DD247699A1

DD247699A1 - Verfahren zur selektiven hemmung der proteinbiosynthese

Info

Publication number: DD247699A1
Application number: DD28767386A
Authority: DD
Inventors: Peter Westermann; Burckhard Gross; Heinz Bielka
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1986-03-07
Filing date: 1986-03-07
Publication date: 1987-07-15

Abstract

Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch die Hemmung der Synthese spezifischer Proteine in den Zellstoffwechsel einzugreifen. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Oligonucleotide mit einer zum jeweiligen Messenger komplementaeren Sequenz von 6-20 Nucleotiden in das Naehrmedium dieser Zellen oder Gewebe eingebracht werden. Anwendungsgebiete der Erfindung sind Mikrobiologie und Medizin.

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen g·

Eine selektive Hemmung der Biosynthese von Proteinen kann bisher nur durch Transformation pro- oder eukaryontischer Zellen mit entsprechenden Plasmiden erreicht werden. Die Transkription dieser Plasmide führt zur Synthese einer Ribonukleinsäure (anti-senseRNA), die der für das jeweilige Protein kodierenden Messenger-RNA z. T. komplementär ist und daher ein RNA-RNA-Hybrid bildet, das die Ablesung des Messengers hemmt (J. G. Izant und H.Weintraub; Cell 36 (1984) 1007-1015). Ein ähnlicher Effekt in nicht transformierten Zeilen wurde bisher nur für E.coli im Fall des ompF-Gens beschrieben (T. Mizuno, M.-Y. Chou und M.lnouye;Proc. Natl.Acad. Sei. (US) 81,1966-1970 [1984]). Eine Transformation ist bei vielen Zellen nicht möglich, andererseits auch aufwendig und nicht ohne weiteres wieder aufzuheben.

Der gleiche Effekt kann auch durch Oligodesoxyribonukleotide erreicht werden, die mit dem Messenger hybridisieren und ebenfalls dessen Ablesung hemmen. Eine Anwendung im zellulären System wurde bisher nur für die Injektion eines Oligodesoxyribonukleotids in Xenopus-Oozyten beschrieben (E.S.Kawasaki; Nucl. Acids. Res. 13,4991-5004 [1985]). Injektionen in einzelne Zellen sind aus technischen Gründen nur für analytische Zwecke im Labormaßstab möglich. Retikulozyten, mit hohen Konzentrationen an Oligodesoxynukleosidmethylphosphonaten inkubiert, zeigten eine Hemmung der Globinsynthese (K. R. Blake, A. Musakami, S. A. Spitz, S. A. Glove, M. D. Reddy, P. O. P. T'so, P. S. Miller; Biochemistry 24 [1985] 6139-6145). Dieses Verfahren hat bezüglich einer technischen Anwendung den Nachteil, das die eingesetzten Methylphosphonate keine natürlich vorkommende Substanzklasse darstellen und deshalb toxisch wirken können.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch die Hemmung der Synthese spezifischer Proteine die behandelte Zelle zu schwächen oder abzutöten, wenn z. B. essentielle Enzyme betroffen sind oder die Synthese von Resistenzfaktoren, z. B. Penizillinase unterdrückt wird.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur selektiven Hemmung der Proteinbiosynthese in Zellen oder Geweben ist dadurch gekennzeichnet, daß Oligodesoxynukleotide mit einer zum jeweiligen Messenger komplementären Sequenz von 6 bis 20 Nucleotiden in das Nährmedium dieser Zellen oder Gewebe eingebracht werden. Dazu ist zweckmäßigerweise ein Oligodesoxynukleotid zu wählen, das wenigstens teilweise der 5'-terminalen, nicht kodierenden Sequenz des Messengers komplementär ist. So ist beispielsweise für die Hemmung der Expression des Groß-T-Antigen des SV-40-Virus ein Oligonucleotjd folgender Sequenz notwendig:

⁵CTTTG CAAAG CTTTTT³'. Es bildet mit dem Messenger ein RNA-DNA-Hybrid und hemmt dadurch die Translation des Messengers.

Dieses Oligonucleotid wird in Konzentration von 30 bis 300ng/ml zur Nährlösung der Zellen gegeben, wodurch eine Hemmung der Biosynthese des Groß-T-Antigens von über 50% erreicht wird.

Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bietet sich sowohl bei der Bekämpfung von Viren, Bakterien, Pilzen oder anderen Mikroorganismen an, ohne daß andere, gleichzeitig mitbehandelte Organismen, wie z. B. die entsprechenden Wirte, beeinflußt werden. Es ist andererseits auch denkbar, daß durch die Ausschaltung von Hemmfaktoren eine Stimulierung des Wachstums erreicht werden kann, oder unkontrolliertes Wachstum durch die Hemmung der Synthese von Wachstumsfaktoren, Rezeptoren o.a. unterbunden wird.

Ausführungsbeispiel

Als Testobjekt wurde die COS-1-Zelle gewählt, die durch Transformation aus der Affennieren-Zellinie CV1 erhalten wurde und die das Groß-T-Antigen des SV-40-Virus exprimiert. Die Gensequenz des Groß-T-Antigens ist bekannt und somit konnte ein Hexadecamer synthetisiert werden, das den 16 links vom Startkodon unmittelbar benachbarten Nukleotiden komplementär ist (⁵-CTTTGCAAAGC ι ι ι ι ι³'). Das Hexadecamer wurde in Konzentrationen von 30 bis 300ng/ml in das Nährmedium der Zellen gegeben und nach einer Einwirkungszeit von 30 min wurde die Synthese des Groß-T-Antigens gemessen. Dazu wurde radioaktives Methionin in das Nährmedium gegeben und das markierte Produkt aus dem Zellextrakt durch Immunpräzipitation isoliert. Eine Quantifizierung ist durch Gelelektrophorese und Autoradiographie möglich. Es konnte eine Hemmung der Neusynthese des Groß-T-Antigens von mindestens 50% in dem untersuchten Konzentrationsbereich nachgewiesen werden ohne das die zelluläre Gesamtproteinsynthese merklich vermindert worden ist.

Claims

Verfahren zur selektiven Hemmung der Proteinbiosynthese in Zellen oder Geweben, dadurch gekennzeichnet, daß Oligodesoxyribonukleotide mit einer zum jeweiligen Messenger komplementären Sequenz von 6 bis 20 Nukleotiden in das Nährmedium dieser Zellen oder Gewebe*eingebracht werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Hemmung der Proteinbiosynthese in Zellen oder Geweben. Anwendungsgebiet der Erfindung sind Mikrobiologie und Medizin.