DE3629194A1 - Biotinylierungsreagentien - Google Patents

Description

Das Avidin-Biotin-System stellt ein wertvolles Hilfsmittel in der Molekular- und Zellbiologie dar. Die Vorteile dieses Systems sind ausführlich im Aufsatz von M. Wilchek und E. A. Bayer, Immunol. Today, Bd. 5 (1984), S. 39-43, erläutert. Diese Technik ist für eine Reihe von Untersuchungen eingesetzt worden, einschließlich Lokalisierung, Isolierung, Nachweis und Immunoassay von verschiedenen biologisch aktiven Verbindungen. Bei vielen dieser Anwendungen wird Biotin kovalent an ein Protein (z. B. Antikörper, Hormon, Lectin) gekuppelt. Das biotinylierte Protein wird sodann in das experimentelle System eingeführt und dieses der Wechselwirkung mit einer geeigneten avidinhaltigen Sonde ("probe") unterworfen; vgl. E. A. Bayer, M. Wilchek und S. Skutelsky, FEBS Lett., Bd. 68 (1976), Seiten 240-244.

Ein wichtiges Biotinylierungsmittel, nämlich Biotinyl-N- hydroxysuccinimidester (BNHS), wurde in starkem Umfang zur Biotinylierung von Proteinen über Amingruppen unter milden Bedingungen verwendet. Dieses Reagens wurde von uns für diesen Zweck vor über 10 Jahren eingeführt und stellt noch immer das zur Zeit gebräuchlichste Biotinylierungsmittel dar. Die weite Verbreitung dieses Reagens und die Tatsache, daß BNHS von Dutzenden von Firmen vertrieben wird, bestätigen dessen wertvolle Eigenschaften. In einigen Fällen, (z. B. wenn ein Lysinrest für die biologische Aktivität des Proteins wesentlich ist) kann jedoch BNHS für die Biotinylierung ungeeignet sein. Dieses Biotinylierungsreagens kann auch aufgrund einiger seiner physikalischen und molekularen Eigenschaften, z. B. aufgrund seiner raschen Hydrolyse und seiner begrenzten Löslichkeit in wäßrigen Lösungen, unzweckmäßig sein.

Aus diesem Grund entwickelten wir alternative Klassen von Reagentien für die Biotinylierung einer Reihe von funktionellen Gruppen. Eine dieser Klassen von Reagentien beruht auf einer Maleinimidgruppe, die kovalent an Biotin über ein geeignetes Abstandsstück gebunden ist. Maleinimidderivate wurden bereits früher als spezifische Thiolreagentien synthetisiert und in starkem Umfang für die Zwecke der Kolorimetrie, Fluorimetrie und Proteinmodifikation verwendet. Bei einer zweiten Reagentienklasse ist ein Hydrazidrest über ein geeignetes Abstandsstück an Biotin gebunden. Biotin-hydrazid (ohne Abstandsstück) kann für verschiedene Gruppen, unter Einschluß von Aldehyd-, Amino- und Carboxylgruppen, spezifisch gemacht werden. Dies gilt insbesondere für die Markierung von Kohlenhydraten, die nach chemischer Behandlung mit Galactose-Oxidase in Aldehydderivate umgewandelt werden können. Eine anschließende Umsetzung mit Biotin-hydrazin ergibt die spezifische Markierung des oxidierten Zuckers.

Wir stellten fest, daß die zwischen dem Biotin-hydrazid und dem Aldehyd-saccharid gebildete kovalente Bindung nicht immer gegenüber der Wechselwirkung mit Avidin stabil ist und daß die Bindung aufgrund physikalischen Kräfte, die durch die starke Wechselwirkung mit der tiefen, biotinbindenden Tasche innerhalb des aktiven Zentrums hervorgerufen wird, gespalten werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist es, Biotinylierungsreagentien zur Verfügung zu stellen, die nicht mit den vorgenannten Nachteilen behaftet sind.

Erfindungsgemäß wird die Verwendung von mit Biocytin-hydrazid verwandten Reagentien vorgeschlagen, bei denen eine ein Abstandsstück bildende Gruppe den Abstand zwischen dem Biotinrest und der Hydrazidfunktion erhöht. Aufgrund der erfindungsgemäßen Untersuchungen wurde festgestellt, daß die Anwesenheit einer α-Aminogruppe in Nachbarschaft zur Hydrazidgruppe dazu dient, sowohl die Stärke als auch die Stabilität der Bindung an den Aldehyd zu erhöhen. Eine dritte Klasse von Reagentien umfaßt biotinhaltige Vernetzungsmittel, die zwei zusätzliche reaktive funktionelle Gruppen enthalten. Vernetzungsmittel haben sich als ausgezeichnete Sonden zur Aufklärung von engen Nachbarschaftsbeziehungen vom Membranprotein-Untereinheiten erwiesen. Die Einverleibung des Biotinylrests in derartige Vernetzungsmittel ermöglicht die gleichzeitige, durch Avidin vermittelte Lokalisierungs-, Nachweis-, Test- und insbesondere Isolierungsmöglichkeit von einem oder beiden Zielmolekülen.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Intakte Zellen, wie Blutzellen, Hybridomazellen, Bakterien oder Hefen, gereinigte Membranfraktionen von derartigen Zellen, Zell- oder Subzellulärextrakte, sowie rohe oder gereinigte Proteine werden einer Behandlung mit den erfindungsgemäßen Biotinylierungsmitteln unterworfen. Diese erfindungsgemäßen Biotinylierungsmittel dienen dazu, das herkömmliche Biotinylierungsmittel (Biotinyl-N-hydroxysuccinimidester, BNHS) zu ergänzen oder zu ersetzen. Die erfindungsgemäßen Reagentien werden zum Nachweis, zur quantitativen Bestimmung, zur Vernetzung, zur Immobilisierung und/oder zur Isolierung der vorgenannten Bestandteile verwendet, wobei man sich im allgemeinen eines geeigneten Mittels zur Biotinidentifizierung bedient, z. B. einer avidinhaltigen, streptavidinhaltigen, antibiotin- oder antikörperhaltigen Sonde.

1. Maleinimidoderivate von Biotin

Es werden thiolspezifische Verbindungen bereitgestellt, die eine selektive Bindung mit -SH-Gruppen eingehen, die insbesondere in SH-haltigen Proteinen vorliegen. Diese neuen Verbindungen lassen sich folgendermaßen schematisch wiedergeben

A-B-C

wobei A eine terminale Biotingruppe oder ein Analoges oder Homologes davon bedeutet, B ein geeignetes Abstandsstück von entsprechender Länge bedeutet und C eine terminale Maleinimidogruppe bedeutet.

Beispiele für Biotinanaloge oder -homologe sind Homobiotin, Norbiotin, Bisnorbiotin, Iminobiotin, Dethiobiotin, Biotinsulfoxid oder Biotinsulfon. Eine große Auswahl von Abstandsstücken (sowohl spaltbare als auch nicht-spaltbare) können verwendet werden. Diese haben im allgemeinen keine spezielle Bedeutung für die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen. Beispiele für geeignete Abstandsstücke sind aliphatische Kohlenwasserstoffe, cyclische aliphatische Kohlenwasserstoffe, substituierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, substituierte aromatische Kohlenwasserstoffe, gemischt aliphatisch-aromatische Kohlenwasserstoffe, substituierte aliphatisch-aromatische Kohlenwasserstoffe, Monosaccharide, Di-, Oligo- und Polysaccharide, substituierte Kohlenhydrate, Aminosäuren, ω-Aminocarbonsäuren, Di-, Oligo- und Polypeptide, substituierte Aminosäuren und Peptide und dergleichen. Geeignete spaltbare Reagentien besitzen Abstandsstücke, die beispielsweise Disulfidgruppen (mit Thiolen spaltbar), Diazogruppen (mit Dithionit spaltbar), vicinale Hydroxylgruppen (mit Perjodat spaltbar) oder Esterbindungen (mit Basen spaltbar) enthalten.

Bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen umfaßt das Abstandsstück eine Mehrzahl von -CH₂-Gruppen und/oder Amidogruppen. Bei einer speziellen Gruppe von Verbindungen besitzt das Abstandsstück die allgemeine Formel worin x, y und z jeweils ganze Zahlen, die im allgemeinen einen Wert von 1 bis 5 haben, sind, und R -COOH oder einen die Wasserlöslichkeit herbeiführenden Rest bedeutet.

Nachstehend wird die Erfindung näher im Bezug auf die spezielle Verbindung der folgenden Formel erläutert:

Diese Verbindung ist ein Beispiel für die vorstehend definierte Gruppe von Verbindungen, deren SH-spezifische Aktivität und andere wichtige Eigenschaften durch die terminalen Biotin- und Maleinimidogruppen festgelegt werden.

Die Verbindungen dieser Gruppe sind thiolspezifisch und können zur Biotinylierung von SH-Gruppen verwendet werden, die in einer Reihe von Verbindungen vorliegen, von denen Proteine und insbesondere biologisch aktive Proteine, z. B. Enzyme, besonders wichtig sind. Die Biotinylierung läuft nach folgendem Schema ab:

Die vorstehend definierten Verbindungen können mit avidin- oder streptavidin-konjugierten Markern als thiolspezifische Sonden verwendet werden. Sie können zum Nachweis von Protein- SH-Gruppen mit einer Empfindlichkeit im Femtomolbereich verwendet werden. SH-haltige Proteine und insbesondere Enzyme, wie β-Galactosidase, können biotinyliert werden, wobei das Produkt als histochemische Sonde eingesetzt werden kann. Biotinylierte Enzyme werden vorteilhafterweise in Säulenform eingesetzt. Diese Enzyme zeichnen sich durch eine hohe biologische Aktivität aus.

2. Hydrazidderivate von Biotin

Eine zweite Klasse von Sonden betrifft zuckerspezifische Reagentien, die durch terminale Biotin- und Hydrazidofunktionen, die voneinander durch ein Abstandsstück getrennt sind, charakterisiert sind.

Diese Ausführungsform der Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Biocytin-hydrazid, bei dem Lysin als Abstandsstück verwendet wird, näher erläutert. Es kommen aber auch eine große Anzahl von anderen Abstandsstücken (wie sie vorstehend für die Maleinimidoderivate in Abschnitt 1 erläutert worden sind) in Frage:

Die Verbindungen der Klasse 2 können für Kohlenhydrate, Amine oder Carboxylgruppen spezifisch ausgestattet werden. Sie können zum Nachweis dieser funktionellen Gruppen mit einem hohen Spezifitätsgrad eingesetzt werden. Ferner können sie auch für Immobilisierungszwecke verwendet werden.

Es ist möglich, eine Bindung an RNA, DNA oder beliebig andere Nucleinsäuresequenzen über die terminale -NH₂-Gruppe der Hydrazidreagentien zu erreichen. Dies kann für verschiedene Anwendungszwecke beispielsweise für DNA-Sonden, ausgenutzt werden.

2.1 Makromoleküle mit Aldehydgruppen

Der Wechselwirkung zwischen Aldehyden (RCHO) und Hydrazidderivaten von Biotin (z. B. Biocytin-hydrazid) liegt folgendes chemisches Schema zugrunde:

(2.1a) RCHO + Biocytin-CONHNH₂ R-CH=N-NHCO-Biocytin

Der Aldehyd kann endogen zum Zielmolekül sein oder er kann auf chemischem Wege vor der anschließenden Umsetzung mit dem Biocytin- hydrazid eingeführt werden. Beispielsweise kann die Derivatbildung von Aminen durch Dialdehyde erfolgen, wie nachstehend unter 2.2b erläutert ist. Ferner können vicinale Hydroxylgruppen an Zuckern durch chemische Umsetzung mit Perjodat zu Aldehyden oxidiert werden. Die gleiche Reaktion ist auch relativ spezifisch für Sialinsäuren, wenn die Reaktionsbedingungen (Perjodatkonzentration, Temperatur) entsprechend eingestellt werden. Ferner können Galactosylreste selektiv durch enzymatische Behandlung mit Galactose-Oxidase zu Aldehyden oxidiert werden. Somit kommen praktisch alle Verfahren in Frage, bei denen ein gegebenes Zielmolekül selektiv so modifiziert werden kann, daß vor der Wechselwirkung mit einem geeigneten biotinhaltigen Hydrazid (z. B. Biocytin-hydrazid) Aldehydgruppen vorliegen.

Die gebildete Hydrazidgruppe, die das Biotin an die Zielmoleküle bindet, kann zusätzlich auf folgende Weise durch Reduktion, z. B. mit Borhydrid oder Cyanoborhydrid, stabilisiert werden:

2.2 Aminohaltige Makromoleküle

In Gegenwart eines geeigneten Oxidationsmittels, z. B. Permanganat, reagieren aminohaltige Makromoleküle (R-NH₂) auf folgende Weise mit Hydraziden:

Ein aminohaltiges Makromolekül kann auch durch Einwirkung eines Überschusses an einem Dialdehyd gemäß folgender Gleichung in einen Aldehyd übergeführt werden:

Die Bindung des biotinhaltigen Hydrazids wird durch die vorstehend für Aldehyde beschriebene weitere Behandlung (Abschnitt 2.1) erreicht.

2.3 Carboxylhaltige Makromoleküle

In Gegenwart eines Carbodiimids reagieren Carboxylgruppen mit Hydraziden auf folgende Weise:

In diesem Fall dient die funktionelle Hydrazidgruppe am Biocytin als nucleophiles Reagens.

3. Biotinhaltige Vernetzungsmittel

Bei einer dritten Klasse von Sonden handelt es sich um trifunktionelle Reagentien der Formel worin A, B und C die in Abschnitt 1 definierten Bedeutungen haben und D eine beliebige funktionelle Gruppe darstellt oder diese enthält, bei der es sich um eine von Natur aus reaktive Gruppe oder eine Gruppe handelt, die anschließend durch geeignete Mittel, beispielsweise auf biochemischem, chemischem, photochemischem oder physikalischem Wege aktiviert werden kann. Die Vernetzungsmittel sind durch Biotin und zwei andere gruppenspezifische funktionelle Gruppen (entweder homobifunktionell, z. B. Di-N-hydroxysuccinimid, oder heterobifunktionell, z. B. Maleinimid und Hydrazid) charakterisiert, die durch ein geeignetes Abstandsstück getrennt sind, das entweder in einer oder zwei Stellungen spaltbar oder nicht-spaltbar ist, wie es für die Maleinimidoderivate in Abschnitt 1 beschrieben worden ist. In diesem Fall stellt das Abstandsstück zwei alternative Positionen zur Verfügung, an denen Substitutionen von reaktiven Gruppen erfolgen können. Beispiele für geeignete Abstandsstücke sind Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide und deren substituierte Derivate, bestimmte natürlich vorkommende und synthetische Aminosäuren (z. B. Lysin, Ornithin, Asparaginsäure und Glutaminsäure), Dipeptide (Glycyl-glutaminsäure, Glycyl-lysin) oder Oligopeptide. Bezüglich der spaltbaren Reste gelten die vorstehenden Ausführungen.

Für diese Ausführungsform der Erfindung kommt eine große Anzahl von Abstandsstücken und funktionellen Gruppen in Frage. Nachstehend wird die Erfindung in Bezug auf heterobifunktionelle reaktive Gruppen unter Verwendung von 3-(N-Maleinimido-propionyl)-biocytin-hydrazid und die entsprechenden Maleinimido-biocytin-N-hydroxysuccinimid- oder -N-hydroxysulfosuccinimidester näher beschrieben.

α-N-Biotinyl-L-glutamyl-di-(N-hydroxysuccinimid) und -di-(N- hydroxysulfosuccinimid)-ester werden zur Erläuterung von homobifunktionellen Reagentien verwendet.

Die heterobifunktionellen Verbindungen der Klasse 3 sind aufgrund der Maleinimidogruppen für SH-Gruppen und aufgrund der N-Hydroxysuccinimidogruppen für Amine spezifisch oder können über die Hydrazidfunktion. für Kohlenhydrat-, Amino- oder Carboxylgruppen spezifisch gemacht werden. Sowohl die homotrifunktionellen als auch die heterotrifunktionellen Verbindungen können zur Vernetzung von zwei unterschiedlichen Makromolekülarten verwendet werden. Die biotinylierten vernetzten Makromoleküle können unter Verwendung eines geeigneten Identifizierungsmittels für Biotin (z. B. avidinhaltige Sonden) isoliert, nachgewiesen oder quantitativ bestimmt werden. Beim vernetzten Proteinpaar kann es sich um Antikörper-Antikörper, Antikörper-Enzym, Enzym-Enzym, Lecitin-Lecitin, Lecitin-Enzym oder Antikörper-Toxin handeln. Diese Konjugate eignen sich beispielsweise für Immunoassays, Enzymreaktionen, insbesondere solche, bei denen aufeinanderfolgende Reaktionen stattfinden (z. B. Kaskaden).

Die Biotinylmarkierung kann an einer Reihe von Zielmakromolekülen und an einer Reihe von Zellen vorgenommen werden.

Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Herstellung von Biocytin bereitgestellt.

Die vorstehend genannten und zusätzliche Aspekte der Erfindung werden durch die folgenden Erläuterungen des erfindungsgemäßen Prinzips näher beschrieben. Dabei wird nochmals betont, daß der Schutzumfang der Erfindung eine große Gruppe von Verbindungen, die vorstehend als Verbindungen vom definiert worden ist, sowie verschiedene Anwendungszwecke dieser Verbindungen umfaßt, die vorstehend angegeben worden sind und im folgenden näher erläutert werden.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung Materialien

Die folgenden Chemikalien, Biochemikalien und Proteine wurden von der Firma Sigma bezogen: 3,3′-Diaminobenzidin, Dithiothreit (DTT), 5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB), p-Dimethylaminozimtaldehyd (DMACA), O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG), 5-Brom-4-chlor-3-indylyl-β-galactopyranosid (XGal), N-Äthylmaleinimid (NEM), Cystein-hydrochlorid, Peroxidase (aus Meerrettich) (HRP), β-Galactosidase, Rinderserumalbumin (BSA), Aldolase und Ovalbumin. Chymotrypsinogen wurde von der Firma Worthington bezogen. Das Nitrocellulosepapier (0,45 µm) war ein Produkt der Firma Schleicher und Schuell. Handelsübliches Avidin wurde an einer Iminobiotin- Sepharose-Säule gemäß G. A. Orr, J. Biol. Chem., Bd. 256 (1981), Seiten 761 bis 766 weiter gereinigt. Sepharose-avidin (1,5 mg Avidin pro 1 g Sepharose) und Biotinyl-N-hydroxysuccinimidester (BNHS) wurden gemäß den vorstehenden Angaben hergestellt (E. A. Bayer und M. Wilchek, Methods Biochem. Anal., Bd. 26 (1980), Seiten 1-45). 3-(N-Maleinimido-propionyl)- N-hydroxysuccinimidester wurde gemäß dem Verfahren von Keller und Rudinger (Helv. Chim. Acta, Bd. 58 (1975), Seiten 531- 541) hergestellt.

Herstellung von Biocytin-hydrochlorid

1,2 g Kupfer(II)-carbonat wurden zu 10 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt an 350 mg Lysin-hydrochlorid gegeben. Die Lösung wurde 5 Minuten in einem Becherglas auf 100°C erwärmt. Der Niederschlag wurde abfiltriert. Das erhaltene blaue Filtrat wurde in einem Eisbad gekühlt. Die Lösung wurde mit 645 mg (1,9 mMol) BNHS in 5 ml Dimethylformamid versetzt. Nach Zugabe von 400 mg festem Natriumhydrogencarbonat ließ man die Reaktion 4 Stunden in einem Eisbad fortsetzen. Der blaue Niederschlag wurde zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Dekantieren entfernt. Das Produkt wurde nacheinander mit Wasser und Äthanol gewaschen und sodann mit Diäthyläther getrocknet. Man erhielt 670 mg (87% d. Th.) Produkt.

Das blaue Pulver wurde in 10 ml 0,1 n HCl gelöst. H₂S wurde eingeleitet, bis kein weiterer Niederschlag mehr auftrat. Sodann wurde das Gemisch im Abzug erwärmt, um das feste CuS zu koagulieren. Der Niederschlag wurde filtriert. Das restliche H₂S wurde durch Abdampfen entfernt. Die erhaltene klare Lösung wurde lyophilisiert. Man erhielt 580 mg (75% d. Th.) Produkt. Die Aminosäureanalyse des hydrolysierten Produkts ergab eine äquivalente Menge Lysin. Bei der Dünnschichtchromtographie an Kieselgel erhielt man einen einzigen Fleck, der mit handelsüblichem Biocytin (Sigma) identisch war und einen R_f-Wert von 0,2 (Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 1 : 1) aufwies, wobei unter Verwendung eines Ninhydrin- oder p-Dimethylaminozimtaldehyd (DMACA)-Sprays (D. B. McCormick und J. A. Roth, Methods Enzymol., Bd. 18A (1970), Seiten 383-385) keine Verunreinigungen sichtbar waren.

Herstellung von Reagentien für die Biotinmarkierung von Sulfhydrylverbindungen 1. Herstellung von 3-(N-Maleinimido-propionyl)-biocytin (MPB)

70 mg 3-(N-Maleinimido-propionyl)N-hydroxysuccinimidester in 1 ml Dimethylformamid wurden zu 1 ml einer Lösung von 107 mg Biocytin-hydrochlorid in 0,5 m NaHCO₃ getropft. Die Umsetzung wurde 2 Stunden lang durchgeführt. Anschließend wurde die Lösung mit 1 n HCl angesäuert. Man ließ das Produkt bei 4°C kristallisieren. Die Kristalle wurden mit kalter 0,1 n HCl gewaschen und sodann mit Diäthyläther getrocknet. Man erhielt 80 mg (60% d. Th.) Produkt.

MPB erschien bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Chloroform/Methanol (1 : 1 Vol./Vol) als Laufmittel als einziger Flecken (R_f-Wert 0,3). Das Produkt konnte durch p-Dimethylaminozimtaldehyd (DMACA), Joddampf oder durch Brennen der Dünnschichtplatte nachgewiesen werden. Um die Reaktivität des Fleckens gegen Sulfhydrylverbindungen zu testen, wurde ein 5-facher molarer Überschuß an Dithiothreit (DTT) mit MPB umgesetzt. Das freie Sulfhydrylderivat MPB-SH wurde gebildet. Nicht-umgesetztes Dithiothreit (DTT) (R_f-Wert 0,9) wurde vom Sulfhydryladdukt (R_f-Wert 0,35) mit dem vorstehenden dünnschichtchromatographischen System abgetrennt. Sowohl Dithiothreit (DTT) als auch MPB-SH wurden mit 5,5′-Dithiobis- (2-nitrobenzoesäure) (DTNB)-Spray (0,1% in Äthanol/ 0,1% NaHCO₃, 1 : 1 Vol./Vol.) nachgewiesen. Mit dem p-Dimethyl- aminozimtaldehyd (DMACA)-Spray war nur das biotinhaltige Derivat nachweisbar.

2. Herstellung von anderen Maleinimido-biocytin-derivaten

Andere Maleinimidoderivate von Biocytin wurden auf ähnliche Weise unter Verwendung handelsüblicher aliphatischer oder aromatischer Maleinimido-N-hydroxysuccinimidester hergestellt. Die aromatischen Derivate sind weniger löslich und daher von geringerer Wirksamkeit. Seit kurzem ist 4-(N-Maleinimido- butyryl)-N-hydroxysuccinimidester im Handel erhältlich (Firma Calbiochem.). Das aus der Butyrylverbindung hergestellte Biocytinderivat verhält sich ähnlich wie MPB.

3. Biotinylierung von β-Galactosidase über Cysteine: B(S)BG

1 mg β-Galactosidase wurde in 0,1 ml Kochsalzlösung gelöst. Eine Lösung von 0,9 ml MPB (26 µg/ml in PBS) wurde zugesetzt. Nach 2 Stunden bei 25°C wurde das biotinylierte Enzym gründlich gegen PBS dialysiert. B(S)BG wurde sodann durch Passage über ein Millipore-Filter (HAO.2µ) sterilisiert und bei 4°C gelagert.

4. Biotinylierung von β-Galactosidase über Amine: B(N)BG

1 mg β-Galactosidase wurde in 1 ml 0,1 n NaHCO₃ gelöst. Eine Lösung von 11 µl BNHS (3,4 mg/ml in Dimethylformamid) wurde zugesetzt. Nach 1-stündiger Umsetzung bei 25°C wurde das biotinylierte Enzym gründlich gegen PBS dialysiert. B(N)BG wurde sodann ebenso wie B(S)BG gelagert.

5. Herstellung von anderen biotinylierten Enzymen

Biotinyl-BSA und Biotinyl-Peroxidase wurden gemäß bekannten Verfahren (Bayer & Wilchek, a. a. O. (1980), J. L. Guesdon, T. Ternynch und S. Avrameas, J. Histochem. Cytochem. Bd. 27 (1979), Seiten 1131 bis 1139) hergestellt. Ein Molverhältnis 15 : 1 für BNHS/BSA und von 20 : 1 für BNHS/Peroxidase wurde angewandt.

6. Herstellung von Avidin : Biotinyl-Peroxidase-Komplexen

Gleiche Volumina mit einem Gehalt an 13 µg/ml Avidin und 1 µg/ml Biotinyl-peroxidase (beide aus entsprechenden Vorratslösungen mit 2% BSA in PBS verdünnt) wurden vereinigt. Die Komplexe wurden vor der Verwendung 30 Minuten bei 25°C auf einem Reziprokschüttler (100 Bewegungen/min) inkubiert.

Enzymtests β-Galactosidase-Testsystem

Die β-Galactosidase-Aktivität wurde in Lösung unter Verwendung von o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid als Substrat (20 mg, gelöst in 30 ml PBS unter Zusatz von 100 mg Dithiothreit) gemessen. Äquivalente Mengen (60 ng pro Vertiefung) an biotinyliertem oder nicht-derivatisiertem Enzym wurden in Mikrotiterplatten bestimmt. Die Vertiefungen wurden wiederholt (alle 10 Minuten) unter Verwendung eines EL-310 EIA- Lesegeräts (Bio-Tek Instrument, Inc., Burlington, VT) abgelesen.

Zum enzymatischen Nachweis von β-Galactosidase auf Tüpfelblots wurde die gleiche Testlösung verwendet, mit der Abänderung, daß 5-Brom-4-chlor-3-indylyl-β-D-galactopyranosid (20 µg gelöst in 0,5 ml Dimethylformamid) anstelle von o-Nitrophenyl- β-D-galactopyranosid verwendet wurde.

Peroxidase-Testsystem

Die Peroxidase-Aktivität auf Tüpfelblots wurde mit einer 3,3′-Diaminobenzidin-Lösung (50 mg gelöst und in 100 ml PBS), die mit Wasserstoffperoxid (15 µl, 30prozentige Lösung) versetzt worden war, nachgewiesen.

Protein-Blotting

Protein-Blots wurden gemäß J. M. Gershoni und G. E. Palade, Anal. Biochem., Bd. 131 (1983), Seiten 1 bis 15, durchgeführt.

Reihenverdünnungen (wie nachstehend erläutert) der Proteinlösungen wurden als 1 µl-Aliquotanteile auf vorgeschnittene (2 × 3,5 cm) Nitrocellulosestreifen aufgebracht. Die Streifen (Tüpfelblots) wurden bei 25°C getrocknet. Die anschließenden Behandlungen (2 ml der benötigten Lösung) wurden in kompartimentierten Polystyrolbehältern (Althor Products; Wilton, CT) durchgeführt. Sofern nichts anderes angegeben ist, erfolgten sämtliche Inkubationen bei 25°C.

Experimentelle Anwendung der Biotinmarkierung über Sulfhydrylgruppen 1. Selektiver Nachweis von Sulfhydryl- und Disulfidgruppen in Proteinen Sulfhydrylfärbung

Geblottete Proteine wurden 1 h mit einer Lösung von MPB (6 µg/ml PBS) behandelt. Die Streifen wurden mit PBS gespült und 1 Stunde mit 2% BSA (in PBS) gequencht. Nach kurzem Spülen mit PBS wurden Avidin : Biotinyl-Peroxidase-Komplexe zugesetzt, und die Streifen wurden weitere 45 Minuten inkubiert. Sodann wurden die Streifen gründlich mit PBS gespült und mit einer Lösung von Peroxidasesubstrat versetzt. Die Flecken erschienen üblicherweise innerhalb von 5 Minuten. Die Streifen wurden getrocknet, auf einem Blatt Whatman III-Papier befestigt und zwischen einer gefalteten Aluminiumfolie gelagert.

Disulfidfärbung

Geblottete Proteine wurden mit einer Lösung von N-Äthylmaleinimid (1 mg in 1 ml PBS) 1 Stunde behandelt, um freie Cysteinyl-SH-Gruppen zu blockieren. Die Streifen wurden gründlich mit PBS gespült. Die Cystinyl-S-S-Gruppen wurden 1 h mit einer 2-prozentigen Lösung von β-Mercaptoäthanol reduziert. Die Streifen wurden gründlich mit PBS gespült und sodann nacheinander mit MPB und Avidin-Enzym-Komplexen behandelt wie vorstehend für die Sulfhydrylfärbung erläutert worden ist.

Die Direktfärbung von geblotteten Proteinen mit MPB ermöglichte deren anschließenden histochemischen Nachweis nach Behandlung mit Avidin-Enzym-Komplexen (Fig. 1). Nur Proteine mit freien Cysteinresten wurden bei diesem Verfahren markiert. Beispielsweise wurde Chymotrypsinogen (dessen Cysteinreste nicht an Disulfidbrücken beteiligt sind) auf Blots auch bei einer wesentlich höheren Konzentration (1 µg/µl) als der in Fig. 2 nicht markiert. Die Nachweisempfindlichkeit scheint proportional zur Anzahl der freien Sulfhydrylgruppen eines gegebenen Proteins zu sein. Somit konnten Aldolase und β-Galactosidase (R. Cecil, in The Proteins, 2. Aufl., Herausgeber H. Neurath, Bd. 1 (1963), Academic Press, New York, Seiten 379 bis 476; A. V. Fowler und I. Zabin, J. Biol. Chem., Bd. 253 (1978), Seiten 5521-5525), die beide zahlreiche freie Cysteinreste tragen, in Proteinkonzentrationen von weniger als 1 ng/µl nachgewiesen werden. Ovalbumin (etwa 3 SH-Gruppen/ Molekül) war bei Konzentrationen von nur 3 ng/µl sichtbar. Das Verfahren ist anscheinend sehr empfindlich, da BSA, das gemäß R. E. Benesch, H. A. Lardy und R. Benesch, J. Biol. Chem., Bd. 216 (1955), Seiten 663-676 durchschnittlich nur 0,7 freie SH-Gruppen aufweist, ebenfalls bei einer Konzentration von etwa 10 ng/µl sichtbar war.

Das Verfahren eignet sich auch für den spezifischen Nachweis von Disulfidbrücken. Durch Blockieren von endogenen SH-Gruppen mit N-Äthylmaleinimid konnten Disulfidgruppen reduziert und die erhaltenen Sulfhydrylreste unter Verwendung von MPB nachgewiesen werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens blieb Aldolase ungefärbt, was zeigt, daß die freien Sulfhydrylgruppen von Aldolase vollständig mit N-Äthylmaleinimid blockiert wurden, während bei der Behandlung mit Mercaptoäthanol keine freien Sulfhydrylgruppen freigelegt wurden. Somit sind in Aldolase keine Disulfidbrücken vorhanden. Im Gegensatz dazu wurde Chymotrypsinogen durch Behandlung mit MPB nicht direkt markiert (keine freien Cysteinreste), wogegen es beim letztgenannten Verfahren stark markiert wurde, was die veröffentlichten Daten (R. Cecil, a. a. O., 1963) bestätigte, daß sämtliche fünf Cysteinpaare an Disulfidbrücken beteiligt sind. BSA, das mit MPB direkt schwach markiert wurde, ergab bei diesem Verfahren eine starke Disulfidmarkierung, was auf dessen 17 Cystinreste zurückzuführen ist (I. M. Koltoff, A. Anatasi und B. H. Tan, J. Am. Chem. Soc., Bd. 80 (1958), Seiten 3235 bis 3240).

2. Immobilisierung von biotinyliertem Enzym an Sepharose-Avidin

MPB kann als mildes Reagens zur Biotinylierung von Proteinen mit freien Sulfhydrylgruppen verwendet werden. Für diesen Zweck wurde β-Galactosidase aufgrund ihrer zahlreichen freiliegenden Cysteinreste (A. V. Fowler und I. Zabin, J. Biol. Chem. Bd. 253 (1978), Seiten 5521 bis 5526) und Reaktivität mit MPB (Fig. 2) gewählt. β-Galactosidase wurde daher über seine Cysteinreste unter Verwendung von MPB oder über seine Aminoreste mit BNHS biotinyliert. Die erhaltenen Enzympräparate, nämlich B(S)BG bzw. B(N)BG, wurden einer weiteren Prüfung unterzogen.

Beide biotinylierten Enzyme behielten den Großteil ihrer ursprünglichen Aktivität:B(S)BG blieb zu mehr als 75% aktiv und B(N)BG zu etwa 60%. Beide Enzyme wurden nach Lagerung bei -20°C inaktiviert B(S)BG partiell und B(N)BG total; nichtderivatisierte β-Galactosidase wurde bei diesen Lagerungsbedingungen nicht beeinträchtigt). Wir empfehlen daher die Lagerung der biotinylierten Proteine bei 4°C unter sterilen Bedingungen und/oder in Gegenwart von Azid.

Immobilisierungsverfahren

Eine Suspension (50 µl gepackte Sepharose pro Probe) von Sepharose-Avidin wurde zweimal mit PBS durch Zentrifugation gewaschen. 1 ml der entsprechenden Enzyme (20 µg/ml von β-Galactosidase, B(S)BG oder B(N)BG wurde zugesetzt. Die Suspension wurde 1 h bei 25°C unter Schütteln (100 Bewegungen/min) inkubiert. Die Proben wurden dreimal mit 1 ml PBS gewaschen. Die flüssigen Überstände wurden gewonnen. Das Sepharose- Pellet wurde in 1 ml Volumen resuspendiert. Die jeweiligen Proben (d. h. die ursprünglichen Enzymlösungen, die einzelnen Waschflüssigkeiten und die gewaschenen, resuspendierten, immobilisierten Enzymproben wurden alle auf ihre enzymatische Aktivität unter Verwendung der o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid- Substratlösung untersucht. Nach Inkubation der jeweiligen biotinylierten Enzyme mit Sepharose-Avidin wurde B(S)BG vollständig auf der festen Matrix immobilisiert (Fig. 2). Das immobilisierte Enzym behielt die gesamte ursprüngliche Ativität des ungebundenen Enzyms. Das immobilisierte Enzym konnte bei 4°C (in Gegenwart von Azid) gelagert werden und zeigte keine signifikante Freisetzung vom Affinitätsharz (etwa 0,5% pro Woche). Unter den gleichen Bedingungen wurde B(N)BG nur partiell an Sepharose-Avidin immobilisiert. Mehr als 10% wurden pro Woche von der Säule freigesetzt, wenn das immobilisierte Enzym bei 4°C gelagert wurde.

3. Verwendung von B(S)BG als Enzymmarkierung

Biotinylierte Enzyme sind für verschiedene histochemische und cytochemische Techniken geeignet und wurden als Markierungen in enzymgebundenen Tests, beim Proteinblotting und für pathologische Nachweise verwendet (Wilchek & Bayer, a. a. O., 1984). Um die Anwendbarkeit des MPB-gestützten Systems für diesen Zweck zu erläutern, verwendeten wir das vorstehend beschriebene B(S)BG-Präparat zum Nachweis von auf Tüpfelblots immobilisiertem Biotinyl-BSA. Avidin wurde zur Überbrückung der beiden biotinylierten Proteine verwendet.

B(S)BG-Färbung von biotinylierten Proteinen

Tüpfelblots mit einen Gehalt an Reihenverdünnungen von B-BSA wurden 1 h mit 2% BSA gequencht. Nach einer kurzen PBS-Spülung wurde eine Avidinlösung (13 µg/ml in 2% BSA/PBS) zugesetzt. Die Streifen wurden 45 min inkubiert, gründlich mit PBS gespült und 1 h in einer Lösung von B(S)BG (30 µg/ml in 2% BSA/PBS) inkubiert. Die Streifen wurden weiter gespült, und die β-Galactosidase-Substratlösung wurde zugesetzt. Die Flecken erreichten nach einer Inkubationsdauer von 2 h ihre maximale Intensität.

Wie in Fig. 3 gezeigt, ergab dieses System eine untere Auflösungsgrenze von etwa 10 pg/µl Biotinyl-BSA. Die in Fig. 4A dargestellten Ergebnisse zeigen ein stufenweises System, bei dem getrennte Lösungen von Avidin und B(S)BG nacheinander auf die Tüpfelblots aufgesetzt wurden. Wir versuchten auch die Markierung von Biotinyl-BSA unter Verwendung von vorher hergestellten Avidin : B(S)BG-Komplexen. In diesem Fall waren die Empfindlichkeit und die Intensität des Signals merklich geringer als beim stufenweisen System (Fig. 3B).

Diskussion

Die Thiol- oder Sulfhydrylgruppe kann aufgrund ihrer nucleophilen Beschaffenheit mit zahlreichen elektrophilen Gruppen reagieren. Diese Eigenschaft hat viele Forscher dazu angeregt, eine Reihe von unterschiedlichen thiolspezifischen Reagentien zu entwerfen. Darunter finden sich Reagentien (sowohl löslich als auch immobilisiert) mit einem Gehalt an Halogenacetylgruppen, Disulfidgruppen, Quecksilbergruppen und Maleinimiden. In einem neueren Übersichtsartikel über das Avidin-Biotin-System (Bayer & Wilchek, a. a. O., 1980) traten wir für die Verwendung von Biotinderivaten mit einem Gehalt an den drei erstgenannten thiolspezifischen Funktionen ein. Bei Biotinyl-Quecksilber- und -Thiolderivaten handelt es sich um reversible Reagentien, die unserer Erfahrung nach offensichtlich von modifizierten, thiolhaltigen Makromolekülen nach Wechselwirkung mit Avidin dissoziiert werden (auch mit Mercaptoäthanolbehandlung). Das Halogenacetylderivat ist trotz der Stabilität der abgeleiteten Verbindungen nicht selektiv genug und tritt in Wechselwirkung mit anderen funktionellen Gruppen (z. B. Lysin, Histidin) an Proteinen (M. Wilchek und D. Givol, Methods Enzymol., Bd. 46 (1977), Seiten 153 bis 157). Andererseits ist von Maleinimidreagentien bekannt, daß sie relativ selektiv für Thiole sind und stabile Bindungen gewährleisten. Wir entschieden uns daher zur Synthese des Biotinylderivats MPB, das diese Funktion enthält.

Dieses Reagens ist durch verschiedene Vorteile charakterisiert. MPB ist bei Lagerung bei 4°C mindestens 3 Jahre stabil. Aufgrund seiner freien Carboxylgruppe ist MPB in wäßrigen Lösungen löslich und für Zellmembranen undurchgängig. Maleinimide sind in wäßrigen Lösungen nicht labil. Unter physiologischen Bedingungen ist das Reagens praktisch unreaktiv, bis eine zur Verfügung stehende SH-Gruppe in die Nähe kommt. Ein weiterer Vorteil dieses Reagens für die Biotinylierung von Proteinen besteht darin, daß MPB mit freien SH- Gruppen, die in zahlreichen Proteinen vorliegen, und häufig für deren Aktivität nicht erforderlich sind, reagiert. Das Reagens weist ein langes Abstandsstück (bestehend aus einer Lysin- und einer Propyl- oder Propionylgruppe) auf und ist daher für die tiefe biotinbindende Tasche, die das Avidinmolekül charakterisiert (M. N. Green, Adv. Protein Chem., Bd. 29 (1975), Seiten 85- 133, D. Scott, D. E. Nitecki, H. Kindler und J. W. Goodman, Molec. Immunol., Bd. 21, (1984), Seiten 1055-1060) leicht zugänglich. Dies wurde klar durch unseren Befund belegt, daß B(S)BG (über Cystein biotinyliert) eine stabilere Wechselwirkung mit Sepharose-Avidin eingeht, als dies bei B(N)BG (über Lysin biotinyliert) der Fall ist. Es ergab sich auch klar aus unseren früheren Untersuchungen, daß die BNHS-Derivatbildung von Proteinen selten zu einer 100prozentigen Adsorption an avidinhaltigen Matrices führt (Bayer et al., a. a. O., 1976). Finn et al. (F. M. Finn, G. Titus, D. Horstmann und K. Hofmann, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), Seiten 7328 bis 7332) wiesen ebenfalls klar nach, daß die direkte Bindung von BNHS an ein Protein nicht immer zur Bindung an eine Avidinsäule ausreicht. Ihre Untersuchungen über den Insulinrezeptor unter Verwendung des biotinylierten Hormons zeigten, daß ein Aminocaproyl-Abstandsstück sowohl für eine wirksame Immobilisierung als auch zu einem Schutz gegen ein Austreten des derivatisierten Hormons aus der Avidinsäule wesentlich ist.

Maleinimide mit einem Gehalt an verschiedenen Chromophoren (einschließlich fluoreszierende und kolorimetrische) wurden bisher für die Modifikation und Bestimmung von Thiolen verwendet. In vorhergehenden Untersuchungen in Verbindung mit unseren früheren Arbeiten unter Verwendung von Enzymhydraziden zum Nachweis von Kohlenhydraten (M. H. Gershoni, E. A. Bayer und M. Wilchek, Anal. Biochem., Bd. 146 (1985), Seiten 59 bis 63) stellten wir Maleinimidoenzyme her, jedoch reagierten diese mit Protein-SH-Gruppen nur mit geringer Empfindlichkeit (E. A. Bayer und M. Wilchek, unveröffentlichte Ergebnisse). Wir kehrten daher zu MPB zurück, durch das außergewöhnlich niedere Nachweisgrenzen erreicht werden konnten. Wir wählten die Verwendung von enzymkonjugiertem Avidin als Sonde, da unsere neueren Untersuchungen (F. Kohen, E. A. Bayer, M. Wilchek et al., in Analytical Applications of Bioluminescence and Chemiluninescence, Herausgeber L. J. Kricka, P. E. Stanley, G. H. G. Thorpe und T. P. Whitehead, Academic Press, New York, 1984, Seiten 149 bis 158) ergaben, daß bei Verwendung der letztgenannten Sonden Empfindlichkeiten erreicht werden können, die denen unter Verwendung von radioaktiven Markierungen ähnlich sind. In der vorliegenden Untersuchung können wir SH-enthaltende Proteine in Konzentrationen von weniger als 1 ng/µl nachweisen, was Femtomolkonzentrationen von zur Verfügung stehenden freien Thiolen entspricht.

Neben dem offenkundigen Verstärkungsfaktor gewährleistet die kombinierte Wirkung von MPB mit einer Reihe von Sonden auf Avidinbasis ein äußerst vielseitiges Hilfsmittel. Somit verkörpert ein Thiolreagens von Natur aus sämtliche möglichen Sondenarten (d. h. fluoreszierend, radioaktiv-markiert, Elektronendichte oder enzymatische Konjugate von Avidin) für sämtliche Zwecke.

Als ein Modell für unsere Untersuchungen wählten wir β-Galactosidase, da dieses Enzym zahlreiche freie SH-Gruppen enthält, von denen die meisten für die biologische Aktivität nicht kritisch sind. Das gleiche Enzym konnte daher als SH- enthaltendes Zielprotein, als SH-enthaltendes Enzym und schließlich als Marker oder Sonde verwendet werden. Die verbesserten Eigenschaften des MPB-markierten Enzyms gegenüber den entsprechenden BNHS-Derivaten zeigen klar, daß das erfindungsgemäße Reagenz in zahlreichen Fällen für die Biotinylierung von Proteinen sehr vorteilhaft ist. Das Verfahren sollte zusätzliche Anwendungsmöglichkeiten durch vorherige Thiolylierung (z. B. über Homocystein-thiolacton) unter anschließender, auf MPB gestützter Biotinylierung finden. Dies führt sowohl zu einer Zunahme der Anzahl an Biotingruppen als auch zu einem weiteren Herausragen des Biotinrests aus der Proteinoberfläche. MPB kann daher als wertvolle Ergänzung zu BNHS und in vielen Fällen als bevorzugtes Reagens eingesetzt werden. Mehr als 10 Jahre nachdem Biotin zur Modifikation von Proteinen verwendet worden ist, fehlt noch immer ein einfaches, zuverlässiges und empfindliches Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl von Biotinresten pro derivatisiertem Protein. In der Vergangenheit beruhten die meisten derartigen Bestimmungen auf der Wechselwirkung (Bindung) des biotinylierten Proteins mit Avidin. Jedoch beeinträchtigen sterische Probleme sowie das Vorhandensein von mehreren reaktiven Zentren an Avidin dessen Verwendung für quantitative Zwecke. Andererseits kann das Ausmaß der durch MPB induzierten Biotinylierung von SH-Gruppen an Proteinen leicht verfolgt werden, indem man Ellman's-Reagens oder beliebige fluoreszierende oder kolorimetrische Maleinimide verwendet. In Anbetracht von Spezifität, Einfachheit und zweckmäßigen Moleküleigenschaften von MPB sehen wir breit gefächerte Anwendungsmöglichkeiten bei Enzymimmunoassys, Proteinblottings, Zellsortierungen und verschiedenen cytochemischen Verfahren (Elektronen-, Fluoreszenz- und Lichtmikroskopie) unter Einschluß der direkten Markierung von Zelloberflächen-Thiolen und -Disulfiden.

Erläuterung der Markierung von Kohlenhydraten Herstellung von Biocytin-hydrazid

5 ml Methanol werden in einem Eiswasser/Aceton-Bad mit 0,5 ml Thionylchlorid versetzt. 200 mg Biocytin werden zugegeben. Anschließend wird das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt. Sodann wird das Lösungsmittel auf ein minimales Volumen verringert. Wasserfreier Diäthyläther wird zugesetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit wasserfreiem Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck über NaOH getrocknet. Der R_f-Wert des Produkts beträgt 0,48 bei Verwendung des vorgenannten Dünnschichtchromatographie- Laufmittelsystems.

100 mg Biocytin-Methylester werden in 2 ml Methanol gelöst und mit 0,1 ml Hydrazin-hydrat versetzt. Nach 48 h bei 25°C wird das Lösungsmittel zur Trockene eingedampft. Eine weitere Trocknung wird in einem Exsikkator unter vermindertem Druck in Gegenwart von H₂SO₄ vorgenommen, bis sich kein Hydrazingeruch mehr nachweisen läßt. Das Produkt wird in 1 ml Wasser gelöst und über eine mit Porapak Typ Q gepackte Säule (4 × 1 cm) gegeben. Die Säule wird mit Wasser eluiert. 2 ml-Fraktionen werden gesammelt. Die ersten Fraktionen enthalten im allgemeinen das restliche Hydrazin-hydrochlorid. Für eine vollständige Entfernung des Hydrazins ist zu sorgen, da dieses mit Aldehyden reagiert und somit eine wirksame Kupplung des Hydrazinreagens verhindert. Die das Biocytin-hydrazid (R_f-Wert 0,11 bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Methanol als Laufmittel) enthaltenden Fraktionen werden durch Ansprühen mit Dimethylaminozimtaldehyd und Ninhydrin nachgewiesen. Um die Elution des Hydrazids zu beschleunigen, wird die Säule im Anschluß an den Hydrazinpeak mit 80prozentigem wäßrigem Methanol eluiert. Die Fraktionen werden dabei in einem scharfen Peak eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, zur Trockene eingedampft, in einer möglichst geringen Menge Methanol gelöst und mit Diäthyläther gefällt. Biocytin-hydrazid läßt sich aus heißem Äthanol kristallisieren. Nach Umsetzung mit Aceton werden drei Produkte (Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Methanol als Laufmittel) mit R_f-Werten von 0,24, 0,55 und 0,65 erhalten, die die erwarteten Reaktionsprodukte darstellen.

Wir stellten die gleiche Verbindung auch aus t-Boc-Biocytin (Bayer und Welchek, Methods Enzymol, Bd. 34 (1974), Seite 265) und tert.-Butylcarbazat (Sigma) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamidlösung her. Die Schutzgruppen werden mit 4 n HCl in Dioxan entfernt.

Biotinmarkierung von Sialinsäuren und anderen Zuckern an den Oberflächen von Lymphocyten- oder Erythrocytenzellen

Zellen etwa 10⁸/ml) werden gewaschen und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 resuspendiert. Eine Lösung von Natrium-m-perjodat wird in einer Endkonzentration von 1 mM oder 10 mM zugesetzt, je nachdem, ob eine Markierung von Zelloberflächen-Sialinsäuren oder -Zuckern im allgemeinen erwünscht ist. Die Behandlung wird 30 Minuten in einem Eisbad durchgeführt. Die Zellen werden sodann gewaschen und in einer Lösung mit einem Gehalt an 50 µg/ml Biocytin-hydrazin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 (PBS) resuspendiert. Die Reaktion zwischen dem Aldehydsaccharid und dem Hydrazidreagens dauert im allgemeinen 1 h bei 25°C. Die Zellen werden sodann gewaschen und weiter für den gewünschten Zweck aufgearbeitet (Nachweis, quantitative Bestimmung, Lokalisierung, Immobilisierung und dergl.).

Biotinmarkierung von Zelloberflächen-Galactose

Eine 5prozentige Zellsuspension wird 60 Minuten bei 37°C in einem bewegten Wasserbad mit einer gepufferten Lösung (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 3 mM CaCl₂) mit einem Gehalt an Vibrio cholerae- Neuraminidase (0,05 U/ml, Behringwerke, Marburg) Galactose- Oxidase (5 U/ml, Sigma) und 50 µg/ml Biocytin-hydrazid inkubiert. Die Zellen werden sodann zweimal gewaschen und im gewünschten Puffer, je nach weiterer Verarbeitung, resuspendiert.

Biotinmarkierung von Glycoproteinen in Lösung

Das Glycoprotein (10 mg in 5 ml 0,1 m Natriumacetat, pH 4,5, mit 5 mM Natriummetaperjodat) wird 1 h bei 4°C im Dunkeln oxidiert. Nach der Oxidation wird überschüssiges Perjodat entweder durch Dialyse oder säulenchromatographisch an Sephadex G-25 entfernt. Das dialysierte Protein wird sodann in einer Lösung mit einem Gehalt von 50 µg/ml Biocytin-hydrazid inkubiert, überschüssiges Hydrazid wird durch Dialyse entfernt. Bei mindestens 90% der Glycoproteinmoleküle erfolgt eine Biotinylierung.

Immobilisierung von Glycoproteinen

Das Glycoprotein (10 mg in 5 ml 0,1 m Natriumacetat, pH 4,5, 10 mM NaJO₄) wird 1 h bei 4°C im Dunkeln oxidiert und über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert. Das dialysierte Protein wird sodann 2 h mit 10 ml Polyacrylhydrazid-Sepharose in einem gleichen Volumen an PBS inkubiert. Das immobilisierte Glycoprotein wird gewaschen und im gleichen Puffer mit 0,5% Azid gelagert.

Biotinmarkierung von Gangliosiden

Rinderhirn-Ganglioside (1 mg) werden in 1 ml PBS suspendiert. 10 µl einer 0,2 m Natriumperjodatlösung werden zugesetzt. Man läßt die Reaktion 30 Minuten bei 4°C ablaufen. Das Reaktionsgemisch wird gründlich gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH-Wert 7,4) dialysiert. Anschließend wird Biocytin-hydrazid (2,5 mg, gelöst in 0,5 ml PBS mit 1 mM MnCl₂) zugesetzt. Die Reaktion wird 1 Stunde bei 37°C durchgeführt. Die modifizierten Ganglioside werden dialysiert und mit Natriumborhydrid (1 mM) 10 min bei Raumtemperatur reduziert und gründlich gegen den gleichen Puffer dialysiert.

Markierung von Glycokonjugaten auf Blots

Nitrocellulosemembranen oder andere immobilisierte Matrices (z. B. positiv geladenes Nylon), auf die Glycokonjugate übertragen worden sind, werden 1 h bei 37°C in 2prozentigem (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin gequencht. Die Blots werden sodann in einer frisch hergestellten wäßrigen Lösung von Natriumperjodat (1 oder 10 mM) 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach kurzer Spülung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung werden die Blots 1 h in 2prozentiger BSA mit einem Gehalt an Biocytin-hydrazid (6 µg/ml) inkubiert und wieder gewaschen (2 × 10 min). Die Blots werden sodann mit Komplexen von Avidin und Biotinyl-alkalischer Phosphatase (Gemisch von 10 µg bzw. 5 µg pro 1 ml der verwendeten Lösung) behandelt. Die Substratlösung besteht aus 10 mg Naphthol-AS-MX-phosphat (Sigma, gelöst in 200 µl Dimethylformamid) und 30 mg Echtrot (Sigma) in 100 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,4. Das Signal, ein roter Niederschlag, erscheint während der 30minütigen Inkubation des Blots.

Markierung von Proteinen über Tyrosin- und Histidinreste 1. Herstellung von p-Aminobenzoesäure-biocytin N′-tBoc-p-Aminobenzoesäure

1,37 g (10 mMol) p-Aminobenzoesäure wurden in 12 ml 1 n NaOH gelöst und mit 2,0 g (10 mMol) Boc-on, gelöst in 5 ml Dioxan, versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gründlich gerührt. Nach Zugabe von Wasser wurde die Lösung mit Petroläther zur Entfernung von Dioxan extrahiert. Die wäßrige Phase wurde mit 10prozentiger Citronensäure angesäuert. Der Niederschlag wurde gewonnen, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhielt 1,5 g (65% d. Th.) Produkt vom F. 185°C.

tBoc-p-Aminobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester

600 mg tBoc-p-Aminobenzoesäure wurden zu 10 ml einer Dioxanlösung mit einem Gehalt an 300 mg N-Hydroxysuccinimid gegeben. 550 mg Dicyclohexylcarbodiimid (gelöst in 2 ml Dioxan) wurden zugesetzt. Die Lösung wurde 1 h gerührt. Das Harnstoffderivat wurde abfiltriert und verworfen. Das Filtrat wurde zu einem geringen Volumen eingeengt. Das Produkt wurde nach Zugabe von Diäthyläther kristallisiert. Man erhielt 650 mg (78% d. Th.) Produkt vom F. 165°C.

tBoc-p-Aminobenzoyl-biocytin

170 mg tBoc-p-Aminobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (in 2 ml Dimethylformamid) wurden langsam zu einer Lösung von 200 mg Biocytin-hydrochlorid in 2,2 ml 0,5 n NaOH gegeben. Man ließ die Reaktion über Nacht ablaufen. Nach Zugabe von Wasser wurde das Reaktonsgemisch mit Diäthyläther und anschließend mit Petroläther (zur Entfernung von Dimethylformamid) extrahiert. Die Lösung wurde mit 10prozentiger Citronensäure angesäuert. Der Niederschlag wurde abfiltriert und zur Entfernung von Spuren an Reaktanten mit Diäthyläther gewaschen. Man erhielt 240 mg (84% d. Th.) Produkt vom F. 171°C.

p-Aminobenzoyl-biocytin

100 mg tBoc-p-Aminobenzoyl-biocytin wurden in 2 ml Eisessig gelöst. Eine Lösung (3 ml Dioxan) mit einem Gehalt an 5 m HCl wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten stehengelassen. Nach Ausfällung des Produkts wurde Diäthyläther zugesetzt. Der Niederschlag wurde filtriert und mit Diäthyläther bis zur Trockene gewaschen. Man erhielt 76 mg (92% d. Th.) Produkt. Bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Butanol-Essigsäure-Wasser ergab sich ein einziger Fleck für das Produkt (R_f-Wert = 0,40). Nach Behandlung mit NaNO₂ reagierte die Verbindung mit Tyrosin.

2. Herstellung von p-Diazobenzoyl-biocytin (DBB)

2 mg p-Aminobenzoyl-biocytin wurden in 40,7 µl eiskalter 1 n HCl gelöst. Ein äquivalentes Volumen an eiskalter NaNO₂-Lösung (7,7 mg/ml) wurde zugesetzt. Man ließ die Lösung 5 Minuten bei 4°C stehen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 35 µl 1 n NaOH beendet. Die DBB-Lösung wurde durch Verdünnung mit 0,2 m Boratpuffer vom pH-Wert 8,4 auf die gewünschte Konzentration gebracht.

3. Markierung von Proben auf Blots

Nitrocellulosestreifen mit den Proben wurden mit einer Lösung mit einem Gehalt an DBB (10 µg/ml) behandelt. Nach 1stündiger Inkubation wurden die Nitrocellulosestreifen dreimal mit PBS gespült und mit einer geeigneten Proteinlösung gequencht. Nach 1 h wurden die Nitrocellulosestreifen wieder dreimal mit PBS gespült und unter Verwendung von avidin- oder streptavidinhaltigen Enzymkonjugaten oder -komplexen gefärbt.

4. Markierung von Proben in Lösung

Eine DBB-Lösung (deren exakte Konzentration wurde durch Vorversuche bestimmt) in Boratpuffer vom pH-Wert 8,4 wurde zu einer Lösung eines bestimmten Proteins in 0,9% NaCl gegeben. Beispielsweise wurden 0,5 ml DBB (100 µg/ml) zu 0,5 ml alkalischer Phosphatase (1 mg/ml) gegeben. Nach 2 h bei 25°C wurde die Lösung gründlich gegen PBS dialysiert. Das biotinylierte Produkt wurde bei -20°C gelagert. Proben wurden sodann für den gewünschten Zweck (Nachweis, Lokalisierung, Immobilisierung und dergl.) unter Verwendung geeigneter avidin- oder streptavidinhaltiger Konjugate oder Komplexe eingesetzt.

5. Markierung von Nucleinsäuren

Eine Lösung (1 ml) mit einem Gehalt an der gewünschten DNA oder RNA (hitzedenaturiert) in einer Konzentration von 0,2 mg/ml wurde in 0,18 m Carbonatpuffer vom pH-Wert 9,0 hergestellt. Diese Lösung wurde mit 0,2 ml DBB (25 mg/ml) versetzt. Nach 30 min bei 25°C wurde eine zweite Aliquotprobe an DBB zugesetzt. Gegebenenfalls wurde dieses Verfahren nochmals wiederholt. Die markierte DNA oder RNA wurde gegen 0,1 m Phosphatpuffer und sodann gegen Wasser dialysiert. Das biotinylierte Präparat wurde bei -20°C aufbewahrt.

Verfahren zur Makromolekülvernetzung Herstellung von Vernetzungsreagentien 1. Herstellung von 3-(N-Maleinimido-propionyl)-biocytin-N- hydroxysuccinimidester

523 mg 3-(N-Maleinimido-propionyl)-biocytin wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 125 mg N-Hydroxysuccinimid versetzt. Die Lösung wurde auf 4°C gekühlt und mit 225 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde auf Eis und über Nacht bei 25°C belassen. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und verworfen. Das Produkt wurde direkt aus dem Filtrat mit wasserfreiem Diäthyläther ausgefällt.

Der Niederschlag wurde gewonnen und mit Diäthyläther gewaschen. Die Menge an N-Hydroxysuccinimidester wurde spektrophotometrisch (ε _{261 nm} = 10 000) nach Hydrolyse mit 0,5 m NH₄OH bestimmt. Die Reinheit wurde dünnschichtchromatographisch ermittelt.

Der N-Hydroxysulfosuccinimidester und andere aktive Ester (z. B. N-Hydroxyphthalimido- und p-Natrophenylester) der vorgenannten Verbindungen wurden auf ähnliche Weise hergestellt.

2. Herstellung von 3-(Maleinimidopropionyl)-biocytin-hydrazid

125 mg 3-(N-Maleinimido-propionyl)-biocytin-N-hydroxysuccinimidester wurden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und tropfenweise zu 1 ml einer Lösung von 10 µl Hydrazin-hydrat in 0,5 m NaHCO₃ gegeben. Die Umsetzung wurde 3 h bei 25°C durchgeführt. Nach Eindampfen zur Trockene wurde in einer geringen Menge Methanol gelöst. Das Produkt wurde mit Diäthyläther gefällt. Die Reinheit wurde dünnschichtchromatographisch bestimmt. Das Produkt wurde durch Umsetzung mit Aceton identifiziert. Andere Hydrazidderivate mit langen Abstandsstücken wurden hergestellt, indem man 3 bis 5 Moläquivalente des entsprechenden Dihydrazids (z. B. 100 bis 200 mg Adipinsäuredihydrazid) verwendete.

3. Herstellung von Biotinyl-L-glutaminsäure

340 mg BNHS wurden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und tropfenweise zu 3 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 150 mg L-Glutaminsäure in 0,5 m NaHCO₃ gegeben. Die Umsetzung wurde 1 bis 2 h oder über Nacht bei 25°C durchgeführt. Die Lösung wurde mit 1 n HCl angesäuert. Der Niederschlag wurde gewonnen, filtriert, mit kaltem destilliertem Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Andere Aminodicarbonsäuren, Peptide und dergl. wurden unter Verwendung entsprechender Moläquivalente anderer Reagentien anstelle von Glutaminsäure hergestellt.

4. Herstellung von α-N-Biotinyl-L-glutamyl-di(N-hydroxysuccinimid- ester

190 mg α-N-Biotinyl-L-glutaminsäure wurden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 125 mg N-Hydroxysuccinimid versetzt. Die Lösung wurde auf 4°C gekühlt und mit 225 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Umsetzung wurde 1 h bei 4°C und über Nacht bei 25°C durchgeführt. Der Niederschlag wurde verworfen. Das Produkt wurde aus dem Filtrat durch Zugabe von wasserfreiem Diäthyläther ausgefällt. Der Niederschlag wurde gewonnen und mit Diäthyläther gewaschen. Der Di-(N-hydroxysulfosuccinimid)- ester von Biotinyl-glutaminsäure wurde in entsprechender Weise hergestellt.

Vernetzungsversuche 1. Vernetzung von internen Erythrozyten-Plasmalemm-Proteinen

Gewendete, wieder versiegelte Erythrozyten-Geisterzellen (ghost) (0,1 ml gepackt) wurden mit 50 µg/ml einer Lösung (in PBS) von 3-(N-Maleinimido-propionyl)-biocytin-N-hydroxysulfosuccinimidester behandelt. Nach 1 h bei 25°C wurden die Geisterzellen mit PBS gewaschen, in einer Lösung mit einem Gehalt an 1% Natriumdodecylsulfat gelöst und der Elektrophorese an Polyacrylamidgel unterworfen.

2. Vernetzung von Makromolekülen an intakten Erythrozytenmembranen

In einem zweiten Versuch wurden intakte Erythrozyten 30 min bei 4°C mit 1 mM NaJO₄ behandelt. Die oxidierten Zellen wurden sodann mit PBS gewaschen und mit einer 50 µg/ml Lösung (in PBS) von 3-(N-Maleinimido-propionyl)-biocytin- hydrazid behandelt. Die Zellen wurden gewaschen, gepackt und der Lyse in 40 Volumenteilen eiskaltem Lysepuffer (5 mM Phosphatlösung, pH-Wert 8,2, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) unterworfen. Die Geisterzellen wurden mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Membranproteine wurden in 1% Natriumdodecylsulfat gelöst. Die biotinylierten, vernetzten Proteine wurden an einer Avidin-Sepharose-Säule isoliert. Das Muster der isolierten Proteine wurde durch Elektrophorese an Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel analysiert und mit dem ursprünglichen Membranextrakt verglichen.

3. Vernetzung von zwei gereinigten Proteinen Biotinyliertes Enzym-Antikörper-Konjugat Beispiel a

1 mg IgG wurde in 1 ml PBS mit 50 µl einer Lösung von 2 mg/ml 3-(N-Maleinimido-propionyl)-biocytin-N-hydroxysucci nimidester in Dimethylformamid versetzt. Man ließ die Reaktion 1 h bei 25°C ablaufen. Das Produkt wurde vom Reagens durch Dialyse oder Gelfiltration an Sephadex G-25 abgetrennt. Das Biotinyl- maleinimido-IgG wurde mit nativem oder induziertem thiolhaltigem Protein (z. B. β-Galactosidase, A- oder B-Kette oder Ricin oder Homocystein-thiolacton-modifiziertes Enzym) vermischt.

Beispiel b

1 mg IgG in 1 ml PBS wurde auf eine Natriumperjodatkonzentration von 1 mM eingestellt (auch eine Endkonzentration von bis zu 10 mM kann eingesetzt werden). Nach 30 min bei 4°C wurde das Protein dialysiert (oder der Gelfiltration an Sephadex G-25 unterworfen). 2 mg 3-(N-Maleinimido-propyl-biocytin- hydrazid in 1 ml PBS wurde zugesetzt. Nach einstündigem Belassen bei 25°C wurde das Konjugat wieder dialysiert (oder über eine Sephadex G-25 Säule gegeben). Sodann wurde mit nativem oder induziertem, thiolhaltigem Protein gemäß Beispiel a umgesetzt. Zur weiteren Stabilisierung kann das Konjugat mit 1 mM Natriumborhydridlösung reduziert werden. Andere Proteinpaare, z. B. Enzym-Enzym oder Antikörper-Toxin, können auf ähnliche Weise hergestellt werden.

Abtrennung von vernetzten, biotinhaltigen Konjugaten an Affinitätssäulen

Ein Konjugat (entweder gemäß Beispiel a oder Beispiel b hergestellt) wird auf eine Säule aufgebracht, die eine immobilisierte Form eines entsprechenden biotinbindenden Proteins (z. B. Avidin, Streptavidin oder Antibiotin-Antikörper) enthält. Das vernetzte Protein und das restliche biotinylierte IgG werden an die Säule gebunden. Eine derartige Säule kann für Reinigungszwecke oder in Enzymreaktionssystemen eingesetzt werden.

Erläuterung der verwendeten Abkürzungen

BNHS: Biotinyl-N-hydroxysuccinimidester;
B(N)BG: Über ein Amin biotinylierte β-Galactosidase;
B(S)BG: Über SH biotinylierte β-Galactosidase;
BSA: Rinderserumalbumin;
MPB: 3-(N-Maleinimido-propionyl)-biocytin;
PBS: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4 mit 1 mM MgCl₂.

Erläuterung der Figuren Fig. 1 Selektive Färbung von Protein-sulfhydryl- und -disulfidgruppen unter Verwendung von MPB.

Verschiedene Konzentrationen (wie angegeben) von Aldolase (ALD), β-Galactosidase (BG), Ovalbumin (OV), Rinderserumalbumin (BSA) und Chymotrypsinogen (CT) wurden an Nitrocellulosemembranen tüpfelgeblottet und wie in der Beschreibung erläutert, der Behandlung von SH- oder S-S-Gruppen unterworfen. Die biotinylierten Proteine wurden unter Verwendung von vorher hergestellten Avidin : Peroxidase-Komplexen sichtbar gemacht.

Fig. 2 Immobilisierung und Enzymaktivität von biotinylierten β-Galactosidase-Präparaten an Sepharose-Avidin

Das nicht-derivatisierte Enzym (BG), das MPB-derivatisierte Enzym (B(S)BG) und das durch BNHS biotinylierte Enzym (B(N)BG) wurden mit Sepharose-Avidin inkubiert und mehrmals gewaschen. Die gesamte eingesetzte enzymatische Aktivität (TA), die Aktivität der jeweiligen Waschflüssigkeiten (W1, W2 und W3) sowie die gesamte gebundene Aktivität wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Histogrammform wiedergegeben. Der zeitliche Verlauf der Reaktion der immobilisierten Enzympräparate ist im unteren Diagramm für BG (○); für B(S)BG, (⚫); und für B(N)BG (▲) angegeben.

Fig. 3 Affinitätsblotting von biotinyliertem Protein unter Verwendung von B(S)BG

Verschiedene Konzentrationen (wie angegeben) von B-BSA wurden auf Tüpfelblots aufgegeben und entweder nacheinander (Zeile A) mit Avidin und B(S)BG oder mit vorher hergestellten B(S)BG-Komplexen (Zeile B) behandelt.

Claims (16)

1. Verbindungen der allgemeinen Formel in der
A eine terminale Biotingruppe, ein Biotingruppen-Analoges oder -Homologes oder eine modifizierte Biotingruppe oder ein Derivat, die die Wechselwirkung mit einer Avidingruppe erlauben, bedeutet;
B ein Abstandsstück von geeigneter Länge, das gegebenenfalls einen Substituenten D zur Gewährleistung der Wasserlöslichkeit der Verbindung und gegebenenfalls eine funktionelle Gruppe, die zur Wechselwirkung mit einem gewünschten Verbindungstyp verwendet werden kann, bedeutet, und
C folgende Bedeutungen hat:
a) eine terminale Maleinimidgruppe, die zur Wechselwirkung mit einer -SH-Gruppe geeignet ist,
b) eine terminale Hydrazidgruppe, die zur Wechselwirkung mit einem Zuckermolekül, einer Aminogruppe, einer Carboxylgruppe oder einer Base einer Nucleotidsequenz geeignet ist,
c) eine terminale Hydrazid- oder Maleinimidgruppe, wobei in jedem Fall am Abstandsstück entweder der gleiche oder ein unterschiedlicher Substituent vorhanden ist, so daß eine mit dreifacher Funktionalität vorliegt,
d) eine therminale Diazogruppe, die zur Wechselwirkung mit einer Tyrosin- oder Histidingruppe oder mit der Base einer Nucleotidsequenz geeignet ist.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das spaltbare oder nicht-spaltbare Abstandsstück B eine Mehrzahl von -(CH₂)-Gruppen aufweist, die gegebenenfalls durch einen oder mehrere -CONH-Reste unterbrochen sind, wobei die Möglichkeit besteht, daß eine oder mehrere der -CH₂-Gruppen durch eine Carboxylgruppe, Hydroxylgruppe, vicinale Hydroxylamingruppe, Sulfhydrylgruppe, und/oder Disulfidgruppe substituiert ist.

3. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Abstandsstück aliphatische Kohlenwasserstoffe, cyclische aliphatische Kohlenwasserstoffe, substituierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, substituierte aromatische Kohlenwasserstoffe, gemischt aliphatisch-aromatische Kohlenwasserstoffe, substituierte aliphatisch-aromatische Kohlenwasserstoffe, Monosaccharide, Di-, Oligo- und Polysaccharide, substituierte Kohlenhydrate, Aminosäuren, ω-Aminocarbonsäuren, Di-, Oligo- und Polypeptide, substituierte Aminosäuren und Peptide umfaßt.

4. Verbindungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die spaltbaren Abstandsstücke als spaltbare Gruppen Disulfidgruppen (mit Thiolen spaltbar), Diazogruppen (mit Dithionit spaltbar), vicinale Hydroxylgruppen (mit Perjodat spaltbar) oder Estergruppen (mit Basen spaltbar) enthalten.

5. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Abstandsstück folgende Formel aufweist: worin x eine ganze Zahl ist, z den Wert 0 oder 1 hat, y den Wert 0 hat oder eine ganze Zahl ist, q den Wert 0 hat oder eine ganze Zahl ist und D eine der folgenden Gruppen darstellt oder enthält: -COOH, -OH, -NH₂ oder -SH.

6. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß B den Rest der folgenden Formel bedeutet:

7. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß C Reste der folgenden Formeln bedeutet:

8. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie drei funktionelle Gruppen aufweisen, wobei C die in Anspruch 5 definierte Bedeutung hat und D eine der in Anspruch 5 definierten Gruppen darstellt oder enthält oder andere reaktive funktionelle Gruppen enthält, z. B. eine N-Hydroxysuccinimidgruppe, N-Hydroxysulfosusuccinimidgruppe, p-Nitrophenylgruppe, Azidophenylgruppe oder andere photoreaktive Gruppen.

9. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Biocytin-hydrazid handelt.

10. Verfahren zur Bindung einer Verbindung mit einem -SH-Substituenten der allgemeinen Formel Q-SH, bei dem man eine derartige Verbindung mit einer Verbindung der Formel gemäß Anspruch 1 unter Bildung einer Verbindung der Formel in Wechselwirkung bringt.

11. Verfahren zur Bindung von Verbindungen vom Zuckertyp oder von Aldehyden an eine Verbindung der Formel A-B-C gemäß Anspruch 1, worin C oder D eine Hydrazidgruppe bedeutet, bei dem der Zucker mit einem Perjodat unter Bildung einer Aldehydgruppe umgesetzt wird und die Aldehydgruppe mit der Hydrazidgruppe in umgesetzt wird.

12. Verfahren zur Bindung eines Amins über dessen NH₂-Gruppe an den Hydrazidrest oder die A-B-C-Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Umsetzung in Gegenwart eines Oxidationsmittels durchgeführt wird.

13. Verfahren zur Bindung einer carboxylgruppenhaltigen Verbindung über die Carboxylgruppe an eine Verbindung der Formel gemäß Anspruch 1 über deren Hydrazidgruppe, bei dem man die Verbindungen in Gegenwart eines Carbodiimids umsetzt.

14. Verfahren zur Bindung einer Verbindung mit einer Nucleotidsequenz, bei dem man diese Verbindung mit einer Verbindung der Formel A-B-C gemäß Anspruch 1 über eine Base des Nucleotids an die Hydrazidgruppe der Verbindung der Formel umsetzt, wobei die Umsetzung dieser Verbindungen in Gegenwart einer katalytischen Menge eines Bisulfits erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 10 bis 14, bei dem eine Verbindung der Formel mit drei funktionellen Gruppen mit einer Verbindung, die zur Reaktion mit der C-Gruppe geeignet ist, und mit einer weiteren Verbindung, die zur Reaktion mit der D-Gruppe geeignet ist, umgesetzt wird, wobei es sich bei C und D um die gleichen funktionellen Gruppen handeln kann.

16. Verfahren zur Herstellung von Biocytin, dadurch gekennzeichnet, daß man Biotin-N-hydroxysuccinimid oder ein anderes aktives Esterderivat mit dem Kupferkomplex von Lysin umsetzt.