DE3851398T2

DE3851398T2 - DNA-Fragmente, die ein für Milchsäurebakterien spezifisches Regulationsgebiet enthalten, zur Expression von Genen, die normalerweise heterologe Proteine kodieren.

Info

Publication number: DE3851398T2
Application number: DE19883851398
Authority: DE
Inventors: Vos Willem Meindert De; Augustinus Franciscus M Simons
Original assignee: NL ZUIVELONDERZOEK INST
Current assignee: NL ZUIVELONDERZOEK INST
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1988-06-13
Publication date: 1995-04-20
Anticipated expiration: 2008-06-14
Also published as: DK319888D0; EP0307011A1; DE3851398D1; DK319888A; NL8701378A; IE64727B1; IE881779L; EP0307011B1

Description

Die Erfindung betrifft insbesondere DNA-Fragmente, die eine Milchsäurebakterium-spezifische Regulatorregion enthalten, die für die wesentliche Expression von Genen verantwortlich ist, die insbesondere für heterologe Proteine wie proteolytische Enzyme, beispielsweise Chymosin, sowie Pseudo-, Pro- und Preprochymosin, kodieren. Es ist bekannt, daß Chymosin ein proteolytisches Enzym ist, das im Labmagen junger Kälber synthetisiert und als Zymogen Prochymosin, das 365 Aminosäuren umfaßt, sezerniert wird. Prochymosin wird durch Entfernung der 42-aminoterminalen Aminosäuren mittels eines pH-abhängigen autokatalytischen Prozesses umgewandelt. Insbesondere kommt Chymosin in Form von 2 Isoenzymen (A und B) vor. Die zwei Formen unterscheiden sich voneinander dadurch, daß eine Asparaginsäure an Position 290 in Form A und ein Glycinrest an dieser Position in Form B vorkommt. Dieses Kälberchymosin wird bereits seit langem zur Herstellung von Käse verwendet. Jedoch führte die fortgesetzte Zunahme der Käseproduktion und die Abnahme im Nachschub von Kälbermägen zu einer Verknappung von Kälberchymosin. Darum wird in vielen Fällen bei der Käseherstellung auf andere Enzyme tierischer oder mikrobieller Herkunft zurückgegriffen. Hinsichtlich der besseren Qualität von Chymosin, verglichen mit diesen anderen Enzymen, besteht jedoch beträchtliches Interesse an Mikroorganismen, die große Mengen von Prochymosin unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken produzieren können.
Es wird ebenfalls unter Bezugnahme auf die oben genannte Käseproduktion erwähnt, daß Milchsäurebakterien, wie Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetylactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc lactis, Streptococcus Leuconostoc cremoris und Lactobacillus spp großtechnisch in der Molkereiindustrie zur Herstellung fermentierter Milchprodukte, wie Käse, Joghurt, Butter und Buttermilch, verwendet werden. Das Wachstum der Milchsäurebakterien hängt von Aminosäuren und Peptiden ab, die nach dem Abbau von Casein (dem wichtigsten Protein in Kuhmilch) unter dem Einfluß von proteinspaltenden Enzymen, wie Proteinasen und Peptidasen, produziert werden. Proteinasen bauen Casein zu kleinen Fragmenten ab, worauf der Abbau der Proteinbruchteile durch Peptidasen zu Aminosäuren erfolgt. Proteinasen, die von verschiedenen Streptococcus cremoris-Stämmen stammen, zeigen einen Abbauweg für die verschiedenen Caseinkompo-nenten αsl-, β- und k-Casein, der für einen solchen Stamm charakteristisch ist. Der industrielle Stamm S. cremoris SK11 enthält eine zellwandgebundene Proteinase, die αsl-, β- und k-Casein abbaut. Die einzigartige caseinolytische Spezifität dieser Proteinase hat zum Ergebnis, daß dieser Stamm nicht zur Bildung von bitterschmeckenden Peptiden aus Casein führt.
Hinsichtlich dessen, was vorstehend erwähnt worden ist, betrifft die Erfindung isolierte DNA-Fragmente, die die Regulatorregion des Proteinasegens, wie in Fig. 5 gezeigt, enthalten, die das ClaI-Fragment auf dem Plasmid pSK111 des Streptococcus cremoris SK11 des Stammes SK112, hinterlegt beim Central Bureau for Mould Cultures, The Netherlands, unter der Nr. CBS 34987, enthalten, und mutierte Formen davon, die im wesentlichen dieselbe Aktivität aufweisen. Insbesondere betrifft die Erfindung das ClaI-Fragment des Proteinasegens des Plasmids pSK111 des Stammes S. cremoris SK112, wie in Fig. 5 gezeigt, gegebenenfalls ergänzt durch die DNA-Teilregion, die in Fig. 7a gezeigt und stromabwärts von dem ClaI-Fragment gelegen ist, oder durch die DNA-Teilregion, die in Fig. 7b gezeigt und stromaufwärts von dem ClaI-Fragment gelegen ist. Insbesondere schien es, daß das in Fig. 7a (1) zwischen der ClaI-Schnittstelle gelegene Fragment in der zweiten Linie vorhanden ist, und daß die Ala-Ala-Sequenz, die in der dritten Zeile der genannten Figur vorhanden ist, die Sekretion von beispielsweise Prochymosin auslösen kann, sofern sie stromabwärts von dem ClaI-Fragment verknüpft ist, was in Fig. 5 erläutert ist. Daher ist der Wirt in der Lage, das produzierte Prochymosin in das Medium zu sezernieren, was einen beträchtlichen Vorteil hinsichtlich der Situation eines Proteins darstellt, das zur Expression gebracht wird, jedoch in der Zelle verbleibt.
Die Erfindung betrifft zweitens rekombinante Plasmide, die mit einem Milchsäurebakterium-spezifischen Replikon versehen werden und außerdem einen umfangreichen Wirtsbereich besitzen und sich mit hoher oder niedriger Kopienzahl in Milchsäurebakterien replizieren. Die Vektoren pNZ121 und pNZ122, die nachstehend ausführlicher definiert werden, werden als spezifische Plasmidvektoren erwähnt.
Das Gen, das für Prochymosin, Preprochymosin, Pseudochymosin oder Chymosin kodiert, wird zweckmäßigerweise als Gen eines heterologen Proteins verwendet, das mit dem erfindungsgemäßen DNA-Regulatorfragment verknüpft ist. Das Gen für β-Galactosidase kann als weiteres Beispiel für ein Gen erwähnt werden, das für ein heterologes Protein kodiert.
Die Erfindung betrifft außerdem ein rekombinantes Plasmid, das eine Kombination eines Plasmidvektors, eine DNA-Regulatorregion und ein Gen für ein heterologes Protein enthält.
Gleichzeitig können ein rekombinantes Plasmid, das ein homologes Gen enthält, und insbesondere ein Proteinasegen, wie in Fig. 4 gezeigt, erfindungsgemäß verwendet werden. In dieser Hinsicht soll erwähnt werden, daß im Gegensatz zu der in der W085/03945 beschriebenen Proteinase die Erfindung eine "nicht bittere" Proteinase betrifft (W.M. de Vos, Neth. Milk Diary, 40, (1986), 14-154).
Die Erfindung betrifft außerdem Mikroorganismen, insbesondere Milchsäurebakterien, und ganz speziell das Milchsäurebakterium Streptococcus lactis MG1363, das wenigstens ein erfindungsgemäßes rekombinantes Plasmid enthält.
Die Erfindung betrifft schließlich auch die Proteine und Lebensmittel wie Käse etc., die mit den oben genannten Mikroorganismen hergestellt werden.
Die Erfindung wird erläutert unter Bezugnahme auf
a) das von Kälbern stammende Prochymosingen, und
b) das DNA-Fragment, das den Promotor, die Ribosomen- Bindungsstelle und die für eine Reihe von aminoterminalen Aminosäuren kodierende Sequenz enthält, einschließlich des AUG-Starterkodons, das von dem Proteinasegen des Plasmids pSK111 des Stammes S. cremoris SK11 stammt,
und unter Bezugnahme auf ein Plasmid mit den beiden unter (a) und (b) erwähnten Elementen sowie unter Bezugnahme auf einen Milchsäurebakterium-Stamm, der ein solches Plasmid enthält. Diese Erläuterung soll nicht einschränkend sein, insbesondere nicht hinsichtlich der Dimensionen der von dem Proteinasegen stammenden DNA und dem für das heterologe Protein kodierenden Gen.

Klassifizierung der befolgten Verfahren

Die nachstehenden Verfahren werden zur Konstruktion von Mikroorganismen befolgt, die Kälber-Chymosin zu produzieren vermögen.

A) Isolierung von Messenger-RNA

Eine Messenger-RNA (mRNA)-Fraktion wurde aus den Schleimhautzellen eines Labmagens junger Kälber isoliert. Die mRNA wurde von den anderen RNA-Bestandteilen mittels der Oligo-dT-Celluluose-Säulenchromatographie abgetrennt.

B) Synthese von Copy-DNA

Zur Herstellung von Copy-DNA (cDNA) der isolierten mRNA-Fraktion, in der die mRNA als Matrix wirkt, wurde gereinigte mRNA in einem geeigneten Puffer mit dem Enzym reverse Transkriptase, einem Primer und einem Gemisch der vier Desoxynukleotide (dNTP's) inkubiert. Die RNA wurde sodann durch eine alkalische Behandlung entfernt und der Komplementärstrang mit Hilfe des Enzyms DNA-Polymerase I und der vier dNTP's synthetisiert. Die Haarnadelform in der produzierten doppelsträngigen DNA wurde mit Hilfe von S1-Nuklease entfernt. Das Gemisch der doppelsträngigen DNA-Stücke wurde fraktioniert, und nur die Fragmente mit einer geeigneten Länge wurden mit einem Klonierungsvektor ligiert.

C) Tailing und Transformation

Ein häufig angewendetes Verfahren zur Klonierung von cDNA-Fragmenten in einem geeigneten Vektor ist die Bereitstellung von Fragmenten mit poly-C-Schwänzen und gleichzeitig die Bereitstellung eines geeigneten Klonierungsvektors wie pUC9 mit poly-G-Schwänzen, wobei das Enzym terminale Transferase verwendet wird. Bakterien, die das Plasmid pUC9 aufweisen, führten in einem geeigneten Wirt zur Synthese des Enzyms β-Galactosidase. Die Zugabe des Farbstoffes 5-Brom-4-chlor-3- indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) zu den Agarplatten führte zu blauen Kolonien. Die transformierten Zellen, die rekombinante Plasmide besaßen, waren jedoch nicht in der Lage, β-Galactosidase zu synthetisieren, und produzierten deshalb keine blaue Färbung.

D) Isolierung des Chymosin-Klons

Die Selektion derjenigen Klone, die die genannten rekombinanten Plasmide enthalten, die das Plasmid pUC9 und die Informationen für das Kälber-Chymosin enthalten, fand mittels radioaktiv markierter Sonden statt. Auf der Grundlage der bereits veröffentlichten Chymosin-DNA- Sequenzen war es möglich, synthetische DNA-Sonden, die für Chymosin-DNA spezifisch waren, zu synthetisieren. Die weißen Kolonien auf der Agarplatte wurden auf ein Nitrocellulosefilter übergeführt, und die erzeugten Replika wurden mit der geeigneten radioaktiven Sonde behandelt.

E) Charakterisierung von Chymosin-Klonen

Die ausgewählten Kolonien enthalten Plasmide mit der erwarteten Chymosin-Sequenz, die anschließend durch geeignete Restriktions-Endonukleasen charakterisiert werden kann. Die vollständige DNA-Sequenz der Plasmide, die die Chymosin-Information enthalten, wurde mit: Hilfe der enzymatischen DNA-Sequenzierungstechniken bestimmt und mit der Aminosäuresequenz von Prochymosin in Beziehung gesetzt.

F) Expressionssignale

Geeignete DNA-Fragmente, die die vollständige oder praktisch vollständige Prochymosin-Information enthielten, sollten anschließend unter die Kontrolle von funktionellen Expressionssignalen gestellt und in geeignete Wirte transformiert werden. Die Expressionssignale können statistisch mit Hilfe von Promotorsondenvektoren isoliert werden, oder es kann von Expressionssignalen einer definierten Herkunft Gebrauch gemacht werden. Hinsichtlich der Tatsache, daß sich die Proteinasen auf der Außenseite der Zellwand befinden, so daß eine Sekretion von Prochymosin zustandekommt, wurde die Wahl getroffen, Expressionssignale zu verwenden, die von dem Proteinasegen des Stammes S. cremoris SK11 stammen.

G) Lage des zellwandgebundenen Proteinasegens

Die mesophilen Milchsäurebakterien, die zur Käseproduktion verwendet werden, enthalten abgesehen von chromosomaler DNA im allgemeinen auch große Mengen (2-10) Plasmide. Obwohl die Mehrzahl dieser Plasmide für kryptisch befunden wurde, kodieren einige Plasmide vollständig oder teilweise für bestimmte Funktionen, die für die Zelle essentiell sind. Kurierungs- und Transferexperimente haben gezeigt, daß sich die vollständige genetische Information für das Proteinasegen in dem Stamm S. cremoris SK11 auf dem Plasmid pSK111 (Größe: 78 kb) befindet.

H) Klonierung des S. cremoris SK11-Proteinasegens

Restriktionsenzymfragmente des Proteinase-Plasmids pSK111 wurden in E. coli mit Hilfe des Lambda-Bakteriophagen-Vektors kloniert. Die Überprüfung der rekombinanten Phagen, die Proteinase synthetisieren, erfolgte durch einen immunologischen Test, bei dem Antikörper verwendet wurden, die gegen S. cremoris SK11- Zellwand-Proteinase gerichtet waren. Die in den positiv reagierenden Phagen vorhandene Insertions-DNA wurde mit Hilfe von Restriktionsenzymen charakterisiert und mit der physikalischen Karte von pSK111 verglichen. Die Anordnung des Proteinase-Strukturgens und der Regulatorregion erfolgte durch Isolierung geeigneter Restriktionsenzymfragmente von den rekombinanten Phagen und durch Klonierung in einem proteinasedefizienten Stamm von S. lactis mit Hilfe Lactobacillus-spezifischer Plasmidvektoren. Transformanten, die in der Lage waren, in Milch zu wachsen, enthielten die vollständige genetische Information für die Proteinase einschließlich der Regulatorregion.

I) Bestimmung der Nukleotidsequenz der Regulatorregion und des Strukturbereiches des Proteinasegens des Stammes S. cremoris SK11

Die gesamte Nukleotid-Sequenz von Regulator- und Strukturregionen des Proteinasegens wurde bestimmt. Die Funktionalität der Regulatorregion wurde durch Verschmelzen der hypothetischen Promotorsequenz und der Ribosomenbindungsstelle mit dem verkürzten E. coli-β-Galactosidasegen (lacZ) des Plasmids pMC1403 bestimmt. Diesem Plasmid fehlte die Promotorregion, die Ribosomenbindungsstelle und die acht aminoterminalen Aminosäuren des lacZ-Gens. Das aminoterminale Ende der gereinigten SK11-Zellwand-Proteinase wurde anschließend bestimmt. Dies wurde mit der Aminosäuresequenz verglichen, die sich von der DNA-Sequenz des Strukturgens ableitete.

J) Kopplung des Proteinase-Promotors an die genetische Information von Prochymosin

Die Regulatorregion des Proteinasegens des Stammes S. cremoris SK11 wurde anschließend mit der genetischen Information von Prochymosin gekoppelt. In dem konstruierten Plasmid wurde ein Prochymosin-Fusionsprotein nach Expression der genetischen Information in einem geeigneten Wirt produziert.
Indem das Plasmids mit einem Ursprung der Replikationsregion versehen wurde, die von Milchsäure-Streptokokken stammt, war es möglich, die Synthese dieses Prochymosin- Fusionsproteins in S. lactis zu steuern.

K) Nachweis der Chymosin-Synthese durch Milchsäurebakterien

Dies erfolgte mittels eines immunologischen Screening- Verfahrens (Western Blot). Hierzu wurde der Inhalt eines Zellextraktes von S. lactis (intrazelluläres Prochymosin) oder der Überstand einer S. lactis-Kultur (extracelluläres Prochymosin) über ein SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert und anschließend auf ein Nitrocellulosefilter übergeführt (Blotting). Das Filter wurde mit Antikörpern gegen Chymosin inkubiert, und der Antigen/Antikörper- Komplex konnte durch eine enzymatische Reaktion sichtbar gemacht werden. Sowohl der qualitative als auch quantitative Nachweis und die Identifizierung des synthetisierten Produkts sind mit Hilfe dieses Verfahrens möglich.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

A) Isolierung von Messenger-RNA

Das mucosale Gewebe einer Reihe von Labmägen von Kälbern, die etwa 1-2 Wochen alt und gerade geschlachtet worden waren, wurde abgekratzt und sofort danach weiterverarbeitet oder bei -80ºC eingefroren. Das Gewebe wurde anschließend zum Schutze der mRNA gegen RNasen in einer Lösung von Guandiniumthiocyanat aufgenommen (Chirgwin J.M. et al., Biochemistry 18, (1979), Seiten 5294-5299), und in einem Potter-Homogenisator pulverisiert. Das Homogenat wurde in einem Sorvall-GSA-Rotor bei 10 000 upm 20 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 0,025 Volumen 1 M Essigsäurelösung und 0,75 Volumen absolutem Ethanol vermischt und über Nacht bei -20ºC stehen gelassen. Die ausgefällte Nukleinsäure wurde durch Zentrifugation in einem Sorvall-GSA-Rotor bei 10 000 upm 30 Minuten lang bei 4ºC sedimentiert. Das Pellet wurde in einer Lösung von Guanidinhydrochlorid aufgenommen und die RNA durch Zugabe von 0,025 Volumen 1 M Essigsäure und 0,5 Volumen Ethanol ausgefällt. Das Gemisch wurde bei -20ºC wenigstens 3 Stunden lang stehengelassen. Nach 20minütigem Zentrifugieren in einem Sorvall-SS34-Rotor bei 15 000 upm bei 4ºC wurde der Guanidinhydrochlorid-Schritt noch einmal wiederholt und das zuletzt erhaltene RNA-Produkt einer Chromatographie über Oligo-dT-Cellulose unterzogen (Aviv, H. und Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, (1972), Seiten 1408-1412). Die RNA-Präparation wurde in einem geeigneten Puffer (0,5% SDS, 0,5 M NaCl, 0,01 M EDTA, 0,01 M Tris-HCl, pH = 7,4) in einer Konzentration von 2 mg/ml aufgelöst, an die Säule gebunden und mit Elutions-puffer (0,5% SDS, 0,01 M Tris-HCl, pH = 7,4) eluiert. Die poly-A-haltigen mRNA-Fraktionen wurden mit Alkohol ausgefällt. Die Reinigung durch Chromatographie über die Oligo-dT-Cellulose-Säule wurde noch einmal wiederholt. Bevor die mRNA-Präparation als Vorlage für die in-vitro-DNA-Synthtese verwendet wurde, wurde ein zellfreier Extrakt aus Kaninchen-Retikulozyten (Pelham, J. und Jackson, R.:, Eur. J. Biochem. 67. (1976), Seiten 247-256) mit mRNA inkubiert, um zu gewährleisten, daß die (Prepro)-Chymosin-mRNA-Moleküle in den isolierten mPNA-Fraktionen vorhanden waren. Unter dem Einfluß der mRNA-Fraktion wurde ein Protein mit einem Molekulargewicht von 40 000 D, was die erwartete Größe von Prochymosin darstellt, in einem zellfreien System synthetisiert. Um zu bestätigen, daß es sich bei dieser Bande um Prochymosin handelt, wurde das Translationsgemisch in vitro mit einem Antiserum gegen Chymosin inkubiert. Nur die 40 000-D-Bande wurde durch das Antiserum ausgefällt.

B) Synthese von Copy-DNA

Die gesamte mRNA-Präparation wurde mit Hilfe des Enzyms reverse Transcriptase aus dem Myeloblastosevirus von Vögeln (AMV) durch das von Ulrich, A. et al. beschriebene Verfahren, Science 196, (1977), Seiten 1313-1319, in Copy-DNA umgewandelt. 10 ug Oligo-dT-Primer wurden zu 10 ug Gesamt-mRNA gegeben, kurz auf 90ºC erhitzt und sofort auf Eis gestellt. Desoxynukleosidtriphosphate (alle vier) wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben, worauf sich die Zugabe von 60 Einheiten RNasin (Promega) und 50 uCi α-32P-dATP in einem Puffer mit einer Endkonzentration von 40 mM KCl, 6 mM Mgcl&sub2; und 50 mM Tris-HCl, pH = 8,3, anschloß. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 Einheiten reverser Transkriptase (AMV) gestartet, und die Inkubation wurde 1 Stunde lang bei 40 ºC durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 20 mM gestoppt und mit NaOH auf 50 mM gebracht, um die RNA in dem RNA-DNA-Doppelstrang abzubauen. Nach einer einstündigen Inkubation bei 65ºC wurde die Lösung durch Zugabe von Tris-HCl, pH = 8,0, bis zu einer Endkonzentration von 250 mM und von HCl bis 0,25 N neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Phenol/ Chloroform extrahiert,: und die freien nicht eingebauten Triphosphate wurden durch Gelfiltration über Sephadex G-50 entfernt. Die einzelsträngige Copy-DNA wurde anschließend mit Alkohol ausgefällt. Der zweite DNA-Strang wurde mit Hilfe des Enzyms DNA-Polymerase I (15 Einheiten) in Gegenwart von 25 uCi α-P32-dATP und Desoxynukleosidtriphosphaten in einer Endkonzentration von 250 uM in einem Reaktionspuffer mit einer Endzusammensetzung von 100 mM K-Phosphat, pH = 6,9, 5 mM DTT und 10 mM MgCl&sub2; synthetisiert. Das Gemisch wurde 3 bis 4 Stunden lang bei 15ºC inkubiert. Nach einer Phenol/Chloroform-Extraktion und Sephadex G-50- Gelfiltration wurde der DNA-Doppelstrang mit Ethanol ausgefällt. Die Haarnadelschleife in dem DNA-Doppelstrang wurde mit Hilfe des Enzyms Nuklease S1 gespalten. Zu diesem Zweck wurde die ausgefällte DNA in S1-Puffer (30 mM Na-Acetat, pH = 4,5, 250 mM NaCl, 1 mM ZnSO&sub4; und 5% Glycerin) und 10-20 Einheiten S1-Enzym aufgenommen. Nach 45 Minuten bei 35ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 20 mM gestoppt. Die doppelsträngige Copy-DNA wurde anschließend der Größe nach durch Chromatographie über Sepharose C1-4B in einem Puffer fraktioniert, der 10 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 300 mM NaCl und 1 mM EDTA enthielt. Nur diejenigen Fraktionen mit den Copy-DNA-Molekülen mit einer Länge von über 500 Basenpaaren wurden mit Alkohol ausgefällt.

C) Tailing und Transformation

Das Enzym terminale Desoxynukleotidyl-Transferase katalysiert das stufenweise Anhängen von Desoxynukleosidtriphosphaten an das 3'-Ende der Polynukleotidketten und wird häufig zur Klonierung doppelsträngiger DNA-Kopien von mRNA verwendet. Polycytidyl- Reste wurden an das 3'-Ende der cDNA-Moleküle in einem Reaktionsgemisch polymerisiert, welches 200 mM K-Cacodylat, pH 7,2, 0,1 mM DTT, 0,1 mM CoCl&sub2;, 0,1 mM dCTP und 12,5 uCi 3H-dCTP enthielt. 10 Einheiten terminale Transferase wurden hinzugegeben, und das Gemisch nach einer 30minütigen Phenol/Chloroform-Extraktion bei 37ºC einer Sephadex G-50-Chromatographie und einer Fällung mit Alkohol wie oben beschrieben unterzogen.
10 ug des Plasmids pUC9 (Vieira, J. und Massing, J., Gene 19 (1982), Seiten 259-268) wurden mit dem Restriktionsenzym PstI verdaut und mit Polyguanidyl- Resten wie oben beschrieben versehen, jedoch mit der Maßgabe, daß dGTP (+ 3H-dGTP) anstelle von dCTP verwendet wurde. Nach 1, 2, 5, 10, 15 und 30 Minuten wurden Proben entnommen und ihre eingebaute Radioaktivität mittels Trichloressigsäure-Fällung bestimmt. Der Rest der Probe, in dem die 15 bis 20 dG-Reste pro Terminus hinzugegeben werden, wurde für die Annealing- Reaktion verwendet. Etwa dieselben Menge Copy-DNA mit dC-Schwänzen und der Klonierungsvektor pUC9, versehen mit dG-Schwänzen, wurden in einem Annealing-Puffer vermischt (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,7, und 1 mM EDTA), bei 68ºC 5 Minuten lang erhitzt, und nach 3 Stunden bei 57ºC wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt. Die rekombinanten DNA-Moleküle wurden anschließend in den E. coli-Stamm JM 83 transformiert (Vieira, J. und Messing, J., Gene 19, (1982), Seiten 259-268). Die transformierten Bakterien wurden auf LB-Agarplatten, die 100 ug/ml Carbenicillin und 40 ug/ml X-gal enthielten, ausplattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Nur die Bakterien, die keinerlei blaue Färbung zeigten, enthielten das Plasmid pUC9, versehen mit einer Copy-DNA-Insertion. Etwa 2 000 Klone wurden erhalten und noch auf die Chymosin-Sequenzen analysiert.

D) Isolierung der Chymosin-Klone

Jeder einzelne Klon, der rekombinante DNA enthielt, wurde auf eine neue LB-Agarplatte (+ 100 ug/ml Carbenicillin) übergeführt, die über Nacht bei 37ºC inkubiert wurde. Die Kolonien wurden auf einen GENE- SCREEN-PLUS-Transfermembran (NEN-Dupont) übergeführt, mit Alkali lysiert und anschließend mit 1 M Tris-HCl, pH = 7,5, neutralisiert, was zuerst von Benton, W.D. und Davis, R.W., Science, 196, (1977), 180-182, beschrieben wurde. Sowohl die chromosomale DNA als auch die rekombinate Plasmid-DNA binden an die Membran. Die getrockneten Filter wurden anschließend in einer 6·NET-Lösung (1·NET: 150 mM NaCl, 15 mM Tris-HCl, pH = 8,3, und 1 mM EDTA), 10·Denhardt-Puffer (1·Denhardt, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA und 0,02% Polyvinylpyrrolidon) und 0,1% SDS 4-6 Stunden bei 65ºC vorhybridisiert.
Die Hybridisierung fand in demselben Puffer statt, zu dem eine markierte Probe gegeben wurde. Die verwendete Probe, 5' TGGTGCCTGTTCATC 3', ist zu der Nukleotidsequenz 602-616 von Kälber-Preprochymosin komplementär, wie von Harris, T. et al., Nucl. Acids Research, 10, (1982), Seiten 2177-2187, veröffentlicht. Eine Probe von 100 Picomol wurde in Gegenwart von 50 uCi γ-32-P-dATP und 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase in einem Puffer, der 70 mM Tris-HCl, pH = 7,6, und 10 mM Mgcl&sub2; enthielt, 45 Minuten lang bei 37ºC phosphoryliert. Die markierte Sonde wurde zu dem Hybridisierungsgemisch gegeben und über Nacht bei 40ºC inkubiert. Die Filter wurden in 6· SSC (1·SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Na-Citrat) + 0,1% SDS gewaschen, getrocknet und anschließend einer Autoradiographie unterzogen, um diejenigen Kolonien zu lokalisieren, die mit der Chymosin-spezifischen Sonde hybridisierten. Von insgesamt etwa 2 000 Klonen wurden 11 positive Transformanten erhalten, die die Chymosinsequenzen enthielten.

E) Charakterisierung der Chymosin-Plasmid-DNA

Die Plasmid-DNA wurde im Labormaßstab aus sämtlichen der 11 positiven Klone durch das von Ish Horowitz, D. und Burke, J., Nucleic Acids Research, 9, (1981), Seiten 2989-2998, beschriebene Verfahren isoliert. Die Größe der isolierten Chymosin-cDNA wurde durch Verdau mit den Restriktionsenzymen HindIII und SalI, gefolgt von einer Analyse über 1% Agarosegelen, bestimmt. Die Insertionsgröße variierte zwischen 800 und 1 300 Basenpaaren. Nur diejenigen Klone mit den größten Inserts (etwa 1 300 bp), pNZ400-5 und pNZ400-6 genannt, wurden weiter getestet. Die Plasmid-DNA der zwei Klone wurde isoliert und mit verschiedenen Restriktionsenzymen (siehe Restriktionskarte in Fig. 1) geschnitten, um die Position einer Reihe von Schnittstellen zu bestimmen, die zur Subklonierung in M13 mp10/mp11-DNA (Messing, J. et al., Nucl. Acids, Res. 9, (1981), Seiten 309-321) zur Bestimmung der DNA-Sequenz verwendet werden. Die Nukleotidsequenz wurde mit dem Didesoxy-Kettenterminationsverfahren, das von Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, (1977), Seiten 5463-5467, entwickelt wurde, bestimmt.
Gleichzeitig wurde zur Bestimmung der DNA-Sequenz das Sequenzierungsverfahren der doppelsträngigen DNA herangezogen, das von Chen, R. und Seeburg, P., DNA 4., (1985), Seiten 165-170, entwickelt und zur Verwendung des Enzyms reverse Transkriptase von Graham, A. et al., FOCUS 8, (1986), Seiten 4-5, angepaßt wurde. DNA-Primer, die zur Sequenzbestimmung verwendet wurden, wurden mittels eines SAM-ONE-Synthesiziers (New Brunswick Scientific) ohne weitere Reinigung bestimmt. Das Ergebnis der DNA-Nukleotidsequenz-Bestimmung ist in Fig. 2 dargestellt. Die obige Aminosäuresequenz entspricht der Sequenz der Chymosin-B-Form, die von Foltmann, B. et al., J. of Biol. Chem. 254, (1979), Seiten 8447-8450, veröffentlicht wurde.

G) Lage des Proteinasegens in dem Stamm S. cremoris SK11

Der S. cremoris SK11-Stamm SK112 (der beim Central Bureau for Mould Cultures, The Netherlands, unter der Nr. CBS 349.87 hinterlegt ist) enthält drei Plasmide namens pSK111, pSK113 und pSK118 mit den Molekulargewichten 48, 28 bzw. 6 Mdal. Indem diese Zellen in Gegenwart von Acriflavin (Konzentration 5 ug/ml) gezogen werden, war es möglich, ein Verschwinden des Plasmids pSK111 aus der Kultur zu ermöglichen, was Kurierung genannt wurde, und zu dem Stamm SK1128 führte. Dieser Stamm zeigte jedoch keinerlei proteolytische Aktivität.
Die Tatsache, daß pSK111 für die Proteinaseaktivität kodiert, wurde außerdem durch Konjugationsexperimente bewiesen. Der Transfer von pSK112 in einen proteinasedefizienten Stamm führte zur Produktion von Proteinaseaktivität (Vos, W.M. de, FEMS Microbiol. Letters 23, (1984), Seiten 175-179, Vos, W.M. de and Davies, F.L., Third European Congress on Biotechnology, Verlag Chemie, 3, (1984), Seiten 201-206.)

H) Klonierung des S. cremoris-SK112-Proteinasegens

Plasmid-DNA wurde gemäß dem von Anderson, D.G., und McKay, L.L., Appl. Environ. Microbiol. 46, (1983), S. 549, beschriebenen Verfahren, aus S. cremoris SK112 isoliert. Die einzelnen Plasmide wurden durch Elektrophorese von etwa 50 ug Plasmid-DNA über ein 1%iges Niedertemperatur-Gelierungsagarosegel (LGT) (Biorad) aufgetrennt. Das 78-kb-Plasmid pSK111 wurde ausgeschnitten und nach der Anleitung des Herstellers der LGT-Agarose verarbeitet. Die pSK111-DNA wurde unter Bedingungen eines teilweisen Verdaus mit Sau3A in Fragmente von etwa 10-15 kb verdaut, die anschließend in die BamHI-Schnittstelle des Bakteriophagenvektors EMBL3 in E. coli Q359 kloniert wurden (Frischauf, H. et al., J. Mol. Biol. 170, (1983), S. 827). Etwa 100 rekombinante Phagen, die sich in diesem Wirt (spi-) vermehren können, wurden auf die Produktion von Proteinase mit Hilfe eines sogenannten Genexpressionskits (Boehringer) geprüft. Hierzu wurden Antiproteinase-Antikörper verwendet, die durch Immunisierung eines Kaninchens mit Zellwandproteinase, isoliert aus S. cremoris SK112 (Hugenholtz, J. Appl. Environ. Microbiol. 48, (1984), S. 1105), produziert worden waren. Die Insertions-DNA, die in 5 rekombinanten Phagen vorhanden war, die in E. coli zur Synthese von Proteinase führte, wurde isoliert und mit Hilfe geeigneter Restriktionsenzymverdaus charakterisiert. Verschiedene Restriktionsenzym-Fragmente wurden aus der in diesen Phagen klonierten pSK111-DNA isoliert und anschließend mit Hilfe von Lactobacillusspezifischen Vektoren in dem proteinasedefizienten S. lactis-Stamm MG1363 (Gasson, M.J., J. Bacteriol. 154, (1983), S. 1) kloniert, wie ausführlicher beschrieben von Vos, W.M., in Molecular Engineering in the European Community, E. Magnien Hrsg. (1986), Seiten 465-472, M. N&ijlig;hoff, Dordrecht. Die physikalischen Karten der verwendeten Vektoren sind in Fig. 3 gezeigt. Sämtliche Plasmidvektoren basieren auf dem Vektor pNZ12, der das pSH71-Replikon enthält, das zur Replikation in Milchsäurebakterien, wie S. lactis und L. casei sowie in E. coli, B. subtilis und S. aureus (siehe de Vos, W.M. und Simons, A.F.M., EP-A-86 202 061.7) in der Lage ist. Das Plasmid pNZ121 wird durch Veränderung der Orientierung des 2,7 kb-TagI-Fragments, das die Cm- und Km-Resistenzgene enthält, konstruiert. Durch Entfernen des Km-resistenten Gens aus pNZ121 mittels eines Verdaus mit SalI und MspI, wodurch das Fragment unter Verwendung von Klenow-Polymerase und Zirkularisierung mit T4-Ligase, mit glatten Enden versehen wurde, wurde das Plasmid pNZ122 konstruiert.
Sämtliche Plasmidderivate enthalten eine einzigartige SalI-Restriktionsenzym-Schnittstelle und besitzen denselben Wirtsbereich wie pNZ12. Während jedoch pNZ12 sich mit einer hohen Kopienzahl in Milchsäurebakterien repliziert, besitzen pNZ112 und pNZ122 eine niedrige Kopienzahl in diesen Bakterien. Es wurde beim Klonieren des SK112-Proteinasegens gefunden, daß nur die Vektoren pNZ112 und pNZ122 mit niedriger Kopienzahl in der Lage sind, das intakte Gen mit den Regulatorregionen in S. lactis MG1363 beizubehalten. Eines dieser rekombinanten Plasmide wird pNZ511 genannt und besteht aus einem Fragment von etwa 6-kb, das mit SalI-Schnittstellen versehen ist und für die Proteinase-Produktion kodiert, die in dem Vektor pNZ122 kloniert ist (siehe Fig. 4). pNZ511 war in der Lage, die Proteinase- Defizienz von S. lactis MG1363 (Wildtyp-Wachstum in Milch) vollständig zu komplementieren und kodierte für eine Proteinaseaktivität, die vollständig in das Medium sezerniert wurde und dieselbe Spezifität relativ zu α-, β- und k-Casein wie S. cremoris SK112-Proteinase besaß. Die Richtung des Proteinasegens und die Position der Regulatorregion dieses Gens wurden durch Deletionsstudien des 6-kb-Inserts in pNZ511 bestimmt (für genaue Angabe siehe de Vos, W.M. in Biomolecular Engineering in the European Community, E. Magnien, Hrsg. (1986), Seiten 465-472, M. N&ijlig;hoff, Dordrecht).
Erwähnenswert ist, daß die Proteinase, kodiert von pNZ511, vollständig von S. lactis sezerniert wurde. Dem Fachmann ist klar, daß dies bedeutet, daß das Proteinasegen Sequenzen enthält, die zur Sekretion notwendig sind, und daß diese Sequenzen zur Entwicklung der sogenannten Sekretionsvektoren verwendet werden können.

I) Bestimmung der DNA-Nukleotidsequenz der Regulatorregion und der Strukturregion des Proteinasegens des Stammes S. cremoris SK112

Plasmid pNZ511 wurde mit dem Restriktionsenzym ClaI verdaut, und das kleine 400-bp-Fragment wurde über ein 1%iges Agarosegel mittels Elektroelution isoliert. Dieses ClaI-Fragment wurde anschließend mit M13-mp10-DNA ligiert, die mit dem Restriktionsenzym AccI geschnitten worden war. Einzelsträngige Phagen-DNA von weißen Plaques wurde, wie von Messing, J. et al., Nucl. Acids Res. 9, (1981), Seiten 309-321, beschrieben, isoliert, und die DNA-Nukleotidsequenz wurde durch das Verfahren von Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. 74, (1977), Seiten 5463-5467) bestimmt. Das Ergebnis ist in Fig. 5 dargestellt. Das Fragment ist sehr reich an AT (73%) und zeigt eine Reihe interessanter Eigenschaften. Die Basensequenzen, die ausgedehnte Homologien mit der Konsensus-Promotorsequenz für Bacillus subtilis und Escherichia coli zeigen und aus einer -35-Region: TTGACA und einer -10-Region: TATAAT, wie beschrieben von Hawley, E. und McClure, W., Nucl. Acids Res. 11, (1983), Seiten 2237-2255, bestehen, können in beiden Strängen identifiziert werden. Das Vorliegen von 5 aufeinanderfolgenden TATAAT-Boxen ist erwähnenswert. Ferner sind eine Reihe direkter und umgekehrter Wiederholungssequenzen mit einer Länge von 10 bis 15 Nukleotiden und sogar eine palindromische Sequenz von 20 Nukleotiden in dieser TATAAT-Region nachweisbar. Diese Region ist außerdem in der Lage, eine stabile Haarnadelschleifenstruktur mit einem Stamm von 14 Nukleotiden und einem AG-Wert von 15,2 kcal (Fig. 6) zu bilden. Stromabwärts von dieser TATAAT-reichen Region sind zwei ATG-Startkodons nachweisbar. Insbesondere geht dem zweiten ATG-Kodon eine Basensequenz voran, die eine ausgedehnte Komplementarität mit dem 3'-Ende der 16S-rRNA von Streptococcus lactis zeigt, die unlängst von Ludwig. W. et al., J. of General Microbiology 131, (1985), Seiten 453-551, bestimmt worden ist. Diese Shine- und Dalgarno- Domäne (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71; (1974), Seiten 1342-1346) besitzt einen AG-Wert von -14,4 kcal.
Die Basensequenz stromaufwärts und stromabwärts von dem ClaI-Fragment wurde durch Klonieren des stromabwärts gelegenen ClaI-SalI-Fragments (siehe Fig. 4) in geeigneten überlappenden Restriktionsenzym-Fragmenten in M13-mp10/mp11-DNA und dem etwa 700 Basenpaare stromaufwärts gelegenen ClaI-SalI-Fragment (siehe Fig. 4) in der M13-mp10-DNA, geschnitten mit AccI/SalI und dargestellt in Fig. 7a, 7b, bestimmt. Aus dieser Sequenz ist ebenfalls klar, daß auf die stromaufwärts gelegene postulierte Promotorsequenz auch ein ATG-Startkodon und eine Basensequenz folgen, die eine extensive Komplementarität mit dem 3'-Ende von 16S-rRNA aufweist und einen AG-Wert von -11,6 kcal besitzt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz sowohl des stromabwärts als auch des stromaufwärts gelegenen offenen Leserahmens zeigt für jeden Fall eine große Entsprechung mit einem Signalpeptid, das für sezernierte Proteine charakteristisch ist (Watson, M., Nucl. Acids Res. 12, (1984), Seiten 5145-5164 und Heyne, G. von. J. Mol. Biol. 184, (1985), Seiten 99-105).
Im Falle des offenen stromabwärts gelegenen Leserahmens befindet sich eine mögliche Signalschnittstelle zwischen Aminosäure 33 und 34 (Ala↓Ala), während im Falle des stromabwärts gelegenen Leserahmens diese sich sehr wahrscheinlich zwischen dem Rest 34 und 35 (Ala↓Thr) befindet. Ferner wurde ein Gasphasensequenzer (Applied Biosystems) zur Bestimmung des aminoterminalen Endes der SK112-Proteinase eingesetzt, die aus der Zellwand gereinigt worden war, gemäß einem von Exterkate, F. und De Veer beschriebenen Verfahren, Appl. Environ. Microbiol. 49, 328-332 (1985). Die Präparation wurde über ein SDS-Polyacrylamid-Gel gemäß Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970) analysiert und gemäß einem von Kerckhove, J. van den et al., Eur. J. Biochem. 152, 9-19 (1986) beschriebenen Verfahren geblottet. Die erhaltene Aminosäuresequenz lautete: Asp-Ala-Lys-Ala-Asn-Ser-Meth- Ala-Asn-Val. Diese Aminosäuresequenz befindet sich an Position 188-197 der Proteinsequenz, die sich von der DNA-Sequenz ableitet. Es kann daraus geschlossen werden, daß die SK112-Proteinase sehr wahrscheinlich als Pre-Pro-Protein in Analogie zu den Serin-Proteasen aus B. subtilis (Jacobs, M. et al., Nucl. Acids Res. 13, 8913, 8926 (1985) synthetisiert wird. Die Funktionalität dieser vermuteten Promotorsequenz und Ribosomen- Bindungsstelle des stromabwärts gelegenen offenen Leserahmens wurde in E. coli durch lacZ-Fusionen gezeigt. Doppelsträngige replikative DNA des rekombinanten M13-Phagen, in den das einzigartige ClaI-Proteinase- Fragment des Stamms S. cremoris SK11 inseriert worden ist, wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut. Mit Hilfe des Enzyms DNA-Polymerase I (Klenow) wurden die überstehenden Enden aufgefüllt, worauf sich ein Verdau mit dem Restriktionsenzym BamHI anschloß. Das so erhaltene glattendige BamHI-Fragment wurde anschließend mit dem Plasmid pMC1403 ligiert (Casadaba, M. et al., J. of Bact. 143, (1980), das mit den Restriktionsenzymen SmaI und BamHI gemäß den Vorschriften des Herstellers geschnitten wurde. Kompetente Escherichia coli-MC1060- Zellen wurden mit dem Ligationsgemisch transformiert, und eine große Anzahl blauer Kolonien wurde erhalten. In allen blauen Transformanten schien das ClaI-Proteinase- Fragment in Phase mit dem lacZ-Gen des Plasmids pMC1403 gekoppelt zu sein. Eine β-Galctosidase-Aktivität von etwa 15 umol/mg Protein, gemessen gemäß einem Verfahren, beschrieben von Miller, J. (1972) in Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press N.Y., wurde nachgewiesen. E. coli-Zellen, die mit dem rekombinanten Plasmid (genannt pNZ290) transformiert wurden, führten zur Synthese eines (3-Galactosidase- Fusionsproteins, das etwa 5% der gesamten zellulären Proteinsynthese ausmacht (Fig. 8).
Um die Synthese dieses β-Galctosidase-Fusionsproteins unter der Kontrolle des stromabwärts gelegenen Proteinase-Promotors in Streptococcus lactis zu prüfen, wurde das Plasmid pNZ290 mit einem Ursprung der Replikation ausgestattet, der spezifisch für die für Milchsäure-Streptococcen spezifisch ist, ausgestattet. Gleiche Mengen von linearisierter (Inkubation mit dem Restriktionsenzym SalI) pNZ290-DNA und linearisierter pNZ121-DNA (Fig. 3) wurden in Gegenwart des Enzyms T4-Ligase inkubiert und gemäß dem von Gasson, M., FEMS Microbiology Letters 9, (1980), Seiten 99-102 und Wright, A. von et al., Appl. and Environ. Microbiol. 50, (1985), Seiten 1100-1102, beschriebenen Verfahren in S. lactis-MG1363-Protoplasten transformiert.
Transformanten wurden auf β-Galctosidase-Aktivität getestet, und positive Transformanten waren in der Lage, ein β-Galctosidase-Fusionsprotein mit einer Aktivität von ±3 umol/min/mg Protein, gemessen gemäß einem vorstehend beschriebenen Verfahren, zu synthetisieren.

J) Fusion des Proteinase-Promotors mit der genetischen Information von Prochymosin

Fig. 9a zeigt schematisch die Konstruktion eines Plasmids zur Expression von Prochymosin. Das Prochymosin- Expressionsplasmid pNZ450 wurde durch Inkubation des Plasmids pNZ290 mit dem Restriktionsenzym BamHI, Behandeln von diesem mit dem Enzym DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart von nur 3 Desoxynukleosiden, insbesondere dATP, dGTP und TTP, und anschließend durch eine Behandlung mit Mungobohnen-Nuk1ease, um den verbleibenden G-Rest zu entfernen konstruiert, mit dem Ergebnis, daß ein glattes Ende erzeugt wurde. Sämtliche enzymatischen Reaktionen wurden unter den vom Hersteller beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Das erhaltene lineare Fragment wurde anschließend mit dem Restriktionsenzym SalI inkubiert, und das kleinste DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 4,0 kb wurde nach Fraktionierung über ein 1%iges Agarosegel mittels Elektroelution isoliert. Die Prochymosin-haltige pNZ400-5-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut, mit dem Enzym DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart von nur 3 Desoxynukleosiden, insbesondere dATP, dGTP und TTP, behandelt, worauf sich die Behandlung mit Mungobohnen- Nuklease, wie vorstehend beschrieben, anschloß. Dieses Gemisch wurde sodann mit dem Restriktionsenzym EcoRI inkubiert, und der kleine aminoterminale 460-Basenpaar- Abschnitt von Prochymosin wurde durch Fraktionierung über ein 4%iges Polyacrylamid-Gel und anschließend mittels Elektroelution isoliert.
Sowohl das 4,0-kb-Proteinase-Promotor-Fragment als auch die beiden ghymosin-Fragmente (0,5 bzw. 0,8 kb) wurden mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase miteinander ligiert. Nach Transformation des Ligationsgemisches in den E. coli-Stamm MC1061 wurde die Sequenz einer Reihe von ausgewählten Transformaten bestimmt, um die korrekte Transformation der verschiedenen Fragmente zu bestätigen. Ein Koppeln in Phase zwischen dem Leserahmen des Proteinasegens und der A7-Prochymosin-Information scheint in dem Plasmid pNZ450-27 zustandegekommen zu sein (siehe Fig. 10). Plasmid pNZ450-27 wurde mit dem Restriktionsenzym SalI inkubiert und mit der linearen pNZ12-DNA (siehe Fig. 3), die nach Inkubation mit dem Enzym Sall erhalten worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde gemäß einem von Gasson, M., FEMS Microbiology 9, (1980), Seiten 99-102 und Wright, A. von et al., Appl. and Environ. Microbiol. 50 (1985), Seiten 1100-1102 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Ausgewählte chimäre DNA-haltige Transformanten, pNZ410 genannt (Fig. 9a), wurden mittels Western Blot auf die Prochymosin-Synthese getestet.
Fig. 9b ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines Plasmids zur Sekretion von Prochymosin. Das Prochymosin-Sekretionsplasmid pNZ470 wurde konstruiert, indem zuerst das 0,57-kb-MaeII-Fragment subkloniert wurde, das die vollständige SK11-Proteinase-Promotorsequenz (Position 54, Fig. 5) und die ersten 94 aminoterminalen Aminosäuren des Proteinasegens (Position 761, Fig. 7a) aus pNZ511 an der Accl-Schnittstelle von pUC9 enthielt, was zu pNZ580 führt (siehe Fig. 9b). Das 0,48-kb-DNA-Fragment, das nach einem doppelten Verdau mit EcoRI/PstI von pNZ580 erhalten worden war, wurde mittels Elektroelution nach Fraktionierung über ein 1%iges Agarosegel isoliert. Dieses Fragment enthält die vollständige Regulatorsequenz des SK11-Proteinasegens bis Aminosäure 62. Anschließend wurde dieses Fragment mit dem Enzym Fnu 4HI inkubiert. Dieses Fragment besaß mehr Fnu 4HI-Schnittstellen, jedoch befindet sich die erste Fnu 41 HI-Schnittstelle zwischen den Aminosäuren 33 und 34 von dem 5'-Ende (Position 578 in Fig. 7a). Anschließend wurden das doppelsträngige DNA-Fragment
5' G GCT GAG ATC ACC AG
CGA CTC TAG TGG TC CTAG
und die beiden Chymosin-DNA-Fragmente (Größe: 0,5 kb und 0,8 kb, siehe Fig. 9a) mit dem 0,39-kb-DNA-Fragment mittels des Enzyms T4-DNA-Ligase ligiert. Das synthetische DNA-Fragment kodiert für die ersten 6 aminoterminalen Aminosäuren von Prochymosin. Das resultierende 1,7-kb-Fragment wurde sodann mit dem Vektor pMC1403 ligiert (Casadaban Metal J. of Bact. 143, 1980, 971-980), der mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SalI geschnitten und in den E. coli-Stamm MC1061 transformiert wurde. Das erhaltene Plasmid pNZ470 der Prochymosin-Information wurde in Phase mit Aminosäure 33 des Proteinasegens gekoppelt.
Plasmid pNZ470 wurde noch mit dem Restriktionsenzym SalI inkubiert und mit linearem pN12, erhalten nach Inkubation mit Sall, ligiert. Das Ligationsgemisch pNZ870 wurde in dem S. lactis-Stamm MG1368 gemäß einem vorstehend beschriebenen Verfahren transformiert, und die Transformanten wurden auf eine Prochymosin-Sekretion mittels eines Western Blots getestet.

L) Western Blot

Eine logarithmisch wachsende Kultur des Stammes S. lactis MG1363, die pNZ410 in Ml7-Medium + Glucose (0,5%) + Chloramphenicol (10 ug/ml) enthielt, wurde abzentrifugiert und in einem Puffer aufgenommen, bestehend aus 15% Saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,0 und 10 mg/ml Lysozym, und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Ein identisches Volumen von 2·SDS-Probenpuffer (Laemmli, U., Nature 227, (1970), Seiten 680-685) wurde zugegeben und 10 Minuten lang in einem siedenden Wasserbad erhitzt. Nach Analyse über ein 12,5%iges Polyacrylamid-Gel gemäß Laemmli und anschließendem Blotten auf ein Nitrocellulosefilter wurde das Filter mit Antikörpern gegen Chymosin inkubiert. Das Filter wurde anschließend mit Peroxidase-markierten Ziegen- Antikaninchen-Antikörpern inkubiert und mit 4-Chlor-1- naphthol gemäß einem vom Hersteller beschriebenen Verfahren (BRL) inkubiert. Es war eine deutliche Färbung einer Proteinbande mit einem Molekulargewicht von 40 000 D in einem S. lactis-MG1363-Lysat, das das Plasmid pNZ410 enthielt, sichtbar, im Vergleich zu einem Lysat, das Plasmid pNZ12 enthielt. Diese Bande besitzt eine etwas langsamere Wanderungsgeschwindigkeit in dem SDS-Gel (analytische Qualität) als das reife Chymosin (Fig. 11).
Eine logarithmisch wachsende Kultur des Stammes S. lactis MG1363, die pNZ870 in einem Medium enthielt, bestehend aus 5% UF-Molkepermeat + Casiton (1%) + J3-Glycerophosphat (1,9%) + Chloramphenicol (10 ug/ml), wurde abzentrifugiert, und der Überstand wurde 16 Stunden in bidestilliertem Wasser dialysiert. Nach Lyophilisieren des Dialysats und Aufnehmen des trockenen Materials in einem Puffer wurde eine Menge entsprechend 1 ml Überstand über ein 12,5%iges Polyacrylamidgel gemäß Laemmli analysiert. Nach dem Blotten auf ein Nitrocellulosefilter wurde das Filter mit Antikörper gegen Chymosin inkubiert. Das Filter wurde sodann mit Peroxidase-markierten Z iegen-Antikaninchen-Antikörpern inkubiert und mit 4-Chlor-1-naphthol angefärbt. Eine deutliche Färbung einer Proteinbande einer exakten Größe von Chymosin wurde im Überstand einer S. lactis-MG1363- Kultur sichtbar, die das Plasmid pnZ870 enthielt.

LEGENDEN

Fig. 1 Karte des Restriktionsenzymverdaus des klonierten Prochymosin-Inserts.
Fig. 2 DNA-Sequenz von kloniertem Chymosin und der sich davon ableitenden Aminosäuresequenz.
Fig. 3 physikalische Karte der Plasmide pSH71, pNZ121, pNZ122 und pNZ12.
Fig. 4 physikalische Karte des Plasmids pNZsl1; dieses Plasmid wurde nach Klonierung des Proteinase- Fragments von 6 kb in den Vektor pNZ122 erzeugt.
Fig. 5 DNA-Sequenz des ClaI-Fragments des Proteinasegens von Streptococcus cremoris SK112, kloniert in die AccI-Schnittstelle von M13 mp10.
Fig. 6 Haarnadelschleifenstruktur in der Promotorregion.
Fig. 7a DNA-Sequenz des stromabwärts gelegenen ClaI-SalI-Framgents des Proteinasegens von pSK111 von S. cremoris SK112.
Fig. 7b DNA-Sequenz des stromaufwärts gelegenen ClaI-SalI-Fragments des Proteinasegens von pSK111 von S. cremoris SK112.
Fig. 8 Polyacrylamid-Gel von Zelllysaten, die das Plasmid pMC1403 (2 und 3) und pNZ290 (4-7) enthalten.
Spur 1 : 5 ug β-Galctosidase.
Fig. 9a schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmiden, die zu der Synthese von Prochymosin führen (pNZ450 und pNZ410).
Fig. 9b schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmiden zur Sekretion von Prochymosin (pNZ870) führen.
Fig. 10 DNA-Sequenz der In-Phasen-Fusion zwischen dem aminoterminalen Ende des Proteinasegens und der Prochymosin-Information.
Fig. 11a Western Blot von Zellysaten von E. coli und Streptococcus lactis
1) 5 ug reifes Chymosin
2) E. coli-MC1061-Zellextrakt + pNZ12
3) E. coli-MC1061-Zellextrakt + pNZ450
4) S. lactis-MG1363-Zellextrakt + pNZ12
5) S. lactis-MG1363-Zellextrakt + pNZ410.

Claims

1. Isoliertes DNA-Fragment, das eine Milchsäurebakteriumspezifische Regulatorregion des Proteinasegens enthält, wie in Fig. 5 gezeigt, die das ClaI-Fragment enthält, angeordnet auf dem Plasmid pSK111 des Stammes S. cremoris SK112, der hinterlegt ist bei dem Central Bureau for Mould Culture, The Netherlands, unter No. CBS 349,87, oder auf einer mutierten Form davon, die im wesentlichen dieselbe Aktivität aufweist.

2. Isoliertes DNA-Fragment nach Anspruch 1, ergänzt um die Basensequenz oder mit funktionellen Teilen davon, die stromabwärts von der ClaI-Stelle angeordnet sind, wie in Fig. 7a gezeigt.

3. Isoliertes DNA-Fragment nach Anspruch 2, umfassend das ClaI-Fragment, wie in Fig. 5 gezeigt, das stromabwärts ergänzt ist um das in Fig. 7a(1) gezeigten DNA-Fragment und sich zwischen der ClaI-Stelle, die in der zweiten Zeile vorhanden ist und der Ala-ala-Sequenz befindet, die in der dritten Zeile von Fig. 7a(1) vorhanden ist.

4. Isoliertes DNA-Fragment nach Anspruch 1, ergänzt um die Basensequenz, die stromaufwärts von der ClaI-Stelle angeordnet ist, oder mit funktionellen Teilen davon, wie in Fig. 7b gezeigt.

5. Rekombinantes Plasmid, das ein DNA-Fragment nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4 enthält.

6. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 5, das ein sich von Milchsäurebakterien ableitendes Replicon enthält.

7. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 5, das ein sich von dem S. lactis-Plasmid pSH71 abgeleitetes Replicon enthält.

8. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 7, das einen Plasmidvektor pNZ121 oder pNZ122 enthält, wie in Fig. 3 gezeigt, worin pNZ121 zugänglich ist, indem die Orientierung des 2,7 kb TagI Fragment, das die Cm- und Km-Resistenzgene enthält, verändert wird, und worin pNZ122 zugänglich ist, indem das Km-Resistenzgen von pNZ121 mittels eines SalI- und MspI-Verdaus entfernt wird, wobei das zurückgelassene Fragment unter Verwendung von Klenow-Polymerase mit glatten Enden versehen wird und indem mit T4-Ligase ein Ringschluß durchgeführt wird.

9. Rekombinantes Plasmid nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-8, worin ein Gen, das für ein Protein kodiert, wenigstens mit der Regulatorregion nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4 verknüpft ist.

10. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 9, das ein Gen enthält, das für Prochymosin, Preprochymosin, Pseudochymosin bzw. Chymosin kodiert.

11. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 9, das ein Gen enthält, das für β-Galactosidase kodiert.

12. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 9, das ein Gen enthält, das für Proteinase kodiert, wie in Fig. 4 gezeigt.

13. Milchsäurebakterium, das ein Plasmid nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-12 enthält.

14. Milchsäurebakterium, das Lactobacillus heißt, wie in. casei, das ein Plasmid nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-12 enthält.

15. Milchsäurebakterium, das zu den Milchsäurestreptokokken gehört, wie Streptococcus lactis und Streptococccus cremoris, das ein Plasmid nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-12 enthält.

16. Milchsäurebakterium des Stamms Streptococcus lactis MG1363, das ein Plasmid nach einem oder mehreren der Ansprüche 5-12 enthält.