DE3879528T2

DE3879528T2 - Biotin-uebertraeger.

Info

Publication number: DE3879528T2
Application number: DE8888102055T
Authority: DE
Inventors: Gerald F Sigler
Original assignee: Hoechst Celanese Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1987-02-17
Filing date: 1988-02-12
Publication date: 1993-08-05
Anticipated expiration: 2008-02-13
Also published as: EP0279365A1; JP2648162B2; ATE87312T1; EP0279365B1; US4709037A; AU615644B2; JPS63203683A; DE3879528D1; AU1190888A; CA1293258C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen, die als Biotin-Überträger von Nutzen sind. Im spezielleren ist die vorliegende Erfindung auf Verbindungen gerichtet, die zum reversiblen Verknüpfen von Biotin mit niedermolekularen Thiolen und Proteinen verwendet werden können.

Hintergrund der Erfindung

Zum Verknüpfen von Biotin mit Proteinen über Thiol- und Aminofunktionen sind zahlreiche Reagentien verwendet worden. Beispiele für nicht-spaltbare Biotinylierungsreagentien, die für die Thiol-Funktion spezifisch sind, umfassen 3-(N-Maleimido)propionylbiocytin, beschrieben von Bayer et al. in Analytical Biochemistry, 149, 529-536 (1985), und N-Iodoacetyl-N'-biotinylhexylendiamin, beschrieben von Sutoh et al. in J.Mol.Biology, 178, 323-339 (1984). Beispiele für spaltbare Biotinylierungsreagentien, die für die Aminofunktion spezifisch sind, umfassen 3-(4-(N-Biotinoyl-6-aminocaproyloxy)phenyl)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (BPE), beschrieben von Mouton et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, 218, 101-108 (1982), und Sulfosuccinimidyl-2-(biotinamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionat (NHS-SS-Biotin), erhältlich von Pierce Chemical Company.
Für einige Anwendungszwecke ist es erwünscht, den Biotinrest abzutrennen und freies, unmarkiertees Protein zu regenerieren. Beispielsweise kann der Biotinrest zusammen mit immobilisiertem Avidin zum Auffinden eines Thiol-hältigen Proteins aus einem dieses enthaltenden Gemisch verwendet werden. Wenn es einmal isoliert ist, kann es von Bedeutung sein, das Protein in unmodifiziertem Zustand zu studieren. In solchen Fällen ist es notwendig, den Biotinrest unter Bedingungen abzuspalten, die die Integrität des Proteins nicht beeinträchtigen.
Jene oben beschriebenen Biotinylierungsreagentien, die gespaltet werden können, d.s. PBE und NHS-SS-Biotin, lassen einen Teil des Reagens, nämlich einen Alkylamidorest, auf dem Protein zurück. Da zahlreiche Proteine freie Thiolfunktionen und/oder Disulfidfunktionen enthalten, die leicht zu freien Thiolfunktionen reduziert werden, würde ein abspaltbares, für Thiolfunktionen spezifisches Biotinylierungsreagens, das die Regenerierung von freiem, unmarkiertem Protein ermöglicht, eine breite Anwendbarkeit in Affinitätsreinigungsmethoden haben.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurden nunmehr Verbindungen synthetisiert und getestet, die zum reversiblen Verknüpfen von Biotin mit einer Thiol-hältigen Substanz über eine Thiol-Disulfid-Austauschreaktion verwendet werden kann. Diese Verbindungen umfassen einen Biotinrest, der über einen Linker-Arm an einen Dithiopyridylrest verknüpft ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform schafft die vorliegende Erfindung die Verbindung Biotin-2-(2'-pyridyldithio)ethylamid, welche die Formel:
aufweist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform schafft die vorliegende Erfindung die Verbindung N-(2-Pyridyldithiopropionyl)biocytin, welche die Formel:
aufweist.
Im Gebrauch reagieren die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einem Thiol, wie einem Proteinthiol, unter Freisetzung eines Pyridin-2- thions und unter Ausbildung eines Biotin-dithio-verknüpften Proteins. Bei Reduktion der Dithiogruppe wird freies Protein freigesetzt. Bei Verwendung in Kombination mit immobilisiertem Avidin ergeben die Verbindungen der Erfindung ein Mittel zur selektiven Isolierung von Proteinen und Proteinkomplexen über die Affinitätschromatographie.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung schafft Verbindungen der Formel:
worin x und y ganze Zahlen von 1 bis 5 darstellen, n für 0 oder 1 steht, R eine acyclische Verknüpfungsgruppe mit einem Gehalt an wenigstens einer Amidofunktion bedeutet und Z eine Pyridylgruppe darstellt, die gegebenenfalls durch einen oder mehrere Substituenten von solcher Art und in einer solchen Stellung substituiert ist, daß der Tautomerismus des gebildeten Thiol-thions bei Spaltung der -S-S-Gruppe beibehalten wird.
Die mit R bezeichnete zweiwertige Gruppe, die vorstehend als eine acyclische Verknüpfungsgruppe definiert ist, die wenigstens eine Amidofunktion enthält, umfaßt eine gerade Kette von Atomen, worin die Stickstoff- und Kohlenstoffatome wenigstens einer Amidofunktion Kettenatome sind. Bevorzugte Gruppen R umfassen -CONH- und -CH(CO&sub2;H)NHCO-.
Was die Gruppe Z anlangt, so umfassen bevorzugte Beispiele 2-Pyridyl, 4-Pyridyl, 5-Nitro-2-pyridyl und 5-Carboxy-2-pyridyl, doch sind beliebige Substituenten, die den Tautomerismus des gebildeten Thiol-thions stabilisieren, geeignet.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können nach mehreren verschiedenen Wegen hergestellt werden. Die am meisten bevorzugten Methoden werden nachfolgend beschrieben.
Verbindungen der Formel (I), worin n den Wert 0 hat, werden durch Inkontaktbringen eines Säuresalzes eines Pyridyldithioalkylamins der Formel:
H&sub2;N-(CH&sub2;x yS-S-Z (II),
worin x, y und Z wie oben definiert sind, mit Biotin-N-hydroxysuccinimidester in Anwesenheit eines tertiären Amins hergestellt. Die Umsetzung wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 0 bis 50ºC vorgenommen. Geeignete Lösungsmittel umfassen beispielsweise N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid und Dimethylsulfoxid. Die Reaktionszeit variiert in Abhängigkeit von der Reaktionstemperatur.
Die Ausgangsverbindung der Formel (II) kann durch Inkontaktbringen eines Dipyridyldisulfids der Formel:
Z - S - S - Z (III),
worin Z wie oben definiert ist, mit einem Säuresalz eines Mercaptoalkylamins der Formel:
HS-(CH&sub2;)x yNH&sub2; (IV),
worin x und y wie oben definiert sind, hergestellt werden. Die Umsetzung wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 0 bis 30ºC während einer Zeit von 1 bis 24 Stunden ausgeführt. Geeignete Lösungsmittel umfassen Ethanol, Ethylacetat und Dioxan.
Verbindungen der Formel (I), worin n den Wert 1 hat und R für -CONHsteht, werden durch Inkontaktbringen einer Verbindung der Formel:
worin x wie oben definiert ist, mit einem Säuresalz eines Pyridyldithioalkylamins der Formel:
H&sub2;N-(CH&sub2;)y-S-S-Z (VI),
worin y und Z wie oben definiert sind, in Anwesenheit eines tertiären Amins hergestellt. Die Umsetzung wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 0 bis 50ºC vorgenommen. Geeignete Lösungsmittel umfassen N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid und Dimethylsulfoxid. Die Umsetzung wird während 1 bis 24 Stunden ausgeführt.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (V) sind in der Technik bekannt. Beispielsweise wird die Herstellung der Verbindung der Formel (V), worin x den Wert 5 hat, nämlich die Herstellung von Biotinamido-hexansäure-N-hydroxysuccinimidester, von Costello et al. in Clin.Chem., 25, 1572-1580 (1979), beschrieben und ist von Behring Diagnostics, La Jolla, Kalifornien, erhältlich.
Verbindungen der Formel I, worin R für -CH(CO&sub2;H)NHC(O)- steht, können durch Inberührungbringen eines organischen Carbonsäuresalzes einer Verbindung der Formel:
worin x wie oben definiert ist, mit einer Verbindung der Formel:
worin y und Z ebenfalls wie oben definiert sind, hergestellt werden. Die Umsetzung wird durch Inberührungbringen eines geeigneten Salzes von (VII), gelöst in einem wäßrigen Puffer, mit einer Lösung von (VIII) in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem dipolaren, aprotischen Lösungsmittel wie N,N-Dimethylformamid, ausgeführt. Der Netto-pH-Wert des Gemisches sollte derart sein, daß die Aminogruppe deprotoniert wird und daher reaktionsfähig ist. Ein pH-Wert zwischen 7,5 und 8,5 ist fakultativ. Geeignete Puffer sind jene, die keine störenden Funktionen enthalten. Ein Alkalimetallbicarbonatpuffer wird bevorzugt. Die Umsetzung wird bei einem Temperaturbereich von 0 bis 30ºC ausgeführt, vorzugsweise durch Mischen der Reagentien bei 0 bis 5ºC und Erwärmenlassen des Gemisches auf Raumtemperatur. Die Reaktanten werden in annähernd äquimolaren Mengen bei Konzentrationen im Bereich zwischen 0,1 und 0,2M vereinigt. Die Umsetzung ist im allgemeinen nach 2 Stunden bei Raumtemperatur abgeschlossen, kann aber länger vorgenommen werden. Das Produkt wird durch Ansäuern des Gemisches auf einen pH-Wert von 3 oder darunter ausgefällt.
Die Ausgangsverbindung der Formel VII wird durch Inberührungbringen von Biotin-N-hydroxysuccinimidester mit einer Verbindung der Formel:
H&sub2;N-(CH&sub2;)x-CH(CO&sub2;H)NHW,
worin x wie oben definiert ist und W eine geeignete Schutzgruppe wie tert.Butyloxycarbonyl (tert-BOC) bedeutet, hergestellt. Die Reaktanten werden durch Zusetzen einer gepufferten Lösung der geschützten Aminosäure zu einer Lösung des Esters in einem organischen Lösungsmittel in Berührung begracht. Diese Umsetzung wird bei einer Temperatur von 0 bis 30ºC während 1 bis 24 Stunden vorgenommen. Geeignete organische Lösungsmittel umfassen N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und dgl. Das Produkt, das erhalten wird, ist das N-α-tert-BOC-Derivat von VII. Vor der Anwendung wird dieses Derivat durch Behandlung mit einer geeigneten organischen Säure von der Schutzgruppe befreit, um das Säuresalzderivat von VII zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (VIII) sind in der Technik bekannt und werden in den US-Patenten 4 149 003; 4 231 999 und 4 232 119 beschrieben.
Die neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind spaltbare, Thiol-spezifische Biotinylierungsmittel, die eine Regenerierung von freies Thiol enthaltender Substanz bei Einwirkung von geeigneten reduzierenden Bedingungen auf das Biotin-derivatisierte Thiol gestatten.
Im Gebrauch reagieren die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einer Thiol-hältigen Substanz, wie einem Proteinthiol, unter Freisetzung eines Pyridin-2-thions und unter Bildung von Biotin-derivatisiertem Protein. Diese Reaktion beruht auf einem Thiol-Disulfid-Austausch, worin das während der Biotinylierung freigesetzte Pyridin-2-thion ein Chromogen mit einem Maximum bei einer Wellenlänge ist, bei welcher die meisten Proteine transparent sind (λmax = 343; &epsi;max = 8.000). Die Freisetzung des Thions erlaubt eine bequeme Überwachung der Biotinylierung durch einfache Spektroskopie.
Die Biotinylierung gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Inkontaktbringen einer Thiol-hältigen Substanz in einem wäßrigen Puffer mit einer Verbindung der Formel (I) in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem dipolaren aprotischen Lösungsmittel. Ein bequemer Puffer für zahlreiche biochemische Anwendungen ist Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4; eine Reihe von Puffern im pH-Bereich von 6 bis 9 ist jedoch geeignet, wobei die exakte Zusammensetzung üblicherweise eine Funktion des zu markierenden Moleküls ist. In der bevorzugten Ausführungsform enthält der Puffer auch eine kleine Menge eines Antioxydationsmittels für Thiolgruppen. Ein Beispiel für ein geeignetes Antioxydationsmittel ist Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Die Biotinylierungsreaktion, bei der es sich um einen Thiol-Disulfid-Austausch handelt, wird in einem Temperaturbereich von 4º bis 30ºC während 1 bis 8 Stunden ausgeführt. Wie zuvor erwähnt, wird der Ablauf der Reaktion in bequemer Weise spektrophotometrisch überwacht, weil das Nebenprodukt der Kondensation ein Chromogen ist. Sobald die Umsetzung als beendet beurteilt wird, werden überschüssiges Biotinylierungsmittel samt Nebenprodukt abgetrennt. Im Falle von Makromolekülen wird dies in einfacher Weise durch Gelfiltration oder Dialyse bewerkstelligt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zum Biotinylieren zahlreicher Substanzen über native oder künstlich eingeführte Thiolgruppen verwendet werden. Derartige Substanzen umfassen Proteine, wie zum Beispiel Hormone, Enzyme und Antikörper sowie niedermolekulare Substanzen.
Die Verwendung der Verbindungen der Formel (I) in Kombination mit geeigneten Avidinkonjugaten, insbesondere Enzym-markierten Avidinkonjugaten, schafft eine universelle, Thiol-spezifische Vielzweckprobe. Beispielsweise ermöglicht ein direktes Anfärben eines Thiolprotein-Blots mit einer Verbindung der Formel (I) eine anschließende Detektion mit einem Avidinenzymkomplex.
Die Verwendung der Verbindungen der Formel (I) in Kombination mit einer Avidin-Affinitätsmatrix (d.h. immobilisiertem Avidin) ergibt ein Mittel für die selektive Isolierung von Proteinen und Proteinkomplexen über die Affinitätschromatographie. Beispielsweise wird ein Antikörper mit einer Affinität für ein besonderes Ziel-Antigen, der mit einer Verbindung der Formel (I) biotinyliert ist, zu einem das Ziel-Antigen enthaltenden Rohgemisch zugesetzt. Das Ziel-Antigen bindet mit dem Biotin-markierten Antikörper und der resultierende Komplex wird mittels einer Avidinaffinitätsmatrix gewonnen. Der gebundene Komplex kann von der Avidinmatrix durch Reduktion der Disulfidbindung mit einem geeigneten Thiol, wie Dithiothreitol, gewonnen werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich besonders zum Binden von Biotin an einen Antikörper oder ein Fragment hievon. Antigenbindungsstellen eines Antikörpers enthalten freie Aminogruppen. Wird ein Antikörper mit einem Biotinmarkierungsmittel markiert, das mit diesen Aminofunktionen reaktiv ist, so wird die Fähigkeit des markierten Antikörpers zum Binden mit seinem Antigen gestört. Wird jedoch ein Antikörper einer milden Reduktion unterworfen, um einige der Intra- und/oder Interkettendisulfidgruppen in freie Thiolgruppen überzuführen, so kann der Antikörper anschließend mit Biotin mit Hilfe der Thiol-spezifischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung markiert werden. Durch Anwendung eines Thiol-spezifischen Markierungsmittels vermeidet man eine Störung der Antigenbindungsstellen.
Die Erfindung wird nunmehr an Hand spezifischer Beispiele erläutert.

Beispiel I

Durch Auflösen von 2,64 g (12 mMol) 2,2'-Dipyridyldisulfid in 75 ml Ethanol wird eine Lösung des Disulfids bereitet. Dann wird unter Rühren eine filtrierte Lösung von 1,29 g (11,3 mMol) 2-Mercaptoethylaminhydrochlorid in 75 ml Ethanol zu der ersten Lösung innerhalb einer Stunde zugesetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Rühren bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nach 2 Stunden wird das Reaktionsgemisch 18 Stunden lang in den Kühlschrank gestellt. Hierauf wird die erhaltene Suspension filtriert, um unlösliches Material, nämlich oxidiertes 2-Mercaptoethylamin, abzutrennen, und das Filtrat wird mit Diethylether auf 500 ml verdünnt. Der sich bildende Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat wird im Rotationsverdampfer auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. Das konzentrierte Filtrat wird wiederum mit Diethylether auf 500 ml verdünnt, wobei sich ein flockiger Niederschlag bildet. Nach dem Kühlen auf 4ºC wird das Produkt gewonnen und unter Vakuum getrocknet und führt zu 2-(2'-Pyridyldithio)ethylamin-hydrochlorid.
Das Produkt ist dünnschichtchromatographisch nahezu homogen (System n-Butanol:Essigsäure: Wasser 4:1:1; Merck Silicagel-Platten 60 F-254) und zeigt einen UV-absorbierenden, Ninhydrin-positiven Fleck bei Rf 0,45. Das NMR-Spektrum in D&sub2;O stimmt mit der angenommenen Struktur überein.

Beispiel II

Durch Auflösen von 0,73 g (2,15 mMol) Biotin-N-hydroxysuccinimidester und 0,53 g (2,39 mMol) 2-(2'-Pyridyldithio)ethylamin-hydrochlorid in 15 ml N,N-Dimethylformamid wird eine Lösung des Esters und des Aminhydrochlorids hergestellt. 0,63 ml (4,54 mMol) Triethylamin werden zugesetzt, und das Gemisch wird zugedeckt und bei Raumtemperatur 18 Stunden gerührt. Hierauf wird das Reaktionsgemisch filtriert, um den Triethylaminhydrochlorid-Niederschlag abzutrennen, und das Filtrat wird unter Vakuum bei 50ºC im Rotationsverdampfer eingedampft. Das erhaltene Öl wird mit 25 ml destilliertem Wasser digeriert, wobei ein flockiger Feststoff erhalten wird, der gesammelt, getrocknet und aus 25 ml Methanol/100 ml Wasser umkristallisiert wird. Der umkristallisierte Feststoff wird unter Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet und ergibt 0,37 g Biotin-2- (2'-pyridyldithio)ethylamid.
Die Analyse des Produktes durch TLC (System n-Butanol:Essigsäure:Wasser 4:1:1; Merck Silicagel-Platten 60 F-254) zeigt einen UV-absorbierenden, durch Iod anfärbbaren Hauptfleck bei Rf 0,65. Das NMR-Spektrum in DMSO-D&sub6; zeigt charakteristische Peaks für Pyridylthio- und Biotinreste.
Die Behandlung des Produktes mit überschüssigem 2-Mercaptoethylamin führt zur nahezu stöchiometrischen Freisetzung von 2-Pyridylthion, bestimmt durch Spektralanalyse (λmax = 343 nm; &epsi;max = 7,06 x 10&sup4;).

Beispiel III

Lyophilisierte Escherichia coli-β-Galactosidase (Behring Diagnostics, EIA-Qualität mit im Mittel 14 freien Sulfhydrylgruppen je Molekül) wird in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 mit einem Gehalt an 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure gelöst, um 4,0 ml einer Vorratslösung mit einer Netto-Enzymkonzentration von 0,7 mg/ml und einer Gesamtfeststoffkonzentration von 3,1 mg/ml zu ergeben. Die Hälfte der Vorratslösung (1,4 mg oder 3,0 nMol Enzym, bezogen auf ein Molekulargewicht von 465.000) wird in eine 4 ml-Quarzküvette eingebracht. Der Rest der Vorratslösung wird in eine zweite gleichartige Küvette eingebracht, und die Küvetten werden gegeneinander bei 343 nm in einem Hitachi 100-80-Spektrophotometer auf Null abgeglichen.
Durch Zusetzen von 8,34 mg Biotin-2-(2'-pyridyldithio)ethylamid zu 5 ml N,N-Dimethylformamid wird eine 4,0 mM Lösung des Biotinderivats in DMF hergestellt. Unter Verwendung einer Spritze werden 39 ul (156 mMol) Biotinreagens zu einer der Küvetten mit einem Gehalt an 2 ml β-Galactosidaselösung zugesetzt. Das Vermischen der beiden Lösungen wird sofort vorgenommen. Zu der anderen Küvette, die ebenfalls 2 ml β-Galactosidaselösung enthält, werden 39 ul Lösungsmittel zugesetzt. Das Vermischen dieser Lösungen wird ebenfalls sofort ausgeführt.
Die gefüllten Küvetten werden im Spektrophotometer angeordnet und die Absorption zufolge der Freisetzung von 2-Pyridylthion wird kontinuierlich bei 343 nm überwacht. Nach 1½ Stunden tritt eine Absorption von 0,161 auf, was 45,6 nMol 2-Pyridylthion entspricht. Auf der Basis der Stöchiometrie der Reaktion entspricht die Ausbeute an 2-Pyridylthion einem Mittel von 15 nMol Biotin, das je nMol Enzym reagiert hat.
Überschüssiges Biotinreagens wird von dem biotinylierten Enzym abgetrennt, indem die Reaktionslösung durch eine Sephadex G-25-Säule (Pharmacia PD-10), equilibriert mit einem Puffer mit pH 7,4, geführt wird. Die das biotinylierte Enzym enthaltenden Fraktionen werden durch A&sub2;&sub8;&sub0;-Protein-Absorption lokalisiert und ergeben insgesamt 3,4 ml Lösung.

Beispiel IV

Ein ml der biotinylierten Enzymlösung aus Beispiel III, welche Lösung 0,70 Protein-Absorptionseinheiten bei 280 nm enthält, wird durch ein Bett von 1 ml Avidin-Agarosegel (Behring Diagnostics, La Jolla, Kalifornien) perkolieren gelassen. Nach Sammeln des Abstroms wird das Bett mit 1,7 ml Puffer pH 7,4 gewaschen. Es zeigt sich, daß die vereinigten Abströme nur 0,4 Protein-Absorptionseinheiten bei 280 nm enthalten, was darauf hinweist, daß 94 % des biotinylierten Enzyms auf der Kolonne zurückgehalten worden sind. In einem Vergleichsversuch erscheinen praktisch alle Absorptionseinheiten, die durch eine nicht-biotinylierte β-Galactosidaseprobe gebildet werden, in dem Abstrom, was darauf hinweist, daß das unmodifizierte Enzym nicht auf der Säule zurückgehalten wird.

Beispiel V

Ein ml des immobilisierten biotinylierten β-Galactosidaseproduktes, hergestellt gemäß Beispiel IV, wird mit 4 ml einer 50 mM Lösung von Dithiothreitol in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit pH 7,4 und mit einem Gehalt an 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure behandelt. Das Dithiothreitolreagens wird bei Raumtemperatur durch das Gelbett filtriert und das Filtrat wird gesammelt. Während dieses Vorganges wird das Gel etwa 2 Stunden dem Reagens ausgesetzt. Das aufgefangene Gesamtfiltrat wird durch eine Gelfiltrationssäule aus Sephadex G-25 geführt, um Dithiothreitol von zurückgewonnener β-Galactosidase abzutrennen. Aus einer Gesamtmenge von 1,57 OD&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten von Biotin-markierter β-Galactosidase, die an das Avidin-Agarosegel gebunden ist, werden 1,28 OD&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten zurückerhalten, was darauf hinweist, daß 82 % des Enzyms gespalten werden.

Beispiel VI

1,10 g (3,23 mMol) Biotin-N-hydroxysuccinimidester werden in 11 ml N,N-Dimethylformamid gelöst und die gebildete Lösung wird in einem Eisbad auf 5ºC abgekühlt. Hierauf wird eine Lösung von 0,927 g (3,77 mMol) N-α-t-BOC-L-Lysin in 11 ml 1M Natriumbicarbonat unter Rühren zu der ersten Lösung innerhalb von 1,5 Stunden zugesetzt. Das Rühren wird über Nacht bei Raumtemperatur fortgeführt. Das Reaktionsgemisch wird dann im Vakuum filtriert und as Filtrat wird unter vermindertem Druck bei 35ºC am Rotationsverdampfer eingeengt. Das erhaltene weiße wolkige Öl wird in 27 ml Wasser gelöst und die gebildete Lösung wird in einem Eisbad auf 5ºC gekühlt. Beim Ansäuern der Lösung mit 1N Chlorwasserstoffsäure auf pH 3 bildet sich ein weißer Niederschlag aus. Das Reaktionsgemisch wird dann etwa 30 Minuten gerührt und anschließend im Vakuum filtriert. Der erhaltene weiße Feststoff wird mit eiskaltem Wasser gewaschen und dann über Nacht bei 40ºC über P&sub2;O&sub5; im Vakuum getrocknet und ergibt 1,10 g N-α-t-BOC-Biocytin.

Beispiel VII

Ein Gemisch aus 4,5 ml Trifluoressigsäure und 0,50 ml Anisol wird zu 1,08 g (2,29 mMol) N-α-t-BOC-Biocytin zugesetzt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum bei 30ºC im Rotationsverdampfer eingeengt und führt zu einem dicken gelben Öl. Das Öl wird mit 20 ml Ethylether digeriert und die erhaltene Suspension im Vakuum filtriert. Der erhaltene weiße Feststoff wird über Nacht unter Vakuum über Natriumhydroxid getrocknet und führt zu 1,34 g Biocytintrifluoracetat.

Beispiel VIII

0,50 g (1,03 mMol) Biocytintrifluoracetat werden in 5 ml 0,5M Natriumbicarbonatpuffer, pH 8,3, gelöst, und die gebildete Lösung wird dann in einem Eisbad auf 5ºC gekühlt. Anschließend wird eine Lösung von 0,32 g (1,03 mMol) N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat in 2 ml N,N-Dimethylformamid tropfenweise unter Rühren zur ersten Lösung zugesetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Rühren fortgesetzt und das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur kommen gelassen. Nach zwei Stunden wird das Reaktionsgemisch mit 1N Chlorwasserstoffsäure auf pH 3 angesäuert und über Nacht in den Kühlschrank gestellt, um das Produkt auszufällen. Die beim Kühlen gebildete Suspension wird im Vakuum filtriert und der gewonnene Feststoff wird im Vakuum getrocknet und ergibt 0,36 g N-(2-Pyridyldithiopropionyl)biocytin mit einem Schmelzpunkt von 166-169ºC.
Das Produkt zeigt sich bei der TLC nahezu homogen (System n-Propanol:Wasser 7:3; Merck Silicagel-Platten 60 F-254) und zeigt eine einzeige UV-absorbierende, Iod-färbende Komponente. Bei Behandlung des Produktes mit überschüssigem 2-Mercaptoethylamin werden mehr als 90% des Pyridyldithiorestes freigesetzt, wie durch Spektraluntersuchung bestimmt wurde (λmax = 343 nm; &epsi;max = 7,06 x 10&sup4;). Das NMR-Spektrum in DMSO-D&sub6; zeigt charakteristische Paks für die Pyridylthio- und Biotinylreste.

Beispiel IX

Unter Anwendung der Methode von Beispiel III, jedoch unter Ersatz von Biotin-2-(2'-pyridyldithio)ethylamid durch N-(2-Pyridyldithiopropionyl)biocytin, wird ein mit dem letztgenannten Reagens biotinyliertes β-Galactosidaseenzym erhalten. Die gemessene Absorption der Reaktion, die auf die Freisetzung von 2-Pyridylthion zurückzuführen ist, entspricht einem Mittel von 12 nMol freigesetztem 2-Pyridylthion je nMol behandeltem Enzym.
Überschüssiges Biotinreagens wird aus dem biotinylierten Enzym durch Durchführen der Reaktionslösung durch eine Sephadex G-25-Säule, equilibriert mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, mit einem Gehalt an 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, abgetrennt. Die das biotinylierte Enzym enthaltenden Fraktionen werden durch A&sub2;&sub8;&sub0;-Proteinabsorption lokalisiert und gepoolt.

Beispiel X

Die in Beispiel IX erhaltene biotinylierte Enzymlösung wird nach der in Beispiel IV beschriebenen Vorgangsweise behandelt, um biotinylierte β-Galactosidase, immobilisiert auf Avidin-Agarose, zu erhalten.
Aus einer Gesamtmenge von 3,00 OD&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten von Biotin-markierter β-Galactosidase, die dem Avidin-Agarosegel zugesetzt worden ist, werden 2,60 OD&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten gebunden, was darauf hinweist, daß 86% des biotinylierten Enzyms auf der Kolonne zurückgehalten werden.

Beispiel XI

Das immobilisierte, Biotin-markierte β-Galactosidaseprodukt von Beispiel X wird nach der Vorgangsweise von Beispiel V behandelt, um unmarkierte β-Galactosidase zu erhalten.
Aus einer Gesamtmenge von 2,60 OD&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten des an das Avidin- Agarosegel gebundenen Enzyms wurden 1,84 OD&sub2;&sub8;&sub0;-Einheiten zurückerhalten, was darauf hinweist, daß 71% des Enzyms von der Kolonne abgespalten werden.

Claims

1. Eine Verbindung mit der Formel (I):

worin

x und y ganze Zahlen von 1 bis 5 darstellen,

n für 0 oder 1 steht,

R die Bedeutung -CONH- oder -CH(CO&sub2;H)NHCO- hat und

Z aus der aus 2-Pyridyl, 4-Pyridyl, 5-Nitro-2-pyridyl und 5-Carboxy- 2-pyridyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin Z für 2-Pyridyl oder 4-Pyridyl steht.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin

n = 0 bedeutet,

x + y = 2 darstellen und

Z = 2-Pyridyl ist: Biotin-2-(2'-pyridyldithio)-ethylamid.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin

n = 1 bedeutet,

x = 4 und y = 2 darstellen und

Z = 2-Pyridyl ist: N-(2-Pyridyldithiopropionyl)biocytin.

5. Verfahren zur Herstellung eines Biotinderivats eines thiolhaltigen Proteins, welches Verfahren die Stufen des Kontaktierens einer wäßrigen gepufferten Lösung des genannten Proteins mit einer Verbindung, wie in Anspruch 1 beansprucht, gelöst in einem organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 4 bis 9, und das Isolieren dieses Biotinderivats umfaßt.

6. Verfahren zur Gewinnung eines Komplexes eines Proteins mit einem Antikörper aus einem dieses Protein enthaltenden Gemisch, welches Verfahren umfaßt:

1) Zur-Verfügung-Stellen eines für das genannte Protein spezifischen Antikörpers;

2) Herstellen eines Biotinderivats dieses Antikörpers durch Inberührungbringen dieses Antikörpers mit einer Verbindung, wie in Anspruch 1 beansprucht; und

3 a) entweder Inberührungbringen dieses Biotin-derivatisierten Antikörpers mit immobilisiertem Avidin zur Erzielung eines immobilisierten Antikörpers;

4 a) Inberührungbringen dieses immobilisierten Antikörpers mit einem das Protein enthaltenden Gemisch zur Ausbildung eines immobilisierten Komplexes aus dem Protein und dem Antikörper; oder

3 b) Inberührungbringen eines Gemisches des Proteins mit dem Biotin-derivatisierten Antikörper zur Ausbildung eines Komplexes des Proteins mit dem Biotin-derivatisierten Antikörper;

4 b) Inberührungbringen des Komplexes mit immobilisiertem Avidin zur Gewinnung eines Avidin-gebundenen Komplexes; und

5) Behandeln dieses immobilisierten Komplexes mit einem Thiol, wodurch der Komplex von dem immobilisierten Avidin freigesetzt wird.