DE3931377A1 - L-fucose-dehydrogenase, verfahren zu ihrer herstellung, quantitative bestimmung von l-fucose unter verwendung des genannten enzyms, sowie kit fuer die quantitative bestimmung - Google Patents
L-fucose-dehydrogenase, verfahren zu ihrer herstellung, quantitative bestimmung von l-fucose unter verwendung des genannten enzyms, sowie kit fuer die quantitative bestimmungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue
L-Fucose-Dehydrogenase (nachfolgend abgekürzt mit L-FDH),
die auf L-Fucose einwirkt, um L-Fuconolacton zu erzeugen,
und gleichzeitig oxidiertes
Nikotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP⁺) in
reduziertes Nikotinamidadenindinucleotid (NADPH)
überführt. Ferner betrifft sie ein Verfahren zur
Herstellung derselben, ein Verfahren zur enzymatischen
Bestimmung von L-Fucose unter Verwendung von L-FDH sowie
einen Kit für die quantitative Bestimmung.
Es wurde herausgestellt, daß komplexe Kohlenhydrate oder
Glycokonjugate, die an Proteine oder Lipide gebunden sind,
beim Informationstransfer im lebenden Organismus eine
Rolle spielen. Seitdem wachsen Kenntnisse über diese
Zucker rapide an. Unter diesen Erkenntnissen gibt es einen
Bericht, daß L-Fucose ansteigt oder abnimmt, und zwar
abhängig von den pathologischen Bedingungen von
Lungenkrebs (Clin. Chem., Bd. 22, Nr. 9, 1516-1521
(1976)). Es wird somit angenommen, daß die Bestimmung
dieses Zuckers nützliche Informationen über die
pathologischen Bedingungen von Patienten mit Lungenkrebs
liefern würde.
Zur Bestimmung von L-Fucose ist ein Verfahren unter
Verwendung eines Enzyms ausgezeichnet hinsichtlich
Genauigkeit und Einfachheit. Als Enzyme zur quantitativen
Bestimmung von L-Fucose sind L-FDH aus Schweineleber (J.
Biol. Chem., Bd. 244, 4785-4792 (1969)), L-FDH aus
Schafleber (Arch. Biochem. Biophys., Bd. 186, 184-188
(1978)), L-FDH aus Kaninchenleber (J. Biochem., Bd. 86,
1559-1565 (1979)), L-FDH aus Bakterien, die zum Genus
Corynebacterium gehören (JP-OS 62-155085), L-FDH aus
Pullularia pullulans (Arch. Biol. Technol., Bd. 30,
361-366 (1987)) und dergleichen bekannt. Diese Enzyme sind
alle Dehydrogenasen, die Nikotinamidadenindinucleotid
(NAD⁺) als Coenzyme verwenden.
Mehrere Versuche zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose
unter Verwendung dieser Enzyme sind beispielsweise auch in
JP-OS 62-175197, Anal. Biochem., Bd. 121, 129-134 (1982),
Anal. Biochem., Bd. 112, 76-81 (1981), Methods Enzym. Anal
(3. Aufl.), Bd. 6, 387-398, usw. vorgeschlagen worden.
Wenn ein Teil des lebenden Organismus, z. B. Serum oder
dergleichen, als Probe verwendet und seine Komponente
enzymatisch bestimmt werden, ist es selbstverständlich
erwünscht, das Assaysystem dergestalt zu entwerfen, daß
Enzyme oder Metaboliten in den metabolischen Systemen,
welche im lebenden Organismus in natürlicher Weise
enthalten sind, so weit wie möglich minimiert werden.
Von diesem Standpunkt aus betrachtet, ist die Verwendung
von Dehydrogenase unter Einsatz von NADP⁺ als Coenzym
der Verwendung von Dehydrogenase unter Einsatz von NAD⁺
als Coenzym überlegen. Dies deshalb, weil Enzyme (z. B.
Lactat-Dehydrogenase usw.), die NAD⁺ (oder NADH)
verwenden, in Serum und dergleichen in relativ großen
Mengen enthalten sind, und deren Metabolite (z. B. Pyruvat,
Lactat usw.) sind wiederum darin immer enthalten, und
deshalb neigt das NAD⁺-Bestimmungssystem dazu, durch
diese Verbindungen leicht beeinflußt zu werden.
Die hier auftretenden Erfinder haben Forschungen
durchgeführt, um L-Fucose in einfacher Weise mit hoher
Genauigkeit zu bestimmen. Als Ergebnis wurde gefunden,
daß ein zum Genus Pseudomonas gehörendes Bakterium, das
aus dem Boden isoliert wird, ein neues Enzym erzeugen
konnte, welches auf L-Fucose einwirkt, um L-Fuconolacton
zu erzeugen, und gleichzeitig NADP⁺ in NADPH überführt,
und daß das Enzym auf wirksame Weise zur Bestimmung von
L-Fucose verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung
ist somit vollbracht worden.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein neues Enzym L-FDH
gerichtet, das auf L-Fucose einwirkt, um L-Fuconolacton zu
erzeugen, und gleichzeitig NADP⁺ in NADPH überführt. Die
vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur
Herstellung von L-FDH unter Verwendung von NADP⁺ als
Coenzym gerichtet, wobei man einen L-FDH erzeugenden
Stamm, der zum Genus Pseudomonas gehört, in einem Medium
züchtet und die gebildete L-FDH aus der Kultur gewinnt.
Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zur
quantitativen Bestimmung von L-Fucose gerichtet, wobei man
eine L-Fucose enthaltende Probe mit L-FDH unter Verwendung
von NADP⁺ als Coenzym zur Reaktion bringt und das
erzeugte NADPH bestimmt. Die Erfindung ist auch auf ein
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von gebundener
L-Fucose gerichtet, wobei man eine L-Fucose enthaltende
Probe mit L-Fucosidase und L-FDH aufeinanderfolgend oder
gleichzeitig zur Reaktion bringt und erzeugtes NADPH
bestimmt. Die vorliegende Erfindung ist schließlich auf
einen Kit zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose
gerichtet, welcher mindestens die genannte L-FDH, NADP⁺
und eine Pufferlösung enthält.
Fig. 1 ist ein Diagramm, das den optimalen pH des
vorliegenden Enzyms zeigt;
Fig. 2 ist ein Diagramm, das den stabilen pH-Bereich
zeigt;
Fig. 3 ist ein Diagramm, das den optimalen
Temperaturbereich dieses Enzyms zeigt;
Fig. 4 ist ein Diagramm, das die thermische Stabilität
des Enzyms zeigt;
Fig. 5 zeigt eine Elektrophoresebande; und
Fig. 6 zeigt eine Eichkurve von L-Fucose in Beispiel 3.
Die vorliegende Erfindung wird nun detailliert beschrieben.
Die physiko-chemischen Eigenschaften des neuen Enzyms
L-FDH sind die folgenden.
Wie in der folgenden Reaktionsgleichung gezeigt, oxidiert
das Enzym L-Fucose zu L-Fuconolacton in Gegenwart von
L-Fucose und NADP⁺ und reduziert gleichzeitig NADP⁺ zu
NADPH.
L-Fucose + NADP⁺ → L-Fuconolacton + NADPH + H⁺
Das Enzym zeigt die höchste Spezifität (100%) für
L-Fucose, reagiert aber auch mit L-Galactose (96%) und
D-Arabinose (1%) usw. Das Enzym wirkt jedoch kaum oder
überhaupt nicht auf andere Zucker ein, die gewöhnlich
vorhanden sind.
Ferner erfordert das Enzym NADP⁺ (100%) als Coenzym,
reagiert jedoch kaum mit NAD⁺ (1%).
Bei Verwendung von
Tris-Imidazol-Natriumacetat-Pufferlösung liegt der
optimale pH in einem Bereich von 9,0 bis 10,0, wie in Fig.
1 gezeigt. Der stabile pH-Bereich liegt zwischen 8,0 und
10,5, wie in Fig. 2 gezeigt.
Wie in Fig. 3 gezeigt, liegt der optimale
Temperaturbereich zwischen 40 und 60°C.
Wie in Fig. 4 gezeigt, ist das Enzym bis 40°C bei einer
entsprechenden 10minütigen Wärmebehandlung stabil, wird
aber bei einer höheren Temperatur rasch inaktiviert. Bei
einer Wärmebehandlung von 30°C über 60 Minuten ist das
Enzym bei einem pH-Wert von 8,0 bis 10,5 stabil, jedoch
instabil bei einem pH-Wert unter 6,0.
Inhibitor | |
Restaktivität (%) | |
keiner | |
100 | |
HgCl₂ | 2 |
CdSO₄ | 2 |
ZnSO₄ | 81 |
PCMB | 18 |
Jodacetamid | 91 |
Die obige Tabelle zeigt die Ergebnisse, die erhalten
wurden, als die Enzymaktivität in einer Reaktionslösung,
enthaltend die verschiedenen Metallsalze und Inhibitoren
in einer Konzentration von 2 mM, gemessen wurde.
Andere Inhibierung und Aktivierung mit CaCl₂, MgSO₄,
NiSO₄, CuSO₄, EDTA, o-Phenanthrolin,
alpha, alpha′-Dipyridyl, KCN, NaN₃, usw. wurde nicht
beobachtet.
Das Enzym wird in üblicher Weise isoliert und gereinigt.
Reinigungsmaßnahmen, wie die Fällung mit Ammoniumsulfat,
Säulenchromatografie unter Verwendung von
Phenyl-Sepharose, Säulenchromatografie unter Verwendung
von DEAE-Sephadex, Gelfiltration unter Verwendung von
Sephadex-G-100 usw., werden einzeln oder in geeigneter
Kombination angewandt.
Das Molekulargewicht wurde durch Gelfiltration durch eine
Sephadex-G-100-Säule unter Verwendung von 0,05 M
Kaliumphosphat-Pufferlösung (enthaltend 0,1 M NaCl)
bestimmt und mit annähernd 32 000 bis 36 000 ermittelt.
Elektrophorese wurde in üblicher Weise unter Verwendung
von 15%igem Polyacrylamidgel durchgeführt. Als Ergebnis
wurde im wesentlichen eine einzige Bande beobachtet, wie
in Fig. 5 gezeigt. Bei Verwendung von Bromphenolblau als
Index lag der relative Beweglichkeitsabstand bei 0,79 im
Falle von 7,5%igem Gel, bei 0,57 im Falle von 10%igem
Gel und bei 0,37 im Falle von 15%igem Gel.
Der durch Polyacrylamidgel-Isoelektrofokussieren bestimmte
isoelektrische Punkt wurde mit 5,2 ermittelt.
Zu 2,5 ml Tris-Imidazol-Natriumacetat-Pufferlösung (die
jeweils 0,12 M enthaltende Lösung wird mit 4 N NaOH auf pH
9,5 eingestellt) werden 0,2 ml 15 mM NADP⁺-Lösung
gegeben. Nach 5 Minuten bei 37°C werden 0,1 ml einer
Enzymlösung zugefügt, und es werden 0,2 ml 150 mM
L-Fucoselösung zu dem System gegeben, um die Reaktion zu
beginnen. Sofort danach wird die Reaktionsmischung in eine
Zelle für die Absorptionsmessung (1 cm Lichtweg)
transferiert, die bei 37°C gehalten wird, und es wird die
Absorption bei der Wellenlänge von 340 nm 2 Minuten lang
oder, falls notwendig, über einen längeren Zeitraum
gemessen. Eine Einheit ist eine Menge an Enzym, die
1 µMol NADPH in 1 Minute erzeugt.
Wie vorstehend beschrieben, stellt das Enzym neue L-FDH
dar, welche bisher insofern unbekannt war, als NADP⁺ als
ihr Coenzym verwendet wird.
Als nächstes wird ein Verfahren zur Herstellung des neuen
Enzyms L-FDH gemäß der vorliegenden Erfindung nachstehend
beschrieben.
Als Mikroorganismus wird ein Stamm verwendet, der zum
Genus Pseudomonas gehört und zur Herstellung von L-FDH
befähigt ist. Ein spezifisches Beispiel ist Pseudomonas
sp. Nr. 1143. Varianten und Mutanten dieses Stammes können
ebenfalls verwendet werden. Pseudomonas sp. Nr. 1143 ist
ein von den hier auftretenden Erfindern aus dem Boden
isolierter Stamm. Seine bakteriologischen Eigenschaften
werden nachfolgend dargelegt.
Betrachtung unter dem Mikroskop (24°C, Agarmediumbrühe, 16
Stunden lang gezüchtet).
- 1. Zellengröße: Stäbe von 0,4 bis 0,5 × 0,7 bis 1,0 µm
- 2. Pleomorphismus: Es liegen einheitliche Stäbe vor. Ebenso wird ein kurzkettiger Zustand von Stäben beobachtet, die an den Enden miteinander verbunden sind.
- 3. Beweglichkeit: Positiv (polare Flagellen). Eine Kette von zwei Stäben rotiert.
- 4. Sporen: Es werden keine Sporen gebildet.
- 5. Gram-Färbung: Negativ
- 6. Verhalten gegen Acid-fast: Negativ
- 1. Agar-Plattenkulturbrühe: Die Kultur ergibt bei 30°C über 2 Tage scheibchenförmige Kolonien mit einem Durchmesser von 1 mm und ist blaßgelb sowie ölartig. Die Peripherie ist irgendwie wellenförmig, wird jedoch nach einem weiteren Zeitablauf vollständig.
- 2. Agar-Schrägkulturbrühe: Sie wächst normal. Die Bakterien sind leicht gelb und ölartig, und die Oberfläche ist glatt. Es wird keine Färbung des Mediums festgestellt.
- 3. Flüssige Kulturbrühe: Sie wächst gut bei 30°C in einem Tag durch Schüttelkultur, beginnt ca. 5 Tage danach zu lysieren und lysiert 7 Tage danach vollständig, um durchsichtig zu werden. In statischer Kultur bei 30°C bildet sie einen leichten Ring auf der Oberfläche sowie kleine weiße Präzipitate und wird als Ganzes leicht trüb.
- 4. Agar-Stichkulturbrühe: (gezüchtet 7 Tage lang bei 30°C) Sie wächst langsam entlang von Stäben, um faserförmig zu werden.
- 5. Lackmusmilch: Der untere Teil wird leicht reduziert, entfärbt und wird leicht sauer.
- 6. BCP-Milch: Sie wird leicht sauer.
- 7. Gelatine-Stichkultur: Durch Züchtung bei 24°C über 7 Tage wird die Oberfläche ein wenig verflüssigt.
- 1. Reduktion von Nitrat: Positiv
- 2. Denitrifizierung: anaerobes Wachstum wird festgestellt, es wird aber kein Gas gebildet.
- 3. MR-Test: negativ
- 4. VP-Test: negativ
- 5. Bildung von Indol: negativ
- 6. Bildung von Hydrogensulfat: positiv (durch Bleiacetat-Testpapier)
- 7. Zersetzung von Stärke: positiv
- 8. Verwendung von Citrat: negativ
- 9. Verwendung anorganischer Stickstoffquellen: Ammoniumsalze werden verwendet, jedoch keine Nitrate.
- 10. Bildung von Farbstoff: Es wird ein gelber, nicht-diffundierbarer Farbstoff gebildet.
- 11. Urease: negativ
- 12. Oxidase: negativ
- 13. Katalase: positiv
- 14. Wachstumsbereich: Die Temperatur liegt bei 16 bis 38°C (optimale Temperatur bei ca. 27°C), der pH bei 5,0 bis 9,8 (optimaler pH bei ca. 7).
- 15. Verhalten gegen Sauerstoff: aerob
- 16. O-F-Test: keine Veränderung
- 17. Bildung von Säure und Gas aus Zuckern:
- 1. Intrazellulare Akkumulation von Polyhydroxybutyrat: negativ
- 2. Erzeugung einer fluoreszierenden Substanz: positiv
- 3. Erzeugung von Arginin-Dihydrolase: negativ.
Bei Vergleich der vorstehenden taxonomischen Eigenschaften
dieses Stammes, der zur Erzeugung neuer L-FDH befähigt
ist, mit der Klassifikation in Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology (1984), Bd. 1, sollte dieser Stamm
zum Genus Pseudomonas gehören, da gram-negative, aerobe
und Katalyse-positive Stäbe vorliegen, die keine Sporen
tragen, jedoch polare Flagellen aufweisen. Von dem Stamm
wird angenommen, daß er mit Pseudomonas syringae oder
Pseudomonas viridiflava verwandt ist, da er in den Zellen
Polyhydroxybutyrat nicht akkumuliert, jedoch eine
fluoreszierende Substanz erzeugt, Arginin-Dihydrolase
nicht erzeugt und Oxidase-negativ ist. Der Stamm
unterscheidet sich jedoch von diesem Stämmen bezüglich
Zersetzung von Stärke, Denitrifikation, Erzeugung eines
gelben Farbstoffes usw., und es wird angenommen, daß er
ein neuer Stamm ist, der bisher unbekannt war.
Aus den vorstehenden Gründen wurde der Stamm Pseudomonas
sp. Nr. 1143 genannt. Pseudomonas sp. Nr. 1143 ist beim
Fermentation Research Institute of the Agency of
Industrial Science and Technology of Japan unter der
Eingangsnummer 2056 (FERM BP-2056) gemäß Budapester
Vertrag hinterlegt worden.
Jedes synthetische und natürliche Medium kann als
erfindungsgemäß zu verwendendes Medium eingesetzt werden,
solange das Medium in geeigneter Weise Kohlenstoffquellen,
Stickstoffquellen, anorganische Stoffe und andere
Nährstoffe enthält.
Als Kohlenstoffquellen können Glucose; Lactose, Fructose,
Maltose, Glycerin usw. eingesetzt werden. Als
Stickstoffquellen können vorzugsweise Ammoniumsalze und
stickstoffhaltige organische Stoffe, wie Pepton,
Caseinzersetzungsprodukte, Natriumglutamat, Hefeextrakt
usw., verwendet werden. Als anorganische Stoffe können
Salze von Natrium, Kalium, Magnesium, Mangan, Kalzium,
Eisen usw. verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung wird der L-FDH erzeugende
Stamm in einem Medium gezüchtet, das L-Fucose enthält,
wodurch L-FDH in guter Ausbeute erhalten werden kann. Ein
bevorzugtes Beispiel des Züchtungsmediums ist ein Medium
(pH 7,0), enthaltend 0,3% L-Fucose, 0,1% Pepton, 0,1%
Hefeextrakt, 0,09% Monokaliumphosphat, 0,11%
Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,001%
Eisensulfat. Wenn der Stamm in dem Medium bei 30°C 24
Stunden lang aerob gezüchtet wird, steigt der
Produktionstiter auf ein 10- bis 100faches dessen an, was
im Falle der Verwendung anderer Kohlenstoffquellen anstatt
L-Fucose erreicht wird.
Die Züchtungstemperatur liegt im allgemeinen in einem
Bereich von 20 bis 35°C, vorzugsweise bei ca. 30°C. Der pH
liegt im allgemeinen in einem Bereich von 6 bis 8,
vorzugsweise bei ca. 7, und zwar wenn die Kultur gestartet
wird. Wenn die Kultur 20 bis 40 Stunden lang unter diesen
Bedingungen geschüttelt oder tiefgedreht wird, wird L-FDH
erzeugt und in der Kultur angereichert.
Da L-FDH im allgemeinen in den Zellen vorhanden ist, wird
die Kultur vorzugsweise zentrifugiert oder filtriert usw.,
um die Zellen alleine zu isolieren. Die Zellen werden in
einer geeigneten Menge Pufferlösung disintegriert, um das
Enzym zur Auflösung zu bringen und dabei das Enzym in die
Lösung freizusetzen.
Die Zellen werden durch physikalische Maßnahmen durch
Verwendung einer Dynomill, einer French press, durch
Anwendung von Ultraschall usw., durch chemische Mittel
unter Verwendung von Triton X-100, Natriumlaurylsulfat,
EDTA usw. oder durch enzymatische Mittel unter Verwendung
von Lysozym usw., einzeln oder in Kombination,
disintegriert. Aus der so erhaltenen Lösung von
abgetrennten Zellen wird Nucleinsäure in üblicher Weise
entfernt, und unlösliche Materialien werden durch
Filtration oder Zentrifugation entfernt, um L-FDH zu
ergeben. Falls notwendig und erwünscht, kann L-FDH durch
übliche Verfahren weiter gereinigt werden, um das Enzym zu
isolieren und zu reinigen, z. B. (1) Fraktionierung mit
Ammoniumsulfat, (2) Säulenchromatografie an
Phenyl-Sepharose, (3) Säulenchromatografie an
DEAE-Sephadex, (4) Gelfiltration durch Sephadex-G-100 usw.
oder in Kombination mit anderen Verfahren, falls
notwendig. Auf diese Weise kann gereinigtes L-FDH erhalten
werden.
Als nächstes werden das Verfahren zur quantitativen
Bestimmung von L-Fucose und der Kit zur quantitativen
Bestimmung gemäß der vorliegenden Erfindung detailliert
beschrieben.
Das Prinzip der quantitativen Bestimmung gemäß der
vorliegenden Erfindung wird nachfolgend gezeigt:
L-Fucose + NADP⁺ → L-Fuconolacton + NADPH + H⁺
L-Fucose kann bestimmt werden, indem man L-FDH auf
L-Fucose in einer Probe einwirken läßt und erzeugtes
NADPH durch bekannte Verfahren mißt, z. B. durch Messung
der Absorption bei 340 nm im ultravioletten Bereich.
L-FDH eines jeden Urprungs ist als L-FDH in der
vorliegenden Erfindung einsetzbar, solange sie NADP⁺ als
Coenzym verwendet, es ist jedoch bevorzugt, L-FDH zu
verwenden, die durch Züchtung eines Mikroorganismus
erhalten wird, insbesondere eines Stammes, ausgewählt aus
Bakterien, die zum Genus Pseudomonas gehören.
Als das Enzym erzeugende Bakterium, das zum Genus
Pseudomonas gehört, wird beispielsweise Pseudomonas sp.
Nr. 1143 (FERM BP-2056) exemplifiziert.
Wenn die oben beschriebene L-FDH mit L-Fucose in einer
Probe zur Reaktion gebracht wird, wird die Reaktion bei
einem pH im Bereich von 7 bis 10 und einer Temperatur
unter 60°C, vorzugsweise bei pH von 8 bis 10 und einer
Temperatur von 35 bis 50°C, im allgemeinen ungefähr 2 bis
20 Minuten lang durchgeführt. Zur Einstellung des
pH-Wertes werden gegebenenfalls Pufferlösungen verwendet,
die den oben angegebenen pH-Bereich aufrecht erhalten
können und die Enzymreaktion nicht inhibieren. Beispiele
der Pufferlösung, die vorteilhafterweise eingesetzt werden
können, schließen Kaliumphosphatpuffer,
Tris-Salzsäurepuffer, Glycin-Natriumhydroxid-Puffer,
Natriumcarbonatpuffer usw. ein.
Zur quantitativen Bestimmung von erzeugtem NADPH durch die
Reaktion von L-FDH kann jedes Verfahren angewandt werden,
die am meisten angewandte Methode schließt jedoch die
Messung der Adsorption bei 340 nm im ultravioletten
Bereich ein. Für die quantitative Bestimmung durch
Überführung in einen Farbstoff mit einer Absorption im
sichtbaren Bereich ist ein Verfahren bekannt, bei dem man
NADPH mit Phenazinmethosulfat und Nitrolblautetrazolium
reagieren läßt und die Adsorption des gebildeten
Diformazan bei 570 nm mißt. Es gibt auch ein Verfahren,
bei dem man NADPH mit Phenazinmethosulfat oder dem
entsprechenden Elektrontransfer oder Metallionen reagieren
läßt, wobei eine Farbbildungsreaktion des erzeugten
Wasserstoffperoxids zusammen mit Peroxidase und
verschiedenen Chromophoren hervorgerufen wird, und die
Adsorption bei einer geeigneten Wellenlänge des jeweils
gefärbten Stoffes mißt. Das System mit Wasserstoffperoxid
kann auch durch Lichtemission mit Luminol nachgewiesen
werden. Des weiteren wird durch Zusammenbringen mit einer
Vielzahl von entsprechend ausgewählten
Oxidations-Reduktions-Indikatoren und Elektrontransfers
die Charakteristik der Farbtöne untersucht und dadurch
L-Fucose halbquantitativ bestimmt.
Diese Nachweismethoden können abhängig von ihren
charakteristischen Merkmalen angewandt werden.
Bei der quantitativen Bestimmung von L-Fucose ist es
notwendig, daß L-Fucose in der Probe in freiem Zustand
vorliegt. Wenn L-Fucose, die als Teil von Glycokonjugaten
gebunden vorliegt, bestimmt wird, ist es notwendig,
alpha-L-L-Fucosidase usw. auf die Konjugate einwirken zu
lassen, um L-Fucose in einen freien Zustand zu überführen.
alpha-L-Fucosidase jeglichen Ursprungs kann in diesem Fall
eingesetzt werden, es ist jedoch notwendig, das in den
Glycokonjugaten gebundene alpha-L-Fucosid rasch zu
spalten. Beispiele von alpha-L-Fucosidase schließen
alpha-L-Fucosidase aus dem Genus Aspergillus (J. Biol.
Chem., Bd. 245, 299-304 (1970)), alpha-L-Fucosidase aus
Meeresschnecken (J. Biochem., Bd. 70, 75-78 (1971)) und
alpha-L-Fucosidase tierischen Ursprungs (J. Biol. Chem.,
Bd. 247, 23-32 (1972)) usw. ein.
Der Kit zur erfindungsgemäßen quantitativen Bestimmung
von L-Fucose umfaßt L-FDH, NADP⁺ und Enzyme und
Reagenzien zur quantitativen Bestimmung von erzeugtem
NADPH, wie auch Pufferlösungen für den glatten Ablauf
dieser Reaktionen. Die Reagenzien und Enzyme werden als
flüssige, feste oder gefriergetrocknete Präparationen
zubereitet und, je nachdem, in Pufferlösungen vor dem
Gebrauch aufgelöst, um die Reagenzien für den Assay
bereitzustellen.
L-Fucose wird wie folgt bestimmt. Durch direkte Reaktion
mit einer L-Fucose enthaltenden Probe wird NADPH erzeugt.
NADPH wird bestimmt, wie es ist, oder es werden die
Reagenzien zur quantitativen Bestimmung von NADPH
zugefügt. Der Assay kann entweder mittels eines
Einzel- oder eines Zwei- oder ferner eines
Multi-Reagenziensystems durchgeführt werden.
Durch Verwendung der neuen L-FDH der vorliegenden
Erfindung können L-Fucose mit guter Genauigkeit
quantitativ bestimmt und nützliche Informationen für die
Diagnose pathologischer Zustände von Lungenkrebs oder
dergleichen erhalten werden. Ferner ist das Verfahren
gemäß der vorliegenden Erfindung einfach, und es kann ein
quantitatives Bestimmungsverfahren für L-Fucose
bereitgestellt werden, das nicht durch vorhandene(s)
Gucose, Pyruvat, Lactat, Lactat-Dehydrogenase usw.
beeinflußt wird und in hohem Maße genau ist. Die
vorliegende Erfindung ist äußerst signifikant auf dem
Gebiet der Untersuchung von Glycokonjugaten.
Als nächstes wird die vorliegende Erfindung unter Bezug
auf die nachstehenden Beispiele beschrieben.
Pseudomonas sp. Nr. 1143 (FERM BP-2056) wurde 30 ml
sterilem Keimmedium (0,3% L-Fucose, 0,1% Pepton, 0,1%
Hefeextrakt, 0,09% Monokaliumphosphat, 0,11%
Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,001%
Eisensulfat, pH 7,0) eingeimpft, welches sich in einem
Erlenmeyer-Kolben von 150 ml befand, worauf eine
Schüttelkultur bei 30°C erfolgte. Die Keimkultur, 10 ml,
wurde 2 l Medium mit derselben Zusammensetzung eingeimpft,
das in einen Kolbenfermenter (hergestellt von K. K.
Iwashiya Biological Science) gegeben worden war, worauf
eine belüftende (2 l/Min.), drehende (400 Upm) Züchtung
bei 30°C über 24 Stunden erfolgte. Die Kulturlösung wurde
bei 8000 Upm 20 Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen
zu gewinnen. L-FDH war im Zellenanteil angereichert.
1,1 kg Zellen aus der Flasche, die in derselben Weise wie
in Beispiel 1 gezüchtet und deren gesammelte Zellen bei
-20°C gefroren aufbewahrt worden waren, wurden in 50 l
0,02 M Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) (nachfolgend als
Standardpuffer bezeichnet) und 25 g Lysozym (hergestellt
von Nagase & Co., Ltd.) dispergiert. Die Mischung wurde 18
Stunden lang bei 24°C stehen gelassen. Der Mischung wurden
1,32 kg Ammoniumsulfat und 500 ml 10%ige wäßrige Lösung
von Triton-X-100 zugefügt. Die Mischung wurde homogen
gerührt, und es wurden dann 80 ml einer wäßrigen Lösung
von Ethyleniminpolymer (10%, pH 8,0) der Mischung
anteilweise zugefügt. Die gebildeten Präzipitate wurden
durch Filtration entfernt.
Das Filtrat wurde durch eine
Hohlfaser-Ultrafiltrationseinrichtung (AIL-2011,
hergestellt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) auf 5 l
aufkonzentriert. Nach Kühlung wurden 1,08 kg
Ammoniumsulfat zu dem Konzentrat gegeben und aufgelöst.
Nach 2stündigem Stehenlassen wurden die gebildeten
Präzipitate durch 20minütige Zentrifugation bei 8000 Upm
entfernt. Ferner wurden 0,74 kg Ammoniumsulfat dem
resultierenden Überstand zugefügt und die Mischung erneut
2 Stunden lang stehen gelassen. Die gebildeten Präzipitate
wurden durch 20minütige Zentrifugation bei 8000 Upm
gesammelt. Die Präzipitate wurden in 1 l Standardpuffer
gelöst und 140 g Ammoniumsulfat der Lösung zugefügt und
aufgelöst. Die entstandene Lösung wurde auf eine Säule
(Durchmesser 13,3 cm, Höhe 38 cm) von
Phenyl-Sepharose-Cl-4B (hergestellt von Pharmacia Fine
Chemicals Inc., Schweden) gegeben, die zuvor mit
Standardpuffer, enthaltend 14% Ammoniumsulfat,
equilibriert worden war, um das Enzym an der Säule zu
adsorbieren. Das Enzym wurde mit 50 l
Standardpufferlösungen mit einem Dichtegradienten (0 bis
30%) an Ethylenglykol und einem umgekehrten
Dichtegradienten (14 bis 0%) an Ammoniumsulfat eluiert.
Die aktive Fraktion wurde mit der
Hohlfaser-Ultrafiltrationsvorrichtung auf 500 ml
aufkonzentriert und das Konzentrat unter Verwendung von
3 l Standardpuffer, enthaltend 0,1 M Kaliumchlorid,
dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule (Durchmesser
6 cm, Höhe 35 cm) von DEAE-Sephadex-A-50 gegeben, die
vorher mit Standardpuffer, enthaltend 0,1 M Kaliumchlorid,
equilibriert worden war, um das Enzym an der Säule zu
adsorbieren. Das Enzym wurde mit 10 l Standardpuffer mit
einem Dichtegradienten (0,1 bis 0,8 M) Kaliumchlorid
eluiert. Die aktive Fraktion wurde mit einer
Ultrafiltrationsvorrichtung (hergestellt von Amicon Corp.,
USA) auf 15 ml aufkonzentriert, und 2 ml des Konzentrates
wurden auf eine Sephadex-G-100-Säule (Durchmesser 2,5 cm,
Höhe 100 cm) gegeben, die vorher mit Standardpuffer,
enthaltend 0,1 M Kaliumchlorid, equilibriert worden war,
um eine Gelfiltration durchzuführen. Die aktiven
Fraktionen wurden gesammelt und aufkonzentriert. Alle
Enzyme wurden der Gelfiltration unterworfen. Als Ergebnis
wurden 34 000 Einheiten L-Fucose-Dehydrogenase erhalten.
Wie in Fig. 5 gezeigt, stellte das Enzym eine Zubereitung
dar, die nahezu eine Einzelbande zeigte.
Die Konzentration von L-Fucose in einer Lösung wurde unter
Verwendung der nachstehenden Reagenzien durch die folgende
Methode bestimmt.
(1) Reagenzien | |
0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0)|1,57 ml | |
NADP⁺ (15 mM) | 0,065 ml |
L-FDH (44 Einheiten/ml) | 0,065 ml |
Probenlösung | 0,30 ml |
Es wurde eine definierte Menge eines jeden Reagenzes in
ein Teströhrchen gegeben. Die Reagenzien wurden bei 37°C 5
Minuten lang zur Reaktion gebracht und die Absorption bei
340 nm gemessen. Die Absorption, die im Falle der Zugabe
derselben Menge Wasser anstatt der Probe und durch
Reaktion in ähnlicher Weise erhalten wurde, wurde von der
vorherigen Absorption abgezogen, was die Absorption der
Probe ergab.
Getrennt davon wurden L-Fucoselösungen mit bekannten
Konzentrationen in ähnlicher Weise behandelt, um eine
Eichkurve zu erhalten. Auf der Grundlage der Eichkurve
wurde die Konzentration von L-Fucose ermittelt. Die
Eichkurve ist in Fig. 6 gezeigt.
Die Konzentration von L-Fucose in einer Lösung wurde unter
Verwendung der nachstehenden Reagenzien durch die folgende
Methode bestimmt.
(1) Reagenzien | |
0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) (enthaltend 0,1% Triton X-100)|150 µl | |
Phenazinmethosulfat (1 mg/ml) | 5 µl |
Nitroblautetrazolium (10 mg/ml) | 5 µl |
NADP⁺ (15 mM) | 15 µl |
L-FDH (44 Einheiten/ml) | 15 µl |
Probenlösung | 10 µl |
Eine definierte Menge eines jeden Reagenzes wurde in ein
Teströhrchen gegeben. Die Reagenzien wurden bei 37°C 10
Minuten lang zur Reaktion gebracht. Dann wurden 2,0 ml
0,3 N Salzsäure zugegeben und die Mischung gründlich
vermischt.
Die Absorption des gebildeten Farbstoffes wurde bei 570 nm
gemessen. Die Absorption, die im Falle der Zugabe derselben
Menge Wasser anstatt der Probenlösung und durch
Reaktion in ähnlicher Weise erhalten wurde, wurde von der
vorherigen Absorption als Nullprobe abgezogen.
Getrennt davon wurden L-Fucoselösungen mit bekannten
Konzentrationen in ähnlicher Weise behandelt, um eine
Eichkurve zu erhalten. Auf der Grundlage der Eichkurve
wurde die Konzentration von L-Fucose ermittelt.
Die Konzentration von L-Fucose in 2′-Fucosyl-Lactose wurde
unter Verwendung der nachstehenden Reagenzien durch die
folgende Methode bestimmt.
(1) Reagenzien | |
0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0)|215 µl | |
NADP⁺ (15 mM) | 15 µl |
L-FDH (44 Einheiten/ml) | 60 µl |
alpha-L-Fucosidase (aus Rinderepithelium) (12 Einheiten/ml) | 100 µl |
Eine definierte Menge eines jeden Reagenzes wurde in eine
Mikroküvette gegeben. Nach 5 Minuten bei 37°C wurden
10 µl von jeweils 0,3, 0,6, 0,9 und 1,2 mM Lösungen von
2′-Fucosyl-Lactose zugefügt. Nach 15minütiger Reaktion
bei 37°C wurde die Absorption bei 340 nm gemessen. Die
Absorption, die im Falle der Zugabe derselben Menge
Wasser anstatt der 2′-Fucosyl-Lactose-Lösung und durch
Reaktion in ähnlicher Weise erhalten wurde, wurde von der
vorherigen Absorption als Nullprobe abgezogen. Als
Ergebnis wurde eine gute lineare Beziehung zwischen der
zugefügten 2′-Fucosyl-Lactose und der Zunahme der
Absorption bei 340 nm festgestellt.
Claims (7)
1. L-Fucose-Dehydrogenase, die Wasserstoff von L-Fucose
abzieht und L-Fucose in L-Fuconolactam überführt und
gleichzeitig Coenzym NADP⁺ zu NADPH reduziert.
2. L-Fucose-Dehydrogenase mit den folgenden
physiko-chemischen Eigenschaften:
- (1) Wirkung und Substratspezifität:
sie zieht Wasserstoff von L-Fucose ab und überführt sie in L-Fuconolacton und reduziert gleichzeitig Coenzym NADP⁺ zu NADPH; - (2) Optimaler pH und stabiler pH-Bereich:
bei Verwendung von Tris-Imidazol-Natriumacetat- Pufferlösung liegen der optimale pH in einem Bereich von 9,0 bis 10,0 und der stabile pH-Bereich zwischen 8,0 und 10,5.
3. Verfahren zur Herstellung von L-Fucose-Dehydrogenase,
die NADP⁺ als Coenzym verwendet, wobei man einen
L-Fucose-Dehydrogenase erzeugenden Stamm, der zum
Genus Pseudomonas gehört, in einem Medium züchtet und
die gebildete L-Fucose-Dehydrogenase aus der Kultur
gewinnt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der
L-Fucose-Dehydrogenase erzeugende Strom Pseudomonas
sp. Nr. 1143 (FERM BP-2056) ist.
5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose,
wobei man eine L-Fucose enthaltende Probe mit
L-Fucose-Dehydrogenase, die NADP⁺ als Coenzym
erfordert, zur Reaktion bringt und gebildetes NADPH
mißt.
6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose,
wobei man eine L-Fucose enthaltende Probe mit
L-Fucosidase und L-Fucose-Dehydrogenase, die NADP⁺
als Coenzym erfordert, aufeinanderfolgend oder
gleichzeitig zur Reaktion bringt und gebildetes NADPH
mißt.
7. Kit zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose,
umfassend L-Fucose-Dehydrogenase, NADP⁺ und eine
Pufferlösung.
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