DE3872346T2

DE3872346T2 - Ionenaustauscher aus basis von vernetztem glukomannan.

Info

Publication number: DE3872346T2
Application number: DE8888309262T
Authority: DE
Inventors: Isao Joko; Hiroshi Morita; Yoshiaki Motozato; Takashi Tomoda; Masato Yamaguchi
Original assignee: Kurita Water Industries Ltd
Current assignee: Kurita Water Industries Ltd
Priority date: 1987-10-06
Filing date: 1988-10-05
Publication date: 1993-02-11
Anticipated expiration: 2008-10-06
Also published as: JPH0194949A; DE3872346D1; EP0312242A3; EP0312242A2; EP0312242B1; US4948814A; JPH0659409B2

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen Ionenaustauscher aus sphärischen Kügelchen, die auf vernetztem Konjakmannan, einer Art van Glucomannan, basieren, und spezieller einen Ionenaustauscher, der in der Druckfestigkeit, welche Verwendung unter hoher hydrodynamischer Scherbeanspruchung erlaubt, überlegen ist, für allgemeine Ionenaustauschzwecke und insbesondere für Ionenaustausch-Chromatographie.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Auf dem Markt findet man heutzutage als typische Ionenaustauscher für Ionenaustausch-Chromatographie DEAE- Sephadex A-50 (DEAE ist eine Abkürzung für Diethylaminoethyl und wird nachfolgend in der ganzen Beschreibung verwendet), DEAE-Sepharose CL-6B, CM-Sephadex C-50 (CM ist eine Abkürzung für Carboxymethyl) und CM- Sepharose CL-6B, alles Warenzeichen, der Firma Pharmacia Fine Chemicals. Sie werden jeweils unter Verwendung eines natürlichen hochmolekularen Stoffes als Ausgangsmaterial hergestellt und werden zur Trennung hochmolekularer Stoffe, wie Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Membranbestandteile usw., verwendet.
Diese vorbekannten Austauscher haben einen Nachteil, daß jedes Kügelchen des Ionenaustauschers aufgrund niedrigerer Druckfestigkeit bei Ionenaustausch-Prozessen bei hoher Fließgeschwindigkeit deformiert wird, wodurch eine beträchtliche Reduzierung in der Trennungseffizienz verursacht wird. Ein weiterer Anstieg der Fließgeschwindigkeit kann einen steilen Anstieg des Druckverlustes in der Austauschersäule verursachen und kann sogar zu einer Blockierung der Säule führen.
Im Falle der Verwendung eines Ionenaustauschers zur Trennung von z.B. Proteinen, Polysacchariden, Nukleinsäuren, Membranbestandteilen und anderen hochmolekularen Stoffen ist es in allgemeinen notwendig, für die anschließende Adsorptionsstufe, nämlich die Ionenaustauschstufe, durch Entfernen aller durch Ionenbindung verbundener Stoffe Sorge zu tragen.
Im allgemeinen ist es üblich, Verunreinigungen wie Lipide und Proteine durch Waschen mit ungefähr 0,1 M wäßrigem NaOH, gefolgt von einer vollständigen Entfernung des restlichen Alkalis durch Waschen mit destilliertem Wasser oder einer Puffer- oder Salzlösung, zu beseitigen. Dieses Verfahren ist langwierig und mühsam im Vergleich zum Ionenadsorptionsverfahren, und stellt eine Hauptursache für den erweiterten Operationszyklus, umfassend die Stufen Ionenadsorption, -desorption (Elution) , Waschen mit Wasser und Regeneration, dar. In der Praxis ist es bevorzugt eher die Länge der Wasch- und Regenerationsstufen als der Adsorptionsstufe zu verringern. Zu diesem Zweck sind Ionenaustauscher-Kügelchen, die höhere Druckfestigkeit besitzen und eine hohe Flüssigkeits-Fließgeschwindigkeit erlauben, erforderlich.
Die japanische Offenlegungsschrift Nr. 236839/1987 offenbart die Verwendung von Glucomannan-Kügelchen, die eine vernetzte Struktur haben und einen Quellgrad im Bereich von 1,5 bis 15 (bezogen auf ml-Zahl Naßgel-Bett pro g Trockengel), ein Ausschluß-Grenzmolekulargewicht von 100 bis 10&sup8; und eine durchschnittliche Kügelchengröße von 1 bis 500 um aufweisen, bei Gelfiltration und Gelchromatographie. Die Glucomannan-Kügelchen haben jedoch keine Ionenaustausch-Fähigkeit und können daher nicht für Ionenaustausch-Chromatographie verwendet werden. CA-A-0960652 offenbart Ionenaustauscher in Kügelchen-Form. Das Ionenaustausch-Material ist ein Polysaccharid wie Stärke oder Xylan, und es wird ausgesagt, das Xylan durch Glucomannan, das aus Douglas-Fichte isoliert wurde, ersetzt werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Ionenaustauscher gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt Kügelchen von vernetztem Konjakmannan mit Resten von einer oder mehreren Ionen-austauschbaren Gruppen, worin das vernetzte Konjakmannan ein Ausschluß-Grenzmolekulargewicht von 10&sup5; bis 10&sup8; aufweist.

Beschreibung der Erfindung

Die Ionen-austauschfähige Gruppe im erfindungsgemäßem Ionenaustauscher kann jede für diesen Zweck im Stand der Technik bekannte sein. Beispiele sind Diethylaminoethyl (DEAE), Carboxymethyl (CM), Sulfomethyl, primäre bis tertiäre Aminoethyle, quaternäres Ethylammonium, Sulfopropyl und Phosphat.
Das Einführen der Ionen-austauschfähigen Gruppe kann durch herkömmliche Technik erfolgen. Zum Beispiel werden vernetzte Konjakmannan-Kügelchen zunächst in einer Lösung von einen Alkali eingeweicht und werden dann mit einem Reagenz mit endständigem Halogenatom umgesetzt, wobei sie einen kombinierten Rest einer Ionen-austauschfähigen Gruppe bilden. Das Reagenz ist beispielsweise 2-Chlortriethylaminhydrochlorid, Chloressigsäure, ein Salz von Chlormethansulfonsäure oder Phosphorychlorid. Das Alkali ist zum Beispiel Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid.
Die Ionenaustausch-Kapazität des erfindungsgemäßen Ionenaustauschers ist vorzugsweise 0,1 bis 5 mÄq. pro Gramm trockener Kügelchen.
Die vernetzten Konjakmannan-Kügelchen haben vorzugsweise einen Quellgrad von 1,5 bis 15, bevorzugter 2 bis 8, und einen durchschnittlichen Kügelchen-Durchmesser im Bereich von 5 bis 500 um.
Konjakmannan ist im Handel erhältlich. Es wird aus der Pflanze Amorphophalus konjak erhalten.
Die vernetzten Konjakmannan-Kügelchen werden aus dem Konjakmannan durch Umsetzung mit einem Vernetzungsmittel erhalten.
Der Quellgrad und das Ausschluß-Grenzmolekulargewicht der sphärischen Kügelchen von vernetztem Konjakmannan werden vorzugsweise so eingestellt, daß sie eine poröse Makrostruktur aufweisen. Es ist möglich, alternativ oder gleichzeitig, die Regelung des Vernetzungsgrades zu inkorporieren, um den Quellgrad und das Ausschluß- Grenzmolekulargewicht zu steuern.
Die vernetzten Konjakmannan-Kügelchen können erhalten werden durch Auflösen eines veresterten Produkts von Konjakmannan, allein oder zusammen mit einem Verdünnungsmittel, in einem Lösungsmittel, Suspendieren der resultierenden Lösung in einem wäßrigen Medium (das Lösungsmittel hat einen niedrigeren Siedepunkt als das wäßrige Medium und ist mit dem wäßrigen Medium nicht mischbar oder nur schlecht mischbar) , um Flüssigkeitströpfchen des veresterten Konjakmannan zu bilden, Verdampfen des in den Flüssigkeitströpfchen enthaltenen Lösungsmittels, Verseifung der resultierenden sphärischen Kügelchen des veresterten Konjakmannans und Umsetzung der verseiften Kügelchen mit einem Vernetzungsmittel.
Die sphärischen Kügelchen des vernetzten Konjakmannans gemäß der vorliegenden Erfindung können in genaueren praktischen Einzelheiten wie folgt hergestellt werden:
Ein handelsübliches Konjakmannan kann als solches als das Ausgangsmaterial eingesetzt werden, oder ein verfeinertes Produkt, das durch einmaliges Auflösen eines handelsüblichen Produktes in Wasser und Ausfällen des Konjakmannans aus dieser wäßrigen Lösung durch Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels wie z.B. Ethylalkohol oder Methylalkohol behandelt wurde. Das Konjakmannan wird dann mit einem Lösungsmittel wie Formamid oder Dimethylformamid aufgequollen. Eine Säure wird hinzugegeben, um das Konjakmannan unter Verwendung eines Veresterungskatalysators wie Pyridin zu verestern. Die Säure kann organisch oder anorganisch sein, wobei Beispiele Essigsäure, Essigsäureanhydrid, Propionsäure, Buttersäure und Salpetersäure sind; eine oder mehrere Säuren können eingesetzt werden, um einen gemischten Ester zu erhalten. Bei Verwendung einer Säure mit freien Carboxylgruppen wird bei der Umsetzung mit dem Konjakmannan Wasser gebildet, was die Molekülkette zum Abbruch bringen kann, so daß es bevorzugt ist, ein Mittel zum Entwässern vorzusehen. Im Gegensatz dazu bildet ein Säureanhydrid, wie z.B. Essigsäureanhydrid, kein Reaktionswasser und ist daher vorteilhaft. Die Veresterung macht das Konjakmannan in Wasser unlöslich und ergibt suspendierte Konjakmannan- Teilchen. Es ist wünschenswert, die meisten, vorzugsweise mehr als 85%, insbesondere mehr als 90%, der OH-Gruppen im Konjakmannan zu verestern.
Das so veresterte Konjakmannan wird dann gereinigt, zum Beispiel unter Verwendung von Aceton. Wenn der Veresterungsgrad weniger als 85% beträgt, ist die Löslichkeit des Konjakmannans in Aceton vermindert, so daß der Gewinnungsgrad verringert ist. Das veresterte Konjakmannan wird danach ausgefällt, indem man es mit Wasser in Kontakt bringt und wird dann getrocknet.
Der so erhaltene Konjakmannan-Ester wird, allein oder zusammen mit einem Verdünnungsmittel, in einem Lösungsmittel aufgelöst. Das Lösungsmittel sollte einen niedrigeren Siedepunkt als das wäßrige Suspendiermedium haben, wie nachfolgend erklärt werden wird, und sollte mit dem wäßrigen Medium nicht mischbar oder schlecht mischbar sein. Das Lösungsmittel ist beispielsweise ein chlorierter Kohlenwasserstoff wie Dichlormethan, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid oder Trichlorethylen, oder eine Mischung davon.
Die Konzentration der wie oben hergestellten Lösung von Konjakmannan-Ester sollte derart sein, daß die sphärischen Kügelchen gebildet werden, nachdem sie in ein wäßriges Medium eingeführt ist, und die Kügelchen sollten ausreichende Festigkeit, z.B. zur Verwendung bei der Ionenaustausch-Chromatographie, besitzen, nachdem das Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt worden ist. Die Konzentration ist vorzugsweise 0,2 bis 20 Gew. %, bevorzugter von 0,5 bis 5 Gew.-%, und am bevorzugtesten von 0,5 bis 2 Gew.-%.
Falls die Konzentration des Konjakmannan-Esters weniger als 0,2 Gew.-% beträgt, wird ein feiner, flockenartiger Niederschlag gebildet, aber keine Kügelchen. Wenn sie 20 Gew.-% übersteigt, ist die Teilchengröße zu groß, und die Teilchen weisen eine nicht-poröse Oberfläche auf, was es unmöglich macht, das gepackte Material in der Chromatographie einzusetzen.
Bei der Herstellung der Lösung des Konjakmannan-Esters ist es möglich, den Ester allein in einem Lösungsmittel aufzulösen, aber es ist bevorzugt, ein Verdünnungsmittel zu verwenden, um die Einstellung des Quellgrads und des Ausschluß-Grenzmolekulargewichts zu erleichtern. Verwendung und Entfernung eines Verdünnungsmittels hinterläßt Hohlräume oder Poren, d.h., poröse Makrostruktur, in den Kügelchen. Das Verdünnungsmittel sollte einen Siedepunkt höher als der des Lösungsmittels haben und sollte den Konjakmannan-Ester nicht auflösen: Beispiele schließen Tetrahydronaphthalin, Decahydronaphthalin, Ethylbenzol, Diethylbenzol, Methyldodecanoat, Methylcaprinat, Toluol, Hexylalkohol, Heptylalkohol und Octylalkohol ein.
Wenn das Konjakmannan vorläufig mit Formamid zum Quellen gebracht wird, werden bevorzugt Tetrahydronaphthalin und Decahydronaphthalin als Verdünnungsmittel gewählt.
Die Menge des zugesetzten Verdünnungsmittels kann in Übereinstimmung mit dem in Erwägung gezogenen Quellgrad und mit dem gewünschten Ausschluß-Grenzmolekulargewicht gewählt werden. Zum Beispiel kann die Menge an Verdünnungsmittel zur Herstellung eines Gel-Produkts mit einem Quellgrad von 3 und einem Ausschluß-Grenzmolekulargewicht von über 10&sup6;, als grobes Maß im Bereich von 100-1000%, vorzugsweise von 100 bis 500%, bezogen auf das Gewicht des verwendeten Glucomannan-Esters, sein.
Die den Konjakmannan-Ester enthaltende Ausgangslösung wird wie oben beschrieben hergestellt. Die Lösung wird dann in ein wäßriges Medium eingebracht, um sphärische Flüssigkeitströpfchen der in dem wäßrigen Medium suspendierten Lösung als Vorläufer der Konjakmannan-Ester- Kügelchen zu bilden. Das wäßrige Medium kann Wasser oder eine wäßrige Lösung, die ein hydrophiles Schutzkolloid, wie z.B teilweise hydrolysiertes Polyvinylacetat, Polyvinylalkohol, Carboxymethlycellulose, Ethylcellulose, Methylcellulose, lösliche Stärke oder Gelatine, enthält, sein. Die Verwendung von teilweise hydrolysiertem Polyvinylacetat und Polyvinylalkohol als Schutzkolloid ist bevorzugt, da sie sich sogar bei niedrigeren Temperaturen ganz gut in Wasser auflösen und außerdem die Fähigkeit zur Dispergierung von Teilchen und einen Effekt zeigen, die Viskosität leichter als verglichen mit anderen zu erhöhen.
Das Schutzkolloid kann vorzugsweise in Form einer wäßrigen Lösung einer Konzentration von 0,1 - 10 Gew.-%, vorzugsweise 0,3 - 5 Gew.-%, verwendet werden.
Eine niedrigere Schutzkolloid-Konzentration als 0,1 Gew.-% neigt zur Bildung von Konjakmannan-Teilchen mit übermäßig großer Teilchengröße, und Konzentrationen außerhalb des Bereichs von 0,1 bis 10 Gew.-% erzeugen oft Konjakmannan- Teilchen von nicht-sphärischer Form.
Das wäßrige Medium kann vorzugsweise mindestens im gleichen Volumen, und vorzugsweise in einer Menge vom 2 - 20-fachen des Volumens der Konjakmannan-Ester-Lösung eingesetzt werden.
Die Ausgangs-Verfahrenslösung wird in das wäßrige Medium auf einmal eingeführt, gefolgt von Rühren, um zu dispergieren, um eine Suspension zu bilden, oder sie kann auf einmal oder tropfenweise in das in gerührtem Zustand gehaltene wäßrige Medium eingebracht werden, um eine Suspension zu bilden. Die Rührintensität ist so geregelt, daß die durchschnittliche Kügelchengröße des Endprodukts von 1 bis 500 um betragen wird.
Beim Einführen der Ausgangslösung in das wäßrige Medium wird der Konjakmannan-Ester dispergiert und fein in dem wäßrigen Medium suspendiert, da verestertes Konjakmannan in Wasser unlöslich ist. Hier beginnt gleichzeitig mit der Kügelchen-Bildung die Verdampfung des Lösungsmittels. Auf diese Weise werden schließlich sphärische Kügelchen von Konjakmannan-Ester, aus denen das Lösungsmittel im wesentlich verdampft ist, erhalten.
Für die Temperatur zur Verdampfung des organischen Lösungsmittels in den Flüssigkeitströpfchen wird eine Temperatur über dem Gefrierpunkt des wäßrigen Mediums und unterhalb des Siedepunkts des organischen Lösungsmittels verwendet. Hier wird eine Temperatur bevorzugt, die niedriger als der Siedepunkt des organischen Lösungsmittels ist, insbesondere um 1- 15ºC, um die sphärische Form des Kügelchens auf eine bessere Weise zu halten und um die Verdampfung des organischen Lösungsmittels zu erleichtern.
Während des Verfahrensschritts zur Verdampfung des organischen Lösungsmittels aus den Flüssigkeitströpchen wird das wäßrige Medium unter Rühren gehalten, um die sphärische Form des Flüssigkeitströpfchens beizubehalten. Nachdem das in den Flüssigkeitströpfchen enthaltene organische Lösungsmittel verdampft worden ist, werden sphärische Kügelchen zurückgelassen.
Die Kügelchen werden in einem gelierten Zustand gebildet und enthalten in sich das Verdünnungsmittel innerhalb einer bimsteinartigen porösen Matrix und können ihre Kügelchen- Gestalt halten, nachdem sie aus dem wäßrigen Medium entnommen worden sind. Das in den Konjakmannan-Ester- Kügelchen enthaltene Verdünnungsmittel wird teilweise in diesem Verfahrens schritt entfernt und wird im anschließenden Verfahrensschritt der Verseifung vollständig entfernt.
Die sphärischen Konjakmannan-Ester-Kügelchen werden dann einer Verseifung unterzogen, nachdem sie aus dem wäßrigen Medium entnommen worden sind. Die Verseifung wird bewirkt, um die wasserlösliche Natur durch Rückumwandlung in freies Konjakmannan wiederherzustellen. Hier wird im wesentlichen das ganze veresterte Konjakmannan verseift. Es ist notwendig ein Verseifungsbad einzusetzen, das erlaubt, die Verseifung zu bewirken, ohne irgendeine schädliche Wirkung auf die sphärische Form der Konjakmannan-Ester-Kügelchen, deren Wasserlöslichkeit nach der Rückumwandlung in freies Konjakmannan wiederhergestellt ist, zu verursachen. Als Verseifungsbad können zum Beispiel eine Alkohollösung von Alkalihydroxid, wie eine Methanollösung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, eine wäßrige Lösung von Alkalihydroxid, wie eine wäßrige Lösung von Natrium- oder Kaliumhydroxid, gelöst in einer wäßrigen Lösung von Salzen wie Natriumsulfat, usw., verwendet werden.
Eine konkrete Art, die Verseifung zu bewirken, besteht darin, daß sphärische Kügelchen des Konjakmannan-Esters in einer Menge an Methanol, die das 5- bis 10fache des Gewichts der Kügelchen in Übereinstimmung mit jedem besonderen Erfordernis betragen kann, 0,1 - 2 Stunden eingeweicht werden. Die so eingeweichten Kügelchen werden dann in ein Verseifungsbad aus einer Mischung, die aus einem Alkohol, wie Methanol usw., und einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid in einem Gewichtsverhältnis von [Alkohol] : [wäßriger Lösung] von [9-7] : [1-3] besteht und eine Konzentration von 0,1 - 5 N NaOH hat, in einer solchen Menge eingebracht, daß das Verhältnis von [Konjakmannan] : [NaOH] 1 : [0,5-10] auf Gewichtsbasis ist, und die Mischung wird bei Raumtemperatur 10 - 24 Stunden gerührt, um die Verseifung zu bewirken. Hier kann die Natriumhydroxidlösung einverleibt werden, indem man sie tropfenweise zugibt, um schließliche diesen Bereich zu erreichen. Falls die NaOH- Konzentration des Bads niedriger als 0,1 N ist, schreitet die Verseifung nicht genügend voran, und andererseits können in den Kügelchen Risse auftreten, falls sie 5 N überschreitet. Wenn der Alkoholgehalt außerhalb des oben genannten Bereichs liegt, können nicht wünschenswerte Phänomene wie Elution oder Leckage des verseiften Konjakmannans und abnormales Fortschreiten der Verseifung usw. auftreten.
Während dieser Verseifungsstufe wird der Konjakmannan-Ester in den Kügelchen verseift und das in den Kügelchen enthaltene Verdünnungsmittel wird in den Alkohol extrahiert werden, wobei es viele Hohlräume oder Poren in den Kügelchen hinterläßt, um eine poröse Makrostruktur zu bilden.
Eine konkrete Art, die Verseifung mit einer wäßrigen Alkalilösung zu bewirken, besteht darin, daß die sphärischen Kügelchen von Konjakmannan-Ester in eine wäßrige Lösung, hergestellt durch Auflösung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid in einer wäßrigen Lösung von Natriumsulfat, eingebracht werden, und die Mischung dann 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird.
Die Konzentration des Alkalihydroxids in dieser wäßrigen Lösung ist 10 - 15 Gew.-% und die Menge an Alkalihydroxid darf nicht weniger als 50 %, bezogen auf die Menge des Konjakmannan-Esters, betragen. Die Menge an verwendeten Natriumsulfat kann im Bereich von 20 bis 30%, bezogen auf das Gesamtgewicht der wäßrigen Lösung, liegen.
Unter den oben beschriebenen konkreten Arten der Verseifung kann die Verwendung der Mischung Alkohol/wäßriges NaOH aus den Gründen bevorzugter sein, daß sie gleichzeitige Elution oder Entfernung des restlichen Lösungsmittels usw. verwirklicht.
Die so erhaltenen Konjakmannan-Kügelchen, deren Wasserlöslichkeit durch die Verseifung wiederhergestellt worden ist, werden dann mit einem Vernetzungsmittel in Kontakt gebracht. Das Vernetzungsmittel wird in das Innere des sphärischen Konjakmannan-Kügelchens eindringen, um Vernetzung der Konjakmannan-Moleküle miteinander zu verwirklichen. Als Vernetzungsmittel können bifunktionelle Verbindungen, wie Epichlorhydrin, Diepoxybutan, Tolylendiisocyanat, Hexamethylendiisocyanat usw., verwendet werden. Das Vernetzungsmittel wird in Form einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel eingesetzt.
Als organisches Lösungsmittel für das Vernetzungsmittel können Kerosin oder flüssiges Paraffin oder eine Mischung davon (beispielsweise in einem Volumenverhältnis von 7 : 3) unter Zugabe eines oberflächenaktiven Stoffes (eines nichtionischen Tensids, wie z.B Sorbitan-Fettsäureester) in einer Menge von 1 - 2 Gew.-% verwendet werden. Ein weiteres Beispiel des Lösungsmittels für das Vernetzungsmittel besteht in einer Mischung aus Aceton mit Dimethylsulfoxid (mit einem Volumenverhältnis von zum Beispiel 6 : 4).
Die Konzentration der Vernetzungsmittel-Lösung kann mindestens 0,01 Mol pro Liter Vernetzungs-Lösung und vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 15 Mol pro Liter Vernetzungs-Lösung sein.
Die Vernetzung von Konjakmannan in den sphärischen Kügelchen wird erreicht durch Einbringen von 1-5 Gewichtsteilen der Konjakmannan-Kügelchen in 100 Gewichtsteile der Vernetzungsmittel-Lösung und Rühren der Mischung bei einer Temperatur von etwa 60ºC für 24-36 Stunden. Die so vernetzten sphärischen Konjakmannan- Kügelchen werden dann abfiltriert und mit Aceton gespült und dann unter Verwendung eines neutralen Tensids gewaschen, gefolgt von einem Waschvorgang mit Wasser.
Wenn die Menge an verwendetem Vernetzungsmittel unterhalb des angegebenen Wertes ist, ist die Stabilität unter Druck verringert.
Der erfindungsgemäße Ionenaustauscher basiert auf Konjakmannan-Kügelchen, in die Reste von einer oder mehreren Ionen-austauschfähigen Gruppen durch eine chemische Behandlung davon eingebracht wurden. Er ist deshalb in Wasser, wäßrigem Alkali und in wäßriger Säure nicht löslich und ist physisch robust. Sein Quellgrad beträgt vorzugsweise 1,5 bis 15, bevorzugter 1 bis 8, so daß er gutes Wasser-Rückhaltungsvermögen aufweist, was ihn für die Verwendung für allgemeine Ionenaustausch-Zwecke geeignet macht. Wenn der Quellgrad weniger als 1,5 beträgt, können die Kügelchen aufgrund der Herabsetzung im Wasser- Rückhaltevermögen in der Praxis nicht für einen Ionenaustauscher verwendet werden. Falls der Quellgrad 15 überschreitet, wird die Druckfestigkeit der Kügelchen in unerwünschtem Ausmaß verringert.
Das Ausschluß-Grenzmolekulargewicht des erfindungsgemäßen Ionenaustauschers ist 10&sup5; bis 10&sup8;. Produkte mit einem derartig hohen Ausschluß-Grenzmolekulargewicht besitzen beträchtlich höhere Druckfestigkeit als andere Gel- Produkte. Die neuartigen Produkte sind nützlich für die Trennung von Materialien wie z.B. Proteinen.
Das "Ausschluß-Grenzmolekulargewicht" bedeutet, daß Teilchen, die ein höheres Molekulargewicht als diese Begrenzung haben, nicht durch die Mikroporen des Füllmaterials hindurchdringen werden. Dies wird in der Praxis als Molekulargewicht repräsentiert, bestimmt durch ein Verfahren, bei dem eine Reihe von wäßrigen Lösungen einer bestimmten hochmolekularen Substanz, wie Dextran, Polyethylenglycol etc., mit variierenden, bekannten Molekulargewichten durch eine Säule, beschickt mit dem zu testenden Füllmaterial, geleitet wird, um jede eluierte Menge unter Verwendung eines Differential-Refraktometers, Spektrophotometers usw. zu beobachten, und die beobachteten Daten in eine Kurve hinsichtlich des Molekulargewichts der beobachteten Substanz aufgezeichnet werden, und der Molekulargewichts-Wert am Knickpunkt der Kurve abgelesen wird.
Die erfindungsgemäßen Ionenaustauscher, die auf Kügelchen aus vernetztem Konjakmannan basieren, sind besonders geeignet für die Verwendung als Füllmaterial für Ionenaustausch-Chromatographie, während andere Verwendungen für universale Ionenaustauschzwecke auch zulässig sind.
Durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Ionenaustauschers in der Ionenaustausch-Chromatographie kann ein deutlicher Anstieg in der Trennungseffizienz beim Trennen verschiedener biologischer Substanzen erreicht werden, da er eine außergewöhnlich hohe Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit, die derartige biologische Substanzen enthält, erlaubt, welche die herkömmlichen Ionenaustauscher niemals erlaubten. Bei einer Trennung physiologisch aktiver Substanzen oder dergleichen ist es erforderlich, Behandlungsoperationen innerhalb eines möglichst kurzen Zeitraums zu bewirken, da aufgrund des möglichen Vorhandenseins von Instabilität der beinhalteten Substanzen während der Trennungsverfahren eine Aktivitätsdepression der Substanzen auftreten kann. Hier wird eine hohe Fließgeschwindigkeit der der Ionenaustausch- Chromatographie zu unterziehenden Flüssigkeit derartige Probleme ersparen und ein erfinderisches Merkmal des erfindungsgemäßen Ionenaustauschers offenbaren.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung mittels Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

(1) Herstellung von vernetzten Konjakmannan-Kügelchen

40 g Konjakmannan-Pulver wurden in 4 l entionisiertem Wasser bei 60-70ºC unter Rühren aufgelöst. Diese Lösung wurde in kleinen Portionen in 6 l Ethanol getropft, um Ausfällung des Glucomannans (Konjakmannans) zu bewirken, welches abfiltriert und an Luft und dann unter Vakuum bei 20ºC getrocknet wurde. 30 g dieses getrockneten Glucomannans (Konjakmannans) wurden in 1 l Formamid eingeführt und zwei Tage gelagert, um es zum Quellen zu bringen. Dazu wurden dann 300 ml Pyridin und 300 ml Essigsäureanhydrid gegeben, um Umsetzung mit dem gequollenen Glucomannan (Konjakmannan) zu veranlassen. Die Umsetzung wurde 5 Tage bei 50ºC durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde dann unter Rühren in 7 l Wasser gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Der Niederschlag wurde dann in Luft getrocknet und dann unter Vakuum. 3 g dieses getrockneten Produkts wurden in 300 ml Chloroform, das 10,5 ml Decahydronaphthalin enthielt, aufgelöst. Diese Lösung wurde dann unter Rühren in 3 l 2%ige wäßrige Lösung eines zu 90% verseiften Polyvinylalkohols getropft, und durch Fortsetzen eines adäquaten Rührens wurden Flüssigkeitströpfchen der Chloroformlösung mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 44 - 105 um gebildet. Durch allmähliches Kühlen dieser Suspension über 24 Stunden wurden verfestigte Teilchen erhalten, die durch Filtration abgetrennt und mit Wasser gewaschen wurden. Dieses teilchenförmige Produkt wurde dann in eine Lösung, zusammengesetzt aus 270 ml Methanol und 30 ml 10 N NaOH, eingeführt, und die Verseifung wurde bewirkt, indem man die Mischung 24 Stunden unter Rühren hielt. Die so verseiften Kügelchen wurden dann durch Filtration abgetrennt und in ein Vernetzungsbad, hergestellt durch Auflösen von 35 g Epichlorhydrin in 300 ml einer 1 : 1 Mischung von Aceton und Dimethylsulfoxid, eingebracht, und die Vernetzungsreaktion wurde 24 Stunden bei 60ºC durchgeführt.

(2) Einführen von Ionen-austauschfähigen Gruppe in die Kügelchen

Ein in ein Eisbad eingetauchter 300 ml-Dreihalskolben wurde mit 5 g (Trockengewicht) vernetzten Glucomannan (Konjakmannan)-Kügelchen beschickt und dazu wurden 40 ml 4 N wäßriger Lösung von Natriumhydroxid gegeben, um die Kügelchen 1 Stunde unter Rühren einzuweichen. Dazu wurden dann 10 ml wäßrige Lösung von 2-Chlortriethylamin-Hydrochlorid, dessen Konzentration auf 3 g/ml eingestellt worden war, gegeben. Die resultierende Mischung wurde auf 80-83ºC erwärmt und die Reaktion wurde 1 Stunde lang durchgeführt. Nach 1 Stunde wurde der Dreihalskolben erneut in das Eisbad getaucht, um die Reaktionsmischung zu kühlen, worauf die Kügelchen mit Ansaugung auf ein Filtertuch filtriert wurden. Die Kügelchen wurden mit etwa 5000 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Es wurde ein Ionenaustauscher aus vernetzten Glucomannan(Konjakmannan)-Kügelchen, in die gebundene Reste von Diethylaminoethyl eingeführt worden waren, erhalten. Die gesamte Ionenaustauschkapazität wurde bestimmt, indem man eine Portion der so erhaltenen Kügelchen als Probe entnahm und sie einer Neutralisierungs-Titration unterzog, und es wurde gefunden, daß sie 0,95 mÄq pro g Trockenkügelchen war.
Die vernetzten Glucomannan (Konjakmannan)-Kügelchen mit darin gebundenen Resten der DEAE-Gruppe, die wie oben erhalten und unter Einweichen in Wasser gelagert worden waren, wurden in eine Säule aus rostfreiem Stahl mit einer Länge von 300 mm und einem Innendurchmesser von 5 mm gepackt. Unter Verwendung dieser gepackten Säule wurden Versuche hinsichtlich der Beziehung der Fließgeschwindigkeit der durch die Säule strömenden Flüssigkeit und des resultierenden Druckverlusts (Δp) durchgeführt, indem man die Fließgeschwindigkeit und den Flüssigkeits-Eingangsdruck beobachtete, indem man die Flüssigkeit unter Einsatz einer Hochdruck-Einspeispumpe fließen ließ. Die beobachteten Werte sind graphisch wie in Fig. 1 gezeigt dargestellt.
Als Vergleichsbeispiele wurden ähnliche Versuche unter Verwendung zweier handelsüblicher Produkte, nämlich DEAE- Sephadex A-50 (Warenzeichen) und DEAE-Sepharose CL-6B (Warenzeichen) der Firma Pharmacia Fine Chemicals, durchgeführt. Die Ergebnisse sind, um des Vergleichs mit denen der erfindungsgemäßen Kügelchen willen, ebenfalls in dem Schaubild von Fig. 1 dargestellt.
Aus dem Graphen von Fig. 1 sieht man, daß die Druckfestigkeit des erfindungsgemäßen DEAE-Glucomannan (Konjakmannan)-Ionenaustauschers erheblich höher als die der Kügelchen von DEAE-Sephadex A-50 und von DEAE- Sepharose CL-6B ist, da es sogar bei höheren Fließgeschwindigkeiten eine lineare Beziehung zwischen der Fließgeschwindigkeit und dem Druckverlust Δp gibt, ohne irgendeinen steilen Anstieg des Drucks zu verursachen.

Beispiel 2

In einem 50 ml Dreihalskolben wurden 2 g (Trockengewicht) der im obigen Beispiel 1 erhaltenen vernetzten Glucomannan (Konjakmannan)-Kügelchen in 20 ml 10 N wäßriger Lösung von Natriumhydroxid eingeweicht. Während der Kolben durch Eintauchen in ein mit Eiswasser gefülltes Bad mit konstanter Temperatur gekühlt wurde, wurde die Reaktionsmischung in dem Kolben 1 Stunde unter Verwendung eines Rührers leicht gerührt gehalten. Dazu wurde anschließend eine wäßrige Lösung von Monochloressigsäure (8 g Monochloressigsäure + 16 ml Wasser von höchster Reinheit) gegeben, und die Temperatur des Kolbeninhalts wurde auf 70ºC angehoben. Nach 1 Stunde von dem Erreichen der 70ºC an wurde die Reaktionsmischung durch einen Glasfilter filtriert, und die so abgetrennten Kügelchen wurden mit Wasser ultrahoher Reinheit ausreichend gewaschen. Die Ionenaustauschkapazität der so gewaschenen Kügelchen wurde bestimmt, nachdem sie auf übliche Weise einer Konditionierung unterzogen worden waren. Es wurde gefunden, daß die Kapazität 2,3 mÄg. pro g Trockenperlen war.

Beispiel 3

Unter Verwendung einer Glassäule mit einem Innendurchmesser von 5 mm und einer Länge von 100 mm, gepackt mit DEAE- Glucomannan-Ionenaustauscher, der gebundene Reste von Ionen-austauschfähigen Gruppen darin eingeführt aufwies, der so hergestellt worden war, daß er eine Gesamt- Ionenaustausch-Kapazität von 0,15 mÄq. pro ml Gel hatte, wurde ein Adsorptions-Elutions-Versuch für Human-Albumin und für Hämoglobin ausgeführt.
Die Konzentration dieser Substanzen in der durch die Säule zu leitenden Flüssigkeit wurde bei jeweils 4 mg/ml festgelegt, und die Beschickungsmenge davon wurde bei 5 ul eingestellt. Für die Ionenadsorption wurde eine Pufferlösung von 0,02 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan (pH = 8,02) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min. durch die Säule geleitet. Für die Elution wurde eine Pufferlösung von 0,5 M NaCl/0,02 M Tris(hydroxymethyl)aminoethan (pH = 8,02) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min. durch die Säule geleitet. Die Elutionszeit für jede der Substanzen wurde ermittelt als:
10,4 Minuten für Human-Albumin
10,2 Minuten für Hämoglobin.
Die Fließgeschwindigkeit der Lösung wurde sowohl für Human- Albumin als auch für Hämoglobin im Bereich von 0,5 ml/Min. bis 5 ml/Min. varriiert, und die Säule wurde bei dem nachfolgenden Versuch nach Regenerierung der Kügelchen und deren Waschung mit Wasser wiederverwendet. In dem Versuch, der das herkömmliche Handelsprodukt (DEAE-Sepharose) verwendete, war es praktisch unmöglich, die Lösung bei Fließgeschwindigkeiten von über 2 ml/Min. fließen zu lassen.

Claims

1. Ionenaustauscher, umfassend Kügelchen von vernetztem Konjakmannan mit Resten von einer oder mehr Ionenaustauschfähigen Gruppen, worin das vernetzte Konjakmannan ein Ausschluß-Grenzmolekulargewicht von 10&sup5; bis 10&sup8; aufweist.

2. Ionenaustauscher nach Anspruch 1, der eine Ionenaustausch-Kapazität von 0,1 bis 5 meq/g der trockenen Kügelchen aufweist.

3. Ionenaustauscher nach Anspruch 1 oder 2, worin die Ionen-austauschfähige Gruppe oder Gruppen aus Carboxymethyl, Sulfomethyl, primären, sekundären, tertiären oder quaternären Aminoethyl-Gruppen, Sulfopropyl und Phosphat ausgewählt sind.

4. Ionenaustauscher nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Kügelchen des vernetzten Konjakmannans einen Quellgrad von 1,5 bis 15 und einen durchschnittlichen Durchmesser der Kügelchen von 5 bis 500 um aufweisen.

5. Ionenaustauscher nach Anspruch 4, worin die Kügelchen des vernetzten Konjakmannans einen Quellgrad von 2 bis 8 aufweisen.

6. Ionenaustauscher nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, der durch die Schritte erhalten wird, bei denen man verestertes Konjakmannan zu Kügelchen verarbeitet, die Kügelchen der Verseifung und Vernetzung unterwirft, und durch chemische Behandlung die Reste einführt.

7. Ionenaustauscher nach Anspruch 6, worin mehr als 85% der Hydroxylgruppen im Konjakmannan verestert sind.

8. Verfahren zur Herstellung eines Ionenaustauschers nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches umfaßt, daß die in Anspruch 6 oder 7 definierten Schritte ausgeführt werden.

9. Ionenaustausch-Säule, die einen Ionenaustauscher nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.

10. Ionenaustausch-Verfahren, welches umfaßt, daß eine Ionen-enthaltende Flüssigkeit mit einem Ionenaustauscher nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 in Kontakt gebracht wird.