CN110157767A - 一种转移因子口服溶液生物活性测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种转移因子口服溶液生物活性测定方法，采用微量板‑白细胞粘附抑制法测定转移因子口服溶液生物活性，缓冲液中含钙镁离子，药物作用白细胞后，白细胞通过释放依赖钙镁离子的黏附抑制因子从而抑制白细胞的黏附，通过粘附抑制作用的大小评价转移因子口服溶液生物活性，该方法经过科学***的验证，能够实现对转移因子口服溶液生物活性的检测。本发明采用96孔微量板结合酶标仪高通量快速测定，通过测定白细胞悬液特征吸收波长下吸收值的差异，间接反映产品的免疫活性；以精密仪器的测定结果替代人工镜检结果，且本发明开发的方法不需要加入抗原，方法简单易行，检测成本低。
Description
技术领域
本发明属于多组分生化药质量研究领域，涉及一种转移因子口服溶液生物活性测定方法。
背景技术
转移因子是一种细胞免疫调节剂，由具有细胞性免疫功能的淋巴细胞产生，作为一种特定的细胞因子参与机体的免疫反应，能使未致敏的淋巴细胞转化为具有免疫活性的淋巴细胞，又能增强巨噬细胞的功能，能提高动物机体细胞免疫功能，促进机体抗感染和防御能力。转移因子的生物活性是代表其免疫特性的主要指标。
传统方法采用脱E受体法进行活性检测，但该方法存在较多不足，如专属性不强、实验环节复杂、实验周期较长、干扰因素多、对实验人员要求较高；同时由于传统的方法的实验环节比较复杂，涉及的实验材料比较多，尤其是生物材料白细胞及红细胞，且检测结果采用镜检的方式判断，以偏概全；因此采用传统方法检测，结果重现性较差。因此，建立快速、简便和灵敏的活性检测方法对于评价转移因子效能的高低及质量的控制具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种转移因子口服溶液生物活性测定方法，该方法操作简便，重现性好，专属性强，检测速度快。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种转移因子口服溶液生物活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，配制Hank’s液，制备白细胞悬液；
步骤2，在培养板中进行测定：供试品孔加入供试品，对照孔加入Hank’s液，然后每孔加入白细胞悬液，将培养板放置在培养箱中培养孵育，培养孵育完成后取出培养板并置于震荡仪上震荡，将未粘附的细胞摇起并吸出上清液，得到转移后悬液，在405nm处测定每孔的转移后悬液的吸光度作为粘附后细胞的吸光度值，分到得到供试品粘附后细胞的吸光度值和对照品粘附后细胞的吸光度值；粘附前供试品孔加入供试品和白细胞悬液，粘附前对照孔加入Hank’s液和白细胞悬液，在405nm处测定每孔样品的吸光度作为粘附前细胞的吸光度值，分别得到供试品粘附前细胞的吸光度值和对照品粘附前细胞的吸光度值；利用公式(1)分别计算得到供试品的粘附率和对照品的粘附率，再利用公式(2)计算得到供试品的粘附抑制率，即得到供试品的生物活性大小；
优选的，步骤1中，采用兔胸腺或猪淋巴制备白细胞悬液。
优选的，采用兔胸腺制备白细胞悬液。
优选的，步骤1中，制备白细胞悬液具体方法为：取兔胸腺或猪淋巴，剪碎，加Hank’s液制成细胞悬液，过滤，离心，弃去上清液，沉淀加Hank’s液分散均匀，与细胞分离液混合，离心，吸出中间层的胸腺细胞，胸腺细胞用Hank’s液洗涤，离心，弃去上清液，沉淀再用Hank’s液稀释，得到白细胞悬液。
优选的，步骤1中，白细胞悬液浓度为每1mL中含(1×107)～(4×107)个细胞。
优选的，步骤2中，供试品孔、对照孔、粘附前供试品孔和粘附前对照孔加入白细胞悬液的体积均为50～100μL。
优选的，步骤2中，培养孵育时间为2～4小时。
优选的，步骤2中，培养板放置在5％二氧化碳培养箱中37摄氏度培养。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明采用微量板-白细胞粘附抑制法测定转移因子口服溶液生物活性，缓冲液中含钙镁离子，药物作用白细胞后，白细胞通过释放依赖钙镁离子的黏附抑制因子从而抑制白细胞的黏附，通过粘附抑制作用的大小评价转移因子口服溶液生物活性，该方法经过科学***的验证，能够实现对转移因子口服溶液生物活性的检测。本发明采用96孔微量板结合酶标仪高通量快速测定，通过测定白细胞悬液特征吸收波长下吸收值的差异，间接反映产品的免疫活性；以精密仪器的测定结果替代人工镜检结果，且本发明开发的方法不需要加入抗原，方法简单易行，检测成本低。本发明降低了检测过程的人为主观因素，易于掌握，便于推广，同时较脱E受体法更加准确、快速、重现性好、专属性强、方法简单易行、检测结果准确、可靠。本发明适用于转移因子口服溶液生物活性的检测与监控。
进一步的，通过筛选淋巴细胞来源优选新鲜兔胸腺，因为新鲜猪胸腺在日常检验中不易获取，并且采用猪淋巴提取的白细胞黏附力较兔胸腺差，空白对照黏附率低；因此样品黏附率较小的差异可导致活力结果即黏附抑制率较大的差异，因此采用猪淋巴检测结果重现性差；而采用兔胸腺检测对照粘附率更高，对操作人员要求低，且检验效率更高。
进一步的，通过筛选白细胞悬液浓度，并运用统计学对实验结果进行分析，确定了白细胞悬液最终浓度优选每1mL中(1×107)～(4×107)个细胞，粘附抑制作用更明显，检测结果更可靠。
进一步的，通过筛选白细胞悬液加入体积，并运用统计学对实验结果进行分析，确定了最优的白细胞悬液体积为50～100μL，粘附抑制作用更明显，检测结果更可靠。
进一步的，通过筛选孵育时间，并运用统计学对实验结果进行分析，确定了优选的孵育时间为2～4小时，粘附抑制作用更明显，检测结果更可靠。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明转移因子口服溶液活性检测采用微量板-白细胞粘附抑制法，包括以下步骤：
a、Hank’s液的配制：称取磷酸二氢钾0.06g，氯化钠8.0g，碳酸氢钠0.35g，氯化钾0.4g，葡糖糖1.0g，磷酸氢二钠0.14g，氯化钙0.14g，硫酸镁0.1g，氯化镁0.1g，加水溶解成1000mL，用浓硫酸调pH至6.5。115℃20min灭菌后4℃保存1个月。临用前用5.6％碳酸氢钠溶液调pH至7.2～7.4。
b、淋巴细胞悬液的制备：取新鲜兔胸腺或猪淋巴，剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经200目过滤，1500r/min离心3～5分钟，弃去上清液，加少量Hank’s液打匀，与占其1/2体积的细胞分离液混合，以2000r/min离心20min，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以1500r/min离心3～5分钟，弃去上清液，用Hank’s液洗涤三次(操作同前)，再用Hank’s液稀释并计数，使最终浓度为每1mL中(1×107)～(4×107)个细胞，作为白细胞悬液。
c、测定法：在96孔培养板中进行，供试品做12孔，对照品做4孔，供试品孔每孔加入供试品50μL，对照孔加入Hank’s液50μL，然后每孔加入白细胞悬液50～100μL，将培养板放置在5％二氧化碳培养箱中37摄氏度培养孵育2～4小时，取出后在水平震荡仪上50r/min震荡1～3min，将未粘附的细胞摇起并吸出上清液转移，每孔再加入Hank’s液50μL，按上法洗涤一次，将洗液与上清液合并，得到转移后悬液。采用酶标仪高通量快速测定，在405nm处测定每孔转移后悬液的吸光度作为粘附后细胞的吸光度值，分到得到供试品粘附后细胞的吸光度值和对照品粘附后细胞的吸光度值。供试品和对照品粘附前各做4孔，粘附前供试品孔加入供试品溶液50μL和白细胞悬液50～100μL，粘附前对照孔加入取Hank’s液50μL和白细胞悬液50～100μL，在405nm处测定每孔的吸光度作为粘附前细胞的吸光度值，分别得到供试品粘附前细胞的吸光度值和为对照品粘附前细胞的吸光度值。按下面公式计算，利用公式(1)分别计算得到供试品的粘附率和对照品的粘附率，再利用公式(2)计算得到供试品的粘附抑制率，供试品的粘附抑制率即反映了供试品的生物活性大小。
步骤a中，配制Hank’s液含钙、镁离子，如此供试品的粘附抑制作用更明显，即活力值更高，检测结果更可靠。
步骤b中，优选新鲜兔胸腺，因为新鲜猪胸腺在日常检验中不易获取，采用猪淋巴检测结果重现性差；而采用兔胸腺检测对照粘附率更高，对操作人员要求低，且检验效率更高。
步骤b中，白细胞悬液最终浓度优选每1mL中(1×107)～(4×107)个细胞，经过考察，最优选每1mL中含2×107个细胞，作为白细胞悬液。
步骤c中，加入白细胞悬液体积优选50～100μL，因为经过考察，最优选100μL，检测结果更可靠。
步骤c中，孵育时间优选2～4小时，最优选3小时。
实施例1微量板-白细胞粘附抑制法测定条件中加入孵育白细胞悬液体积的筛选
步骤：
a、Hank’s液的配制：称取磷酸二氢钾0.06g，氯化钠8.0g，碳酸氢钠0.35g，氯化钾0.4g，葡糖糖1.0g，磷酸氢二钠0.14g，氯化钙0.14g，硫酸镁0.1g，氯化镁0.1g，加水溶解成1000mL，用浓硫酸调pH至6.5。115℃20min灭菌后4℃保存1个月。临用前用5.6％碳酸氢钠溶液调pH至7.2。
b、淋巴细胞悬液的制备：取新鲜兔胸腺，剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经200目过滤，1500r/min离心3分钟，弃去上清液，加少量Hank’s液打匀，与占其1/2体积的细胞分离液混合，以2000r/min离心20min，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以1500r/min离心3分钟，弃去上清液，用Hank’s液洗涤三次(操作同前)，再用Hank’s液稀释并计数，使最终浓度为每1mL中2×107个细胞，作为白细胞悬液。
c、测定法：在96孔培养板中进行，供试品做12孔，对照品做4孔，供试品孔每孔加入供试品50μL，对照孔加入Hank’s液50μL，然后每孔加入白细胞悬液，将培养板放置在5％二氧化碳培养箱中37摄氏度培养孵育2小时，取出后在水平震荡仪上50r/min震荡1min，将未粘附的细胞摇起并吸出上清液转移，每孔再加入Hank’s液50μL，按上法洗涤一次，将洗液与上清液合并，得到转移后悬液。采用酶标仪高通量快速测定，在405nm处测定每孔转移后悬液的吸光度作为粘附后细胞的吸光度值，分到得到供试品粘附后细胞的吸光度值和对照品粘附后细胞的吸光度值。供试品和对照品粘附前各做4孔，粘附前供试品孔加入供试品溶液50μL和白细胞悬液，粘附前对照孔加入取Hank’s液50μL和白细胞悬液，在405nm处测定每孔的吸光度作为粘附前细胞的吸光度值，分别得到供试品粘附前细胞的吸光度值和为对照品粘附前细胞的吸光度值。按上面公式计算得到供试品的粘附抑制率。
通过两名实验人员在其他实验操作不变的基础上，对同批次转移因子溶液考察孵育白细胞悬液加入体积分别为50μL和100μL时的检测结果，每名实验人员平行测定6组数据，统计检测结果见表1，其中，95％CI为95％置信区间，FL为可信限率。
表1加入孵育白细胞体积的考察结果
由上述实验结果可见，加入孵育白细胞悬液体积为100μL时检测结果更可靠，因此最优选加入孵育白细胞悬液体积为100μL。
实施例2微量板-白细胞粘附抑制法测定生物活性中孵育时间的筛选
步骤：
a、Hank’s液的配制：称取磷酸二氢钾0.06g，氯化钠8.0g，碳酸氢钠0.35g，氯化钾0.4g，葡糖糖1.0g，磷酸氢二钠0.14g，氯化钙0.14g，硫酸镁0.1g，氯化镁0.1g，加水溶解成1000mL，用浓硫酸调pH至6.5。115℃20min灭菌后4℃保存1个月。临用前用5.6％碳酸氢钠溶液调pH至7.2。
b、淋巴细胞悬液的制备：取新鲜兔胸腺，剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经200目过滤，1500r/min离心3分钟，弃去上清液，加少量Hank’s液打匀，与占其1/2体积的细胞分离液混合，以2000r/min离心20min，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以1500r/min离心3分钟，弃去上清液，用Hank’s液洗涤三次(操作同前)，再用Hank’s液稀释并计数，使最终浓度为每1mL中1×107个细胞，作为白细胞悬液。
c、测定法：在96孔培养板中进行，供试品做12孔，对照品做4孔，供试品孔每孔加入供试品50μL，对照孔加入Hank’s液50μL，然后每孔加入白细胞悬液100μL，将培养板放置在5％二氧化碳培养箱中37摄氏度培养孵育，取出后在水平震荡仪上50r/min震荡1min，将未粘附的细胞摇起并吸出上清液转移，每孔再加入Hank’s液50μL，按上法洗涤一次，将洗液与上清液合并，得到转移后悬液。采用酶标仪高通量快速测定，在405nm处测定每孔转移后悬液的吸光度作为粘附后细胞的吸光度值，分到得到供试品粘附后细胞的吸光度值和对照品粘附后细胞的吸光度值。供试品和对照品粘附前各做4孔，粘附前供试品孔加入供试品溶液50μL和白细胞悬液100μL，粘附前对照孔加入取Hank’s液50μL和白细胞悬液100μL，在405nm处测定每孔的吸光度作为粘附前细胞的吸光度值，分别得到供试品粘附前细胞的吸光度值和为对照品粘附前细胞的吸光度值。按上面公式计算得到供试品的粘附抑制率。
上述实施步骤，在其他操作参数不变的情况下，对同批次转移因子口服溶液，分别考察2h、3h及4h共三个不同的孵育时间点的粘附抑制率，每个孵育时间点平行测定9组数据，统计检测结果见表2，其中，95％CI为95％置信区间，FL为可信限率。
表2孵育时间的考察结果
由上述实验结果可见，适当延长孵育时间可以提高样品的粘附抑制率且可以提高检测结果的可靠性，孵育3h及4h的检测结果无显著差异，因此为提高检测效率，最优选孵育时间为3h。
实施例3微量板-白细胞粘附抑制法测定生物活性准确性考察
白细胞悬液体积为100μL，白细胞悬液浓度为每1mL中4×107个细胞，其他条件与实施例1相同，将同批次转移因子口服溶液用Hank’s液稀释至5个系列浓度的溶液(5％，10％，50％，75％，100％)进行活性测定，考察供试品浓度和活性之间的关系，从而判断本发明方法的准确性。每个浓度平行测定至少6次，运用统计学对实验结果进行分析，统计检测结果见表3，其中，95％CI为95％置信区间，FL为可信限率。
表3药物浓度与活性关系的考察结果
对上述药物浓度(自变量)和活性结果(因变量)进行回归分析，得到回归方程为C2＝0.879+47.46C1，调整后相关系数为86.34％；且P<0.05，说明自变量药物浓度对因变量活性结果的解释力或预测力正相关，调整后的相关系数为0.8634。说明本发明开发的检测方法具有较为显著的区分力，即检测结果是准确可靠的。
Claims (8)
1.一种转移因子口服溶液生物活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，配制Hank’s液，制备白细胞悬液；
步骤2，在培养板中进行测定：供试品孔加入供试品，对照孔加入Hank’s液，然后每孔加入白细胞悬液，将培养板放置在培养箱中培养孵育，培养孵育完成后取出培养板并置于震荡仪上震荡，将未粘附的细胞摇起并吸出上清液，得到转移后悬液，在405nm处测定每孔的转移后悬液的吸光度作为粘附后细胞的吸光度值，分到得到供试品粘附后细胞的吸光度值和对照品粘附后细胞的吸光度值；粘附前供试品孔加入供试品和白细胞悬液，粘附前对照孔加入Hank’s液和白细胞悬液，在405nm处测定每孔样品的吸光度作为粘附前细胞的吸光度值，分别得到供试品粘附前细胞的吸光度值和对照品粘附前细胞的吸光度值；利用公式(1)分别计算得到供试品的粘附率和对照品的粘附率，再利用公式(2)计算得到供试品的粘附抑制率，即得到供试品的生物活性大小；
2.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液生物活性测定方法，其特征在于，步骤1中，采用兔胸腺或猪淋巴制备白细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液生物活性测定方法，其特征在于，采用兔胸腺制备白细胞悬液。
4.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液生物活性测定方法，其特征在于，步骤1中，制备白细胞悬液具体方法为：取兔胸腺或猪淋巴，剪碎，加Hank’s液制成细胞悬液，过滤，离心，弃去上清液，沉淀加Hank’s液分散均匀，与细胞分离液混合，离心，吸出中间层的胸腺细胞，胸腺细胞用Hank’s液洗涤，离心，弃去上清液，沉淀再用Hank’s液稀释，得到白细胞悬液。
5.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液生物活性测定方法，其特征在于，步骤1中，白细胞悬液浓度为每1mL中含(1×107)～(4×107)个细胞。
6.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液生物活性测定方法，其特征在于，步骤2中，供试品孔、对照孔、粘附前供试品孔和粘附前对照孔加入白细胞悬液的体积均为50～100μL。
7.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液生物活性测定方法，其特征在于，步骤2中，培养孵育时间为2～4小时。
8.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液生物活性测定方法，其特征在于，步骤2中，培养板放置在5％二氧化碳培养箱中37摄氏度培养。
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