DE69333550T2

DE69333550T2 - TNF-alpha RIBOZYME UND ABBAU-RESISTENTE mRNA DERIVATIVE GEBUNDEN AN TNF-alpha Ribozyme

Info

Publication number: DE69333550T2
Application number: DE69333550T
Authority: DE
Inventors: Mouldy Sioud
Original assignee: Gene Shears Pty Ltd
Current assignee: Gene Shears Pty Ltd
Priority date: 1992-11-03
Filing date: 1993-11-03
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2013-11-04
Also published as: NZ257484A; WO1994010301A1; JPH08505521A; EP0672133B1; ATE269405T1; DE69333550D1; US6040159A; AU680843B2; IL107480A0; US5985620A; EP0672133A1; CA2148368A1; AU5412094A; ZA938208B; EP0672133A4

Description

Im Rahmen dieser Anmeldung wird auf verschiedene Publikationen durch arabische Ziffern in Klammern Bezug genommen. Die Offenbarungen dieser Publikationen werden dadurch in ihrer Gesamtheit durch die In-Bezugnahme in diese Anmeldung übernommen, um so vollständiger den Stand der Technik zu beschreiben, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht.
Die Entdeckung von RNS-Molekülen, die enzymatische, selbst-spaltende Aktivität besitzen (Ribozyme), hat einen neuen Weg zur künstlichen Steuerung der Gen-Expression zur Verfügung gestellt (Foster & Symons (1987), Cell 49: 585–591). Es wurden Ribozyme entworfen, die nahezu alle Sequenzen enthalten, die für eine Spaltung erforderlich sind. Für den „Hammerkopf"-Typ muss die Ziel-RNS nur die Sequenz XUX enthalten, und eine Spaltung tritt in 3'-Position von der Sequenz XUX auf (Haseloff & Gerlach (1988), Nature, (London), 343: 585–591; Periman et al., Gene (1992), 113: 157–163). Die hohe Spezifität und die begrenzten Anforderungen an das Target geben diesen katalytischen RNS-Molekülen das Potential zur Inhibierung viraler Pathogene und zur Regulation einer spezifischen Gen-Expression durch Eingreifen in die Transkription in einer hochgradig spezifischen Weise (Uhlenbeck (1987), Nature (London), 328: 596–600; Haseloff & Gerlach (1988), Nature (London) 334: 585–591).
Einige Berichte geben an, dass der „Hammerkopf"-Typ von Ribozymen in lebenden Zellen funktioniert. Cotten & Birnstiel (1989, EMBO J., 8: 3861–3866) und Cameron & Jennings (1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 9139–9143) berichteten über eine Ribozym-vermittelte Zerstörung und Verringerung der spezifischen Gen-Expression in Oocyten von Xenopus laevis bzw. in Affen-Zellen (COS1). Sarver et al., (1990), Science 247: 1222–1225, zeigten, dass ein gegen HIV-1-gag-RNS gerichtetes Ribozym die p24-Antigen-Expression in CD4⁺-Hela-Zellen verringerte. In jüngster Zeit wurde diese Linie von Untersuchungen ausgedehnt auf Bakterienzellen, indem man zeigte, dass ein zur Spaltung des Integrase-Gens von HIV-1 gedachtes Ribozym wirksam ist, wenn es von einem Plasmid in Escherichia coli transkribiert wird. Integase-RNS wurde eliminiert, und die Integase-Protein-Synthese wurde blockiert (Sioud & Drlica (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 7303–7307). Da Ribozyme in vivo wirksam sind, können nun Probleme der Ribozym-Stabilität und Bereitstellung angesprochen werden.
Um in die Gen-Expression von Tumor-Necrose-Faktor-α (TNF-α) einzugreifen, haben wir eine kationische, Liposom-vermittelte Transfektion angewendet (Malone et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 6077–6081), um so ein Ribozym, das gegen TNF-α gerichtet ist, in menschliche promyelocytische Leukämiezellen (HL60) und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) zu liefern. TNF-α spielt eine wichtige Rolle in vielen entzündlichen rheumatischen Krankheiten (Shinmei et al., (1989), Sem. Arth. Rheum., 18 (Ergänzungsband 1), 27–32), und es moduliert die Expression verschiedener Proteine einschließlich der Klasse-I-Antigene des Major Histocompatibility Kompexes (MHC) und von Zytokinen wie beispielsweise Interleukin 1 und Interleukin 6 (Beutler & Cerami, (1988), Annu. Rev. Biochem., 57: 505–518 und (1989), Annu. Rev. Immunol., 7: 625–655). TNF-α scheint auch nötig für normale Immun-Antworten zu sein, jedoch können großen Mengen davon zerstörerische Wirkungen ausüben, beispielsweise wie diejenigen, die bei rheumatoider Arthritis beobachtet werden (Brennan et al., (1989), Lencet ii, 244–247). Darüber hinaus ist TNF-α das Zytokin, das verantwortlich für die Induktion einer HIV-1-Expression in ACH-2-Zellen ist (Rosenberg & Fauci, (1990), Immunol. Today, 11: 176–180). TNF-α induziert die Produktion cellulärer Faktoren, die an die NF-XB-Verstärker-Elemente in viralen langen terminalen Repeat-Sequenzen gebunden werden und aktiviert dadurch die HIV-1-Expression.
Die Wirksamkeit katalytischer RNS-Moleküle ist abhängig von der Stabilität der mRNS in vivo. In Vergleich mit der Kenntnis von DNS-Struktur-Elementen ist wenig über Elemente der mRNS-Stabilität bekannt. Halbwertszeiten einer mRNS liegen im Bereich von weniger als 30 min für Fibroblasten-Interferon und c-fos bis zum mehr als 17 h für β-Globin. Die meisten eukariotischen mRNSs werden in Zellen vor einem Angiff einer Exonuklease durch eine cap-Strukur in 5'-Stellung und den 3'-Poly(A)-Schwanz und Poly(A)-Bindungsproteine geschützt. Darüber hinaus weisen eukariotischr mRNSs so wohl in 5'-Stellung als auch in 3'-Stellung nicht-kodierende Bereiche auf jeder der beiden Seiten des kodierenden Bereichs auf. Der in 5'-Position liegende, nicht-kodierende Bereich ist in die Geschwindigkeit der Initiierung der Translation der mRNS zum Protein involviert. Der in 3'-Position befindliche nicht-kodierende Bereich dient zur Initiierung der Bildung des Poly(A)-Bereichs und kann in der Weise wirken, dass er die mRNS stabilisiert (F. E. Baralle, Int. Rev. Of Cytology (1983), 81: 71–106). Insbesondere wurden auf 3'-Position liegende, nicht-kodierende, auf Eisen reagierende Elemente identifiziert, die eine mRNS-Stabilität in Gegenwart von Eisen modulieren. Ein anderes charakterisiertes Motiv ist das AUUUA-Element, das verantwortlich für den schnellen Abbau einiger cellulärer mRNSs ist, insbesondere von Zytokin-mRNSs (K. S. Saini et al., Mol. Cel. Biochem. (1990), 96: 15–23; H. J. Ross et al., Blood (1991), 77: 1787–1795). Einige haben postuliert, dass eine anfängliche Endonuklease-Attacke erforderlich ist, bevor ein schneller Abbau stattfinden kann (D. A. Nielson und D. J. Shapiro, Mol. Endocrinology (1990), 4: 953–957).
Es gibt einen Bedarf für Verfahrensweisen zur Verlängerung der Halbwertszeit spezieller mRNSs in vivo zur Protein-Produktion und für Oligonukleotid-Verfahren der Gen-Steuerung (Antisense und Triple-Helix) zur Verwendung in Pflanzen und Tieren. Weiter können stabilisierende von mRNS-Elemente auf Ribozyme zusätzlich zu Antisense-Oligonukleotiden angewendet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt Verbindungen, die aktiv gegen TNF-α-mRNS sind. Sie beschreibt weiter RNS-Moleküle, die in der Lage sind, RNS in vivo durch ein oder mehrere endogenes) Proteine) Stabilität zu verleihen. Mögliche zu stabilisierende RNS-Moleküle schließen ein: Ribozyme, Antisense-Moleküle, mRNS-codierende Polypeptide, die nützlich für eine Protein-Produktion und andere celluläre RNS sind. Die hier beschriebenen Ribozyme und Antisense-Moleküle sind nützlich in Säugern und Pflanzen und sind besonders geeignet für virale Krankheiten. Verfahren der Herstellung und Verfahren der Anwendung werden ebenfalls beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Basen-Paarung von Ribozym A, B und II mit einer TNF-α-RNS-Matrize (SEQ-ID Nr. 15–18).
Ribozym A besteht aus der konservativen Ribozym-Sequenz, wie beschrieben von Haseloff & Gerlach (1988), den 5'- und 3'-Flankierungssequenzen, die komplementär den TNF-α-RNS-Nukleotiden 374 und 393 sind: Siehe Pennica et al., (Nature) (1984), 312: 724–729 hinsichtlich der Numerierung; und Bakteriophage-T7-Transkriptions-Terminator mit CU-Mispaarung (C), (Rosenberg et al., Gene 1987, 56: 125–135).
Ribozym B ist identisch mit A, mit der Ausnahme, dass ihm der T7-Transkriptions-Terminator fehlt.
Ribozym II ist eine verkürzte Version von Ribozym B mit 9 bzw. 11 Basen-Paare umfassenden hybridisierenden Armen.
Die Antisense-RNS ist identisch mit Ribozym A, mit der Ausnahme, dass es ein einzelnes Guanosin-Nukleotid anstelle der katalytischen Domain aufweist. Das Anti-TNF-α-Hammerkopf-Katalyse-Gen und die Antisense-RNS-Steuerung wurden hergestellt, wie beschrieben von Sioud & Drlica (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 7303–7307). Kurz gesagt, wurden zwei überlappende Halb-Oligonukleotide, die die Sequenzen eines Bakteriophagen-T7-RNS-Polymerase-Promoters enthielten, die 5'- und 3'-Erkennungs-Sequenzen des Ribozyms, die katalytische Domain und der T7-Transkriptions-Terminator synthetisiert (eine XbaI-Restriktions-Stelle wurde zwischen dem T7-Terminator und dem 3'-Ende des Ribozyms eingeführt, und PvuII- und XhoI-Stellen wurden an den 5'- und 3'-Enden der Ribozym-Sequenzen eingeführt), die Sequenzen wurden hybridisiert und dann mit dem Klenow-Fragment von DNS-Polymerase erweitert. Im Anschluss an die Erweiterung wurde die DNS mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt, auf Gel gereinigt und anschließend in einen mit SmaI-gespaltenen pUC-18- Vektor kloniert. Die Sequenzen der überlappenden Primer waren wie folgt (Public Health Research Institute, New York, 10016 N. Y.):
(1) Ribozym-Primer (SEQ-ID Nr. 19–22)
(2) Antisense-Primer
Die unterstrichenen Sequenzen in der Figur resultierten aus der Gegenwart von Restriktions-Stellen in der DNS-Matrize. Ribozym II, im Unterschied zu Ribozym A und B, fehlen diese Sequenzen. Daher sind die Restriktions-Sequenzen für eine Stabilität nicht erforderlich. Alle drei Ribozyme sind in vivo stabil und binden sich an Protein.
1a–2b: (A) In-vitro-RNS-Transkripte und (B) In-vitro-Aktivität

(A) In-vitro-Transkription der Ribozyme A, B und TNF-α Antisense. Ribozyme und Antisense-RNS wurden mit T7-RNS-Polymerase von auf PAGE gereinigten Matrizen-DNS-Fragmenten transkribiert, die von rekombinanten Plasmiden gespalten wurden, wie beschrieben von 0. Uhlenbeck, Nature (1987), 328: 596–600. Die RNS wurde intern mit [α³²P] CTP während der Transkription markiert. Die Transkription wurde in allen Fällen mit 7-Methylguanosin-(5')-triphospho-(5')-guanosin geprimt. Die Transkripte wurden mit DNAse (RNAse-frei) behandelt, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und anschließend durch Elektrophorese in einem 15%-Polyacralymid-Gel analysiert, das 7 M Harnstoff enthielt. Die Längen der Ribozyme A, B und Antisense waren 97, 49 bzw. 76 Nukleotide.
(B) Spaltung von TNF-α-RNS in vitro. PBMNC-Zellen wurden mit PMA und ConA stimuliert, um das TNF-α-Protein zu exprimieren. Die gesamte Zell-RNS wurde extrahiert, und die RNS (20 μg) wurden mit 1 μg Ribozym bzw. Antisense-RNS für 60 min bei 50°C inkubiert. Die RNS-Spezies wurden dann durch Gel-Elektrophorese getrennt, und TNF-α-RNS wurde durch Northern Blotting identifiziert (kb = 10³ Basen).

3a–3c: Ribozym-Stabilität im Anschluß an die Transfektion
Die Auswirkung des Bakteriophagen-T7-Transkriptions-Terminators auf die RNS-Stabilität wurde verglichen durch Co-Transfektieren von HL60-Zellen mit den Ribozymen A und B. Die Gesamt-RNS wurde extrahiert und durch Elektrophorese in 15%igen (w/v) Polyacrylamid-Gelen, die 7 M Harnstoff enthielten. Ribozym A konnte mehr als 72 h nach der Transfektion nachgewiesen werden; demgegenüber ist die Menge an Ribozym B progressiv abgefallen (3(a)). Die in jeder Bande enthaltene Radioaktivität wurde dann bestimmt, und die Ergebnisse wurden als Prozentwert der Radioaktivität zum Zeitpunkt Null ausgedrückt. 3(c) zeigt, dass Ribozym B schneller als Ribozym A zerfällt. Die Rest-Radioaktivität für Ribozym A und B 7 h nach der Transfektion betrug 57% bzw. 19%. Die Stabilität der Antisense-RNS-Kontroll-Probe (Ribozym A, dem die katalytische Domain fehlt) ist ähnlich der von Ribozym A (Daten nicht gezeigt). Damit erhöht die Addition eines Bakteriophagen-T7-Terminators an das 3'-Ende eines Ribozyms dessen Stabilität.

(a) Die Kompartmentierung von Ribozym A in HL60-Zellen wurde ebenfalls untersucht durch Analyse der cytoplasmatischen und der Kern-RNSs. Wie in 3(b) gezeigt (Spuren N und C) ist Ribozym A vorzugsweise im Kern angeordnet.

Zehn Millionen Human-HL60-Zellen (ATCC CCL 240) wachsend in der log-Phase in RPMI 1640, supplementiert mit 20% (v/v) an fetalem Kälberserum (FCS), wurden für eine RNS-Transfektion verwendet. Die Zellen wurden zweimal mit Serum-freiem Medium gewaschen. Ein Tropfen (5 ml) Serum-freies Medium wurde in Polystyrol-Röhrchen gegeben, gefolgt von 35 μg Lipofectin (Firma Bethesda Research Laboratories), 10 μg Träger-RNS (E. Coli tRNS), 3 × 10⁶ Disints min. von ³²P-markiertem, gecapptem Ribozym A, B oder Antisense-RNS (5 μg). Die Mischung wurde sofort gemischt. Die Zellen wurden in einer Mischung aus Serum-freiem Medium Lipofectin/RNS/Träger-RNS resuspendiert und für 20 h in den Inkubator zurückgestellt. Im Anschluss an die Transfektion wurden die Zellen 3 mal mit Hank's gepufferter Kochsalz-Lösung gewaschen und dann in den Inkubator mit RPMI, das mit 20% FCS supplementiert war, zurückgestellt. Die Zellen (10⁶) wurden zu den Zeiten, die oberhalb jeder Spur angegeben sind, gewonnen, und die Gesamt-RNS wurde hergestellt und analysiert mittels 15%igem Polyacrylamid-Gel mit 7 M Harnstoff. Die für eine Transfektion verwendeten RNS-Proben sind oben in 3 angegeben. Ribozym B allein dient als Marker, um seine Position in den Co-Transfektions-Experimenten anzuzeigen.

(a) Analyse von nukleärer (N) und cyctoplasmatischer (C) RNS: Eine Probe (50 μM) von markiertem, gecapptem Ribozym A wurden zum Transfektieren von HL60-Zellen für 20 h verwendet. Die Zellen wurden 3 mal gewaschen, und die nukleäre und ccctoplasmatische RNS wurde hergestellt und durch Gel-Elektrophorese analysiert. Zur Herstellung von cytoplasmatischen und nukleären Fraktionen wurden die Zellen in 10 mM-Tris·HCl (pH: 7,5), 5 mM KCl, 140 mM NaCl, 5 mM Dithiothreitol und 0,49% (w/v) Nonidet P40 für 10 min bei 4°C homogenisiert, und die Kerne wurden durch Zentrifugation bei 800 g für 5 min gewonnen. Die RNS in dem überstehenden Fluid wurde gefällt und als cytoplasmatische Fraktion aufbewahrt. Die Kerne wurden verarbeitet wie beschrieben von Chomezynski & Sacchi (1987), Anal. Biochem., 162: 156–160, um die Gesamt-RNS herzustellen. Der Pfeil zeigt die Position des Ribozym A-Monomers an.
(b) Ein Experiment, das die quantitative RNS-Bestimmung zeigt. Die Lauf-Menge an Radioaktivität in den Ribozym-Banden, die in (a) gezeigt sind, wurde bestimmt und als Prozent-Wert der Radioaktivität ausgerückt, die unmittelbar nach 20 h Transfektionszeit vorhanden war; ☐ Ribozym A; ♦ Ribozym B.

4: Stabilität von Ribozym A, B und II in HL60-Zellen
Mittelwert von mehr als 50 Experimenten: Ribozyme wurden in die Zellen unter Anwendung der durch DOTMA-kationisches Liposom-vermittelten Transfektion eingeführt. Im Anschluss an die Transfektion wurden die Zellen gewaschen und in vollständigem Medium resuspendiert. In 1 ml Kultur enthaltende Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnen. Die Gesamt-RNS wurde hergestellt und dann mittels 15%-Polyacrylamid-Gel analysiert, das 7 M Harnstoff enthielt. Die Menge an Ribozym-Radioaktivität wurde auf Actin-mRNS oder ribosomale RNS normalisiert und dann als Prozent-Wert der Radioaktivität ausgedrückt, die nach 16 h Post-Transfektions-Zeit vorhanden war. Diese Experimente wurden 50 mal für einige Zeitpunkte wiederholt, im Gegensatz zu 3(c), die die Ergebnisse gerade eines einzelnen Experiments zeigt. Weiter zeigte eine erneute Untersuchung von 3(c) parallele Kurven von Ribozym A und B, was eine ähnliche Stabilität für Ribozym B anzeigt.
5a–5b: Ribozym-Aktivität in vivo
Ribozym- und Antisense-RNS-Aktivitäten in HL60-Zellen (a) wurden nach einer Transfektions-Periode (20 h) analysiert. Im Anschluss an die Transfektion mit Ribozym A oder Antisense-RNS wurden die Zellen 6 h lang stimuliert, um TNF-α zu exprimieren. Die RNS wurde extrahiert, mittels Gel-Elektrophorese durch ein 1 bis 2%iges (w/v) Agarose-Formaldehyd-Gel getrennt und durch Northern Blotting mit einer radioaktiven Sonde für das TNF-α Gen nachgewiesen. Nach Hybridisieren mit der TNF-α-Sonde wurde das Filter gestrippt und anschließend mit einer Actin-Sonde (Firma British Biotechnology Limited) im Fall von peripheren mononukleären Blut-Zellen (PBMNC) hybridisiert. Die Zellen wurden getrennt (Sioud et al., 1990) und 4 mal mit Hank's gepufferter Kochsalz-Lösung und 3 mal mit Serum-freiem Medium gewaschen. Die Zellen (10⁶) wurden transfektiert und als HL60-Zellen verarbeitet. Spuren 1 und 4: Kontroll-Proben (transfektiert nur mit Träger-RNS 1 μg E. Coli tRNS); Spur 2: Antisense-RNS; Spuren 3 und 5: Ribozym A. Dieses Autoradiogramm wurde überbelichtet und zeigte so ein TNF-α-Signal in den Ribozym A-Spuren.

(b) Radioimmuno-Assay für das TNF-α-Protein: Inomycin wurde während des Stimulations-Schritts zum Freisetzen des TNF-α-Proteins in das Medium verwendet. Die Menge an TNF-α-Protein, die in dem Medium zugegen war, wurde bestimmt unter Verwendung des TNF-α-[¹²⁵I]-Test-Systems (Firma Amersham). Die Spuren 1 bis 5 entsprechen den Spuren 1 bis 5 in den 5(a) bzw. 5(b).

6a–6b: Immunofärbung der Ribozyme B und II in HL60-Zellen
6a zeigt, dass Digoxigenin-konjugiertes Uridin in die Ribozyme während der Transkription inkorporiert worden war. Die Zellen wurden mit Digoxigenin-konjugierten Ribozymen transfektiert. Im Anschluss an die Transfektion wurden Mikroskop-Objektträger hergestellt, und dann wurden das Ribozym in den Zellen mit einem Anti-Digoxigen-Fluorescein-Fab-Konjugat nachgewiesen. 6b zeigt eine Photographie der Fluoreszenz-Zellen.
7a–7c: Gel-Retardations-Assay von cytoplasmatischen Extrakten von HL60-Zellen und PBMNC mit TNF-α-Ribozymen II und B

(A) Ribozym II wurde bei Raumtemperatur für die Zeit von 25 bis 30 min inkubiert (Spuren 2, 3, 4 und 5) (siehe unten) oder nicht inkubiert (Spur 1), und zwar mit Extrakt-Proteinen, und wurde anschließend mittels Elektrophorese analysiert (25 μg Oligo + 5 μg cytoplasmatischer Extrakt (CE)). Die Spuren 4 und 5 sind wie die Spuren 2 bzw. 3, jedoch wurden 20 Einheiten RNSsin zugesetzt. Alle in den Spuren 4 und 5 beobachteten Komplexe konnten in den Spuren 2 und 3 beobachtet werden (Original-Film).
(B) 25 ng TNF-α-Ribozym II wurde durch In-vitro-Transkription erzeugt (wie vorher beschrieben: Sioud et al., 1992) und wurde bei Raumtemperatur 25 min lang mit cytoplasmatischen Extrakten (CE) inkubiert, die aus HL60- oder PBMNC-Zellen hergestellt worden waren, wie im Abschnitt „Materialien und Verfahrensweisen" beschrieben ist. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Protein-Ribozym-Komplexe durch ein 4%iges natives Polyacrylamid-Gel getrennt. Spur 1: Kontroll-Probe ohne CE; Spur 2: +5 μg CE aus HL60-Zellen; Spur 3: wie Spur 2, jedoch wurde zusätzlich 1 μg tRNS zugesetzt; Spur 4: wie Spur 3, jedoch wurden zusätzlich 10 Einheiten RNAse-Inhibitor zugesetzt; Spur 5: wie Spur 4, jedoch vor der Elektrophorese wurde die Probe mit Proteinase K behandelt; Spur 6: wie Spur 1, jedoch wurden 5 μg der CE von PBMN-Zellen zugesetzt; Spur 7: wie Spur 6, jedoch wurde mehr als 1 μg tRNS zugesetzt; Spur 8: enthält die Ribozym-RNS, gewonnen von dem hochmolekularen Komplex (der Komplex wurde aus einem präparativen Gel herausgeschnitten, die Materialien wurden eluiert und dann mit Phenol extrahiert).
(C) Gel-Retardation mit Ribozym B: wie Platte A-Ribozym B und inkubiert (Spur 2) mit 5 μg des CE, das aus HL60-Zellen hergestellt worden war.

8: Kompetitive Assays
25 ng Ribozym II wurden mit 5 μg cytoplasmatischen Proteins von HL60-Zellen oder PBMNC inkubiert, wie dies in 5 beschrieben wurde. Spur 1: Kontrolle ohne CE; Spur 2: wie Spur 1, jedoch wurden sowohl 5 μg CE von HL60-Zellen als auch 2.500 mg PolydCdI zugesetzt; Spur 3: wie Spur 2, jedoch wurden anstelle von PolydCdI 2.500 ng kaltes Ribozym zugesetzt; Spur 4: wie Spur 3, jedoch wurde ein 500facher Überschuss an kaltem Ribozym zugesetzt; Spur 5: wie Spur 1, jedoch wurden 5 μg CE von PBMN-Zellen zugesetzt; Spuren 6, 7 und 8: wie Spur 5, jedoch wurden 300, 400 oder 500 an kaltem Ribozym zugesetzt.
9: Vorausgesagte Sekundär-Struktur von Interleukin-2-(IL-2)-Ribozym und IL-2-Ribozym gebunden an das 5'-Ende des TNF-α-Ribozyms oder Antisense-SEQ-ID Nr. 23–25
10a–10c: Gel-Retardations-Assay von cytoplasmatischem Extrakt mit IL-2-Ribozymen

(A) 25 ng IL-2-Ribozym, erzeugt durch In-vitro-Transkription wurden inkubiert mit CE von HL60-Zellen; Spur 1: Kontroll-Probe ohne CE; Spur 2: mit CE von HL60-Zellen.
(B) Anstelle von CE mit HL60-Zellen wurde IL-2-Ribozym inkubiert mit CE von PBMN-Zellen (Spur 2).

11a–11c: Gel-Retardations- und UV-Vernetzungs-Experimente

(A) 50 ng TNF-α-Ribozym Π, erzeugt durch In-vitro-Transkription, wurden bei Raumtemperatur 25 min lang mit cytoplasmatischen Extrakten (CE) inkubiert, die von PBMN-Zellen hergestellt worden waren. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Protein-Ribozym-Komplexe mit einem 6%igen nativen Polyacrylamid-Gel abgetrennt. Spur 1: Kontrolle ohne CE; Spur 2: +5 μg CE1 von PBMN-Zellen; Spur 3: +5 μg CE2 von PBMN-Zellen; Spuren 4 und 5: wie Spuren 2 bzw. 3, jedoch behandelt mit Proteinase K für 15 min vor der Elektrophorese. CE1 und CE2 entsprechen zwei verschiedenen Cytoplasma-Protein-Zubereitungen.
(B) Dieselbe Platte wie A, jedoch überbelichtet.
(C) Der Bereich des Gels, der den Komplex enthält, wie durch den Pfeil angezeigt ist, wurde aus dem nativen Gel herausgeschnitten, 30 min lang mit UV bestrahlt, in Tris-Puffer eingeweicht, mit Ribonuklease T1 behandelt und auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert.

12A: Gel-Reatardation mit IL-2-Ribozym, IL-2-gebundenem Ribozym, gebunden an das 5'-Ende von TNF-α-Ribozym
50 ng TNF-α-Ribozym, IL-2-Ribozym, IL-2-gebundenes Ribozym an dem 5'-Ende von TNF-α-Ribozym oder IL-2 gebunden an das 5'-Ende von TNF-α-Antisense wurden bei Raumtemperatur mit 2 verschiedenen cyctoplasmatischen Extrakten (CE1 und CE2) inkubiert, die aus PBMN-Zellen hergestellt worden waren: Spur 1: TNF-α-Ribozym –CE als Kontroll-Spur; Spur 2: TNF-α-Ribozym +CE; Spur 3: IL-2-Ribozym –CE als Kontroll-Probe; Spur 4: IL-2-Ribozym +CE, Spur 5: IL-2-Ribozym +CE2; Spur 6: IL-2-Ribozym gebunden an das 5'-Ende von TNF-α-Ribozym –CE; Spur 7: IL-2-Ribozym gebunden an das 5'-Ende von TNF-α-Ribozym +CE1; Spur 8: IL-2-Ribozym gebunden an das 5'-Ende von TNF-α-Ribozym +CE2.
12B: Gel-Retardation mit IL-2, gebunden an das 5'-Ende von TNF-α-Antisense
Spur 1: IL-2-Ribozym gebunden an das TNF-α-Antisense –CE; Spuren 2 und 3: IL-2-Ribozym gebunden an das TNF-α Antisense +2 μg CE1 bzw. 5 μg CE.
13a–13b: (A) Vorhergesagte Sekundärstruktur des T7-Terminators gebunden an TNF-α-Ribozym; (B) TNF-α-Antisense, gebunden an das 3'-Ende von TNF-α-Ribozym (SEQ-ID Nr. 26–27)
* Um die Faltung für das Antisense-Molekül zu erhalten, wurden an dem Verbindungs-Punkt zwei AS addiert.
14A: Gel-Retardation unter Verwendung von TNF-α-Ribozym oder TNF-Antisense, gebunden an TNF-α-Ribozym
50 ng TNF-α-Ribozym-II oder TNF-Antisense, gebunden an TNF-Ribozym, erzeugt durch In-vitro-Transkription, wurden bei Raumtemperatur 25 min lang mit cytoplasmatischen Extrakten (CE) inkubiert, die von PBMN-Zellen hergestellt worden waren.
Spur 1: TNF-α –CE als Kontroll-Probe; Spur 2: TNF-α +CE; Spur 4: TNF-α-Antisense, gebunden an das TNF-α-Ribozym –CE als Kontroll-Probe; Spuren 5 und 6: wie Spur 4, jedoch inkubiert mit CE1 bzw. CE2.
14B: Kompetitiv-Experimente
Spur 1: Kontroll-Probe –CE; Spur 2: +CE; Spur 3: wie Spur 2, jedoch wurde ein 300facher Überschuss an kaltem TNF-α-Ribozym der Reaktion zugesetzt; Spur 4: wie Spur w, jedoch wurde der Reaktion ein 500facher Überschuss des kalten TNF-α-Ribozyms zugesetzt.
15A–15B: (A) Vorausgesagte Sekundärstruktur des IL-2-Ribozyms und B) IL-2-Ribozym, gebunden an das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms (SEQ-ID Nr. 28–29)
16: Gel-Retardation unter Verwendung von IL-2-Ribozym oder IL-2-Ribozym, gebunden an das 3'-Ende von TNF-α-Ribozym
50 ng IL-2-Ribozym und IL-2-Ribozym gebunden an das 3'-Ende von TNF-α-Ribozym, erzeugt durch In-vitro-Transkription, wurden mit oder ohne cytoplasmatischen Extrakt, für 25 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Spur 1: IL-2-Ribozym –CE als Kontroll-Probe; Spur 2: wie Spur 1, jedoch +CE; Spur 3: IL-2-Ribozym, gebunden an das 3'-Ende von TNF-α-Ribozym –CE als Kontroll-Probe; Spur 4: wie Spur 3, jedoch +CE.
Die Elektrophorese-Mobilität des IL-2-Ribozyms und des IL-2-Ribozyms gebunden an TNF-α war nicht reproduzierbar, vermutlich aufgrund intramolekularer Wechselwirkungen.
17A–17B: (A) Vorausgesagte Sekundärstruktur des TNF-α-Ribozyms, verkürzt am 5'-Ende; und (B) des TNF-α-Ribozyms, verkürzt am 3'-Ende (SEQ-ID Nr. 30–31)
18A–18D: Gel-Retardation unter Verwendung von TNF-α-Ribozym, den am 3'-Ende oder 5'-Ende verkürzten TNF-α-Ribozymen und des Integrase-Ribozyms

(A) 50 ng TNF-α-Ribozym, am 3'-Ende oder 5'-Ende verkürzten TNF-α-Ribozym und Integrase-Ribozym, erzeugt durch In-vitro-Transkription, wurden bei Raumtemperatur 25 min lang mit cytoplasmatischen Extrakten (CE) inkubiert, die von PBMN-Zellen hergestellt worden waren.

Spur 1: TNF-α-Ribozym –CE; Spur 2: TNF-α-Ribozym +CE; Spur 3: am 3'- Ende verkürztes TNF-α-Ribozym –CE als Kontroll-Probe; Spur 4: wie Spur 3, jedoch +CE; Spur 5: am 5'-Ende verkürztes TNF-α-Ribozym –CE als Kontroll-Probe; Spur 6: wie Spur 5, jedoch +CE; Spur 7: Integrase-Ribozym –CE als Kontroll-Probe; Spur 8: wie Spur 7, jedoch +CE.

(B) Wie Platte A, jedoch überbelichtet;
(C) Spur 1: das am 5'-Ende verkürzte TNF-α-Ribozym –CE als Kontroll-Probe; Spur 2: wie Spur 1, jedoch +CE; Spur 3: Integrase-Ribozym –CE als Kontroll-Probe; Spur 4: wie Spur 3, jedoch +CE.
(D) 25 ng des am 3'-Ende verkürzten TNF-α-Ribozyms, erzeugt durch In-vitro-Transkription, wurden bei Raumtemperatur für 25 min lang mit cytoplasmatischen Extrakten inkubiert, die von verschiedenen Zell-Typen hergestellt worden waren.

Spur 1: –CE als Kontroll-Probe; Spur 2: wie Spur 1, jedoch inkubiert mit CE, hergestellt von PBMN-Zellen; Spur 3: wie Spur 1, jedoch inkubiert mit CE, hergestellt von HL60-Zellen; Spur 4: wie Spur 1, jedoch +CE hergestellt von WH164-Zellen.
19: Potentielle Bindungsstellen für Protein an TNF-α-Ribozym B (SEQ-ID Nr. 32) und TNF-α-Ribozym II
20: In-vivo-Aktivität von IL-2-Ribozym und IL-2-Ribozym gebunden an das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms
21A–21B: In-vivo-Aktivität des TNF-α-Ribozyms und des TNF-α-Antisense gebunden an das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms

(A) Cytotoxizitäts-Assay bei 6 und 12 h Transfektions-Zeit;
(B) Quantitative Bestimmung der TNF-α-Konzentrationen durch Radioimmuno-Assay.

22: Quantitative Bestimmungen von In-vivo-Konzentrationen von IL-2 durch CTLL-2-Test (siehe Text)
23: Wirkung von TNF-α-Ribozym und -Antisense auf die IL-2-Gen-Expression
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die hier beschriebene Erfindung betrifft TNF-α-Ribozyme oder Verbindungen, die die folgende Struktur aufweisen (SEQ-ID Nr. 1):
worin jedes X für ein Ribonukleotid oder ein Deoxyribonukleotid steht, die gleich oder verschieden sein können oder an ihren Zuckern, Phosphat-Resten oder Basen modifiziert oder substituiert sein können, worin jeder der Reste A, C, U und G für ein Ribonukleotid steht und a, c, u (t) und g für ein Ribonukleotid oder Deoxyribonukleotid stehen, die unmodifiziert oder an ihren Zuckern, Phosphat-Resten oder Basen modifiziert oder substituiert sein können, worin jeder der Reste (X)_n und (X)_n' für ein Oligonukleotid steht, das eine vorbestimmte Sequenz aufweist und mindestens einer der Reste (X)_n oder (X)_n' ein Ribozym, eine Antisense-RNS oder eine mRNS umfasst;
worin jeder der Indices n oder n' entweder für 0 oder eine ganze Zahl mit der Maßgabe steht, dass wenigstens einer der Indices n oder n' eine ganze Zahl ist;
worin jedes * für eine Basen-Paarung zwischen den Nukleotiden steht, die auf jeder der beiden Seiten davon angeordnet sind;
worin jede durchgezogene Linie für eine chemische Bindung steht, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonukleotiden darstellt, die auf jeder der beiden Seiten angeordnet sind;
worin a für eine ganze Zahl steht, die eine Zahl von Ribonukleotiden mit der Maßgabe definiert, dass a 0 oder 1 sein kann und dann, wenn a 0 ist, der Rest A, der in 5'-Position von (X)_a angeordnet ist, an den Rest X gebunden ist, der in 3'-Position des Rests (X)_a angeordnet ist;
worin jeder der Indices m und m' für eine ganze Zahl steht, die größer als oder gleich 1 ist und typischerweise geringer als 100 ist;
worin jede der gestrichelten Linien unabhängig von einer anderen entweder für eine chemische Bindung steht, die kovalente Bindungen zwischen den Nukleotiden liefert, die auf jeder der beiden Seiten davon angeordnet sind, oder die Abwesenheit irgendeiner derartigen chemischen Bindung bedeutet; und
worin (X)_b für ein Oligonukleotid steht, das vorhanden sein kann oder nicht vorhanden sein kann, mit der Maßgabe, dass b für eine ganze Zahl steht, die größer als oder gleich 2 ist, wenn (X)_b vorhanden ist.
Solchen Verbindungen sind ins Auge gefasst zur Spaltung der TNF-α-mRNS in vivo. Eine auf spezifische Stellen gerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis) in den hybridisierenden Armen ggu (t) ccgu (t) cA und u (t) cu (t) agu (t) agaa (SEQ-ID Nr. 2) ist möglich, vorausgesetzt, dass ausreichend Komplementarität aufrecht erhalten wird, so dass die Verbindung mit der TNF-α-mRNS in vivo hybridisiert. Alle RNS-Verbindungen sind auch Teil der Erfindung, wie dies Verbindungen mit DNS-Armen und einem katalytischen RNS-Bereich sind.
Auch Teil der Erfindung sind Verbindungen, in denen (X)_a oder (X)_a' fehlt. Eine Form der oben beschriebenen Verbindung hat die nachfolgend gezeigte Struktur (SEQ-ID Nr. 3):
worin die Nukleotide wie oben definiert sind. Eine ausschließlich RNS-Nukleotide umfassende Version der Verbindung wird auch beschrieben. Weiter kann die Verbindung die folgende Struktur haben (SEQ-ID Nr. 4):
worin (X)_n für ein Oligoribonukleotid steht.
Die Erfindung schließt weiter eine Verbindung ein, die ein Mehrfach-Ribozym mit der folgenden Struktur ist: 3'-[-(Z)_r-Q-(Z)_s-]_z-5' worin jeder Rest Q für die obige Verbindung steht, die gleich oder verschieden sein kann; worin jeder Rest Z für ein Ribonukleotid oder ein Deoxyribonukleotid steht, das gleich oder verschieden sein kann und in seinen Zuckern, Phosphat-Resten oder Basen modifiziert oder substituiert sein kann, worin jeder der Indices r und s für eine ganze Zahl steht, die größer oder gleich 0 sein kann; und worin z für eine ganze Zahl steht, die größer oder gleich 1 ist.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen und Verfahren zur Erhöhung der Protein-Produktion durch Erhöhung der Steady-State-Konzentration der mRNS durch Senken der Rate des intrazellulären Abbaus einer mRNS von Interesse. Solche Verbindungen und Verfahren sind nützlich zur Erhöhung der Stabilität – und daher der Wirksamkeit – von Ribozymen und Antisense-RNS. Die Verbindungen und Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können auch zur Erhöhung der Produktion von Proteinen durch Erhöhen der Menge an mRNS verwendet werden, die für eine Transkription verfügbar ist.
Ribozyme sind RNSs, die in der Lage sind, RNS-Spaltungs-Reaktionen zu katalysieren. Eines der einfachsten und am weitesten verbreiteten Ribozyme sind die Hammerkopf-Typ-Ribozyme, die eine konservative katalytische Domain und flankierende Sequenzen enthalten, die mit der Substrat-RNS hybridisieren (Haseloff et al., Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO89/05852). Hammerkopf-Ribozyme können zielgerichtet gegen irgendeine beliebige RNS-Sequenz eingesetzt werden, die ein XUX-Triplet enthält, das für eine Spaltung empfänglich ist. Einige Untersuchungen haben das Vermögen dieser Ribozyme gezeigt, eine Ziel-RNS in vivo zu spalten und eine Protein-Expression zu unterdrücken. Andere Klassen von Ribozymen sind Tetrahymena IVS (Gruppe I-Intron) (Cech et al., US-Patent Nr. 4,740,463, erteilt 26. April 1988), RNAse P (Altmann et al., Internationale PCT-Patent-Veröffentlichungsnummer WO 92/03566), Hepatitis-Delta-Ribozyme (z. B. Blumenfeld et al., Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO90/05157) und „Hairpin"- (Haarnadel-) Ribozyme (Europäische Patentanmeldung Nr. EP 0 360 257 ; (Hampel et al., Nuc. Acids. Res. (1990), 18: 299–304).
Die stabilisierten mRNSs der beanspruchten Erfindung können weiter unter Anwendung von Verfahrensweisen in der Literatur stabilisiert werden, beispielsweise unter Verwendung von Transkriptions-Terminatoren am 3'-Ende wie beispielsweise des T7-Terminators, des ρ-unabhängigen Terminators, des Cry-Elements (Gelfand et al., US-Patent Nr. 4,666,848, erteilt 19. Mai 1987) oder des TrpE-Terminators. Weiter können Sequenzen wie beispielsweise das Poly(A)-Additions-Signal (AATAAA addiert wer den, und Strategien, die eine Änderung der Länge des nicht-kodierenden Bereichs am 3'-Ende einschließen, können angewandt werden (siehe Gillies, US-Patent Nr. 5,149,635, erteilt am 22. September 1992). Diese Verfahrensweisen können zur Stabili sierung der mRNS für Ribozym-, Antisense- oder Protein-Produktions-Zwecke angewendet werden.
Speziell umfasst die vorliegende Erfindung RNS-Moleküle, die in der Lage sind, einer einsträngigen RNS Stabilität zu verleihen, die durch die Reste (X)_a und (X)_a' von Interesse wiedergegeben werden, die die folgende Struktur haben (SEQ-ID Nr. 5):
worin jeder Rest X für ein Ribonukleotid steht, das gleich oder verschieden sein kann;
worin jeder der Reste (X)_n und (X)_n' für ein Oligonukleotid mit einer vorbestimmten Sequenz steht;
worin jeder der Indices n und n' für eine ganze Zahl von 0 bis 1.000 steht;
worin jedes * für eine Basen-Paarung zwischen den Ribonukleotiden steht, die auf jeder der beiden Seiten davon angeordnet sind;
worin jede durchgezogene Linie für eine chemische Bindung steht, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonukleotiden bereitstellt, die auf jeder der beiden Seiten davon angeordnet sind;
worin a für eine ganze Zahl steht, die eine Zahl von Ribonukleotiden definiert, mit der Maßgabe, dass a 0 oder 1 sein kann, wenn a 0 ist, der Rest A, der am 5'-Ende von (X)_a angeordnet ist, an den Rest X gebunden ist, der am 3'-Ende von (X)_a angeordnet ist;
worin jeder der Indices m und m' für eine ganze Zahl steht, die größer als oder gleich 1 ist;
worin (X)_b für ein Oligoribonukleotid steht, mit der Maßgabe, dass b für eine ganze Zahl steht, die größer als oder gleich 2 ist.
Wie oben beschrieben, ist eine auf bestimmte Stellen gerichtete Mutagenese (sitedirected mutagenesis) möglich in der Sequenz GGUCCGUCA und UCUAGUAGAA (SEQ-ID) Nr. 7) in jeder der beiden TNF-α-Ribozym-Strukturen oder TNF-α-Antisense-Strukturen. Da die Arme die RNS-Bindung in vivo binden, sind erhebliche Variationen möglich. Verbindungen, denen entweder der 3'-Arm oder der 5'-Arm fehlt, sind auch von der vorliegenden Erfindung umfasst, wie sie hier beschrieben ist. Vorzugsweise fehlt der 5'-Arm. Ebenfalls vorzugsweise sind die Verbindungen an das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms gebunden. In einer Ausführungsform werden Mehrfach-Versionen des 3'-Endes des TNF-α-Ribozyms als stabilisierende Elemente verwendet.
In einer Ausführungsform der Erfindung kodiert (X)_n oder (X)_n' für wenigstens ein Ribozym. Das Ribozym kann ein „Haarnadel"- (Hairpin-) Ribozym, eine RNAse P oder – noch mehr bevorzugt – ein Hammerkopf-Ribozym sein. In dem Fall, in dem (X)_n oder (X)_n' für wenigstens ein Hammerkopf-Ribozym kodiert, kann es die folgende Struktur haben (SEQ-ID Nr. 8):
worin jeder der Reste X und Y für ein Ribonukleotid steht, das gleich oder verschieden vom jeweils anderen sein kann; worin jeder der Reste (Y)_p und (Y)_p' für ein Oligonukleotid steht, das eine vorbestimmte Sequenz aufweist, die in der Lage ist, mit einer RNS-Ziel-Sequenz, die gespalten werden soll, zu hybridisieren; worin jeder der Indices p und p' für eine ganze Zahl steht, die die Zahl von Ribonukleotiden in dem Oligonukleotid definiert, mit der Maßgabe, dass die Summe (p + p') ausreichend groß ist, um zu ermöglichen, dass das Ribozym mit der RNS-Ziel-Sequenz hybridisiert, worin jeder * für eine Basen-Paarung zwischen Ribonukleotiden steht, die an jeder der beiden Seiten davon angeordnet sind; worin jede durchgezogene Linie für eine chemische Bindung steht, die kovalente Bindungen zwischen den Ribonukleotiden bereitstellt, die an jeder der beiden Seiten davon angeordnet sind; worin a für eine ganze Zahl steht, die eine Zahl von Ribonukleotiden definiert, mit der Maßgabe, dass a 0 oder 1 sein kann und dass dann, wenn a gleich 0 ist, der Rest A, der in 5'-Position von (X)_a angeordnet ist, an den Rest X gebunden ist, der in 3'-Positionen von (X)_a angeordnet ist; worin jeder der Indices m und m' für eine ganze Zahl steht, die größer als oder gleich 1 ist; worin (X)_b für ein Oligoribonukleotid steht, mit der Maßgabe, dass b eine ganze Zahl bedeutet, die größer als oder gleich 2 ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann das RNS-Molekül die folgenden Strukturen aufweisen (SEQ-ID Nr. 9, 10):
Alternativ dazu können (X)_n oder (X)_n' die folgende Struktur aufweisen:
worin Y für ein Ribonukleotid oder ein Deoxyribonukleotid steht, das gleich oder verschieden sein kann oder in seinem Zucker, seinem Phosphat-Rest oder seiner Base modifiziert oder substituiert sein kann; worin (Y)_n und (Y)_n' für Oligonukleotide stehen, worin n und n' ganze Zahlen sind, die die Zahl von Nukleotiden in den Oligonukleotiden definieren, wobei derartige Oligonukleotide vorbestimmte Sequenzen aufweisen, die ausreichend komplementär zu einer vor-definierten RNS-Ziel-Sequenz sind, die gespalten werden soll, um eine Hybridisierung mit der RNS-Ziel-Sequenz zu erlauben, wobei eine solche vordefinierte RNS-Ziel-Sequenz nicht innerhalb der Verbindung zugegen ist; worin N für Adenin, Guanin, Cytosin oder Uracil stehen kann; worin jede durchgezogene Linie für eine chemische Bindung steht, die kovalente Bindungen zwischen den Nukleotiden bereitstellt, die auf jeder der beiden Seiten davon angeordnet sind; worin m für eine ganze Zahl von 2 bis 20 steht; und worin keines der Nukleotide (Y)_m Watson-Crick-Basen-gepaart mit irgendeinem anderen Nukleotid innerhalb der Verbindung ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist, dass das RNS-Molekül, das oben beschrieben wurde, auch zum Stabilisieren einer mRNS verwendet werden kann, die für ein Polypeptid kodiert. Insbesondere sind die RNS-Verbindungen nützlich für die Herstellung von Proteinen industrieller oder kommerzieller Bedeutung. Viele solche Proteine sind entweder bereits im Handel erhältlich oder stehen unter kommerzieller Entwicklung. Beispiele solcher Proteine schließen ein: Human- und Tier-Wachstums-Hormone, Gewebe-Plasminogen-Aktivatoren, Erythropoietin und Faktor VIII.
Die Erfindung kann auch verwendet werden, um die Produktion eines derartigen Proteins in einer Zellkultur zu verbessern, vorzugsweise in einer Tierzell-Kultur, wie beispielsweise bei CHO-Zellen, die in Kultur gezüchtet werden. Dadurch könnte man die erheblichen Kosten reduzieren, die in die kommerzielle Produktion solcher Proteine involviert sind.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist (X)_n oder (X)_n' ein Ribozym, das in der Lage ist, Ziel-Moleküle zu spalten. Alternativ dazu ist (X)_n oder (X)_n' eine Antisense-Sequenz, die in der Lage ist, mit einer RNS zu hybridisieren, die einem Säuger oder einer Pflanze angeboren ist, und sie dadurch zu deaktivieren (für Pflanzen: siehe Schewmaker et al., US-Patent Nr. 5,107,065; erteilt 21. April 1992). Weiter können die Ziel-Moleküle für das Ribozym oder die Antisense-Sequenz ein virales Gen sein, das virale Ziel-Moleküle wie beispielsweise die folgender Viren einschließt: Cytomegalo-Virus, Hepatitis-Virus, Herpes-Virus, HIV, EBV, Papilloma-Virus, Cytomegalo-Virus, Rhino-Virus, Influenza-Virus, Varicella-Zoster-Virus, Parainfluenza-Virus, Mumps-Virus, Atemtrakt-Syncyten-Virus (respiratory syncytial virus), Adeno-Virus, Masern-Virus, Röteln-Virus, humaner Parvo-Virus, Polio-Virus, Rota-Virus, Echo-Virus, Arbo-Virus oder menschlicher T-Zell-Leukämie-Lymphom-Virus (human T cell leukemia lymphoma virus).
Die Erfindung umschließt auch Verfahren zur Produktion der Verbindungen und RNS-Moleküle, die oben beschrieben wurden, welche die folgenden Schritte umfassen: (a) Ligation einer der genannten Verbindung entsprechenden Nukleotid-Sequenz in einen Transfer-Vektor, bestehend aus DNS, RNS oder einer Kombination daraus; (b) Transkription der Nukleotid-Sequenz von Schritt (a) mit RNS-Polymerase; und (c) Gewinnung der Verbindung. Die Erfindung schließt auch Transfer-Vektoren, und zwar sowohl bakterielle Vektoren als auch Phagen-Vektoren, bestehend aus RNS oder DNS oder einer Kombination daraus ein, die eine Nukleotid-Sequenz enthalten, die bei Transkription Anlaß zur Bildung der oben beschriebenen Verbindungen oder RNS-Moleküle gibt.
Weiter wurden viele Verfahren zum Einführen geklonter eukaryotischer DNSs in in Kultur gehaltene Säuger-Zellen entwickelt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989): Calciumphosphat- oder DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion; Polybrene; Protoplasten-Fusion, Elektroporation; und direkte Mikroinjektion in Kerne.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung einer Störung bereit, die mit einer Überexpression von TNF-α verbunden ist, die umfaßt das Verabreichen einer wirksamen Menge des TNF-α-Ribozyms an eine Person unter Reduzieren der Überexpression von TNF-α und dadurch Behandeln der Störung. Solche Störungen schließen ein: rheumatische Arthritis, AIDS, septischen Schock, Transplantat-Abstoßung (graft versus host disease), mit Krebs assoziierte Cachexie und Autoimmun-Krankheiten.
Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Spaltung oder Deaktivierung einer speziellen RNS-Ziel-Sequenz unter Verwendung der oben beschriebenen RNS-Moleküle. Derartige RNS-Sequenzen können einen Säuger oder einer Pflanze angeboren sein. Das Verfahren ist besonders geeignet zum zielmäßigen Ansteuern viraler Gene wie beispielsweise HIV (siehe Goodchild et al., US-Patent Nr. 4,806,463; erteilt 21. Februar 1989).
In den im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen und Verfahren können die jeweiligen 5'- und 3'-Enden der Gruppen (X)_n und (X)_n' modifiziert werden, um die Endonuklease gegen einen Abbau zu stabilisieren. Beispielsweise können blockierende Gruppen addiert werden, um einen terminalen Nuklease-Angriff zu verhindern, beispielsweise eine besondere vom 3'-Ende auf das 5'-Ende fortschreitende Exonuklease-Aktivität. Um einige Beispiele zu nennen: Blockierende Gruppen können gewählt werden aus gegebenenfalls substituierten Alkyl-Gruppen, gegebenenfalls substituierten Phenyl-Gruppen, gegebenenfalls substituierten Alkanoyl-Gruppen. Denkbare Substituenten können gewählt werden aus C₁-C₅-Alkoxy-Gruppen und dergleichen. Alternativ dazu können Nukleotid-Analoge wie beispielsweise Phosphorothioate, Methylphosphonate oder Phosphoramidate oder Nukleosid-Derivate (wie beispielsweise die α-Anomeren der Ribose-Einheit), die gegenüber einem Nuklease-Angriff resistent sind, als terminale blockierende Gruppen verwendet werden.
Alternativ dazu können Nicht-Nukleinsäure-Gruppen, die die Empfänglichkeit des Endonuklease-Moleküls gegen über anderen Nukleasen verändern, in das 3'-Ende und/oder 5'-Ende der Endonuklease eingeführt werden. Beispielsweise kann eine 9-Amino-acridin-Gruppe, die an die Endonuklease gebunden wird, als terminale blockierende Gruppe dienen und so eine Beständigkeit gegenüber einem Nuklease-Angriff auf die Endonuklease-Moleküle erzeugen, und/oder als interkalierendes Mittel dienen, um die endonukleolytische Aktivität zu unterstützen. Es wird schnell erkannt, dass eine Vielzahl anderer chemischer Gruppen, z. B. Spermin oder Spermidin, in einer verwandten Weise verwendet werden könnten.
Endonukleasen gemäß der vorliegenden Erfindung können kovalent oder nicht-kovalent mit Affinitäts-Mitteln wie beispielsweise Proteinen, Steoriden, Hormonen, Lipiden, Nukleinsäure-Sequenzen, interkalierenden Molekülen (wie beispielsweise Acridin-Derivaten, z. B. 9-Aminoacridin) oder dergleichen assoziiert werden, um so die Bindungs-Affinität für eine Substrat-Nukleotid-Sequenz zu modifizieren oder die Affinität gegenüber Ziel-Zellen oder eine Anordnung in cellulären Kompartimenten oder dergleichen zu erhöhen. Beispielsweise können die Endonukleasen der vorliegenden Erfindung mit RNS-Bindungs-Peptiden oder -Proteinen assoziiert werden, die in der Situation Unterstützung geben können, in der die Endonukelase in Gegenüberstellung mit einer Ziel-Nukleinsäure gebracht wird, so dass eine Hybridisierung und Spaltung der Ziel-Sequenz stattfinden kann. Nukleotid-Sequenzen können in die am 5'-Ende und 3'-Ende der Gruppen (X)_n und (X)_n' eingebaut werden, um die Affinität für Substrate zu erhöhen. Solche zusätzlichen Nukleotid-Sequenzen können Dreifach-Helices mit Ziel-Sequenzen bilden (S. A. Strobel et al., (1991), Nature, 350: 172–174) und darin angesprochene Druckschriften, die durch In-Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung übernommen werden, die eine Wechselwirkung mit intramolekular gefaltetem Substrat ermöglichen können. Alternativ dazu können modifizierte Basen (nicht natürliche Basen oder modifizierte Basen, wie beschrieben in „Principles of Nucleic Acid Structure, a. a. O."), innerhalb der zusätzlichen Nukleotid-Sequenzen verwendet werden, die sich entweder mit einsträngigen oder doppelstängigen DNS assoziieren und Basen-Paar-, Triplet- oder Quadruplet-Wechselwirkungen mit Nukleotiden in dem Substrat erzeugen. Geeignete Basen schließen Inosin, 5'-Methylcytosin, 5'-Bromouracil und andere Basen ein, die in diesem technischen Bereich wohlbekannt sind, wie beispielsweise beschrieben ist in „Principles of Nucleic Acid Structure, a. a. O.".
Synthetische Zubereitungen von mRNS sind wohlbekannt (siehe: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Gemischte DNS-RNS-Oligomere mit modifizierten Basen-Paaren für das TNF-α-Ribozym können hergestellt werden mittels im Handel erhältlicher DNS-Synthese-Anlagen, wie beispielsweise mit Hilfe deren, die produziert werden von der Firma Applied Biosystems, von der Firma Biosearch oder von der Firma Milligen (siehe z. B.: Perrault et al., Nature, 344: 565–567 (1990); für Derivate: E. Uhlmann und A. Peyman, Chemical Reviews (1990), 90: 543–584, für H-Phopshonat-Monomere; siehe Agrawal et al., US-Patent Nr. 5,149,798).
Die Proteine, die sich an das konservative TNF-α-Motiv binden, können dazu dienen, die Rate und Spezifität der Ribozym-Reaktion zu erhöhen. Kürzlich berichteten Tsuchihashi et al., dass das p7-Nukleocapsid-(NC-)Protein die Spaltungsrate eines Hammerkopf-Ribozyms um das 10–20fache erhöht (Science (1993), 262: 99–102). Dementsprechend kann das Protein, das sich an das TNF-α-Motiv bindet, einen ähnlichen Effekt haben.
Der Ausdruck „eine wirksame Menge", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf die Menge, die einen gewünschten Effekt in einem Säuger liefert, der einen gegebenen Zustand und einen Verabreichungs-Plan hat. Zusammensetzungen umfassen wirksame Mengen zusammen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Solubilisierungsmitteln, Emulgatoren, Hilfsstoffen und/oder Trägern, die für eine Therapie nützlich sind. Solche Zusammensetzungen sind Flüssigkeiten oder lyophilisierte oder anderweitig getrocknete Formulierungen und schließen Verdünnungsmittel mit unterschiedlichem Puffer-Gehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH-Wert und Ionen-Stärke, Zusatzstoffe wie beispielsweise Albumin oder Gelatine, um eine Absorption an Oberflächen zu verhindern, oberflächenaktive Mittel bzw. Detergenzien (z. B. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, Gallensäure-Salze), solubilisierende Mittel (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol), Masse bringende Substanzen oder Verbindungen zum Modifizieren der Tonizität (z. B. Lactose, Mannitol), kovalente Anhänge von Polymeren wie beispielsweise Polyethylenglycol, an das Oligonukleotid, eine Komplexierung mit Metall-Ionen oder eine Einarbeitung des Materials in oder auf teilchenförmige Zubereitungen von Polymer-Verbindungen wie beispielsweise Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polyvinylpyrrolidon usw. oder in Liposome, Mikroemulsionen, Micellen, unilamellare oder multilamellare Versikel, Erythrocyten-Ghosts oder Spheroplasten ein.
Derartige Zubereitungen beeinflussen den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, die Stabilität, die Rate der Freisetzung in vivo und die Rate des Verschwindens aus dem Organismus („Clearance") in vivo des Oligonukleotids. Andere Komponenten können gegebenenfalls zugesetzt werden, wie beispielsweise Oxidations-Inhibitoren, z. B. Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa zehn Reste), d. h. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie beispielsweise Serumalbumin, Gelatine oder Immunoglobuline, Aminosäuren wie beispielsweise Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; chelatisierende Mittel wie beispielsweise EDTA; und Zucker-Alkohole wie beispielsweise Mannitol oder Sorbitol. Mögliche Zusammensetzungen für eine verzögerte Freisetzung (sustained release) schließen eine Formulierung von lipophilen Depots ein (z. B. Fettsäuren, Wachse, Öle). Auch von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind teilchenartige Zubereitungen, die überzogen sind mit Polymeren (z. B. Polyoxameren oder Polyoxaminen) und Oligonukleotide, die an Antikörper gekoppelt sind, die gegen Gewebe-spezifische Rezeptoren, Liganden oder Antigene gerichtet sind oder an Liganden von Gewebe-spezifischen Rezeptoren gekoppelt sind. Weiter können spezielle Nukleotid-Sequenzen zugesetzt werden, um die Oligonukleotide gemäß der Erfindung auf den Kern, das Cytoplasma oder spezielle Typen von Zellen zielmäßig auszurichten. Andere Ausführungsformen der Zusammensetzungen gemäß der Erfindung schließen teilchenartige Formen mit Schutzüberzügen, Proteaseinhibitoren oder Permeations-Verstärkungsmittel für verschiedene Verabreichungswege ein, einschließlich einer parenteralen, pulmonären, nasalen und oralen Verabreichung.
Geeignete topische Formulierungen schließen Gele, Cremes, Lösungen, Emulsionen, Kohlehydrat-Polymere, abbaubare Matrices davon, Dämpfe, Nebel, Aerosole oder andere Inhalantien ein. Die Oligonukleotide können in einem Waver, einem Wachs, einem Film oder einem festen Träger, einschließlich Kaugummis, verkapselt werden. Permeations-Verstärker zur Unterstützung beim Transport von Bewegungen durch die Epithel-Schicht sind auch in diesem technischen Bereich bekannt und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Dimethylsulfoxid und Glycole.
Die vorliegende Erfindung wird im nachfolgenden Abschnitt „experimentelle Einzelheiten" erläutert. Diese Abschnitte werden angegeben, um ein Verständnis der Erfindung zu unterstützen, jedoch ist es nicht beabsichtigt – und sollte auch so nicht angenommen werden – dass dadurch die Erfindung in irgendeiner Weise beschränkt wird, wie sie in den Ansprüchen beansprucht ist, die danach folgen.
Experimentelle Einzelheiten
Zielgerichtete Ribozyme schneiden TNF-α-RNS in vitro
Drei Hammerkopf-Ribozyme (Haseloff und Gerlach, 1988), die zur Spaltung der TNF-α-RNS vorgesehen sind, sind in 1 gezeigt. Ihre In-vitro-Aktivitäten wurden unter Verwendung der Gesamt-RNS untersucht, die aus PEMNC im Anschluss an eine Stimulierung einer TNF-α-Gen-Transkription durch Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) und Concanavalin A (Con A) extrahiert wurde, wie beschrieben wurde von English et al., (1991). Ribozym A enthielt einen Bakteriophagen-T7-Terminator an seinem 3'-Ende, während Ribozym B diesen Terminator nicht enthielt. Ribozym II fehlten die unterstrichenen Restriktions-Stellen. 2 zeigt eine Ribozym-vermittelte RNS-Spaltung, getestet mittels Gel-Elektrophorese und Northern Blott-Hybridisierung unter Verwendendung einer TNF-α-Sonde. Das TNF-α-Ribozm spaltete die etwa 1.800 Nu kleotide lange Ziel-RNS in Fragmente von 1.420 und 380 Nukleotide. Die Größen der TNF-α-Fragmente, die durch die Ribozyme produziert wurden, waren konsistent mit der Anordnung der vorausgesagten Stelle für eine Spaltung. Somit spalten die Ribozyme A und B das TNF-α-Ziel-Molekül in vitro in Gegenwart nicht-verwandter RNSs.
Stabilität der Ribozyme A, B und II in lebenden Zellen
Die Stabilität von Ribozym A, Ribozym B und Ribozym II in lebenden Zellen ist in den 3 und 4 gezeigt. Da die Zell-Membran eine wesentliche Barriere für den Eintritt stark geladener Moleküle mit hohem Molekulargewicht darstellt, ist deren Lieferung an das Cytoplasma eine Hauptaufgabe. Um diese Situation zu überwinden, wurden Transfektions-Techniken wie z. B. die kationische, Liposom-vermittelte Transfektion (Malone et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96: 6077–6081), Elektroporation (Callis et al., (1987) Nucl. Acids. Res., 15: 5823–5831) und Mikroinjektion (Rosa et al., (1989), J. Cell. Biol., 109: 17–34) entwickelt. Da das auf Liposomen basierende Verfahren das am meisten Vielseitige zu sein scheint, wurde dessen Vermögen zum Liefern von genug funktionellem Ribozym, um erfolgreich die TNF-α-RNS zu spalten, getestet.
Die Effizienz einer RNS-Transfektion wurde zuerst in HL60-Zellen gemessen und durch Messung der Zell-assoziierten intakten ³²P-markierten RNS bestimmt. Im Anschluß an die Transfektion mit Ribozymen, wurden die Zellen mit Hank's gepufferter Salzlösung (Firma GIBCO) gewaschen. Die Gesamt-RNS wurde aus den Zellen hergestellt, und die RNS-Spezies wurden durch Gel-Elektrophorese getrennt. Die in den Ribozym-RNS-Banden enthaltene Radioaktivität wurde dann bestimmt. Die Ergebnisse zeigen an, dass die radioaktiven Banden von 2 bis 4% der anfänglichen RNS, die den Liposomen während der Transfektions-Periode zwischen 8 und 20 Stunden zugesetzt worden war, schwankte. Dies entspricht einer Lieferung von etwa 300.000 Molekülen Ribozym A pro Zelle.
4 zeigt die Stabilität der Ribozyme A, B und II. Zehn Millionen Human-HL60-Zellen (ATCC CCL 240), die in der log-Phase in RPMI 1640 wuchsen, das mit 20% (v/v) fetalem Kälberserum (FCS) supplementiert war, wurden für die RNS-Transfektion verwendet. Die Zellen wurden zweimal mit Serum-freiem Medium gewaschen. Ein Tropfen (5 ml) Serum-freies Medium wurde in Polystyrol-Röhrchen gegeben, gefolgt von 35 μg Lipofectin (Firma Bethesda Research Laboratories), 10 μg Träger-RNS (E. Coli-tRNS) und 3 × 10⁶ Disint min von ³²P-markiertem, gecapptem Ribozym A, B oder II (5 μg). Die Mischung wurde sofort gemischt, die Zellen wurden in einer Mischung aus Serum-freiem Medium-Lipofectin/RNS/Träger-RNS resuspendiert und für 20 h in den Inkubator zurückgestellt. In Anschluß an die Transfektion wurden die Zellen 3 mal mit Hank's gepufferter Kochsalz-Lösung gewaschen und dann mit RPMI, supplementiert mit 20% FCS, in den Inkubator zurückgestellt. Zellen (10⁶) wurden zu den oberhalb jeder Spur angegebenen Zeiten gewonnen, und die Gesamt-RNS wurde hergestellt und analysiert durch 15%iges Polyacrylamid-Gel mit 7 M Harnstoff. Die RNS-Proben, die für die Transfektion verwendet wurden, sind am oberen Ende von 4 angegeben. Eine Probe (50 μM) von markiertem, gecapptem Ribozym A wurde zum Transfektieren von HL60-Zellen für 20 h verwendet. Die Zellen wurden 3 mal gewaschen, und die Kern- und Cytoplasma-RNSs wurden hergestellt und durch Gel-Elektrophorese analysiert. Zur Hestellung der Cytoplasma- und Kern-Fraktionen wurden die Zellen in 10 mM Tris·HCL (pH 7,5), 5 mM KCL, 140 mM NaCl, 5 mM Dithiothreitol und 0,4% (w/v) Nonidet P40 für 10 min bei 4°C homogenisiert, und die Kerne wurden durch Zentrifugieren bei 800 g für 5 min gewonnen. Die RNS in der überstehenden Flüssigkeit wurde gefällt und als Cytoplasma-Fraktion aufgehoben. Die Kerne wurden in der Weise verarbeitet, wie dies beschrieben wurde von Chomezynski & Sacchi (Anal. Biochem. (1987), 162: 156–160), und zwar für die Herstellung der Gesamt-RNS. Der Pfeil zeigte die Position eines Ribozym A-Monomers an. Die Menge an Radioaktivität in den Ribozym-Banden, die in (a) gezeigt sind, wurde bestimmt und ausgedrückt als Prozentmenge der Radioaktivität, die unmittelbar nach 20 h Transfektions-Zeit vorhanden war.
5 zeigt die Aktivität von Ribozymen in vivo
Die Aktivitäten der Ribozyme und Antisense-RNS in H160-Zellen (a) wurden nach einer Transfektions-Periode (20 h) analysiert. In Anschuß an eine Transfektion mit Ribozym A oder Antisense-RNS wurden die Zellen zum Exprimieren von TNF-α für 6 h stimuliert. Die RNS wurde extrahiert, durch Gel-Elektrophorese unter Verwendung eines 1 bis 2%igen (w/v) Agarose- Formaldehyd-Gels getrennt und durch Northern Blotting mit einer radioaktiven Sonde für das TNF-α-Gen nachgewiesen. Im Anschluß an die Hybridisierung mit der TNF-α-Sonde wurde das Filter gestrippt und dann mit einer Actin-Sonde hybridisiert (Firma British Biotechnology Limited). Im Fall von PBMNC (b) wurden die Zellen abgetrennt (Sioud et al., Scand. J. Immunol. (1990), 31: 415–421) und wurden 4 mal mit Hank's gepufferter Kochsalz-Lösung und 3 mal mit Serum-freiem Medium gewaschen. Zellen (10⁶) wurden transfektiert und wie HL60-Zellen verarbeitet. Spuren 1 und 4: Kontroll-Proben (transfektiert nur mit Träger-RNS); Spur 2: Antisense-RNS; Spuren 3 und 5: Ribozym A. Diese Autoradiogramme wurde überbelichtet, um das TNF-α-Signal in den Ribozym A-Spuren zu zeigen. Der Radioimmuno-Assay für das TNF-α-Protein ist (c) gezeigt. Die Menge an TNF-α-Protein, das in dem Medium zugegen war, wurde unter Verwendung des TNF-α-[¹²⁵I]-Assay-Systems (Firma Amersham) bestimmt. Die Spuren 1 bis 5 entsprechen den Spuren 1 bis 5 in 5(a) bzw. (b).
Zerstörung von endogener TNF-α-RNS in vivo durch Ribozyme
Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob Ribozym A sein Ziel-Molekül im Anschluß an eine RNS-Transfektion eliminieren kann. Eine Vorab-Untersuchung des Zeit-Verlaufs der TNF-α-RNS-Synthese in HL60-Zellen zeigte, dass TNF-α-RNS nach 2 h Stimulation durch PMA und Con A nachgewiesen werden konnte und eine maximale Expression nach 4 bis 6 h erreicht wurde. Die Zellen wurden mit Ribozymen transfektiert, mit PMA und Con A 6 h lang stimuliert, und die Gesamt-RNS wurde extrahiert und durch Northern Blotting unter Verwendung einer TNF-α-Sonde analysiert. Da die TNF-α und Actin-mRNS etwa dieselbe elektrophoretische Mobilität aufweisen, wurde deeselbe Blott nach dem Strippen mit Actin-Sonde hybridisiert. Daten, die von densitometrischen Scans eines unterentwickelten Film abgeleitet waren, zeigten, dass das TNF-α-Signal um 40% reduziert war (5a, Antisense-Spur) und um 90% reduziert war (3(a), Ribozym A-Spur). Darüber hinaus wurde ein Radioimmuno-Assay zum Messen des TNF-α-Proteins in dem Kultur-Medium verwendet. Dieses System hat schwerwiegende Vorteile gegenüber Bioassays dahingehend, dass es spezifisch für TNF-α ist. Die Daten geben an, dass HL60-Zellen, die mit PMA und Con A stimuliert wurden, eine große Menge von 100 fMol TNF-α pro Milliliter abscheiden, jedoch nur noch 150 und 400 fMol, wenn die Zellen mit Ribozym A bzw. Antisense tranfektiert wurden. (5(b)).
Da der Effekt von Antisense-RNS geringer ist als der von Ribozym A und da sowohl Ribozym A als auch Antisense-RNS innerhalb der Zellen in gleichen Konzentrationen vorhanden waren (Daten nicht gezeigt), schlagen wir vor, dass ein Teil der Aktivität des Ribozyms A auf sein Vermögen zurückzuführen ist, RNS zu spalten. Eine Ribozym-vermittelte RNS-Spaltung in vivo wurde in eukaryotischen Zellen beobachtet (Saxena & Ackermann, J. Biol. Chem. (1990), 256: 17106–17109).
In diesem Fall wurden keine Spalt-Produkte gesehen. Wie vorher vorgeschlagen (Cotten & Birnstiel, 1989; Sarver et al., 1990; Sioud & Drlica, 1991), werden die Produkte einer Ribozym-vermittelten Spaltung wahrscheinlich durch celluläre Nukleasen abgebaut (es wird erwartet, dass das 5'-Fragment, obwohl es an seinem 5'-Ende gecappt ist, schnell durch 3' → 5'-Exonukleasen abgebaut wird).
Dieselben Bedingungen wurden angewendet, um Ribozym A in PBMNC zu überführen. Wie aus 5(a) und (b) ersichtlich ist, reduzierte Ribozym A die Menge an TNF-α-RNS um 80% und die Menge an TNF-α-Protein um 70%, was die Möglichkeit aufwirft, dass eine Liposom-vermittelte RNS-Transfektion einen Weg bietet, Ribozyme in eine große Vielzahl von Zellen unterschiedlicher Typen zu überführen. Während der Analyse wurde gefunden, dass Ribozym B eine ähnliche Verringerung der Menge an TNF-α-mRNS zu induzieren scheint wie Ribozym A (Daten nicht gezeigt). So kann der Zusatz des T/-Transkriptions-Terminators spezifische Aktivität von Ribozym A senken.
6 zeigt die celluläre Verteilung von TNF-α-Ribozymen
Die TNF-α-Ribozyme (1) waren unüblich stabil. Sie konnten im Innern von Human-Zellen sieben Tage lang nachgewiesen werden, während die Ribozyme normalerweise in Human-Zellen instabil sind; siehe 4. Obwohl eine Zell-Fraktionierungs-Untersuchung ergab, dass TNF-α-Ribozyme von der Zelle gewonnen werden können, sprach dies nicht die Möglichkeit an, dass ein Haupt-Teil des Ribozyms an Stellen sequestriert wurde, die für celluläre Nukleasen unzugänglich sind. Um sich mit dieser Frage zu beschäftigen, wurden Zellen mit mit Digoxigenin markierten Ribozymen transfektiert. Nach 72 h nach der Transfektion wurden Mikroskop-Objekträger hergestellt, und dann wurde das Ribozym durch ein Anti-Digoxigen-Fluorescein-Fab-Konjugat nachgewiesen, wie im Abschnitt „Materialien und Verfahrensweisen" beschrieben ist. Die in den 5A und 5B gezeigten Daten zeigten an, dass der Stabilisierungseffekt nicht auf irgendeine Zell-Kompartmentalisierung zurückzuführen war, da bei Immunofluoreszenz-Färben des Ribozyms die gesamte Zelle die Fluoreszenz annahm. Siehe 6(a) und 6(B)
7 zeigt die Analyse der Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität bei TNF-α-Ribozymen mit Zellextrakten
Es war die anfängliche Hypothese, dass das gegen diese spezielle Stelle des Tumor-Necrose-Faktors gerichtete Ribozym durch bestimmte celluläre Faktoren wie beispielsweise Proteine geschützt ist. Wenn sich Proteine an das Ribozym binden und es vor einem Abbau schützen, sollten Experimente der Verschiebung der Mobilität diese nachweisen. Während der anfänglichen Experimente, die mit HL60-Zellen durchgeführt wurden, zeigten Cytoplasma-Proteine, dass die gebildeten Komplexe nicht durch die Gegenwart von PolydC dI und die tRNS in der Reaktionsmischung inhibiert wurden. In diesen Experimenten trat immer noch ein erheblicher Abbau des Ribozyms aufgrund der in dem Extrakt vorhandenen Nukleasen ein. Wenn dann RNSsin der Inkubationsmischung zugesetzt wurde, um die Wirkung der Nuklease zu verringern, wurde ein viel größerer Teil der zugesetzten RNS in dem größeren Komplex eingeschlossen (7a, Spuren 2, 3 und 4). Wenn Cytoplasma-Extrakte von PBMN-Zellen verwendet wurden, war der Komplex mit geringer elektrophoretischer Mobilität auch nachweisbar (7b, Spuren 6, 7), was nahelegt, dass das Protein, dass sich an das Ribozym bindet, ein allen Zelltypen gemeinsames Protein ist. Die Komplexe, die in Gegenwart oder Abwesenheit von RNSsin gebildet wurden, hatten identische Mobilitäten, was anzeigt, dass sich die Proteine in voller Länge binden. Weiter entspricht das aus dem Komplex im Anschluss an die Phenol-Extraktion gewonnene Ribozym dem die volle Länge aufweisenden Ribozym (7b, Spur 8).
Die Komplex-Bildung ist spezifisch für TNF-α-Ribozyme
Ein Zusatz von tRNS zu der Reaktion verringerte nicht die Menge an gebildetem Komplex, was ein in gewissem Umfang spezifisches Binden an das Ribozym nahelegt. Diese Bindungsspezifität wurde durch die Kompetitions-Assays (8) bestätigt. Im Gegensatz zu tRNS und PoldCdI tritt unmarkiertes Ribozym in Konkurrenz mit markiertem Ribozym bei der Komplexbildung. Interessanterweise wurde eine Komplexbildung nicht beobachtet mit Hammerkopf-Ribozymen, die auf die mRNS von IL-2 oder auf Integrase von HIV gerichtet waren. Dies zeigt an, dass die Bindung nicht aufgrund der katalytischen Domain der TNF-α-Ribozyme erfolgt. Im Unterschied zu dem TNF-α war das IL-2-Ribozym innerhalb der Zellen nicht so stabil wie das TNF-α-Ribozym und zeigt nicht dieses Bindungs-Phänomen. So ist es möglich, dass dieses Binden verantwortlich für die In-vivo-Stabilität der TNF-α-Ribozyme ist.
Das TNF-α-Ribozym verleiht anderen Ribozymen Stabilität
Selbst vor Charakterisierung dieses/dieser RNS-Element(e)s, das das TNF-α vor einem Abbau schützt, wurde die Möglichkeit getestet, dass es an andere RNSs gebunden werden kann, um diese zu stabilisieren. Das TNF-α-Ribozym wurde an das IL-2-Ribozym gebunden (9), das allein instabil war. Wie in den 10A und 10B gezeigt, bildete das IL-2-Ribozym allein von sich aus keine Komplexe mit irgendeinem Zell-Faktor unter unseren Bedingungen. Wie unten gezeigt wird, bildete das an das IL-2-Ribozym gebundene TNF-α-Ribozym Komplexe und wurde stabilisiert.
Die In-vivo-Aktivität von geschützten und ungeschützten IL-2-Ribozymen
Wir wissen, dass die Inhibierung der TNF-α-Gen-Expression durch Antisense oder das Ribozym nicht signifikant die IL-2-Gen-Expression beeinträchtigt. So konnte die Wirkung des Doppel-Ribozyms (IL-2-Ribozym, gebunden an TNF-α-Ribozym) auf die IL-2-Gen-Expression genau untersucht werden.
Das gegen das TNF-α-Ribozym gerichtete Ribozym wurde durch bestimmte Zell-Faktoren wie beispielsweise Proteine geschützt. Diese Faktoren konnten die Stabilität und/oder Aktivität des Ribozyms über eine strukturelle Stabilisierung hinaus erhöhen.
Solche Faktoren oder verwandte Verbindungen könnten mit dem Ribozym mittels eines Gen-Therapie-Ansatzes kombiniert werden.
Experimente der Verschiebung der Mobilität wurden angewendet, um erfolgreich zu zeigen, dass sich ein Protein/Proteine an das TNF-α-Ribozym bindet/binden (siehe 7, 8 und 9). Eine Vorbehandlung des Komplexes mit Proteinase K vor einer Elektrophorese eliminiert den Komplex (11A, Spuren 4 und 5), was bestätigt, dass der Co-Faktor die Natur eines Proteins hat. Der Abbau des Ribozyms, der in 4 zu sehen ist, beruht auf dem Überschuss an Ribonuklease, die in diesem speziellen Cytoplasma-Extrakt (CE) zugegen ist. Weiter zeigte eine UV-Vernetzungs-Analyse von Proteinen, die sich an das TNF-α-Ribozym binden, ein hauptsächliches Ribozym-Bindungs-Protein, wie aus 11C, Spur 1, ersichtlich ist.
Eine ähnliche Komplex-Bildung wurde nicht beobachtet mit einem Integrase-Ribozym, damit ist das Protein spezifisch für TNF-α-Ribozym und legt nahe, dass der Unterschied der In-vivo-Stabilität zwischen dem Integrase-Ribozym und dem TNF-α-Ribozym auf das/die Proteine) zurückzuführen sein kann.
Um zu sehen, ob die Bindung von TNF-α-Ribozym an andere RNS-Moleküle ein Protein binden und die In-vitro- und In-vivo-Stabilität verleiht, wurden die folgenden Mini-Gene konstruiert:
(1) IL-2-Ribozym, gebunden an das 5'-Ende von TNF-α-Ribozym
Das sich das TNF-α-Ribozym und die Integrase oder das IL-2-Ribozym nur in der Nukleotid-Sequenz unterscheiden, die komplementär zu ihrem RNS-Ziel-Molekül ist, ist dieser RNS-Bereich wahrscheinlich verantwortlich für die Komplex-Bildung.
(2) IL-2-Ribozym gebunden an die Antisense- TNF-α-RNS (siehe 9)
Die für diese Moleküle kodierenden Gene wurden kloniert, in vitro transkribiert, und die radiomarkierten RNS-Moleküle wurden in Gel-Retardations-Assays verwendet.
Obwohl in einigen Experimenten schwache Komplexe nachgewiesen wurden, zeigen unsere Daten an, dass sich weder an das 5'-Ende des TNF-α-Ribozyms gebundenes IL-2 noch das IL-2-Ribozym, das an die Antisense-Verbindung gebunden ist, an das Protein binden (hinsichtlich der Struktur, siehe 9). 12A: Spuren 4, 5, 7 und 8; und 12B: Spuren 2 und 3. Wie aus 12A ersichtlich ist, wurde ein Abbau des IL-2-Ribozyms und der chimären Moleküle in Gegenwart von CE in allen Spuren gefunden, was anzeigt, dass die Komplexbildung das Ribozym gegen Abbau schützt.
Diese Daten legen nahe, dass die Bindung des Proteins eine Sekundärstruktur erfordert. Da der an das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms gebundene T7-Terminator die Bindung nicht beeinträchtigte, wurde angenommen, dass die Ribozym-Bindungsstelle zwischen der flankierenden Sequenz des TNF-α-Ribozyms an seinem 5'-Ende und seiner katalytischen Domain gebildet sein könnte. Darüber hinaus wurden Versuche gemacht, die Sekundärstruktur des TNF-α-Ribozyms, das an den T7-Terminator gebunden ist ( 13A), nachzuahmen.
TNF-α-Antisense, gebunden an das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms
Das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms wurde gebunden an eine Antisense-Sequenz, die gerichtet ist gegen eine unterschiedliche Ziel-Sequenz auf dem TNF-α (13B). Die gewählte Antisense-Sequenz hat eine Hairpin-Struktur (keesing loop). Beide Gene wurden kloniert, in vitro transkribiert, und anschließend wurden die radiomarkierten RNS-Moleküle in Gel-Retardations-Assays verwendet.
Die Ergebnisse (14A: Spuren 5 und 6) zeigen an, dass die an das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms gebundene Antisense-Sequenz sich an ein Protein/Proteine bindet. Darüber hinaus zeigten Kompetitions-Experimente, dass dasselbe/dieselben Proteine) verantwortlich sind für die Komplex-Bildung, da unmarkiertes TNF-α-Ribozym mit dem chimären Ribozym hinsichtlich einer Komplex-Bildung in Konkurrenz trat ( 14B: Spuren 3 und 4).
In den zweiten Experimenten wurde das IL-2-Ribozym an das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms gebunden (15B). Die flankierenden Sequenzen des IL-2-Ribozyms wurden in dem Konstrukt erweitert, um eine intramolekulare Wechselwirkung zu verhindern.
Die aus diesem chimären Ribozym erzeugte RNS bindet sich an Protein(e) wie TNF-α-Ribozym (16: Spur 4). Diese Experiment-Daten legen nahe, dass die flankierende Sequenz am 5'-Ende des TNF-α-Ribozyms in die Bindung involviert ist.
Trunkierte TNF-α-Ribozyme
Um den Einbezug der flankierenden Sequenzen zu testen, wurden TNF-α-Ribozyme, die an ihrer 5'- oder 3'-Flankierungs-Sequenz trunkiert waren, konstruiert (17A bzw. 17B). Die für diese Ribozyme kodierenden Gene wurden kloniert, in vitro transkribiert, und die radioaktiven RNS-Moleküle wurden in Gel-Retardations-Assays verwendet. Wie aus 18A, Spur 4, ersichtlich ist, bindet sich das am 3'-Ende trunkierte Ribozym an Proteine. Im Gegensatz dazu bildet das am 5'-Ende trunkierte TNF-α-Ribozym keinen Protein-Komplex (18A: Spur 6). Die mit einem * markierte Bande ist wahrscheinlich auf die intramolekulare Konformation des Ribozyms zurückzuführen.
Gel-Retardations-Assays wurden verwendet, um zu sehen, ob das am 3'-Ende trunkierte Ribozym sich an Proteine von anderen Zell-Typen bindet. Wie aus 18D: Spuren 2, 3 und 4 ersichtlich ist, binden sich die trunkierten Ribozyme an die Proteine von PBMN-Zellen, HL60-Zellen und WH164-Zellen. Zusammengenommen zeigen unsere experimentellen Daten an, dass sich endogene Proteine von vielen Zell-Typen an die am 3'-Ende trunkierten TNF-α-Ribozyme binden. Damit hängt das Vermögen irgendeines Ribozyms, sich an ein Protein/an Proteine zu binden, von seiner Basen-Zusammensetzung am 5'-Ende und vielleicht am 3'-Ende ab.
Eine mögliche Sekundärstruktur für das TNF-α-Ribozym B und -II und die mutmaßliche Bindungs-Stelle des Proteins sind in 19 vorgeschlagen.
Während dieser Analyse wurde beobachtet, dass eine In-vitro-Komplexbildung das Ribozym gegen Abbau schützt (siehe 21A). Ein endogenes Protein könnte für die unerwartete Stabilität der TNF-α-Ribozyme verantwortlich sein. Darüber hinaus kann/können ein endogenes) Proteine) in vivo die Ribozym-Aktivität verstärken, indem sie dazu beitragen, das Auftreten missgefalteter Ribozyme zu verhindern und aufzulösen.
In-vivo-Stabilität von IL-2 und an das 3'-Ende von TNF-α-Ribozym gebundem IL-2
Die Stabilität von IL-2-Ribozym und von an das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms gebundenem IL-2-Ribozym wurden untersucht, wie vorstehend berichtet. Kurz gesagt, wurden HL60-Zellen, die in der Log-Phase in RPMI wuchsen, das mit 20%igem fetalem Kälberserum supplementiert war, mit IL-2-Ribozym oder an TNF-α gebundenem IL-2 unter Verwendung von DOTAP als Tranfektionsmittel transfektiert. Im Anschluss an die Transfektion wurden die Zellen 3 mal mit Hank's gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in den Inkubator mit RPI zurückgestellt, das mit 20%igem FCS supplementiert war. Zellen, die in 1 ml Kultur enthalten waren, wurden zu verschiedenen Zeiten gewonnen. Die Gesamt-RNS wurde hergestellt und mittels eines 15%igen Polyacrylamid-Gels mit 7 M Harnstoff analysiert. Die Radioaktivität in Ribozym-Banden wurde bestimmt und als Prozent-Wert der Radioaktivität ausgedrückt, die unmittelbar nach der Transfektions-Zeit vorhanden war (20). Die Daten zeigen an, dass das chimäre Ribozym stabiler ist als das IL-2-Ribozym allein.
In-vivo-Aktivität und Cytotoxizität von TNF-α-Ribozym und an TNF-α-Ribozym gebundenem TNF-α-Antisense
Die In-vivo-Aktivität von TNF-α-Ribozym, der Antisense-Sequenz und der an das TNF-α-Ribozym gebundenen Antisense-Sequenz wurde unter Verwendung eines Cytotoxizitäts-Assays und eines Radioimmuno-Assays untersucht. In diesen Experimenten erfolgte die celluläre Internalisierung der Ribozyme mittels eines kationischen Ribosoms (DOTAP). Eine 36 nt lange Antisense-Sequenz, die komplementär zu der TNF-α-Sequenz war, die über den Bereich von 56 bis 91 reicht (siehe Pennica et al., 1984, Nature 312: 724) wurde zum Numerieren mit dem TNF-α-Ribozym verbunden.
Etwa 100.000 PBMN-Zellen wurden mit dem Ribozym für die Zeit von 6 h oder 12 h transfektiert. Die Expression von TNF-α wurde mit 10 μg Phasenumwandlungs-Tinten für 16 h induziert, und die Menge an abgeschiedenem TNF-α in dem Medium wurde mittels eines Cytotoxizitäts-Assays unter Verwendung von L929-Zellen gemessen. TNF-α inhibiert das Wachstum von L929-Zellen. Ein hoher Radioaktivitäts-Count (hoher Wert von inkorporiertem 3H-Thymidin) zeigt einen niedrigen Wert TNF-α und damit wirksame Ribozyme in PBMN-Zellen an. Der Konzentrations-Wert von TNF-α ist erheblich verringert, wenn peripheres Blut mit Ribozymen transfektiert wird. Darüber hinaus wurde ein Radioimmuno-Assay verwendet, um die Menge an TNF-α in dem Kulturmedium zu messen. Dieses System hat den großen Vorteil gegenüber Bio-Assays, dass es spezifisch für TNF-α ist.
Die in 21 präsentierten Daten geben an, dass alle Moleküle in vivo aktiv sind. Wie erwartet werden kann, zeigt die an das TNF-α-Ribozym gebundene Antisense-Sequenz einen synergistischen Effekt.
Eines der Hauptprobleme beim Entwerfen einer Behandlungsmethode ist die Spezifität und Cytotoxizität. So wurden die Effekte des TNF-α-Ribozyms und der an das TNF-α-Ribozym gebundenen TNF-α-Antisense-Sequenz an der Interleukin-2-Gen-Expression untersucht, um so die Spezifität und Cytotoxizität zu checken. Die Moleküle wurden den Zellen über kationische Liposome zugeleitet. Etwa 100.000 periphere mononukleäre Blut-Zellen wurden mit den Test-Molekülen für 5 h transfektiert. Im Anschluss an die Transfektion wurden die Zellen mit 5 μg/ml PHA 16 h lang stimuliert, und anschließend wurde die Menge an Interleukin-2, das in das Medium abgeschieden worden war, unter Verwendung des CTLL2-Assays bestimmt. In diesem Assay wird eine Verdünnungs-Reihe (1/4 bis 1/128) von der überstehenden Flüssigkeit hergestellt, die von den Kontroll-Proben und von den Zellen erhalten wurde, die mit den Test-Molekülen transfektiert wurden. 100 μl jeder Verdünnung (durchgeführt jeweils 3fach) wurden 5.000 CTLL2-Zellen in 20 μl Medium zugegeben. Nach 20 h wurden die Zellen mit 3H-Thymidin 4 h lang gepulst, die Zellen wurden gewonnen, und die mit der DNS assozi ierten Radioaktivität wurde bestimmt. Interleukin-2 fördert das Wachstum von CTLL2-Zellen, und damit gibt ein hoher radioaktiver Count hohe Konzentrationen an IL-2 an, und folglich ein ineffektives Ribozym in PBMN-Zellen.
22 zeigt, dass die Expression von Interleukin-2 durch das TNF-α-Ribozym nicht bewirkt wird. Sie zeigt auch an, dass das Ribozym für die Zellen nicht cytotoxisch ist und dass die IL-2-Gen-Expression nicht durch den Grad der TNF-α-Gen-Expression reguliert wird.
In-vivo-Aktivität von IL-2-Ribozym und an das 3'-Ende von TNF-α-Ribozym gebundenem IL-2-Ribozym wurden durch einen CTLL2-Assay untersucht
Etwa 100.000 PBMN-Zellen wurden mit den verschiedenen Molekülen (25 μM End-Konzentration) unter Verwendung von DOTAP als kationischem Liposom transfektiert. Nach 8 h der Transfektion wurden die Zellen mit PHA (5 μg/ml) 16 h lang stimuliert, und danach wurde das IL-2 in dem Medium mittels des CTLL2-Assays getestet, wie in 22 gezeigt.
Die in 23 präsentierten Daten zeigen, dass beide Ribozyme aktiv sind. Die Aktivität des an das 3'-Ende des TNF-α-Ribozyms gebundenen IL-2-Ribozyms ist viel höher als die Aktivität von IL-2 allein, was nahe legt, dass das Protein sowohl die Stabilität als auch die Aktivität des Enzyms verstärken kann.
Ein anderer Weg zur Messung der Interleukin-2-Gen-Expression ist, die PBMN-Zellen direkt mit 3H-Thymidin zu pulsen.
Im Anschluss an die Transfektion wurden die Zellen mit PHA für 48 h stimuliert, mit 3H-Thymidin Puls-mäßig behandelt und dann 18 h später gewonnen. In diesem Assay fördert IL-2 das Wachstum von T-Zellen, und ein hoher Radioaktivitäts-Count zeigt eine hohe Konzentration an IL-2 und damit ein nicht wirksames Molekül an. Die Ergebnisse von 3 Experimenten werden nachfolgend präsentiert.

A: Kontroll-Probe
B: Zellen transfektiert allein mit IL-2-Ribozym
C: Zellen transfektiert mit Il-2-Ribozym gebunden an das 3'-Ende des TNF-Ribozyms
D: unstimulierte Zellen

Die in der obigen Tabelle präsentierten Ergebnisse zeigen an, dass beide Ribozyme in vivo aktiv sind. Das an das TNF-α-Ribozym gebundene IL-2-Ribozym ist aktiver als IL-2 allein.
Es wurde oben gezeigt, dass das am 3'-Ende trunkierte Ribozym sich an Proteine wie das TNF-α-Ribozym bindet. So könnte dieses trunkierte Ribozym als Stabilisator für das/die Proteine) verwendet werden. Zusätzlich ist dieses trunkierte Ribozym nicht aktiv, da ihm seine am 3'-Ende angeordneten flankierenden Sequenzen fehlen.
Die In-vivo-Aktivität von TNF-α-Ribozym und von am 3'-Ende trunkiertem Ribozym wurde an verschiedenen Transfektions-Fällen untersucht; siehe die nachfolgenden Ergebnisse. Wie oben wurden Zellen mit dem TNF-α-Ribozym oder mit dem am 3'-Ende trunkierten Ribozym unter Verwendung von DOTAP transfektiert. In diesen Experimenten wurden die Zellen mit LPS (100 mg/ml) nach 6, 20, 42 oder 72 h nach der Transfektions-Zeit stimuliert. Das in dem Medium enthaltene TNF-α wurde durch Radioimmuno-Assay gemessen, wie in dem Kit beschrieben (Firma Amersham). Diese Daten sind in fMol-ml angegeben.
Diese Daten zeigen an, dass das trunkierte Ribozym nicht aktiv ist, verglichen mit dem TNF-α-Ribozym, und sie zeigen, dass das TNF-α-Ribozym selbst 72 h nach der Transfektions-Zeit aktiv ist.
Wie ersichtlich ist, schieden die unstimulierten Zellen nach 42 h dieselbe Menge an TNF-α ab wie die Kontroll-Zellen, die stimuliert wurden. Dies kann auf der Tatsache beruhen, dass die Zellen durch Kontakt mit dem Kunststoff stimuliert wurden (es ist bekannt, dass ein langer Kontakt der Zellen mit Kunststoff die Expression einiger Lymphokin-Gene stimulieren kann). So kann der Rückgang der Ribozym-Aktivität, der 48 h nach der Transfektions-Zeit beobachtet wurde, auf die Überexpression des TNF-α Gens aufgrund des langen Kontakts mit dem Kunststoff und/oder auf den Zerfall des Ribozyms selbst zurückgeführt werden.
Schlüsse
Damit haben wir gezeigt, dass TNF-α-Ribozyme innerhalb menschlicher Zellen unüblich stabil sind. Dieses Phänomen wird im Hinblick auf die Anordnung innerhalb der Zelle nicht leicht erklärt, da das Ribozym über die Zellen verteilt zu sein scheint ( 6). Eine signifikante Teil-Menge des Ribozyms wurde als Komplex mit verringerter elektrophoretischer Mobilität gewonnen. Eine Unterdrückung der Ribonukleasen durch RNSsin erhöht die Menge an gewonnenen Komplexen aus Cytoplasma-Extrakten. Eine Zugabe von tRNS hatte keinen kompetitiven Effekt. Eine Inhibierung der Komplexbildung wurde allein mit unmarkiertem Ribozym erhalten. Weder Integrase noch IL-2- Ribozyme bildeten nachweisbare Komplexe. Damit ist die Bindung spezifisch für TNF-α-Ribozym. Das IL-2-Ribozym zeigte eine verringerte intracelluläre Stabilität, verglichen mit dem TNF-α-Ribozym, was die Möglichkeit aufwirft, dass eine Bildung der Komplexe mit der Stabilität in Beziehung steht.
Die Bindung von TNF-α-Ribozym an IL-2-Ribozym erhöhte sowohl die Stabilität, als auch verlieh sie dem Doppel-Ribozym das Vermögen, Komplexe zu bilden. Weiter waren die verbundenen Ribozyme aktiv.
So bindet sich ein am 3'-Ende trunkiertes Ribozym an Proteine. Im Gegensatz dazu bildet am 5'-Ende trunkiertes TNF-α-Ribozym keinen Protein-Komplex. Damit hängt das Vermögen irgendeines Ribozyms, sich an Protein(e) zu binden, von seiner Basen-Zusammensetzung (einschließlich der Länge) am 5'-Ende und vielleicht am 3'-Ende ab. Unsere Daten tragen dazu bei, solch ein Ribozym zu entwerfen, dass sich an endogenes) Proteine) bindet.
Sequenz-Liste

Claims

Eine Verbindung mit der Struktur:
worin jedes X ein Ribonukleotid oder ein Deoxyribonukleotid darstellt, das das Gleiche oder unterschiedlich ist, und an seinem Zucker, Phosphat oder der Base modifiziert oder substituiert sein kann; worin jedes der A, C, U und G ein Ribonukleotid darstellt und a, c, u(t) und g ein Ribonukleotid oder ein Deoxyribonukleotid darstellt, das an seinem Zucker, Phosphat oder der Base nicht-modifiziert oder modifiziert oder substituiert sein kann; worin jede der (X)_n und (X)_n' ein Oligonukleotid mit einer vorbestimmten Sequenz darstellt und mindestens eines der (X)_n oder (X)_n' ein Ribozym, eine Antisense-RNA oder eine mRNA umfasst; worin jede der n oder n' entweder 0 oder eine ganze Zahl mit der Proviso darstellt, dass mindestens einer der n oder n' eine ganze Zahl ist; worin jedes * eine Basenpaarung zwischen den auf jeder Seite davon lokalisierten Nukleotiden darstellt; worin jede durchgezogene Linie eine chemische Verbindung darstellt, die kovalente Bindungen zwischen den auf jeder Seite davon lokalisierten Ribonukleotiden zur Verfügung stellt; worin „a" eine ganze Zahl darstellt, die eine Anzahl von Ribonukleotiden definiert, mit der Proviso, dass „a" 0 oder 1 sein kann und, falls 0, dann ist das A, das 5' von (X)_a lokalisiert ist, an das X gebunden, das 3' von (X)_a lokalisiert ist; worin jedes der m und m' eine ganze Zahl darstellt, die größer oder gleich 1 ist; worin jede der gestrichelten Linien unabhängig voneinander entweder kovalente Bindungen zwischen den auf jeder Seite davon lokalisierten Nukleotiden oder die Abwesenheit jeglicher solcher Bindungen darstellt; und worin (X)_b ein Oligonukleotid darstellt, das vorhanden oder nicht-vorhanden sein kann, mit der Proviso, dass b eine ganze Zahl darstellt, die größer als oder gleich 2 ist, wenn (X)_b vorhanden ist.
Die Verbindung von Anspruch 1, worin jedes X ein Ribonukleotid darstellt, worin jede der A, C, U und G ein Ribonukleotid darstellt und jede der a c, u(t) und g ein Ribonukleotid darstellt.
Die Verbindung von Anspruch 1 mit der Struktur:
worin X, A, C, U, G, c, u(t), g, (X)_n, (X)_n', n, n', *, die durchgezogenen Linien, m, m', die gestrichelten Linien, (X)_b und b in Anspruch 1 definiert sind.
Die Verbindung von Anspruch 3, mit der Struktur:
worin X, A, C, U, G, a, c, u(t), g, (X)_n, (X)_n', n, n' und * in Anspruch 1 definiert sind.
Die Verbindung von Anspruch 4 mit der Struktur:
worin X, A, C, U, G, (X)_n, n und * in Anspruch 1 definiert sind.
Eine Verbindung mit der Struktur: 3'-[-(Z)_r-Q-(Z)_s-]_z-5 worin jedes Q die Verbindung einer der Ansprüche 1 bis 5 darstellt, die gleich oder verschieden sein können; worin jedes Z ein Ribonukleotid oder ein Deoxyribonukleotid darstellt, das das Gleiche oder verschieden ist und an seinem Zucker, Phosphat oder der Base modifiziert oder substituiert sein kann; worin jedes r und s eine ganze Zahl darstellt, die größer oder gleich 0 sein kann; und worin Z eine ganze Zahl darstellt, die größer oder gleich 1 ist.
Die Verbindung von einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das (X)_n oder (X)_n' ein Ribozym darstellt, das ein Haamadelribozym, ein Hammerkopfribozym oder ein Hepatitis-Delta-Ribozym ist.
Die Verbindung von Anspruch 7, worin (X)_n oder (X)_n' die folgende Struktur aufweist:
worin jedes X und Y ein Ribonukleotid darstellt, welche die Gleichen oder verschieden sein können; worin jede der (Y)_p und (Y)_p' ein Oligonukleotid mit einer vorbestimmten Sequenz darstellt, die in der Lage ist, mit einer zu spaltenden RNA-Zielsequenz zu hybridisieren; worin jedes der p und p' eine ganze Zahl darstellt, die die Anzahl der Ribonukleotide in dem Oligonukleotid definiert, mit der Proviso, dass die Summe p + p' ausreichend ist, um es dem Ribozym zu ermöglichen, mit der RNA-Zielsequenz zu hybridisieren; worin jedes * eine Basepaarung zwischen den auf jeder Seite davon lokalisierten Ribonukleotiden darstellt; worin jede durchgezogene Linie eine kovalente Verbindung zwischen den auf jeder Seite davon lokalisierten Ribonukleotiden darstellt; worin „a" eine ganze Zahl darstellt, die eine Anzahl von Ribonukleotiden definiert, mit der Proviso, dass „a" 0 oder 1 sein kann, und, falls 0, dann ist das A, das 5' von (X)_a lokalisiert ist, an das X, das 3' von (X)_a lokalisiert ist, gebunden; worin jedes m und m' eine ganze Zahl darstellt, die größer oder gleich 1 ist; worin (X)_b ein Oligoribonukleotid darstellt, mit der Proviso, dass b eine ganze Zahl darstellt, die größer oder gleich 2 ist.
Die Verbindung von Anspruch 8 mit der Struktur:
Die Verbindung von einem der Ansprüche 1 bis 5, worin mindestens eines der (X)_n oder (X)_n' die folgende Struktur aufweist:
worin jedes X und Y ein Ribonukleotid darstellt, das das Gleiche oder verschieden sein kann; worin jedes (Y)_p und (Y)_p' ein Oligonukleotid mit einer vorbestimmten Sequenz darstellt, das in der Lage ist, mit einer zu spaltenden RNA-Zielsequenz zu hybridisieren; worin jedes p und p' eine ganze Zahl darstellt, die die Anzahl der Ribonukleotide in dem Oliginukleotid definiert, mit der Proviso, dass die Summe aus p + p' ausreicht, um es dem Ribozym zu ermöglichen, mit der RNA-Zielsequenz zu hybridisieren; worin jedes * eine Basenpaarung zwischen den auf jeder Seite davon lokalisierten Ribonukleotiden darstellt; worin jede durchgezogene Linie eine kovalente Bindung zwischen den auf jeder Seite davon lokalisierten Ribonukleotiden darstellt; worin „a" eine ganze Zahl darstellt, die eine Anzahl von Ribonukleotiden definiert, mit der Proviso, dass „a" 0 oder 1 sein kann und, falls 0, dass das A, das 5' von (X)_a lokalisiert ist, an das 3' von (X)_a lokalisierte X gebunden ist; worin jedes m und m' eine ganze Zahl darstellt, die größer oder gleich 1 ist; worin (X)_b ein Oligoribonukleotid darstellt, mit der Proviso, dass b eine ganze Zahl darstellt, die größer oder gleich 2 ist.
Die Verbindung von Anspruch 10, worin (X)_n' die folgende Struktur aufweist:
worin X, Y, (Y)_p, (Y)_p' p, p', *, die durchgezogenen Linien, "a", m, m', (X)_b und b in Anspruch 10 definiert sind.
Die Verbindung von Anspruch 10 oder 11, worin (Y)_p oder (Y)_p' in der Lage ist, mit einer RNA zu hybridisieren, die einem Säugetier angeboren ist.
Die Verbindung von Anspruch 10 oder 11, worin (Y)_p oder (X)_p' in der Lage ist, mit einer RNA zu hybridisieren, die einer Pflanze angeboren ist.
Die Verbindung von einem der Ansprüche 1 bis 5, worin (X)_n oder (X)_n' in der Lage ist, mit einer RNA zu hybridisieren, die einem Säugetier angeboren ist.
Die Verbindung von einem der Ansprüche 1 bis 5, worin (X)_n oder (X)_n' in der Lage ist, mit einer RNA zu hybridisieren, die einer Pflanze angeboren ist.
Die Verbindung von einem der Ansprüche 1 bis 5, worin (X)_n oder (X)_n' ein Polypeptid kodiert.
Eine Zusammensetzung, die eine Verbindung einer der Ansprüche 1 bis 6 zusammen mit einem pharmazeutisch, veterinärmedizinisch oder landwirtschaftlich verträglichen Träger oder Hilfsstoff umfasst.
Die Zusammensetzung von Anspruch 17 zur Behandlung einer Erkrankung, die mit der Überexpression von TNF-α assoziiert ist, durch die Verringerung der Überexpression von TNF-α.
Die Zusammensetzung von Anspruch 18, worin die Erkrankung rheumatische Arthritis, AIDS oder eine Autoimmunerkrankung ist.
Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung einer der Ansprüche 1 bis 16, das die folgenden Schritte umfasst: (a) das Ligieren einer Nukleotidsequenz, die zu besagter Verbindung korrespondiert in einen Transfervektor, der aus DNA, RNA oder einer Kombination davon besteht; (b) das Transkribieren der Nukleotidsequenz von Schritt (a) mit RNA-Polymerase; und (c) die Rückgewinnung der Verbindung.
Ein Transfervektor, der aus RNA oder DNA oder einer Kombination davon besteht, der eine Nukleotidsequenz enthält, die bei Transkription in der Verbindung einer der Ansprüche 1 bis 16 resultiert.
Ein Transfervektor gemäß Anspruch 21, der RNA oder DNA oder eine Kombination davon umfasst, die aus einem bakteriellen Plasmid oder einem Phagen abgeleitet ist.
Eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle, die eine Nukleotidsequenz enthält, die bei Transkription in der Verbindung einer der Ansprüche 1 bis 16 resultiert.
Eine Zusammensetzung, die eine erste RNA umfasst, die an eine zweite RNA kovalent gebunden ist, worin die erste RNA ein Ribozym oder eine mRNA umfasst und das zweite RNA-Molekül mindestens die folgende Sequenz umfasst:
Die Zusammensetzung von Anspruch 24, worin die erste RNA ein Ribozym umfasst.
Die Zusammensetzung von Anspruch 24, worin die erste RNA eine mRNA umfasst.
Die Zusammensetzung von Anspruch 25, worin das Ribozym Ribonukleotide umfasst, von denen jedes an seinem Zucker, Phosphat oder der Base nicht modifiziert oder modifiziert oder substituiert sein kann.
Die Zusammensetzung von Anspruch 25, worin das Ribozym ein TNF-α-Ribozym ist.
Ein Verfahren zur Verstärkung der Aktivität eines Ribozyms oder einer mRNA in einer Pflanzenzelle, das die Verabreichung der Zusammensetzung von Anspruch 24 in die Zelle dergestalt umfasst, dass das Ribozym oder die mRNA stabilisiert wird und seine Aktivität verstärkt wird.
Die Zusammensetzung von Anspruch 24, zur Verstärkung der Aktivität eines Ribozyms oder einer mRNA zur Verwendung in der Therapie.