DE3853643T2

DE3853643T2 - Rechtsdrehendes Enantiomer von alpha-(4,5,6,7-Tetrahydrothieno[3,2-c]pyrid-5-yl)(2-chlorphenyl)methylacetat, Verfahren zu seiner Herstellung und dieses enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.

Info

Publication number: DE3853643T2
Application number: DE3853643T
Authority: DE
Inventors: Alain Badorc; Daniel Frehel
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 1987-02-17
Filing date: 1988-02-16
Publication date: 1995-11-30
Anticipated expiration: 2008-02-17
Also published as: LU90324I2; PH25960A; HU197909B; DE19875053I2; AR243891A1; FI880720A0; JPS63203684A; YU46748B; ES2071621T3; FI880720A; NL990002I1; RO99191B1; HUT47291A; EP0281459B1; IE880273L; DK80088A; MX9203026A; IL85294A0; DK173636B1; NZ223475A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Salz des rechtsdrehenden Enantiomeren des α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylesters, das Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.
Dieses Enantiomer entspricht der folgenden Formel (I):
worin das C*-Kohlenstoffatom ein asymmetrisches Kohlenstoffatom ist. In der Tat repräsentiert diese Formel sowohl das rechtsdrehende Molekül als auch sein linksdrehendes Enantiomeres. Die dieser Formel entsprechende racemische Mischung wurde in der unter der Nr. 2 530 247 veröffentlichten französischen Patentanmeldung beschrieben. Im folgenden wird das rechtsdrehende Enantiomere als Id und das linksdrehende Enantiomere als Il bezeichnet.
Es ist bekannt, daß der Drehwert einer Verbindung von dem Lösungsmittel, in dem er gemessen wird, und seiner Konzentration in diesem Lösungsmittel abhängt. Das erfindungsgemäße rechtsdrehende Isomere besitzt in Lösung in Methanol ein positives Drehvermögen.
Überraschenderweise besitzt lediglich das rechtsdrehende Enantiomere Id eine gegen die Blutplättchenaggregation gerichtete Wirkung, während das linksdrehende Enantiomere Il inaktiv ist. Darüber hinaus ist das inaktive linksdrehende Enantiomere Il das weniger gut verträgliche der beiden Enantiomeren.
Die Verbindung (Id) ist ein Öl, während sein Hydrochlorid die Form eines weißen Pulvers besitzt. Ölige Produkte sind im allgemeinen schwierig zu reinigen und es ist für die Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen bevorzugt, kristalline Produkte zu verwenden, die im allgemeinen durch Umkristallisation gereinigt werden können.
Es hat sich im vorliegenden Fall weiterhin gezeigt daß bestimmte Salze der Verbindung (Id) im allgemeinen in amorpher Form ausfallen und/oder hygroskopisch sind, was ihre Handhabung in technischem Maßstab schwierig macht. Es wurden daher in der Pharmazie klassische Salze mit Carbonsäuren und Sulfonsäuren hergestellt, wie mit Essigsäure, Benzoesäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Citronensäure, Weinsäure, Gentisinsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure und Laurylsulfonsäure sowie das Salz der Dihydroxybenzolsulfonsäure (F = 70ºC) und das der p-Toluolsulfonsäure (F = 51ºC), deren Reinigung sich als schwierig erwiesen hat.
Es wurden nunmehr unter den Salzen des rechtsdrehenden Isomeren der Verbindung der Formel Id mit organischen und anorganischen Säuren Salze gefunden, die leicht kristallisieren, nicht hygroskopisch und in Wasser ausreichend löslich sind, so daß ihre Verwendung als Arzneimittelwirkstoffe besonders vorteilhaft ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit insbesondere das Hydrogensulfat des rechtsdrehenden Enantiomeren des α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylesters.
Dieses Salz bereitet man in klassischer Weise durch Einwirkung der entsprechenden Säure auf die Base in Lösung in einem Lösungsmittel, in dem das Salz spontan oder nach der Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels für das Salz ausfällt.
Das rechtsdrehende Isomere des α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylesters kann durch Salzbildung der racemischen Verbindung mit einer optisch aktiven Säure in einem Lösungsmittel, wiederholte Umkristallisationen des Salzes bis zum Erhalt eines Produkts mit konstantem Drehwert und anschließende Freisetzung des rechtsdrehenden Isomeren aus seinem Salze mit Hilfe einer Base hergestellt werden. Gegebenenfalls wird das rechtsdrehende Isomere mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure in ein Salz überführt.
Die optisch aktive Säure kann mit Vorteil die linksdrehende Campher-10- sulfonsäure sein.
Für die Salzbildung und die Umkristallisation kann man ein einziges Lösungsmittel verwenden, wobei in diesem Fall Aceton besonders geeignet ist.
Man setzt die linksdrehende chirale Campher-10-sulfonsäure der Formel (II&sub1;) in einem inerten Lösungsmittel mit der racemischen Mischung der Formel (I) gemäß dem folgenden Reaktionsschema um: (II linksdrehend)
Die Salzbildung kann in Lösungsmitteln erfolgen, wie Alkoholen, Ketonen, Dimethylformamid. Das Salz fällt spontan aus und wird durch Aussalzen oder Verdampfen des Lösungsmittels isoliert. Es bildet sich eine Mischung der beiden Diastereoisomeren der Formel (IIIa). Durch aufeinanderfolgende Umkristallisationen aus einem Lösungsmittel, wie Aceton, wird der Niederschlag an dem rechtsdrehenden Isomeren der Verbindung (I) angereichert. Nach jeder Umkristallisation wird der Drehwert [α]D20 des Niederschlags bei 20ºC in Methanol bei einer Konzentration zwischen 1,5 und 2 g/ 100 ml gemessen. Wenn der Wert von [α]D20 sich nicht mehr verändert, setzt man die Base der Formel (Id) ausgehend von dem Salz (IIIa) durch Einwirkung einer Base, wie Natriumhydrogencarbonat oder Kaliumhydrogencarbonat in wäßrigern Medium bei Temperaturen zwischen 5ºC und 20ºC frei.
Durch Eindampfen des Filtrats der ersten Umkristallisation IV nach dem Abfiltrieren der Kristalle des ausgefällten Salzes (IIIA) erhält man eine Mischung, die an dem Enantiomeren (Il) angereichert ist. Das Alkalischstellen dieser Mischung der Salze der Diastereoisomeren mit einer schwachen Base, wie Natrium- oder Kaliumhydrogencarbonat, in wäßriger Lösung bei Temperaturen zwischen 5ºC und 20ºC führt zu einer an dem linksdrehenden Enantiomeren (Il) angereicherten Mischung der beiden Enantiomeren (Id) + (Il).
Man kann diese an dem Enantiomeren (Il) angereicherte Mischung (Id) + (Il) mit rechtsdrehender Carnpher-10-sulfonsäure, die im folgenden als (IId) bezeichnet wird, in einem Lösungsmittel gemäß dem folgenden Reaktionsschema umsetzen: als Hauptbestandteil (II rechtsdrehend)
Die erhaltene Mischung der kristallinen Salze der Diastereoisomeren (IIIb) wird aus Aceton umkristallisiert, bis der Drehwert [α]D20 des Niederschlags konstant ist. Man bestimmt den Drehwert [α]D20 des Diastereoisomeren-Salzes (IIIb) nach jeder Umkristallisation.
Die Freisetzung des Stereoisomeren (Il) aus seinem Salz wird in klassischer Weise bewirkt, wie es für die Verbindung (Id) beschrieben worden ist.
Die linksdrehende Campher-10-sulfonsäure (IIl) kann ausgehend von handelsüblichem Ammonium-campher-10-sulfonat der Formel (IV) gemäß dem folgenden Reaktionsschema erhalten werden: Ionenaustauscherharz
Man chromatographiert eine wäßrige Lösung des Ammoniumsalzes (V) über ein Amberlite IRN-77-Harz. Nach dem Gefriertrocknen des Eluats gewinnt man die Campher-10-sulfonsäure der Formel (IIl).
Das gesamte Verfahren kann wie folgt schematisch dargestellt werden: Aceton Alkalischstellen Lösung wässriges NaHCO&sub3; Umkristallisation Aceton rein Alkalischstellen wässriges NaHCO&sub3; rechtsdrehendes Enatiomer mit (Il) als Hauptbestandteil linksdrehendes Enatiomer
Jedes dieser reinen Enantiomeren (Id) und (Il) kann mit Hilfe klassischer Verfahrensweisen in das Salz überführt werden: beispielsweise bereitet man die Hydrochloride durch Zugabe einer Lösung von gasförmigern Chlorwasserstoff in Diethylether zu einer Lösung von (Id) oder (Il) in Diethylether.

Bestimmung der Enantiomerenreinheit der rechtsdrehenden (Id) und linksdrehenden (Il) Enantiomeren

Man verwendet zwei Methoden:
- Protonen-NMR-Spektroskopie unter Zugabe einer chiralen Seltenen Erdverbindung;
- Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer chiralen stationären Phase.

a) Protonen-NMR-Spektroskopie unter Zugabe einer chiralen Seltenen Erdverbindung

Die Enantiomerenreinheit (optische Reinheit) wurde durch ¹H-NMR-Spektroskopie bei 60 MHz in Gegenwart eines chiralen Seltenen Erdkomplexes nach der G.M. Withesides et al. beschriebenen Methode (J. Am. Chem. Soc. 96(1974), 1038) bestimmt.
Bei dem racemischen Produkt (I) erscheint der an das Asymmetriezentrurn in α-Stellung zu der Estergruppe gebundene Wasserstoff als Singulett (chemische Verschiebung δ = 4,87 ppm in CDCl&sub3; als Lösungsmittel). Die Zugabe des Seltenen Erdkomplexes Eu (tfc)&sub3; [Europium(III)-tris(trifluormethyl-3-hydroxymethylen)-d-camphorat] zu der Sonde, die die Lösung des Racemats (I) in CDCl&sub3; enthält, führt zu einer Aufspaltung des ursprünglichen Singuletts in zwei gut getrennte Singuletts, die dem Proton jeweils der beiden Enantiomeren (Id) und (Il) entsprechen. Bei einem Molverhältnis von Seltenem Erdkomplex/Verbindung (I) von 0,4 beträgt die Trennung zwischen den beiden Singuletts 6 Hz. Für Jedes der beiden hergestellten Enantiomeren (Id) und (Il) wurde die gleiche Verfahrensweise angewandt, wie sie für das Racemat (1) angewandt worden ist. Die geringste chemische Verschiebung entspricht dem Proton des rechtsdrehenden Enantiomeren (Id) und die stärkste chemische Verschiebung dem linksdrehenden Enantiomeren (Il).
Die Präzision der Methode wurde durch Vergleich der mit oder ohne Zugabe des Seltenen Erdkomplexes erhaltenen ¹H-NMR-Spektren (60 MHz) eines jeden der beiden Enantiomeren (Id) und (Il) in reiner Form oder in Mischung mit wachsenden Mengen des anderen Enantiomeren bestimmt. Es hat sich gezeigt, daß es möglich ist. ohne weiteres mehr als 5 Gew. -% des einen der Enantiomeren in der Mischung mit dem anderen nachzuweisen.

b) Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer chiralen stationären Phase

Die Untersuchung wurde mit einem Flüssigkeitschromatographen HP-1084 unter Verwendung eines UV-Detektors bei 215 nm durchgeführt. Die chirale stationäre Phase war DEAE-Siliciumdioxid (10 um), auf das ein saures 1- α-Glycoprotein aufgepfropft ist (0,4x 100 mm) (ENANTIOPAC R-LKB). Die mobile Phase bestand aus einer wäßrigen Mischung eines Phosphatpuffers (8 mM (NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;), der 0,1 M NaCl enthielt, auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt war und 15% Isopropanol (Vol./Vol.) enthielt. Der Durchsatz wurde auf 0,3 ml/min eingestellt und die Säulentemperatur wurde bei etwa 18 - 20ºC gehalten.
Bei diesen Bedingungen zeigt das rechtsdrehende Enantiomere (Id) eine Retentionszeit von 45 Minuten und das linksdrehende Enantiomere (Il) eine Retentionszeit von 35 Minuten.
Die Genauigkeit der Bestimmung der optischen Reinheit dieser beiden Enantiomeren wurde dadurch abgeschätzt, daß jedes der beiden hergestellten Enantiorneren (Id) und (Il) entweder alleine oder in Mischung mit wachsenden Mengen des anderen Enantiomeren chromatographiert wurde. Es hat sich gezeigt, daß es möglich ist, ohne weiteres folgendes nachzuweisen:
- 2 % (Gew./Gew.) des Enantiomeren (Id) in dem Enantiomeren (Il)
- 4 % (Gew./Gew.) des Enantiomeren (Il) in dem Enantiomeren (Id)
Man kann schließen, daß bei diesen Bedingungen die optische Reinheit der beiden nach den Beispielen erhaltenen Enantiomeren (Id) und (Il) mindestens 96 % für das rechtsdrehende Enantiomere (Id) und mindestens 98 % für das linksdrehende Enantiomere (Il) beträgt.
Die nachfolgend angegebenen nicht einschränkenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

BEISPIEL 1 - Salz des rechtsdrehenden α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylesters

a) Linksdrehende Campher-10-sulfonsäure

Man bereitet eine Amberlite IRN-77-Harzsäule, die man durch Hindurchleiten einer 1N Chlorwasserstoffsäure behandelt, wonach man diese angesäuerte Harzsäule mit viel Wasser wäscht. Man löst linksdrehendes Ammonium-campher-10-sulfonat in der minimalen Menge Wasser und trägt die Lösung auf die zuvor vorbereitete Harzsäule auf. Man eluiert mit Wasser. Die die Säure enthaltenden Elutionsfraktionen werden gefriergetrocknet.
Weiße Kristalle, F = 198ºC; [α]D20 = -20,53 (C: 2,075 g/100 ml, Wasser).

b) 1-Campher-10-sulfonsäuresalz des α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylesters (SR 25990 B).

Man löst 32 g (0,0994 Mol racemischen α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylester in 150 ml Aceton, gibt 9,95 g (0,0397 Mol) linksdrehendes Campher-10-sulfonsäure-monohydrat zu und läßt das homogene Medium bei Raumtemperatur stehen. Nach 48 Stunden erfolgt das Auftreten einiger Kristalle. Man engt das Reaktionsmedium auf 50 ml ein und läßt während 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man filtriert die erhaltenen Kristalle ab, wäscht sie mit Aceton und trocknet sie (Ausbeute: 55 %, bezogen auf das racemische Ausgangsmaterial).
Weiße Kristalle, F = 165ºC, [α]D20 = +24,67 (C = 1,58 g/100 ml; Methanol).
Man löst die in dieser Weise erhaltenen Kristalle erneut in der minimalen Menge siedenden Acetons (50 ml). Man filtriert die nach dem Abkühlen erhaltenen Kristalle, wäscht sie mit Aceton und trocknet sie (Ausbeute: 88 %).
Weiße Kristalle, F = 165ºC, [α]D20 = +24,75 (C = 1,68 g/100 ml; Methanol).

c) Rechtsdrehender α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2- chlor-phenyl)-essigsäuremethylester.

Man löst 12 g (0,022 Mol) des unter b) erhaltenen reinen Produkts in der minimalen Menge Wasser. Unter Abkühlen auf 5ºC stellt man die erhaltene wäßrige Lösung mit einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung alkalisch. Man extrahiert die alkalische wäßrige Phase mit Dichlormethan. Man trocknet die organischen Extrakte über wasserfreiem Natriumsulfat. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man ein farbloses Öl (quantitative Ausbeute). Öl, [α]D20 = +51,52 (C = 1,61 g/100 ml; Methanol).

d) Hydrogensulfat des rechtsdrehenden α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylesters (SR 25990 C).

Man gibt 800 ml einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung zu einer Suspension von 200 g SR 25990 B in 800 ml Dichlormethan. Nach dem Rühren dekantiert man die organische Phase ab, trocknet über Natriumsulfat und vertreibt das Lösungsmittel unter vermindertem Druck. Man löst den Rückstand in 500 ml eisgekühltem Aceton und gibt tropfenweise 20,7 ml konzentrierter Schwefelsäure (93,64 %, d = 1,83) zu. Der auftretende Niederschlag wird durch Filtration isoliert, mit 1000 ml Aceton gewaschen und dann im Vakuumtrockenschrank bei 50ºC getrocknet.
Man erhält in dieser Weise 139 g weiße Kristalle, die analytisch rein sind und einen Schmelzpunkt von 184ºC besitzen. Summenformel: C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub6;ClNO&sub2;S, H&sub2;SO&sub4; [α]D20ºC = +55,10 (C = 1,891 g/100 rnl, Methanol). BEISPIEL 2 - Salzes des linksdrehenden (x-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3, 2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylesters

a) Salz der d-Campher-10-sulfonsäure (SR 25989 B)

Man verdampft das Lösungsmittel aus der in Beispiel 1-b nach der Abtrennung der Verbindung SR 25990 B erhaltenen Lösung.
Man nimmt den Rückstand mit Wasser und Diethylether auf. Man dekantiert die Etherphase ab, kühlt die wäßrige Phase auf 5ºC ab und stellt mit einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung alkalisch. Man extrahiert die alkalische wäßrige Phase mit Diethylether. Man vereinigt die Etherextrakte und trockent sie über wasserfreiem Natriumsulfat.
Beim Eindampfen verbleibt ein Öl, welches man durch Filtration über ein Siliciumdioxidbett (Elutionsmittel: Dlethylether) reinigt.
Man gewinnt ein farbloses Öl, welches aus einer Mischung aus etwa 65 % des linksdrehenden Enantiomeren und 35 % des rechtsdrehenden Enantiomeren besteht, welche Anteile durch ¹H-NMR-Spektroskopie (60 MHz) unter Zugabe eines chiralen Seltenen Erdkomplexes bestimmt worden sind.
Man löst 16,66 g (0,0517 Mol) der in dieser Weise erhaltenen Mischung in 70 ml Aceton und gibt 7,77 g (0,0310 Mol) rechtsdrehende Campher-10-säuremonohydrat zu. Man läßt das homogene Medium über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Die erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet (Ausbeute: 44 % bezogen auf die Mischung).
Man löst die erhaltenen Kristalle in der minimalen Menge Aceton am Rückfluß (60 ml). Der nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur erhaltene Niederschlagwird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Weißekristalle, F = 167ºC, [α]D20 = -24,85 (C = 1,79 g/100 ml, Methanol).

b) Linksdrehender α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2- chlor-phenyl)-essigsäuremethylester.

Man löst 11,3 g (0,0204 Mol) des in der Stufe a) erhaltenen Campher-10- sulfonats in der minimalen Menge Wasser. Durch Abkühlen auf 5ºC stellt man die erhaltene wäßrige Lösung mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung alkalisch. Man extrahiert die wäßrig alkalische Phase mit Dichlormethan. Die erhaltene organische Lösung wird getrocknet und man verdampft das Lösungsmittel. Man isoliert ein farbloses Öl (quantitative Ausbeute).
Öl: [α]D20 -50,74 (C = 1,58 g/100 ml, Methanol).
Man bereitet die Verbindung nach der in Beispiel 1d) beschriebenen Verfahrensweise. Ausbeute: 94 %.
Weiße Kristalle, F = 117º C, [α]D20 = -62,56 (C = 1,80 g/ 100 ml Methanol).

d) Hydrogensulfat des linksdrehenden α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylesters (SR 25989 C).

Man stellt 70 g (0,126 Mol) des in der oben beschriebenen Weise a) erhaltenen Camphersulfonats SR 25989 B mit einer wäßrigen gesättigten Natriumbicarbonatlösung in Gegenwart von Dichlormethan alkalisch. Man dekantiert die organische Phase ab, trocknet sie über Sulfat und dampft sie zur Trockne ein.
Zu dem mit 300 ml Aceton aufgenommenen Rückstand gibt man tropfenweise 7,2 ml (0,126 Mol) konzentrierte Schwefelsäure. Nach dem Rühren filtriert man die gebildeten Kristalle ab und wäscht mit Aceton. Man erhält 47,8 g weiße Kristalle.
F = 182ºC, [α]D20 = -51,61 (C = 2,044 g/100 ml Methanol).
Die Analyse (C, H, N) ist mit der Struktur konform.

PHARMAKOLOGISCHE UNTERSUCHUNG

Man vergleicht die antiaggregierende Wirkung und die Toxizität der neuen Verbindungen mitjenen der racemischen Mischung, die in der französischen Patentschrift Nr. 82. 12599 (Veröffentlichungs-Nr. 2 530 247) beschrieben ist.
Im folgenden werden die Ergebnisse dieser Untersuchung beschrieben, die einen weiteren Vorteil der Erfindung verdeutlichen, nämlich denjenigen, daß die Salze des rechtsdrehenden Isomeren einen besseren therapeutischen Index aufweisen als das Salz der racemischen Mischung. In der Tat zeigt das linksdrehende Isomere praktisch keine gegen die Blutplättchenaggregation gerichtete Wirkung und seine Toxizität ist deutlich größer als die seines rechtsdrehenden Homologen.
Die gegen die Blutplättchenaggregation gerichteten und die antithrombotischen Wirkungen dieser Verbindungen wurden an der Ratte mit Hilfe klassischer Verfahrensweisen untersucht.
Man bestimmt ex-vivo die Wirkung auf die durch ADP oder Kollagen verursachte Plättchenaggregation.
Man verabreicht die Produkte in Lösung in Ethanol (200 mg/ml), die mit Wasser, das Gummi arabicum enthält (5% - Gew./Vol.) auf oralem Wege an Gruppen von 5 weiblichen Ratten des Stammes CD-COBS, mit einem Gewicht von 250 - 300 g in einer Menge von 10 ml der Suspension pro Kilogramm zwei Stunden vor der Entnahme des Bluts.
Die Entnahme des Bluts von den mit Diethylether betäubten Tieren erfolgte durch Punktion der Bauchaorta, wobei das Blut auf Natriumcitrat in 3,8 %-iger wäßriger Lösung gegeben wurde (1 Vol./9 Volumen Blut). Das plättchenreiche Plasma wurde anschließend durch Zentrifugieren während 10 Minuten bei 200 g isoliert.
Die Aggregation wird durch Zugabe von 2 ul der aggregierenden Lösung pro 400 ul des plättchenreichen Plasmas induziert. Als aggregierende Lösungen verwendet man: eine wäßrige Lösung von ADP, die im Handel von der Firma Boehringer Mannheim erhältlich ist, in einer Konzentration von 500 uM (Endkonzentration 2,5 uM) und eine von der Firma Sigma vertriebene Kollagenlösung (Typ 1) mit einer Konzentration von 0,25 g/ 100 ml in 3 %-iger Essigsäure (V/V) (Endkonzentration 12,5 ug/ml).
Die Plättchenaggregation wurde nach der von G.V.R. Born in Nature 194 (1967), S. 927 beschriebenen Methode mit einem Coultronics -Aggregometer bei einer Temperatur von 37ºC und unter Rühren bei 900 min&supmin;¹ verfolgt.
Bei der Aggregation mit ADP liefert das Aggregometer eine Kurve, welche die durch eine Veränderung der optischen Dichte gemessene Plättchenaggregation wiedergibt. Die Höhe dieser Kurve ist als Ausmaß der Aggregation definiert. Der Prozentsatz der Aggregation entspricht dem Verhältnis zwischen dem gemessenenausmaß der Aggregation und dem Ausmaß, das einer 100 %-igen Aggregation entspricht, x 100. Der Prozentsatz der Inhibierung wird durch das folgende Verhältnis bestimmt:
Ausmaß der Aggregation Kontrolle - Ausmaß der Aggregation des Produkts/Ausmaß der Aggregation Kontrolle x 100
Die bei der Aggregation mit ADP erhaltenen Ergebnisse für das Hydrochlorid der racemischen Mischung (PCR 4099), die Hydrogensulfate der rechtsdrehenden (SR 25990 C) und linksdrehenden (SR 25989 C) Isomeren einerseits, PCR 4099 und die Hydrochloride der rechtsdrehenden (SR 25990 A) und linksdrehenden (SR 25989 A) Isomeren andererseits sind in der nachfolgenden Tabelle I angegeben. Sie verdeutlichen, daß das linksdrehende Isomere inaktiv ist und daß das rechtsdrehende Isomere mindestens ebenso aktiv ist wie das Racemat. TABELLE I Produkt Dosis Menge der verabreichten Base % Aggregation* % Inhibierung Kontrolle (Racemat) * Mittelwerte der Ergebnisse ± Standardabweichung ** Student-Test n.s. nicht signifikant
Bei der Aggregation mit Kollagen entspricht der Prozentsatz der Inhibierung der Differenz der Steigungen der Kurven, welche die Änderung der optischen Dichte in Abhängigkeit von der Zeit für die Kontrolle und das zu untersuchende Produkt dividiert durch den Anstieg für die Kontrolle multipliziert mit 100 wiedergeben. Die in der Tabelle II angegebenen Ergebnisse zeigen weiterhin, daß lediglich das rechtsdrehende Isomere wirksam ist, während die Salze vergleichbare Aktivitäten besitzen. TABELLE II Produkt Dosis Verabreichte Menge der Base Neigung % Inhibierung Kontrolle (Racemat) ** Student-Test n.s. nicht signifikant
Es wurde auch die antithrombotische Wirkung der Verbindungen bei dem von T. Kumada et coll. in Thromb. Res. 18 (1980), S. 189 beschriebenen Bohrer- Venenthrombosetest untersucht.
Man betäubt weibliche Ratten des oben beschriebenen Typs in Gruppen von jeweils 10 Tieren pro Gruppe mit Diethylether und isoliert ihre Hohlvene nach einem Bauchschnitt.
Man führt in das Lumen dieser Vene bis direkt unterhalb der Nierenverzweigung bis zu den Ileumvenen ohne Verletzung der Wandung einen Metallbohrer ein, der aus einem Zahnarztpastenstopfen mit einer Länge von 21 mm der Größe Nr. 30, der von der Firma Dyna (France) vertrieben wird, besteht. Der Bohrer 30 wird auf eine Länge von 19 bis 20 mm implantiert und übersteigt das Äußere um 1 mm, wonach der Bauch wieder verschlossen wird.
Es bilden sich schnell Thromben und fünf Stunden später wird unter Betäubung mit Pentobarbital der Bauch geöffnet und es werden Ligaturen oberhalb und unterhalb des Bohrers angeordnet, der nach einem Längsschnitt der Vene entnommen wird, worauf der isolierte Thrombus gewogen wird.
Die in der Tabelle III angegebenen Ergebnisse verdeutlichen, daß das linksdrehende Isomere bei diesem Test inaktiv ist im Gegensatz zu dem rechtsdrehenden Isomeren und dem Racemat. TABELLE III Produkt Dosis mg/kg p.o. verabreicht Menge der Base Gewicht der Thromben* Variation % Kontrolle (Racemat) * Gewicht der Thromben in mg ± Standardabweichung P = U-Test nach Kruskal-Wallis
Zur toxikologischen Untersuchung verabreicht man die Verbindungen auf oralem Wege in Form einer Suspension in einem gleichen Volumen mit 10 % Gummi arabicum (Gew./Vol.) versetztem Wasser an Gruppen von 10 nüchternen weiblichen Ratten des Stammes Sprague Dawley mit einem Gewicht von 120 bis 135 g.
Man bestimmt die Anzahl der toten Tiere 14 Tage nach der Verabreichung des zu untersuchenden Produkts. Die in dieser Weise bestimmten letalen Dosierungen ausgedrückt als Gewicht des verabreichten Salzes sind in der Tabelle IV angegeben. Diese Ergebnisse zeigen, daß einerseits die Toxizität der racemischen Mischung ähnlich der des linksdrehenden Isomeren ist, während das rechtsdrehende Isomere wesentlich weniger toxisch ist, und daß andererseits die Toxizität von der Art der für die Salzbildung verwendeten Säure abhängt. TABELLE IV Produkte Absolute letale Dosis (Racemat) ( ) = Fehlerbereich

Claims

1. Hydrogensulfat des rechtsdrehenden Isomeren des α-(4,5,6,7-Tetrahydro thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylesters.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den racemischen α-(4,5,6,7-Tetrahydro-thieno[3,2-c]pyrid-5-yl)-(2-chlor-phenyl)-essigsäuremethylester mit linksdrehender 10-Camphersulfonsäure in Aceton in das Salz überführt, aufeinanderfolgende Umkristallisationen des Salzes in Aceton bewirkt, bis man ein Produkt mit konstantem Drehwert erhält und dann das rechtsdrehende Isomere mit einer Base aus seinem Salz freisetzt und sein Salz mit Schwefelsäure bildet.

3. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff eine Verbindung nach Anspruch 1 enthält.

4. Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß jede Einheitsdosis 0,001 bis 0,100 g des Wirkstoffs enthält.