DE3853854T2

DE3853854T2 - Vakzin gegen Neisseria meningitidis Gruppe-B, Gammaglobulin und Transferfaktor.

Info

Publication number: DE3853854T2
Application number: DE3853854T
Authority: DE
Inventors: Jorrin Gonzalo Bisset; Huergo Concepcion Campa; Dominguez Manuel Alfr Galguera; Imia Luis Guillermo Garcia; Vazquez Maria Merced Gutierrez; Rizo Gisela De La Cari Puentes; Herrera Maria Del Car Sampedro; Gonzalez Victoriano Gus Sierra; Padron Franklin Sotolongo; Le Riverend Morales El Xochitl
Original assignee: Centro Nacional de Biopreparados
Current assignee: Centro Nacional de Biopreparados
Priority date: 1987-07-30
Filing date: 1988-07-30
Publication date: 1996-02-08
Anticipated expiration: 2008-07-31
Also published as: AU5319794A; US5597572A; GR3017218T3; AU2031288A; RU2023448C1; EP0301992A3; AU8134991A; CA1341199C; ATE122893T1; ES2074445T3; JPH01125328A; AU615461B2; IN167607B; EP0301992B1; DE3853854D1; US5747653A; EP0301992A2

Description

Technischer Bereich

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den medizinischen Bereich und ganz speziell auf die Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die durch pathogene Bakterien verursacht wurden.
Ziel dieser Erfindung ist, eine Methode zur Gewinnung eines Vakzins gegen die verschiedenen Serotypen von Neisseria meningitidis Gruppe B und auch das resultierende Vakzin zur Verfügung zu stellen.
Ein anderes Ziel der gegenwärtigen Erfindung ist, eine Methode zur Verfügung zu stellen zur Gewinnung von Antimeniningokokken- Hyperimmun-Gammaglobulin sowie das so gewonnene Gammoglobulin.
Schließlich besteht ein zusätzliches Ziel dieser Erfindung in einer Methode zur Gewinnung eines spezifischen Transfer-Faktors (dialysierbarer Faktor in Leukozyten-Extrakten), der zum Transfer von T-Zellen-Immunität gegen Neisseria meningitidis B verwendet wird, sowie der Transfer-Faktor selbst.

Gegenwärtige Technik

Neisseria meningitidis besitzt die typische Hülle gramnegativer Bakterien, die sich aus einer Zytoplasmamembran, einer Peptidoglycan-Schicht und einer äußeren Membran mit drei Schichten zusammensetzt, die zusammen mit dem Kapsel- Polysaccharid die Bakterienzellwand bildet.
Aus immunologischer Sicht sind die Strukturen, die potentiell in irgendeiner der Phasen der Beziehung zwischen Mikroorganismus und Wirt mit dem Immunsystem in Kontakt kommen können, speziell die der ersten Phasen, d.h. die meistäußerlichen Komponenten, von Bedeutung. Es ist kein Zufall, daß die Einstufung dieses Mikroorganismus auf Basis der Gruppen, Typen und Untertypen durchgeführt wurde, die dank der Reaktion mit polyklonalen (Frasch, C.E. and Chapman, 1973, J. Infect. Dis. 127; 149-154) oder monoklonalen Antikörpern (Hussein, A., Monoclonal Antibodies and N. meningitidis. Proefshift. Utrecht, 1988) festgelegt wurden.
Heute sind 12 Serogruppen bekannt: A, B, C, X, Y, Z, 29-E, W135, H, I, K und L (Ashton, F.E. et al., 1983, J: Clin. Microbiol. 17: 722-727; Branham, S.E., 1956, Can. J. Microbiol. 2: 175-188; Evans, A.C., 1920, Lab. Bull. 1245: 43:87; Shao-Quing et al., 1972, J. Biol. Stand. 9: 307-315; Slatoruc, K.W., 1961, Ant. v. Leeuwenhoek J. Microbiol. Serol. 29: 265-271). Solche Gruppen wurden entsprechend dem Kapsel-Polysaccharid (CPS) differenziert, das Unterschiede in bestimmten Antigendeterminanten bei jeder dieser Gruppen aufweist (Branham, S.E., 1940, Bacteriol. Rev. 4: 59-96; Frasch, C.E. et al., 1985, Rev. Infect. Dis. 7: 504-510).
Trotz Veränderungen der epidemiologischen Situation in verschiedenen Regionen der Erde und der auf einen Mangel an adäquaten Gesundheitskontrollsystemen in einigen Ländern zurückzuführenden "Kenntnislücke" war es möglich nachzuweisen, daß unter all diesen Gruppen zur Zeit nur die Gruppen A, B, C, Y und W-135 für mehr als 90% der Fälle in der Welt verantwortlich sind (Abdillahi, H., 1988, Proefschrift, pag. 13, Utrecht, Nederland); gemäß anderen Autoren sind sie für mehr als 95% der Fälle verantwortlich (Frasch, C.E. Enr. J. Microbiol. 4: 533-536).
Die gereinigten und charakterisierten und bisher als Vakzine verwendeten Kapsel-Polysaccharide haben sich als genügend wirksam erwiesen, die Ausbrüche und Epidemien aufgrund der Gruppen A, C, Y und W-135 unter Kontrolle zu bringen, als mono-, di-, tri- oder tetravalente Vakzine (Gold et al., 1969-1970, Bull. WHO 45: 272- 282; Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med. 129: 134-136; Hankins, 1982, Proc. Soc. Biol. Med. 169: 54-57). Trotz der noch zu lösenden Unzulänglichkeiten - wie z.B. schlechte oder keine Reaktion auf Polysaccharid C bei Kindern unter 2 Jahren und die Thermolabilität des Polysaccharids A, neben Schwierigkeiten bezüglich der Iduktionstoleranz nach der Wiederimpfung mit den Polysacchariden A und C bis zu dem Punkt, daß an einigen Plätzen ein Anstieg der Fälle entdeckt wurde (Marzochi, K.B.F. Meningite Meningococcica. Tese (doutorado) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil (328 pag.) - stellen die Polysaccharid-Vakzine, auch wenn Sie noch nicht definitiv sein können, jetzt eine genügend effektive Waffe im Kampf gegen Krankheiten dar, die durch die Gruppen A, C, Y und W-135 verursacht werden, aber nicht gegen die Gruppe B, deren Kapsel-Polysaccharid ein sehr schlechtes Immunogen ist (Wyle et al., 1972, J. Infect. Dis. 126: 514-522; Zollinger et al., 1981, J. Immunol. 127: 104-108). Dies kann auf verschiedene Ursachen zurückzuführen sein, wie z.B. die Kreuzreaktivität mit Antigenen des Wirtes selbst (Hirn- Sialoglykopeptide), bei der Reingigung dieser Polysaccharide stattgefundene Gestaltveränderungen und ihre große Empfindlichkeit gegenüber enzymatischen oder anderen in dem Organismus auftretenden Abbauprozessen, wie z.B. schnelle Veresterung, usw. (Lifely, M.R. und Moreno, C., Lancet, Jan. 25, 214-215). Das endgültige Ergebnis besteht trotz der intensiven Arbeit der wichtigen Forscher und Gesellschaften, wie z.B. die Welcome Fdtion., darin, daß es bisher unmöglich gewesen ist, das Polysaccharid der Gruppe B in ein zufriedenstellendes Immunogen umzuwandeln. Aus den oben erwähnten Gründen gilt die generelle Lösung für die anderen als Vakzine angewandten Polysaccharid- Gruppen nicht für die Gruppe B. Außer der Tatsache, daß die Serogruppe B heute die Hauptursache der durch Meningokokken hervorgerufenen Krankheiten in den meisten Ländern mit gemäßigtem Klima sowie anderen Regionen überall auf der Erde ist, ist aus den oben erwähnten Gründen notwendig, alternative Vakzine zu gewinnen. Jeder Versuch, diese alternativen Vakzine zu finden, sollte deshalb nicht auf Kapselantigenen basieren, speziell nicht auf denen der äußeren Membran, unter Berücksichtigung ihrer Bedeutung in der Beziehung zwischen Mikroorganismus und Wirt.
In bezug auf die Membrankomponenten hat fast jede Arbeitsgruppe die Proteine in den Mittelpunkt ihres Interesses gestellt, weil die anderen relevanten Komponenten die Lipopolysaccharide (LPS) wären, deren hochtoxische Natur, ihre hohe Pyrogenaktivität und ihre Mitogenkapazität jedoch verhindert haben, diesen Bestandteil als Vakzin-Option anzusehen, obgleich er der wichtigste in der Pathogenese der Meningokokkenerkrankungen ist.
Die Mehrheitsproteine in der äußeren Membran, sowohl der Gruppe B als auch der Gruppe C, führen zu Unterteilungen dieser Gruppen in Serotypen (von jetzt an beziehen wir uns nur auf die Gruppe B). Sie basieren auf der immunologischen Spezifität dieser Mehrheitsproteine, die bei Reaktionen mit den polykonalen und monoklonalen Antikörpern in verschiedenen Techniken (Abdillahi, U. Proefschrift, Utrecht, Nederland, 1988) entdeckt wurde. Die Gruppe B wurde schon in mehr als 18 Serotypen unterteilt.
Für diese Identifizierung wurden solche Verfahren angewandt, wie z.B. doppelte Immundiffusion, Gegen-Immunelektrophorese, Radioimmuno-Assay, ELISA, SPRIA, Koagglutination unter Anwendung von mit Protein A beschichtetem Staphylococcus aureus zur Fixierung monoklonaler Antikörper oder anderer fester Träger, Agglutination durch Latex usw. (Gold, R. und Wyle, F.A., 1970, 1: 479-484; Jones, O.M. und Tobin, B.M., 1976, J. Clin. Pathol. 29: 746-748; Zollinger, W.D. und Mandrell, R.E., 1977, Infect. Immun. 5: 98-102; Frasch, C.E. und Chapman, S.S., 1973, Infect. Dis. 127: 149-154; Danielsson, D. und Olsen, 1979, J. Clin. Pathol. 32: 136-142).
Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper war es sogar möglich, weitere verschiedene Serotypen zu unterteilen, indem man sie in Beziehung setzte zu ihrem Grad an "Virulenz", d.h. der Serotyp 2 wurde unterteilt in 2a, 2b und 2c (Abdillahi, H. und Poolman, J.T., 1988, Proefschrift Ch. 6 pag. 69-78, Utrecht, Nederland; Poolman, J.T. et al., 1980, J. Oen. Microbiol. 116: 465:473).
Es ist offensichtlich, daß wir durch Verwendung der Mehrheitsproteine der äußeren Membran als Basis für das Immunogen ein Immunogen eines spezifischen Serotyps herstellen. Trotz der Tatsache, daß festgestellt wurde, daß von allen Serotypen nur wenige Krankheitserreger sind (Frasch, C.E. et al., 1972, Seminar in Infections Diseases, Vol 1 S.I.M. Book Corp., N.Y. 304-337), während andere selten sind, wäre die Herstellung eines auf einem Serotyp basierten Immunogens unmöglich, das ausreichende Antigendeterminanten für alle krankheitsverursachenden Serotypen hätte. Deshalb haben derartige Serotyp-Vakzine einen engen Effektivitätsbereich, der nur auf den spezifischen Serotyp abzielt, mit dem das Vakzin ausgearbeitet wurde. Dies war die Geschichte fast aller Proteinvakzine, die in den letzten paar Jahren hergestellt wurden, und das war - unter einigen anderen - eine ihre Haupteinschränkungen. Auf Proteinen des Serotyps 2a basierende Vakzine wurden aus Vesikeln der äußeren Membran hergestellt (Fasch, C.E. et al., 1982, Infect. Immun. 37: 271- 280), und bestimmte Varianten dieser Vakzine wurden hinsichtlich ihrer Immunisierung und Toxizität an Tieren studiert (Pepler et al., 1982, Infect. Immun. 37: 264-270) und auf ihre Sicherheit und Immunisierung hin an freiwilligen Erwachsenen geprüft (Frasch, C.E. et al., 1982, Sem. Infect. Dis., 4; Zollinger et al., 1979, J. Clin. Invect. 63: 836-484).
Andere Forschungsarbeiten offenbaren auch die Bedeutung der Löslichkeit dieser Vakzine (Frasch, C.E. et al., 1982, Sem. Infect. Dis. 4; Frasch, C.E., 1978, J. Exp. Med. 147: 629- 644).
Über die Vorzüge der Anwendung von Kapsel-Polysacchariden und verschiedener Hilfsstoffe aus Aluminiumhydroxid oder Phosphat wurden auch durch zahlreiche Autoren berichtet (Frasch, C.E., 1983, Med. Microbiol. Vol. 2 Acad. Press, N.Y.). In einigen Fällen wurde eine sorgfältige Studie durchgeführt in bezug auf die Korrelationen zwischen den Proportionen dieser Komponenten, ihre Elektronenmikroskopiedarstellung und ihre Reaktion bei verschiedenen Tieren, einschließlich Primaten und Menschen verschiedener Altersgruppen (Campa, C. et al., 1986).
In unserer Forschungsarbeit (Campa, C. et al., bereit zur Veröffentlichung) fanden wir sogar die Lösung für den Mangel an Immunisierung bei Kindern unter 2 Jahren.
Die ersten Auswertungen von Effektivitätsversuchen wurden durch eine kubanische Delegation bei der Fünften Internationalen Konferenz über pathogene Neisseria vorgestellt (Campa, C.A. und Sierra, G., 1987, Interf. y biotecn., Vol. 4: 259-260).

Zusumenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode zur Gewinnung eines Vakzins gegen verschiedene pathogene Serotypen von Neisseria meningitidis der Gruppe B entsprechend den Patentansprüchen 1-10 zur Verfügung. Das Hauptmerkmal basiert auf der Anwendung eines Protein-Antigen-Komplexes mit einem allen pathogenen Serotypen gemeinsamen hohen Molekulargewicht, welcher, verankert in den Vesikeln der äußeren Membran des Mikroorganismus, gebildet aus - unter anderen Komponenten - Serotyp-Mehrheitsproteinen des in der gesamten Herstellung mit Adjuvanten angewandten Stammes, die Gewinnung eines schützenden Präparats ermöglicht, das nie zuvor erlangt wurde.
Die Vesikel bilden einen der Bestandteile des Vakzins, die Antigendeterminanten der Antigen-Mehrheitsproteine beisteuern, sie regulieren immunologisch LPS und bilden die ideale Struktur zur Verankerung anderer Proteine, die in dem B Meningococcus in einer Minorität vorkommen, die aber allen getesteten pathogenen Typen gemeinsam und sehr gute Immunogene sind, die eine langandauernde bakterizide Reaktion induzieren.
Die weitreichende gemeinsame Schutzeigenschaft ist durch die Antigen-Gemeinsamkeit in der Gruppe B im Bereich des Protein- Antigen-Komplexes mit hohem Molekulargewicht gegeben. Der Protein-Antigen-Komplex mit hohem Molekulargewicht "unterstützt" und erhöht ebenfalls die Reaktion auf andere Antigene, abgesehen davon, daß er ebenfalls für das verlängerte immunologische Gedächtnis sorgt.
Die Serotyp-Antigene sind im ersten Stadium der Schutzreaktion (4-6 Monate) wichtig, aber danach wird hauptsächlich der schützende Titer gegenüber dein Protein-Antigen-Komplex mit hohem Molekulargewicht festgestellt.
Aus diesem Grund ist die zweite Komponente unseres Vakzins der Protein-Antigen-Komplex mit dem Molekulargewicht von 65-95 KD, der in Vesikeln in einem Verhältnis von 15 % ± 3 hinzugefügt wird.
Die Vesikel selbst würden wahrscheinlich als ein Serotyp-Vakzin mit gemäßigter und flüchtiger Wirksamkeit dienen.
Ein anderes Merkmal der Methode ist die Extraktion von Proteinen aus der äußeren Membran durch kombinierte Behandlung lebender Mikroorganismen mit einem Detergens, Enzym und Ultraschallbad, genauer die Verwendung von Natriumdeoxycholat, Natriumdodecylsulfat und Brij-96 als Detergens in den folgenden jeweiligen Konzentrationen: niedriger als 1%, von 0,1-5% und von 0,01-0,5%, wobei alle unabhängig kombiniert sind mit Lysozym in einer Konzentration von 0,03-1% und einem Ultraschallbad. Eine Variante dieses Extraktionsverfahrens besteht in der Verwendung von Tween 80 in einer Konzentration von 0,1-2% kombiniert mit einem Ultraschallbad.
Beispiele für Membranprotein-Extraktionsmittel: EXTRAKTIONSMITTEL AUSBEUTE DOC weniger als 0,1% + Lysozym 0,03% + US Tween 80 0,1% + US SDS 0,1-0,5% + Lysozym Brij-96 0,1-0,5% + Lysozym 0,03-1% + US
US: Ultraschallbad. Die Infizierungs-DNA bezieht sich auf den Prozentsatz der gesamten DNA/Gesamtproteine, die in den folgenden Schritten beseitigt werden muß.
Das Extraktionsverfahren für die Membranproteine wird bei einer Temperatur zwischen 2-10ºC mit einer Extraktionszeit zwischen 15 Minuten und 5 Stunden unter magnetischem oder mechanischem Rühren (250-950 rpm) durchgeführt; das Medium, in dem die Extraktion stattfindet, kann durch verschiedene wäßrige Puffer gebildet werden, und der pH-Wert liegt zwischen 6,5-9,0, abhängig von der angewandten Extraktionskombination; das magnetische oder mechanische Rühren kann mit einer Ultraschallbehandlung abgewechselt werden.
Das Proteinextrakt wird durch eine dissoziative Behandlung mit einem Detergens, eine Ultraschallbehandlung und eine Chromatographie nach der Entfernung von Nukleinsäuren gereinigt. Diese Kombination, die Modulation des Inhaltes an LPS, Phospholipiden und anderen Lipiden der Vesikel sorgen für die Leistungsfähigkeit des Vakzins, eine effektive Antikörperreaktion gegen Endotoxin herbeizuführen. Als Detergenzien werden Natriumdeoxycholat, Brij96 , Tween 20 oder Tween 80 in einer Konzentration von 0,1-6 % verwendet. Die Molekularsiebung wird in einer Sephacryl C1-4 Säule durchgeführt.
Das Antigenmaterial, das sich aus der Modulation zur Gewinnung des Protein-Antigen-Komplexes mit einem hohem Molekulargewicht von 65-95 KD ergibt, wird durch Anwendung der HPLC- Chromatographie (TSK 3000 SWG Säule) oder der Affinitätschromatographie oder der Ionenaustauschchromatographie oder einer Kombination irgendwelcher dieser Verfahren gereinigt.
Der Protein-Antigen-Komplex wird zu der die Vesikel enthaltenden Fraktion in einem Verhältnis von 15% ± 13 unter Ultraschallbehandlung hinzugefügt, so daß der Komplex auf den Vesikeln verankert wird.
Mit der Ultraschallbehandlung wird die Integration des Antigen- Komplexes auf den natürlich geformten Vesikeln, die schon Spuren solcher Proteine als Rückstand aus der Reinigung besitzen, erleichtert. Auf diese Art arbeitet das Vesikel als ein Träger oder Adjuvans in bezug auf das Antigen mit hohem Molekulargewicht.
Zur Fraktion, die die Vesikel enthält, wird Kapsel-Polysaccharide in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:4 bezogen auf Protein hinzugefügt sowie das Adjuvans in einem Verhältnis von 20-100 ug/ug Protein. Als Adjuvans können Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat oder Kalziumphosphat benutzt werden.
Durch Hinzufügen der vorerwähnten Proportionen von Kapsel- Polysaccharide und Adjuvans wird eine Erhöhung der Immunisierungsfähigkeit des Vakzinpräparates erreicht sowie eine adäquate Darstellung der Lipopolysaccharid-Komponente mit ihrer Fähigkeit, unerwünschte Reaktionen auf ein Mindestniveau zu reduzieren.
Die verschiedenen Komponenten der Vakzinmischung werden durch Ionisationsbestrahlung mit Kobalt 60 in Dosen von 5-25 Kgy bei einer Temperatur von 1-4ºC sterilisiert. Vor dem Zubereiten der Endmischung kann die Sterilisation auch mit diesem Verfahren durchgeführt werden, sobald die entstehende Mischung erlangt ist. Ionisationsbestrahlung wird zur individuellen oder gemeinsamen Sterilisation der Komponenten der Vakzinmischung in flüssiger oder lyophilierter Form für diesen Vakzintyp benutzt.
Alternativ kann die Sterilisation der Komponenten durch Membranfiltation ausgeführt werden.
Eine andere Variante der Sterilisationsschrittes besteht in der Anwendung beider Verfahren in Kombination: Ionisationsbestrahlung mit Kobalt 60 in den erwähnten Dosen und Temperaturen sowie Membranfiltration, und zwar derart, daß einige der Komponenten durch das erste Verfahren unabhängig sterilisiert werden und der Rest durch das zweite beschriebene Verfahren.
Das so durch die beschriebene Methode gewonnene Vakzin hat einen breiten langanhaltenden Schutzbereich gegen die verschiedenen pathogenen Serotypen von Neisseria meningitidis der Gruppe B. Es ist das erste Vakzin gegen B-Meningokokken, um das Niveau eines Masseneffizienz-Feldversuchs zu erzielen, dem sich schon insgesamt 300.000 freiwillige Impfstoffempfänger unterzogen haben.
Dieses Vakzin enthält eine immunologisch wirksame Menge des Protein-Antigen-Komplexes mit einem Molekulargewicht von 65-95 KD, die den verschiedenen pathogenen Serotypen eine Antigen- Gemeinsamkeit verleiht und die Produktion von bakteriziden Antikörpern induziert; es enthält auch eine Vesikelmenge in der benötigten Proportion, um eine starke Antikörperreaktion gegen die Serotyp-Antigen-Determinanten und das Endotoxin herbeizuführen, sowie einen Anteil an Kapsel-Polysaccharid, der sowohl die Löslichkeit und Immunisierungsfähigkeit des ganzen als auch die Reaktion des Organismus auf den Polysaccharid- Bestandteil erhöht, sogar bei Kindern unter 2 Jahren, und seine polyvalente Eigenschaft definiert. Das Vakzin wird durch die notwendige Adjuvansmenge optimiert.
Diese Erfindung ermöglicht auch - über Blutspenden von den Impfstoffempfängern - die Gewinnung eines Antimeningokokken- Hyperimmun-Gammaglobulin-Präparates, das erfolgreich in der Prophylaxe und Behandlung von Meningitis angewendet wird, die durch irgendeinen oder die verschiedenen pathogenen Serotypen von Neisseria meningitidis der Gruppe B verursacht werden, gegen die es bakterizide und neutralisierende Aktivität besitzt.
Diese Erfindung sorgt auch zum ersten Mal für die Gewinnung eines spezifischen Transferfaktors (dialysierbarer Faktor aus weißen Blutkörperchen von Spendern), der die Fähigkeit zur Übertragung von T-Zellen-Immunität gegen diesen Mikroorganismus besitzt.

Kontrollen

Die Kontrollen über das Polysaccharid C sind durch die Normen der WHO festgelegt und müssen strikt eingehalten werden.
Die Kontrollen für die Proteinherstellung sind folgende:
Elektrophorese in Polyacrylamid-Gel (Tsai und Frasch, 1980 J. Bacteriol. 141: 169-176). In den gewonnenen Elektrophoresemustern werden, außer den Serotyp-Mehrheitsproteinen, 12-15% Proteine des Antigen-Komplexes mit einem hohen Molekulargewicht von 65-95 KD gefunden.
KDO. (Osborn et al., 1963, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50: 499- 506). KDO ist eine Zuckersäure, die 5% der Lipopolysaccharidstruktur bildet. Sie ist daher als Indikator zur Bestimmung von Liposaccharidkonzentrationen geeignet. In der bis auf Feldniveau untersuchten Variante betrug die zulässige festgelegte Grenze 10 %.
Andere Varianten mit KDO über 10 % werden jetzt an menschlichen Freiwilligen untersucht.
Nukleinsäuren. Nach der Ausschaltung des Proteins durch extensives Phenol und Dialyse wird eine differenzielle Spektrophotometrie-Messung (260-280 mm) durchgeführt, um die feststellbare Abwesenheit von Proteinen zu nachzuweisen, und dann wird die Nukleinsäure-Konzentration durch Lichtadsorption bei 260 mm berechnet, indem folgender Extinktionskoeffizient benutzt wird:
Sialsäure: Der residuelle Gehalt an Polysaccharid B wurde entsprechend der Methode von L. Svennerholm (Biochem. Biophys. Proc. 24: 604, 1957) gemessen. In unserer bis auf Feldversuchsniveau durchgeführten Variante wurde eine Grenze von 1-10% festgelegt.
Elektronenmikroskopie: Sie wird als Routineverfahren durchgeführt, wie durch Frasch und Peppler (Infect. Immun. 37: 271-280, 1982) beschrieben. Die ultramikroskopische Darstellung ist mit der Löslichkeit und Immunisierungsfähigkeit verbunden. Andere Strukturstudien sind mit den zu untersuchenden Varianten in Arbeit.
Die Protein-Konzentration wurde durch die Lowry-Methode festgelegt (1951, J. Rial. Chem. 192: 265-275).

Abschließende Vakzin-Kontrollen

Die unten aufgeführten Zahlen beziehen sich auf die Variante unseres Vakzins, mit dem ein Feldversuch bei Menschen durchgeführt wird.

Zusammensetzung

Protein-Antigene: 100 ± 20 mcg pro ml. Polysaccharid: 100 ± 20 mcg pro ml. Aluminiumhydroxid (Gel): 4 mg pro ml. Thiomersal: 1 g in 10.000 ml. Die Dosis beträgt 0,5 ml.
Thiomersal: (Merthiolat, Sodium-Ethyl-Merkuri-Thisalizylat), wird durch Spektrophotometrie unter Anwendung von Diphenyl- Thiocarbzon bestimmt, entsprechend dem WHO MANUAL BLC/UNDP/77.1 Rev. 1 pp 84-85. Die zulässigen Grenzen reichen von 0,005 bis 0,02%.
pH-Messung:
Anwendung aller pH-Meßgeräte mit Glas und Kalomelelektrode und Standardpufferlösungen (BDH) mit den pH-Werten 5,0, 7,0, 9,0. Zulässige pH-Werte müssen sich im Bereich von 7,0 ± 0,4 befinden.
Bestimmung des Aluminiumgehaltes:
Sie wird entsprechend dem Appendix D.18 der Broschüre WHO/UNDP/77/ 1 Rev. 1 pp 87-88 durchgeführt.
Das Angemessenheitskriterium dar 1,25 mg Al (Aluminium) pro Dosis nicht überschreiten.

Bestimmung der Antigen-Konzentrationen und Prozentsatz des Absorption des Hilfsgels

Das absorbierte Vakzin wird zentrifugiert, und die Konzentrationen von Protein und Polysacchariden in der Schwemmschicht und dem Sediment werden durch Anwendung der oben erwähnten Methoden bestimmt.
Das Präparat wird akzeptiert, wenn nicht mehr als 20% der ursprünglich hinzugefügten Antigene in der Schwemmschicht frei werden.

Sterilitätskontrolle

Sie wird entsprechend den Spezifikationen im Appendix D.27 der BLG/UNDP/77.1 Rev. 1, General Requirements for the Sterility of Biological Substances und den entsprechenden kubanischen Normen bestimmt.

Unschädlichkeitskontrolle

Jede Charge wird auf Unschädlichkeit hin überprüft durch Verabreichung einer menschlichen Dosis (max. 1 ml) an 5 ausgewachsene Mäuse mit einem Gewicht von 17-22 g und einer Dosis von nicht mehr als 15 ml an 2 Meerschweinchen mit einem Gewicht von 250-350 g.
Das Präparat wird akzeptiert, wenn kein Tier während der nächsten 7 Tage nach der Impfung Krankheitszeichen aufweist. Wenn irgendeines des Tiere stirbt oder Krankheitszeichen aufweist und die anderen nicht betroffen sind, wird der Test wiederholt. Die Charge wird genehmigt, wenn keines der Tiere in der zweiten Gruppe innerhalb von 7 Tagen stirbt oder Krankheitszeichen aufweist.

Elektronenmikroskopie

Proben der endgültigen Vakzinchargen werden einer Elektronenmiskroskopie unterworfen, indem die bereits erwähnte Methode angewandt wird.

ELISA

Die immunenzymatische Analyse der Festphase wurde durchgeführt, wie durch Peppler und Frasch (Infect. Immun. 37: 264-260, 1982) beschrieben, und unseren Antigen-Kupplungscharakteristiken angepaßt, hauptsächlich um ein Bezugssystem für unsere Methode zu haben (Sierra et al., 1988. Rev. Cub. Ifn Biot., im Druck).
Dieses System basiert auf der Anwendung von PVC-Mikroplättchen mit mit Polystyrol beschichteten Vertiefungen und 10 mcl effektiver Volumenkapazität, die in der von Fernändez Yero und Kollegen im Centro de Immunoensayo (Habana, Cuba) entwickelten Ausstattung (SUMA) abgelesen werden, die aus einem vertikalen Schnellablesungs-Spektrophotometer-Fluorometer besteht mit automatisierter Operation und Interpretation der Ergebnisse und den 96-Positions-Multipipetten, die eine Auswertung von Tausenden von Proben in sehr kurzer Zeit ermöglichen und das mathematische Verarbeitung erleichtern.
Dieses System wurde kalibriert, um die Antikörperreaktion in verschiedenen Vakzinexperimenten auszuwerten.

Bakterizide Mikroversuch

Leicht modifizierte bakterizide Mikroversuch von Frasch und Robbins (J. Ecp. Med. 147: 229-244; 1978) mit Verbesserung der Ergänzungsquelle durch ihre Gewinnung aus SPF-Kaninchen-Seren (hergestellt im Centro de Produccion de Animales de Laboratoria, Habana, Cuba) zur Analyse von Seren immunisierter Mäuse, und aus frischen Blutbankspenden bei der Analyse der Seren von Menschen und Affen.

Statistische Analyse

Nichtparametrische Methoden wurden in der statischen Analyse benutzt, da die Verteilungen von ELISA- und bakteriziden Werten kein normales Muster aufwiesen, sonderen etwas assymetrisch waren.
Hautsächlich wurde der Wilcoxon-Test für unabhängige Proben angewendet. Um eine bessere Analyse zu erhalten, wurde eine große Anzahl von Prozentsätzen berechnet, wodurch eine andere Annäherung an den Mittelwert jeder untersuchten Gruppe angewendet wurde.

Tierversuche

Versuche an Mäusen: Jede Variante des Vakzinpräparats wurde auf Immunisierungsvermögen und Bakterizide an Mäusen getestet (außer dem oben erwähnten Sicherheitstests an Meerschweinchen und Mäusen). Die Ergebnisse zeigten, daß die Präparate immunisierend waren und bedeutende Niveaus an bakteriziden Antikörpern hervorrufen können.
Tests an Affen:
Vakzinvarianten, die bei freiwilligen Personen angewendet werden mußten, wurden auch an Affen (Macaccus aethipiens) in verschiedenen Dosen und Programmen getestet. Die Resultate zeigten, daß sie unschädlich und immunisierend waren und eine hohe Fähigkeit besaßen, bakterizide Antikörper zu gewinnen, wenn man sie mit dem Placebo vergleicht.
Tests an Menschen:
Reaktionsfähigkeits-Tests wurden bei Gruppen von 3, 10 und 30 Personen durchgeführt, um die unterschiedlichen Dosen zu berücksichtigen, die überprüft werden mußten; dann wurden größere Gruppen den Immunisierungstests unterworfen.
Die ersten Gruppen wurden durch spezialisiertes medizinisches Personal während der Anfangstage eng überwacht, einschließlich folgender Untersuchungen: a) Vitalfunktionen (Puls, Temperatur, Blutdruck); b) örtliche Reaktionen; c) Systemreaktionen; d) Nierenfunktion; e) Leberfunktion; f) hämatologische Untersuchung (Differentialblutbild, Blutplättchen Koagulogramm); g) erhöhte Nervenfunktion (EEG); h) Herzfunktion (EKG).
Keine der Untersuchungen zeigte irgendwelche pathologischen Wechsel in irgendeinem Organ oder System bei irgendeiner der untersuchten Dosen, im Bereich von 20 bis 100 mcg Proteinantigenen und den anderen entsprechenden Komponenten.
Die einzigen bei den meisten Freiwilligen beobachteten Reaktionen waren:
1.- Leichter Schmerz an der Infektionsstelle, speziell in den ersten 48 Stunden.
2.- Rötung der Infektionsstelle und des Umgebungsbereiches.
3.- Geringes Fieber mit einem Mittel von 37,5ºC.
4.- Unwohlsein und Kopfschmerzen nur bei wenigen Personen, sehr vorübergehend, innerhalb der ersten 10-12 Stunden.
Es traten keine ernsthaften oder bemerkenswerten Reaktionen auf, und es wurde keine plötzliche oder verzögerte Hypersensitivität beobachtet.
Das Blutbild war in bezug auf die Neutrophilen leicht und in bezug auf die Lymphozyten deutlich verändert.
Jedem Freiwilligen wurde ein Formblatt zum Ausfüllen mit seinen Beobachtungen übergeben. Ein Teil des Formblattes mußte von dem medizinischen Personal ausgefüllt werden. Diese Praxis wurde bei den Reaktionsfähigkeits-Tests für jede Charge beibehalten, die zur Anwendung hergestellt und freigegeben wurde.

Immunisierungstests und Induktion bakterizider Antikörper bei Menschen

Dosis-Reaktionsuntersuchungen wurden in Gruppen von 100, 200, 300, 500 und 1000 freiwilligen Erwachsenen (20 - 100 mcg) durchgeführt sowie zur Festlegung von Impfungsprogrammen, Intervallen in der Dosisverabreichung und der Anzahl der Dosen. Die Tests wurden zuerst mit jungen Erwachsenen vorgenommen und dann mit kontrollierten Gruppen verschiedener Altersstufen und unterschiedlichem sozialen Status in graduell erhöhter Anzahl (3, 10, 30 und 50 Personen).
A. Erwachsene im Alter von 18 bis 45 Jahren
B. Schüler beiderlei Geschlechts und aus verschiedenen Erziehungssystemen (Internatsschüler und nicht auf ein Internat gehende Schüler) im Alter von 13 bis 18 Jahren
C. Grundschüler im Alter von 6 bis 12 Jahren
D. Kinder im Alter von 2 bis 6 Jahren
E. Kleinkinder im Alter von 6 Monaten bis 2 Jahren
F. Kleinkinder im Alter von 3 bis 6 Monaten
G. Erwachsene älter als 45 Jahre
Menschen unter 12 Jahren erhielten keine Dosen über 50 mcg.
Die Resultate waren außerordentlich zufriedenstellend. Es wurden keine unerwünschten Reaktionen, außer den schon erwähnten, beobachtet. Bei Kindern waren im Zusammenhang mit abnehmendem Alter die Reaktionen weniger intensiv.
Dosen von 20 bis 100 mcg erwiesen sich als deutlich immunisierend, aber die besten Ergebnisse wurden mit 50 mcg erzielt. Diese Dosis wurde für alle Altersstufen ausgewählt, mit der schon beschriebenen Variante, die bis zu einer Feldauswertung untersucht wurde. Alle diese Untersuchungen, einschließlich der an Tieren, der Reaktionsfähigkeit usw., wurden an Kontrollgruppen verglichen, denen ein Placebo mit dem gleichen Erscheinungsbild, aber ohne die aktiven Komponenten gegeben wurde, d.h. nur Aluminiumhydroxid.
Antikörpermessungen durch ELISA und bakterizide Tests wurden wie bereits erwähnt durchgeführt (vido supra).
Die Reaktionen verschiedener Antikörpertypen und -subtypen wurden untersucht, wobei die konsequent wichtigste Reaktion die von IGG (Immunglobulin G) war.
Für den Feldversuch hinsichtlich des Schutzes wurden die Varianten mit den bereits festgestellten Charakteristiken (weniger als 10% LPS, 50 mcg Protein, 50 mcg Polysaccharid C unterstützt durch 2 mg Aluminiumhydroxy) verwendet. Die anderen Varianten wurden an gleichen kleineren Gruppen untersucht.

Für den Feldversuch ausgewählte Impfungsprogramme

Auch wenn andere Programme mit 2 und 5 Dosen und unterschiedlichen Intervallen untersucht werden, bestand das eine ausgewählte aus zwei separaten Dosen in einem Intervall von 6-8 Wochen.

Untersuchung von Hyperimmun-Gammaglobulin, erhalten von geimpften Freiwilligen

Die Reinigung der Plasma-IgG-Fraktion wurde unter Anwendung der modifizierten Methode von E.J. Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc. 68: 459-476, 1946) aus Blutspenden von 250-350 ml vorgenommen, wobei die Extraktionen mehr als 4 Wochen nach der Impfung durchgeführt und die Qualität der individuellen Reaktionen (ELISA und bakterizide Mikroanalyse) geprüft wurden. Die so gewonnene IgG- Fraktion mit über 90% Reinheit wurde allen nach der WHO ausgerichteten Kontrollen unterworfen, die die Verwendung von endovenösen Präparaten betreffen (W.H.O. Tech. Rep. Ser. 567, 19/5, idem. 610, 1977), einschließlich der Tests auf AIDS und Hepatitisviren und der Bestätigung seines Gehalts an spezifischen und bakteriziden Antikörpern gegen die zirkulierenden Stämme. Das Verfahren erhöht beträchtlich die spezifische Antimeningokokken- Aktivität des Präparats verglichen mit den Initialseren. Es zeigte eine hohe Konzentration spezifischer Antikörper gegen die verschiedenen Antigene des Vakzinpräparats und der natürlichen Stämme sowie hohe bakterizide Titer gegen diese. Nach den wissenschaftlichen und legalen Verfahren war seine Anwendung eine Segnung für Kinder mit Meningitis und/oder Meningokokkämie und seine Benutzung hat sich als hocheffizient erwiesen; seine antipyretische Wirkung und sein Einfluß auf den Allgemeinzustand und die Entwicklung von Patienten sind besonders bemerkenswert. Dieses Hyperimmun-Gammaglobulin wird jetzt in größerem Umfang zur Verteilung an Intensivbetreuungseinrichtungen überall im Land hergestellt.
Die Wirkung dieses Präparats ist nicht nur zurückzuführen auf seine bakteriziden Eigenschaften, sondern auch auf die Möglichkeit, verschiedene Antigene durch Lyse von Meningokokken und der gesamten Meningokokken zu beseitigen (Campa, C. und Sierra, G., Rev. Ciencia 2, Juli, 1988; Galguera, M. et al., Rev. Cub. Hemat. Immun. Hemot. 2, 1988).
Die Wirkung dieses Antimeningokokken-Hyperimmun-Gammaglobulins, das bei der Behandlung von Patienten mit durch B-Meningokokken verursachten Meningitis oder Meningokokkämie von Geimpften gewonnen wurde, ist ein anderer indirekter Nachweis des Vakzinwirksamkeit.

Spezifischer Transferfaktor

Der spezifische Transferfaktor wird entsprechend allgemeiner Kenntnis aus dem Blut von Erwachsenen gewonnen, die gegen Meningokokken der Gruppe B und C geimpft wurden, mit einem Ausgangsmaterial gereinigter Leukozyten (Lawrence N.S., Al Askari S., David J.R., Franklin E.C. und Zweimann B.: Transfer of immunological information in humans with dialisates of leukocyte extracts. Trans. Assoc. Am. Physicians. 76: 84, 1963).

Andere Ergebnisse fit der Vakzinvariante, sterilisiert durch Ionisationsbestrahlung mit Kobalt 60

Eine extensive und intensive physikalisch-chemische und immunologische Charakterisierung des bestrahlten Präparats wurde durchgeführt, einschließlich Untersuchungen der Teratogenizität, Carcinogenizität, Mutagenizität, Bestimmung neuer Verbindungen und Wiederholung aller obligatorischen Tests bei Tieren und freiwilligen Personen bezüglich Reaktionsfähigkeit und Immunisierungsvermögen.
Schließlich wurden die Chargen der ausgewählten Variante nach allen zufriedenstellend verlaufenen Kontrollen bei einer Gruppe von 50 jungen Erwachsenen angewendet, um das produzierte Hyperimmun-Gammaglobulin zu erhalten und auszuwerten, das die gleiche Qualität in all seinen Parametern und der klinischen Anwendung ergab wie das, das aus den im Effizienzfeldversuch verwendeten Vakzinvarianten gewonnen wurde.

Effizienzfledtest

Ein Anzahl Varianten unseres weitreichenden Vakzins werden in Variantschritten in Versuchen an Personen geprüft. Die fortgeschrittenste Variante unter diesen ist die für den Feldversuch ausgewählte.

Hauptmerkmale des in dem Feldversuch angewandten Vakzins

1. Protein-Antigen: 60-75%; Serotyp-Mehrheitsproteine 12-18%; Antigen-Komplex mit hohem Molekulargewicht von 65-95 KD. Rest: Infizierungsstoffe mit niedrigem und hohem Molekulargewicht
2. Polysaccharid C: 50 mcg pro Dosis
3. Al(OH) 3 Gel: 2 mg Al(OH) 3 pro Dosis; niedriger als 1,25 mg Al pro Dosis
4. pH: 7,0 ± 0,4
5. Geladsorption: Höher als 80% für die Vakzin- Antigene
6. LPS: Geringer als 10 %
7. Polysaccharid B: Niedriger als 5 %
8. Nukleinsäure: Niedriger als 10 %
9. Thiomersal: 0,005 bis 0,02 %
10. Haltbarkeit: Über 2 Jahre bei 2-8ºC

Immunbiologische Merkmale

1. Das Vorhandensein des Antigen-Komplexes mit hohem Molekulargewicht, mit den allen getesteten B-Serotypen gemeinsamen Bändern(?) und der endgültigen Anordnung all dieser Antigene auf dem Vesikel der Mehrheitsproteine und LPS ergeben die Eigenschaft der Gewinnung von Antikörpern nicht nur gegen den Serotyp, aus dem die Mehrheitsproteine extrahiert wurden, sondern auch gegen ganz unterschiedliche Stämme, die gemeinsam nur einige Antigene des Komplexes mit hohem Molekulargewicht haben. Beispiele: Stamm/Typ Bakterizider Titer Cuba 385 Norway 44/76
2. Vier bis sechs Monate nach der zweiten Dosis wurde ein sensitiver Abfall der Antikörper bei den Mehrheitsproteinen durch ELISA und bakterizide Analyse beobachtet; die Antikörper des Antigen-Komplexes mit hohem Molekulargewicht blieben bestehen. Dieses wurde duch Anwendung von Vakzinvarianten mit verschiedenen Zusammensetzungen und Western-Blotting-Untersuchungen nachgewiesen.
3. Die Beständigkeit des vesikulären Komplexes und seine Immunisierungsfähigkeit sowie sein immunologisches Gedächtnis erhöhten sich im gleichen Ausmaß, wie die Komponente mit hohem Molekulargewicht erhöht wurde.
Zwei Effizienzfeldversuche wurden ausgeführt:
A. Massenimpfung der am meisten gefährdeten Bevölkerungsgruppe im Alter von 6 Monaten bis 24 Jahren in der ganzen Provinz. Es wurde die Provinz mit der geschichtlich nachgewiesenen größten Häufigkeit (eine Rate von 30 pro 100.000) ausgewählt, und 145.000 Personen wurden geimpft. Bei dieser Untersuchung wurde kein anderer Vakzintyp oder Placebo verwendet; einige Untersuchungen werden bei Gruppen verschiedener Alters- und Gesellschaftsstufen durchgeführt; die entsprechenden Ergebnisse werden mit der geschichtlich nachgewiesenen Häufigkeit und der nicht geimpften Bevölkerung verglichen. Die Graphik zeigt die ersten Monate der Kampagne und das Krankheitsverhalten.
Wie festgestellt werden kann, wurde die Epidemie in dieser Provinz besiegt.
Wenn man die gesamte Anzahl der Fälle in jeder Provinz vergleicht, kann man feststellen, daß die Provinz mit der höchsten Rate in der Vergangenheit diese jetzt nicht mehr aufweist.
B. Der Hauptversuch entsprechend den Anforderungen für die Zulassen neuer Vakzine ist ein Placebo-Vakzin- Doppelblindversuch, der insgesamt 106.000 Internatsschüler in 7 Provinzen mit einer hohen Häufigkeitsrate umfaßt. Die Bevölkerungsgruppen, die entweder Vakzin oder Placebo erhielten, waren größer als notwendig, so daß nach mehr als einem Jahr - dies ist die Zeit seit Beginn des Experimentes - die erforderlichen normalen Verlustzahlen in so großen und mobilen Bevölkerungsgruppen, wie Internatsschüler, zur Verfügung stehen.
Zwecks weiterer Details hinsichtlich dieser Effizienzfeldstudie wird verwiesen auf ein offizielles Dokument, das durch die Epidemiologische Abteilung des kubanischen Gesundheitsministeriums, "Estudio de campo de la vacuna antimeningocóccia de proteina de membrana externa y polisac rido C", 14. November 1968, Havana.

Ergebnisse der ersten Auswertung des Doppelblind-Placebo-Vakzin- Experiments

Bevor man endgültig die Wirksamkeit bewerten kann, sind noch einige Monate notwendig; sie kann aber jetzt schon basierend auf den Serumkonversionsniveaus durch ELISA und Bakterizidtest und auf den Ergebnissen der therapeutischen Anwendung des Hyperimmun- Gammaglobulins, das von den Geimpften gewonnen wurde, vorausgesagt werden. TEILWEISE AUSWERTUNG Serumkonversion (%) Gruppe Insgesamt bis dato ELISA BAKTERIZIDTEST Geimpfte Placebo Insgesamt
Für diese Untersuchungen wurde eine repräsentative Universalgruppe von 2.100 Internatschülern dem Versuch unterworfen.
Die Korrelation des Trägerzustandes vor der Impfung wurde als ein möglicher Faktor analysiert, der mit keiner oder mit einer atypischen Reaktion auf das Vakzin übereinstimmt. Die beiden obigen Ergebnisse und die der Anwendung des Antimeningokokken- Hyperimmun-Gammaglobulins ermöglichen eine Voraussage darüber, daß wir eine Generation eines Antimeningokokken-Vakzins der Gruppe B haben, das den vorherigen überlegen und zum esten Mal effektiv ist und verbessert werden kann.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der Ausgangsstamm in vorliegender Erfindung kann im Prinzip jeder pathogener Stamm der B-Meningokokken sein, die in der Gegend, für die Impfschutz gesucht wird, vorhanden oder verantwortlich sind für den größten Teil der Krankheiten.
Dieser Stamm ist ordnungsgemäß gekennzeichnet, speziell in bezug auf Beständigskeits- und Wachstumsanforderungen in ausgewählten Kulturmedien.
Der Mikroorganismus wird adequat kultiviert und zentrifugiert, um 500 g (Naßgewicht) einer Biomasse von Neisseria meningitidis der Gruppe B zu erhalten, die wieder in 2.500 ml Natriumdeoxycholat (0,09% Natriumdeoxycholat, 50 mM Tris-HCl pH = 8,5, 2 mM EDTA) suspendiert wird, wozu 0,05% Lysozym hinzugefüqt werden. Das Extraktionsverfahren wird 2 1/2 Stunden lang bei 4ºC durchgeführt; während dieser Zeitspanne werden 10 Behandlungsdurchläufe von 30 Sekunden in einem Ultraschallbad vorgenommen, abwechselnd mit magnetischem Rühren mit 250 nm.
Die Zellreste werden vom Extrakt durch Zentrifugieren bei 10.000 g getrennt. Die Schwemmschicht wird mit DNase und RNase in einer Konzentration von 5 mg pro Liter Extrakt eine jede bei 37 ºC behandelt.
Der Extrakt wird bei 100.000g 2 Stunden lang zentrifugiert, und das Sediment wird in 200 ml 5%igem Deoxycholat-Puffer in Tris- EDTA, pH 8-9, suspendiert. Die Chromatographie wird durch Molekularsiebung in einer Matrix von Sephacryl S-300 mit 1%igem Deoxycholat-Puffer für Elutionszwecke durchgeführt. Die erste Spitzenmenge wird gesammelt und auf dem Uvicord bei 280 nm kontrolliert.
Die erste Spitzenmenge, die aus dieser Fraktionierung eluiert wurde, ist das Grundmaterial, das die Vesikel enthält, zu denen der Antigen-Komplex mit hohem Molekulargewicht in einer Proportion von 12-18% hinzugefügt wird. Dieser Komplex wird durch Anreicherung der Fraktion mit dem Molekulargewicht von 65 bis 95 KD aus der ersten Spitzenmenge extrahiert, indem die Ultraschallbehandlung im Beisein eines 5%igen Tris-EDTA- Deoxycholat-Puffers wiederholt wird, gefolgt durch eine Affinitätschromatographie in einer Säule mit Anti-P1 und Anti-P3 monoklonalen Antikörpern, durch Konzentration mittels Ultrafiltration und abschließender Chromatographie auf einer vorbereitenden Säule (TSK 300-SWG) mit Tris-EDTA-Puffer.
Das Proteinpräparat, das 60-75% Serotypproteine und einen Antigen-Komplex mit einem hohem Molekulargewicht enthält, wird niedergeschlagen und in Ethanol nach vorheriger steriler Filtration mit einer Membran vom Sartorius-Typ gewaschen. Unter Aufrechterhaltung der Sterilitätsbedingungen wird Kapsel- Polysaccharid in einem Verhältnis von Polysaccarid zu Protein von 1:1 hinzugefügt. Dieses Polysaccharid der Gruppe C wurde in Übereinstimmung mit Gold et al., 1969-1970, WHO Bull. 45: 279-282 und Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med. 129: 1349-1365) hergestellt und durch Membranfiltration sterilisiert (vida supra).
Abschließend wird ein Aluminiumhydroxid der Protein- Polysaccharid-Mischung als Adjuvans in einer Proportion von 2 mg A1(OH)3 auf alle 50 mcg Protein und Polysaccharid zugesetzt, wobei die Mengen den Gehalt einer Dosis darstellen. Das Hilfsgel wird vorher radiosterilisiert, indem eine Bestrahlung mit Kobalt 60 in einer Menge von 15 Kgy bei einer Temperatur von 4ºC zur Anwendung gebracht wird.
Ein endgültiger pH-Wert des Präparats von 7,0 ± 0,4, eine Adsorption des Gels von mehr als 80% des gesamten Proteins und Polysaccharids und ein Gehalt an 10% LPS werden garantiert.
Als Schutz wird Thiomersal in einer Konzentration von 0,005-0,02% angewendet.
Das ganze Produkt wird einer Reihe von physikalisch-chemischen und biologischen Kontrollen, wie im Patent beschrieben, unterworfen.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes gegen die verschiedenen Serotypen von Neisseria meningitidis Gruppe B, dadurch gekennzeichnet, daß man von den lebenden Mikroorganismen irgendeines der bekannten pathogenen Serotypen von Gruppe B ohne Inaktivierung ausgeht, von denen die Extraktion der Vesikel der äußeren Membran und des Protein-antigenen Komplexes vom Molekulargewicht 65 bis 95 KD unter Verwendung einer kombinierten Behandlung mit Detergens, Lisozym und Ultraschall erfolgt, daß das erhaltene Produkt nach der Behandlung zur Abtrennung der Nukleinsäuren durch eine Dissoziationsbehandlung mit Detergens, Ultraschallbad und Säulenchromatographie gereinigt, das so erhaltene multiantigene Material zur Gewinnung des Proteinantigenen Komplexes mit dem Molekulargewicht 65 bis 95 KD für die HPLC Chromatographie unter Verwendung einer Säule wie der TSK 3000 SWG oder Affinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern oder Chromatographie mit hydrophober Interaktion oder eine Kombination irgendwelcher dieser Verfahren gereinigt, der Proteinantigene Komplex zu der Fraktion, die die Vesikel enthält, unter Ultraschallbehandlung zugesetzt wird, sodaß er in einem Verhältnis von 15% ± 3% daran verankert wird, wobei auch verkapseltes Polysaccharid in elnem Verhältnis von 1:1 bis 1:4 In bezug auf das Protein und das Hilfsmittel in einer Menge von 20 bis 100 ug/ug Protein zugesetzt werden und die verschiedenen Komponenten der Mischung durch Ionisationsbestrahlung mit Kobalt 60 in Dosen von 5 bis 25 Kgy bei einer Temperatur von 1 bis 4ºC sterilisiert werden können, bevor die Mischung bereitet wird, oder die entstehende Mischung durch dieses Verfahren sterilisiert werden kann.

2. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes gegen die verschiedenen pathogenen Serotypen von Neisseria meningitidis Gruppe B nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion des Proteins aus der äußeren Membran irgendeines der pathogenen Serotypen der Gruppe B durch eine Behandlung mit Deoxycholat als Detergens in einer Konzentration von weniger als 1% Gew. /Vol. Lisozym bei 0,03 bis 1% und Ultraschallbad erfolgt.

3. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes gegen die verschiedenen pathogenen Serotypen von Neisseria meningitidis Gruppe B nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion der Proteine der äußeren Membran irgendeines der bekannten Serotypen der Gruppe B mit Hilfe einer Behandlung mit einern Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration zwischen 0,1 und 5%, Lisozym zwischen 0,03 un 1% und Ultraschallbad erfolgt.

4. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes gegen die verschiedenen pathogenen Serotypen von Neisseria meningitidis Gruppe B nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion der Proteine der äußeren Membran irgendeines der bekannten pathogenen Serotypen der Gruppe B mit Hilfe einer Behandlung mit Brij 96 als Detergens in einer Konzentration zwischen 0,01 und 0,5%, Lisozym von 0,03 bis 1% und mit Ultraschallbad erfolgt.

5.Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion des Proteins aus der äußeren Membran irgendeines der bekannten pathogenen Serotypen der Gruppe B gemäß einer Variante unter Verwendung von Tween 80 als Detergens in einer Konzentration von 0,1 bis 2% erfolgt.

6. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsverfahren für das Protein aus der Membram bei einer Temperatur zwischen 2 und 10 mit einer Extraktionszeit von 15 Minuten bis 5 Stunden in einem gepufferten Medium gemäß dem verwendeten Extraktionsverfahren bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 9,0 und unter magnetischem oder mechanischem Rühren mit 250 bis 950 Upm vor sich geht.

7. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung des entstehenden Produktes von den Nukleinsäuren durch Veränderung seines Gehaltes an Lipopolysacchariden und Phospholipiden mit Hilfe einer Dissoziationsbehandlung mit Natriumdeoxycholat oder Brij 96 oder Tween 20 oder Tween 80 als Detergentien in einer Konzentration zwischen 0,1 und 6% und einer Ultraschallbehandlung mit anschließender Molekularsiebung in einer Sephacryl S 300 oder S 400 oder einer Sepharose C1-4B Säule erfolgt.

8. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Komponenten der entstehenden Impfstoffmischung durch Membranfiltration sterllisiert werden.

9. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß manche der Komponenten der Impfstoffmischung gemäß Anspruch 1 durch Ionisationsbestrahlung mit Kobalt 60 in Dosen von 5 bis 25 Kgy bei einer Temperatur von 1 bis 4ºC sterilisiert werden und der Rest durch Membranfiltration sterilisiert werden.

10. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes gegen die verschiedenen pathogenen Serotypen von Neisseria meningitidis Gruppe B nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial ein Konzentrat der löslichen Fraktion des Biomassenextraktes ist.

11. Impfstoff mit breiter, langanhaltender Schutzwirkung gegen verschiedene pathogene Serotypen von Neisseria meningitidis Gruppe B, der eine immunologisch wirksame Menge des Protein-antigenen Komplexes des Molekulargewichtes 65 bis 95 KD, eine Menge an Vesikel der äußeren Membran der Neisseria meningitidis Gruppe B, elnen an den Vesikeln in einem Verhältnis von 15 % ± 3 % verankerten Protein-antigenen Komplex, verkapseltes Polysaccharid in einem Verhältis von 1:1 bis 1:4 in bezug auf das Protein, und ein Hilfsmittel in einer Menge von 20 bis 100 ug/ug Protein enthält.

12. Impfstoff mit weitem Schutzbereich gegen die verschiedenen pathogenen Serotypen von Neisseria meningitidis Gruppe B nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er nach einem in den Ansprüchen 1 bis 10 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.

13. Verfahren zur Gewinnung von Antimeningokokken-Hyperimmun- Gammaglobulin, dadurch gekennzeichnet, daß Plasma von Erwachs£nen, die mit dem in den Ansprüchen 11 und 12 beschriebenen Impfstoff geimpft wurden, als Ausgangsmaterial verwendet und daraus dessen G- Fraktion gewonnen wird.

14. Antimeningokokken-Hyperiummun-Gammaglobulin mit Seitenund Wirkungsbereich für die Prophylaxe und Behandlung voll Meningitis und Meningokokkämie, die durch irgendeinen der verschiedenen pathogenen Serotypen von Neisseria meningitidis Gruppe B hervorgerufen wurden, hergestellt nach dem Verfahren vori Anspruch 13.

15. Verfahren zur Gewinnung des spezifischen Antimeningokken- Transfer-Faktors B gemäß der üblichen Vorgehensweise, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial aus gereinigten Leukozyten aus dem Blut von Erwachsenen, die mit dem in den Ansprüchen 11 und 12 beschriebenen Impstoff geimpft worden sind, besteht.

16. Spezifischer Transfer-Faktor (dialysierbarer Faktor aus Leukozytenextrakt), hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 15, der zum Transfer von T-Zellen Immunität gegen Neisseria meningitidis Gruppe B verwendet wird.