅骨和肱骨。其它常见转移部位包括***、肺、肝和脑。转移性***癌通常通过手术切开或腹腔镜盆腔***切除术、全身放射性核素扫描、骨骼X线照相术和/或骨病灶活组织检查来诊断。
术语″调节剂″或″检测化合物″或″药物候选物＂或语法上的等价表述在这里描述将被检测以了解直接或间接改变癌的表型或癌序列(例如核酸或蛋白质序列)的表达的能力，或癌序列的效应(例如产生信号、基因表达、蛋白质相互作用等)的任何分子，例如蛋白质、寡肽、小有机分子、多糖、多核苷酸等。一方面，调节剂将中和本发明的癌蛋白的效应。″中和″是指蛋白质的活性以及随后对细胞的效应被抑制或阻遏。在另一方面，调节剂使所述蛋白质水平正常化可中和本发明的基因及其相应蛋白质的功效。在优选的实施方案中，调节剂改变表达特征，或这里提供的核酸或蛋白质的表达特征，或改变下游效应子途径。在一个实施方案中，所述调节剂抑制癌症表型，例如正常组织指纹。另一实施方案中，调节剂诱导癌症表型。通常用不同的试剂浓度平行进行检测多个混合物以获得对不同浓度的差异应答反应。通常，将这些浓度之一即零浓度或低于检测水平的浓度作为阴性对照。
调节剂、候选药物或检测化合物包括多种类别的化学试剂，但它们通常是有机分子，优选分子量大于100小于约2,500道尔顿的小有机化合物。优选的小分子小于2000，或小于1500，或小于1000，或小于500D。候选试剂包含在结构上与蛋白质相互作用必需的官能团，具体说是氢键，且通常包含至少一个胺基、羰基、羟基或羧基，优选至少两个化学官能团。所述候选试剂通常包含碳环或杂环结构和/或被一个或多个上述官能团取代的芳香性结构或芳香性聚合结构。调节剂还包括以下生物分子，如肽类、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。特别优选的是肽。一种类别的调节剂是肽，例如含有约5-35个氨基酸，优选含有约20个氨基酸，更优选含有约7-15个氨基酸的肽。优选癌症调节蛋白是可溶的，包括一个非跨膜区和/或一个N-末端Cys以助溶解。在一个实施方案中，片段的C-末端被保留作为游离酸同时N-末端是游离的胺以助偶合，即与半胱氨酸偶合。在一个实施方案中，本发明的癌蛋白与这里所述的免疫原性剂偶联。在一个实施方案中，所述癌蛋白与BSA偶联。本发明的肽，例如优选长度的肽，可相互结合或与其它氨基酸结合以形成较长的肽/蛋白质。这种调节肽可被消化成天然产生的蛋白质(如上文所述)、随机肽或“偏置(biased)”随机肽。在一优选的实施方案中，基于肽/蛋白质的调节剂是这里定义的抗体及其片段。
癌症的调节剂也可以是核酸。核酸调节剂可以是天然产生的核酸、随机核酸或″偏置″随机核酸。例如，原核或真核基因组的消化产物可用于上述蛋白质的相应类似物中。
术语“单克隆抗体”指获自一群基本上均质性抗体的抗体，即包含一群相同的抗体但可能存在少量天然产生的突变体的抗体。
“基序”，如PSCA相关蛋白的生物学基序中指组成蛋白质一级序列一部分的任何氨基酸模式，该模式与某具体功能(例如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等)或修饰(例如磷酸化、糖基化或酰胺化修饰)、或定位(例如分泌序列、核定位序列等)或与产生体液或细胞免疫性相关的序列有关。基序可以是毗连的或能够排列成通常与某种功能或特性有关的某种位置。在HLA基序中，“基序″是指确定长度的肽中残基的模式，对I类HLA基序而言通常是约8-13个氨基酸的肽，对II类HLA基序而言通常是约6-25个氨基酸的肽，它可被特定的HLA分子识别。由各自的人HLA等位基因编码的各个蛋白质的结合HLA的肽基序通常不同，且主要(primary)和次要(secondary)锚定残基的模式也不同。
“药用赋形剂”包括佐剂、载体、pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂、防腐剂等物质。
“药学上可接受的”是指无毒的、惰性的和/或与人或其它哺乳动物生理上相容的组合物。
术语“多核苷酸”表示长度至少为10个碱基或碱基对的核糖核苷酸或脱氧核苷或修饰形式的两种核苷酸类型的聚合形式，指包括DNA和/或RNA的单链和双链形式。在本领域中，该术语通常与“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可包括这里揭示的核苷酸序列，如图2所示，其中的胸腺嘧啶(T)也可以是尿嘧啶(U)；这种定义涉及DNA和RNA化学结构之间的区别，具体地说，RNA中四个主要碱基之一是尿嘧啶(U)而不是胸腺嘧啶(T)。
术语“多肽”表示至少约4、5、6、7或8个氨基酸的聚合物。在该说明书中使用氨基酸的标准三字母或单字母符号。在本领域中，该术语通常与“肽”或“蛋白质”互换使用。
HLA“主要锚定残基(primary anchor residue)”是沿肽序列特定位置上的一个氨基酸认为其能够提供免疫原性肽和HLA分子之间的接触点。确定长度的肽内1-3个，通常是2个主要锚定残基限定了免疫原性肽的一个“基序”。这些残基被认为适合与HLA分子的结合沟紧密接触，同时将它们的侧链***结合沟的特定口袋中。例如，在一个实施方案中，HLA I类分子的主要锚定残基位于位置2(从氨基末端位置算起)并位于本发明所述肽表位羧基末端第8、9、10、11或12残基位置上。或者，另一实施方案中，结合HLA II类分子的肽的主要锚定残基相互间隔而不是在肽的末端，这里的肽的长度通常至少有9个氨基酸。各个基序和超基序(supermotif)的主要锚位置列于表IV。例如，可通过改变表IV所示主要和/或次要锚位置中的特定残基的存在或缺失来产生类似物肽。这种类似物被用来调节包含特定HLA基序或超基序的肽的结合亲和力和/或细胞群覆盖(population coverage)范围。
“放射性同位素”包括但不限于以下这些(同时列出了非限制性的示范用途)：
**医用同位素的例子：
″随机″或语法等价表述在这里用于核酸和蛋白质，表示每种核酸和肽分别都由基本上随机(连接)的核苷酸和氨基酸构成。这些随机肽(或这里讨论的核酸)可在任何位置掺入任何核苷酸或氨基酸。可设计合成方法来产生随机蛋白质或核酸，以在序列长度上形成所有或大多数可能的组合，从而形成随机的候选生物活性蛋白质试剂文库。
在一个实施方案中，文库是“完全随机化的”，在任何位置都没有优选序列或恒定的序列。另一实施方案中，文库是“偏置随机”文库。即序列中的一些位置或保持恒定，要么选自数目有限的可能残基。例如，核苷酸或氨基酸残基可在规定的类别(例如疏水性氨基酸、亲水性残基，空间偏置(小的或大的)残基)中随机选择以形成核酸结合域，形成交联用的半胱氨酸，SH-3结构域用的脯氨酸，磷酸化位点等用的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或组氨酸，或者对于嘌呤等亦是如此。
“重组体”DNA或RNA分子是在体外制作的DNA或RNA分子。
小分子的非限制性例子包括与PSCA结合或相互作用的化合物、配体(包括激素类、神经肽类、趋化因子、添味剂、磷脂以及结合并优选抑制PSCA蛋白功能的其功能等价物)。这种非限制性小分子的分子量宜小于约约10kDa，更优选小于约9、约8、约7、约6、约5或约4kDa。在某些实施方案中，小分子能物理性与PSCA蛋白缔合或结合PSCA蛋白；未在天然产生的代谢途径中被发现；和/或相比非水性溶液更易溶于水溶液。
杂交反应的“严谨性”易由本领域的一般技术人员来确定，且通常可根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭借经验来计算。通常，探针越长，合适退火需要的温度越高，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于当互补链存在于低于解链温度的环境下时变性的核酸序列重退火的能力。探针和可杂交序列之间所需同源性程度越高则可使用相对较高的温度。其结果是，相对较高的温度使反应条件越严谨，而温度越低则反应条件的严谨度越低。杂交反应严谨性的其它细节解释可见Ausubel等，《分子生物学最新方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley IntersciencePublishers，(1995)。
这里定义的“严谨条件”或“高严谨条件”可通过以下特征来鉴定，但不限于此，它们是：(1)洗涤时采用低离子强度和高温，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，温度为50℃；(2)杂交过程中使用甲酰胺等变性剂，例如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)和750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，温度为42℃；或(3)使用50％甲酰胺、5x SSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x登哈特溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，温度为42℃，42℃用0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)洗涤并在55℃用50％甲酰胺洗涤，然后用在55℃用含有EDTA的0.1x SSC以高严谨性洗涤。″中等严谨条件″描述在，但不限于，Sambrook等在《分子克隆实验手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1989)中的描述，并且包括使用严谨程度低于上述条件的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严谨条件的一个例子是在37℃在含有以下成分的溶液中培养一夜：20％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/mL变性剪切的鲑精DNA，然后在约37-50℃用1x SSC洗涤滤膜。熟练的技术人员将了解如何调节温度、离子强度等以适应探针长度等因素。
HLA“超基序”是由两个或多个HLA等位基因编码的HLA分子共享的肽结合特异性。不同种族人群中HLA-超型的所有表型频率列于表IV(F)。各种超型(supetype)的非限制性组成如下：
A2：A*0201，A*0202，A*0203，A*0204，A*0205，A*0206，A*6802，A*6901，A*0207
A3：A3，A11，A31，A*3301，A*6801，A*0301，A*1101，A*3101
B7：B7，B*3501-03，B*51，B*5301，B*5401，B*5501，B*5502，B*5601，B*6701，B*7801，B*0702，B*5101，B*5602
B44：B*3701，B*4402，B*4403，B*60(B*4001)，B61(B*4006)
A1：A*0102，A*2604，A*3601，A*4301，A*8001
A24：A*24，A*30，A*2403，A*2404，A*3002，A*3003
B27：B*1401-02，B*1503，B*1509，B*1510，B*1518，B*3801-02，B*3901，B*3902，B*3903-04，B*4801-02，B*7301，B*2701-08
B58：B*1516，B*1517，B*5701，B*5702，B58
B62：B*4601，B52，B*1501(B62)，B*1502(B75)，B*1513(B77)
不同HLA-超型组合计算出的人群覆盖率列于表IV(G)中。
“治疗”或“治疗的”以及语法上相关的术语在本文中是指对疾病后果的任何改善，如存活时间延长、发病率降低和/或副作用减轻，这些是更换治疗模式的副产品；不要求完全根治疾病。
“转基因动物”(例如小鼠或大鼠)是具有含有转基因的细胞的动物，所述转基因被引入动物或在出生前(例如胚胎阶段)被引入动物的祖先。“转基因”是被整合入细胞的基因组内的DNA，以产生转基因动物。
HLA或细胞免疫应答“疫苗”在这里表示含有或编码一种或多种本发明的肽的组合物。有许多此类疫苗的实例，如一种或多种肽的混合物；多表位(polyepitopic)肽所含的一种或多种本发明的肽；或编码这种单独的肽或多肽的核酸，例如编码多表位肽的小基因。“一种或多种肽”可包含1-150或更多中的任何整数，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150或更多本发明的肽。所述肽或多肽可任选被修饰，如通过脂化、加入靶序列或其它序列。本发明的HLA I类肽可与HLA II类肽混合或连接以易于活化细胞毒T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞的活化。HLA疫苗可包含肽-脉冲的抗原呈递细胞，例如树突细胞。
术语“变体”是指显示不同于所述类型或正常类型的变化的分子，如在明确描述的蛋白质(如图2或图3所示的PSCA蛋白)的相应位置上含有一个或多个不同氨基酸残基的蛋白质。变体蛋白质的一个例子是类似物。剪接同种型和单核苷酸多态性(SNP)是变体的其它例子。
本发明的“PSCA相关蛋白”包括这里特别描述的那些，以及等位变体、保守取代变体、类似物和同系物，它们可按照这里列出的方法或本领域容易获得的方法无需过度实验便可分离/产生并作特征性鉴定。也包括将不同PSCA蛋白或其片段的部分组合产生的融合蛋白以及PSCA蛋白和异源多肽形成的融合蛋白。这种PSCA蛋白统称为PSCA相关蛋白、本发明的蛋白质或PSCA。术语“PSCA相关蛋白”是指有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或25个以上氨基酸；或至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575或576个或更多氨基酸的多肽片段或PSCA蛋白质序列。
II.)PSCA多核苷酸
本发明的一个方面提供了与所有或部分PSCA基因、mRNA和/或编码序列相对应或互补的多核苷酸，优选以分离形式，包括编码PSCA相关蛋白及其片段的多核苷酸、DNA、RNA、DNA/RNA杂合体及有关分子、与PSCA基因或mRNA序列或其部分相互补的多核苷酸或寡核苷酸、以及与PSCA基因、mRNA或与编码PSCA的多核苷酸(统称为“PSCA多核苷酸”)杂交的多核苷酸或寡核苷酸。在章节提及的所有情况下，图2中T也可以是U。
PSCA多核苷酸的实例包括：具有图2所示序列的PSCA多核苷酸，图2所示的PSCA的核苷酸序列，其中将T换成U；具有图2所示序列的多核苷酸的至少10个毗连核苷酸；或具有图2所示序列但将T换成U的多核苷酸的至少10个毗连核苷酸。例如，PSCA核苷酸的实例包括，但不限于：
(I)包含图2所示序列、基本上由其组成或由其组成的多核苷酸，其中T也可以是U；
(II)包含图2A所示序列第18-389位氨基酸残基、基本上由其组成或由其组成，并包含终止密码子的多核苷酸，其中T也可以是U；
(III)包含图2B所示序列第56-427位氨基酸残基、基本上由其组成或由其组成，并包含终止密码子的多核苷酸，其中T也可以是U；
(IV)包含图2C所示序列第423-707位氨基酸残基、基本上由其组成或由其组成，并包含终止密码子的多核苷酸，其中T也可以是U；
(V)包含图2D所示序列第424-993位氨基酸残基、基本上由其组成或由其组成，并包含终止密码子的多核苷酸，其中T也可以是U；
(VI)包含图2E所示序列第910-1479位氨基酸残基、基本上由其组成或由其组成，并包含终止密码子的多核苷酸，其中T也可以是U；
(VII)包含图2F所示序列第83-427位氨基酸残基、基本上由其组成或由其组成，并包含终止密码子的多核苷酸，其中T也可以是U；
(VIII)包含图2G所示序列第56-427位氨基酸残基、基本上由其组成或由其组成，并包含终止密码子的多核苷酸，其中T也可以是U；
(IX)包含图2H所示序列第424-993位氨基酸残基、基本上由其组成或由其组成，并包含终止密码子的多核苷酸，其中T也可以是U；
(X)编码PSCA相关蛋白并与图2A-H所示整个氨基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同源的多核苷酸；
(XI)编码PSCA相关蛋白并与图2A-H所示整个氨基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的多核苷酸；
(XII)编码表VIII-XXI和XXII-XLIX中列出的至少一个肽的多核苷酸；
(XIII)编码图3A肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增至123，并包括在图5的亲水性值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XIV)编码图3A肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增123，并包括在图6的亲水性值小于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XV)编码图3A肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增123，并包括在图7的可接触残基百分比值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XVI)编码图3A肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增123，并包括在图8的平均屈曲性值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XVII)编码图3A肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增123，并包括在图9的β-转角值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XVIII)编码图3B的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增94，并包括在图5的亲水性值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XIX)编码图3B的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增94，并包括在图6的亲水性值小于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XX)编码图3B的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增94，并包括在图7的可接触残基百分比值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXI)编码图3B的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增94，并包括在图8的平均屈曲性值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXII)编码图3B的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增94，并包括在图9的β-转角值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXIII)编码图3C、3E-3L的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增189，并包括在图5的亲水性值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXIV)编码图3C、3E-3L的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增189，并包括在图6的亲水性值小于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXV)编码图3C、3E-3L的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增189，并包括在图7的可接触残基百分比值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXVI)编码图3C、3E-3L的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增189，并包括在图8的平均屈曲性值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXVII)编码图3C、3E-3L的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增189，并包括在图9的β-转角值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXVIII)编码图3D的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增114，并包括在图5的亲水性值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXIX)编码图3D的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增114，并包括在图6的亲水性值小于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXX)编码图3D的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，所述氨基酸的数目以任何整数递增114，并包括在图7的可接触残基百分比值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXXI)编码图3D的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，氨基酸的数目以任何整数递增114，并包括在图8的平均屈曲性值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXXII)编码图3D的肽至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽区域的多核苷酸，氨基酸的数目以任何整数递增114，并包括在图9的β-转角值大于0.5的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXXIII)与(I)-(XXXII)中任一项所述多核苷酸完全互补的多核苷酸。
(XXXIV)由(I)-(XXXII)中任一项所编码的肽；和；
(XXXV)包含(I)-(XXXII)中任一项所述的多核苷酸或(XXXIV)所述肽以及药用赋形剂和/或以人单位剂量形式的组合物；
(XXXVI)在调节细胞表达PSCA的方法中使用(I)-(XXXII)中任一项所述的多核苷酸或(XXXIV)所述的肽或(XXXV)所述的组合物的方法；
(XXXVII)在诊断、预防、预测或治疗具有表达PSCA的细胞的个体的方法中使用(I)-(XXXII)中任一项所述的多核苷酸或(XXXIV)所述的肽或(XXXV)所述的组合物的方法；
(XXXVIII)在诊断、预防、预测或治疗具有表达PSCA的细胞的个体的方法中使用(I)-(XXXII)中任一项所述的多核苷酸或(XXXIV)所述的肽或(XXXV)所述的组合物的方法，所述细胞来自表1所列组织的癌细胞；
(XXXIX)在诊断、预防、预测或治疗癌症的方法中使用(I)-(XXXII)中任一项所述的多核苷酸或(XXXIV)所述的肽或(XXXV)所述的组合物的方法；
(XL)在诊断、预防、预测或治疗表1所列组织的癌症的方法中使用(I)-(XXXII)中任一项所述的多核苷酸或(XXXIV)所述的肽或(XXXV)所述的组合物的方法；以及；
(XLI)在鉴定或特征分析表达PSCA的细胞的调节剂的方法中使用(I)-(XXXII)中任一项所述的多核苷酸或(XXXIV)所述的肽或(XXXV)所述的组合物的方法；
在本文中，某一范围应理解为明确公开了其所有完整单位位置。
这里所揭示的本发明的典型实例包括编码PSCA mRNA序列特定部分的PSCA多核苷酸(以及与该序列互补的序列)，如编码蛋白质和/或其片段的序列，例如：
(a)PSCA变体1的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120和123个或更多毗连氨基酸；其它变体的最大长度为:变体3，94个氨基酸；变体4，189个氨基酸，变体6，114个氨基酸，变体19，189个氨基酸，变体20，189个氨基酸，变体21，189个氨基酸，变体22，189个氨基酸，变体24，189个氨基酸，变体25，189个氨基酸，变体26，189个氨基酸，以及变体27，189个氨基酸。
例如，这里公开的本发明的典型实例包括:编码图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸1-10的多核苷酸以及它们编码的肽本身，编码图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸10-20的多核苷酸，编码图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸20-30的多核苷酸，编码图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸30-40的多核苷酸，编码图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸40-50的多核苷酸，编码图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸50-60的多核苷酸，编码图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸70-80的多核苷酸，编码图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸80-90的多核苷酸，编码图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸90-100的多核苷酸，以约10个氨基酸递增，结束于图2或图3所示的羧基末端氨基酸。因此，编码PSCA蛋白氨基酸的部分氨基酸序列(约10个氨基酸)、第100至羧基末端氨基酸的多核苷酸是本发明的实例。应该理解，每个具体的氨基酸位置包括加或减5个氨基酸残基的位置。
编码PSCA蛋白相对较长部分的多核苷酸也包括在本发明范围之内。例如，编码图2或图3所示PSCA蛋白或“变体”的从1氨基酸(或20或30或40等)到20氨基酸(或30或40或50等)的多核苷酸可用本领域熟知的各种技术来产生。这些多核苷酸片段可包括图2所示PSCA序列的任何部分。
这里揭示的本发明的其它示范性实施方案包括编码PSCA蛋白或“变体”序列中所含的一个或多个生物基序的PSCA多核苷酸片段，包括带有一个或多个基序的表VIII-XXI和XXII-XLIX所列PSCA蛋白或“变体”的亚序列。另一实施方案中，本发明的典型多核苷酸片段编码显示出与已知分子有同源性的PSCA蛋白或变体的一个或多个区域。在本发明的另一个实施方案中，典型的多核苷酸片段可编码一个或多个PSCA蛋白或变体的N-糖基化位点、cAMP以及cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点或N-肉豆蔻酰化位点和酰胺化位点。
注意，为确定表VIII-XXI和表XXII-XLIX(统称为HLA肽表)中所列任何肽在其母体蛋白质(例如变体1、变体2等)中的起始位置，需要考虑三个因素：具体变体、该肽在HLA肽表中的长度和表VII中的检索肽。通常用独特检索肽来获得具体变体的HLA肽。每个检索肽相对其各自母体分子的位置列于表VII。因此，如果一检索肽开始于位置“X”，我们必需在表VIII-XXI和XXII-XLIX中每个位置上加上“X-1”的值以确定HLA肽在它们母体分子中的实际位置。例如，如果一具体检索肽开始于其母体分子的第150位，我们必需在HLA肽每个氨基酸位置上加上150-1，即149，以计算该氨基酸在母体分子中的位置。
II.A.)PSCA多核苷酸的用途
II.A.1.)监测遗传异常
上面所述的多核苷酸有多种不同用途。人PSCA基因的染色体定位图列于题为“PSCA的染色体绘图”的实施例中。例如，由于这种染色体的PSCA基因图，编码PSCA蛋白不同区域的多核苷酸被用来确定该染色体部位的细胞遗传异常，例如鉴定为与各种癌症有关的异常。在某些基因中，包括重排在内的多种染色体异常已经被鉴定为许多不同癌症中经常出现的细胞遗传异常(见例如Krajinovic等，Mutat.Res.382(3-4)：81-83(1998)；Johansson等，Blood86(10)：3905-3914(1995)和Finger等，P.N.A.S.85(23)：9158-9162(1988))。因此，编码PSCA蛋白特定区域的多核苷酸最可能是用来描绘编码可能会造成恶性表型的PSCA的染色体区域中的细胞遗传异常的比原先可能更精确的新工具。文中，这些多核苷酸满足了本领域对提高染色体筛选的灵敏度以鉴定出更加精细和更不常见的染色体异常的需求(见例如Evans等，Am.J.Obstet.Gynecol171(4)：1055-1057(1994))。
此外，已证明PSCA在***和其它癌中高表达，PSCA多核苷酸被用于评定正常组织和癌组织中PSCA基因产物状况的方法。通常，编码PSCA蛋白特定区域的多核苷酸被用来评定PSCA基因特定区域(如含有一个或多个基序的区域)是否存在紊乱(如缺失、***、点突变或导致抗原性丧失的变化)。示范性的检测法包括RT-PCR测定和单链构象多态性(SSCP)分析(见例如Marrogi等，J.Cutan.Pathol.26(8)：369-378(1999)，它们都利用编码蛋白质特定区域的多核苷酸来检测蛋白质内的这些区域。
II.A.2.)反义实例
与这里所述本发明的实施方案有关的其它具体的核酸是基因组DNA、cDNA、核酶和反义分子，以及基于可替换主链或包含可替换碱基的核酸分子，它们可以来自天然来源或者是合成的，并且包括能够抑制RNA或PSCA蛋白质表达的分子。例如，反义分子可以是RNA或其它分子，包括肽核酸(PNA)或非核酸分子，如以碱基对依赖方式特异性结合DNA或RNA的硫代磷酸酯衍生物。熟练的技术人员可用这里所述的PSCA多核苷酸和多核苷酸序列容易获得这些类型的核酸分子。
反义技术需要使用结合细胞内靶多核苷酸的外源寡核苷酸。术语″反义″是指这种寡核苷酸与它们的胞内靶(例如PSCA)互补。见例如Jack Cohen，Oligodeoxynucleotides，Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，1989；和Synthesis1：1-5(1988)。本发明的PSCA反义寡核苷酸包括衍生物，如S-寡核苷酸(硫代磷酸酯衍生物或S-oligo，见Jack Cohen，同上)，这种物质具有增强的抑制癌细胞生长的活性。S-oligo(核苷硫代磷酸酯)是寡核苷酸(O-oligo)的等电子类似物，其中磷酸基的非桥接氧原子被硫原子替代。本发明的S-oligo可用硫原子转移剂3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物处理相应的O-oligo来制备。见例如Iyer，R.P.等，J.Org.Chem.55：4693-4698(1990)；和Iyer，R.P.等，J.Am.Chem.Soc.112：1253-1254(1990)。本发明的其它PSCA反义寡核苷酸包括本领域已知的吗啉代反义寡核苷酸(见例如Partridge等，1996，Antisense & Nucleid Acid Drug Development6：169-175)。
本发明的PSCA反义寡核苷酸通常可以是与PSCA基因组序列的前100个5’密码子和后100个3’密码子或相应的mRNA互补或稳定杂交的RNA或DNA。尽管互补性程度高是优选的，但不要求完全互补。使用与该区域互补的寡核苷酸能够与PSCA mRNA选择性杂交而不与蛋白激酶其它调节亚基的mRNA杂交。在一个实施方案中，本发明的PSCA反义寡核苷酸是含有与PSCA mRNA杂交的序列的反义DNA分子的15至30个残基的片段。任选地，PSCA反义寡核苷酸是与PSCA前10个5’密码子或后10个3’密码子互补的30-个残基的寡核苷酸。或者，所述反义分子被修饰以便用核酶来抑制PSCA表达，见例如L.A.Couture & D.T.Stinchcomb；Trends Genet12：510-515(1996)。
II.A.3.)引物和引物对
本发明这些核苷酸的其它具体实施方案包括能够特异性扩增本发明的多核苷酸或其任何特定部分的引物和引物对，以及与本发明的核酸分子或其任何部分选择性或特异性杂交的探针。探针可用可检测标记标识，如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶标记。这种探针和引物被用来检测样品中是否存在PSCA多核苷酸并被作为检测表达PSCA蛋白的细胞的工具。
这种探针的例子包括含有全部或部分图2所示人PSCA cDNA序列的多肽。能够特异性扩增PSCA mRNA的引物对的例子也在实施例中描述。熟练的技术人员将了解，可基于这里提供的序列来制备大量不同的引物和探针并将它们用来有效扩增和/或检测PSCA mRNA。
本发明的PSCA多核苷酸可用于许多目的，其中包括但不限于将它们用作扩增和/或检测PSCA基因、mRNA或其片段的探针和引物；作为诊断和/或预测***癌以及其它癌症的试剂；作为能够引导PSCA多肽表达的编码序列；作为调节或抑制PSCA基因表达和/或PSCA转录物翻译的工具；以及作为治疗剂。
本发明包括使用这里所述的任何探针鉴定并分离来自天然来源(如人或其它哺乳动物)的PSCA或PSCA相关核酸序列，以及分离的核酸序列本身，所述序列可包含在所用探针中发现的全部或大多数序列。
II.A.4.)分离编码PSCA的核酸分子
这里所述的PSCA cDNA序列能够分离编码PSCA基因产物的其它多核苷酸，以及分离编码PSCA基因产物同系物、交替剪切同种型、等位变体和PSCA基因产物突变形式的多核苷酸，以及编码PSCA相关蛋白类似物的多核苷酸。已经熟知各种用来分离编码PSCA基因的全长cDNA的分子克隆方法(见例如Sambrook，J.等，《分子克隆实验手册》(第二版)，Cold Spring Harbor Press，New York，1989；Ausubel等编的《分子生物学最新方法》，Wiley and Sons，1995)。例如，可用市售的克隆***(例如Lambda ZAP Express，Stratagene)方便地进行λ噬菌体克隆法。可用标记的PSCA cDNA或其片段作为探针来鉴定含有PSCA基因cDNA的噬菌体克隆。例如，在一个实施方案中，可合成PSCA cDNA(例如图2)或其部分并将其用作探针来检索与PSCA基因相对应的重叠和全长cDNA。可通过用PSCA DNA探针或引物筛选基因组DNA文库、细菌人造染色体文库(BAC)、酵母人造染色体文库(YAC)等来分离PSCA基因本身。
II.A.5.)重组核酸分子和宿主-载体***
本发明还提供了含有PSCA多核苷酸、其片段、类似物或同系物的重组DNA或RNA分子，包括但不限于噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、YAC、BAC、以及本领域熟知的各种病毒和非病毒载体，以及被这种重组DNA或RNA分子转化或转染的细胞。产生这种分子的方法可熟知的(见例如Sambrook等，1989，同上)。
本发明还提供的宿主-载体***含有能在合适的原核或真核宿主细胞内(表达)的含有PSCA多核苷酸、其片段、类似物或同系物的重组DNA。合适的真核宿主细胞的例子包括酵母细胞、植物细胞护动物细胞，如哺乳动物细胞或昆虫细胞(例如可被杆状病毒感染的细胞，如Sf9或HighFive细胞)。合适的哺乳动物细胞的例子包括各种***癌细胞系，如DU145和TsuPr1，其它可转染或可转导的***癌细胞系，原代细胞(PrEC)，以及许多通常用来表达重组蛋白的哺乳动物细胞(如COS、CHO、293、293T细胞)。更具体地说，可用任何一种本领域通常使用并被广泛了解的宿主-载体***，利用含有PSCA编码序列或其片段、类似物或同系物的多核苷酸来产生PSCA蛋白残基片段。
可获得许多适合表达PSCA蛋白或其片段的宿主-载体***，见例如Sambrook等，1989，同上；《分子生物学最新方法》，1995，同上)。用于哺乳动物表达的优选的载体包括但不限于pcDNA3.1myc-His-tag(Invitrogen)和逆转录病毒载体pSRαtkneo(Muller等，1991，MCB11：1785)。使用这些表达载体，能够在一些***癌和非***细胞系中表达PSCA，其中包括例如293、293T、rat-1、NIH3T3和TsuPr1细胞。本发明的宿主-载体***可用来制造PSCA蛋白或其片段。这种宿主-载体***可被用来研究PSCA和PSCA突变体或类似物的功能特性。
重组人PSCA蛋白或其类似物或同系物或片段可用被编码PSCA-相关核苷酸的构建物转染的哺乳动物细胞来制造。例如，293T细胞可被编码PSCA或其片段、类似物或同系物的表达质粒转染，从而PSCA相关蛋白在293T细胞中表达，并可用标准纯化方法(例如用抗-PSCA抗体亲和纯化)来分离重组PSCA蛋白。另一实施方案中，PSCA编码序列白亚克隆入逆转录病毒载体pSRαMSVtkneo并用来感染各种哺乳动物细胞系，如NIH3T3、TsuPr1、293和rat-1，以建立PSCA表达细胞系。也可用本领域熟知的各种其它表达***。编码连接到PSCA编码序列读框的前导肽的表达构建物可用来产生分泌形式的重组PSCA蛋白。
如这里所论述的，遗传密码的冗余性允许PSCA基因序列中存在变化。具体地说，本领域已知特定种类的宿主通常具有特定密码子的偏爱，因此可以采纳已知的所需宿主偏爱的序列。例如，优选的类似物密码子序列通常用高频密码子代替罕用密码子(即在所需宿主的已知序列中使用频率不到20％的密码子)。例如可利用在因特网上获得的密码子使用表(URL为dna.affrc.go.jp/～nakamura/cocon.html)可计算出特定种类优选的密码子，。
已知其它的序列修饰可增强细胞宿主内的蛋白质表达。这些修饰包括删除编码假聚腺苷化信号、外显子/内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列，和/或其它此类充分了解的对基因表达有害的序列。序列的GC含量可被调节至给定细胞宿主的平均水平，该水平可参考在细胞宿主内表达的已知基因来计算。可能的话，可对序列进行修饰以避免预测的mRNA发夹次要结构。其它有用的修饰包括在开放读框开始处加入翻译启动共有序列，如Kozak所述，Mol.Cell Biol.，9：5073-5080(1989)。熟练的技术人员知道以下一般原则，即真核核糖体无一例外地从最接近5′端的AUG密码子开始翻译，该原则只在极少情况下失效(见例如Kozak PNAS92(7)：2662-2666，(1995)，和Kozak NAR15(20)：8125-8148(1987))。
III.)PSCA相关蛋白
本发明的其它方面提供了PSCA相关蛋白。PSCA蛋白的具体实施方案包括具有图2或图3所示人PSCA全部或部分氨基酸序列的多肽。或者，PSCA蛋白的实施方式包括在图2或图3所示的PSCA氨基酸序列中有改变的变体、同系物或类似物多肽。
PSCA多核苷酸的实施方式包括：具有图2所示序列的PSCA多肽，图2所示的PSCA的肽序列，其中将T换成U；具有图2所示序列的多肽的至少10个毗连核苷酸；或具有图2所示序列但将T换成U的多肽的至少10个毗连核苷酸。例如，PSCA肽的实施方式包括，但不限于(I)包含图2A-H或图3A-L所示氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的蛋白质；
(II)与图2A-H或图3A-L所示的整个氨基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同源的PSCA相关蛋白；
(III)与图2A-H或图3A-L所示的整个氨基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同的PSCA相关蛋白；
(IV)包含表VIII-XLIX中所列至少一个肽的蛋白质，任选以它不是图2的完整蛋白质为条件；
(V)包含表VIII-XXI中所收集的至少一个肽的蛋白质，该肽也收集于表XXII-XLIX，任选以它不是图2的完整蛋白质为条件；
(VI)包含选自表VIII-XLIX所列的肽中至少两个肽的蛋白质，任选以它不是图2的完整蛋白质为条件；
(VII)包含选自表VIII-XLIX所列的肽中至少两个肽的蛋白质，以该蛋白质不是图2的氨基酸序列的毗连序列为条件；
(VIII)包含选自表VIII-XXI所列的肽中至少一个肽；和选自表XXII-XLIX所列的肽中至少一个肽的蛋白质，以该蛋白质不是图2氨基酸序列的毗连序列为条件；
(IX)包含图3A蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增123，并包括在图5的亲水性值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(X)包含图3A蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增123，并包括在图6的亲水性值小于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XI)包含图3A蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增123，并包括在图7的可接触残基百分比值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XII)包含图3A蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增123，并包括在图8的平均屈曲性值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XIII)包含图3A蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增123，并包括在图9的β-转角值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XIV)包含图3B蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增94，并包括在图5的亲水性值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XV)包含图3B蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增94，并包括在图6的亲水性值小于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XVI)包含图3B蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增94，并包括在图7的可接触残基百分比值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XVII)包含图3B蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增94，并包括在图8的平均屈曲性值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XVIII)包含图3B蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增94，并包括在图9的β-转角值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XIX)包含图3C、3E-3L蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增189，并包括在图5的亲水性值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XX)包含图3C、3E-3L蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增189，并包括在图6的亲水性值小于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXI)包含图3C、3E-3L蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增189，并包括在图7的可接触残基百分比值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXII)包含图3C、3E-3L蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增189，并包括在图8的平均屈曲性值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXIII)包含图3C、3E-3L蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增189，并包括在图9的β-转角值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXIV)包含图3D蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增114，并包括在图5的亲水性值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXV)包含图3D蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增114，并包括在图6的亲水性值小于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXVI)包含图3D蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增114，并包括在图7的可接触残基百分比值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXVII)包含图3D蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增114，并包括在图8的平均屈曲性值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXVIII)包含图3D蛋白质的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的多肽，氨基酸的数目以任何整数分别递增114，并包括在图9的β-转角值大于0.5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸位置；
(XXIX)在表VIII-XXI和XXII-XLIX中收集的出现至少两次的肽；
(XXX)在表VIII-XXI和XXII-XLIX中收集的出现至少三次的肽；
(XXXI)在表VIII-XXI和XXII-XLIX中收集的出现至少四次的肽；
(XXXII)在表VIII-XXI和XXII-XLIX中收集的出现至少五次的肽；
(XXXIII)在表VIII-XXI中出现至少一次并在表XXII-XLIX中出现至少一次的肽；
(XXXIV)在表VIII-XXI中出现至少一次并在表XXII-XLIX中出现至少两次的肽；
(XXXV)在表VIII-XXI中出现至少两次并在表XXII-XLIX中出现至少一次的肽；
(XXXVI)在表VIII-XXI中出现至少两次并在表XXII-XLIX中出现至少两次的肽；
(XXXVII)具有以下特征中的至少2、3、4或5个的肽，或编码这种肽的寡核苷酸：
i)图3的肽至少5个氨基酸的区域，以任何整数递增加至图3的蛋白质的全长，其包含的氨基酸位置在图5的亲水性图谱中值等于或大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，或值等于1.0；
ii)图3的肽至少5个氨基酸的区域，以任何整数递增加至图3的蛋白质的全长，其包含的氨基酸位置在图6的亲水性图谱中值等于或小于0.5、0.4、0.3、0.2、0.1，或值等于0.0；
iii)图3的肽至少5个氨基酸的区域，以任何整数递增加至图3的蛋白质的全长，其包含的氨基酸位置在图7的可接触残基百分比图谱中值等于或大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，或值等于1.0；
iv)图3的肽至少5个氨基酸的区域，以任何整数递增加至图3的蛋白质的全长，其包含的氨基酸位置在图8的平均屈曲性图谱中值等于或大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，或值等于1.0；
v)图3的肽至少5个氨基酸的区域，以任何整数递增加至图3的蛋白质的全长，其包含的氨基酸位置在图9的β-转角图谱中值等于或大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，或值等于1.0；
(XXXVIII)含有(I)-(XXXVII)的肽或抗体或其结合区以及药用赋形剂，和/或以人单位剂量形式的组合物；
(XXXIX)在调节细胞表达PSCA的方法中使用(I)-(XXXVII)的肽或抗体或其结合区或(XXXVIII)的组合物的方法；
(XL)在诊断、预防、预测或治疗具有表达PSCA的细胞的个体的方法中使用(I)-(XXXVII)的肽或抗体或其结合区或(XXXVIII)的组合物的方法；
(XLI)在诊断、预防、预测或治疗具有表达PSCA的细胞的个体的方法中使用(I)-(XXXVII)的肽或抗体或其结合区或(XXXVIII)的组合物的方法，所述细胞来自表1所列组织的癌症；
(XLII)在诊断、预防、预测或治疗癌症的方法中使用(I)-(XXXVII)的肽或抗体或其结合区或(XXXVIII)的组合物的方法；
(XLIII)在诊断、预防、预测或治疗表1所列组织的癌症的方法中使用(I)-(XXXVII)的肽或抗体或其结合区或(XXXVIII)的组合物的方法；和
(XLIV)在鉴定或特性分析表达PSCA的细胞的调节剂的方法中使用(I)-(XXXVII)的肽或抗体或其结合区或(XXXVIII)的组合物的方法。
在本文中，某一范围应理解为明确公开了其所有的全部单元位置。
这里所揭示的本发明的典型实例包括编码PSCA mRNA序列特定部分的PSCA多核苷酸(以及与该序列互补的序列)，如编码蛋白质和/或其片段的序列，例如：
(a)PSCA变体1的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120和123个或更多毗连氨基酸；其它相关变体的最大长度为：变体3，94个氨基酸；变体4，189个氨基酸，变体6，114个氨基酸，变体19，189个氨基酸，变体20，189个氨基酸，变体21，189个氨基酸，变体22，189个氨基酸，变体24，189个氨基酸，变体25，189个氨基酸，变体26，189个氨基酸，以及变体27，189个氨基酸。
通常，天然产生的人PSCA的等位变体具有高结构相同性和同源性(例如90％或更高的同源性)。通常，PSCA蛋白的等位变体在这里所述的PSCA序列中含有保守性氨基酸取代，或含有PSCA同系物相对应位置的氨基酸取代。一类PSCA等位变体是与特定PSCA氨基酸序列至少一个小的区域具有高同源性、但还含有背离该序列的自由基(如非保守性取代、平截、***或移码)的蛋白质。在蛋白质序列的比较中，术语类似性、相同性和同源性分别具有遗传领域已知的明确含义。此外，直向同源性和侧向同源性也是重要的概念，它们描述了一生物体中某一给定蛋白质家族的成员与其它生物体中相同家族的成员之间的关系。
表II提供了氨基酸缩写。通常可在蛋白质内进行保守性氨基酸取代而不改变蛋白质的构象或功能。本发明的蛋白质可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个保守性取代。这种变化包括异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)这些疏水性氨基酸之间的任何相互取代；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，或者反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，或者反之亦然；以及用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，或者反之亦然。其它的取代也可被认为是保守性的，这取决于特定氨基酸的环境以及它在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)通常可互换，丙氨酸(A)和缬氨酸(V)也可互换。相对疏水的甲硫氨酸(M)通常可与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时也可与缬氨酸互换。当赖氨酸(K)和精氨酸(R)的显著特征是这两种氨基酸残基的电荷和pK值差异不明显，通常可以互换。在具体情况下，还有一些其它的变化也可被认为是“保守的”(见例如这里的表III；Lubert Stryer编的《生物化学》(第二版)(Stanford University)第13-15页；Henikoff等，PNAS1992第89卷10915-10919；Lei等，J Biol Chem1995-5-19；270(20)：11882-6)。
这里所述的本发明的实施方案包括大量本领域可接受的PSCA蛋白的变体或类似物，如带有氨基酸***、缺失和取代的多肽。PSCA变体可用本领域已知的方法，例如定点诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来制造。定点诱变(Carter等，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987))、盒式诱变(Wells等，Gene，34：315(1985))、限制选择诱变(Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986))或其它已知技术可在克隆的DNA上进行来产生PSCA变体DNA。
扫描氨基酸分析也可用来鉴定毗连序列上与特定生物活性如蛋白质-蛋白质相互作用有关的一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对较小的中性氨基酸。这种氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是该组中优选的扫描氨基酸，因为它的β碳原子上没有侧链并且不太可能改变变体的主链构象。丙氨酸通常也是优选的，因为它是最常见的氨基酸。此外，它通常发现于被埋没及被暴露的位置(Creighton，Proteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976))。如果丙氨酸取代未产生适量的变体，则可使用等构氨基酸。
如本文的定义，PSCA变体、类似物或同系物的至少一个可鉴别的属性是具有一个表位能与含有图3氨基酸序列的PSCA蛋白起“交叉反应”。在该句中，“交叉反应”是指特异性结合PSCA变体的抗体或T细胞也特异性结合具有图3所示氨基酸序列的PSCA蛋白。当一多肽不再含有任何能够被特异性结合起始PSCA蛋白的抗体或T细胞识别的表位时，该多肽不再是图3所示蛋白质的变体。精通本领域的技术人员知道，识别蛋白质的抗体结合不同大小的表位，从集的约4或5个毗连或不毗连的氨基酸认为是最小表位中典型的氨基酸数目。见例如Nair等，J.Immunol2000165(12)：6949-6955；Hebbes等，Mol Immunol(1989)26(9)：865-73；Schwartz等，JImmunol(1985)135(4)：2598-608。
其它类型的PSCA相关蛋白变体与图3的氨基酸序列或其片段具有70％、75％、80％、85％或90％或更高的类似性。其它特定类型的PSCA蛋白变体或类似物包含一种或多种这里所述的或本领域目前已知的PSCA生物基序。因此，本发明包括相比起始片段功能(例如免疫原性)特性已经改变的PSCA片段的类似物(核酸或氨基酸)。还知道这种基序或本领域已知的基序将被用于图2或图3的核酸或氨基酸序列。
如这里所论述的，本发明的实施方案包括含有小于图2或图3所示PSCA蛋白全长氨基酸序列的多肽。例如，本发明的典型实例包括含有图2或图3所示PSCA蛋白任何4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多毗连氨基酸的肽/蛋白质。
此外，这里揭示的本发明的典型实例包括由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸1-10构成的多肽，由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸10-20构成的多肽，由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸20-30构成的多肽，由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸30-40构成的多肽，由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸40-50构成的多肽，由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸50-60构成的多肽，由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸60-70构成的多肽，由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸70-80构成的多肽，由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸80-90构成的多肽，由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸90-100构成的多肽，依此类推，直至整个PSCA氨基酸序列。此外，由图2或图3所示PSCA蛋白的氨基酸1(或20或30或40等)至20(或130或140或150等)构成的多肽是本发明的实例。应该理解，本段中提到的起点和终点位置表示所指定的位置以及加减5个残基的位置。
PSCA相关蛋白是用标准肽合成技术或用本领域熟知的化学剪接法产生的。或者可用重组方法来产生编码PSCA相关蛋白的核酸分子。在一个实施方案中，可用核酸分子来产生PSCA蛋白的规定片段(或其变体、同系物或类似物)。
III.A.)带有基序的蛋白质的实例
这里所揭示的本发明的其它示范性实施方案包括含有图2或图3所示PSCA多肽序列中所含的一个或多个生物基序的氨基酸残基的PSCA多肽。本领域已知各种基序，并且可通过许多可公开获得的因特网站点(例如有以下URL：pfam.wustl.edu/；searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html；psort.ims.u-tokyo.ac.jp/；cbs.dtu.dk/；ebi.ac.uk/interpro/scan.html；expasy.ch/tools/scnpsit1.html；EpimatrixTM和EpimerTM，Brown University，brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html；以及BIMAS，bimas.dcrt.nih.gov/.)来评估这种基序的存在情况。
在表VIII-XXI和XXII-XLIX中列出并鉴定了带有所有PSCA变体蛋白质带有基序的亚序列。
表V列出了基于pfam检索(见URL pfam.wustl.edu/)的一些常见的基序。表V的各栏列出了：(1)基序名称的缩写，(2)该基序家族不同成员之间的相同性百分比，(3)基序名称或描述，以及(4)最常见的功能；如果该基序与定位有关则还包括位置信息。
鉴于上述PSCA基序与生长失调有关并且由于PSCA在某些癌症(见例如表I)中过度表达，含有上述一个或多个PSCA基序的多肽对于阐明恶性表型的具体特征是有用的。例如，已知酪蛋白激酶II、cAMP和依赖于camp的蛋白激酶以及蛋白激酶C是与恶性表型的发展有关的酶(见例如Chen等，Lab Invest.，78(2)：165-174(1998)；Gaiddon等，Endocrinology136(10)：4331-4338(1995)；Hall等，Nucleic Acids Research24(6)：1119-1126(1996)；Peterziel等，Oncogene18(46)：6322-6329(1999)和O′Brian，Oncol.Rep.5(2)：305-309(1998))。此外，糖基化和肉豆蔻酰化也是与癌症和癌发展有关的蛋白质修饰(见例如Dennis等，Biochem.Biophys.Acta1473(1)：21-34(1999)；Raju等，Exp.Cell Res.235(1)：145-154(1997))。酰胺化是另一种也与癌症和癌发展有关的蛋白质修饰(见例如Treston等，J.Natl.Cancer Inst.Monogr.(13)：169-175(1992))。
另一实施方案中，本发明的蛋白质包含一个或多个用本领域可接受的方法鉴定出的免疫反应性表位(如表VIII-XXI和XXII-XLIX中列出的方法)。可用特定的算法鉴定出PSCA蛋白内能够最佳结合特定HLA等位基因的肽来确定CTL表位(例如表IV；EpimatrixTM和EpimerTM，Brown University，URLbrown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html；以及BIMAS，URLbimas.dcrt.nih.gov/)。此外，鉴定与HLA分子有足够的结合亲和力且与成为免疫原性表位有关的肽的方法是本领域熟知的，并且无需过度实验便可进行。此外，鉴定成为免疫原性表位的肽的方法是本领域熟知的，并且无需过度实验便可在体外或体内进行。
本领域还知道产生这种表位的类似物以调节免疫原性的原理。例如，我们可以从带有CTL或HTL基序(见例如表IV的HLAI类和HLAII类基序/超基序)的表位开始。通过取代一个指定位置的氨基酸并用为该位置指定的另一个氨基酸代替它可以产生类似的表位。例如，基于表IV定义的碱基，我们可以用任何其它残基，例如优选的残基，取代出有害的残基；用优选的残基取代不太优选的残基；或用另一个优选的残基取代最初产生的优选的残基。取代可发生在某肽的主要锚定位置或肽内的其它位置；见例如表IV。
许多参考资料都反映了鉴定 并产生感兴趣的蛋白质及其类似物中的表位的技术。见例如Chesnut等的WO 97/33602；Sette，Immunogenetics199950(3-4)：201-212；Sette等，J.Immunol.2001166(2)：1389-1397；Sidney等，Hum.Immunol.199758(1)：12-20；Kondo等，Immunogenetics199745(4)：249-258；Sidney等，J.Immunol.1996157(8)：3480-90；和Falk等，Nature351：290-6(1991)；Hunt等，Science255：1261-3(1992)；Parker等，J.Immunol.149：3580-7(1992)；Parker等，J.Immunol.152：163-75(1994))；Kast等，1994152(8)：3904-12；Borras-Cuesta等，Hum.Immunol.200061(3)：266-278；Alexander等，J.Immunol.2000164(3)；164(3)：1625-1633；Alexander等，PMID：7895164，UI：95202582；O’Sullivan等，J.Immunol.1991147(8)：2663-2669；Alexander等，Immunity19941(9)：751-761，以及Alexander等，Immunol.Res.199818(2)：79-92。
本发明的有关实施方案包括含有表VI列出的不同基序，和/或一个或多个表VIII-XXI和XXII-XLIX的预测的CTL表位，和/或一个或多个表XLVI-XLIX的预测的HTL表位，和/或一个或多个本领域已知的T细胞结合基序的组合的肽。优选的实施方案在基序或多肽的间插序列中不含***、缺失或取代。此外，也可以考虑在这些基序的任一侧上有多个N-末端和/或C-末端氨基酸残基的实例(例如，包括含有基序的多肽结构的较大部分)。通常，基序任一侧上N-末端和/或C-末端氨基酸残基的数目为约1-100个氨基酸残基，优选5-50个氨基酸残基。
PSCA相关蛋白的实例可以有许多形式，优选分离形式。纯化的PSCA蛋白分子将基本上不含会削弱PSCA与抗体、T细胞或其它配体结合的其它蛋白质或分子。分离和纯化的类型和程度将取决于所需用途。PSCA相关蛋白的实例包括纯化的PSCA相关蛋白和功能化的可溶性PSCA相关蛋白。在一个实施方案中，功能化的可溶性PSCA蛋白或其片段保留被抗体、T细胞或其它配体结合的能力。
本发明还提供了含有图2和图3所示PSCA氨基酸序列的生物活性片段的PSCA蛋白。这种蛋白质具有原始PSCA蛋白的特性，例如能够诱导产生能特异性结合原始PSCA蛋白相关表位的抗体产生；能够被这种抗体结合；能够诱导HTL或CTL的活化；和/或能够被同样特异性结合原始蛋白质的HTL或CTL识别。
含有特别感兴趣结构的PSCA相关多肽可用本领域熟知的各种分析技术来预测和/或鉴定，这些技术包括，例如，Chou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf的分析方法，或基于免疫原性的方法。含有这种结构的片段对于产生亚单位特异性抗-PSCA抗体或T细胞，或鉴定结合PSCA的细胞因子特别有用。例如，可用Hopp，T.P.和Woods，K.R.的方法(1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828)生成亲水性图谱并鉴定免疫原性肽片段。可用Kyte，J.和Doolittle，R.F.的方法(1982，J.Mol.Biol.157：105-132)生成亲水性图谱并鉴定免疫原性肽片段。可用Janin J.的方法(1979，Nature277：491-492)生成可接触残基百分比(％)图谱并鉴定免疫原性肽片段。用Bhaskaran R.，Ponnuswamy P.K.的方法(1988，Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255)生成平均屈曲性图谱并鉴定免疫原性肽片段。可用Deleage，G.，Roux B.的方法(1987，Protein Engineering1：289-294)生成β-转角图谱并鉴定免疫原性肽片段。
可用特定算法确定CTL表位从而鉴定PSCA蛋白内能够最佳结合特定HLS等位基因的肽(例如，通过使用SYFPEITHI站点，其万维网URL地址为syfpeithi.bmi-heidelberg.com/；表IV(A)-(E)的列出的算法；EpimatrixTM和EpimerTM，Brown University，URL(brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html)；以及BIMAS，URL bimas.dcrt.nih.gov/)。用上述算法可预测在本文人MHC I类分子部分所述的来自PSCA的肽表位，例如HLA-A1、A2、A3、A11、A24、B7和B35(见例如表VIII-XXI、XXII-XLIX)。具体地说，PSCA蛋白的整个氨基酸序列以及其它变体的有关部分，即与该变体相对应的预测的HLA I类点突变或外显子两侧任一侧上的9个侧接残基，和预测的HLA II类点突变或外显子两侧任一侧上的14个侧接残基，被用于HLA肽基序检索算法，该算法可在上述Bioinformatics and MolecularAnalysis Section(BIMAS)网址中找到；此外还有SYFPEITHI站点，其URL为syfpeithi.bmi-heidelberg.com/。
HLA肽基序检索算法是由Ken Parker博士根据HLAI类分子，尤其是HLA-A2沟槽中的特定肽序列的结合建立的(见例如Falk等，Nature351：290-6(1991)；Hunt等，Science255：1261-3(1992)；Parker等，J.Immunol.149：3580-7(1992)；Parker等，J.Immunol.152：163-75(1994))。该算法能够对来自完整蛋白质序列的8-肽、9-肽和10-肽进行定位和分级以便预测性地结合HLA-A2和许多其它HLA I类分子(的能力)。许多HLA I类结合肽是8-、9-、10或11-肽。例如，对I类HLA-A2而言，该表位优选在2位含有亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)并在C-末端含有缬氨酸(V)或亮氨酸(L)(见例如Parker等，J.Immunol.149：3580-7(1992))。选出的PSCA预测的结合肽结果示于这里的表VIII-XXI和XXII-XLIX。在表VIII-XXI和XXII-XLVII中显示了选出的每个家族成员的候选(9-肽和10-肽)以及它们的位置、每个特定肽的氨基酸序列和估算的结合力评分。在表XLVI-XLIX中显示了选出的每个家族成员的候选15肽以及它们的位置，各具体肽的氨基酸序列和估算的结合力评分。结合力评分对应于含肽复合体在37℃pH6.5的条件下解离的预计半衰期。预计具有最高结合评分的肽细胞表面的HLA I类分子结合最紧密而半衰期最长，因此给T细胞识别提供了最佳的免疫原性靶标。
肽与HLA等位基因的实际结合可通过抗原加工缺陷细胞系T2上HLA表达的稳定情况来评估(见例如Xue等，Prostate30：73-8(1997)和Peshwa等，Prostate36：129-38(1998))。具体肽的免疫原性可通过体外在抗原呈递细胞(如树突细胞)存在时CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)的激活来评估。
宜将每个通过BIMAS站点、EpimerTM和EpimatrixTM站点预测的表位，或由HLAI类或II类基序指定的表位将被“用于”本发明所述的PSCA蛋白，所述HLA I类或II类基序可用所述技术获得或成为所述技术的一部分，如列于表IV(或用万维网站点URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/，或BIMAS，bimas.dcrt.nih.gov/确定)。“用于”在文中表示评价PSCA蛋白，例如通过视觉评价或通过基于计算机的模式找寻方法，精通相关领域的技术人员可方便地进行。PSCA蛋白的每个带有HLA I类基序的8、9、10或11个氨基酸残基的亚序列，或带有HLA II类基序的9个或更多个氨基酸残基的亚序列都属于本发明范围之内。
III.B.)PSCA相关蛋白的表达
在下面的实施例描述的一个实施方案中，PSCA可在商品化的表达载体转染的细胞(如293T细胞)内方便地表达，商品表达载体例如有CMV-驱动的编码含C-末端6个组氨酸和MYC标记的PSCA的表达载体(pcDNA3.1/mycHIS，Invitrogen或Tag5，GenHunter Corporation，Nashville TN)。Tag5载体提供了一个IgGK分泌信号，可用于促进转染的细胞产生分泌的PSCA蛋白。例如，可采用标准技术用镍柱纯化分泌到培养基中的HIS-标记的PSCA。
III.C.)PSCA相关蛋白的修饰
PSCA相关蛋白的修饰，如共价修饰包括在本发明范围之内。共价修饰的一种类型包括使PSCA多肽的靶氨基酸残基与能够和PSCA蛋白的所选侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生剂反应。本发明范围内的PSCA多肽共价修饰的另一种类型包括改变本发明蛋白质的天然糖基化模式。PSCA共价修饰的另一种类型包括以美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中列举的方式将PSCA多肽连接到多种非蛋白质类型聚合物之一，这些聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。
本发明的PSCA相关蛋白可被修饰以形成含有融合到其它异源多肽或氨基酸序列的PSCA的嵌合分子。这种嵌合分子可通过化学或重组方法合成。嵌合分子可含有融合到其它肿瘤相关抗原或其片段的本发明的蛋白质。或者，本发明所述的蛋白质可含有PSCA序列(氨基酸或核酸序列)片段的融合物，这样便形成了在其长度上不与图2或图3所示氨基酸或核酸序列直接同源的分子。这种嵌合分子可含有多个相同的PSCA亚序列。嵌合分子可包含带有多组氨酸表位标记(提供了固定的镍可选择性结合的表位)的PSCA相关蛋白与细胞因子或与生长因子的融合物。该表位标记通常置于PSCA蛋白的氨基-或羧基-末端。在另一个实施方案中，嵌合分子可包含PSCA相关蛋白与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于这种嵌合分子的二价形式(也成为″免疫粘附素″)，这种融合物可以是IgG分子的Fc区域。Ig融合物宜包含用PSCA多肽的可溶(跨膜结构域被删除或失活)形式代替Ig分子至少一个可变区的取代。在一优选的实施方案中，所示免疫球蛋白融合物包含IgG1分子的绞链、CH2和CH3区，或绞链、CHI、CH2和CH3区。为制造免疫球蛋白融合物，可参见，例如，1995年6月27日发表的美国专利号5,428,130。
III.D.)PSCA相关蛋白的用途
本发明的蛋白质有许多不同的用途。由于PSCA在***癌和其它癌症中高度表达，PSCA相关蛋白被用于评估正常组织和癌组织中PSCA基因产物的状态从而确定恶性表型的方法。通常，来自PSCA蛋白特定区域的多肽被用来评估那些区域(如含有一个或多个基序的区域)中是否存在错乱(如缺失、***、点突变等)。示范性的试验利用靶向含有PSCA多肽序列中所含的一个或多个生物基序的氨基酸残基的PSCA相关蛋白的抗体或T细胞，以评价正常组织和癌组织中该区域的特性，或引发对该表位的免疫应答。或者，含有PSCA蛋白一个或多个生物学活性基序的氨基酸残基的PSCA相关蛋白被用于筛选与PSCA的该区域相互作用的因子。
PSCA蛋白片段/亚序列对于产生或特征分析结构域特异性抗体(例如识别PSCA蛋白胞外或胞内表位的抗体)以鉴定结合PSCA或其特定结构域的自己或细胞因子特别有用，并且在各种治疗和诊断应用中特别有用，包括但不限于诊断测定、癌疫苗和制备这种疫苗的方法。
PSCA基因或其类似物、同系物或片段编码的蛋白质有许多用途，包括但不限于产生抗体和用来鉴定结合PSCA基因产物的配体和其它试剂和细胞成分。产生的抗PSCA蛋白或其片段的抗体可用于诊断和预后测定，并被用于人以表达PSCA蛋白为特征的表I中列出的那些癌症的摄像方法。这种抗体可在胞内表达并被用于治疗这种癌症患者的方法。PSCA-相关核酸或蛋白质也被用来产生HTL或CTL应答。
使用了各种对于检测PSCA蛋白有效的免疫试验，其中包括但不限于各种类型的放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫荧光测定(ELIFA)、免疫细胞化学法等等。抗体可被标记并被用作能够检测表达PSCA的细胞的免疫显象剂(例如在放射闪烁摄像法中)。PSCA蛋白对于产生癌症疫苗也特别有用，这将在文中进一步描述。
IV.)PSCA抗体
本发明的另一方面提供了结合PSCA相关蛋白的抗体。优选的抗体特异性结合PSCA相关蛋白但在生理条件下不结合(或弱结合)不与PSCA相关的蛋白质的肽或蛋白质。文中，生理条件的例子包括：1)磷酸缓冲盐水；2)含25mM Tris和150mM NaCl的Tris缓冲盐水；或生理盐水(0.9％NaCl)；4)动物血清如人血清；或5)1)-4)中任一项的组合；这些反应宜在pH7.5下发生，或在pH7.0-8.0的范围内发生，或在pH6.5-8.5的范围内发生；同时，这些反应在4-37℃的温度下发生。例如，结合PSCA的抗体可结合PSCA相关蛋白，例如其同系物或类似物。
本发明的PSCA抗体对于癌症(见例如表I)诊断和预后检测以及摄像方法特别有用。类似地，这种抗体对于治疗、诊断和/或预测其它癌症也是有用的，只要PSCA也在这些其它癌症中表达或过度表达。此外，胞内表达的抗体(例如单链抗体)在处理与PSCA的表达有关的癌症(例如进行性或转移性***癌)中也有治疗作用。
本发明还提供了各种用来检测和量化OSCA和突变型PSCA相关蛋白的免疫试验。这种试验可包括一种或多种能够适当识别并结合PSCA相关蛋白的PSCA抗体。这些试验可用本领域熟知的各种免疫测定模式进行，其中包括各种类型的放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫荧光测定(ELIFA)等等。
本发明的非抗体免疫测定还可包括T细胞免疫原性测定(抑制或刺激)以及主要组织相容性复合体(MHC)结合检测。
此外，本发明还提供了能够检测***癌和其它表达PSCA的癌症的免疫摄像法，其中包括但不限于使用标记的PSCA抗体的放射闪烁摄像法。这种检测法在临床上用于表达PSCA的癌症(如***癌)的检测、监控和预测。
PSCA抗体也被用于纯化PSCA相关蛋白和分离PSCA同系物及相关分子的方法。例如，纯化PSCA相关蛋白的方法包括在允许PSCA抗体结合PSCA相关蛋白的条件下将含有PSCA相关蛋白的裂解液或其它溶液与已与固体基质偶联的PSCA抗体一起孵育；洗涤该固体基质以除去杂质；并从偶联的抗体洗脱PSCA相关蛋白。本发明所述PSCA抗体的其它用途包括产生模拟PSCA蛋白的抗-独特型抗体。
各种制造抗体的方法是本领域熟知的。例如，可通过用分离形式或免疫偶联形式的PSCA相关蛋白、肽或片段免疫哺乳动物宿主来制备抗体(《抗体实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，CSH Press，Harlow和Lane编辑(1988)；Harlow，《抗体》(Antibodies)，Cold Spring Harbor Press，NY(1989))。此外，也可使用PSCA的融合蛋白，如PSCAGST-融合蛋白。在一具体实施方案中，制造了包含图2或图3的全部或大部分氨基酸序列的GST融合蛋白，然后将其用作免疫原来产生合适的抗体。另一实施方案中，合成了PSCA相关蛋白并将其用作免疫原。
此外，本领域已知的裸DNA免疫技术被用来(有或没有纯化的PSCA相关蛋白或PSCA表达细胞)产生对编码的免疫原的免疫应答(参见Donnelly等，1997，Ann.Rev.Immunol.15：617-648)。
可分析图2或图3中所示的PSCA蛋白的氨基酸序列以选择出产生抗体的PSCA蛋白的特定区域。例如，可利用PSCA氨基酸序列的疏水性和亲水性分析来鉴定PSCA结构中的亲水区域。具有免疫原性结构的PSCA蛋白区域以及其它区域和结构域可方便地用本领域已知的各种其它方法来鉴定，这些方法例如Chou-Fasman、Gamier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf的分析法。可用Hopp，T.P.和Woods，K.R.的方法(1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828)生成亲水性图谱。可用Kyte，J.和Doolittle，R.F.的方法(1982，J.Mol.Biol.157：105-132)生成亲水性图谱。可用Janin J.的方法(1979，Nature277：491-492)生成可接触残基百分比(％)图谱。用Bhaskaran R.，Ponnuswamy P.K.的方法(1988，Int.J.Pept.ProteinRes.32：242-255)生成平均屈曲性图谱。可用Deleage，G.，Roux B.的方法(1987，Protein Engineering1：289-294)生成β-转角图谱。因此，用这些程序或方法中的任何一种鉴定出的各个区域在本发明范围之内。这里还通过实施例的方式进一步阐述了产生PSCA抗体的方法。制备用作免疫原的蛋白质或多肽的方法是本领域熟知的。本领域还熟知制备蛋白质与载体(如BSA、KLH或其它载体蛋白)的免疫原性偶联物的方法。一些情况下，采用直接结合，例如使用碳二亚胺试剂；其它情况下，例如由Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)提供的结合试剂是有效的。像本领域知晓的那样，经常通过在适当时间内与合适的佐剂一起注射来施用PSCA免疫原。在免疫过程中，可通过抗体的滴度来确定是否形成足够抗体。
PSCA单克隆抗体可用各种本领域熟知的方法来制造。例如，众所周知，用Kohler和Milstein的标准杂交瘤技术或改进技术使产生抗体的B细胞永生来制备了分泌所需单克隆抗体的永生细胞系。分泌所需抗体的永生细胞系通过以PSCA相关蛋白作为抗原的免疫测定来筛选。当鉴定出合适的永生细胞培养物时，可扩充细胞并从体外培养物或从腹水液中制造抗体。
本发明的抗体或片段可通过重组方法制造。特异性结合所需PSCA蛋白区域的区域也可在多物种来源的嵌合或互补决定区(CDR)移植抗体形式来生产。也可制造人源化或人PSCA抗体，且它们宜用于治疗。通过用一个或多个非人抗体CDR来代替相应的人抗体序列制备人源化鼠抗体或其它非人抗体的方法是熟知的(见例如Jones等，1986，Nature321：522-525；Riechmann等，1988，Nature332：323-327；Verhoeyen等，1988，Science239：1534-1536)。也可参见Carter等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285和Sims等，1993，J.Immunol.151：2296。
制造完全的人单克隆抗体的方法包括噬菌体展示和转基因方法(参见例如Vaughan等，1998，Nature Biotechnology16：535-539)。完全的人PSCA单克隆抗体可利用人Ig基因大组合文库通过克隆技术产生(即噬菌体展示)(Griffiths和Hoogenboom，“建立体外免疫***：来自噬菌体展示文库的人抗体”(Building aninvitro immune system：human antibodies from phage display libraries)。引自：Clark，M.编写的《用于男性诊断和治疗的抗体分子的蛋白质工程》(Protein Engineering ofAntibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man)，NottinghamAcademic，第45-64页，(1993)；Burton和Barbas，《来自组合文库的人抗体》(HumanAntibodies from combinatorial libraries)。同上，第65-82页)。完全的人PSCA单克隆抗体也可用经过工程构建而含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠来制造，如1997年12月3日公开的Kucherlapati和Jakobovits等的PCT专利申请WO98/24893所述(也可参见Jakobovits，1998，Exp.Opin.Invest.Drugs7(4)：607-614；2000年12月19日发表的美国专利6,162,963；2000年11月12日发表的6,150,584；和2000年9月5日发表的6，114598)。该方法避免了噬菌体展示技术要求的体外操纵，并可有效制造高亲和性真正的人抗体。
PSCA抗体与PSCA相关蛋白的反应性可通过许多熟知的方法来建立，其中包括使用合适PSCA相关蛋白、表达PSCA的细胞或其提取物的Western印迹、免疫沉淀、ELISA和FACS分析。PSCA抗体或其片段可用可检测标记物标记或与第二分子偶联。合适的可检测标记物包括但不限于放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。此外，用本领域通常了解的方法产生对两个或多个PSCA表位的双特异性抗体。均二聚(Homodimeric)抗体也可通过本领域已知的交联技术制得(例如，Wolff等，Cancer Res.53：2560-2565)。
V.)PSCA细胞免疫应答
T细胞识别抗原的机制已被阐明。有效的本发明的肽表位疫苗组合物能在全世界大多数人群中诱导治疗性和预防性免疫应答。为了解本发明的偶联物诱导细胞免疫应答的价值和功效，提供对免疫学相关技术的简单回顾。
HLA-限制性T细胞识别HLA分子和作为配体的肽抗原的复合体(Buus，S.等，Cell47：1071，1986；Babbitt，B.P.等，Nature317：359，1985；Townsend，A.和Bodmer，H.，Annu.Rev.Immunol.7：601，1989；Germain，R.N.，Annu.Rev.Immunol.11：403，1993)。通过研究单个氨基酸取代的抗原类似物和天然加工的内源结合肽的序列测定，已经鉴定出了与HLA的特异性结合抗原分子所需基序相对应的关键残基，列于表IV(也可参见例如，Southwood等，J.Immunol.160：3363，1998；Rammensee等，Immunogenetics41：178，1995；Rammensee等，SYFPEITHI，访问万维网的URL站点(134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm)；Sette，A.和Sidney，J.Curr.Opin.Immunol.10：478，1998；Engelhard，V.H.，Curr.Opin.Immunol.6：13，1994；Sette，A.和Grey，H.M.，Curr.Opin.Immunol.4：79，1992；Sinigaglia，F.和Hammer，J.Curr.Biol.6：52，1994；Ruppert等，Cell74：929-937，1993；Kondo等，J.Immunol.155：4307-4312，1995；Sidney等，J.Immunol.157：3480-3490，1996；Sidney等，人Immunol.45：79-93，1996；Sette，A.和Sidney，J.Immunogenetics1999-11；50(3-4)：201-12，综述)。
此外，HLA-肽复合体的X射线晶体分析显示，HLA分子的肽结合裂隙/沟内的口袋可以等位基因特异性模式容纳肽配体的残基；这些残基又决定了带有它们的肽结合HLA的能力。(见例如Madden，D.R.Annu.Rev.Immunol.13：587，1995；Smith等，Immunity4：203，1996；Fremont等，Immunity8：305，1998；Stern等，Structure2：245，1994；Jones，E.Y.Curr.Opin.Immunol.9：75，1997；Brown，J.H.等，Nature364：33，1993；Guo，H.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：8053，1993；Guo，H.C.等，Nature360：364，1992；Silver，M.L等，Nature360：367，1992；Matsumura，M.等，Science257：927，1992；Madden等，Cell70：1035，1992；Fremont，D.H.等，Science257：919，1992；Saper，M.A.，Bjorkman，P.J.和Wiley，D.C.，J.Mol.Biol.219：277，1991)。
因此，确定I类和II类等位基因特异性HLA结合基序，或者I类或II类超基序能够鉴定出蛋白质内与特定HLA抗原结合的相关区域。
因此，通过鉴定HLA基序可鉴定出基于表位的疫苗候选物；还可通过HlA-肽结合检测进一步评价这种候选物以确定与表位和它相应的HLA分子有关的结合亲和力和/或结合周期。可进行其它证实工作以在这些疫苗候选物中选择在群体覆盖和/或免疫原性上具有较佳特性的表位。
可用多种方法来评价细胞的免疫原性，包括：
1)评价正常个体的原代T细胞培养物(见例如Wentworth，P.A.等，Mol.Immunol.32：603，1995；Celis，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2105，1994；Tsai，V.等，J.Immunol.158：1796，1997；Kawashima，I.等，HumanImmunol.59:1，1998)。该过程包括当存在抗原呈递细胞时在体外用测试肽刺激正常人的外周血淋巴细胞(PBL)数周。该肽的特异性T细胞在此期间将被激活，可用例如肽致敏靶细胞的淋巴因子-或51Cr-释放试验进行检测。
2)免疫HLA转基因小鼠(见例如Wentworth，P.A.等，J.Immunol.26：97，1996；Wentworth，P.A.等，Int.Immunol.8：651，1996；Alexander，J.等，J.Immunol.159：4753，1997)。例如，在该方法中，皮下给予Hla转基因小鼠用弗氏不完全佐剂配的肽。免疫接种数周后取得脾细胞，在测试肽存在时体外培养约1周。用例如肽致敏靶细胞和表达内源产生抗原的靶细胞的51Cr-释放试验检测肽特异性T细胞。
3)证实已有效接种疫苗的免疫个体和/或慢性病患者中的记忆T细胞应答(见例如Rehermann，B.等，J.Exp.Med.181：1047，1995；Doolan，D.L.等，Immunity7：97，1997；Bertoni，R.等，J.Clin.Invest.100：503，1997；Threlkeld，S.C.等，J.Immunol.159：1648，1997；Diepolder，H.M.等，J.Virol.71：6011，1997)。因此，可通过培养由于疾病已经接触过抗原因此产生了“天然”免疫应答，或接种过这种抗原的疫苗者的PBL来检测记忆应答。将患者的PBL在测试肽和抗原呈递细胞(APC)存在时在体外培养1-2周以激活“记忆”T细胞，与“原初”T细胞作比较。在培养期结束时，使用包括与肽致敏靶细胞的51Cr释放、T细胞增殖或淋巴因子释放等试验检测T细胞活性。
VI.)PSCA转基因动物
编码PSCA相关蛋白的也可用来产生转基因动物或″敲除″动物，这种动物然后可用于开发和筛选有治疗作用的试剂。根据已有技术，编码PSCA的cDNA可用来克隆编码PSCA的基因组DNA。然后可用克隆的基因组序列来产生含有表达编码PSCA的DNA的细胞的转基因动物。制造转基因动物，尤其是例如小鼠或大鼠之类的动物，的方法已成为本领域的常规方法，并描述在，例如，1988年4月12日发表的美国专利4,736,866和1989年9月26日发表的4,870,009。通常，特定的细胞将成为带有组织特异性增强子的PSCA转基因掺入的靶点。
包含编码PSCA的转基因拷贝的转基因动物可被用来检查编码PSCA的DNA表达增强的效应。这种动物也可被用作药剂的实验动物，所述药剂被认为可提供例如与其过度表达有关的病理状态的保护。根据本发明的这一方面，相比具有该转基因的未治疗动物，用药剂治疗的动物病理状态的发病率降低，这说明该药剂对该病理状态有潜在治疗作用。
或者，可用PSCA的非人同系物来构建PSCA″敲除″动物，所述动物由于编码PSCA的外源基因和引入动物胚胎细胞的改变的编码PSCA的基因组DNA之间的同源重组而导致编码PSCA的基因缺陷或被改变。例如，根据已有技术，可用编码PSCA的cDNA来克隆编码PSCA的基因组DNA。部分编码PSCA的基因组DNA的一部分可被删除或被用另一基因(例如编码可用来监控整合的可选标记的基因)替代。通常，载体中包含数千个碱基的未改变的侧接DNA(同时在5′和3′末端)(见例如Thomas和Capecchi，Cell，51：503(1987)关于同源重组载体的描述)。载体被引入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)并选择引入的DNA已经与内源DNA同源重组的细胞(见例如Li等，Cell，69：915(1992))。然后将选出的细胞注射到动物(例如小鼠或大鼠)的胚泡以形成聚集嵌合体(见例如Bradley，引自E.J.Robertson编写的《畸胎癌和胚胎干细胞实际进展》(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：APractical Approach)(IRL，Oxford，1987)，第113-152页)。然后可将嵌合胚胎植入合适的假孕雌性养育动物，然后使所述胚胎足月妊娠以产生″敲除″动物。在其生殖细胞内带有同源重组DNA的后代可通过标准技术鉴定并用来繁殖所有动物细胞都含有同源重组DNA的动物。可特征鉴定敲除动物它们抵抗疾病的能力或者由于缺乏PSCA多肽而发病。
VII.)检测PSCA的方法
本发明的另一方面涉及检测PSCA多核苷酸和PSCA相关蛋白的方法，以及鉴定表达PSCA的细胞的方法。PSCA的表达特征使其成为转移疾病的诊断标记物。因此，PSCA基因产物的状态便为预测包括发生晚期疾病的易感性、进展速度和/或肿瘤侵袭性等各种因素提供了有用信息。如本文详细讨论的，患者样品中PSCA基因产物的状态可用本领域熟知的各种方法来分析，其中包括免疫组织化学分析、包括原位杂交在内的各种Northern印迹技术、RT-PCR分析(例如在激光捕获显微切割样品上进行RT-PCR)、Western印迹分析和组织阵列分析。
更具体地说，本发明提供了检测生物样品(如血清、骨、***、以及其它组织、尿、***、细胞制品等)中的PSCA多核苷酸的试验。可检测的PSCA多核苷酸包括，例如，PSCA基因或其片段、PSCA mRNA、PSCA mRNA交替剪接变体以及含有PSCA多核苷酸的重组DNA或RNA分子。许多扩增和/或检测PSCA多核苷酸存在的方法是本领域熟知的并且可用于本发明这个方面的实践。
在一个实施方案中，检测生物样品中PSCA mRNA的方法包括用至少一种引物通过逆转录从样品制造cDNA；用PSCA多核苷酸作为正义和反义引物扩增如此制得的cDNA以扩增其中的PSCA cDNA；以及检测是否存在扩增的PSCA cDNA。可任选确定扩增的PSCA cDNA序列。
另一实施方案中，检测生物样品中PSCA基因的方法包括首先分离样品的基因组DNA；用PSCA多核苷酸作为正义和反义引物扩增分离的基因组DNA；以及检测是否存在扩增的PSCA基因。可从PSCA核苷酸序列(见例如图2)设计出任意数目的合适正义和反义探针的组合，并用于此目的。
本发明还提供了检测组织或其它生物样品(如血清、***、骨、***、尿、细胞制品等)中PSCA蛋白存在情况的试验。检测PSCA相关蛋白的方法也是熟知的，包括例如免疫沉淀、免疫组织化学分析、Western印迹分析、分子结合检测、ELISA、ELIFA等。例如，检测生物样品中PSCA相关蛋白存在情况的方法包括首先使样品接触PSCA抗体、抗体的PSCA-反应性片段或含有PSCA抗体抗原结合区的重组蛋白；然后检测样品中PSCA相关蛋白的结合。
鉴定表达PSCA的细胞的方法也在本发明范围之内。在一个实施方案中，鉴定表达PSCA基因的细胞的检测法包括检测细胞中是否存在PSCA mRNA。检测细胞内特定mRNA的方法是熟知的，其中包括，例如，使用互补DNA探针进行杂交试验(如用标记的PSCA核糖核酸探针原位杂交、Northern印迹以及相关技术)和各种核酸扩增试验(如用PSCA的特异性互补引物进行RT-PCR，以及其它类型的扩增检测法，如例如分支DNA、SISBA、TMA等等)。或者，鉴定表达PSCA基因的细胞的试验包括检测细胞内或细胞分泌的PSCA相关蛋白的存在情况。各种检测蛋白质的方法是本领域熟知的，并被用来检测PSCA相关蛋白和表达PSCA相关蛋白的细胞。
PSCA表达分析也被用作鉴定和评价调节PSCA基因表达的试剂的工具。例如，PSCA表达在***癌中显著上调，并在表I所列组织的癌症中表达。鉴定抑制PSCA在癌细胞内表达或过度表达的分子或生物试剂具有治疗价值。例如，可采用通过RT-PCR、核酸杂交或抗体结合来量化PSCA表达的筛选方法来鉴定这种试剂。
VIII.)临测PSCA-相关基因状态及其产物的方法
已知肿瘤形成是一个多步骤过程，其中，细胞生长逐步失调同时细胞由正常生理状态发展到癌前状态然后到癌症状态(见例如Alers等，Lab Invest.77(5)：437-438(1997)和Isaacs等，Cancer Surv.23：19-32(1995))。文中，检查生物样品细胞生长失调的证据(如癌症中的异常PSCA表达)能够在病理状态(如癌症)发展到治疗选项更加有限或预后更加不良的阶段之前早期察觉这种异常生理状态。在这种实施方案中，可将感兴趣的生物样品内PSCA的状态与例如相应的的正常样品(如来自个体或未受病理影响的其它个体的样品)内PSCA的状态进行比较。生物样品中PSCA状态的改变(相比正常样品)提供了细胞生长失调的证据。除使用未受病变影响的生物样品作为正常样品，我们也可使用预定的标准值，例如预定的正常mRNA表达水平(见例如Grever等，J.Comp.Neurol.1996-12-9；376(2)：306-14以及美国专利5,837,501)与样品的PSCA状态进行比较。
文中，术语″状态″具有本领域可接受的含义，是指基因及其产物的情况或状态。通常，熟练的技术人员可使用许多参数来评价基因及其产物的情况或状态。这些参数包括但不限于表达的基因产物的定位(包括PSCA表达细胞的定位)和水平、表达的基因产物(如PSCA mRNA、多核苷酸和多肽)的生物活性。通常，PSCA状态的改变包括PSCA和/或PSCA表达细胞定位的变化，和/或PSCA mRNA和/或蛋白质表达增加。
样品的PSCA状态可用许多本领域熟知的方法来分析，包括但不限于免疫组织化学分析、原位杂交、在激光捕获显微切割样品上进行RT-PCR分析、Western印迹分析和组织阵列分析。评价PSCA基因和基因产物状态的典型方法可在以下文献中找到，例如：Ausubel等编的《分子生物学最新方法》，1995，第2(Northern印迹)、4(Southern印迹)、15(免疫印迹)和18(PCR分析)单元。因此，熟练的技术人员可用各种方法来评价生物样品的PSCA状态，其中包括但不限于基因组Southern分析(用来检测例如PSCA基因内的紊乱)、PSCA mRNA的Northern分析和/或PCR分析(用来检测例如多核苷酸序列或PSCA mRNA表达水平的变化)、以及Western和/或免疫组织化学分析(用来检测例如多肽序列的变化、多肽在样品内定位的变化、PSCA蛋白表达水平的变化和/或PSCA蛋白与多肽结合伴侣的结合)。可检测的PSCA多核苷酸包括，例如，PSCA基因或其片段、PSCA mRNA、交替剪接变体、PSCA mRNA以及含有PSCA多核苷酸的重组DNA或RNA分子。
PSCA的表达特征使其成为局限性和/或转移疾病的诊断标记，并为生物样品的生长或致癌潜能提供了信息。具体地说，PSCA的状态为预测对特定疾病阶段的易感性、进展和/或肿瘤侵袭性提供了有用信息。本发明提供了确定PSCA状态和诊断表达PSCA的癌症(如表I所列组织的癌症)的方法和试验。例如，由于相比正常***组织，PSCA mRNA在***和其它癌症中如此高度地表达，评价生物样品内PSCAmRNA转录物或蛋白质水平的试验可被用来诊断与PSCA失调有关的疾病，并可在确定合适的治疗方法时提供有用的预测信息。
PSCA的表达状态提供的信息包括发育异常细胞、癌前细胞和癌细胞的存在、状态和定位；预测对各种疾病阶段的易感性和/或测量肿瘤的侵袭性。此外，这种表达特征使其可用作转移疾病的显象剂。因此，本发明的一个方面涉及检测生物样品(如来自患有或疑有以细胞生长失调为特征的病变(如癌症)的个体的样品)中PSCA状态的各种分子预测和诊断方法。
如上所述，生物样品的PSCA状态可通过许多本领域熟知的方法检测。例如，取自机体特定部位的生物样品的PSCA状态可通过评估样品内存在或不存在PSCA表达细胞(如表达PSCA mRNA或PSCA蛋白的细胞)加以检测。例如，当在正常情况下不含表达PSCA的细胞的生物样品(如***)内发现这种细胞时，由于生物样品中PSCA状态的这种变化通常与细胞生长失调有关，因此这种检测可提供细胞生长失调的证据。具体地说，细胞生长失调的一个指标是癌细胞从原来的器官(如***)转移到身体的其它区域(如***)。文中，细胞生长失调的证据是重要是，这是由于，例如，可在一定比例的***癌患者内检出隐性***转移，且这种转移与已知的疾病发展预测器有关(见例如Murphy等，Prostate42(4)：315-317(2000)；Su等，Semin.Surg.Oncol.18(1)：17-28(2000)和Freeman等，J Urol1995-8154(2Pt1)：474-8)。
一方面，本发明提供了监测PSCA基因产物的方法，该方法通过确定个体细胞表达的PSCA基因产物的状态，所述个体疑有与细胞生长失调有关的疾病(如增生或癌症)，然后将如此确定的状态与相应的正常组织的PSCA基因产物的状态进行比较。相对正常组织，测试样品内存在异常PSCA基因产物说明该个体的细胞内存在细胞生长失调。
在另一方面，本发明提供了对于确定个体内存在癌症有用的试验，该方法包括检测测试细胞或组织样品内PSCA mRNA或蛋白质的表达相对于对应的正常细胞或组织内的表达水平显著升高。可在例如但不限于表I所列的组织内评价PSCA mRNA的存在。由于相应的正常组织不表达PSCA mRNA或以较低水平表达，所以任何这些组织内出现显著的PSCA表达可用来说明癌症的再现、存在和/或严重性。
在有关实施方案中，PSCA状态是在蛋白质水平而不是核酸水平确定的。例如，这种方法包括确定测试组织样品的细胞表达的PSCA蛋白的水平，并将这样确定的水平与相应的正常样品内表达的PSCA水平进行比较。在一个实施方案中，例如用免疫组织化学的方法评估了PSCA蛋白的存在。能够检测PSCA蛋白表达的PSCA抗体或结合伴侣被用于本领域熟知的用于此目的的各种测定模式。
在另一实施方案中，我们可评价生物样品中PSCA核苷酸和氨基酸序列的状态，以鉴定这些分子结构内的紊乱。这些紊乱可包括***、缺失、取代等。这种评价是有用的，因为在大量与生长失调表型有关的蛋白质中观察到核苷酸和氨基酸序列的紊乱(见例如Marrogi等，1999，J.Cutan.Pathol.26(8)：369-378)。例如，PSCA序列中的突变可说明肿瘤的存在或促进。因此，PSCA的突变表明潜在的功能损失或肿瘤生长加快，这种测定具有诊断和预测价值。
许多观察核苷酸和氨基酸序列内紊乱的试验是本领域熟知的。例如，通过这里所述的Northern、Southern、Western、PCR和DNA测序法观察PSCA基因产物核酸或氨基酸序列的大小和结构。此外，观察核苷酸和氨基酸序列内紊乱的其它方法，如单链构象多态性分析，是本领域熟知的(见例如1999年9月7日发表的美国专利5,382,510，和1995年1月17日发表的5,952,170)。
此外，我们可检测生物样品中PSCA基因的甲基化状态。基因5’调节区CpG岛的异常去甲基化和/或超甲基化经常出现于永生细胞和转化细胞，并且可导致不同基因的表达改变。例如，π-类谷胱甘肽S-转移酶(一种在正常***中表达的蛋白质，但在90％以上的***癌中不表达)的启动子超甲基化将永久沉默转录该基因，并且是***癌中最经常检测到的基因组变化(De Marzo等，Am.J.Pathol.155(6)：1985-1992(1999))。此外，这种变化在至少70％的高级***上皮内瘤样病变(PIN)中出现(Brooks等，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.，1998，7：531-536)。在另一实施例中，成淋巴细胞样细胞中脱氧-氮杂胞苷诱导LAGE-I肿瘤特异性基因(该基因不在正常***中表达，但在25-50％的***癌中表达)的表达，说明肿瘤表达是由于去甲基化造成的(Lethe等，Int.J.Cancer76(6)：903-908(1998))。许多检测基因甲基化状态的试验是本领域熟知的。例如，我们可在Southern杂交方法中使用对甲基化敏感但不能切割含甲基化CpG位点的序列的限制性酶来了解CpG岛的甲基化状态。此外，MSP(甲基化特异性PCR)可迅速显示所给基因CpG岛中存在的所有CpG位点的甲基化状态。该过程包括先用亚硫酸氢钠(它将把所有未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶)修饰DNA，然后用甲基化和非未甲基化DNA的特异性引物进行扩增。关于甲基化紊乱的方法也可在例如FrederickM.Ausubel等编的《分子生物学最新方法》(1995)第12单元中找到。
基因扩增是另一种获得PSCA状态的方法。直接测定样品的基因扩增，例如通过常规的Southern印迹或Northern印迹来量化mRNA的转录(Thomas，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205)、斑点印迹(DNA分析)或原位杂交，使用根据这里提供的序列的合适标记的探针。或者，可使用识别特定双链体的抗体，其中包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合体双链体或DNA-蛋白质双链体。然后抗体被标记并进行测定，其中双链体结合到表面，从而在表面形成双链体，因此可检测是否存在结合到双链体的抗体。
通常可检测活检组织或外周血以了解癌细胞的存在，使用例如Northern印迹、斑点印迹或RT-PCR分析来检测PSCA表达。存在RT-PCR可扩增的PSCA mRNA表明了癌症的存在。RT-PCR试验是本领域熟知的。目前评价了外周血肿瘤细胞的RT-PCR试验是否可用于诊断和处理多种人类实体瘤。在***癌领域，这些包括检测表达PSA和PSM的细胞的RT-PCR试验(Verkaik等，1997，Urol.Res.25：373-384；Ghossein等，1995，J.Clin.Oncol.13：1195-2000；Heston等，1995，Clin.Chem.41：1687-1688)。
本发明的另一方面是评估个体对癌症的易感性。在一个实施方案中，预测对癌症易感性的方法包括检测组织样品内的PSCA mRNA或PSCA蛋白，其存在说明对癌症易感，其中PSCA mRNA的表达程度与易感性程度相对应。在以具体实施方案中，检测了***或其它组织内PSCA的存在情况，样品内存在PSCA说明对***癌易感(或出现或存在***肿瘤)。类似地，我们可评估生物样品内PSCA核苷酸和氨基酸序列的完整性以鉴定这些分子结构内的紊乱，所述紊乱如***、缺失、取代等。样品PSCA基因产物内存在一种或多种紊乱是癌症易感性(或出现或存在肿瘤)的指标。
本发明还包括测定肿瘤侵袭性的方法。在一个实施方案中，测定肿瘤侵袭性的方法包括确定肿瘤细胞表达的PSCA mRNA或PSCA蛋白的水平，将如此确定的水平与取自同一个体或正常组织参考样品的相应的正常组织内表达的PSCA mRNA或PSCA蛋白的水平进行比较，其中，相对正常样品，肿瘤样品中PSCA mRNA或PSCA蛋白的表达程度说明了侵袭性程度。在一具体实施方案中，肿瘤的侵袭性是通过确定肿瘤细胞内PSCA的表达程度来评价的，表达水平越高说明越是侵袭性肿瘤。其它实施方案评价了生物样品中PSCA核苷酸和氨基酸序列的完整性，以鉴定这些分子结构内的紊乱，所述紊乱如***、缺失、取代等。存在一种或多种紊乱说明是侵袭性更强的肿瘤。
本发明的另一个实施方案涉及观察一段时间内恶性肿瘤在个体的发展的方法。在一个实施方案中，观察一段时间内恶性肿瘤在个体的发展的方法包括确定肿瘤样品内细胞表达的PSCA mRNA或PSCA蛋白的水平，将如此确定的水平与不同时间取自同一个体的相同组织样品内表达的PSCA mRNA或PSCA蛋白的水平进行比较，其中，一段时间内肿瘤样品中表达的PSCA mRNA或PSCA蛋白的程度提供了癌症发展的信息。在一具体实施方案中，通过测定一段时间内肿瘤细胞中表达的PSCA来评价癌症的发展，一段时间内表达升高表明癌症发展。同时，我们可评价生物样品中PSCA核苷酸和氨基酸序列的完整性，以鉴定这些分子结构内的紊乱，所述紊乱如***、缺失、取代等，存在一种或多种紊乱说明了癌症发展。
上述诊断方法也可与本领域已知的多种预测和诊断方法中的任何一种联合。例如，本发明的另一个实施方案涉及观察PSCA基因和PSCA基因产物的表达(或PSCA基因和PSCA基因产物中的紊乱)与恶性肿瘤相关因子相一致的方法，该方法被作为诊断和预测组织样品状态的手段。可采用多种与恶性肿瘤有关的因子，如恶性肿瘤相关基因的表达(例如***癌的PSA、PSCA和PSM的表达，等等)以及总的细胞学观察(见例如Bocking等，1984，Anal.Quant.Cytol.6(2)：74-88；Epstein，1995，Hum.Pathol.26(2)：223-9；Thorson等，1998，Mod.Pathol.11(6)：543-51；Baisden等，1999，Am.J.Surg.Pathol.23(8)：918-24)。例如，由于存在一组与疾病相一致的特定因子，这为诊断和预测组织样品状态提供了重要信息，因此观察PSCA基因和PSCA基因产物的表达(或对PSCA基因和PSCA基因产物的紊乱)与其它恶性肿瘤相关因子相一致的方法是有用的。
在一个实施方案中，观察PSCA基因和PSCA基因产物的表达(或PSCA基因和PSCA基因产物中的紊乱)与其它恶性肿瘤相关因子相一致的方法必需检测组织样品内PSCA mRNA或蛋白质的过度表达，检测组织样品内PSA mRNA或蛋白质的过度表达(或者PSCA或PSM的表达)，并观察PSCA mRNA或蛋白质与PSA mRNA或蛋白质的过度表达(或者PSCA或PSM的表达)的一致性。在一具体实施方案中，检测了***组织内PSCA和PSA mRNA的表达，样品内PSCA和PSA mRNA的过度表达相一致说明了***癌的存在、对***癌的易感性或***肿瘤的复发或状态。
这里描述了检测并量化PSCA mRNA或蛋白质的表达的方法，标准核酸和蛋白质检测和量化技术是本领域熟知的。检测和量化PSCA mRNA的标准方法包括使用标记的PSCA核糖核酸探针的原位杂交、使用PSCA多核苷酸探针的Northern印迹和相关技术、使用PSCA特异性引物的RT-PCR分析以及其它扩增类型的检测方法，例如有分支DNA、SISBA、TMA等等。在一具体实施方案中，采用半定量RT-PCR来检测和量化PSCA mRNA的表达。出于该目的可使用任何数量的能够扩增PSCA的引物，包括但不限于这里具体描述的各种引物组。在一具体实施方案中，在活检组织的免疫组织化学测定中从使用与野生型PSCA蛋白质特异性反应的多克隆或单克隆抗体。
IX.)鉴定与PSCA相互作用的分子
通过本领域可接受的多种方法中的任何一种，熟练的技术人员可用这里揭示的PSCA蛋白和核酸序列来鉴定与PSCA相互作用的蛋白质、小分子和其它试剂。例如，我们可利用一种所谓相互作用阱的***(也成为“双杂交试验”)。在该***中，分子与指导报告基因表达的转录因子相互作用并重建，从而可检测报告基因的表达。其它***通过真核转录激活蛋白的重建在体内鉴定蛋白质-蛋白质相互作用，见例如1999年9月21日发表的美国专利5,955,280，1999年7月20日发表的5,925,523，1998年12月8日发表的5,846,722和1999年12月21日发表的6,004,746。本领域也存在基于基因组的预测蛋白质功能的算法(见例如Marcotte等，Nature402：41999年11月4日，83-86)。
或者，我们可筛选肽文库来鉴定与PSCA蛋白质序列相互作用的分子。在该方法中，通过筛选文库中编码随机或受控氨基酸集合来鉴定结合PSCA的肽。该文库编码的肽被作为噬菌体外被蛋白的融合蛋白表达，然后可选出抗PSCA蛋白的噬菌体颗粒。
因此，无需之前对配体或受体分子的结构有任何了解就鉴定出了具有多种用途的肽，例如治疗、预测或诊断肽。可用来鉴定与PSCA蛋白质序列相互作用的分子的典型肽文库和筛选方法描述于，例如，1998年3月3日发表的美国专利5,723,286和1998年3月31日发表的5,733,731。
或者，表达PSCA的细胞系被用来鉴定PSCA介导的蛋白质-蛋白质相互作用。这种相互作用可用免疫沉淀技术来检测(见例如Hamilton B.J.等Biochem.Biophys.Res.Commun.1999，261：646-51)。可用抗-PSCA抗体从表达PSCA的细胞系中免疫测定PSCA蛋白。或者，可在经工程改造的表达PSCA和His-tag(上述载体)融合物的细胞系内采用抗His-tag抗体。可通过以下方法检测免疫沉淀的复合体的蛋白质结合，例如Western印迹、35S-甲硫氨酸标记蛋白质、蛋白质微测序、银染和双向凝胶电泳。
可通过与这种筛选测定有关实施方案来鉴定与PSCA相互作用的小分子和配体。例如，可鉴定紊乱蛋白质功能的小分子，包括紊乱PSCA介导磷酸化和去磷酸化能力、与DNA或RNA分子相互作用的分子，作为调节细胞周期、第二信使信号传导或肿瘤发生的指标。类似地，可鉴定调节PSCA-相关离子通道、蛋白质泵或细胞通讯功能的小分子，并用来治疗具有表达PSCA的癌症的患者(见例如Hille，B.，《可兴奋膜的离子通道》(Ionic Channels of Excitable Membranes)，第二版，Sinauer Assoc.，Sunderland，MA，1992)。此外，调节PSCA功能的配体可基于其结合PSCA和活化受体构建物的能力加以鉴定。典型的方法叙述于例如1999年7月27日发表的美国专利5,928,868，并包括形成至少有一个配体是小分子的杂交配体的方法。在一示范性实施方案中，利用经工程改造能表达PSCA和DNA-结合蛋白融合蛋白的细胞来共表达杂交配体/小分子的融合蛋白和cDNA文库转录激活蛋白。该细胞还含有报告基因，报告基因的表达使第一和第二融合蛋白相互接近，相互接近只有当杂交配体结合两个杂交蛋白上的靶位点时才会发生。选择表达报告基因的那些细胞，并鉴定未知小分子或未知配体。该方法可鉴定激活或抑制PSCA的调节剂。
本发明一个实施方案包括筛选与图2或图3所示PSCA氨基酸序列相互作用的方法，该方法包括使一群分子接触PSCA氨基酸序列、使这群分子和PSCA氨基酸序列在易于相互作用的条件下相互作用、确定存在与PSCA氨基酸序列相互作用的分子、然后将不和PSCA氨基酸序列相互作用的分子与和PSCA氨基酸序列相互作用的分子分离的步骤。在一具体实施方案中，该方法还包括纯化、特征分析和鉴定与PSCA氨基酸序列相互作用的分子。鉴定出的分子可用来调节PSCA的功能。在一优选的实施方案中，PSCA氨基酸序列与肽文库相连。
X.)治疗方法和组合物
鉴定在有限的组织内正常表达但也在表I所列的癌症中表达的PSCA将开创了许多治疗此类癌症的方法。
注意，即便当靶蛋白在正常组织(甚至是正常的生命器官组织)内表达时靶向抗肿瘤疗法也是有效的。生命器官是维持生命必需的器官，如心脏或结肠。非生命器官是可切除但个体仍能存活的器官。非生命器官的例子有卵巢、乳腺和***。
例如，是一种FDA批准的药物，其活性成分为与已知为HER2、HER2/neu和erb-b-2的各种蛋白质发生免疫反应的抗体。它由Genentech销售并且是一种获得商业成功的抗肿瘤药。2002年Herceptin的销售额达到约4亿美元。Herceptin用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌。然而，HER2的表达不限于这种肿瘤。这种蛋白质在许多正常组织内表达。具体地说，已知HER2/neu存在于正常的肾脏和心脏内，而这些组织存在于所有接受Herceptin的人当中。Latif，Z.等也证实正常肾脏内存在HER2/neu(B.J.U.International(2002)89：5-9)。如该文献所示(其评价了肾细胞癌是否应成为抗-HER2抗体如Herceptin的优选适应证)，良性肾组织制造这种蛋白和mRNA。特别地，HER2/neu蛋白在良性肾组织内强烈过度表达。
尽管HER2/neu在心脏和肾脏等生命组织内表达，但Herceptin是一种非常有效的、获得FDA批准并取得商业成功的药物。Herceptin对心脏组织的影响，即“心脏毒性(cardiotoxicity)”仅是一种治疗副作用。当单独用Herceptin治疗患者时，仅在极少患者内会发生显著心脏毒性。
特别制得注意的是，尽管肾组织显示正常表达，甚至可能高于心脏组织的表达，但肾脏未出现任何可评价的Herceptin副作用。此外，在表达HER2的各种正常组织中，只有极少会发生副作用。只有心脏组织出现可评价的副作用。在HER2/neu表达尤其显著的组织，如肾组织，未出现任何副作用。
此外，发现以表皮生长因子受体(EGRF)为靶点的抗肿瘤疗法有良好的治疗效果。EGFR也在许多正常组织内表达。使用抗-EGFR疗法之后正常组织内的副作用非常有限。
因此，正常组织甚至正常生命组织内靶蛋白的表达不会使以这种蛋白质作为某些也过度表达该蛋白的肿瘤治疗靶标的药剂失效。
因此，抑制PSCA蛋白活性的治疗方法可用于患有表达PSCA的癌症的患者。这些治疗方法通常分为两类。一类包括各种抑制PSCA蛋白与其结合伴侣或其它蛋白质结合或缔合的方法。另一类包括各种抑制PSCA基因转录或PSCA mRNA翻译的方法。
X.A.)抗癌疫苗
本发明提供了含有PSCA相关蛋白或PSCA-相关核酸的癌症疫苗。就PSCA的表达而言，癌症疫苗可预防和/或治疗表达PSCA的癌症，而对非靶组织的影响很小或没有影响。在疫苗中使用产生体液和/或细胞-介导的免疫应答的肿瘤抗原以进行抗癌治疗的方法是本领域熟知的，并被用于将人PSMA和啮齿动物PAP免疫原用于***癌的治疗(Hodge等，1995，Int.J.Cancer63：231-237；Fong等，1997，J.Immunol.159：3113-3117)。
通过使用PSCA相关蛋白或编码PSCA的核酸分子以及能够表达和呈递PSCA免疫原的重组载体(通常包含许多抗体或T细胞表位)不难实施这种方法。本领域技术人员知道，本领域已知许多输送免疫反应性表位的疫苗***(见例如Heryln等，Ann Med1999-231(1)：66-78；Maruyama等，Cancer Immunol Immunother2000-649(3)：123-32)。简言之，这种在哺乳动物内产生免疫应答(例如体液和/或细胞-介导的免疫应答)的方法包括以下步骤：使哺乳动物的免疫***接触某免疫反应性表位(例如图3所示PSCA蛋白或其类似物或同系物上的表位)从而使哺乳动物产生该表位的特异性免疫应答(例如产生特异性识别该表位的抗体)。在优选的方法中，PSCA免疫原包含一生物学基序，见例如表VIII-XXI和XXII-XLIX，或一定大小的图5、图6、图7、图8和图9所示PSCA肽。
完整的PSCA蛋白、其免疫原性区域或表位可加以组合通过各种方法输送。这种疫苗组合物可包括，例如，脂肽(例如Vitiello，A.等，J.Clin.Invest.95：341，1995)、包裹在聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球体中的肽组合物(见例如Eldridge等，Molec.Immunol.28：287-294，1991：Alonso等，Vaccine12：299-306，1994；Jones等，Vaccine13：675-681，1995)、含在免疫刺激复合物(ISCOM)内的肽组合物(见例如Takahashi等，Nature344：873-875，1990；Hu等，ClinExpImmunol.113：235-243，1998)、多重抗原肽***(MAP)(见例如Tam，J.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5409-5413，1988；Tam，J.P.，J.Immunol.Methods196：17-32，1996)、配制成多价肽的肽；用于弹道输送***的肽(通常是结晶的肽)和病毒输送载体的肽(Perkus，M.E.等，引自：Kaufmann，S.H.E.编的《疫苗发展概述》(Concepts in vaccinedevelopment)，第379页，1996；Chakrabarti，S.等，Nature320：535，1986；Hu，S.L等，Nature320：537，1986；Kieny，M.-P.等，AIDSBio/Technology4：790，1986；Top，F.H.等，J.Infect.Dis.124：148，1971；Chanda，P.K.等，Virology175：535，1990)、病毒或合成来源的颗粒(例如，Kofler，N.等，J.Immunol.Methods.192：25，1996；Eldridge，J.H.等，Sem.Hematol.30：16，1993；小Falo，L.D.等，NatureMed.7：649，1995)、佐剂(Warren，H.S.，Vogel，F.R.和Chedid，L.A.Annu.Rev.Immunol.4：369，1986；Gupta，R.K.等，Vaccine11：293，1993)、脂质体(Reddy，R.等，J.Immunol.148：1585，1992；Rock，K.L.，Immunol.Today17：131，1996)，或者裸cDNA或颗粒吸收的cDNA(U1mer，J.B.等，Science259：1745，1993；Robinson，H.L.、Hunt，L.A.和Webster，R.G.，Vaccine11：957，1993；Shiver，J.W.等，引自：Kaufmann，S.H.E.编的《疫苗发展概述》(Concepts in vaccine development)，第423页，1996；Cease，K.B.和Berzofsky，J.A.，Annu.Rev.Immunol.12：923，1994，以及Eldridge，J.H.等，Sem.Hematol.30：16，1993)。也可使用靶向毒素的输送技术，也成为受体介导的寻靶，如Avant Immunotherapeutics，Inc.(Needham，Massachusetts)的那些技术。
在患有PSCA相关癌症的患者中，本发明的疫苗组合物也可与其它治疗癌症的方法例如手术、化疗、药物治疗、放疗等结合，包括与IL-2、IL-12、GM-CSF等免疫佐剂联合使用。
细胞疫苗：
可用特定的算法鉴定PSCA蛋白内结合相应HLA等位基因的肽以确定CTL表位(见例如表IV；EpimerTM和EpimatrixTM，Brown University(URLbrown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html)；以及BIMAS(URLbimas.dcrt.nih.gov/；SYFPEITHI，URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/)。在一优选的实施方案中，PSCA免疫原含有一个或多个用本领域熟知的技术鉴定的氨基酸序列，如表VIII-XXI和XXII-XLIX所示的序列，或有8、9、10或11个HLA I类基序/超基序(例如表IV(A)、表IV(D)或表IV(E))特有氨基酸的肽和/或至少有9个氨基酸的包含HLA II类基序/超基序(例如表IV(B)或表IV(C))的肽。本领域已知，HLA I类结合沟末端基本关闭，因此只有特定大小范围的肽才能与沟相符合并与之结合，HLA I类表位的长度通常有8、9、10或11个氨基酸。相反，HLAII类结合沟末端基本开放；因此有约9个或更多氨基酸的肽可被HLAII类分子结合。由于HLA I和II类的结合沟不同，因此HLA I类基序是长度特异的，即I类基序的位置2是肽氨基到羧基方向的第二个氨基酸。II类基序的氨基酸位置只是相互之间相对的，而不是相对于整个肽，即带有基序的序列的氨基和/或羧基末端可结合其它氨基酸。HLAII类表位是长度通常有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸，或25个氨基酸以上。
基于抗体的疫苗
本领域已知许多在哺乳动物内产生免疫应答的方法(例如产生杂交瘤的第一个步骤)。在哺乳动物内产生免疫应答的方法包括使哺乳动物的免疫***暴露于蛋白质的免疫原性表位(例如PSCA蛋白)以产生免疫应答。一个具体的实施方案包括在宿主内产生针对PSCA的免疫应答的方法，该方法是使宿主接触足量的至少一种PSCA B细胞或细胞毒T细胞表位或其类似物；并在这之后至少一定实践间隔使宿主再接触PSCAB细胞或细胞毒T细胞表位或其类似物。一个具体的实施方案包括产生抗PSCA相关蛋白或人造多表位肽的免疫应答的方法：给予人或其它哺乳动物含在疫苗制品内的PSCA免疫原(例如PSCA蛋白或其肽片段、PSCA融合蛋白或类似物等)。通常，这种疫苗制品还含有合适的佐剂(见例如美国专利6,146,635)或通用辅助表位，如PADRETM肽(Epimmune Inc.，San Diego，CA；见例如Alexander等，J.Immunol.2000164(3)；164(3)：1625-1633；Alexander等，Immunity1994 1(9)：751-761，和Alexander等，Immunol.Res.1998 18(2)：79-92)。另一种方法包括在个体内产生抗PSCA免疫原的免疫应答，方法如下：在哺乳动物机体的肌肉或皮肤中体内给予包含编码PSCA免疫原的DNA序列的DNA分子，该DNA序列操作性连接于控制DNA序列表达的调节序列；其中所述DNA分子被细胞摄取，DNA序列在细胞内表达，并产生抗该免疫原的免疫应答(见例如美国专利号5,962,428)。也可任选给予基因疫苗促效剂(facilitator)，如阴离子脂质；皂苷；凝集素；***类化合物；羟基化低级烷基；二甲基亚砜；以及尿素。此外，可给予模拟PSCA的抗独特型抗体以产生对于靶抗原的反应。
核酸疫苗：
本发明的疫苗组合物包括核酸-介导的形式。可给予患者编码本发明蛋白质的DNA或RNA。可采用基因免疫接种法来产生抗表达PSCA的癌细胞的预防性或治疗性体液和细胞免疫应答。可将含有编码PSCA相关蛋白/免疫原的DNA和适当调节序列的构建物直接注射到个体的肌肉或皮肤内，从而肌肉或皮肤细胞摄取该构建物并表达编码的PSCA蛋白/免疫原。或者疫苗中包含PSCA相关蛋白。PSCA相关蛋白免疫原的表达导致产生抗带有PSCA蛋白的T细胞的预防性或治疗性体液和细胞免疫力。可使用本领域已知的各种预防性和治疗性基因免疫接种技术(参见例如互联网地址genweb.com上公布的信息和参考资料)。基于核酸的输送描述在，例如，Wolff等，Science247：1465(1990)以及美国专利5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；WO 98/04720。基于DNA的输送技术的例子包括“裸DNA”、促效(bupivicaine、聚合物、肽-介导的)输送、阳离子脂质复合体和颗粒-介导的输送(“基因枪”)或压力介导的输送(见例如美国专利5,922,687)。
出于治疗性或预防性免疫接种的目的，本发明的蛋白质可通过病毒载体或细菌载体表达。可用于本发明实践的各种病毒性基因输送***包括但不限于牛痘、禽痘、金丝雀痘、腺病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、腺伴随病毒、慢病毒和辛德毕斯病毒(见例如Restifo，1996，Curr.Opin.Immunol.8：658-663；Tsang等J.Natl.Cancer Inst.87：982-990(1995))。也可使用非病毒输送***，方法是在患者内引入编码PSCA相关蛋白的裸DNA(例如在肌肉内或真皮内)以诱导抗肿瘤应答反应。
例如，牛痘病毒可被用作载体以表达编码本发明的肽的核苷酸序列。引入宿主之后，重组牛痘病毒表达蛋白质免疫原性肽，因而引发宿主的免疫应答。牛痘载体以及免疫接种用的方法描述在例如美国专利4,722,848中。另一种载体是BCG(BacilleCalmette Guerin)。BCG载体描述在Stover等，Nature351：456-460(1991)。通过这里的描述，本领域技术人员直到许多其它载体可用治疗性给予或免疫接种本发明的肽，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)载体、解毒的炭疽毒素载体等。
因此，基因输送***被用来运送PSCA-相关核酸分子。在一个实施方案中使用了全长人PSCA cDNA。另一实施方案中使用了编码特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)和/或抗体表位的PSCA核酸分子。
离体疫苗
也可用各种离体方法来产生免疫应答。一种方法包括使用抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞(DC)，以将PSCA抗原呈递到患者的免疫***。树突细胞表达MHCI和II类分子、B7共刺激物和IL-12，因此是高度专一的抗原呈递细胞。在***癌中，***特异性膜抗原(PSMA)脉冲的自体树突细胞被用于I期临床试验以刺激***癌患者的免疫***(Tjoa等，1996，Prostate28：65-69；Murphy等，1996，Prostate29：371-380)。因此，树突细胞可用来将PSCA肽呈递到T细胞的MHCI或II类分子。在一个实施方案中，自体树突细胞被能够结合到MHCI类和/或II类分子的PSCA肽脉冲。另一实施方案中，树突细胞被完整的PSCA蛋白脉冲。再一个实施方案包括用本领域已知的各种执行载体使PSCA基因在树突细胞内过度表达，所述载体例如腺病毒(Arthur等，1997，Cancer Gene Ther.4：17-25)、逆转录病毒(Henderson等，1996，Cancer Res.56：3763-3770)、慢病毒、腺伴随病毒、DNA转染(Ribas等，1997，CancerRes.57：2865-2869)或肿瘤衍生的RNA转染(Ashley等，1997，J.Exp.Med.186：1177-1182)。也可工程改造表达PSCA的细胞来表达免疫调节剂，如GM-CSF，并将其用作免疫剂。
X.B.)PSCA作为基于抗体的疗法的靶标
511582008800能够降低同期化疗剂量，尤其是对于不能良好耐受化疗剂毒性的患者。
可评价癌症患者的PSCA表达或水平，优选采用肿瘤组织的免疫组织化学评定、定量PSCA摄像或其它可靠指示PSCA表达的存在和程度的技术。肿瘤活检或手术标本的免疫组织化学分析优选用于此目的。肿瘤组织的免疫组织化学分析法是本领域熟知的。
治疗***癌和其它癌症的抗-PSCA单克隆抗体包括那些能诱导抗肿瘤强效免疫应答的抗体或直接导致细胞毒性的抗体。就这点而言，抗-PSCA单克隆抗体(mAb)可通过补体介导的或抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)机制导致肿瘤细胞溶解，这两种机制都要求免疫球蛋白分子的完整Fc部分与补体蛋白上的效应细胞Fc受***点相互作用。此外，对肿瘤生长发挥直接生物效应的抗-PSCA mAb可用于治疗表达PSCA的癌症。细胞毒mAb的直接作用机制包括：抑制细胞生长、调节细胞分化、调节肿瘤血管形成因子的特征和诱导凋亡。用多种评价细胞死亡的体外试验评价了特定抗-PSCA mAb发挥抗肿瘤作用的机制，这些试验通常是本领域已知的，如ADCC、ADMMC、补体介导的细胞溶解等等。
一些患者中，使用鼠类或其它非人单克隆抗体或人/小鼠嵌合mAb可诱导中等至强的抗非人抗体的免疫应答。这可导致从循环中清除抗体和降低功效。最严重时，这种免疫应答可导致大量形成免疫复合体，这种复合体可能造成肾衰竭。因此，优选的用于本发明治疗方法的单克隆抗体是完全人的或人源化的，并以高亲和力特异性结合靶PSCA抗原，但在患者内有低抗原性或没有抗原性。
本发明的治疗方法包括单独给予的抗-PSCA mAb以及其它mAb的组合物或混合物。这种mAb混合物具有某些优点，这是由于它们含有的mAb可靶向不同表位、采用不同的效应机制或将细胞毒mAb与依赖于免疫效应功能的mAb直接组合。这种组合的mAb可发挥协同治疗作用。此外，抗-PSCA mAb可与其它治疗形式一起给予，包括但不限于各种化学治疗剂、雄激素阻断剂、免疫调节剂(例如IL-2、GM-CSF)、手术或放疗。抗-PSCA mAb以其“裸露”形式或非结合形式给予，或者可与治疗剂结合。
抗-PSCA抗体制剂可通过任何能够将抗体输送到肿瘤细胞的途径给予。给药途径包括但不限于静脉内、腹膜内、肌肉内、瘤内、真皮内等等。治疗一般包括通过可接受的给药途径如静脉注射(IV)重复给予抗-PSCA抗体制剂，其剂量范围一般约为每千克体重0.1、.2、.3、.4、.5、.6、.7、.8、.9.、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25毫克。通常，每周10-1000mg mAb的剂量是有效的并且是可以耐受的。
基于用HerceptinTM治疗转移性乳腺癌的临床试验，一种可接受的剂量方案是，起始负荷剂量约为每千克患者体重静脉注射4mg，然后以约2mg/kg的剂量每周静脉注射一次抗-PSCA mAb制剂。优选地，起始负荷剂量是以90分钟或更长时间灌输给予的。定期维持剂量以30分钟或更长时间的灌输给予，只要起始剂量可良好耐受。精通本领域的技术人员都知道，在具体病理中，许多因素会影响理想的剂量方案。这些因素包括，例如，所用Ab或mAb的结合亲和力和半衰期、PSCA在患者内的表达程度、循环排除PSCA抗原的程度、所需稳定状态的抗体浓度水平、治疗频率、与本发明的治疗方法联合使用的化疗剂或其它试剂的影响以及具体患者的健康状况。
任选地，可评价患者给定样品内PSCA的水平(例如循环PSCA抗原和/或PSCA表达细胞的水平)以帮助确定最有效的剂量方案等。这种评价也可用来监测整个治疗的目的，并且可结合其它参数的评估(例如膀胱癌治疗中的尿细胞学和/或免疫细胞化学水平，或通过类推，***癌治疗中的血清PSA水平)来衡量治疗效果。
抗-独特型抗-PSCA抗体也可用作抗癌疗法的疫苗素诱导对表达PSCA相关蛋白的细胞的免疫应答。具体地说，抗-独特型抗体的产生是本领域熟知的；该方法适合产生模拟PSCA相关蛋白上的表位的抗-独特型抗-PSCA抗体(见例如Wagner等，1997，Hybridoma16：33-40；Foon等，1995，J.Clin.Invest.96：334-342；Herlyn等，1996，Cancer Immunol.Immunother.43：65-76)。这种抗-独特型抗体可用于癌症疫苗方法。
X.C.)PSCA作为细胞免疫应答的靶
疫苗和制备疫苗的方法是本发明的另一实施方案，所述疫苗含有免疫有效量的一种或多种这里所述HLA-结合肽。此外，本发明的疫苗包含一种或多种所述肽的组合物。肽可单独存在于疫苗中。或者，所述肽可作为含有同一肽多个拷贝的均聚物或作为不同肽的杂聚物存在。聚合物的优点在于有增强的免疫反应，并且由于使用了不同的表位而使聚合物具有额外的诱导与免疫应答寻靶的病原生物或肿瘤-相关肽的不同抗原决定子反应的抗体和/或CTL的额外能力。所述组合物可以是天然产生的抗原区域或这可以通过例如重组或化学合成方法制备。
可与本发明的疫苗一起使用的载体是本领域熟知的，其中包括，例如：甲状腺球蛋白，白蛋白如人血清白蛋白，破伤风类毒素，聚氨基酸如聚L-赖氨酸、聚L-谷氨酸，流感病毒、乙肝病毒核蛋白等等。疫苗可含有生理上可耐(即可接受的)稀释剂，如水或盐水，优选磷酸缓冲盐水。疫苗中通常还可含有佐剂。不完全弗氏佐剂、硫酸铝、氢氧化铝或明矾等佐剂都是本领域熟知的材料的例子。此外，如本文所述，将本发明的肽与脂质如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰丝氨酸-丝氨酸(P3CSS)结合可引发CTL应答。此外，发现佐剂，如含有合成胞嘧啶-硫代磷酸化-鸟嘌呤(CpG)的合成寡核苷酸可使CTL应答提高10-100倍(见例如Davila和Celis，J.Immunol.165：539-547(2000))。
通过注射、气溶胶、口服、透皮、透粘膜、胸膜内、鞘内或其它合适途径用本发明的肽组合物免疫之后，宿主的免疫***可通过产生大量所需抗原特异性的CTL和/或HTL对疫苗产生反应。之后，宿主对随后产生的表达或过度表达PSCA的细胞至少有部分免疫力，或者对该抗原相关的肿瘤至少能产生一些治疗作用。
在一些实施方案中，宜将I类肽组分与诱导或促进产生对该靶抗原的中和抗体和或辅助T细胞应答的组分组合。这种组合物的一个优选的实施方案包含本发明的I类和II类表位。这种组合物的另一个实施方案包含本发明的I类和/或II类表位以及交叉反应性HTL表位，如PADRETM(Epimmune，San Diego，CA)分子(描述在例如美国专利5,736,142中)。
本发明的疫苗还可包含抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞(DC)，作为呈递本发明的肽的载体。可在体外产生疫苗组合物，然后活动并收获树突细胞，从而在体外加载树突细胞。例如，树突细胞可用例如本发明的小基因转染或用肽脉冲。然后将该树突细胞给予患者并在体内引发免疫应答。基于DNA或肽的疫苗组合物也可体内施用，同时活动树突细胞，从而在体内加载树突细胞。
在选择多表位组合物的表位阵列时采用了以下原则，所述多表位组合物被用于疫苗或者用来选择疫苗中所包含的和/或由核酸(如小基因)编码的不连续表位。为进行此种选择宜平衡以下原则。加入给定疫苗组合物内的多个表位可以是但不需要是产生该表位的天然抗原序列中毗连的表位。
1.)选择在施用后模拟与清除肿瘤有关的免疫应答的表位。对于HLAI类而言，包括来自至少一个肿瘤相关抗原(TAA)的3-4个表位。对于HLA II类采用了类似的原理；又从至少一个TAA中选择了3-4个表位(见例如Rosenberg等，Science278：1447-1450)。来自一个TAA的表位可与来自一个或多个其它TAA的表位组合以产生能靶向肿瘤并改变常见的TAA表达模式的疫苗。
2.)选择具有与免疫原性有关的必需结合亲和力的表位：对HLAI类分子，IC50为500nM或更低，通常为200nM或更低；对II类分子，IC50为1000nM或更低。
3.)选择具有足够超基序的肽，或具有足够等位基因特异性基序的肽阵列，以得到较宽的群体覆盖率。例如优选有至少80％的群体覆盖率。可用本领域已知的统计计算法—Monte Carlo分析来评价群体覆盖的宽度或冗余。
4.)当选择癌症相关抗原表位时经常选择类似物，这是由于患者可能已经建立了对天然表位的耐受。
5.)特别适合的表位称为“嵌套表位(nested epitope)”。嵌套表位见于某一给定肽序列的至少两个表位重叠处。嵌套的肽序列可包括B细胞、HLA I类和/或HLAII类表位。当提供嵌套表位时，一般的目的是提供每个序列的最大表位数。因此，一方面是避免提供比肽氨基末端表位的氨基末端长或比肽羧基末端表位的羧基末端长的肽。当提供多表位序列时，例如含有嵌套表位的序列时，为确保不具有致病或其它有害生物学性能，筛选序列通常是重要的。
6.)如果产生了多表位蛋白质或在产生小基因时，一个目的是产生包括感兴趣表位的最小的肽。该原则与选择包含嵌套表位的肽的原则相同或类似。然而，若是人造多表位肽，长度最小化的目的是使整合在该多表位蛋白质中各表位之间的间隔序列相平衡。例如，可引入间隔氨基酸残基以避免相连表位(可被免疫***识别但靶抗原中不存在并且只能通过人为并列表位而产生的表位)相连，或便于在各表位之间切断从而增强表位呈递。由于受体可产生针对非天然表位的免疫应答，所以通常需要避免表位相连。当相连表位是“优势表位”时需要特别注意。优势表位可导致对其它被削弱或被抑制表位的零应答。
7.)当存在同一靶蛋白多个变体的序列时，也可根据它们的保密性选择可能的肽表位。例如，保密性的标准可规定，HLAI类结合肽的整个序列或II类结合肽的整个9-肽核心对某具体蛋白质抗原所指定的序列评价其百分率是保守的。
X.C.1.小基因疫苗
有许多不同的能够同时输送多个表位的方法。编码本发明的肽的核酸是本发明的一个特别有用的实例。根据以上章节设定的指南，优选包含在小基因中的表位。一个优选的给予编码本发明肽的核酸的方法使用编码含有一个或多个本发明表位的肽的小基因构建物。
下文和以下文献描述了多表位小基因的应用：Ishioka等，J.Immunol.162：3915-3925，1999；An，L.和Whitton，J.L.，J.Virol.71：2292，1997；Thomson，S.A.等，J.Immunol.157：822，1996；Whitton，J.L.等，J.Virol.67：348，1993；Hanke，R.等，Vaccine16：426，1998。例如，可经工程改造产生一种多表位DNA质粒，该质粒编码带有超基序和/或基序的PSCA衍生表位、通用辅助T细胞表位或PSCA的多个HTL表位(见例如表VIII-XXI和XXII-XLIX)以及内质网-转运信号序列。疫苗也可包含衍生自其它TAA的表位。
可在转基因小鼠内验证多表位小基因的免疫原性以评估针对测试表位诱导的CTL应答反应的数量级。此外，DNA编码表位的体内免疫原性可与特定CTL品系针对被该DNA质粒转染的靶细胞的体外应答相关联。因此，这些实验可显示这种小基因的两种作用：1.)产生CTL应答，和2.)诱导CTL识别的细胞表达编码的表位。
例如，为产生编码所选表位(小基因)的DNA序列以在人类细胞中表达，可反翻译该表位的氨基酸序列。可用人密码子表来选择各个氨基酸的密码子。这些编码表位的DNA序列可直接毗邻，因此当翻译时可产生连续的多肽序列。为使表达和/或免疫原性最优，可在设计小基因时加入其它元件。可被反翻译的小基因序列内的氨基酸序列的例子包括：HLA I类表位、HLAII类表位、抗体表位、遍在蛋白化信号序列和/或内质网靶向信号。此外，可通过加入合成的(例如聚丙氨酸)或天然产生的毗邻CTL或HTL表位的侧接序列来改进CTL和HTL表位的HLA呈递；这些较大的肽包括的表位属于本发明范围。
可通过组装编码小基因正链和负链的寡核苷酸将小基因序列转化成DNA。可用熟知的技术在适当条件下合成、磷酸化、纯化和退火重叠寡核苷酸(长30-100个碱基)。可用例如T4DNA连接酶连接寡核苷酸的末端。然后将这种合成的编码表位多肽的小基因克隆入所需表达载体。
载体中优选包含精通本领域的技术人员熟知的标准调节序列以确保在靶细胞内表达。需要一些载体元件:带有下游克隆位点以***小基因的启动子；有效终止转录的聚腺苷化信号；用来复制的大肠杆菌起点；和大肠杆菌可选择标记(例如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。许多启动子可用于该目的，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。参见例如美国专利5,580,859和5,589,466以了解其它合适的启动子序列。
可加入其它载体修饰以优化小基因的表达和免疫原性。一些情况下，需要内含子以进行有效的基因表达，可在小基因的转录区掺入一个或多个合成的或天然产生的内含子。在哺乳动物细胞内加入mRNA稳定序列以及复制的序列也可提高小基因的表达。
一旦选择了表达载体，可将小基因克隆到启动子下游的多接头区。将该质粒转化到合适的大肠杆菌菌株并用标准技术制备DNA。通过限制性酶切绘图和DNA序列分析验证小基因的取向以及DNA序列以及载体内的所有其它元件。包含正确质粒的细菌细胞可保存作为主细胞库和工作细胞库。
此外，免疫刺激序列(ISS或CpG)似乎在DNA疫苗的免疫原性中发挥作用。如果需要增强免疫原性，可在载体的小基因编码序列之外包含这些序列。
一些实施方案中，可使用能够制造小基因编码表位和第二蛋白质(可增强或降低免疫原性)的双顺反子表达载体。共同表达时可有利地增强免疫应答的蛋白质或多肽的例子包括细胞因子(例如IL-2、IL-12、GM-CSF)、诱导细胞因子产生的分子(例如LeIF)、共刺激分子，或者对于HTL应答有pan-DR结合蛋白(PADRETM，Epimmune，San Diego，CA)。辅助(HTL)表位可结合到胞内寻靶信号并与CTL表位独立表达；这可将HTL表位导向不同于CTL表位的细胞区室。需要的话，这可使HTL表位更有效地进入HLA II类途径，从而促进HTL诱导。与HTL或CTL诱导相反，通过共表达免疫抑制分子(例如TGF-β)特异性降低免疫应答对于某些疾病有益。
例如，可通过在大肠杆菌内发酵培养然后再纯化来生产治疗量的质粒DNA。按照熟知的技术，将等量的工作细胞库接种到生长培养基，在摇瓶或生物反应器内生长至饱和。质粒DNA可用标准生物分离技术纯化，例如QIAGEN，Inc.(Valencia，California)提供的固相阴离子交换树脂。需要的话可用凝胶电泳或其它方法将开环形式和线型形式中的DNA与超螺旋DNA相分离。
可制备纯化的质粒DNA以便用各种制剂进行注射。最简单的方法是用无菌磷酸缓冲盐水(PBS)重建冻干的DNA。这种称为“裸DNA”的方法目前在临床试验中被用于肌肉内(IM)给药。为尽可能提高基因DNA疫苗的免疫治疗作用，可以采用其它配制纯化的质粒DNA的方法。已经描述过许多方法，并且也可使用新技术。该试剂可采用阳离子脂质、糖脂和促融脂质体(见例如以下文献所述：WO 93/24640；Mannino & Gould-Fogerite，BioTechniques6(7)：682(1988)；美国专利5,279,833；WO91/06309；以及Felgner等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA84：7413(1987)。此外，肽以及统称为保护性、交互反应性、非凝聚化合物(PINC，protective，interactive，non-condensing compound)的化合物也可与纯化的质粒DNA形成复合物，以改变例如稳定性、肌肉内分散性或对特定器官或细胞类型的运输等变量。
靶细胞致敏可被用作小基因编码的CTL表位的表达和HLA I类呈递的功能测定。例如，质粒DNA被引入适合作为标准CTL铬释放测试的靶的哺乳动物细胞系。所用转染方法将千里眼最终的制剂。电穿孔可用于″裸″DNA，而阳离子脂质可用于直接体外转染。表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒可被共转染以便通过荧光激活细胞分选(FACS)富集转染的细胞。这些细胞然后用铬-51(51Cr)标记并被用作表位特异性CTL系的靶细胞；通过51Cr释放检测细胞溶解，它表明了小基因编码的CTL表位的产生以及HLA呈递。可用类似的试验评价HLA表位的表达以便评估HLA活性。
体内免疫原性是检测小基因DNA制剂功能的第二种方法。用DNA产物免疫接种表达合适人HLA蛋白的转基因小鼠。给药剂量和途径取决于所用的制剂(例如，对用PBS配的DNA采用IM途径，对脂质复合的DNA采用腹膜内(i.p.)途径)。免疫21天后收获脾细胞并在存在编码各个测试表位的肽时再刺激一周。然后可用标准技术检测CTL效应细胞溶解中带有肽的51Cr标记的靶细胞试验。被带有与小基因编码表位相对应的肽表位的HLA致敏的靶细胞溶解证实了DNA疫苗制剂体内诱导CTL应答。用类似的方法证实HTL表位在转基因小鼠内的免疫原性。
或者，可用例如美国专利5,204,253中所述的弹道输送法施用核酸。采用这种技术时，给予仅含有DNA的颗粒。在再一个实施方案中，可使DNA附着到颗粒例如金颗粒上。
也可用本领域树脂的细菌或病毒输送***来输送小基因，例如可将编码本发明表位的表达构建物掺入牛痘等病毒载体。
X.C.2.CTL肽和辅助肽的组合
含有本发明的肽的疫苗组合物可被修饰，例如被类似化，以提供所需特性，如血清半衰期改进、群体覆盖率变宽或免疫原性增强。
例如，可使肽连接到含有至少一个能够诱导T辅助细胞应答的表位的序列来增强肽诱导CTL活性的能力。尽管CTL肽可直接连接到T辅助肽，但通常通过间隔分子使CTL表位/HTL表位结合。这种间隔分子通常含有相对较小的中性分子，如在生理条件下基本上不带电荷的氨基酸或氨基酸模拟物。间隔分子通常可选自，例如Ala、Gly或其它非极性氨基酸或中性极性氨基酸的中性间隔分子。可以理解，任选存在的间隔分子不一定要含有相同的残基，因此可以是杂-或同-寡聚物。当存在间隔分子时，间隔分子通常有至少一个或两个残基，更通常有3-6个残基，有时甚至有10个或更多残基。可将CTL肽表位可直接或通过CTL肽氨基或羧基末端的间隔连接到T辅助肽表位。免疫原性肽或T辅助肽的氨基末端可被酰化。
在某些实施方案中，T辅助肽可被遗传多样性群体的大多数中存在的T辅助细胞识别。这可通过选择结合许多、大多数或所有HLA II类分子的肽实现。这种结合多种HLA II类分子的氨基酸序列的例子包括得自抗原的序列，如破伤风类毒素第830-843位(QYIKANSKFIGITE；SEQ ID NO：1)，恶性疟原虫环孢子(CS)蛋白第378-398位(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS；SEQ ID NO：2)以及链球菌18kD蛋白第116-131位(GAVDSILGGVATYGAA；SEQ ID NO：3)。其它的例子包括带有DR1-4-7超基序或DR3基序的肽。
或者用天然不存在的氨基酸序列制备能够以疏松HLA限制方式激活T辅助淋巴细胞的合成肽(见例如PCT公布WO 95/07707)。设计了这些被称为Pan-DR-结合表位的合成的化合物(例如PADRETM，Epimmune，Inc.，San Diego，CA)，这些化合物最优选结合大多数HLA-DR(人HLA II类)分子。例如，具有下式：aKXVAAWTLKAa(SEQ ID NO：4)的pan-DR-结合表位肽，式中，“X”是环己基丙氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸，并且可以是D-丙氨酸或L-丙氨酸，已被发现结合大多数HLA-DR等位基因，并刺激来自多数个体的T辅助淋巴细胞的应答而无论它们的HLA类型。另一种pan-DR结合表位包含所有的天然“L”氨基酸，并且可以编码表位的核酸的形式提供。
HTL肽表位也可被修饰以改变其生物特性。例如，它们可被修饰以包含D-氨基酸从而增强它们对蛋白酶的抗性并因此延长它们的血清半衰期，或者它们可与其它分子(如脂质、蛋白质、糖类等)结合以增强其生物活性。例如，T辅助肽可在氨基或羧基末端结合一条或多条棕榈酸链。
X.C.3.CTL肽和T细胞引发(priming)剂的组合
一些实施方案中，本发明的药物组合物中可包含至少一种能引发B淋巴细胞或T淋巴细胞的组分。已鉴定脂质能在体内引发CTL。例如可将棕榈酸残基附加到赖氨酸残基的ε-和α-氨基上然后再通过一个或多个连接基(如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等)连接到免疫原性肽。脂质化的肽然后可作为掺入脂质体的微团或颗粒直接施用，或用乳剂(如不完全弗氏佐剂)乳化后施用。在一优选的实施方案中，特别有效的免疫原性组合物包含附加到Lys的ε-和α-氨基上的棕榈酸，然后通过接头(如Ser-Ser)使其结合于免疫原性肽的氨基末端。
引发CTL应答的脂质的另一个例子是大肠杆菌脂蛋白，如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)当共价结合到合适的肽时可被用来引发病毒特异性CTL(见例如Deres等，Nature342：561，1989)。本发明的肽可与例如P3CSS偶联，并将脂肽施用给个体以引发针对靶抗原的特异性免疫应答。此外，由于用P3CSS-偶联的表位引发也可诱生中和抗体，因此可将这样的两种组合物结合以更有效地引发体液和细胞介导的应答。
X.C.4.含有用CTL和/或HTL肽脉冲的DC的疫苗组合物
本发明所述疫苗组合物的一个实施方案包括离体给予来自患者血液的PBMC或从中分离的DC带有表位的肽的混合物。可使用有利于收获DC的药物，如ProgenipoietinTM(Pharmacia-Monsanto，St.Louis，MO)或GM-CSF/IL-4。用肽脉冲DC并在再输注到患者之前洗涤DC以除去未结合的肽。该实施方案中，疫苗包含肽脉冲的DC，其表面存在脉冲肽表位与H1A分子形成的复合物。
可用肽的混合物离体脉冲DC，混合物中有一些肽刺激针对PSCA的CTL应答。可任选地含有辅助T细胞(HTL)肽，如天然或人造的疏松限制的HLAII类肽，以促进CTL应答。因此，本发明的疫苗被用来治疗表达或过度表达PSCA的癌症。
X.D.过继免疫治疗
抗原性PSCA-相关肽也被用来离体诱导CTL和/或HTL应答。所得CTL或HTL细胞可被用来治疗患者体内的肿瘤，所述患者对其它传统治疗模式无反应或将对本发明的治疗性疫苗肽或核酸无反应。通过在组织培养液内一起培养患者的或遗传相容的CTL或HTL前体细胞以及抗原呈递细胞(APC)如树突细胞和合适的免疫原性肽，离体诱导对特定抗原的CTL或HTL应答。培养适当的时间(通常约7-28天)之后，这期间前体细胞被激活并扩增成为效应细胞，将其灌输回患者，它们将在这里破坏(CTL)或帮助破坏(HTL)它们的特异性靶细胞(例如肿瘤细胞)。转染的树突细胞也可被用作抗原呈递细胞。
X.E.出于治疗或预防目的施用疫苗
本发明的药物组合物和疫苗组合物通常可用来治疗和/或预防表达或过表达PSCA的癌症。在治疗应用中，可给予患者一定量的肽和/或核酸组合物，所述量足以引发有效的针对抗原的B细胞、CTL和/或HTL应答，或者可治愈或至少部分阻止或减缓症状和/或并发症。适合实现该目的的量被称为″治疗有效剂量″。对该用途有效量将取决于，例如，所施用的具体组合物、给药方式、被治疗疾病的阶段和严重性、患者的体重和健康状况以及主治医师的判断。
本发明的药物组合物、免疫原性肽或编码它们的DNA给予已经带有表达PSCA的肿瘤的个体。所述肽或其编码DNA可单独给予或以一个或多个肽序列的融合序列的形式给予。患者可用所述免疫原性肽单独治疗，或者适当的话也可与其它治疗方法(如手术)联合治疗。
在治疗应用中，给药通常开始于首次被诊断出PSCA相关癌症时。然后增加剂量直到至少症状基本缓解并再持续一段时间。输送到患者的疫苗组合物(即包括但不限于例如肽混合物、多表位多肽、小基因或TAA特异性CTL或脉冲的树突细胞)可根据疾病阶段或患者的健康状况而改变。例如，在患有表达PSCA的肿瘤的患者中，相比其它实例，含有PSCA特异性CTL的疫苗对于杀死晚期癌症患者体内的肿瘤细胞更有效。
通过一种给药方式输送足以有效刺激细胞毒T细胞应答量的肽表位通常是重要的；也可按照本发明的实施方案给予刺激辅助T细胞应答的组合物。
用于最初治疗免疫的剂量通常以单位剂量出现，其范围下限约为1、5、50、500或1,000μg，上限约为10,000、20,000、30,000或50,000μg。用于人的剂量值范围通常为每70千克体重患者约500μg至约50,000μg。之后的数周至数月内可提高剂量，增加剂量在约1.0μg和约50,000μg肽之间，这取决于通过测量获自患者血液的CTL和HTL的比活确定的患者的反应和状况。可连续给药直到临床症状或实验室试验表明肿瘤已被排除或减少，并再持续一段时间。剂量、给药途径以及给药方案将根据本领域已知的方法来判断。
在某些实施方案中，本发明的肽和组合物可用于严重的疾病状态，即威胁生命或有可能威胁生命的状态。此时，基于外部物质的最小量和优选的本发明组合物中的肽的相对无毒特性，可以并且有必要给予患者相对所述剂量过量的肽组合物来进行治疗。
本发明的疫苗组合物也可仅作为预防剂。最初的预防免疫接种剂量通常以单位剂量出现，其范围下限为约1、5、50、500或1000μg，上限为约10,000、20,000、30,000或50,000μg。用于人的剂量值范围通常为每70千克患者约500μg至约50,000μg。在初次接种疫苗之后以约4周至6个月的预定间隔给予强化剂量，强化剂量在约1.0μg和约50,000μg肽之间。疫苗的免疫原性可通过测量获自患者血液样品的CTL和HTL的特异性活性来评估。
治疗用的药物组合物可通过肠胃外、外用、口、鼻、鞘内或在局部(例如作为乳膏或外用软膏)施用。优选通过肠胃外施用药物组合物，例如静脉内、皮下、真皮内或肌肉内。因此，本发明提供了供肠胃外用药的组合物，其中包含溶于或悬浮在可接受载体，优选含水载体内的免疫原性肽的溶液。
可使用各种含水载体，例如水、缓冲的水、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可用熟知的常规灭菌技术来灭菌，或者可被无菌过滤。所得水溶液可被包装成直接使用的制剂，或被冻干，冻干的制品在给药之前需要用无菌溶液重溶。
所述组合物可含有药学上可接受的辅助物质以满足生理条件的需要，如pH-调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂、防腐剂等，具体例如有乙酸钠、乳酸纳、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
药物制剂中本发明的肽的浓度是可变的，即其重量比例可从小于约0.1％(通常为或至少约2％)至20％-50％或更高，并将根据所选特定给药模式主要通过液体体积、粘度等来选择。
药物组合物中通常含有人单位剂量单位的组合物，所述药物组合物包含人单位剂量的可接受的载体，在一个实施方案中是含水载体，并以精通本领域的技术人员已知的用来将这种组合物给予人类的体积/质量比进行给药(见例如《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第17版，A.Gennaro编，Mack PublishingCo.，Easton，Pennsylvania，1985)。例如，70kg体重患者的初次免疫肽剂量可从约1到约50,000μg，通常为100-5,000μg。例如，对核酸而言，初次免疫可用以0.5-5mg的量在多个部位通过IM(或SC或ID)给予的裸核酸形式的表达载体进行。核酸(0.1-1000μg)也可用基因枪给予。3-4周后给予强化剂量。强化剂可以是以5-107至5x109pfu的剂量施用的重组禽痘病毒。
对抗体而言，治疗通常包括通过可接受的给予途径，如静脉注射(IV)，重复给予抗-PSCA抗体制品，其剂量通常为每千克体重约0.1-10mg。通常，每周10-500mg
mAb的剂量是有效并能良好耐受的。此外，一种可以接受的抗-PSCA mAb制品的剂量方案是，每千克体重患者通过IV给予约4mg起始负荷剂量，然后每周通过IV给予约2mg/kg的剂量。精通本领域的技术人员知道，在具体病例中，有许多因素会影响理想剂量。这些因素包括，例如，组合物的半衰期、Ab的结合亲和力、物质的免疫原性、PSCA在患者内的表达程度、PSCA抗原的循环排除程度、所需稳定状态的浓度水平、治疗频率、与本发明的治疗方法联合使用的化疗剂或其它试剂的影响以及特定患者的健康状况。非限制性的优选的人单位剂量是，例如，500μg-1mg、1mg-50mg、50mg-100mg、100mg-200mg、200mg-300mg、400mg-500mg、500mg-600mg、600mg-700mg、700mg-800mg、800mg-900mg、900mg-1g或1mg-700mg。在某些实施方案中，剂量范围是每千克体重2-5mg，例如，然后每周给予1-3mg/kg；例如，然后是0.5mg、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/kg体重，每周给予，为期2、3或4周；例如，然后是0.5-10mg/kg体重，每周给予，为期2、3或4周；每周225、250、275、300、325、350、375、400mg/m2体表面积；每周1-600mg/m2体表面积；每周225-400mg/m2体表面积；这些剂量可每周给予，为期2、3、4、5、6、7、8、9、19、11、12或更多周。
在一个实施方案中，多核苷酸的人单位剂型包括合适的剂量范围或提供任何治疗效果的有效量。如本领域的一般技术人员所了解的，治疗效果取决于许多因素，其中包括多核苷酸的序列、多核苷酸的分子量和给药途径。剂量通常由医生或其它健康护理专家根据各种本领域已知的参数(例如症状的严重性、病史等)来选择。通常，对于约20个碱基的多核苷酸而言，剂量范围可选自，例如，独立选择的下限，如约0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500mg/kg，至独立选择的大于下限的上限，如约60、80、100、200、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000mg/kg。例如，剂量可以是以下任何一种：0.1-100mg/kg、0.1-50mg/kg、0.1-25mg/kg、0.1-10mg/kg、1-500mg/kg、100-400mg/kg、200-300mg/kg、1-100mg/kg、100-200mg/kg、300-400mg/kg、400-500mg/kg、500-1000mg/kg、500-5000mg/kg或500-10,000mg/kg。通常，相比将核苷酸更直接地施加到疾病组织，肠胃外给药途径需要较高剂量的多核苷酸，当多核苷酸长度增加时剂量也需增加。
在一个实施方案中，T细胞的人单位剂型包括合适的剂量范围或提供任何治疗效果的有效量。如本领域的一般技术人员所了解的，治疗效果取决于许多因素。剂量通常由医生或其它健康护理专家根据各种本领域已知的各种参数(例如症状的严重性、病史等)来选择。剂量可以是约104-106细胞、约106-108细胞、约108-1011细胞或约108-5x1010细胞。剂量还可以是约106细胞/m2至约1010细胞/m2，或约106细胞/m2至约108细胞/m2。
本发明的蛋白质和/或蛋白质的编码核酸也可通过脂质体给予，脂质体具有以下作用：1)使蛋白质靶向特定组织如淋巴组织；2)选择性寻靶疾病细胞；或3)延长肽组合物的半衰期。脂质体包括乳剂、泡沫、微团、不溶单层、液晶、磷脂分散体、多层等等。在这些制品中，将被输送的肽被作为脂质体的一部分单独掺入或与结合淋巴细胞普遍受体的分子(如结合CD45抗原的单克隆抗体)或其它治疗性或免疫原性成分一起掺入。因此，装有所需的本发明的肽的脂质体或用这种肽装饰的脂质体可被导向到淋巴细胞部位，然后脂质体将在这里输送所述肽组合物。可用标准载体形成脂质来形成用于本发明的脂质体，其中一般包括电中性和负电荷的磷脂和类固醇(如胆固醇)。选择脂质时通常要考虑以下因素，例如脂质体的大小、酸不稳定性和脂质体在血液中的稳定性。有许多制备脂质体的方法，例如以下文献中所描述的方法：Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)以及美国专利4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369。
为使细胞靶向免疫***，被掺入脂质体的配体例如可包括所需免疫***的细胞表面决定簇的特异性抗体或其片段。含有肽的脂质体悬液可通过静脉内、局部等途径给予，其剂量可根据给药方式、被输送的肽以及被治疗击疾病的阶段等因素而改变。
对于固体组合物可使用常规的无毒固体载体，其中包括，例如，药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石。纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。为口服给药，可通过掺入任何通常使用的赋形剂(如上面列出的那些载体)来形成药学上可接受的无毒组合物，这种组合物中通常含有10-95％活性成分，即一种或多种本发明的肽，且更优选的浓度为25％-75％。
对于气溶胶给药，免疫原性肽优选以细分的形式和表面活性剂及推进剂一起提供。肽的重量比例通常为约0.01％-20％，优选约1％-10％。当然，表面活性剂必需是无毒的，并且优选溶于推进剂。代表性的这种试剂是含有6-22个碳原子的脂肪酸(如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油基硬脂酸(olesteric acid)和油酸)与脂族多羟基醇或其环酐的酯或偏酯。可使用混合的酯，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂占组合物重量的约0.1％-20％，优选约0.25-5％。用常规推进剂平衡组合物。需要的话也可含有载体，例如鼻内输送时可含有卵磷脂。
XI.)PSCA的诊断性和治疗性实施方案
如本文所述，PSCA多核苷酸、多肽、反应性细胞毒T细胞(CTL)、反应性辅助T细胞(HTL)和抗-多肽抗体被用于熟知的诊断、预测和治疗试验，这用来检测与细胞生长失调有关的疾病，如癌症，尤其是表I列出的癌症(参见，例如，其特定组织表达模式及其在某些癌症中的过度表达，如题为“正常组织和患者标本内PSCA的表达分析”的实施例所述)。
由此可知，PSCA是一种***相关抗原PSA，医疗工作者用这种原型标记来鉴定和监测***癌的发生已有多年(见例如Merrill等，J.Urol.163(2)：503-5120(2000)；Polascik等，J.Urol.Aug；162(2)：293-306(1999)和Fortier等，J.Nat.CancerInst.91(19)：1635-1640(1999))。也可使用许多其它的诊断标记，其中包括p53和K-ras(见例如Tulchinsky等，Int J Mol Med1999-7-4(1)：99-102和Minimoto等，Cancer Detect Prev2000；24(1)：1-12)。因此，公开PSCA多核苷酸和多肽(以及用来鉴定这些分子存在情况的PSCA多核苷酸探针和抗-PSCA抗体)以及它们的特征使得熟练的技术人员能够将这些分子用于类似的方法，例如许多涉及癌症相关症状的诊断试验。
使用PSCA多核苷酸、多肽、反应性T细胞和抗体的诊断方法的典型实施方案类似于已经良好建立的使用例如PSA多核苷酸、多肽、反应性T细胞和抗体的诊断试验。例如，就像在监测PSA过度表达或***癌转移的方法中使用PSA多核苷酸作为探针(例如Northern分析，见例如Sharief等，Biochem.Mol.Biol.Int.33(3)：567-74(1994))和引物(例如PCR分析，见例如Okegawa等，J.Urol.163(4)：1189-1190(2000))以观察PSA mRNA的存在和/或水平一样，可用同样的方法用这里所述的PSCA多核苷酸来监测PSCA的过表达或***癌和其它表达这种基因的癌症的转移。或者，就像在监测PSA蛋白过表达(见例如Stephan等，Urology55(4)：560-3(2000))或***细胞转移(见例如Alanen等，Pathol.Res.Pract.192(3)：233-7(1996))的方法中用PSA多肽来产生PSA特异性的抗体用来观察PSA蛋白的存在和/或水平一样，可用这里所述的PSCA多肽来产生用来监测PSCA的过表达和/或***细胞以及表达这种基因的其它癌症细胞的转移。
具体地说，由于转移涉及癌细胞从一种来源的器官(如肺或***等)移动到身体其它区域(如***)，所以可采用检测生物样品是否存在表达PSCA多核苷酸和/或多肽的细胞的试验来提供转移的证据。例如，当发现来自通常不含表达PSCA的细胞的组织(***)的生物样品中含有表达PSCA的细胞时，例如在分离自***和骨转移的异种移植物LAPC4和LAPC9中观察到PSCA表达，该发现预示着转移。
或者，可用PSCA多核苷酸和/或多肽来提供癌症的证据，例如当发现通常不表达PSCA或以不同水平表达PSCA的生物样品内的细胞表达PSCA或PSCA表达升高时(见例如表I所列癌症中的PSCA表达以及相应的图中所示的患者样品等中的PSCA表达)。在这种测定中，技术人员还希望通过检测生物样品中是否存在除PSCA之外的第二组织限制性标记，如PSA、PSCA等，来产生关于转移的补充证据(见例如Alanen等，Pathol.Res.Pract.192(3)：233-237(1996))。
使用免疫组织化学法鉴定组织切片内存在PSCA多肽可说明该组织内某些细胞的状态被改变。如本领域所熟知的，抗体定位到癌细胞表达的多肽的能力是一种诊断疾病存在、疾病所处阶段、发展和/或肿瘤侵袭性的方法。相比相应的非恶性肿瘤组织，这种抗体也可检测癌细胞内该多肽分布的改变。
PSCA多肽和免疫原性组合物也可用于了解疾病状态中亚细胞蛋白定位的改变。细胞从正常状态改变成疾病状态会使细胞形态发生变化并通常与亚细胞单位定位/分布的变化有关。例如，以极化方式在正常细胞中表达的细胞膜蛋白质在疾病中会改变，这导致蛋白质以非极性方式分布在整个细胞表面。
已通过免疫组织化学方法用MUC1和Her2蛋白表达证实了疾病状态中亚细胞蛋白定位改变的现象。正常的上皮细胞具有典型的MUC1的顶端分布，除此之外还有糖蛋白的核上定位，而在恶性肿瘤病病灶通常呈现非极性染色模式(Diaz等，TheBreast Journal，7；40-45(2001)；Zhang等，Clinical Cancer Research，4；2669-2676(1998)：Cao等，The Journal ofHistochemistry and Cytochemistry，45：1547-1557(1997))。此外，正常的乳腺上皮是Her2蛋白阴性的或仅显示基底外侧分布，而恶性T细胞可在整个细胞表面表达蛋白质(De Potter等，International Journal of Cancer，44；969-974(1989)：McCormick等，117；935-943(2002))。或者，在疾病状态中，蛋白质的分布可从仅定位于表面变为分散到胞质中。对MUC1可观察到这样的例子(Diaz等，TheBreast Journal，7：40-45(2001))。
通过免疫组织化学方法检测到的细胞内蛋白质定位/分布的变化也为某些治疗方法的可行性提供了重要信息。这最后一点可通过在正常组织中位于胞内但在恶性细胞中出现在细胞表面的蛋白质的情况来说明；细胞表面定位使得细胞可顺利地用于基于抗体的诊断和治疗方法。当PSCA发生蛋白质定位改变时，PSCA蛋白和与其有关的免疫应答是非常有用的。因此，确定24P4C12亚细胞蛋白定位是否发生变化的能力使PSCA蛋白和与其有关的免疫应答非常有用。使用PSCA组合物使得精通本领域的技术人员能够做出重要的诊断和治疗决定。
当PSCA多肽出现在正常情况下不产生PSCA的组织中时，特异于PSCA的免疫组织化学试剂对于检测表达PSCA的肿瘤的转移也是有用的。
因此，PSCA多肽及其免疫应答产生的抗体可用于许多重要的方面，如精通本领域的技术人员已知的诊断、预后、预防和/或治疗目的。
就像熟练的技术人员将PSA多核苷酸片段和多核苷酸变体用于监测PSA的方法一样，PSCA多核苷酸片段和多核苷酸变体也可以类似方式使用。具体地说，用于监测PSA方法的典型PSA多核苷酸是由PSA cDNA序列片段构成的探针或引物。举例来说，用来PCR扩增PSA多核苷酸的引物必需包含不完整的PSA序列以在聚合酶链式反应中发挥作用。在这种PCR反应中，熟练的技术人员通常产生许多不同的多核苷酸片段，这些片段可被用作引物以扩增感兴趣的多核苷酸的不同部分或使扩增反应最优(见例如Caetano-Anolles，G.Biotechniques25(3)：472-476，478-480(1998)；Robertson等，Methods Mol.Biol.98：121-154(1998))。使用这种片段的另一个例子提供在题为“正常组织和患者标本内PSCA的表达分析”的实施例中，其中将PSCA多核苷酸片段用作探针以显示PSCA RNA在癌细胞中的表达。此外，变体多核苷酸序列在PCR和Northern分析中通常被用作相应mRNA的引物和探针(见例如Sawai等，Fetal Diagn.Ther.199611-1211(6)：407-13和Frederick M.Ausubel等编的《分子生物学最新方法》，1995))。多核苷酸片段和变体在这里是有用的，它们在高度严谨条件下能够结合靶多核苷酸序列(例如图2所示的PSCA多核苷酸或其变体)。
此外，含有可被抗体或T细胞识别的表位的PSA多肽被用于监测PSA的方法，其中所述抗体或T细胞特异性结合该表位。PSCA多肽片段和多肽类似物或变体也可以类似方式使用。这种用多肽片段或多肽变体产生抗体(如抗-PSA抗体或T细胞)在本领域的许多***中是常见的，如技术人员使用的融合蛋白***(见例如Frederick M.Ausubel等编的《分子生物学最新方法》，1995，第2卷第16单元)。文中，每个表位的功能是提供抗体或T细胞的反应性结构。通常，熟练的技术人员创建许多不同的多肽片段，这些片段可用来产生特异于感兴趣多肽不同部分的免疫应答(见例如美国专利5,840,501和美国专利5,939,533)。例如，可优选使用含有这里所述的一种PSCA生物基序或带有基序的亚序列的多肽，这种亚序列是精通本领域的技术人员基于本领域已知序列容易鉴定的。多肽片段、变体或类似物在这里通常是有用的，只要它们含有能够产生靶多肽序列(例如图3所示的PSCA多肽)特异性抗体或T细胞的表位。
如本文所示，PSCA多核苷酸和多肽(以及用来鉴定存在这些分子的PSCA多核苷酸探针和抗-PSCA抗体或T细胞)具有特殊的性质，这种特性使它们可用于诊断癌症，如表I所列的癌症。测量存在PSCA基因产物以评价这里所述疾病状况(如***癌)的出现或发生的诊断方法被用于鉴定患者以进行预防性检测或进一步的监测，就像已经获得成功的PSA那样。此外，这些物质满足了本领域在一些情况下对具有与PSA类似或互补特性的小分子的需要，所述情况例如，仅根据PSA的测试不能明确诊断***来源的转移(见例如Alanen等，Pathol.Res.Pract.192(3)：233-237(1996))，因此需要用PSCA多核苷酸和多肽(以及用来鉴定存在这些分子的PSCA多核苷酸探针和抗-PSCA抗体)等物质来证实***来源的转移。
最后，除了它们在诊断检测中的用途，这里所述的PSCA多核苷酸有许多其它用途，例如它们可用来鉴定PSCA基因染色体区域内与致癌有关的染色体异常(见下文题为“PSCA的染色体绘图”的实施例)。此外，除了用于诊断试验外，这里所述的PSCA相关蛋白和多核苷酸有许多其它用途，，例如它们可用于法医分析未知来源的组织(见例如Takahama K Forensic Sci Int1996-6-28；80(1-2)：63-9)。
此外，本发明的PSCA相关蛋白或多核苷酸可用来治疗以PSCA过度表达为特征的病理状况。例如，图2或图3的氨基酸或核酸序列，或其片段，可用来产生针对PSCA抗原的免疫应答。可用与PSCA反应的抗体或其它分子来调节这种分子的功能，从而可提供治疗益处。
XII.)抑制PSCA蛋白功能
本发明包括各种抑制PSCA结合其结合伴侣或与其它蛋白质相互关联的方法和组合物，以及抑制PSCA功能的方法。
XII.A.)用胞内抗体抑制PSCA
一种方法中，编码特异性结合PSCA的单链抗体的重组载体被通过基因传递技术引入PSCA表达细胞。因此，编码的单链抗-PSCA抗体在胞内表达，结合PSCA蛋白，并因此抑制其功能。工程改造这种胞内单链抗体的方法是熟知的。这种胞内抗体也称为“胞内抗体”，能特异性靶向细胞内的特定区室，使治疗的抑制作用基重在该区室。这种技术已成功用于本领域(参见例如Richardson和Marasco，1995，TIBTECH第13卷)。胞内抗体事实上可消除高丰度细胞表面受体的表达(见例如Richardson等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：3137-3141；Beerli等，1994，J.Biol.Chem.289：23931-23936；Deshane等，1994，Gene Ther.1：332-337)。
单链抗体包含通过可弯曲的接头多肽连接的重链和轻链的可变区，并作为单个多肽表达。任选地，单链抗体被作为与轻链恒定区结合的单链可变区片段表达。将熟知的胞内运输信号经工程改造成编码这种单链抗体的重组多核苷酸载体以使该胞内抗体精确靶向所需胞内区室。例如，靶向内质网(ER)的胞内抗体经改造而加入前导肽和任选的C-末端ER保留信号肽(如KDEL氨基酸基序)。工程改造使其含有核定位信号因而使胞内抗体在细胞核内具有活性。使脂质部分与胞内抗体结合以将胞内受体限制在质膜的胞质侧。胞内抗体经靶向也在胞质溶胶中发挥作用。例如，使胞质内的胞内抗体与胞质溶胶内的因子螯合，这样可防止它们进入它们的天然细胞目标地点。
在一个实施方案中，胞内抗体被用来捕获细胞核内的PSCA，从而防止它在细胞核内的活性。在这种PSCA胞内抗体中加入核靶向信号以实现所需寻靶。可设计这种PSCA胞内抗体来特异性结合特定的PSCA结构域。另一实施方案中，特异性结合PSCA蛋白的胞质胞内抗体被用来防止PSCA与细胞核接触，从而可防止它们在细胞核内发挥任何生物活性(例如防止PSCA与其它因子形成转录复合体)。
为具体指导这种胞内受体在特定细胞内表达，使胞内受体在合适的肿瘤特异性启动子和/或增强子的调控之下转录。为使胞内受体在***中特异性表达，可使用例如PSA启动子和/或启动子/增强子(见例如1999年7月6日发表的美国专利5,919,652)。
XII.B.)用重组蛋白抑制PSCA
另一种方法中，重组分子结合PSCA并因此抑制PSCA的功能。例如，这些重组分子可防止或抑制PSCA接触/结合其结合伴侣或与其它蛋白质关联。例如，这种重组分子可以含有PSCA特异性抗体分子的反应性部分。在一具体实施方案中，PSCA结合伴侣的PSCA结合域经工程改造到二聚融合蛋白中，因此该融合蛋白含有两个与人IgG(如人IgG1)的Fc部分结合的PSCA配体结合域。这种IgG部分可含有，例如，CH2和CH3区域以及绞链区，但不含CH1区域。这种二聚融合蛋白可以可溶形式给予患有与PSCA表达有关的癌症的患者，从而该二聚融合蛋白特异性结合PSCA并阻断PSCA与结合伴侣相互作用。还可用已知的抗体结合技术使这种二聚融合蛋白组合成多聚蛋白。
XII.C.)抑制PSCA转录或翻译
本发明还包括各种抑制PSCA基因转录的方法和组合物。类似地，本发明还提供了抑制PSCA mRNA翻译成蛋白质的方法和组合物。
一种方法中，抑制PSCA基因转录的方法包括使PSCA基因接触PSCA反义多核苷酸。另一种方法中，抑制PSCA mRNA翻译的方法包括使PSCAmRNA接触反义多核苷酸。另一个方法中，用PSCA特异性核酶来切割PSCA信使从而抑制翻译。这种基于反义和核酶的方法也可针对PSCA基因的调节区域，如PSCA启动子和/或增强子元件。类似地，能够抑制PSCA基因转录因子的蛋白质被用来抑制PSCAmRNA转录。在上述方法中有用的各种多核苷酸和组合物已经在上文中描述。使用反义和核酶分子抑制转录和翻译的方法是本领域熟知的。
通过紊乱PSCA转录活性抑制PSCA转录的其它因子也可用来治疗表达PSCA的癌症。类似地，紊乱PSCA加工的因子也可用来治疗表达PSCA的癌症。使用这类因子的癌症治疗方法也在本发明范围之内。
XII.D.)治疗方法的一般过程
可用基因转移和基因治疗技术来输送治疗性多核苷酸分子到合成PSCA的肿瘤细胞(即反义、核酶、编码胞内抗体的多核苷酸和其它PSCA抑制分子)。本领域已知许多基因治疗方法。也可用这种基因治疗方法将编码PSCA反义多核苷酸的重组载体、核酶、能够紊乱PSCA转录的因子等输送到靶肿瘤细胞。
上述治疗方法可与广泛使用的手术、化疗或放疗方法联合。本发明的治疗方法能够降低化疗(或其它疗法)的剂量和/或施用频率，这对患者是有利的，尤其是对于那些无法良好耐受化学治疗剂毒性的患者。
特定组合物(例如反义、核酶、胞内受体)或这些物质组合的抗肿瘤活性可用各种体外和体内测定***进行评价。评价治疗活性的体外测定包括细胞生长测定、软琼脂测定和其它指示肿瘤生长活性的试验，结合测定能够确定治疗化合物将抑制PSCA与结合伴侣等结合的程度的结合试验等。
可在合适的动物模型内评价PSCA治疗组合物的体内效果。例如可使用异种***癌模型，此模型中，人***癌外植体或传代的异种移植物组织被引入免疫能力低下的动物，如裸鼠或SCID小鼠(Klein等，1997，Nature Medicine3：402-408)。例如，PCT专利申请WO98/16628和美国专利6,107,540描述了人***癌的各种异种移植物模型，这些模型能够说明原发性肿瘤的发展、微转移和作为晚期疾病特征的成骨细胞转移。可利用测定抑制肿瘤形成、肿瘤消退或转移等预测其功效。
评价促进凋亡的体内试验也可用来评价治疗组合物。在一个实施方案中，可检测用治疗组合物处理的带有肿瘤异种移植物的小鼠以了解相比未处理的带有对照异种移植物的小鼠是否存在凋亡病灶。在经过治疗的小鼠的肿瘤内发现的凋亡病灶说明了组合物的治疗功效。
用于上述方法的治疗组合物可被配制成药物组合物，该药物组合物中含有适合所述输送方法的载体。合适的载体包括当与治疗组合物混合时保留治疗组合物的抗肿瘤功能且通常不与患者的免疫原性发生反应的任何物质。其例子包括但不限于任何一种标准药用载体，如无菌磷酸缓冲盐水溶液、抑菌水等(通常可见《雷明顿药物科学》第16版，A.Osal.编，1980)。
治疗制剂可被溶解并通过任何能够将治疗组合物输送到肿瘤部位的途径给药。比较有效的给药途径包括但不限于：静脉内、肠胃外、腹膜内、肌肉内、瘤内、真皮内、器官内、正位等。优选的静脉注射制剂所含的该治疗组合物可与防腐抑菌水、无菌非防腐水配成溶液或稀释在注射用含有0.9％无菌氯化钠的聚氯乙烯或聚乙烯袋中。治疗性蛋白质制品可被冻干并作为无菌粉末保存，优选在真空下冻干，然后在注射之前用抑菌水(含有例如苯甲醇防腐剂)或无菌水重配。
用上述方法治疗癌症的剂量和给药方法可根据方法和靶癌症不同而改变，且通常将取决于许多本领域已知的其它因素。
XIII.)PSCA调节剂的鉴定、特征分析和用途
鉴定和使用调节剂的方法
在一个实施方案中，进行筛选以鉴定调节剂，所述调节剂诱导或抑制特定表达模式、抑制或诱导特定途径，优选因此产生相关表型。另一实施方案中，已经鉴定了对于具体情况重要的差别表达的基因；进行筛选以鉴定改变(提高或降低)个体基因表达的调节剂。另一实施方案中，进行筛选以鉴定改变差别表达基因表达产物的生物功能的调节剂。再者，已经鉴定了基因在特定状态中的重要性，进行筛选以鉴定结合和/或调节基因产物生物活性的试剂。
此外，筛选在对候选试剂应答反应中受诱导的基因。鉴定调节剂(抑制癌症表达模式而产生正常表达模式的试剂，或能调节癌基因导致该基因在正常组织中表达的调节剂)，然后进行筛选以鉴定在对该试剂的应答反应中受到特异性调节的基因。比较正常组织和用试剂处理的癌组织的表达模式可显示在正常组织或癌组织内不表达但在经过试剂处理的组织内表达的基因，或者反之亦然。用这里所述的用于癌症基因或蛋白质的方法鉴定和使用这些试剂特异性序列。具体地说，这些序列和它们编码的蛋白质被用来标记或鉴定试剂处理的细胞。此外，产生了抗试剂诱导型蛋白质的抗体并被用来使新的治疗剂靶向被治疗的癌症组织样品。
与调节剂有关的鉴定和筛选试验：
与基因表达有关的试验
本发明的蛋白质、核酸和抗体被用于筛选试验。与癌症有关的蛋白质、抗体、核酸、修饰的蛋白质以及含有这些序列的细胞被用于筛选测定，例如评价药物候选物对＂基因表达模式”、多肽表达模式或改变生物功能的作用。在一个实施方案中，使用表达模式(优选与高通量筛选技术结合)以在用候选试剂处理之后监测基因表达模式(例如Davis，GF等，J Biol Screen7：69(2002)；Zlokarnik等，Science279：84-8(1998)；Heid，Genome Res6：986-94，1996)。
癌蛋白、抗体、核酸、修饰的蛋白质和含有天然或修饰癌蛋白或基因的细胞被用于筛选测定。即，本发明包括筛选调节癌症表型或本发明的癌蛋白生理功能的方法。这可基因上完成或通过评价药物候选物的“基因表达模式”或生物学功能而完成。在一个实施方案中，使用表达模式(优选与高通量筛选技术结合)以在用候选试剂处理之后进行监测，见Zlokamik，同上。
进行了各种涉及本发明的基因和蛋白质的试验。测定可在个体核酸或蛋白质水平进行。即，鉴定在癌症中上调的特定基因之后可筛选测试化合物以了解调节基因表达或结合本发明的癌蛋白的能力。″调节″在这里包括提高或降低基因表达。优选的调节量将取决于正常组织与癌组织中基因表达的最初变化，其变化至少为10％，优选50％，更优选100-300％，且在一些实施方案中为300-1000％或更高。因此，如果正常组织相比某基因在癌组织中表达增加4倍，常需要降低约4倍；类似地，与正常组织相比在癌组织内降低10倍，常需要测试化合物使其表达提高10倍。也可采用能恶化癌症中基因表达的调节剂，例如，在进一步分析上调靶基因表达。
用核酸探针和定量测定来监测基因表达的量及基因表达水平，或者可监测基因产物本身，例如通过使用癌蛋白的抗体和标准免疫试验。也可用蛋白组学和分离技术来定量测定表达。
通过监测表达来鉴定修饰基因表达的化合物
在一个实施方案中，同时对许多实体进行基因表达监测，即监测表达图谱。这种图谱通常包括一个或多个图2所示的基因。该实施方案中，例如，使癌症核酸探针结合到生物芯片上以检测并量化特定细胞内的癌症序列。或者可采用PCR。因此可使用微量滴定板，其所需孔内分散有引物。然后可进行PCR反应并对每个孔进行分析。
进行表达监测以鉴定修饰一种或多种癌症相关序列(如图2所列的多核苷酸序列)的表达的化合物。通常在分析之前在细胞中加入测试调节剂。此外，还进行筛选以鉴定调节癌症、调节本发明的癌蛋白、结合本发明的癌蛋白或紊乱本发明的癌蛋白与抗体或其结合伴侣结合的分子。
在一个实施方案中，高通量筛选方法包括提供包含大量潜在治疗化合物(候选化合物)的库。然后在一个或多个测定中筛选这种″组合化学库″以鉴定那些具有所需化学活性的库成员(尤其是化学种类或亚类)。鉴定出的化合物可作为常规的″先导化合物″，如筛选用化合物，或作为治疗剂。
在某些实施方案中，筛选潜在调节剂组合文库结合癌多肽的能力或调节活性。通常，通过鉴定具有一些所需特性或活性(例如抑制活性)的化合物(称作“先导化合物”)、产生所述先导化合物的变体并评价这些变体化合物的特性和活性，可产生具有有用特性的新的化学实体。通常，高通量筛选(HTS)法被用于这种分析。
如上所述，基因表达监测通常被用来检测候选调节剂(例如蛋白质、核酸或小分子)。加入候选试剂并将细胞培养一段时间之后，含有待分析靶序列的样品例如被加到生物芯片上。
需要的话可用已知技术来制备靶序列。例如，用已知的裂解缓冲液、电穿孔等方法处理样品以使细胞裂解，并纯化和/或扩增，例如通过PCR。例如可用共价结合到核苷酸的标记物进行体外转录。核酸通常用生物素-FITC或PE或用cy3或cy5标记。
靶序列可用荧光信号、化学发光信号、化学信号或放射性信号标记以便检测与探针特异性结合的靶序列。标记也可以是酶，如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，当提供合适底物时可检测这些酶产生的产物。或者，标记是被标记的化合物或小分子，如酶抑制剂，它们与酶结合但不被酶催化或改变。标记也可以是例如表位标记或特异性结合链霉亲和素的生物素。以生物素为例，如上所述标记链霉亲和素，从而为结合的靶序列提供了可检测的信号。未结合的标记链霉亲和素通常在分析之前被除去。
本领域的技术人员将了解，这些试验可以是直接杂交测定或者是使用多个探针的“夹心试验”，这种方法通常描述在美国专利5,681,702；5,597,909；5,545,730；5,594,117；5,591,584；5,571,670；5,580,731；5,571,670；5,591,584；5,624,802；5,635,352；5,594,118；5,359,100；5,124，246和5,681,697。该实施方案中，通常按上述方法制备靶核酸，然后在能够形成杂交复合体的条件下将其加到含有许多核酸探针的生物芯片上。
本发明采用了多种杂交条件，其中包括上述高、中和低严谨条件。通常在仅在靶存在时才能形成标记探针杂交复合体的严谨条件下进行测定。可通过改变热力学可变的步骤参数来控制严谨性，其中包括但不限于温度、甲酰胺浓度、盐浓度、离液盐浓度、pH、有机溶剂浓度等。也可用这些参数来控制非特异性结合，例如美国专利5,681,697所述。因此，在比较高的严谨条件下进行某些步骤以减少非特异性结合较为理想。
可用各种方法实现这里列出的反应。反应组分可同时或以不同顺序依次加入，其优选实施方案如下。此外，可在反应物中加入许多其它试剂。这些试剂包括盐、缓冲液、中性蛋白质(如白蛋白)、去污剂等，它们将有利于优化杂交和检测，和/或减少非特异性或背景相互作用。需要的话也可使用能够提高测定效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酶抑制剂、抗微生物剂等，这取决于样品制备方法和靶的纯度。分析检测数据以确定各个基因的表达水平以及各种状态之间表达水平的变化，从而形成基因表达图谱。
与生物活性有关的测定
本发明提供了鉴定或筛选调节本发明的癌症相关基因或蛋白质的活性的化合物。该方法包括在含有本发明癌蛋白的细胞中加入上文定义的检测化合物。所述细胞含有编码本发明癌蛋白的重组核酸。另一实施方案中，在许多细胞上检测候选试剂的库。
一方面，在存在或不存在生理信号，或者之前或之后暴露于生理信号的情况下进行测定，所述生理信号例如有激素、抗体、肽、抗原、细胞因子、生长因子、动作电位、药剂(包括化疗剂)、辐射、致癌物或其它细胞(即细胞-细胞接触)。另一实施例中，在细胞周期的不同阶段进行测定。用这种方法鉴定了调节本发明的基因或蛋白质的化合物。具有药理活性的化合物能够增强或紊乱本发明的癌蛋白的活性。一旦被鉴定，可评估类似的结构以便鉴定化合物的决定性结构特征。
在一个实施方案中，提供了调节(例如抑制)癌细胞***的方法；该方法包括给予一种癌症调节剂。另一实施方案中，提供了调节(例如抑制)癌症的方法；该方法包括给予一种癌症调节剂。再在其它实施方案中，提供了处理癌细胞或患有癌症的个体的方法；该方法包括给予一种癌症调节剂。
在一个实施方案中，提供了调节表达本发明基因的细胞的状态的方法。这里所述的状态包括本领域接受的参数，如细胞的生长、增殖、存活力、功能、凋亡、老化、定位、酶活性、信号转导等。在一个实施方案中，癌症抑制剂是上述抗体。另一实施方案中，癌症抑制剂是反义分子。如本文所述，各种测定细胞生长、增殖和转移的方法是精通本领域的技术人员已知的。
通过高通量筛选鉴定调节剂
鉴定合适调节剂的试验包括高通量筛选。优选的试验能够检测癌基因转录的增强或抑制、多肽表达的增强或抑制、以及多肽活性的抑制或增强。
在一个实施方案中，高通量筛选法鉴定的调节剂是蛋白质，通常是天然产生的蛋白质或是天然产生的蛋白质的片段。因此，例如可使用含有蛋白质的细胞提取物或蛋白质性细胞提取物的随机或定向消化物。通过这种方法制得了在本发明方法中用来进行筛选的蛋白质文库。在该实施方案中，特别优选的是细菌、真菌、病毒和哺乳动物蛋白质文库，优选哺乳动物蛋白质文库，尤其是人蛋白质文库。特别有用的测试化合物将被定向到靶所属蛋白质种类，例如酶和底物，或者配体和受体。
使用软琼脂生长和集落形成来鉴定和特征分析调节剂
正常细胞需要固体基质以附着和生长。当细胞被转化后便丧失了这种表型并可离开基质生长。例如，转化的细胞可生长在搅拌的悬浮培养物中或悬浮在半固体培养基(例如半固体琼脂或软琼脂)中。当用肿瘤抑制基因转染转化的细胞时，它们可恢复正常表型并又需要固体基质以便附着和生长。在检测中用软琼脂生长或集落形成来鉴定癌症序列的调节剂，当该序列在宿主细胞内表达时可抑制异常细胞增殖和转化。调节剂可降低或消除宿主细胞在固体或半固体培养基(如琼脂)中悬浮生长的能力。
悬浮测定中的软琼脂生长或集落形成技术描述在Freshney的《动物细胞培养基础技术手册》(Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique)(第三版，1994)。也可参见Garkavtsev等(1996，同上)一书的方法部分。
评定接触抑制和生长密度限制以鉴定和特征分析调节剂
正常细胞在细胞培养物中通常以平铺且有组织的模式生长，直到它们接触其它细胞。当细胞接触其它细胞时它们会接触抑制并停止生长。然而，转化的细胞不会接触抑制并在紊乱的病灶内继续生长至高密度。因此，相比正常细胞，转化的细胞生长至较高的饱和密度。这可通过在病灶中形成无序的细胞单层细胞从形态上加以鉴定。或者可用饱和密度时(3H)-胸腺嘧啶的标记指数来测定生长密度限制，类似地，MTT或Alamar蓝检测将显示细胞的增殖能力以及调节剂影响增殖的能力。见Freshney，(1994)，同上。转化的细胞当被肿瘤抑制基因转染时可恢复正常表型，受到接触抑制并生长至较低密度。
该检测中，饱和密度时(3H)-胸腺嘧啶的标记指数是优选的测量生长密度限制的方法。用癌症相关序列转染转化的宿主细胞并使其在非限制培养条件下在饱和密度生长24小时。通过每分钟掺入的数量来确定(3H)-胸腺嘧啶标记的细胞的百分比。
用接触不限制的生长来鉴定癌症序列的调节剂，所述序列以及导致异常细胞增殖和转化。调节剂可降低或消除接触不限制的生长并使细胞回到正常表型。
评价生长因子或血清依赖性以鉴定和特征分析调节剂
转化的细胞相比相对应的正常细胞具有较低的血清依赖性(见例如Temin，J.Natl.Cancer Inst.37：167-175(1966)；Eagle等，J.Exp.Med131：836-879(1970))；Freshney，同上。这部分是由于转化的细胞会释放各种生长因子。可将转化的宿主细胞的生长因子或血清依赖性程度与对照细胞相比较。例如，在方法中监测细胞的生长因子或血清依赖性以鉴定和特征分析调节本发明癌症相关序列的化合物。
使用肿瘤特异性标记的水平来鉴定和特征分析调节剂
肿瘤细胞释放的某些因子(以后称为“肿瘤特异性标记”)的量高于相对应的正常细胞。例如，人胶质瘤以高于正常脑细胞的水平释放纤溶酶原激活剂(PA)(见例如Gullino，“血管发生、肿瘤血管形成和肿瘤生长的潜在紊乱”(Angiogenesis，TumorVascularization，and Potential Interference with Tumor Growth)，引自《癌症中的生物应答》(Biologial Responses in Cancer)一书第178-184页(Mihich编，1985))。类似地，肿瘤细胞也以高于相对应的正常细胞的水平释放肿瘤血管形成因子(TAF)。见例如Folkman，《血管发生和癌症》(Angiogenesis and Cancer)，Sem Cancer Biol.(1992))，而内皮瘤释放bFGF(Ensoli，B等)。
测量这些因子的释放的各种技术描述在Freshney(1994)，同上。也可参见Unkless等，J.Biol.Chem.249：4295-4305(1974)；Strickland & Beers，J.Biol.Chem.251：5694-5702(1976)；Whur等，Br.J.Cancer42：305312(1980)；Gullino，“血管发生、肿瘤血管形成和肿瘤生长的潜在紊乱”，引自《癌症中的生物应答》一书第178-184页(Mihich编，1985)；Freshney，Anticancer Res.5：111-130(1985)。例如，可在方法中监测肿瘤特异性标记的水平以鉴定和特征分析调节本发明癌症相关序列的化合物。
通过对基质胶的侵袭来鉴定和特征分析调节剂
可将侵入基质胶的程度或胞外基质成分用于鉴定和特征分析能调节癌症相关序列的化合物的试验。肿瘤细胞在恶变和侵入基质胶或其它胞外基质成分之间显示为正相关。在该测定中通常将肿瘤发生细胞作为宿主细胞。肿瘤抑制基因在这些宿主细胞内表达将降低对宿主细胞的侵入性。可使用以下文献中描述的技术：Cancer Res.1999；59：6010；Freshney(1994)，同上。简言之，可用涂有基质胶或其它胞外基质成分的滤器来测量对宿主细胞的侵入水平。侵入凝胶或穿过滤器的远侧被评定为侵袭力，并通过细胞数和移动距离或通过用125I预先标记细胞然后对滤器的远侧或平皿底部进行放射性计数来进行组织学评价。见例如Freshney(1984)，同上。
评定体内肿瘤生长以鉴定和特征分析调节剂
在转基因生物或免疫抑制生物内检测癌症相关序列对细胞生长的作用。转基因生物用各种本领域可接受的方法制备。例如可制造敲除转基因生物，例如小鼠等哺乳动物，其中的癌基因被破坏或在其中***癌基因。通过同源重组在小鼠基因组的内源癌症基因位点***标记基因或其它异源基因从而制造出敲除转基因小鼠。也可用突变的癌基因取代内源癌基因，或使内源癌基因突变(例如通过本领域致癌物)来制造这种小鼠。
为制造转基因嵌合动物(如小鼠)，可将DNA构建物引入胚胎干细胞的细胞核。具有新构建的遗传缺陷的细胞被注射入宿主小鼠胚胎，并将该胚胎重新植入雌性受体。其中一些胚胎发展成嵌合小鼠，这些小鼠的一些生殖细胞源自突变细胞系。因此，通过饲养这种嵌合小鼠能够获得含有引入的遗传缺陷的新小鼠品系(见例如Capecchi等，Science244：1288(1989))。可用以下方法获得嵌合小鼠：2002年4月2日发表的美国专利6,365,797；2000年8月22日发表的美国专利6,107,540；Hogan等，《小鼠胚胎操作实验室手册》(Manipulating the Mouse Embryo：A laboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)以及Robertson编写的《畸胎癌和胚胎干细胞实际进展》，IRL Press，Washington，D.C.，(1987)。
或者可使用各种免疫抑制或免疫缺陷宿主动物。例如，通过基因方法获得的无胸腺“裸”鼠(见例如Giovanella等，J.Natl.Cancer Inst.52：921(1974))、SCID小鼠、胸腺切除小鼠或照射小鼠(见例如Bradley等，Br.J.Cancer38：263(1978)；Selby等，Br.J.Cancer41：52(1980))可被用作宿主。注射入同基因宿主的可移植的肿瘤细胞(通常约106细胞)以高比例产生侵入性肿瘤，而类似来源的正常细胞则不会这样。在发展了侵入性肿瘤的宿主中皮下或正位注射表达肿瘤相关序列的细胞。然后将小鼠分成对照组和治疗实验组(例如用调节剂治疗)。合适时间后，优选4-8周，测量肿瘤生长(例如通过体积或通过其两个最大尺寸，或肿瘤)并与对照进行比较。统计学上显著减少的肿瘤(采用例如斯氏T检验)被认为生长受到抑制。
鉴定和特征分析调节剂的体外检测
可在体外进行检测以鉴定具有调节活性的化合物。例如，使癌症多肽首先接触潜在的调节剂，然后培养合适的时间，例如0.5-48小时。在一个实施方案中，通过测量蛋白质或mRNA水平在体外确定癌症多肽水平。蛋白质水平采用免疫测定(例如Western印迹、ELISA等)用选择性结合癌症多肽或其片段的抗体来测量。为测量mRNA，优选用扩增检测(例如用PCR、LCR)或杂交检测(例如Northern杂交、RNA酶保护、斑点印迹)。用直接或剪接标记的检测试剂检测蛋白质或mRNA的水平，所述检测试剂如上所述例如荧光标记或放射性标记的核酸、放射性标记或酶标记的抗体等。
或者，可用操作性连接于萤光素酶、绿色荧光蛋白、CAT或P-gal等报告基因的癌蛋白启动子来设计报告基因***。报告基因构建物通常被转染到细胞中。用潜在的调节剂处理之后，用精通本领域的技术人员已知的标准计数来测量报告基因转录、翻译或活性量(Davis GF，同上；Gonzalez，J.& Negulescu，P.Curr.Opin.Biotechnol.1998：9：624)。
如上所述，对各个基因和基因产物进行体外筛选。这就是说，在鉴定出在特定状态重要的差异性表达的特定基因之后对表达该基因或其基因产物的调节剂进行筛选。
在一个实施方案中，筛选表达特定基因的调节剂。通常只评价一个或几个基因的表达。另一实施方案中，筛选被设计成首先寻找结合差别表达的蛋白质的化合物。然后评价这些化合物调节差异性表达活性的能力。此外，一旦鉴定了最初的候选化合物，可进一步筛选其变体以更好地评价结构活性关系。
鉴定和特征分析调节剂的结合检测
在本发明的结合检测中通常使用纯化或分离的本发明的基因产物。例如，产生本发明蛋白质的抗体，进行免疫测定以确定该蛋白质的量和/或定位。或者，含有癌蛋白的细胞可用于该测定。
因此，所述方法包括使本发明的癌蛋白结合候选化合物(如配体)，并确定该化合物与本发明的癌蛋白的结合。优选的实施方案使用人癌蛋白；也可建立并使用人类疾病的动物模型。同时，精通本领域的技术人员也可使用其它类似的哺乳动物蛋白质。此外，一些实施方案使用了变体或衍生的癌蛋白。
通常，本发明的癌蛋白或配体非扩散性地结合不溶性支持物。例如，所述支持物可以含有独立的样品接受区(微量滴定板、阵列等)。不溶性支持物可用任何组合物制成，它可结合所述组合物，易于从可溶性物质中分离，或者与整个筛选方法相容。这种支持物的表面可以是固体或是多孔的，并具有任何方便操作的形状。
合适的不溶性支持物的例子包括微量滴定板、阵列、膜和珠。它们通常由玻璃、塑料(如聚苯乙烯)、多糖、尼龙、硝酸纤维素或TeflonTM等制成。微量滴定板和阵列尤其方便，因为可用小量试剂和样品同时进行大量测定。对组合物和支持物的具体结合方法没有规定，只要它与本发明的试剂和方法相容、保持组合物的活性且不可扩散即可。优选的结合方法包括使用抗体，当该抗体将蛋白质结合到支持物时对配体结合位点或活化序列都不造成空间阻遏；直接结合到“粘性”或离子支持物；化学交联；在表面合成蛋白质或试剂等。蛋白质或配体/结合剂与支持物结合之后通过洗涤除去过量的未结合的物质。然后与牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或其它无关蛋白质或其它化学分子一起培育以封闭样品接受区。
一旦本发明的癌蛋白与支持物结合，便可加入检测化合物进行测定。或者使候选结合剂结合支持物然后加入本发明的癌蛋白。结合剂包括特异性抗体、通过筛选化学文库鉴定的非天然结合剂、肽类似物等。
特别感兴趣的是鉴定对人类细胞具有低毒性的试剂。出于该目的可使用许多检测方法，其中包括增殖分析、cAMP分析、标记的蛋白质-蛋白质结合体外检测、电泳迁移率变动分析、蛋白质结合的免疫测定、功能分析(磷酸化作用分析等)，等等。
可用许多方法来测定检测化合物(配体、结合剂、调节剂等)与本发明的癌蛋白的结合。检测化合物可被标记，并可直接确定结合作用，例如将全部或部分本发明的癌蛋白加到固体支持物、加入标记的候选化合物(例如荧光素标记)、洗去过量试剂并确定固体支持物上是否存在标记。需要的话可使用不同的封闭和洗涤步骤。
在某些实施方案中，只有一种组分被标记，例如标记本发明的蛋白质或配体。或者用不同的标记物标记多个组分，例如用I125标记蛋白质并用荧光团标记化合物。邻近试剂(proximity reagent)，例如淬灭剂或能量转移剂，也是有用的。
竞争性结合以鉴定和特征分析调节剂
在一个实施方案中，通过与“竞争者”的竞争性结合实验确定“检测化合物”的结合。竞争者是结合靶分子(例如本发明的癌蛋白)的结合部分。竞争者包括抗体、肽、结合伴侣、配体等之类的化合物。某些情况下，竞争者代替检测化合物竞争性结合。在一个实施方案中，检测化合物被标记。可在蛋白质中加入检测化合物或竞争者或这两者并放置足够进行结合的时间。在使活性最强的温度(通常在4-40℃之间)下进行培育。培育时间通常被最优化，例如以有利于迅速高通量筛选；通常0-1小时就足够了。过量的试剂通常被除去或洗去。然后加入第二组分，之后加入或不加入指示结合的标记的组分。
在一个实施方案中，先加入竞争者，然后再加入检测化合物。竞争者被置换说明检测化合物结合癌蛋白，因此能够结合并有可能调节癌蛋白的活性。该实施方案中，任一组分可被标记。因此，例如，如果竞争者被标记，检测后化合物的洗涤液中存在标记说明竞争者被检测化合物置换。或者，如果检测化合物被标记，则支持物上存在标记说明被置换。
在另一个实施方案中，首先加入检测化合物，培育并洗涤，然后加入竞争者。竞争者未结合说明该检测化合物结合癌蛋白的亲和力高于竞争者。因此，如果检测化合物被标记，则支持物上存在标记竞争者未能结合说明检测化合物能结合本发明的癌蛋白从而可能调节癌蛋白。
因此，竞争性结合法包括差异性筛选以鉴定能够调节本发明癌蛋白活性的试剂。在该实施方案中，所述方法包括使癌蛋白与第一样品内的竞争者结合。第二样品含有检测化合物、癌蛋白和竞争者。确定两个样品竞争者的结合，两个样品之间结合情况的改变或不同说明存在能够结合癌蛋白并有可能调节其活性的试剂。这就是说，如果第二样品内竞争者的结合不同于第一样品，则该试剂能够结合癌蛋白。
或者，用差异性筛选来鉴定结合天然癌蛋白但不能结合修饰的癌蛋白的药物候选物。例如，确定癌蛋白的结构并将其用于合理的药物设计，从而合成与该位点相互作用的试剂以及通常不结合位点修饰的蛋白质的试剂。此外，还通过筛选药物增强或降低这种蛋白质活性的能力而鉴定了影响天然癌蛋白活性的药物候选物。
分析中也可使用阳性对照和阴性对照。对照样品和测试样品宜进行至少三次以获得统计学上显著的结果。将所有样品培育足以使试剂与蛋白质结合的时间。培育之后洗涤样品以除去非特异性结合的物质并确定结合的且通常是标记的试剂的量。例如，当使用放射性标记时，样品可在闪烁计数器内计数以确定结合的化合物的量。
筛选分析中也可使用其它试剂。这些试剂包括盐、中性蛋白质(例如白蛋白)、去污剂等，使用它们将有利于蛋白质-蛋白质最佳结合和/或减少非特异性或背景相互作用。也可使用能够提高测定效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酶抑制剂、抗微生物剂等。以一定顺序加入各组分的混合物以提供需要的结合。
使用多核苷酸来下调或抑制本发明的蛋白质
如WO 91/04753所述，通过形成与配体结合分子的偶联物可将癌症的多核苷酸调节剂引入含有靶核苷酸序列的细胞。合适的配体结合分子包括但不限于：细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子或结合细胞表面受体的其它配体。优选配体结合分子的结合基本上不会影响配体结合分子结合其相应分子或受体、或者阻止正义或反义寡核苷酸或其结合形式进入细胞的能力。或者，癌症的多核苷酸调节剂可被引入含有靶核酸序列的细胞，例如通过形成多核苷酸-脂质复合体，如WO 90/10448所述。除治疗方法外，在上述筛选方法中也可使用反义分子或敲除及敲入模型。
抑制性和反义核苷酸
在某些实施方案中，通过使用反义多核苷酸或抑制性核内小RNA(snRNA)，即与mRNA编码核酸序列(例如本发明的癌蛋白)、mRNA或其亚序列互补并且可较佳地与它们特异性杂交的核酸，下调或完全抑制癌症相关蛋白的活性。反义多核苷酸与mRNA结合降低了mRNA翻译和/或稳定性。
在本发明中，反义多核苷酸可包括天然产生的核苷酸或由天然产生的亚单位或其密切同系物形成的合成种类。反义多核苷酸也可含有改变的糖部分或糖内连接。其例子有硫代磷酸酯以及其它含有硫的种类，已知它们都可用于本领域。只要类似物可与本发明的核苷酸有效杂交即包含在本发明之内。见例如Isis Pharmaceuticals，Carlsbad，CA；Sequitor，Inc.，Natick，MA。
这种反义多核苷酸可以用重组方法方便地合成，或者可以在体外合成。一些厂商出售这种合成设备，其中包括Applied Biosystems。制备其它寡核苷酸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物的方法也是精通本领域的技术人员熟知的。
这里使用的反义分子包括包括反义或正义寡核苷酸。例如，可用正义寡核苷酸与反义链的结合而阻断转录。反义和正义寡核苷酸包括能够结合癌症分子靶mRNA(正义)或DNA(反义)序列的单链核酸序列(RNA或DNA)。本发明所述的反义或正义寡核苷酸包括通常含有至少约12个核苷酸，优选含有约12-30个核苷酸的片段。从编码指定蛋白质的cDNA序列产生反义或正义寡核苷酸的能力描述在，例如，Stein&Cohen(Cancer Res.48：26591988)和van der Krol等(BioTechniques6：958(1988))。
核酶
除反义多核苷酸，可用核酶来寻靶和抑制癌症相关核苷酸序列的转录。核酶是能催化性切断其它RNA分子的RNA分子。已经描述过不同种类的核酶，其中包括I组核酶、锤头核酶、发夹核酶、核糖核酸酶P和斧头核酶(可参见例如Castanotto等，Adv.in Pharmacology25：289-317(1994)以对不同核酶的特性有大致了解)。
发夹核酶的一般特性描述在，例如，Hampel等，Nucl.Acids Res.18：299-304(1990)；欧洲专利公开号0360257；美国专利5,254,678。其制备方法是精通本领域的技术人员熟知的(见例如WO 94/26877；Ojwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6340-6344(1993)；Yamada等，Human Gene Therapy1：39-45(1994)；Leavitt等，Proc.Natl.Acad Sci.USA92：699-703(1995)；Leavitt等，Human Gene Therapy5：1151-120(1994)；以及Yamada等，Virology205：121-126(1994))。
在表型筛选中使用调节剂
在一个实施方案中，给予具有癌症相关表达特征的癌细胞群检测化合物。″给予″或″接触″在这里是指将调节剂加入细胞中，调节剂对该细胞的作用方式是通过摄入和在胞内发挥作用或在细胞表面发挥作用。一些实施方案中，编码蛋白质样试剂(即肽)的核酸被加入病毒构建物，例如腺病毒或逆转录病毒构建物，并加入细胞，这样可实现肽试剂的表达，例如PCT US97/01019。也可用可调基因治疗***。一旦给予细胞调节剂，需要的话洗涤细胞并优选在生理条件下将细胞培育一段时间。然后收获细胞并生成新的基因表达图谱。筛检该试剂所调节(诱导或抑制)的癌组织表型变化。至少一个(优选有多个)基因表达图谱的变化说明该试剂对癌症活性有作用。类似地，生物功能或信号通路的改变也指示了调节剂的活性。通过定义这种癌症表型特征可以筛选出改变这种表型的新药。用这种方法不需要知道药靶，并且不需要在传统的基因/蛋白质表达平台上展示，且不需要改变靶蛋白的转录物水平。调节剂的抑制功能将被作为替代标记。
如上所述，对基因或基因产物进行了筛选。这就是说，在鉴定出在特定状态重要的差别表达的特定基因之后对表达该基因或其基因产物的调节剂进行筛选。
使用调节剂来影响本发明的肽
用各种试验测量癌症多肽的活性或癌症表型。例如通过检测上述参数测量调节剂对癌症多肽的作用。用影响活性的生理变化来评估检测化合物对本发明多肽的影响。当用完整的细胞或动物确定功能结果之后可评估各种效应，例如，在与实体瘤有关的癌症病例中，这些效应包括肿瘤生长、肿瘤转移、新血管形成、激素释放、已知和未知遗传标记的转录变化(例如通过Northern印迹)、细胞代谢的变化如细胞生长或pH的改变以及胞内第二信使如cGNIP的变化。
鉴定定性癌症相关序列的方法
使各种基因序列的表达与癌症相关。因此可确定基于突变体或变体癌症基因的疾病。在一个实施方案中，本发明提供了鉴定含有变体癌症基因的细胞的方法，例如确定细胞内存在(全部或部分)至少一种内源癌症基因的序列。这可通过多种测序技术实现。本发明包括鉴定个体癌症基因型的方法，例如确定个体内至少一种本发明基因的全部或部分序列。这通常在至少一种个体组织内进行，例如表I所列的组织，并且可包括评价许多组织或相同组织的不同样品。该方法可包括测序基因的序列与已知癌症基因(即野生型基因)进行比较以确定存在家族成员、同系物、突变体或变体。然后可将该基因的全部或部分序列与已知癌症基因的序列进行比较以确定是否存在任何区别。这可通过多种已知的同源性程序进行，如BLAST、Bestfit等。如这里所述，患者的癌症基因序列和已知癌症基因序列之间存在差别与患病或可能患病相关联。在一优选的实施方案中，癌症基因被用作探针以确定基因组内癌症基因的拷贝数。癌症基因被用作探针以确定癌症基因的染色体定位。染色体定位等信息可用于诊断或预测，尤其是在癌症基因基因座内鉴定出染色体异常如易位时。
XIV.)试剂盒/制造物品
为用于这里所述的实验室、预后、预防、诊断和治疗用途，本发明包括试剂盒。这种试剂盒可包含载体、包装或被划分以容纳一种或多种内容物如小瓶、试管等的容器，每个容器内中包含一个单独用于该方法的独立元件，以及包括使用说明书。例如，容器内可包含被或可被可检测标记的探针。这种探针可以是分别特异于本发明的蛋白质或基因或信使的抗体或多核苷酸。当所述方法利用核酸杂交来检测靶核酸时，试剂盒的容器中还可含有用来扩增靶核酸序列的核苷酸。试剂盒的容器中含有受体，如结合生物素的蛋白质，例如亲和素或链霉亲和素，它们结合到酶标记、荧光标记或放射性同位素标记等报告分子；这种报告分子可与例如核酸或抗体一起使用。所述试剂盒在可含有图2或图3的全部或部分氨基酸序列或其类似物，或编码这种氨基酸序列的核酸分子。
本发明的试剂盒通常包含上述容器以及一个或多个与其有关的其它容器，这些容器中含有出于商业和用户立场而需要的物质，包括缓冲液、稀释剂、填料、针头、针管；载体、包装、标识成分和/或使用说明的小瓶和/或试管上的标签、以及使用说明书。
标签可出现在容器上或与容器一起出现，以指导如何将该组合物用于特定的治疗或非治疗用途，例如预后、预防、诊断或实验室用途，并且可以指导如何在体内和体外使用，如这里所述的那些。说明或其它信息也可出现在说明书或标签上，所述说明书或标签与试剂盒一起提供或提供在试剂盒上。标签可出现在容器上或与容器一起提供。当构成标签的字母、数字或其它特征是模压到或嵌入容器本身上时标签可出现在容器上；当标签出现在装有该容器的盒子或载体内时标签可与容器一起提供。标签可指示如何将组合物用于诊断、治疗、预防或预测症状，所述症状例如表I所列组织的肿瘤形成。
术语“试剂盒”和“制造物品”可互换使用。
在本发明的另一个实施方案中，制造物品中包含组合物，如氨基酸序列、小分子、核酸序列和/或抗体，例如用于诊断、预后、预防和/或治疗组织(如表I中列出的那些组织)肿瘤形成的物品。制造物品中通常含有至少一个容器和至少一份标签。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、针筒和试管。所述容器可由多种材料制成，如玻璃、金属或塑料。容器中可含有氨基酸序列、小分子、核酸序列、细胞群和/或抗体。在一个实施方案中，容器中含有用来检测细胞mRNA表达图谱的多核苷酸以及用于此目的的试剂。另一实施方案中，容器中含有抗体、其结合片段或特异性结合蛋白，以评价细胞和组织内282P1G3的蛋白质表达，或用于相关实验室、预后、诊断、预防和治疗目的；这种容器上或与其一起出现的还有这种用途的指导和/或说明书，并且可含有用于这些目的的试剂和其它组合物或工具。另一实施方案中，容器中含有用来引发细胞或体液免疫应答的物质，以及有关指导和/或说明书。另一实施方案中，容器中含有用于过继免疫治疗的物质，如如细胞毒T细胞(CTL)或辅助T细胞(HTL)，以及有关指导和/或说明书；也可含有用于该目的的试剂和其它组合物或工具。
容器中也可含有能够有效治疗、诊断、预测或预防某种症状的组合物并且可含有无菌接口(例如，所述容器可以是静脉内溶液包或小瓶，其上有可用皮下注射针头刺穿的塞子)。组合物内的活性剂可以是能够特异性结合282P1G3并调节282P1G3功能的抗体。
所述制造物品还可含有第二个容器，其中含有药学上可接受的缓冲液，如磷酸缓冲盐水、林格溶液和/或葡萄糖溶液。它还可含有其它出于商业和用户立场而需要的物质，包括其它缓冲液、稀释剂、填料、搅拌器、针头、针管和/或使用说明书和/或用法指导。
实施例
通过下面的几个实施例对本发明的各个方面做进一步的描述和说明，这些实施例都不意味着对本发明范围的限制。
实施例1：利用SSH分离PSCA基因的cDNA片段
故意省略
实施例2：全长PSCA编码cDNA的分离
故意省略
实施例3：PSCA的染色体绘图
故意省略
实施例4：PSCA变体在正常组织及患者标本内的表达分析
PSCA在本文中被称为PSCA v.1，以前的研究已经证实PSCA在***癌中是作为抗原来表达的。在超过80％的原发***癌和大多数***转移癌中都有PSCA的表达。PSCA还表达于胆囊癌、卵巢癌和胰腺癌中；这种类型的肿瘤都列于表I中。通过免疫组织化学分析发现在大多数尿道移行细胞癌、60％的原发胰腺腺癌的细胞表面都有PSCA的过量表达。在许多专利文献(PCT/US98/04664、PCT/US/28883、PCT/US00/19967)和同行评议的文章(Saffran等，Proc Natl Acad SciUSA.2001-2-27；98(5)：2658-2663；Amara等，CancerRes.2001-6-15；61(12)：4660-65；Reiter等，ProcNatl Acad Sci USA.1998-2-17；95(4)：1735-40；Argani等，Cancer Res.2001-6-1；61(11)：4320-24)中都报道了有关PSCA表达的数据。
本发明研究了不同PSCA变体在正常组织和癌症患者标本内的特异性表达情况(图14和图15)。所设计的引物可以区分PSCA v.1/v.2/v.4、PSCA v.3和PSCA v.5之间的区别，PSCA v.1/v.2/v.4的PCR产物长度为425bp，PSCA v.3的PCR产物长度为300bp，而PSCA v.5的PCR产物长度为910bp(图14A)。
从正常胆囊、脑、心脏、肾、肝脏、肺、***、脾、骨骼肌、睾丸、胰腺、结肠、胃组织以及一组***癌、胆囊癌、肾癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、转移癌和胰腺癌组织中制备cDNA第一条链(图14B)。用肌动蛋白的引物进行PCR扩增所得到的产物为对照。利用不同变体特异性的引物进行半定量PCR，扩增进行30个循环。
结果显示PSCA v.5主要表达于乳腺癌、转移癌和胰腺癌内，在结肠癌和肺癌内也有低水平表达。在***癌、胆囊癌、肾癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、转移癌和胰腺癌内检测到了PSCA v.1/v.2/v.4的PCR产物。在正常组织内，只在***、胃组织内检测到了PSCA v.1/v.2/v.4的PCR产物，在肾和肺组织内也检测到了低水平表达的PSCA v.1/v.2/v.4，而在所有正常组织内都没有检测到PSCA v.5。在所检测的所有样品内都没有检测到PSCA v.3的PCR产物。
设计出可以区分PSCA v.4和PSCA v.5的引物(图15A)。PSCA v.4的PCR产物长度为460bp，而PSCA v.5的PCR产物长度为945bp。
从正常胆囊、脑、心脏、肾、肝脏、肺、***、脾、骨骼肌、睾丸、胰腺、结肠、胃组织和一组***癌、胆囊癌以及多种异种移植物混合物(***癌、肾癌和胆囊癌异种移植物)组织内制备cDNA第一条链(图15B)。用肌动蛋白的引物进行PCR扩增所得到的产物为对照。利用不同变体特异性的引物进行半定量PCR，扩增进行30个循环。
结果显示在***癌、胆囊癌、多种异种移植物混合物、正常肾和***组织内有PSCA v.4的表达。只在正常***组织和胆囊癌组织内检测到了PSCA v.5的表达。
PSCA变体在正常组织内的表达是受限的，而在癌症患者的标本内可以检测到PSCA变体的表达，这说明PSCA变体可以作为人类肿瘤的治疗性、预后性、实验性、预防性和诊断靶位。
实施例5：PSCA的转录物变体
本文所用的术语“变体”包括转录物变体和单核苷酸多态性(SNP)。转录物变体是同一基因的成熟mRNA的变体，是由于选择性转录或选择性剪接而形成的。选择性转录物是指来自同一个基因但是转录起始位点不同的转录物。剪接变体是指同一个转录物经过不同剪接而形成的mRNA变体。在真核生物中，当多外显子基因从基因组DNA中转录出来后，所产生的RNA前体需要经过剪接才能形成功能性的mRNA，这种mRNA只有一个外显子，用于翻译成氨基酸序列。相应的，一个给定的基因可能有0到多个不同的选择性转录物，每个转录物都可能有0到多个剪接变体。每个转录物变体都由其独特的外显子组成，包含转录物前体来源的不同编码和/或非编码(5’或3’末端)部分。转录物变体可以编码相同的、相似的或不同的蛋白质，这种蛋白质可以有相同的或相似的功能，也可以有不同的功能。突变蛋白质可能在相同的时间、相同的组织内表达，也可能在相同的时间、不同的组织内表达，或者在不同的时间、相同的组织内表达，或者在不同的时间、不同的组织内表达。转录变体编码的蛋白质可能具有相似的或不同的亚细胞或细胞外定位(如分泌型和胞内型)。
本领域的许多方法都可用于鉴定转录物变体。例如，选择性转录物和剪接变体可通过全长克隆或使用全长转录物和EST序列来鉴定。首先将所有的人源EST分成不同的簇，这些簇彼此之间具有直接的或间接的相同性。第二，将同一簇内的EST分成不同的亚簇，组合成一个共有序列。基因的原始序列与共有序列或其他的全长序列比较。每个共有序列都是该基因的一个潜在剪接变体。有几个确证方法是本领域所熟知的，如通过RNA印迹、全长克隆或使用探针文库等来鉴定变体。即使所鉴定出的变体不是全长克隆，这个变体片段也可用作研究工具，例如通过本领域熟知的技术用于抗原制备，或者用于进一步克隆全长剪接变体。
另外，本领域现有一些计算机程序，这些程序可根据基因组序列来鉴定转录物变体。基于基因组序列的转录物变体鉴定程序包括FgenesH(A.Salamov和V.Solovyev，″Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA，″Genome Research.2000-4；10(4):516-22)；Grail(URL compbio.oml.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm)和GenScan(URLgenes.mit.edu/GENSCAN.html)。有关剪接变体鉴定工具的讨论见Southan，C.，Agenomic perspective on human proteases，FEBS Lett.2001-6-8；498(2-3)：214-8；deSouza，S.J.等，Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORFexpressed sequence tags，Proc.Natl Acad SciUSA.2000-11-7；97(23)：12690-3。
本领域现有多种技术可用于进一步确定转录物变体的参数，如全长克隆、蛋白质组验证、以PCR为基础的验证和5’RACE验证等(见蛋白质组验证：Brennan，S.O.等，Albumin banks peninsula：a new termination variant characterized by electrospraymass spectrometry，Biochem Biophys Acta.1999-8-17；1433(1-2):321-6；Ferranti P等，Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of maturecaprine alpha(s1)-casein，Eur J Biochem.1997-10-1；249(1)：1-7。以PCR为基础的验证：Wellmann S等，Specific reverse transcription-PCR quantification of vascularendothelial growth factor(VEGF)splice variants by LightCycler technology，Clin Chem.2001-4；47(4)：654-60；Jia，H.P.等，Discovery of new human beta-defensins using agenomics-based approach，Gene.2001-1-24；263(1-2)：211-8。以PCR为基础的验证和5’RACE验证：Brigle，K.E.等，Organization of the murine reduced folate carrier gene andidentification ofvariant splice forms，Biochem Biophys Acta.1997-8-7；1353(2)：191-8)。
正如本领域所熟知的，肿瘤的基因组区是有变化的。当一个特定肿瘤的基因组区的基因绘图发生变化时，该基因的选择性转录物或剪接变体也会发生相应的变化。本文所描述的就是与肿瘤相关的PSCA的一个特殊表达模式(见表1)。肿瘤内也包含PSCA的选择性转录物和剪接变体，如这些组织中的一种或多种组织以及某些其他组织来源的肿瘤。因此这些变体也可以被看成是肿瘤相关标记/抗原。
利用全长PSCA基因和EST序列鉴定出了另外的四个转录物变体，分别被命名为PSCA v.2、v.3、v.4和v.5。原始转录物PSCA v.1的外显子边界显示在表LI内。转录物变体核酸序列的结构用图10表示。在图10中，具有相同图形模式的柱描述的是相邻遗传物质的延伸，例如黑色柱代表变体1的基因组序列。
表LII(a)-(d)到LV(a)-(d)基于变体-变体。LII(a)-(d)描述的是转录物变体的核苷酸序列。表LIII(a)-(d)描述的是具有PSCA v.1(只对v.2)或PSCA v.2(对其他所有变体)转录物变体的核苷酸序列的排列。表LIV(a)-(d)描述的是转录物变体在特定阅读框架方向上的氨基酸序列。表LV(a)-(d)描述的是PSCA v.1的剪接变体编码的氨基酸序列的排列。
实施例6：PSCA的单核苷酸多态性
单核苷酸多态性(SNP)是指核苷酸序列在特定位点上的单个碱基对的变化。在基因组的任意给定位点上都存在四个可能的核苷酸碱基对：A/T、C/G、G/C和T/A。如本文所描述，等位基因是指一个给定基因的一系列不同形式中的一个，不同等位基因之间的差异在于其DNA序列，并且可影响其产物(RNA和/或蛋白质)。
cDNA上发生的SNP被称为cSNP。这种cSNP可导致基因编码的蛋白质发生氨基酸序列的变化，因而蛋白质的功能也可能发生变化。某些SNP可导致遗传性疾病；另外的一些SNP与表型量变及不同人对环境因素如食物和药物的反应的量变有关。因此，SNP和/或等位基因组合(被称为单元型)的存在有许多用途，如遗传性疾病的诊断、药物反应和剂量的确定、疾病相关基因的鉴定以及个体之间遗传相关性的分析(P.Nowotny，J.M.Kwon和A.M.Goate，“SNP analysis to dissect human traits，”Curr.Opin.Neurobiol.2001-10；11(5)：637-641；M.Pirmohamed和B.K.Park，“Geneticsusceptibility to adverse drug reactions，”Trends Pharmacol.Sci.2001-6；22(6)：298-305；J.H.Riley，C.J.Allan，E.Lai和A.Roses，“The use of single nucleotidepolymorphisms in the isolation of common disease genes”，Pharmacogenomics.2000-2；1(1)：39-47；R.Judson，J.C.Stephens和A.Windemuth，“The predictive power ofhaplotypes inclinical response，”Pharmacogenomics.2000-2；1(1)：15-26)。
SNP可用本领域已有的多种方法加以鉴定(P.Bean，“The promising voyage ofSNP target discovery，”Am.Clin.Lab.2001年10-11月；20(9)：18-20；K.M.Weiss，“Insearch ofhuman variation，”Genome Res.1998-7；8(7)：691-697；M.M.She，“Enablinglarge-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection andgenotyping technologies，”Clin.Chem.2001-2；47(2)：164-172)。例如，经过凝胶方法如限制性片段长度多态性(RFLP)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测发现具有多态性的DNA片段可通过测序来鉴定其SNP。另外也可以通过直接测定不同个体的DNA样品的序列或通过比较不同DNA样品的序列来揭示SNP。利用公共数据库和私人数据库中快速积累起来的序列数据，人们也可以利用计算机程序通过序列比较来发现SNP(Z.Gu，L.Hillier和P.Y.Kwok，“Single nucleotide polymorphism hunting incyberspace，”Hum.Mutat.1998；12(4)：221-225)。许多方法都可用于验证SNP，确定不同个体的基因型和单元型，其中包括直接测序和高通量芯片方法(P.Y.Kwok，“Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms，”Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2001；2：235-258；M.Kokoris，K.Dix，K.Moynihan，J.Mathis，B.Erwin，P.Grass，B.Hines和A.Duesterhoeft，“High-throughput SNP genotyping withthe Masscode system，”Mol.Diagn.2000-12；5(4)：329-340)。
利用上面所描述的方法找出了PSCA v.2转录物的13个SNP。我们使用了变体2而不是变体1，这是因为变体2的不明确碱基少于变体1。相应的，PSCA v.2的SNP被确定位于位点57(t/c)、367(c/t)、424(a/c)、495(c/g)、499(c/t)、563(c/t)、567(g/a)、627(g/a)、634(t/g)、835(g/a)、847(g/a)、878(g/a)和978(c/g)上。选择性等位基因的转录物或蛋白质被命名为变体PSCAv.6到v.18，如表LVI和图12a所示。
v.6上的核苷酸变化改变了v.1的起始密码子，因此其翻译直到遇到下一个ATG(mRNA上为AUG)才开始，产生的蛋白质比v.1蛋白少9个氨基酸(图11a)。v.7和v.8上的核苷酸改变反映在蛋白质水平上是静默的。
这13个SNP中的12个也存在于变体4上，如图12b和表LVI所示。PSCA v.4相关的12个SNP分别被命名为PSCA v.19到v.30。变体19到27编码不同的氨基酸(图11b和表LVI)。
表LVI还描述了蛋白质序列的氨基酸改变。虽然这些SNP在本文中是单独描述的，但是它们可以不同的组合方式存在，可以存在于任何一个含SNP位点的转录物变体上。
实施例7：在原核***中制备重组PSCA
为了在原核细胞内表达重组的PSCA和PSCA变体，将全长PSCA和PSCA变体cDNA序列或其片段克隆到本领域熟知的任何一种表达载体内。表达PSCA变体的下列一个或多个片段：图2和图3所示的全长序列，或者含有PSCA、PSCA变体或其类似物的任意8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个连续氨基酸的片段。
A.体外转录和翻译构建物：
pCRII：为了制备用于RNA原位检测的PSCA正义和反义RNA探针，制备编码全长PSCA cDNA或其片段的pCRII构建物(Invitrogen，Carlsbad CA)。在pCRII载体内含有Sp6和T7启动子，分别位于***片段的两侧，这两个启动子驱动PSCA RNA的转录，转录出的RNA可作为探针用于RNA原位杂交试验中。这些探针可用于在RNA水平上分析PSCA在细胞和组织内的表达。代表PSCA基因cDNA氨基酸编码区的PSCA RNA转录物可用于体外翻译***如TnTTMCoupled Reticulolysate System(Promega，Corp.，Madison，WI)中来合成PSCA蛋白。
B.细菌构建物：
pGEX构建物：为了在细菌中制备融合有谷胱甘肽S转移酶(GST)蛋白的重组PSCA蛋白，将全长或部分PSCA cDNA蛋白编码序列克隆到GST融合载体的pGEX质粒家族(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)中。这些构建物能够可控地表达氨基端融合GST、羧基端为6×组氨酸表位(6×His)的重组PSCA蛋白。GST和6×His标记的存在主要是为了用适当的亲和基质从诱导的细菌中纯化重组融合蛋白，抗GST抗体和抗His抗体可识别这种融合蛋白。通过在开放阅读框架(ORF)的3’端克隆引物上加上6个组氨酸密码子就可以使蛋白添加上6×His标记。通过引入蛋白酶裂解位点，如在pGEX-6P-1上引入PreScissionTM识别位点，可将GST标记从PSCA相关蛋白上裂解下来。氨苄青霉素耐药基因和pBR322复制起点用于pGEX质粒在大肠杆菌内的筛选和复制。
pMAL构建物：为了在细菌内制备融合有甘露聚糖结合蛋白(MBP)的重组PSCA蛋白，将全长或部分PSCA cDNA蛋白编码序列克隆到pMAL-c2X和pMAL-p2X载体(New England Biolabs，Beverly，MA)内使之与MBP基因融合。这些构建物能够可控地表达氨基端融合MBP、羧基端为6×组氨酸表位标记的重组PSCA蛋白。MBP和6×His标记的存在主要是为了用适当的亲和基质从诱导的细菌中纯化重组融合蛋白，抗MBP抗体和抗His抗体可识别这种融合蛋白。通过在3’端克隆引物上加上6个组氨酸密码子就可以使蛋白添加上6×His标记。添加因子Xa识别位点是为了将pMAL标记从PSCA上裂解下来。pMAL-c2X和pMAL-p2X载体分别用于重组蛋白的胞质和周质表达。周质表达有利于蛋白利用二硫键进行折叠。
pET构建物：为了在细菌细胞内表达PSCA，将全长或部分PSCA cDNA蛋白编码序列克隆到pET家族的载体(Novagen，Madison，WI)内。这些载体能够在细菌内可控地表达融合有增加可溶性的蛋白质和表位标记或不含融合蛋白的重组PSCA蛋白，增加可溶性的蛋白质包括NusA和硫氧还原蛋白(Trx)，表位标记包括6×His和S-TagTM，这些标记可用于重组蛋白的纯化和检测。例如，利用pET NusA融合***43.1构建表达载体可使表达出的PSCA蛋白在氨基端融合上NusA。
C.酵母构建物：
pESC构建物：为了在酿酒酵母内表达PSCA以制备重组蛋白并进行功能性研究，将全长或部分PSCA cDNA蛋白编码序列克隆到pESC家族的载体内，这些载体分别含有以下四种筛选标记中的一种：HIS3、TRP1、LEU2和URA3(Stratagene，LaJolla，CA)。这些载体使我们能够在同一种酵母细胞内从2个不同基因或克隆序列的同一个质粒中可控地表达不同的蛋白，这两个基因或克隆序列分别含有FlagTM和Myc表位标记。这个***可用于确定PSCA的蛋白-蛋白相互作用。另外，在酵母内表达可产生与真核细胞表达相似的翻译后修饰，如糖基化和磷酸化。
pESP构建物：为了在粟酒酵母(Saccharomyces pombe)内表达PSCA，将全长或部分PSCA cDNA蛋白编码序列克隆到pESP家族的载体内。这些载体能够可控地高水平表达在氨基端或羧基端融合有GST的PSCA蛋白序列，GST有助于重组蛋白的纯化。FlagTM表位的存在使我们能够用抗FlagTM抗体来检测重组蛋白。
实施例8：在高等真核***内表达重组PSCA
故意省略
实施例9；抗原性图谱和二级结构
图5A-C、图6A-C、图7A-C、图8A-C和图9A-C分别用图形描述了PSCA变体1、3、4的5个氨基酸图谱，通过访问ExPasy分子生物学服务器上的ProtScale站点(URL www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)可以找到对每种图谱的评价。
这些图谱：图5，亲水性(Hopp T.P.，Woods K.R.，1981.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828)；图6，亲水性(Kyte J.，Doolittle R.F.，1982.J.Mol.Biol.157：105-132)；图7，可接触残基百分比(Janin J.，1979Nature277：491-492：图8，平均屈曲性(Bhaskaran R.和Ponnuswamy P.K.，1988.Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255)；图9，β-转角(Deleage，G.，Roux B.1987Protein Engineering1：289-294)；以及本领域熟知的其他图谱，如ProtScale站点上所列的，都可用于鉴定每个PSCA变体蛋白上的抗原区。PSCA变体的上述氨基酸特性都可用下面的ProtScale参数来描述：1)窗口大小为9；2)窗口边缘占窗口中心的百分权重；以及3)氨基酸图谱值经标准化后位于0到1之间。
亲水性(图5)、亲水性(图6)和可接触残基百分比(图7)用于确定亲水性氨基酸(即亲水性和可接触氨基酸百分比大于0.5、亲水性小于0.5的氨基酸)的分布区域。这种区域可能会暴露于水性环境中，位于蛋白质的表面，因此可作为免疫识别位点，如抗体的识别位点。
平均屈曲性(图8)和β转角(图9)决定了二级结构如β折叠和α螺旋中不包含的氨基酸(即β转角和平均屈曲性大于0.5的氨基酸)的分布区域。这种区域也可能暴露于蛋白表面，因此也可用于免疫识别，如抗体的识别。
图5A-C、图6A-C、图7A-C、图8A-C和/或图9A-C所示的图谱展示了PSCA变体蛋白的抗原序列，这些序列可用于制备免疫原，如以肽或其编码核酸的形式，利用这些免疫原可制备出治疗性和诊断性的抗PSCA抗体。免疫原可以包含图2和图3所列的PSCA变体蛋白的任意5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个连续氨基酸，或编码这些氨基酸的相应核酸，这些序列的氨基酸图谱显示在图9中，也可以推算出其氨基酸图谱，因为变体所含有的序列与图9所示的变体是一样的。特别需要指出的是，本发明的肽免疫原可以包含至少含有图2和图3的5个氨基酸的肽区域，其中所含的氨基酸数目可以任意整数递增，其中所包含的氨基酸位置在图5的亲水性图谱中值大于0.5；至少含有图2和图3的5个氨基酸的肽区域，其中所含的氨基酸数目可以任意整数递增，其中所包含的氨基酸位置在图6的亲水性图谱中的值小于0.5；至少含有图2和图3的5个氨基酸的肽区域，其中所含的氨基酸数目可以任意整数递增，其中所包含的氨基酸位置在图7的可接触残基百分比图谱中的值大于0.5；至少含有图2和图3的5个氨基酸的肽区域，其中所含的氨基酸数目可以任意整数递增，其中所包含的氨基酸位置具有图8的屈曲性图谱中的值大于0.5；以及至少含有图2和图3的5个氨基酸的肽区域，其中所含的氨基酸数目可以任意整数递增，其中所包含的氨基酸位置在图9的β转角图谱中的值大于0.5。本发明的肽免疫原还包含编码上述肽段的核酸。
本发明的所有免疫原，不论肽或是核酸，都可以人用单位剂量的形式体现，或者包含在组合物内，这种组合物包含与人体生理环境相容的药用赋形剂。
PSCA变体蛋白1、3、4和6的二级结构，即预测α螺旋、延伸链和不规则螺旋是否存在及存在的位置，可利用HNN—Hierarchical Neural Network方法根据蛋白质的一级氨基酸序列来推测(NPS@：Network Protein Sequence Analysis TIBS2000年3月，第25卷，No3[291]：147-150；Combet C.，Blanchet C.，Geourjon C.和DeléageG.，http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_nn.html)，该方法通过访问ExPasy分子生物学服务器可以找到(http://www.expasy.ch/tools/)。通过分析发现PSCA变体1由30.89％的α螺旋、21.95％的延伸链和47.15％的不规则螺旋组成(图13A)。PSCA变体3由14.89％的α螺旋、28.51％的延伸链和76.60％的不规则螺旋组成(图13B)。PSCA变体4由9.52％的α螺旋、8.99％的延伸链和81.48％的不规则螺旋组成(图13C)。PSCA变体6由24.56％的α螺旋、21.93％的延伸链和53.51％的不规则螺旋组成(图13D)。
PSCA变体蛋白上是否存在跨膜区可用ExPasy分子生物学服务器上的各种跨膜预测算法进行分析(http://www.expasy.ch/tools/)。图13E、G、I和K显示的是利用Tmpred程序计算出的变体1、3、4、6的分析结果。PSCA变体1和6可能编码GPI样蛋白。变体3和4可能编码可溶性蛋白，因为他们不含明显的跨膜区。结构分析程序的计算结果显示在表VI中。
实施例10：PSCA多克隆抗体的制备
多克隆抗体可通过给哺乳动物注射一次或多次免疫制剂来制备，如果需要，制剂内可加入佐剂。一般来说，免疫制剂和/或佐剂通过多位点的皮下注射或腹膜内注射来免疫哺乳动物。除了用全长的PSCA蛋白变体来免疫以外，还可以用计算机程序来设计免疫原，例如根据氨基酸序列分析结果找到抗原性的序列以及可被免疫宿主的免疫***识别的序列(见实施例“抗原性特征和二级结构”)。经预测可知这种片段具有亲水性、屈曲性、β转角构型，位于蛋白质的表面(见图5A-C、图6A-C、图7A-C、图8A-C或图9A-C所示的氨基酸图谱，描述了PSCA蛋白变体1上的这类区域)。
例如，含有PSCA蛋白变体的亲水性、屈曲性、β转角区域的重组细菌融合蛋白或多肽可作为抗原用于在新西兰白兔体内制备多克隆抗体或实施例11所描述的单克隆抗体。例如，在PSCA变体1中，这类区域包括而不限于氨基酸28-56和氨基酸66-94。在变体3中，这类区域包括而不限于氨基酸6-18、氨基酸27-39、氨基酸103-133和氨基酸177-189。在变体6中，这类区域包括而不限于氨基酸19-35和氨基酸57-85。在免疫因子上连接一个已知在被免疫的哺乳动物体内具有免疫原性的蛋白质是有益的。这类免疫原性蛋白包括而不限于匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制因子。在一个实施方式中，编码PSCA变体4的氨基酸103-133的肽连接上一个KLH用于免疫家兔。另外，免疫制剂还可以包含PSCA变体蛋白的全长或部分序列、其模拟物或融合蛋白。例如，可以利用重组DNA技术将PSCA变体的氨基酸序列与本领域熟知的任意一种融合蛋白伴侣相融合，如含谷胱甘肽S转移酶(GST)和HIS标记的融合蛋白。在一个实施方式中，利用重组技术将PSCA变体1的氨基酸18-98与GST融合，在pGEX表达载体内表达，纯化后用于免疫家兔和小鼠，可以分别制备出多克隆抗体和单克隆抗体。这种融合蛋白可用适当的亲和基质从被诱导的细菌内纯化出来。
可用于本发明的其他重组细菌融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白、LacZ、硫氧还原蛋白、NusA或免疫球蛋白的恒定区(见“在原核***中制备PSCA”部分和Frederick M.Ausubu等编的《分子生物学最新方法》第2卷第16单元，1995；Linsley，P.S.，Brady，W.，Urnes，M.，Grosmaire，L，Damle，N.和Ledbetter，L(1991)J.Exp.Med.174，561-566)。
除了细菌来源的融合蛋白以外，也可以使用哺乳动物表达的蛋白抗原。这些抗原可用哺乳动物表达载体如Tag5和Fc-融合载体进行表达(见“在真核***中制备重组PSCA”部分)，利用这种载体进行表达可保留翻译后修饰过程，如天然蛋白的糖基化。在一个实施方式中，PSCA变体1的cDNA、N端先导肽和C端GPI锚定蛋白被克隆到Tag5哺乳动物分泌型载体内，并在293T细胞内表达。利用金属鳌合层析技术从稳定表达重组载体的293T细胞组织培养上清中纯化重组蛋白。纯化出的Tag5PSCA蛋白就可以用作免疫原。
在免疫过程中，用佐剂混合或乳化抗原以增强宿主动物的免疫反应是有益的。佐剂的例子包括而不限于完全弗氏佐剂(CFA)和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，一种合成的海藻糖二白喉菌酸盐(trehalose dicorynomycolate)。
在一个典型的免疫方法中，家兔先通过皮下注射多达200μg，一般为100-200μg的融合蛋白或肽进行免疫，融合蛋白连接有KLH，用完全弗氏佐剂(CFA)混合。然后每两周一次皮下注射200μg，一般为100-200μg用不完全弗氏佐剂(IFA)混合的免疫原。每次免疫后7-10天采集血样进行检测，通过ELISA测定抗血清的滴度。
为了测定免疫血清的反应性和特异性，如用PSCA变体3或4蛋白的GST融合蛋白免疫的家兔血清，将各自的全长PSCA变体cDNA克隆到pCDNA3.1myc-his表达载体(Invitrogen，见实施例“在真核***中制备重组PSCA”)内。将构建物转染到293T细胞内以后，通过蛋白印迹技术用抗变体血清和抗His抗体(Santa CruzBiotechnologies，Santa Cruz，CA)与细胞裂解物杂交以确定与变性的突变蛋白的特异反应性。另外，利用荧光显微镜、流式细胞术以及抗293T和其他重组PSCA变体表达细胞的免疫沉淀方法来分析免疫血清以确定天然蛋白的特异性识别活性。也可以利用内源性表达PSCA的细胞进行蛋白印迹、免疫沉淀、荧光显微镜和流式细胞术分析来测定蛋白的反应性和特异性。
纯化PSCA变体融合蛋白如GST和MBP融合蛋白免疫的家兔抗血清以去除能与融合伴侣序列反应的抗体，利用只含融合伴侣或除融合伴侣外还含不相关融合蛋白的亲和层析柱可以纯化抗血清。例如，GST-PSCA变体1融合蛋白来源的抗血清首先通过含GST蛋白共价结合的AffiGel基质(BioRad，Hercules，Calif.)的层析柱来纯化。然后通过含MBP-PSCA融合蛋白共价结合的Affigel基质的层析柱来纯化。再通过G蛋白亲和层析柱来纯化抗血清以分离其中的IgG组分。其他His-标记抗原和肽免疫家兔来源的血清以及去除融合伴侣的血清通过含原始蛋白免疫原或游离肽的层析柱进行亲和纯化。
实施例11：PSCA单克隆抗体(mAb)的制备
在一个实施方式中，PSCA变体的治疗性mAb包括能与每个变体蛋白特异性的表位或变体共有序列特异性的表位发生反应的那些抗体，其中的共有序列可以去除或改变PSCA变体的生物学功能，例如那些可去除与配基和结合伴侣相互作用的序列。用于制备这种mAb的免疫原包括那些编码或包含完整PSCA蛋白变体序列的免疫原，或者包含经氨基酸序列的计算机分析预测具有抗原性的PSCA蛋白变体的某个区域的免疫原(见图5A-C、图6A-C、图7A-C、图8A-C或图9A-C，以及实施例“抗原性图谱”)。免疫原包括肽、重组细菌蛋白、哺乳动物细胞表达的Tag5蛋白以及人和鼠的IgG FC融合蛋白。另外，经基因工程改造后可高水平表达各种PSCA变体的细胞如293T-PSCA变体4或300.19-PSCA变体4鼠Pre-B细胞都可用于免疫小鼠。
为了制备PSCA变体的mAb，小鼠首先通过腹膜内注射(IP)用完全弗氏佐剂混合的10-50μg蛋白免疫原或107PSCA表达细胞进行免疫。然后每2到4周腹膜内注射用不完全弗氏佐剂混合的10-50μg蛋白免疫原或107PSCA表达细胞进行加强免疫。另外，MPL-TDM佐剂也可用于免疫小鼠。除了上述蛋白和细胞免疫策略以外，也可利用DNA免疫方法免疫小鼠，即通过直接注射质粒DNA用编码PSCA变体序列的哺乳动物表达载体来免疫小鼠。例如，将PSCA变体4的全长cDNA克隆到Tag5哺乳动物分泌型载体内，以这种重组载体作为免疫原免疫小鼠。在另一个实施例中，将相同的氨基酸克隆到Fc融合分泌型载体内，其中的PSCA变体4序列被融合到IgK先导序列的氨基端和人或鼠IgG Fc区编码序列的羧基端。这种重组载体可作为免疫原来免疫小鼠。质粒免疫策略可与相同载体表达的纯化蛋白以及表达各种PSCA变体的细胞联合使用。
在免疫过程中，注射后的7到10天采集血样以监测免疫反应的滴度和特异性。通过ELISA、蛋白印迹、免疫沉淀、荧光显微镜和流式细胞术检测一旦发现得到了足够的反应性和特异性，就可以用本领域熟知的方法进行细胞融合及杂交瘤制备(见Harlow和Lane，1988)。
在一个制备PSCA单克隆抗体的实施方式中，表达编码变体4抗原的氨基酸1-189的GST融合蛋白，然后从稳定转染的293T细胞内纯化该蛋白。Balb C小鼠首先通过腹膜内注射用完全弗氏佐剂混合的25μg GST-PSCA变体4蛋白进行免疫。然后每2周腹膜内注射用不完全弗氏佐剂混合的25μg抗原进行加强免疫，共进行三次。利用GST融合抗原和GST部分被去除的裂解产物进行ELISA分析以确定免疫小鼠血清的抗体滴度。利用编码PSCA变体1cDNA的表达载体转染的293T细胞通过蛋白印迹、免疫沉淀和流式细胞术监测血清对全长PSCA变体4蛋白的反应性和特异性(见实施例“在真核***中制备重组PSCA”)。其他表达重组PSCA变体4的细胞或内源性地表达PSCA变体4的细胞也可以使用。挑出发生最强反应的小鼠，最后注射一次PBS混合的Tag5抗原，4天后处死小鼠。取出小鼠的脾，利用标准方法与SPO/2骨髓瘤细胞融合(Harlow和Lane，1988)。利用ELISA、蛋白印迹、免疫沉淀、荧光显微镜和流式细胞术检测HAT筛选生长孔的上清液，找出产生PSCA特异性抗体的克隆。
为了制备PSCA变体4蛋白特异性的单克隆抗体，所设计的免疫原要编码该变体的特异性序列。例如，合成编码PSCA变体4的氨基酸6-18的肽，连接上KLH作为免疫原。用肽抗原筛选杂交瘤上清液，再用表达PSCA变体4蛋白的细胞筛选上清，然后用表达其他PSCA变体的细胞进一步筛选上清，就可以得到变体4特异性的单克隆抗体。
利用标准方法测定PSCA变体单克隆抗体的结合亲和性。亲和性测定方法可定量检测抗体与表位结合的强度，可用于帮助确定哪种PSCA变体单克隆抗体是优选的用于诊断或治疗目的的抗体，这都是本领域技术人员所熟知的。BIAcore***(Uppsala，Sweden)是一种优选的结合亲和性测定方法。BIAcore***利用表面胞质团共振(SPR，Welford K.1991，Opt.Quant.Elect.23：1；Morton和Myszka，1998，Methodsin Enzymology295：268)实时监测生物分子的相互作用。BIAcore分析方法可以很容易地测定出结合速率常数、解离速率常数和亲和常数。
实施例12：HLAI类分子和II类分子的结合实验
HLA I类分子和II类分子的结合实验利用纯化的HLA分子进行，所用的方法是文献公开报道的(见PCT专利申请WO 94/20127和WO 94/03205；Sidney等，CurrentProtocols in Immunology18.3.1(1998)；Sidney等，J.Immunol.154：247(1995)；Sette等，Mol.Immunol.31：813(1994))。简言之，纯化的MHC分子(5-500nM)与各种未标记的肽抑制因子和1-10nM125I标记的肽探针结合，共孵育后通过凝胶过滤将MHC-肽复合物与游离肽分离，测定肽结合的部分。一般来说，在预试验中，需要在固定量的放射性标记肽存在的情况下测定每种MHC制备物的滴度以确定结合10-20％的总放射性所需要的HLA分子的浓度。随后的抑制和直接结合试验就用这些浓度的HLA进行。
由于在这些条件下标记物的浓度小于HLA的浓度，IC50大于等于HLA的浓度，因此所测得的IC50值应当近似等于真实的KD值。肽抑制因子的浓度一般在120μg/ml到1.2ng/ml之间，应当进行2到4次完全独立的试验。为了比较不同试验所得到的数据，需要计算每种肽的相对结合指数，计算方法为阳性对照的IC50除以每个检测肽的IC50(一般是放射性标记探针肽的未标记版本)。为了构建数据库和进行试验内的比较，需要编纂相对结合值。这些值可以再转换成IC50nM值，转换方法为阳性对照的IC50nM值除以目的肽的相对结合值。这种数据编纂方法用于比较在不同时间检测肽所得到的数据或用不同批次的纯化MHC进行试验所得到的数据时是准确而稳定的。
上述的结合分析试验也可用于分析含HLA超基序和/或基序的肽(见表IV)。
实施例13：含有HLA超基序的CTL候选表位和
HLA基序的CTL候选表位的鉴定
本发明的HLA疫苗组合物可包含多个表位。这些表位包括多个HLA超基序或基序以达到扩大群体覆盖范围的目的。本实施例描述的是这种疫苗组合物所包含的含超基序和基序的表位的鉴定和确认。群体覆盖范围的计算是用下文所描述的方法进行的。
鉴定含超基序和/或基序的表位的计算机检索方法和算法
利用图2和图3所列的PSCA基因产物的蛋白序列数据进行检索以鉴定实施例“抗原性图谱”和表VIII-XXI及XXII-XLIX中的含基序肽序列，用于制备该表的特异性检索肽列于表VII中。
利用计算机程序检索含HLA I类分子或II类分子超基序或基序的表位按照如下过程进行。利用文本字符串检索软件程序分析所有翻译的PSCA蛋白序列以确定含有适宜HLA结合基序的潜在肽序列；利用本领域的信息并参考已知的基序/超基序可以很容易地编写这种程序。另外，也可以人工进行这种计算。
利用多项式算法计算鉴定出的A2-、A3-和DR-超基序序列的得分以预测其结合特异性HLAI类分子或II类分子的能力。这些多项式算法考虑了不同位置上的不同氨基酸的影响，其基本依据是假设肽-HLA分子相互作用的总亲和性(或ΔG)约等于下述公式的线性多项式：
“ΔG”＝a1ixa2ixa3i......xani
其中aji是一个系数，代表一个给定氨基酸(j)在含n个氨基酸的肽序列上处于给定位置(i)时产生的影响。这种方法的一个重要假设是每个位置上的影响都是彼此独立的(即各个侧链独立结合)。当残基j处于肽的位置i时，假设其对肽结合的自由能的贡献为常数ji，不考虑肽的其余序列。
特异性算法系数的其他衍生方法见于下列文献的描述：Gulukota等，J.Mol.Biol.267：1258-126，1997；(也可参见Sidney等，Human Immunol.45：79-93，1996和Southwood等，J.Immunol.160：3363-3373，1998)。简言之，对于所有的位置i来说，锚定子和非锚定子一样，计算所有携带j的肽相对于其余基团的平均相对结合(ARB)的几何均数，作为ji测定值。对于II类肽来说，如果可进行多种排列，那么只利用得分值最高的排列，随后反复进行。为了计算一个试验组内的一个给定肽的算法得分，将肽序列相应的ABR值相乘。如果得数超过了一个预先设定的阈值，则这个肽据预测是可以结合的。合适的阈值是代表预测严格程度的指标。
HLA-A2超型交叉反应肽的筛选
利用基序鉴定软件扫描PSCA的蛋白序列，寻找具有HLA-A2超基序主要锚定子特异性的8-、9-、10-和11-聚体序列。这些序列通常再用上述方法处理以计算其得分，然后合成得分值为正值的序列相应的肽，在体外测定其与纯化的HLA-A*0201分子的结合能力(HLA-A*0201被认为是典型的A2超型分子)。
然后检测这些肽与其他A2超型分子(A*0202、A*0203、A*0206和A*6802)的结合能力。能与5个A2超型等位基因中的至少3个结合的肽一般被认为可以作为A2超型交叉反应的结合肽。优选的肽能够以等于或低于500nM的亲和性与3个或更多个HLA-A2超型分子相结合。
含HLA-A3超基序的表位的筛选
进一步分析上面扫描出的PSCA蛋白，以确定其是否存在含HLA-A3超基序主要锚定子的肽。合成含HLA-A3超基序的序列相应的肽，检测其与HLA-A*0301和HLA-A*1101分子的结合能力，这两个分子是由两个最常见的A3超型等位基因编码的。能与两个等位基因中的至少一个以结合亲和性≤500nM，通常为≤200nM，结合的肽做进一步检测，测定其与其他常见的A3超型等位基因(如A*3101、A*3301和A*6801)的交叉反应性，找出那些能与5个HLA-A3超型分子中的至少3个结合的肽。
含HLA-B7超基序的表位的筛选
进一步分析上面扫描出的PSCA蛋白，以确定其是否存在含HLA-B7超基序的8-、9-、10-或11-聚体肽。合成相应的肽，测定其与HLA-B*0702结合的能力，这个分子是由最常见的B7超型等位基因编码的(即典型的B7超型等位基因)。利用标准方法找出能与B*0702以IC50≤500nM的亲和力结合的肽。然后测定这些肽与其他常见B7超型分子(如B*3501、B*5101、B*5301和B*5401)的结合能力。从而找出能与5个B7超型等位基因中的3个或更多个结合的肽。
含A1和A24基序的表位的筛选
为了进一步增加群体的覆盖范围，HLA-A1和HLA-A24表位也可以加入到疫苗组合物内。PSCA蛋白的分析方法也可用于鉴定含HLA-A1和HLIA-A24基序的序列。
利用类似的方法可以找出含有其他基序和/或超基序的高亲和力和/或交叉反应结合表位。
实施例14：免疫原性的确定
进一步筛选上述含CTL A2超基序的交叉反应性候选肽以确定其体外免疫原性。利用如下方法进行确认：
细胞筛选所用的靶细胞系：
.221A2.1细胞系是通过HLA-A2.1基因转化无HLA-A、-B、-C突变的人B淋巴母细胞瘤细胞系721.221而得到的，可以作为载肽靶细胞来测定HLA-A2.1限制性CTL的活性。这个细胞系用RPMI-1640培养基培养，其中添加了抗生素、丙酮酸钠、非必需氨基酸和10％(v/v)的人灭活FCS。表达目的抗原的细胞或包含目的抗原编码基因的转化子作为靶细胞来测定肽-特异性CTL识别内源性抗原的能力。
初级CTL诱导培养物：
树突状细胞(DC)的制备：PBMC用含30μg/ml DNA酶的RPMI融解，洗涤两次后用完全培养基(RPMI-1640加上5％AB人血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠、L谷氨酰胺和青霉素/链霉素)重悬。将PBMC加到6孔板内以纯化单个核细胞，每孔10×106PBMC。37℃孵育2小时后温和振荡培养板，吸去上清以去掉未黏附的细胞。培养板用3ml RPMI洗涤三次以去除大多数未黏附的和松散黏附的细胞。然后每个孔内加入3ml含50ng/ml GM-CSF和1,000U/ml IL-4的完全培养基。在第6天时将75ng/mlTNFα加入到DC内，第7天的细胞用作CTL的诱导培养物。
用DC和肽诱导CTL：用Dynal免疫磁珠(M-450)和试剂通过阳性筛选分离CD8+T细胞。一般来说，从约200-250×106PBMC中可以分离出24×106CD8+T细胞(足够48孔培养板培养)。简言之，PBMC用含30μg/ml DNA酶的RPMI融解，用含1％人AB血清的PBS洗涤一次，再用PBS/1％AB血清重悬，浓度为20×106/ml。磁珠用PBS/AB血清洗涤三次，加入到细胞内(140μl磁珠/20×106细胞)，在4℃孵育1小时，不断混合。用PBS/AB血清将磁珠和细胞洗涤4次以去除未黏附的细胞，用含100μl/ml试剂和30μg/ml DNA酶的PBS/AB血清重悬，浓度为100×106/ml(根据原始的细胞数计算)。混合物在室温下孵育1小时，不断混合。再用PBS/AB/DNA酶洗涤磁珠以收集CD8+T细胞。收集DC，1300rpm离心5-7分钟，用含1％BSA的PBS洗涤一次，计数，添加40μg/ml肽，细胞浓度为1-2×106/ml，加入3μg/mlβ2-微球蛋白，20℃孵育4小时。然后照射DC(4,200拉德)，用培养基洗涤一次，再次计数。
建立诱导培养物：在48孔培养板的每个孔中加入0.25ml细胞因子诱导的DC(1×105/ml)和0.25ml CD8+T细胞(2×106/ml)共培养，细胞培养基内含有10ng/ml的IL-7。第二天加入重组人IL-10，使其终浓度达到10ng/ml，48小时后加入10IU/ml的重组人IL-2。
用肽脉冲的黏附细胞重新刺激诱导培养物：初次诱导后的7和14天，细胞用肽脉冲的黏附细胞重新刺激。PBMC融解后用RPMI和DNA酶洗涤两次，重悬成5×106/ml的悬液，约4200拉德照射。将2×106PBMC接种到培养板内，每孔含0.5ml完全培养基，37℃孵育2小时。培养板用RPMI洗涤两次，轻扣培养板去掉未黏附的细胞，黏附的细胞用10μg/ml肽脉冲，每孔加入0.25ml RPMI/5％AB，其中含3μg/mlβ2微球蛋白，37℃孵育2小时。吸出每个孔中的肽溶液，用RPMI洗涤一次。吸去诱导培养物(CD8+细胞)的大部分培养基，再加入0.5ml新鲜培养基，然后将细胞转移到含肽脉冲黏附细胞的孔内。24小时后加入10ng/ml重组人IL-10，第二天加入重组人IL-2，2-3天后再加一次，浓度为50IU/ml(Tsai等，Critical Reviews in Immunology18(1-2)：65-75，1998)。7天后通过51Cr释放试验分析培养物的CTL活性。在某些试验中，还要在第二次刺激时通过原位IFNγELISA试验分析培养物的肽特异性识别活性，然后在7天后分析其内源性的识别活性。扩增以后用两种方法测定其活性并进行彼此比较。
通过 51 Cr释放试验测定CTL的细胞溶解活性
第二次重新刺激后7天，用标准的(5小时)51Cr释放试验测定每个孔的细胞毒活性，使用单一的效：靶比。通过使细胞与10μg/ml肽在37℃孵育过夜来制备肽脉冲靶细胞。
用胰蛋白酶-EDTA消化培养瓶，收获黏附的靶细胞。靶细胞用200μCi51Cr铬酸钠(Dupont，Wilmington，DE)标记，37℃孵育1小时。重悬标记的靶细胞，浓度为106/ml，用浓度为3.3x106/ml的K562细胞(一种NK敏感的红系骨髓瘤细胞系，用于降低非特异性溶解)稀释成1:10的混合物。靶细胞(100μl)和效应细胞(100μl)接种到96孔圆底培养板内，37℃孵育5小时。然后从每孔中收集100μl上清液，根据下面的公式计算溶解百分率：
[(检测样品的cpm—自发的51Cr释放样品的cpm)/(51Cr最高释放样品的cpm—自发的51Cr释放样品的cpm)]×100
标记靶细胞分别与1％Triton X-100和纯培养基共孵育以确定最大释放和自发释放。阳性培养物定义为分析扩增的培养物时每个孔的特异性溶解活性(样品—背景)都大于或等于10％，两个最高效:靶比的活性都大于或等于15％。
原位测定人IFNγ的产生作为肽特异性识别和内源性识别的指标
Immulon2培养板用鼠抗人IFNγ单克隆抗体(4μg/ml0.1M NaHCO3，pH8.2)包被，4℃孵育过夜。培养板用无Ca2+、Mg2+的PBS/0.05％Tween20洗涤，用PBS/10％FCS封闭2小时，然后将CTL(100μl/孔)和靶细胞(100μl/孔)加入到每个孔内，留下空白孔作为标准和空白(只加培养基)。无论肽脉冲的靶细胞还是内源性的靶细胞，使用浓度都为1×106/ml。培养板在37℃、5％CO2中孵育48小时。
重组人IFN-γ加到标准孔内，起始剂量为400pg或1200pg/100μl/孔，培养板在37℃孵育2小时。洗涤培养板，然后加入100μl生物素化的鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(2μl/ml，溶于PBS/3％FCS/0.05％Tween20中)，室温下孵育2小时。再次洗涤后加入100μl HRP-链亲和素(1:4000)，培养板在室温下孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤培养板6次，每孔加入100μl发育溶液(TMB1:1)，使培养板发育5-15分钟。然后每孔加入50μl1M H3PO4终止反应，测定OD450。如果每孔的IFN-γ至少超过背景50pg并且是背景表达水平的2倍，那么就认为这个培养物是阳性的。
CTL扩增
用抗CD3抗体扩增那些被证明对肽脉冲靶细胞和/或肿瘤靶细胞具有特异性溶解活性的培养物2周。简言之，5×104CD8+细胞加入到含下列物质的T25培养瓶内：1×106经照射(4,200拉德)的PBMC(自身的或同种异体的)/ml，2×105经照射(8,000拉德)的EBV转化细胞/ml，30ng/ml OKT3(抗CD3抗体)，RPMI-1640培养基，其中含有10％(v/v)人AB血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠、25μM2-巯基乙醇、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。24小时后加入200IU/ml的重组人IL-2，此后每2天更换一次新鲜培养基，其中IL-2的浓度为50IU/ml。如果细胞浓度超过1×106/ml则传代一次，在13到15天之间通过51Cr释放试验检测培养物，效:靶比分别为30:1、10:1、3:1和1:1，或者用与扩增前相同的靶细胞进行原位IFNγ分析，浓度为1×106/ml。
在没有抗CD3+抗体的情况下扩增培养物的过程如下。选择那些被证明对肽脉冲靶细胞和内源性靶细胞具有特异性溶解活性的培养物和5×104CD8+细胞，加入到含下列物质的T25培养瓶内：1×106/ml自身的PBMC，已用10μg/ml的肽在37℃脉冲2小时，并经过照射(4,200拉德)；2×105/ml经照射(8,000拉德)的EBV转化细胞，30ng/ml OKT3(抗CD3抗体)，RPMI-1640培养基，其中含有10％(v/v)人AB血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠、25mM2-ME、L-谷氨酰胺和庆大霉素。
含A2超基序的肽的免疫原性
通过细胞试验测定A2超基序交叉反应性结合肽在正常个体内诱导肽特异性CTL的能力。在这个试验中，如果一个肽至少能够在一个个体内诱导出肽特异性的CTL，那么这个肽就被认为是一个表位，最好是这个个体也能够识别内源性表达的肽。
从携带表达PSCA的肿瘤的患者体内分离PBMC，这种PBMC也可用来测定免疫原性。简言之，从患者体内分离出PBMC，用肽脉冲的单个核细胞重新刺激，分析其识别肽脉冲靶细胞和内源性表达抗原的转化细胞的能力。
测定A*03/A11的免疫原性
类似于测定HLA-A2超基序肽的免疫原性的方法也可用于评价含HLA-A3超基序的交叉反应性结合肽。
测定B7的免疫原性
本文所用的测定B7超型交叉反应性结合肽的免疫原性的方法与含A2-和A3-超基序的肽的免疫原性测定方法类似。
含有其他超基序/基序如HLA-A1、HLA-A24等的肽也可以用类似的方法分析。
实施例15：通过制备模拟肽来扩充超基序以改善天然表位的结合能力
如本文所描述，HLA基序和超基序(含有主要和/或次要残基)可用于鉴定和制备高交叉反应性的天然肽。另外，定义HLA基序和超基序也使我们能够通过确定天然肽序列内的残基来制备高交叉反应性的表位，这种模拟肽可赋予肽某些特征，如在含超型的HLA分子群内具有较高的交叉反应性，和/或对某些或全部HLA分子具有更高的结合亲和力。本实施例描述了结合亲和力发生改变的典型模拟肽。
在主要锚定残基上模拟
可以通过肽改造策略来进一步提高表位的交叉反应性。例如可以改变含A2超基序的肽的主要锚定残基，如优选的是在2位上引入L、I、V或M，在C端引入I或V。
为了检测模拟肽的交叉反应性，首先测定每种人工模拟肽与典型的A2超型等位基因A*0201的结合活性，如果能够保持与A*0201的结合能力，就进一步测定其与其他A2超型的交叉反应性。
另外，如果一个肽被确认可以结合一个或者所有的超型成员，那么就制备这个肽的模拟肽，改变其对任意一个(或多个)超型成员的结合亲和力，从而可以扩大群体覆盖范围。
在细胞筛选试验中筛选具有免疫原性的模拟肽通常还受到其亲本野生型(WT)肽与多个A2超型等位基因中的至少3个结合能力弱，即IC50等于5000nM或更低，的限制。需要这个条件的原理在于WT肽内源性的表达量要足以产生生物学相关性。实验证明模拟肽与T细胞特异性的亲本表位相比其免疫原性和交叉反应性都升高(见Parkhurst等，J.Immunol.157：2539，1996和Pogue等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：8166，1995)。
在这些肽模拟物的细胞筛选过程中，确认模拟肽特异性的CTL也能够识别野生型肽，以及在可能的情况下也能够识别表达内源性肽的靶细胞是很重要的。
模拟含HLA-A3和B7超基序的肽
利用含HLA-A2超基序的肽的模拟方法来制备含HLA-A3超基序的表位的模拟物。例如，改造能与3/5A3超型分子结合的肽的主要锚定残基使其在2位上拥有一个优选残基(V、S、M或A)。
然后测定模拟肽与A*03和A*11(典型的A3超型等位基因)的结合能力。然后确定结合能力≤500nM的那些肽是否具有A3超型交叉反应性。
与含A2和A3基序的肽一样，如果可能的话，还可以进一步改造能够结合3个或更多个B7超型等位基因的肽以增加其交叉反应性结合能力、结合亲和力或结合半衰期。例如，含B7超基序的肽经改造后在C端主要锚定位置上拥有一个优选的残基(V、I、L或F)，如Sidney等(J.Immunol.157：3480-3490，1996)所报道。
在含其他基序和/或超基序的表位的主要锚定残基上进行模拟也可以同样的方式的进行。
然后测定模拟肽的免疫原性，一般是利用细胞筛选试验进行测定。同样，证明模拟肽特异性的CTL也能够识别野生型肽，以及在可能的情况下也能够识别表达内源性肽的靶细胞也是很重要的。
在次要锚定残基上进行模拟
此外，通过鉴定次要锚定位置上与交叉反应性和/或亲和力相关的特定残基来改造高交叉反应性肽和/或与HLA分子的亲和力提高的肽也是有意义的。例如，分析1位上为F残基的含B7超基序的肽的结合能力。然后将1位上的F替换成L就可以制备出这个肽的模拟物。测定这个模拟肽的结合亲和力、结合半衰期和/或交叉反应性。利用这种方法可以鉴定出特性得到改善的模拟肽。
也可利用HLA-B7转基因小鼠分析经过改造结合能力或交叉反应性足够高的模拟肽的免疫原性，例如在IFA免疫或脂质肽免疫后。还可以利用PSCA表达肿瘤患者的PBMC测定模拟肽刺激记忆反应的能力。
其他模拟肽制备策略
另外一种与锚定位置无关的模拟肽制备方法是用α-氨基丁酸替换半胱氨酸。由于其所具有的化学特性，半胱氨酸有形成二硫键的倾向，因此足以改变肽的结构从而降低其结合能力。用α-氨基丁酸替换半胱氨酸不仅可以解决这个问题，而且已经证实这种替换在某些情况下还可以提高结合和交叉结合能力(见Sette等，《顽固性病毒感染》(Persistent Viral Infections)，R.Ahmed和I.Chen编，John Wiley & Sons，英国，1999)。
因此，通过单氨基酸替换可以改变肽配基对HLA超型分子的结合特性和/或交叉反应性。
实施例16：PSCA来源的含HLA-DR结合基序的序列的鉴定和确认
利用与HLA I类肽相似的方法通过下面所描述的过程来鉴定和确认含HLA II类超基序或基序的肽表位。
筛选含HLA-DR超基序的表位
为了鉴定PSCA来源的HLA II类HTL表位，分析PSCA抗原以确定其是否存在含HLA-DR基序或超基序的序列。特意挑选含DR超基序、9-聚体核心和C端侧翼区的15-聚体序列(总共含15个氨基酸)。
能与DR分子结合的肽的预测方法已设计出来(Southwood等，J.Immunol.160：3363-3373，1998)。针对不同DR分子的这些方法可以给9-聚体核心区评分和评级。每种方法不仅可以分析肽序列的9-聚体核心区内是否存在DR超基序主要锚定残基(即1位和6位)，而且可以评价序列内是否存在次要锚定残基。根据等位基因特异性的筛选表(见Southwood等，同上)发现利用这些方法可有效地筛选出具有很高可能性结合特定DR分子的肽序列。另外还发现连续使用这些方法，特别是那些用于DR1、DR4w4和DR7的方法，可有效地筛选出DR交叉反应性的肽。
测定上述PSCA来源的肽与各种常见HLA-DR分子的结合能力。首先测定所有肽对主要DR分子：DR1、DR4w4和DR7的结合能力。然后通过第二轮试验测定能与这3个DR分子中的至少2个相结合的肽与DR2w2β1、DR2w2β2、DR6w19和DR9分子的结合活性。最后，通过第三轮试验测定能与第二轮4个DR分子中的至少2个相结合，也就是能与上述7个不同DR分子中的至少4个相结合的肽与DR4w15、DR5w11和DR8w2分子结合活性。能与上述第一、二、三轮试验的10个DR分子中的至少7个结合的肽被认为是交叉反应性的DR结合肽。我们对PSCA来源的能与常见HLA-DR等位基因结合的肽特别感兴趣。
含DR3基序的肽的筛选
由于HLA-DR3普遍存在于高加索、黑人和西班牙语人群中，因此与DR3的结合能力是筛选HTL表位的一个合适标准。因而应该测定候选肽与DR3的结合能力。但是，考虑到DR基序的结合特异性，那些只与DR3结合的肽也被当作疫苗制剂的候选组分。
为了有效地鉴定出能与DR3结合的肽，分析PSCA靶抗原找出其中包含两个DR3特异性结合基序中的一个基序的序列，见Geluk等(J.Immunol.152：5742-5748，1994)的报道。然后合成相应的肽，确定其结合DR3的亲和力是否达到1μM或更高，如低于1μM。符合这一结合标准的肽可以作为HLA II类分子的高亲和性结合肽。
利用这种方法鉴定出的DR3结合表位可以加入到含DR超基序肽表位的疫苗组合物中。
与含HLA I类基序的肽一样，含II类基序的肽也可以被模拟以提高其亲和力或交叉反应性。例如，9-聚体核心序列第4位上的天冬氨酸是DR3结合的理想残基，对该残基的替换通过可以改善其DR3结合活性。
实施例17：PSCA来源的HTL表位的免疫原性
本实施例利用本文所描述的方法从已鉴定出的那些表位中筛选出具有免疫原性的含DR超基序和DR3基序的表位。
利用类似于确定CTL表位免疫原性的方法通过分析其刺激HTL反应和/或利用合适的转基因小鼠模型来确定HTL表位的免疫原性。通过如下试验可确定表位的免疫原性：1.)在体外利用正常PBMC进行初级诱导，或2.)测定表达PSCA的肿瘤患者的记忆反应。
实施例18：通过计算HLA超型在不同种族背景的人群中的显型频率
来确定群体覆盖范围的宽度
本实施例描述了含多种表位的疫苗组合物的群体覆盖范围宽度的计算方法，其中的表位含有多个超基序和/或基序
为了确定群体覆盖范围，计算HLA等位基因的基因频率。可以利用二项分布公式gf＝1-(SQRT(1-af))(见Sidney等，Human Immunol.45：79-93，1996)根据抗原或等位基因的频率来计算每个HLA等位基因的基因频率。为了获得全面的显型频率，利用逆向公式[af＝1-(1-Cgf)2]计算累积基因频率和累积抗原频率。
如果在DNA分型水平上没有可用的频率数据，那么就要先假设其相应的通过血清学方法定义的抗原频率。为了获得总的潜在超型群体覆盖范围，先假设没有连锁不平衡现象，并且每个超型只包含一个待确认的等位基因(最低估计值)。通过位点的组合来估计总的潜在覆盖范围，即将非A覆盖群体的部分加到A覆盖范围内，其中非A覆盖群体的部分据预测可被B位点覆盖(即总覆盖范围＝A+B*(1-A))。A3样超型中被确认的成员有A3、A11、A31、A*3301和A*6801。虽然A3样超型还包括A34、A66和A*7401，但是在计算总频率时不包括这些等位基因。同样，A2样超型家族中被确认的成员有A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*6802和A*6901。最后，B7样超型中被确认的等位基因有B7、B*3501-03、B51、B*5301、B*5401、B*5501-2、B*5601、B*6701和B*7801(可能的还有B*1401、B*3504-06、B*4201和B*5602)。
通过A2-、A3-和B7-超型组合而得到的群体覆盖范围在5个主要种群中大约为86％。加上含A1和A24基序的肽可以扩大覆盖范围。平均而言，在5个主要的种群(高加索人、北美黑人、中国人、日本人和西班牙人)中A1存在于12％的人群中，A24存在于29％的人群中。这些等位基因综合在一起在上述种群中的平均频率为39％。A1和A24与A2、A3和B7超型等位基因组合起来在主要种群中的总覆盖范围大于>95％，见表IV(G)。可通过相似的方法利用含II类基序的表位组合来估计群体覆盖范围。
在人体内的免疫原性试验结果(见Bertoni等，J.Clin.Invest.100：503，1997；Doolan等，Immunity7：97，1997和Threlkeld等，J.Immunol.159：1648，1997)表明具有高交叉反应性的结合肽几乎都被看作是表位。使用高交叉反应性结合肽是鉴定在不同种群中具有免疫原性的疫苗所包含的候选表位的重要筛选标准。
如果有足够数目的表位(如本文所描述的和本领域已知的)，在5个主要种群的任何一个种群中的平均群体覆盖率都可以达到95％以上。本领域所熟知的博弈论蒙地卡罗模拟分析(见Osborne，M.J.和Rubinstein，A.，《博弈论教程》(A course in gametheory)，MIT Press，1994)可用于估计在由高加索人、北美黑人、日本人、中国人和西班牙人组成的群体中有多少百分比的个体可识别本文所描述的疫苗表位。优选的百分比是90％，更优选的是95％。
实施例19：CTL被活化后对内源性抗原的识别
本实施例描述了如本文所描述的被鉴定和筛选出的天然肽或模拟肽所诱导的CTL对内源性合成抗原、即天然抗原的识别作用。
从肽表位如含HLA-A2超基序的表位免疫的转基因小鼠体内分离效应细胞，在体外用载肽刺激细胞重新刺激。6天后分析效应细胞的细胞毒活性，然后进一步刺激具有肽特异性细胞毒活性的细胞系。再过6天以后，用51Cr标记的含肽或不含肽的Jurkat-A2.1/Kb靶细胞以及51Cr标记的可内源性表达抗原的靶细胞如稳定转染PSCA表达载体的细胞测定这些细胞系的细胞毒活性。
结果表明从肽表位刺激的动物体内分离出的CTL细胞系可识别内源性合成的PSCA抗原。用于这种分析的转基因小鼠模型的选择要根据评价的表位而定。除了HLA-A*0201/Kb转基因小鼠以外，其他几种可用的转基因小鼠也已经制备出来，其中包括可用于评价A3表位的携带人A11等位基因的转基因小鼠和携带B7等位基因的小鼠(如可用于评价HLA-A1和A24的转基因小鼠)。HLA-DR1和HLA-DR3小鼠也已制备出来，这种小鼠可用于评价HTL表位。
实施例20：CTL-HTL偶联表位在转基因小鼠体内的活性
本实施例描述的是利用PSCA来源的CTL和HTL肽疫苗组合物在转基因小鼠体内诱导CTL和HTL。本文所用的疫苗组合物包含可给携带表达PSCA的肿瘤的患者使用的肽。肽组合物包含多种CTL和/或HTL表位。这些表位是利用本文所描述的方法鉴定的。本实施例还描述了通过在CTL疫苗组合物内加入一种或多种HTL表位来提高组合物的免疫原性的方法；这种肽组合物可以包含与CTL表位连接的HTL表位。CTL表位可以是与多种HLA家族成员的亲和力等于或低于500nM的表位或该表位的模拟肽。如果需要，这种肽可以是脂质化的。
免疫过程：按照文献描述的方法免疫转基因小鼠(Alexander等，J.Immunol.159：4753-4761，1997)。例如，携带人HLA A2.1等位基因的转基因小鼠A2/Kb可用于测定含HLA-A*0201基序或HLA-A2超基序的表位的免疫原性，在该小鼠的皮下(尾巴根部)注射0.1ml含不完全弗氏佐剂的肽进行刺激，如果肽组合物是脂质化的CTL/HTL偶联表位，则用DMSO/盐水溶解，如果肽组合物是多肽，则用PBS或不完全弗氏佐剂溶解。刺激后7天，取这些动物的脾细胞，用载肽的经照射的LPS活化的同系淋巴母细胞重新刺激。
细胞系：测定肽特异性细胞毒活性所用的靶细胞为转染了HLA-A2.1/Kb嵌合基因的Jurkat细胞(Vitiello等，J.Exp.Med.173：1007，1991)。
体外CTL活化：初次刺激以后1周，脾细胞(30×106/瓶)与载肽的、经照射的(3000拉德)同系淋巴母细胞(10×106/瓶)在37℃共培养，每个T25培养瓶含10ml培养基。6天以后，收获效应细胞，测定其细胞毒活性。
细胞毒活性的检测：靶细胞(1.0-1.5×106)在37℃与200μl51Cr共孵育。60分钟后洗涤细胞三次，用R10培养基重悬。在需要的瓶中加入1μg/ml肽。在活性测定时将10451Cr标记的靶细胞加到U底96孔板内不同浓度的效应细胞内(终体积为200μl)。37℃孵育6小时以后，从每孔中吸取0.1ml上清液，用Micromedic自动伽马计数仪测定放射活性。用如下公式计算特异性溶解百分率：特异性溶解百分率＝100×(试验组释放值—自发释放值)/(最大释放值—自发释放值)。为了便于比较在相同条件下进行的两轮CTL试验所得到的结果，％51Cr释放值表达为溶解单位/106细胞。1个溶解单位定义为在6小时的51Cr释放试验中将10000个靶细胞中的30％溶解所需要的效应细胞数。含肽的溶解单位/106减去不含肽的溶解单位/106就得到了特异性溶解单位/106。例如，如果在没有肽的情况下达到30％51Cr释放所需要的效(E):靶(T)比为50:1(即5×105对10,000靶细胞)，而在肽存在的情况下效:靶比为5:1(即5×104效应细胞对10,000靶细胞)，那么特异性溶解单位为：[(1/50,000)-(1/500,000)]×106＝18LU。
对结果进行分析以评估用免疫原性CTL/HTL偶联疫苗制剂免疫的小鼠的CTL反应强度，并与用上述实施例“免疫原性的确定“中所描述的CTL表位免疫的小鼠的CTL反应强度比较。可用与此相似的方法确定含多种CTL表位和/或多种HTL表位的偶联肽的免疫原性。通过这些处理可以发现注射这种组合物以后CTL反应被诱导出来，同时伴随着HTL反应的发生。
实施例21：PSCA特异性疫苗中所含CTL和HTL表位的筛选
本实施例描述的是用于本发明的疫苗组合物的肽表位筛选过程。组合物内的肽可以是核酸序列的形式，如编码肽的单个序列或一个或多个序列(小基因)，也可以是单表位肽和/或多表位肽。
可添加到疫苗组合物中的表位可以根据以下原则进行选择。各个原则要加以平衡以利于筛选。
选择那些一旦注射以后就可以产生与PSCA清除相关的免疫反应的表位。所用的表位数目要根据能自发清除PSCA的患者的情况而定。例如，如果能自发清除PSCA表达细胞的患者至少可以对PSCA的3个表位产生免疫反应，那么至少要使用HLAI类分子的3个表位。根据相似的原则可以确定HLA II类分子的表位。
一般来说，选择的HLA I类分子的表位所具有的结合亲和力要达到IC50等于或小于500nM，HLA II类分子的表位所具有的结合亲和力要达到IC50等于或小于1000nM；或者从BIMAS网站中挑选那些具有高结合分数的HLA I类肽，网址是bimas.dcrt.nih.gov/。
为了使疫苗在不同人群中能够达到较宽的覆盖范围，要选择足够数目的含超基序肽或足够多组的含等位基因特异性基序肽以获得较宽的群体覆盖范围。在一个实施方式中，所选择的表位至少能提供80％的群体覆盖率。本领域所熟知的一种统计学评价方法蒙地卡罗分析方法可用于评价群体覆盖范围的宽度或丰度。
当制备多表位组合物或编码相同表位的小基因时，一般希望得到包含目的表位的最小肽。其适用的原则与筛选含嵌套表位的肽所使用的原则即使不完全相同，也是相似的。例如，可以选择一个蛋白序列用于疫苗组合物中，因为蛋白序列内含有最多数目的表位，即它含有高浓度的表位。表位可以是嵌套的或重叠的(即彼此移码)。例如，对于重叠表位来说，一个含10个氨基酸的表位内就可以包含2个9-聚体的表位和1个10-聚体的表位。在注射这种肽时每个表位都可以暴露出来并且被HLA分子结合。多表位肽可通过合成或重组方法制备，也可以通过裂解天然蛋白来制备。另外，也可以制备这种天然序列的模拟物，其中的一个或多个表位存在残基替换，这种替换可改变多表位肽的交叉反应性和/或结合亲和力。这种疫苗组合物被注射后可达到治疗或预防的目的。本实施方式提供了一种可能性，即免疫***中有些还未被发现的处理过程用于天然的嵌套序列，从而促进可诱导免疫反应的治疗性或预防性疫苗组合物的制备。除此以外，本实施方式还提供了另外的可能性，即有些HLA分子的含基序表位目前还是未知的。另外，本实施方式(不制备任何模拟肽)可直接诱导针对PSCA内实际存在的多个肽序列的免疫反应，因此就不需要再评价任何接合表位了。最后，本实施方式用于制备核酸疫苗组合物时是比较经济的。根据本领域的这些原则可以设计出与此实施方式相关的计算机程序，用于鉴定靶序列，确定单位序列长度上存在的最大表位数。
由所选择的肽组成的疫苗组合物在注射时是安全有效的，可以诱导出免疫反应，其强度足以控制或清除含或表达PSCA的细胞。
实施例22：“小基因”多表位DNA质粒的构建
本实施例讨论了小基因表达质粒的构建。当然，小基因质粒可以包含本文所描述的各种组合的B细胞、CTL和/或HTL表位或表位模拟物。
小基因表达质粒一般都包含多个CTL和HTL肽表位。在本实施例中，含HLA-A2、-A3、-B7超基序的肽表位和含HLA-A1和-A24基序的肽表位与含DR超基序的表位和/或DR3表位相连接。所选择的是PSCA来源的含HLA I类分子超基序或基序的肽表位，这样质粒内就包含了多个超基序/基序，从而确保有一个较宽的群体覆盖范围。同样，选择PSCA来源的HLAII类表位也可以提供较宽的群体覆盖范围，即在小基因构建物内既存在含HLADR-1、-4、-7超基序的表位又存在含HLA DR-3基序的表位。然后将选择的CTL和HTL表位***到小基因内，使其在表达载体内表达。
这种构建物还可能包含将HTL表位引导到内质网上的序列。例如，Ii蛋白可以被融合到本领域所描述的一个或多个HTL表位上，其中Ii蛋白的CLIP序列被删除，替换以HLA II类表位序列，这样HLA II类表位就可以被引导到内质网上，表位在此处与HLA II类分子结合。
本实施例描述了含小基因的表达质粒的构建方法。其他的表达载体也可用于小基因组合物，这些载体也是本领域技术人员熟知的。
本实施例的小基因DNA质粒包含一个共有的Kozak和一个共有的鼠κIg轻链信号序列，随后是根据本文所描述的原则选择的CTL和/或HTL表位。这些序列可编码一个开放阅读框架，利用pcDNA3.1Myc-His表达载体可将Myc和His抗体表位标记融合上。
平均包含约70个核苷酸，其中有15个重叠核苷酸的重叠寡核苷酸可以用化学合成的方法合成，通过HPLC纯化。寡核苷酸编码所选择的肽表位和适当的连接寡核苷酸、Kozak序列和信号序列。利用PCR通过三组反应延伸重叠的寡核苷酸就可以装配成最终的多表位小基因。利用Perkin/Elmer9600PCR仪在下列条件下进行30个循环：95℃15秒，复性温度(比每个引物对的最低Tm计算值低5℃)30秒，以及72℃1分钟。
例如按照如下过程制备小基因。第一轮PCR反应使用两种寡核苷酸，每种5μg，复性和延伸：在一个例子中使用8种寡核苷酸，即4对引物，寡核苷酸1+2、3+4、5+6和7+8混合在100μl反应液中，其中含有Pfu聚合酶缓冲液(1×＝10mM KCL，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-Cl，pH8.75，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100，100μg/ml BSA)、dNTP各0.25mM和2.5U Pfu聚合酶。通过凝胶纯化全长的二聚产物，包含产物1+2和3+4以及产物5+6和7+8的两种反应液混合、复性及延伸10个循环。然后两种反应液各取一半混合，进行5个循环的复性和延伸，加入两侧引物以扩增全长产物。凝胶纯化全长产物，克隆到pCR-blunt(Invitrogen)中，通过测序筛选每一个克隆。
实施例23：质粒构建物及其诱导免疫原性的程度
一个质粒构建物，如上述实施例所构建的质粒，其诱导免疫原性的能力可通过在体外用表位表达核酸构建物转导或转染APC，然后再测定APC提呈表位的能力来确定。这种试验可确定“抗原性”，可使用人APC。该试验测定的是表位被APC提呈的能力，如果一个表位可以被T细胞识别，那么通过定量测定细胞表面表位-HLA I类分子复合物的密度就可以确定这种能力。定量测定可通过直接测定从APC上洗脱的肽数量来确定(见Sijts等，J.Immunol.156：683-692，1996；Demotz等，Nature342：682-684，1989)，或者通过测定溶解释放或淋巴因子释放的量来确定肽-HLA I类分子复合物的数量，溶解释放或淋巴因子释放是由患病的或转染的靶细胞诱导的，然后就可以确定达到相同水平的溶解释放或淋巴因子释放所需要的肽浓度(见Kageyama等，J.Immunol.154：567-576，1995)。
另外，免疫原性也可以通过体内注射小鼠，然后体外测定CTL和HTL活性来确定，CTL活性和HTL活性分别用细胞毒活性测定试验和增殖试验来确定，如Alexander等，Immunity1：751-761，1994所详细描述的。
例如，为了确定至少含一个HLA-A2超基序肽的DNA小基因构建物在体内诱导CTL的能力，肌肉注射100μg裸cDNA免疫HLA-A2.1/Kb转基因小鼠。为了比较cDNA免疫所诱导的CTL水平，对照组动物用肽组合物进行免疫，其中肽组合物内含有多个表位，这些表位位于一条多肽链上，如同小基因编码的多肽链一样。
从免疫动物体内分离脾细胞，用两种组合物(小基因编码的肽表位和多表位肽编码的肽表位)分别刺激两次，然后通过51Cr释放试验测定肽特异性的细胞毒活性。结果可显示抗A2限制性表位的CTL反应强度，从而说明了小基因疫苗和多表位疫苗在体内的免疫原性。
因此，该试验的结果证明了小基因可激发针对HLA-A2超基序肽表位的免疫反应，多表位肽疫苗也是如此。利用其他HLA-A3和HLA-B7转基因小鼠模型通过相似的试验也可以评价HLA-A3和HLA-B7基序或超基序表位对CTL的诱导能力，结果发现小基因也可以激发出针对这些表位的免疫反应。
为了评价编码II类表位的小基因在体内诱导HTL的能力，肌肉注射100μg质粒DNA免疫DR转基因小鼠或I-Ab-限制性小鼠，后者用于评价能与适宜鼠MHC分子发生交叉反应的那些表位。为了比较DNA免疫所诱导的HTL水平，设一组对照动物，用完全弗氏佐剂乳化的肽组合物免疫。从免疫动物体内分离脾细胞，纯化出其中的CD4+T细胞，即HTL，用两种组合物(小基因编码的肽)分别刺激。通过3H胸腺嘧啶掺入增殖试验测定HTL反应(见Alexander等，Immunity1：751-761，1994)。结果表明产生了一定强度的HTL反应，因而说明了小基因在体内具有免疫原性。
按照上述实施例的描述构建的DNA小基因也可以作为疫苗联合加强因子通过初免-加强策略进行评价。加强因子包括重组蛋白(见Barnett等，Aids Res.and HumanRetroviruses14，增刊3：S299-S309，1998)或重组痘苗病毒，如表达编码完整目的蛋白的小基因或DNA(见Hanke等，Vaccine16：439-445，1998；Sedegah等，Proc.Natl.Acad.Sci USA95：7648-53，1998；Hanke和McMichael，Immunol.Letters66：177-181，1999以及Robinson等，Nature Med.5：526-34，1999)。
例如，用于初免-加强策略的DNA小基因的效率首先用转基因小鼠进行评价。在本实施例中，A2.1/Kb转基因小鼠用IM加100μg编码免疫原性肽的DNA小基因免疫，其中的免疫原性肽至少包括一个含HLA-A2超基序的肽。经过孵育期(3-9周)以后，小鼠通过腹膜内注射重组痘苗病毒进行加强免疫，注射剂量为每只小鼠107pfu，痘苗病毒表达DNA小基因编码的相同序列。对照鼠用100μgDNA或不含小基因的重组痘苗病毒免疫，或者用编码小基因的DNA免疫，但是不用痘苗病毒加强免疫。再经过2周的孵育期后，取小鼠的脾细胞，立即通过ELISPOT试验分析其肽特异性的细胞毒活性。另外，在体外用小基因或重组痘苗病毒编码的A2限制性肽表位刺激，然后通过α、β和/或γIFN ELISA来测定肽特异性的细胞毒活性。
结果发现初免-加强策略所用的小基因所激发的针对HLA-A2超基序肽的免疫反应比单独的DNA强。利用HLA-A11或HLA-B7转基因小鼠模型可进行类似的分析以评价HLA-A3或HLA-B7基序或超基序表位诱导CTL的能力。在人体内实施初级加强方案的方法见下面的实施例“利用初免-加强策略诱导CTL反应”的描述。
实施例24：预防用肽组合物
本发明的疫苗组合物可用于防止那些有可能产生表达PSCA抗原的肿瘤的人表达PSCA。例如，给易发PSCA相关肿瘤的个体注射含多种CTL和HTL表位，如上述实施例所描述的那些表位，的多表位肽表位组合物(或含相同表位的核酸)。
例如，肽组合物可以包含多个表位的单链多肽的形式提供。疫苗一般用含佐剂如不完全弗氏佐剂的生理溶液溶解。对于一个70公斤的患者来说，初次免疫所需的肽剂量约为1导50,000μg，一般为100-5,000μg。初级免疫后4周用加强剂量再免疫一次，然后测定患者体内的免疫反应强度，如分析PBMC样品内是否存在表位特异性的CTL细胞群。需要时还可以再次进行加强免疫。试验的结果表明作为抗PSCA相关疾病的预防用药，组合物是安全有效的。
另外，包含转染试剂的组合物还可以通过本领域熟知的和本文所描述的方法以核酸疫苗的形式注射。
实施例25：天然PSCA序列来源的多表位疫苗组合物
分析天然的PSCA多蛋白序列，优选利用计算机算法，根据每种I类和/或II类超基序或基序的定义，鉴定出多蛋白上含多个表位的“相对较短的”区域。这个相对较短的序列包含多个不同的或重叠的、“嵌套的”表位，可用于制备小基因构建物。构建物经改造后可表达天然蛋白序列相应的肽。这个“相对较短的”肽所包含的氨基酸数目一般少于250个，常见的是少于100个，优选的是少于75个，更优选的是少于50个。疫苗组合物选用蛋白序列，因为蛋白序列内包含最大数目的表位，即蛋白具有高浓度的表位。如本文所强调的，表位基序可以是嵌套的或重叠的(即彼此移码)。例如，对于重叠表位来说，一个含10个氨基酸的肽中可以存在两个9-聚体表位和一个10-聚体表位。这种疫苗组合物可用于治疗和预防的目的。
疫苗组合物包含PSCA抗原来源的多个CTL表位和至少一个HTL表位。这种多表位天然序列可以肽或编码肽的核酸序列的形式注射。另外，利用这种天然序列还可以制备模拟肽，其中的一个或多个表位包含残基的替换，这种替换可改变多表位肽的交叉反应性和/或结合亲和力。
本实施例的实施方式提供了一种可能性，即免疫***中有些还未被发现的处理过程用于天然的嵌套序列，从而促进可诱导治疗性或预防性免疫反应的疫苗组合物的制备。除此以外，本实施方式还提供了另外的可能性，即有些HLA分子的含基序表位目前还是未知的。另外，本实施方式(不包括模拟肽的实施方式)可直接诱导针对天然PSCA内实际存在的多个肽序列的免疫反应，因此就不需要再评价任何接合表位了。最后，本实施方式用于制备肽疫苗组合物或核酸疫苗组合物时是比较经济的。
与本实施方式相关的是，本领域已有一些计算机程序可用于鉴定靶序列上单位序列长度内所包含的最大表位数。
实施例26：多抗原来源的多表位疫苗组合物
本发明的PSCA肽表位可与其他肿瘤相关靶抗原来源的表位组合，形成的疫苗组合物可用于预防或治疗表达PSCA和该肿瘤相关靶抗原的肿瘤。例如，本发明提供的一种疫苗组合物以单链多肽的形似存在，该多肽链内含有PSCA和肿瘤相关抗原来源的多个表位，其中表达PSCA的靶肿瘤通常也表达该肿瘤相关抗原，或者该疫苗组合物是一个或多个不连续表位的混合物。另外，疫苗还可以小基因构建物或树突状细胞的形式注射，其中的树突状细胞已在体外被加载上肽表位。
实施例27：利用肽评价免疫反应
本发明的肽可用于分析免疫反应以判断是否存在针对PSCA的特异性抗体、CTL或HTL。这种分析可用Ogg等，Science279：2103-2106，1998描述的方法进行。在本实施例中，本发明的肽作为试剂而不是免疫原用于诊断或判断预后的目的。
在本实施例中，高敏感性的人白细胞抗原四聚体复合物(“四聚物”)作为有代表性的例子用于分析处于不同疾病阶段的或用含A*0201基序的PSCA肽免疫后的HLAA*0201阳性个体产生PSCA HLA-A*0201-特异性CTL的几率。按照文献(Musey等，N.Engl.J.Med.337：1267，1997)描述的方法合成四聚体复合物。简言之，在原核表达***内合成纯化的HLA重链(在本实施例中为A*0201)和β2-微球蛋白。通过删除跨膜-胞质尾巴并在COOH端添加一个含BirA酶催化生物素化位点的序列来修饰重链。通过稀释使重链、β2-微球蛋白和肽重新折叠。利用快速蛋白液相色谱技术分离出45-kD的重折叠产物，在生物素(Sigma，St.Louis，Missouri)、5’-三磷酸腺苷和镁离子存在的条件下利用BirA使该产物生物素化。以1:4摩尔比的比例加入链亲和素-藻红蛋白连接物，四聚体产物浓缩到1mg/ml。所得到的产物被称为四聚物-藻红蛋白。
为了对患者的血样进行分析，约1×106PBMC在300g离心5分钟，然后重悬到50μl冷磷酸盐缓冲液中。利用四聚物-藻红蛋白、抗CD8-Tricolor和抗CD38进行三色分析。PBMC与四聚物和抗体在冰上共孵育30到60分钟，洗涤两次后用甲醛固定。所设定的门为大于对照样品的99.98％。四聚物的对照包括A*0201阴性个体和A*0201阳性非患病供体。然后通过流式细胞术测定四聚物染色的细胞所占的百分数。结果可显示出PBMC样品内包含表位限制性CTL的细胞数，从而可以很容易地确定针对PSCA表位的免疫反应强度，因此可判断出暴露于PSCA或疫苗后所激发的保护性反应或治疗性反应的状况。
实施例28：利用肽表位评价记忆反应
本发明的肽表位可作为试剂用于评价T细胞反应，如患者体内的急性反应或记忆反应。这种分析可在已从PSCA相关疾病中恢复过来或已用PSCA疫苗免疫的患者体内进行。
例如，分析已被免疫的个体体内的I类限制性CTL反应。疫苗可以是任何PSCA疫苗。从免疫的个体体内分离PBMC，进行HLA定型。然后用本发明的适宜肽表位分析具有该型HLA的个体来源的样品，其中肽表位最好包含超基序以使其与多个HLA超型家族成员发生交叉反应。
利用Ficoll-Histopaque密度梯度离心***(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)分离免疫个体来源的PBMC，用HBSS(GIBCO Laboratories)洗涤3次，重悬于含L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(50U/ml)、链霉素(50μg/ml)、Hepes(10mM)和10％热灭活人AB血清的RPMI-1640(GIBCO Laboratories)(完全RPMI)中，然后接种到微量细胞培养板内。每个孔内加入10μg/ml含本发明表位的合成肽和1μg/ml HBV核心128-140表位作为第一周刺激期间T细胞辅助因子的来源。
在微量细胞培养格式中，将100μl/孔含4×105PBMC的完全RPMI加入到96孔圆底培养板内，设8复孔。在第3天和第10天，每孔内加入100μl含20U/ml rIL-2的完全RPMI。在第7天，将培养物转移到96孔平底培养板内，用肽、rIL-2和105经辐射(3,000拉德)自身滋养细胞再次刺激。在第14天测定培养物的细胞毒活性。如以前的文献(Rehermann等，Nature Med.2：1104，1108，1996；Rehermann等，J.Clin.Invest.97：1655-1665，1996；以及Rehermann等，J.Clin.Invest.98：1432-1440，1996)所描述，阳性CTL反应的定义为，与非患病对照个体相比，8复孔培养物中至少有2个或更多个复孔展现出超过10％的特异性51Cr释放。
自身的和同种异体的EBV转化B-LCL靶细胞系可从美国组织相容性和免疫遗传学协会(ASHI，Boston，MA)购买，或者按照文献(Guilhot等，J.Virol.66：2670-2678，1992)描述的方法从患者的样本中分离。
按照下列方法进行细胞毒活性分析。HLA相配的同种异体靶细胞或EBV转化的自身B淋巴母细胞瘤细胞系与10μM本发明的合成肽表位孵育过夜，用100μCi51Cr(Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)标记1小时，然后用HBSS洗涤4次。
利用U底96孔培养板通过标准的4小时裂孔51Cr释放试验测定细胞毒活性，每孔含3,000个靶细胞。在第14天以20-50:1的效/靶(E/T)比检测被刺激的PBMC。按照如下公式计算百分细胞毒活性：100×[(试验组释放值—自发释放值)/(最大释放值—自发释放值)]。最大释放值得自去污剂(2％Triton X-100；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)裂解的靶细胞。所有试验组的自发释放值都小于最大释放值的25％。
本试验的结果显示了经PSCA或PSCA疫苗刺激后所产生的HLA限制性CTL群的范围。
同样也可以分析II类分子限制性的HTL反应。在96孔平底培养板内培养纯化的PBMC，每孔1.5x105细胞，用10μg/ml本发明的合成肽、完整PSCA抗原或PHA刺激。按照常规每个试验条件设4-6个复孔。培养7天以后，吸去培养基，替换成含10U/ml IL-2的新鲜培养基。2天后每个孔内加入1μCi3H-胸腺嘧啶核苷，继续培养18小时。然后将细胞的DNA收获到玻璃纤维垫片上，测定3H-胸腺嘧啶掺入值。抗原特异性T细胞增殖率定义为有抗原时的3H-胸腺嘧啶掺入值除以无抗原时的3H-胸腺嘧啶掺入值。
实施例29：在人体内诱导特异性的CTL反应
本发明的包含CTL和HTL表位的免疫原性组合物的人体临床实验设计为剂量逐渐增大的IND I期临床研究，是一种安慰剂对照的随机双盲临床试验，临床方案如下：
约27位受试者入组，分为3组：
I组：3位受试者注射安慰剂，6位受试者注射5μg肽组合物；
II组：3位受试者注射安慰剂，6位受试者注射50μg肽组合物；
III组：3位受试者注射安慰剂，6位受试者注射500μg肽组合物。
首次注射4周后，所有受试者用相同剂量的组合物加强免疫一次。
本研究测定的指标与肽组合物的安全性和耐受性及其免疫原性相关。针对肽组合物的细胞免疫反应是这个肽组合物固有的活性指数，因此可以作为生物学效应的指标。下文总结了与安全性和疗效指标相关的临床及实验室数据。
安全性：监测安慰剂组和药物治疗组的不良事件发生率，评估其程度和可逆性。
疫苗疗效的评价：为了评价疫苗的疗效，注射前和注射后分别采集受试者的血样。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从肝素化的新鲜血样中分离外周血单个核细胞，用冻存液重悬后装入冻存管冷冻储存。分析样品的CTL和HTL活性。
实验结果表明疫苗是安全有效的。
实施例30：表达PSCA的患者的II期临床试验
II期临床试验通过给携带表达PSCA的肿瘤的患者注射CTL-HTL肽组合物来研究疫苗的疗效。本试验的主要目的在于确定在表达PSCA的肿瘤患者体内诱导CTL所需的有效剂量和给药方案，以便于在这些患者体内安全地诱导出CTL和HTL反应，以及观察何种程度的CTL活化可以改善患者的临床症状，如损伤的减轻和/或病变的缩小。该试验的设计方案如下：
本研究在多个中心进行。试验设计成一种开放、无对照、剂量逐渐增大的方案，其中的肽组合物先用单次剂量注射一次，6周后用相同的剂量加强免疫一次。剂量分别为每次注射50、500和5,000μg。记录药物相关的不良反应(严重程度和可逆性)。
患者分为3组。第1组注射50μg肽组合物，第2、3组分别注射500和5000μg肽组合物。每组内的患者年龄范围为21-65，代表不同的种族背景。所有患者都患有表达PSCA的肿瘤。
监测临床表现或抗原特异性的T细胞反应以评价肽组合物的疗效。结果发现疫苗组合物用于治疗PSCA相关疾病是安全有效的。
实施例31：通过初免-加强策略诱导CTL
与上述实施例“质粒构建物及其诱导免疫原性的程度”所描述的用于确定DNA疫苗在转基因小鼠体内的疗效相似的初免-加强策略在下文所描述的原则下也可用于评价疫苗在人体内的疗效。这种疫苗免疫方案包括用裸DNA初次免疫，然后再用佐剂混合的编码疫苗的重组病毒或重组蛋白/多肽或肽混合物加强免疫。
例如，初次免疫可以用表达载体，如实施例“小基因多表位DNA质粒的构建“中所构建的表达载体，以裸核酸的形式肌肉注射(或皮下注射或ID)到多个位点，给药剂量为0.5-5mg。也可以用基因枪注射核酸(0.1-1000μg)。经过3-4周的孵育期后，再进行一次加强免疫。加强免疫可以用5×107到5×109pfu的重组鸡痘病毒。其他的重组病毒，如MVA、金丝雀痘病毒、腺病毒或腺相关病毒也可用于加强免疫，或者多表位蛋白或肽混合物。为了评价疫苗的疗效，在免疫前、初次免疫后和加强免疫后采集患者的血样。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从肝素化的新鲜血样中分离外周血单个核细胞，用冻存液重悬后装入冻存管冷冻储存。分析样品的CTL和HTL活性。
试验结果表明所产生的免疫反应强度足以达到产生抗PSCA治疗性或保护性免疫的目的。
实施例32：利用树突状细胞(DC)给予疫苗组合物
包含本发明的肽表位的疫苗也可以利用APC或“专业的”APC如DC来给予受体。在本实施例中，载肽DC注射给患者以刺激患者体内的CTL反应。在本方法中，分离、扩增树突状细胞，并用含本发明的肽CTL和HTL表位的疫苗脉冲。然后将树突状细胞输入患者体内以激发CTL和HTL反应。所诱导出的CTL和HTL可破坏靶细胞或加速靶细胞的破坏，这些靶细胞表达PSCA蛋白，疫苗所包含的表位正来源于此。
例如，在体外用含肽的表位混合物刺激PBMC或从中分离的DC。可促进DC扩增的药物也可以使用，如ProgenipoietinTM(Monsanto，St.Louis，MO)或GM-CSF/IL-4。DC用肽脉冲以后，回输给患者以前要进行洗涤以去除未结合的肽。
如临床试验所熟知的，也是本领域的技术人员根据临床结果很容易确定的，回输给患者的DC数量可以改变(见Nature Med.4：328，1998；Nature Med.2：52，1996以及Prostate32：272，1997)。尽管在一般情况下每个患者注射2-50×106DC，但是也可以注射107或108DC。这种细胞群一般含有50-90％的DC。.
在某些实施方式中，给患者注射的是载肽PBMC而不是纯化的DC。例如，制备出的PBMC用试剂如ProgenipoietinTM处理后注射给患者，而不用纯化出DC。注射的PBMC总量一般为108到1010。一般来说，给患者注射的细胞数要根据每个患者血液中的DC百分含量而定，如利用抗DC的特异性抗体通过免疫荧光分析来确定DC的百分含量。因此，如果ProgenipoietinTM可动员一个患者外周血中2％的DC，这个患者需要接受5×106DC，那么给该患者注射的载肽PBMC总量应为2.5×108。据估计，利用试剂如ProgenipoietinTM动员的DC含量一般在2-10％之间，但是，正如本领域技术人员所了解的，DC的含量也可能变化很大。
体外活化CTL/HTL反应
另外，可在体外组织培养物内通过患者的或遗传相容的CTL或HTL前体细胞与APC如DC和免疫原性肽共孵育来诱导针对PSCA抗原的CTL或HTL反应。经过一段合适的孵育时间(一般约7到28天)以后，前体细胞被活化，扩增成效应细胞，然后将细胞输入到患者体内，效应细胞可在患者体内破坏(CTL)其特异性的靶细胞，即肿瘤细胞，或者加速靶细胞的破坏(HTL)。
实施例33：鉴定和确认含基序肽的其他方法
鉴定和确认含基序肽的另一种方法是将它们从携带特定MHC分子的细胞上洗脱下来。例如，已有许多研究集中在用于组织定型的EBV转化B细胞系上以确定它们表达何种HLA分子。在某些例子中，这些细胞只表达一种类型的HLA分子。可用表达目的抗原如PSCA的核酸转染这些细胞。作为转染的结果，经过内源性抗原处理而产生的肽可结合细胞内的HLA分子，并被运输和呈现在细胞表面。然后将细胞暴露于弱酸性条件下就可以将肽从HLA分子上洗脱下来，再测定其氨基酸序列，如通过质谱分析(见Kubo等，J.Immunol.152：3913，1994)。因为大多数与特定HLA分子结合的肽是包含基序的，所以这也是获得与细胞表达的特定HLA分子相关的含基序肽的一种方法。
另外，也可以用编码单个HLA等位基因的表达构建物转染不表达内源性HLA分子的细胞系。然后按照本文描述的方法使用这些细胞，即用编码PSCA的核酸转染这些细胞，然后分离细胞表面呈现的PSCA相应的肽。通过这种方法获得的肽都包含基序，这些基序可与细胞所表达的单个HLA等位基因结合。
如本领域技术人员所了解的，我们可利用相似的试验分析含多个HLA等位基因的细胞，然后确定所表达的每个HLA等位基因特异性的肽。另外，本领域的技术人员还应当了解，除了转染以外，如利用蛋白抗原加载，也可以为细胞提供抗原。
实施例34：互补的多聚核苷酸
与PSCA编码序列或其片段互补的序列也可用于检测、降低或抑制天然PSCA的表达。虽然本文已经描述了约含15到30个碱基对的寡核苷酸的用途，但是基本类似的方法也可用于更小或更大的序列片段。利用OLIGO4.06软件(NationalBiosciences)和PSCA的编码序列设计适宜的寡核苷酸。为了抑制转录，根据最独特的5’序列设计互补的寡核苷酸，用于阻止启动子与编码序列的结合。为了抑制翻译，所设计的互补寡核苷酸可阻止核糖体结合到PSCA编码转录物上。
实施例35：利用PSCA特异性的抗体纯化天然的或重组的PSCA
利用PSCA特异性的抗体通过免疫亲和层析纯化天然的或重组的PSCA。将抗PSCA抗体共价结合到活化的层析树脂如CNBr活化的SEPHAROSE(AmershamPharmacia Biotech)上制备出免疫亲和层析柱。结合以后按照厂商的说明书封闭和洗涤树脂。
含PSCA的介质通过免疫亲和层析柱，然后在允许PSCA优先吸附的条件(如含去污剂的高离子强度缓冲液)下洗涤层析柱。再用打破抗体/PSCA结合的条件(如pH2到pH3的缓冲液，或高浓度的离液剂，如尿素或硫氰酸盐离子)洗脱层析柱，收集GCR.P。
实施例36：鉴定可与PSCA相互作用的分子
PSCA或其生物活性片段用1211Bolton-Hunter试剂标记(见Bolton等(1973)Biochem.J.133：529)。在上述多孔培养板的孔内排列的候选分子与标记的PSCA共孵育，洗涤后检测含标记的PSCA复合物的所有孔。不同浓度的PSCA所得到数据用于计算PSCA与候选分子结合的数量、亲和力和相互作用。
实施例37：测定PSCAv.4在体内对肿瘤生长的促进作用
通过评价表达或缺乏PSCA v.4的细胞的发育和生长情况来确定PSCA v.4蛋白在体内对肿瘤生长的效应。例如，在SCID小鼠一侧皮下注射1×106含tkNeo空载体或PSCA v.4的3T3细胞、***癌细胞(如PC3细胞)、膀胱癌细胞(如UM-UC3细胞)或胰腺癌细胞(如PANC1细胞)。至少有两种策略可用：(1)在启动子如组成型启动子的调节下进行PSCA v.4的组成型表达，这种组成型的启动子可来自病毒的基因组，如多瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日出版的UK2,211,504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛***状瘤病毒、鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)，或者是来自于哺乳动物的异源启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，只要这些启动子与可诱导的载体***相容即可，以及(2)在可诱导载体***的控制下进行可调控的表达，如蜕皮素、四环素等，只要这种启动子与宿主细胞***相容即可。如果肿瘤是可以触摸到的，那么就用卡钳测量肿瘤的体积，经过一段时间以后判断PSCA v.4表达细胞是否以更快的速度生长，以及PSCA v.4表达细胞形成的肿瘤其侵袭性特征是否已经发生改变(如转移能力提高、血管化、对化疗药物的敏感性降低)。
另外，可以给小鼠原位植入1×105相同的细胞以判断PSCA v.4对胰腺内的局部生长是否有影响，以及PSCA v.4是否影响细胞转移的能力，特别是***和骨内的转移(Miki T等，Oncol Res.2001；12：209；Fu X等，Int.J Cancer.1991，49：938)。PSCA v.4骨肿瘤形成和生长的影响可以通过向胫骨内注射肿瘤细胞来评价。
该试验也可用于分析PSCA v.4对候选治疗性组合物的抑制效应，如PSCA v.4内体、PSCA v.4反义分子和核酶。
实施例38：PSCAv.4单克隆抗体介导的肿瘤体内抑制作用
PSCA v.4在肿瘤组织内显著表达，而在正常组织内限制性表达，这就使PSCAv.4成为抗体治疗的理想靶位。PSCA v.4同样也是T细胞免疫治疗的靶位。因此，重组细胞系如PC3-PSCA v.4、UM-UC3-PSCA v.4、PANC1-PSCA v.4和3T3-PSCA v.4(见Kaighn，M.E.等，Invest Urol，1979.17(1)：16-23)和人异种移植模型(Saffran等，PNAS1999，10：1073-1078)可用于评价抗PSCA v.4单克隆抗体在人肿瘤异种移植鼠模型中的治疗效应，其中包括***癌、膀胱癌、胰腺癌(如PANC1细胞)和表1中所列的其他PSCA v.4肿瘤。
抗体对肿瘤生长和转移癌形成的效应可在鼠原位卵巢癌、胰腺癌或血癌异种移植模型中进行研究。可以利用小鼠原位卵巢癌、胰腺癌或血癌异种移植模型研究抗体对肿瘤生长和转移癌形成的影响。抗体可以如本实施例所讨论的那样是未连接任何物质的，也可以如本领域所熟知的那样连接到治疗性载体上。抗体PSCAv.4mAb可抑制肿瘤在鼠异种移植模型中的形成。抗PSCA v.4mAb还可以抑制已有原位肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的存活期。这些结果说明抗PSCAv.4mAb可用于治疗几种局部固体肿瘤和晚期固体肿瘤(见Saffran，D.等，PNAS10：1073-1078；或访问站点pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698)。
注射抗PSCA v.4mAb可导致已有原位肿瘤生长的抑制，阻止肿瘤转移到远处的部位，这样就可以显著延长荷瘤小鼠的存活期。这些研究表明PSCA v.4是免疫治疗的理想靶位，PSCA v.4mAb用于治疗局部肿瘤和转移肿瘤时是有效的。本实施例说明未连接任何物质的PSCA v.4单克隆抗体可有效地抑制人胰腺癌、卵巢癌和淋巴癌异种移植物在SCID小鼠体内的生长；相应的，这类单克隆抗体的组合也是有效的。
利用多种未结合的PSCAv.4mAb抑制肿瘤
材料和方法
PSCA v.4单克隆抗体：
根据实施例“PSCA v.4单克隆抗体(mAb)的制备”所描述的方法可以制备出抗PSCA v.4的单克隆抗体。通过ELISA、蛋白印迹、FACS和免疫沉淀技术测定抗体与PSCA v.4结合的能力。通过ELISA和蛋白印迹试验获得的抗PSCA v.4mAb的表位图谱数据表明该抗体可识别PSCA v.4蛋白上的表位。利用这些抗体对肿瘤组织和细胞进行免疫组化分析。
利用Protein-G Sepharose层析柱从腹水或杂交瘤组织培养上清液中纯化单克隆抗体，用PBS透析，过滤除菌后-20℃储存。利用Bradford assay(Bio-Rad，Hercules，CA)测定蛋白含量。制备治疗性单克隆抗体或包含不同单克隆抗体的混合物，用于治疗皮下或原位注射PC3、UM-UC3、CaKi和A427肿瘤异种移植物的小鼠。
细胞系和异种移植物
LAPC-9异种移植物表达野生型雄激素受体，可产生***特异性抗原(PSA)，通过皮下套针将其植入到6-8周龄的雄性ICR-重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠(TaconicFarms)体内(Craft，N.等，1999，Cancer Res.59：5030-5036)。AGS-K3和AGS-K6肾异种移植物也通过皮下植入到6-8周龄的SCID小鼠体内进行传代。按照Craft等描述的方法制备肿瘤细胞的单细胞悬液。
肿瘤细胞系PC3、UM-UC3和PANC1以及成纤维细胞系NIH3T3(美国典型培养物收集中心)。***癌细胞系PC3用添加L谷氨酰胺和10％FBS的RPMI培养，膀胱癌细胞系UM-UC3和胰腺癌细胞系PANC1用添加L谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养。按照Hubert，R.S.等，Proc Natl.Acad.SciUSA，1999.96(25)：14523描述的方法通过逆转录病毒基因转导制备PC3-PSCA v.4、UM-UC3-PSCA v.4、PANC1-PSCA v.4和3T3-PSCA v.4细胞群。
鼠异种移植模型
在雄性SCID小鼠右腹部皮下注射2×106用基质胶(Collaborative Research)按1:1的比例混合的肿瘤细胞制备皮下(s.c.)肿瘤。为了检测抗体对肿瘤形成的影响，在注射肿瘤细胞的同一天开始注射抗体。对照小鼠注射纯化的鼠IgG(ICN)或PBS；或者注射识别人源细胞不表达的无关抗原的纯化单克隆抗体。在预实验中发现鼠IgG和PBS对肿瘤生长的影响无明显差异。利用卡钳测定肿瘤的大小，肿瘤的体积等于长度×宽度×高度。当皮下肿瘤的直径超过1.5cm时处死小鼠。
用***/赛拉嗪麻醉后进行原位注射。在进行***原位移植试验时，切开小鼠腹肌，暴露膀胱和精囊，然后通过切口暴露***背侧。基质胶混合的LAPC-9细胞(5×105)注射到两侧的背瓣内，注射体积为10μl。为了监测肿瘤的生长情况，每周采集一次小鼠血样，测定PSA的表达水平。对于胰腺原位移植模型来说，切开小鼠腹肌，暴露***组织，将胰腺癌细胞的单细胞悬液注射到乳腺的基底组织内。对于膀胱原位移植模型来说，将AGS-B1膀胱癌组织黏附到膀胱壁上。肿瘤移植以后，给小鼠分组，分别进行适当的处理，腹膜内注射抗PSCA v.4或对照单克隆抗体。为了监测肿瘤的生长情况，对小鼠进行触诊，每周采集血样测定hCG的表达水平。
抗PSCA v.4mAb可抑制表达PSCA v.4的异种移植肿瘤的生长
利用细胞系(如PC3、UM-UC3、PANC1和3T3)和患者来源的肿瘤原位移植模型来评价抗PSCAv.4mAb对肿瘤形成的影响。与皮下肿瘤模型相比，原位肿瘤移植模型需要将肿瘤细胞直接注射到小鼠的器官内，导致局部肿瘤的形成，肿瘤向远处部位的转移，小鼠健康状况的恶化，以及小鼠随后死亡(Saffran，D.等，PNAS，同上)。这些特征使原位模型更能代表人类疾病的进展过程，能够使我们根据临床相关指标来判断单克隆抗体的治疗效应。
原位肿瘤模型的主要优点是能够研究肿瘤转移的发生发展。利用抗肿瘤特异性细胞表面蛋白的抗体如***癌的抗CK20抗体通过IHC分析可研究已有原位肿瘤的小鼠体内转移瘤的形成(LinS等，Cancer Detect Prev.2001；25：202)。
原位肿瘤模型的另一个优点是能够研究新生血管化和血管生成。肿瘤生长部分依赖于新血管的形成。虽然毛细血管***和形成的血管网是宿主来源的，但是异种移植肿瘤也能够调节新生血管的起始和结构(DavidoffAM等，Clin Cancer Res.2001；7：2870；Solesvik O等，Eur.J Cancer Clin Oncol.1984，20：1295)。利用本领域熟知的方法可以研究抗体和小分子对新生血管化的影响，例如通过IHC分析肿瘤组织及其周围的微环境。
在4周内给已有原位肿瘤的小鼠注射1000μg抗PSCA v.4mAb或PBS。给两组小鼠都加载较高的肿瘤负荷以确保在小鼠肺内形成转移瘤。然后处死小鼠，通过IHC分析其膀胱、肝脏、骨和肺内是否存在肿瘤细胞。这些试验的结果证明抗PSCA v.4抗体在鼠异种移植模型内具有高效的抗***癌形成和进展的活性。抗PSCAv.4抗体可抑制肿瘤的形成，阻止已有肿瘤的生长，延长治疗小鼠的存活期。而且，抗PSCAv.4mAb对局部***肿瘤向远处位点的转移具有极强的抑制效应，即使存在较高的肿瘤负荷。因此，抗PSCA v.4mAb有助于改善主要临床指标(肿瘤生长)，延长存活期，改善患者的健康状况。
实施例39：抗PSCA抗体在人体内的治疗性和预防性应用
抗PSCA单克隆抗体用于人体的诊断、预防、预测预后和/或治疗目的时是安全有效的。用抗PSCA mAb通过蛋白印迹和免疫组化技术分析肿瘤组织和肿瘤异种移植物，结果表明在癌组织内出现强染色，而在正常组织内染色较弱或根本检测不到。通过检测肿瘤和转移瘤内的PSCA发现mAb可作为诊断和/或预后指示因子。因此，抗PSCA抗体可用于诊断试验中，如对肾活检标本进行免疫组化染色以判断疑似患者是否携带肿瘤。
通过流式细胞仪检测发现抗PSCA mAb可特异地结合癌细胞。因此，抗PSCA抗体可用于诊断性的全身造影术中，如放免闪烁扫描术和放免治疗(见Potamianos S.等，Anticancer Res20(2A)：925-948(2000))用于检测局部的或转移的表达PSCA的肿瘤。PSCA的细胞外区域可能会脱落或释放到细胞外基质中，如碱性磷酸二酯酶B10所发生的(Meerson，N.R.，Hepatology27：563-568(1998))，这样就使我们能够用抗PSCA抗体检测疑似患者血清和/或尿液标本中的PSCA来进行诊断。
可特异性结合PSCA的抗PSCA抗体也可用于治疗中，治疗表达PSCA的肿瘤。抗PSCA抗体可以是未连接任何分子的形式，也可以是连接一种本领域熟知的治疗性分子或造影分子的形式，如前药、酶或放射性同位素。在临床前研究中，未连接的和连接的抗PSCA抗体用SCID鼠肿瘤异种移植模型如肾癌模型AGS-K3和AGS-K6检测其预防肿瘤和抑制肿瘤生长的效应(见实施例“PSCA单克隆抗体介导的膀胱癌和肺癌体内抑制效应”)连接的和未连接的抗PSCA抗体都可以作为治疗分子单独或与下面实施例所描述的其他因子结合用于人体临床试验中。
实施例40：
体内使用人源抗PSCA抗体治疗和诊断人类肿瘤的人体临床研究
本发明的抗体可识别PSCA上的表位，用于治疗某些肿瘤，如表I中所列的那些肿瘤。考虑到多种因素，其中包括PSCA的表达水平，肿瘤如表I中所列的那些肿瘤是目前优选的适应证。与这些适应证相联系，我们成功地实施了以下三种临床方案。
I.)辅助治疗：作为辅助治疗措施，抗PSCA抗体联合化疗药物或抗肿瘤药物和/或放射治疗来治疗患者。原发肿瘤靶位，如表I所列的那些肿瘤，用标准的治疗措施进行处理，在标准的一线和二线治疗措施以外再用抗PSCA抗体处理。治疗方案中设定的有效性是根据肿瘤块的缩小以及减少标准化疗药物使用剂量的能力来判断的。标准化疗药物使用剂量的减少使化疗药物的与剂量相关的毒性也下降，因此使我们能够采用其他的治疗措施和/或延长治疗周期。抗PSCA抗体可用于几个辅助临床研究中，与化疗药物或抗肿瘤药物联合使用，如阿霉素(晚期***癌)、顺铂(晚期头颈癌和肺癌)、紫杉醇(乳腺癌)和多柔比星(临床前研究)。
II.)单一治疗：单独使用抗PSCA抗体***是指只给患者使用抗体而不用化疗药或抗肿瘤药。在一个实施方式中，单一治疗措施用于治疗患有晚期肿瘤且严重转移的病人。患者的病情表现出某种程度的稳定。试验证明抗体对执拗的肿瘤患者也有一定疗效。
III.)造影剂：通过将放射性核素(如碘或钇(I131，Y90)连接到抗PSCA抗体上制备放射性标记的抗体，这种抗体可用作诊断试剂和/或造影剂。用于此目的时，标记的抗体局域的定位到固体肿瘤和表达PSCA的转移灶内。当抗PSCA抗体用作造影剂时，抗体可以作为固体肿瘤手术治疗的附加剂，用于术前扫描以及术后扫描以确定肿瘤是否被清除干净和/或复发。在一个实施例中，(111In)-PSCA抗体作为造影剂用于I期人体临床试验，筛选患有表达PSCA的肿瘤的患者(类似的例子见Divgi等J.Natl.Cancer Inst.83：97-104(1991))。患者随后进行标准的前位和后位γ射线造影。从造影结果中可以嵌出原发病灶和转移灶的部位。
给药剂量和给药途径
如本领域技术人员所熟知的，给药剂量的确定要考虑与临床中所用的其他类似药物相比较。因此，抗PSCA抗体的给药剂量范围为5到400mg/m2，根据安全性研究的结果，可以考虑更低的剂量。与已知抗体对其靶位的亲和性相比，抗PSCA的相对亲和性是本领域技术人员确定类似给药方案时所用的一个参数。另外，抗PSCA抗体是完全的人源抗体，与嵌合抗体相比，其清除率相对较低；因此患者使用这种抗体时所需的剂量也要相应减少，可能在50到300mg/m2之间依然有效。剂量单位用mg/m2，而不是常规的剂量单位mg/kg，是根据表面积来给药的，这样便于确定从婴幼儿到成年人各种体形的人所需的给药剂量。
有三种不同的给药方法可用于抗PSCA抗体的给药。常规的静脉给药是大多数肿瘤所用的标准给药方法。但是，如果肿瘤位于腹膜腔内，如卵巢内的肿瘤、胆管内的肿瘤以及其他腔隙内的肿瘤，腹膜内注射被认为是较好的，这样可在肿瘤部位达到较高的抗体剂量，同时也可使抗体的清除率降到最低。某些固体肿瘤含有血管，这样通过局部灌注给药就比较合适。局部灌注使高剂量的抗体集中到肿瘤部位，同时使抗体的短期清除率降到最低。
临床开发计划(CDP)
概述：CDP利用和开发抗PSCA抗体与辅助治疗、单一治疗和作为造影剂有关的临床应用潜能。先通过临床研究证明其安全性，然后再证明其重复给药的有效性。临床试验是开放标签的，标准化疗与标准治疗加抗PSCA抗体作比较。应当说明的是，与筛选受试者有关的一个入选标准是根据活检得到的其肿瘤表达PSCA的水平。
与任何蛋白或抗体输注治疗措施一样，对安全性的考虑主要与下列因素有关：(i)细胞因子释放综合征，如低血压、发热、颤抖、寒战；(ii)针对药物的免疫原性反应的发生(如患者产生的针对治疗性抗体的抗体，或HAHA反应)；以及(iii)对表达PSCA的正常细胞的毒性。要进行标准的检测并进行随访以监测这些安全性指标。试验表明抗PSCA抗体用于人体时是安全的。
实施例41：以人源抗PSCA抗体和化疗药为辅助治疗措施的人体临床试验
首先进行6个静脉注射剂量的人源抗PSCA抗体的I期临床试验以评价其和固体肿瘤治疗有关的安全性，这些固体肿瘤是指表I所列的肿瘤。在本研究中，以单次剂量的抗PSCA抗体作为抗肿瘤药物或化疗药物的辅助治疗措施进行I期临床试验评价其安全性，如本文所描述但不仅仅限于顺铂、多柔比星、阿霉素、紫杉醇等。试验方案包括6个单次剂量的抗PSCA抗体，6个剂量逐渐升高，从约25mg/m2到约275mg/m2，试验过程的安排如下：
在每次进行抗体治疗和化疗后1周内密切监测患者。特别要注意评价上述的安全性指标：(i)细胞因子释放综合征，如低血压、发热、颤抖、寒战；(ii)针对药物的免疫原性反应的发生(如患者产生的针对治疗性抗体的抗体，或HAHA反应)；以及(iii)对表达PSCA的正常细胞的毒性。要进行标准的检测并进行随访以监测这些安全性指标。还要评价患者的临床表现，特别是通过MRI或其他造影技术观察到的瘤块的缩小情况。
试验证明抗PSCA抗体是安全有效的，II期临床试验的目的在于进一步确证其有效性并确定最佳治疗剂量。
实施例42：人体临床试验：用人源抗PSCA抗体进行单一治疗
抗PSCA抗体在上述辅助治疗临床试验中是安全的，II期人体临床试验也确证了有效性并且为单一治疗确定了最佳给药剂量。经过这个临床试验以后发现，其安全性和临床疗效与上述辅助治疗临床试验的结果一样，只是患者在接受抗PSCA抗体的同时不使用化疗药物。
实施例43：人体临床试验：用抗PSCA抗体进行诊断造影
如上所述，按照上述安全性标准用抗体进行辅助治疗是安全的，因此我们利用抗PSCA抗体作为诊断造影剂再次进行临床试验。试验方案与本领域描述的那些方案基本相似，如Divgi等，J.Natl.Cancer Inst.83：97-104(1991)。结果发现抗体作为诊断试剂是安全有效的。
实施例44：PSCAv.4与已知序列的同源性比较
PSCA v.4基因一个含189个氨基酸的蛋白。人源PSCA v.4蛋白与人源***干细胞抗原(gi27482160)具有高度的同源性，该抗原在蛋白水平上与PSCA v.4的相同性达到98％(图4)。PSCA v.4的鼠同源类似物还没有鉴定出来。
PSCA v.4蛋白有几个变体(图11)。其中包括8个SNP和1个剪接变体，被称为PSCA v.3。PSCA v.3蛋白包含PSCA v.4的C端部分，相当于该变体的aa94-189。利用拓扑学预测程序进行生物信息学分析发现PSCA v.4是一种可溶性蛋白，不含跨膜区(表L)。
基序分析发现PSCA v.4蛋白上存在两个功能性基序(表L)，即已鉴定出的钙粘蛋白基序和颗粒体蛋白基序。钙粘蛋白属于钙依赖性细胞粘附分子家族。它们是包含免疫球蛋白样区的单链跨膜蛋白，参与细胞的粘附和分类(Shan等，Biophys Chem1999，82：157)。例如，钙粘蛋白可介导淋巴细胞向内皮细胞表面的组织特异性粘附。研究表明钙粘蛋白参与组织的形态发生、细胞粘附、细胞分化、细胞迁移和肿瘤转移(Yap AS，Kovacs EM.J Biol Chem2003，160：11；Vestweber D.Curr Opin Cell Biol2002，14：587；Bloom等，Mol Biol Cell.1999，10：1521；Brodt P.Cancer Met Rev1991，10：23)。颗粒体蛋白或上皮素是一种生长因子，最初是从细胞调整的培养基中纯化出来的，能够增强细胞的增殖能力(Xu，S.Q.等，J.Biol.Chem.1998，273：20078)。颗粒体蛋白在几种肿瘤中的表达水平升高，其中包括神经胶质瘤和肾癌(Liau L等，CancerRes.60：1353；Donald，C.D等，AnticancerRes.21：3739)。
PSCA v.4存在基序说明PSCA v.4能够通过调节细胞增殖、细胞粘附、细胞通讯、侵袭和转移来调控肿瘤的生长和进展。
因此，当PSCA v.4作为肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤侵袭、存活或细胞信号转导的调节因子而发挥功能时，PSCA v.4就可用于治疗、诊断、预测预后和/或预防的目的。另外，当分子如PSCA v.4的剪接变体或SNP在癌组织如表I所列的那些癌组织内表达时，这些分子就可用于治疗、诊断、预测预后和/或预防的目的。
实施例45：转录的调节
PSCA v.4定位在线粒体上并且其序列内含有钙粘蛋白结合区，说明PSCA v.4可调节真核基因的转录。通过在表达或不表达PSCA v.4的细胞内研究基因的表达就可以确定PSCAv.4对基因表达的调节作用。为此我们进行了两类试验。
在第一组试验中，从亲本细胞和PSCA v.4表达细胞中提取RNA，然后与购买的基因芯片(Clontech)杂交(Smid-Koopman E等，Br J Cancer.2000.83：246)。静息细胞与FBS、雄激素或生长因子处理的细胞进行比较。根据本领域熟知的方法找出表达出现差异的基因，然后找出这些表达出现差异的基因在生物学通路上的定位(Chen K等，Thyroid.2001.11：41.)。
在第二组试验中，利用购买的(Stratagene)虫荧光素酶报告质粒来评价特异性转录通路的活化水平，其中包括：NFkB-luc、SRE-luc、ELK1-luc、ARE-luc、p53-luc和CRE-luc。这些转录报告基因包含位于已知信号转导通路下游的已知转录因子共有的结合位点，是确定通路活化及筛选通路活化正性调节因子和负性调节因子的有效工具。
因此，PSCA v.4在基因调节中扮演重要角色，可作为靶位用于诊断、预测预后、预防和/或治疗的目的。
实施例46：潜在信号转导通路的鉴定和确认
据报道有许多哺乳动物蛋白能与信号分子相互作用，参与信号通路的调节(JNeurochem.2001；76：217-223)。试验证实钙粘蛋白与Cdc42和Rho信号通路有关(Kouklis J Biol Chem.2003，278：16230)。利用免疫沉淀和蛋白印迹技术可以鉴定出与PSCA v.4有关并介导信号转导事件的蛋白。已被证明在肿瘤生物学中发挥作用的几个通路可被PSCA v.4调节，其中包括磷脂通路；如PI3K、AKT等，粘附和迁移通路；如FAK、Rho、Rac-1、链蛋白等；以及丝裂原/存活级联，如ERK、p38等(CellGrowth Differ.2000，11：279；J Biol Chem.1999，274：801；Oncogene.2000，19：3003，J.Cell Biol.1997，138：913)。为了证明PSCA v.4的表达是否足以调节静息癌细胞内无活性的特异性信号通路，用癌细胞系PA-1、Panc1和Daudi研究PSCA v.4对信号级联活化的调节作用。稳定表达PSCA v.4或neo的癌细胞系用生长因子、FBS或其他活化分子刺激，然后通过蛋白印迹技术分析全细胞裂解物。
为了确定PSCA v.4能够直接或间接地活化细胞内已知的信号转导通路，用表达不同基因的细胞进行虫荧光素酶(luc)转录报告试验。这些转录报告基因包含位于已知信号转导通路下游的已知转录因子共有的结合位点，报告基因和典型的转录因子、信号转导通路及活化刺激信号如下：
1.NFkB-luc，NFkB/Rel；Ik-激酶/SAPK；生长/调亡/应激
2.SRE-luc，SRF/TCF/ELK1；MAPK/SAPK；生长/分化
3.AP-1-luc，FOS/JUN；MAPK/SAPK/PKC；生长/调亡/应激
4.ARE-luc，雄激素受体；类固醇/MAPK；生长/分化/调亡
5.p53-luc，p53；SAPK；生长/分化/调亡
6.CRE-luc，CREB/ATF2；PKA/p38；生长/调亡/应激
7.TCF-luc，TCF/Lef；-链蛋白，粘附/侵袭
基因介导的效应可用有mRNA表达的细胞进行分析。利用脂质介导的转染试剂(TFX-50，Promega)转导虫荧光素酶报告质粒。荧光素酶的活性可作为相对转录活性的指标，细胞提取物与荧光素底物共孵育，然后用发光计测定反应的发光强度就可以计算出虫荧光素酶的活性。
绘出PSCA v.4活化的信号通路图，用于鉴定和验证治疗性靶位。如果PSCA v.4参与信号转导，那么它就可用于诊断、预测预后、预防和/或治疗的目的。
实施例47：参与肿瘤进展
根据颗粒体蛋白和钙粘蛋白基序在细胞生长、粘附和蛋白相互作用中的作用来推测，PSCA v.4基因可影响癌细胞的生长、粘附、侵袭和转化。利用各种原发的和转染的细胞系如***细胞系以及稳定表达PSCA v.4的NIH3T3细胞系可以确证PSCA v.4在肿瘤生长中的作用。利用成熟的增殖试验可以分析缺乏PSCA v.4的亲本细胞和表达PSCA v.4的细胞的生长状况(Fraser SP，Grimes JA，Djamgoz MB.Prostate.2000，44：61；Johnson DE，Ochieng J，Evans SL.Anticancer Drugs.1996，7：288)。
为了确定PSCA v.4在转化过程中的作用，分析其在克隆形成试验中的效应。利用软琼脂试验分别在严格的条件和较宽松的条件下比较缺乏PSCA v.4的亲本NIH3T3细胞和表达PSCA v.4的NIH-3T3细胞(Song Z.等，Cancer Res.2000；60：6730。
确定PSCA v.4在癌细胞侵袭和转移中的作用可以利用已确立的方法，如Transwell Insert System assay(Becton Dickinson)(Cancer Res.1999；59：6010)。对照细胞，包括不表达PSCA v.4的***、胰腺和肾细胞系与表达PSCA v.4的细胞系比较。细胞用荧光染料钙黄绿素染色，接种到覆盖基膜类似物的Transwell插片的顶孔内。根据在低层槽内的细胞的荧光强度相对于整个细胞群的荧光强度来判断细胞的侵袭性。
PSCA v.4在细胞周期和调亡中也发挥作用。利用已确立的BrdU试验(Abdel-MalekZA.J Cell Physiol.1988，136：247)比较亲本细胞和表达PSCA v.4的细胞在细胞周期调节方面的不同。简言之，在最佳条件(全血清)和限制性条件(低浓度血清)下培养细胞，收获细胞后用BrdU标记，再用抗BrdU Ab和溴化丙啶染色。测定进入G1、S和G2M期的细胞百分数。另外，用对照亲本细胞和表达PSCA v.4的细胞，其中包括正常***细胞和***癌细胞，评价应激对调亡的影响。经遗传改造的细胞和亲本细胞用各种化疗药物如依托泊甙、紫杉醇等和蛋白合成抑制剂如环己亚胺处理。细胞用膜联蛋白V-FITC染色，通过FACS测定细胞的死亡率。PSCA v.4对细胞死亡的调节在肿瘤进展和肿瘤负荷的调节中扮演重要角色。
当PSCA v.4在细胞生长、转化、侵袭或调亡中发挥作用时，PSCAv.4就可用于诊断、预测预后、预防和/或治疗的目的。
实施例48：参与血管生成
血管生成或新毛细血管形成是肿瘤生长所必需的(Hanahan D，Folkman J.Cell.1996，86：353；Folkman J.Endocrinology.1998，139：441)。已经确立了几种方法用于在体外和体内测定血管生成情况，如组织培养试验分析内皮细胞微管的形成和内皮细胞的增殖。利用这些分析方法和体外新生血管化分析方法可以确定PSCA v.4在血管生成中的作用，如促进或抑制作用。
例如，利用微管形成试验和增殖试验评价经改造后表达PSCA v.4的内皮细胞。利用动物模型还可以评价PSCA v.4在体内的效应。例如将表达或不表达PSCA v.4的细胞植入到免疫缺陷鼠的皮下。5-15天后利用免疫组化技术评价内皮细胞的迁移和血管生成。PSCA v.4可影响血管生成，因此可用作诊断、预测预后、预防和/或治疗的靶位。
实施例49：参与蛋白-蛋白相互作用
研究表明钙粘蛋白基序可介导与其他蛋白的相互作用。利用免疫沉淀技术和酵母双杂交***鉴定可与PSCA v.4发生相互作用的蛋白。比较表达和不表达PSCA v.4的细胞的免疫沉淀物，确定特异性的蛋白-蛋白相互作用。
利用试验来分析PSCA v.4与其他效应分子的相互作用，如核蛋白、转录因子、激酶、磷酸盐等。通过比较PSCA v.4阳性和PSCA v.4阴性细胞，比较未刺激的/静息的细胞和内皮细胞活化因子如细胞因子、生长因子、雄激素和抗整合素抗体处理的细胞可以显示独特的相互作用。
另外，利用酵母双杂交方法也可以确定蛋白-蛋白相互作用(Curr Opin Chem Biol.1999，3：64)。将携带蛋白文库的载体导入到表达PSCA v.4-DNA-结合区融合蛋白和报告构建物的酵母中，其中蛋白文库内的蛋白被融合到转录因子的活化区上。通过比色分析报告基因的活性就可以确定蛋白-蛋白的相互作用。与效应分子和转录因子的特异性作用可以使技术人员了解PSCA v.4的作用模式，因此可以找出肿瘤的治疗、预测预后、预防和/或诊断靶位。这种分析方法以及相似的方法也可用于鉴定和筛选与PSCA v.4相互作用的小分子。
试验证明PSCA v.4可与蛋白质和小分子发生作用。相应的，PSCA v.4和与其相互作用的蛋白和小分子可用作诊断、预测预后、预防和/或治疗的目的。
实施例50：PSCA v.4参与细胞-细胞通讯
细胞-细胞通讯是维持器官完整和内环境稳定的必要因素，在肿瘤形成和进展过程中二者都失控。由于PSCA v.4上存在钙粘蛋白基序，这是一个已知的参与细胞相互作用和细胞-细胞粘附的基序，因此说明PSCA v.4可调节细胞通讯。细胞之间的通讯可用两种试验进行检测(J.Biol.Chem.2000，275：25207)。在第一种试验中，加载荧光染料的细胞与未标记的受体细胞共孵育，然后在荧光显微镜下观察细胞群。这种定性方法可用于分析相邻细胞之间的染料交换。在第二种试验中，供体细胞群和受体细胞群按上述方法处理，利用FACS定量分析受体细胞群。利用这两种试验比较表达PSCA v.4的细胞和不表达PSCA v.4的对照细胞，结果表明PSCA v.4可促进细胞通讯。可调节PSCA v.4介导的细胞-细胞通讯的小分子和/或抗体可作为治疗因子用于治疗表达PSCA v.4的肿瘤。由于PSCA v.4参与细胞-细胞通讯和小分子运输，因此它可以被用作诊断、预测预后、预防和/或治疗的靶位或标记。
本申请引用了各种网站资料、出版文献、专利申请和专利(引用的站点用其资源统一定位符或URL表示，地址在万维网上)。这些参考文献的公开内容都被完整纳入到本文中作为参考。另外，本申请涉及以下专利：1999年7月20日提交的美国专利申请No.09/359,326；1999年5月25日提交的美国专利申请No.09/308,503；1999年7月20日提交的美国专利申请No.09/359,326；1999年2月17日提交的美国专利申请No.09/251,835；1998年12月2日提交的美国专利申请No.09/203,939；1998年3月10日提交的美国专利申请No.09/038,261；1997年3月10日提交的美国专利申请No.08/814,279；1998年1月12日提交的美国专利申请No.60/071,141；1998年2月13日提交的美国专利申请No.60/074,675；1999年3月16日提交的美国专利申请No.60/124,658；1999年2月17日提交的美国专利申请No.60/120,536；以及1998年12月21日提交的美国专利申请No.60/113,230。上述所有的专利申请的内容都已完整纳入本申请中作为参考。
本发明并不局限于本文所描述的实施方式所规定的范围内，这些实施方式只是为了说明本发明的各个方面，与其功能等价的任何修改版本都包括在本发明的范围之内。除了本文所描述的以外，本领域的技术人员根据上面的描述和说明，应该可以了解对本发明的模型和方法所作出的各种修改，这些修改同样也落在本发明的范围之内。只要不偏离本发明的真正范围和精神就可以实施这种修改或其他实施方式。
表：
表I：表达PSCA的组织：
a.恶性组织
***
胰
膀胱
肾
结肠
肺
卵巢
乳腺
b.正常组织
表II：氨基酸缩写
单个字母 三个字母 全称
F Phe 苯丙氨酸
L Leu 亮氨酸
S Ser 丝氨酸
Y Tyr 酪氨酸
C Cys 半胱氨酸
W Trp 色氨酸
P Pro 脯氨酸
H His 组氨酸
Q Gln 谷氨酰胺
R Arg 精氨酸
L llg 异亮氨酸
M Met 甲硫氨酸
T Thr 苏氨酸
N Asn 天冬酰胺
K Lys 赖氨酸
V Val 缬氨酸
A Ala 丙氨酸
D Asp 天冬氨酸
E Glu 谷氨酸
G Gly 甘氨酸
表III：氨基酸取代矩阵
采纳自GCG软件9.0BLOSUM62氨基酸取代矩阵(封闭取代矩阵)。数值越大在相关天然蛋白质中越可能被取代。(见万维网URL ikp.unibe.ch/manual/blosum62.html)
表IV：
HLAI类/II基序/超基序
表IV(A)：HLAI类超基序/基序
超基序 位置 位置 位置
2(主要锚) 3(主要锚) C末端(主要锚)
A1 TILVMS FWY
A2 LIVMATQ IVMATL
A3 VSMATLI RK
A24 YFWIVLMT FIYWLM
B7 P VILFMWYA
B27 RHK FYLWMIVA
B44 ED FWYLIMVA
B58 ATS FWYLIVMA
B62 QLIVMP FWYMIVLA
基序
A1 TSM Y
A1 DEAS Y
A2.1 LMVQIAT VLIMAT
A3 LMVISATFCGD KYRHFA
A11 VTMLISAGNCDF KRYH
A24 YFWM FLIW
A＊3101 MVTALIS RK
A＊3301 MVALFIST RK
A＊6801 AVTMSLI RK
B＊0702 P LMFWYAIV
B＊3501 P LMFWYIVA
B51 P LIVFWYAM
B＊5301 P IMFWYALV
B＊5401 P ATIVLMFWY
黑体表示的残基是优选的，斜体表示的残基不十分优选：如果某肽在上表所示基序或超基序的每个主要锚定位置具有主要锚着点认为其带有基序。
表IV(B)：HLAII类超基序
1 6 9
W，F，Y，V，.I，L A，V，I，L，P，C，S，T A，V，I，L，C，S，T，M，Y
表IV(C)：HLAII类基序
斜体表示的残基是不十分优选或“勉强可用的”残基
表IV(D)：HLAI类超基序
斜体表示的残基是不十分优选或“勉强可用的”残基
表IV(E)：HLA I类基序
表IV(F)：
表IV(G)：
表VI：PSCAv.4的翻译后修饰
表VII：
检索肽
表VIII-XXI：
表XXII-XLIX：
表L：PSCAv.4的蛋白质特性
表LI：转录物PSCAv.1的外显子区域
表LII(a).转录变体PSCAv.2的核苷酸序列(SEQ ID NO：6527
表LIII(a).PSCAv.2(SEQ ID NO：6528)和PSCAv.1(SEQ ID NO：6529)的核苷酸序列排列对比
表LIV(a).PSCAv.2编码蛋白的肽序列(SEQ ID NO：6530)
表LV(a).PSCAv.2(SEQ ID NO：6531)和PSCAv.1(SEQ ID NO：6532)的氨基酸序列排列对比
表LII(b).转录变体PSCAv.3的核苷酸序列(SEQ ID NO：6533)
表LIII(b).PSCAv.2(SEQ ID NO：6534)和PSCAv.3(SEQ ID NO：6535)的核苷酸序列排列对比
表LIV(b).PSCAv.3编码蛋白的肽序列(SEQ ID NO：6536)
表LV(b).PSCAv.2和PSCAv.3的氨基酸序列排列对比
无显著同源性
表LII(c).转录变体PSCAv.4的核苷酸序列(SEQ ID NO：6537)
表LIII(c).PSCAv.2(SEQ ID NO：6538)和PSCAv.4(SEQ ID NO：6539)的核苷酸序列排列对比
表LIV(c).PSCAv.4编码蛋白的肽序列(SEQ ID NO：6540)
表LV(c).PSCAv.2和PSCAv.4的氨基酸序列排列对比
无显著同源性
表LII(d).转录变体PSCAv.5的核苷酸序列(SEQ ID NO：6541)
表LIII(d).PSCAv.2(SEQ ID NO：6542和PSCAv.5(SEQ ID NO：6543)的核苷酸序列排列对比
表LIV(d).PSCAv.5编码蛋白的肽序列(SEQ ID NO：6544)
表LV(d).PSCAv.2和PSCAv.5的氨基酸序列排列对比
无显著同源性
表LVI PSCAv.2和v.4中的SNP和密码子改变
＊AA：氨基酸
＊＊-：无编码的氨基酸。

Claims (4)

1.PSCA蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸用于制造检测癌症的试剂的用途，所述PSCA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6540所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多核苷酸是mRNA。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多核苷酸是经反转录产生的cDNA。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述癌症选自***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌或肺癌。
CN200480021931.4A 2003-05-30 2004-05-28 ***干细胞抗原(psca)变体及其序列 Expired - Lifetime CN101090729B (zh)

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