DE3931377A1

DE3931377A1 - L-fucose-dehydrogenase, verfahren zu ihrer herstellung, quantitative bestimmung von l-fucose unter verwendung des genannten enzyms, sowie kit fuer die quantitative bestimmung

Info

Publication number: DE3931377A1
Application number: DE3931377A
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Horiuchi; Minoru Hiruma; Toshiyuki Suzuki
Original assignee: Noda Institute for Scientific Research
Current assignee: Noda Institute for Scientific Research
Priority date: 1988-09-21
Filing date: 1989-09-20
Publication date: 1990-03-29
Anticipated expiration: 2009-09-21
Also published as: JPH0667316B2; DE3931377C2; US5260197A; JPH0284177A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue L-Fucose-Dehydrogenase (nachfolgend abgekürzt mit L-FDH), die auf L-Fucose einwirkt, um L-Fuconolacton zu erzeugen, und gleichzeitig oxidiertes Nikotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP⁺) in reduziertes Nikotinamidadenindinucleotid (NADPH) überführt. Ferner betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung derselben, ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von L-Fucose unter Verwendung von L-FDH sowie einen Kit für die quantitative Bestimmung.

Es wurde herausgestellt, daß komplexe Kohlenhydrate oder Glycokonjugate, die an Proteine oder Lipide gebunden sind, beim Informationstransfer im lebenden Organismus eine Rolle spielen. Seitdem wachsen Kenntnisse über diese Zucker rapide an. Unter diesen Erkenntnissen gibt es einen Bericht, daß L-Fucose ansteigt oder abnimmt, und zwar abhängig von den pathologischen Bedingungen von Lungenkrebs (Clin. Chem., Bd. 22, Nr. 9, 1516-1521 (1976)). Es wird somit angenommen, daß die Bestimmung dieses Zuckers nützliche Informationen über die pathologischen Bedingungen von Patienten mit Lungenkrebs liefern würde.

Zur Bestimmung von L-Fucose ist ein Verfahren unter Verwendung eines Enzyms ausgezeichnet hinsichtlich Genauigkeit und Einfachheit. Als Enzyme zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose sind L-FDH aus Schweineleber (J. Biol. Chem., Bd. 244, 4785-4792 (1969)), L-FDH aus Schafleber (Arch. Biochem. Biophys., Bd. 186, 184-188 (1978)), L-FDH aus Kaninchenleber (J. Biochem., Bd. 86, 1559-1565 (1979)), L-FDH aus Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören (JP-OS 62-155085), L-FDH aus Pullularia pullulans (Arch. Biol. Technol., Bd. 30, 361-366 (1987)) und dergleichen bekannt. Diese Enzyme sind alle Dehydrogenasen, die Nikotinamidadenindinucleotid (NAD⁺) als Coenzyme verwenden.

Mehrere Versuche zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose unter Verwendung dieser Enzyme sind beispielsweise auch in JP-OS 62-175197, Anal. Biochem., Bd. 121, 129-134 (1982), Anal. Biochem., Bd. 112, 76-81 (1981), Methods Enzym. Anal (3. Aufl.), Bd. 6, 387-398, usw. vorgeschlagen worden.

Wenn ein Teil des lebenden Organismus, z. B. Serum oder dergleichen, als Probe verwendet und seine Komponente enzymatisch bestimmt werden, ist es selbstverständlich erwünscht, das Assaysystem dergestalt zu entwerfen, daß Enzyme oder Metaboliten in den metabolischen Systemen, welche im lebenden Organismus in natürlicher Weise enthalten sind, so weit wie möglich minimiert werden.

Von diesem Standpunkt aus betrachtet, ist die Verwendung von Dehydrogenase unter Einsatz von NADP⁺ als Coenzym der Verwendung von Dehydrogenase unter Einsatz von NAD⁺ als Coenzym überlegen. Dies deshalb, weil Enzyme (z. B. Lactat-Dehydrogenase usw.), die NAD⁺ (oder NADH) verwenden, in Serum und dergleichen in relativ großen Mengen enthalten sind, und deren Metabolite (z. B. Pyruvat, Lactat usw.) sind wiederum darin immer enthalten, und deshalb neigt das NAD⁺-Bestimmungssystem dazu, durch diese Verbindungen leicht beeinflußt zu werden.

Die hier auftretenden Erfinder haben Forschungen durchgeführt, um L-Fucose in einfacher Weise mit hoher Genauigkeit zu bestimmen. Als Ergebnis wurde gefunden, daß ein zum Genus Pseudomonas gehörendes Bakterium, das aus dem Boden isoliert wird, ein neues Enzym erzeugen konnte, welches auf L-Fucose einwirkt, um L-Fuconolacton zu erzeugen, und gleichzeitig NADP⁺ in NADPH überführt, und daß das Enzym auf wirksame Weise zur Bestimmung von L-Fucose verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung ist somit vollbracht worden.

Die vorliegende Erfindung ist auf ein neues Enzym L-FDH gerichtet, das auf L-Fucose einwirkt, um L-Fuconolacton zu erzeugen, und gleichzeitig NADP⁺ in NADPH überführt. Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Herstellung von L-FDH unter Verwendung von NADP⁺ als Coenzym gerichtet, wobei man einen L-FDH erzeugenden Stamm, der zum Genus Pseudomonas gehört, in einem Medium züchtet und die gebildete L-FDH aus der Kultur gewinnt.

Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose gerichtet, wobei man eine L-Fucose enthaltende Probe mit L-FDH unter Verwendung von NADP⁺ als Coenzym zur Reaktion bringt und das erzeugte NADPH bestimmt. Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von gebundener L-Fucose gerichtet, wobei man eine L-Fucose enthaltende Probe mit L-Fucosidase und L-FDH aufeinanderfolgend oder gleichzeitig zur Reaktion bringt und erzeugtes NADPH bestimmt. Die vorliegende Erfindung ist schließlich auf einen Kit zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose gerichtet, welcher mindestens die genannte L-FDH, NADP⁺ und eine Pufferlösung enthält.

Fig. 1 ist ein Diagramm, das den optimalen pH des vorliegenden Enzyms zeigt;

Fig. 2 ist ein Diagramm, das den stabilen pH-Bereich zeigt;

Fig. 3 ist ein Diagramm, das den optimalen Temperaturbereich dieses Enzyms zeigt;

Fig. 4 ist ein Diagramm, das die thermische Stabilität des Enzyms zeigt;

Fig. 5 zeigt eine Elektrophoresebande; und

Fig. 6 zeigt eine Eichkurve von L-Fucose in Beispiel 3.

Die vorliegende Erfindung wird nun detailliert beschrieben.

Die physiko-chemischen Eigenschaften des neuen Enzyms L-FDH sind die folgenden.

(1) Wirkung und Substratspezifität

Wie in der folgenden Reaktionsgleichung gezeigt, oxidiert das Enzym L-Fucose zu L-Fuconolacton in Gegenwart von L-Fucose und NADP⁺ und reduziert gleichzeitig NADP⁺ zu NADPH.

L-Fucose + NADP⁺ → L-Fuconolacton + NADPH + H⁺

Das Enzym zeigt die höchste Spezifität (100%) für L-Fucose, reagiert aber auch mit L-Galactose (96%) und D-Arabinose (1%) usw. Das Enzym wirkt jedoch kaum oder überhaupt nicht auf andere Zucker ein, die gewöhnlich vorhanden sind.

Ferner erfordert das Enzym NADP⁺ (100%) als Coenzym, reagiert jedoch kaum mit NAD⁺ (1%).

(2) Optimaler pH und stabiler pH-Bereich

Bei Verwendung von Tris-Imidazol-Natriumacetat-Pufferlösung liegt der optimale pH in einem Bereich von 9,0 bis 10,0, wie in Fig. 1 gezeigt. Der stabile pH-Bereich liegt zwischen 8,0 und 10,5, wie in Fig. 2 gezeigt.

(3) Optimaler Temperaturbereich

Wie in Fig. 3 gezeigt, liegt der optimale Temperaturbereich zwischen 40 und 60°C.

(4) Bedingungen zur Inaktivierung durch pH, Temperatur usw.

Wie in Fig. 4 gezeigt, ist das Enzym bis 40°C bei einer entsprechenden 10minütigen Wärmebehandlung stabil, wird aber bei einer höheren Temperatur rasch inaktiviert. Bei einer Wärmebehandlung von 30°C über 60 Minuten ist das Enzym bei einem pH-Wert von 8,0 bis 10,5 stabil, jedoch instabil bei einem pH-Wert unter 6,0.

(5) Inhibitoreinfluß und Stabilisation

Inhibitor
Restaktivität (%)
keiner
100
HgCl₂	2
CdSO₄	2
ZnSO₄	81
PCMB	18
Jodacetamid	91

Die obige Tabelle zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, als die Enzymaktivität in einer Reaktionslösung, enthaltend die verschiedenen Metallsalze und Inhibitoren in einer Konzentration von 2 mM, gemessen wurde.

Andere Inhibierung und Aktivierung mit CaCl₂, MgSO₄, NiSO₄, CuSO₄, EDTA, o-Phenanthrolin, alpha, alpha′-Dipyridyl, KCN, NaN₃, usw. wurde nicht beobachtet.

(6) Reinigung

Das Enzym wird in üblicher Weise isoliert und gereinigt. Reinigungsmaßnahmen, wie die Fällung mit Ammoniumsulfat, Säulenchromatografie unter Verwendung von Phenyl-Sepharose, Säulenchromatografie unter Verwendung von DEAE-Sephadex, Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex-G-100 usw., werden einzeln oder in geeigneter Kombination angewandt.

(7) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht wurde durch Gelfiltration durch eine Sephadex-G-100-Säule unter Verwendung von 0,05 M Kaliumphosphat-Pufferlösung (enthaltend 0,1 M NaCl) bestimmt und mit annähernd 32 000 bis 36 000 ermittelt.

(8) Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Elektrophorese wurde in üblicher Weise unter Verwendung von 15%igem Polyacrylamidgel durchgeführt. Als Ergebnis wurde im wesentlichen eine einzige Bande beobachtet, wie in Fig. 5 gezeigt. Bei Verwendung von Bromphenolblau als Index lag der relative Beweglichkeitsabstand bei 0,79 im Falle von 7,5%igem Gel, bei 0,57 im Falle von 10%igem Gel und bei 0,37 im Falle von 15%igem Gel.

(9) Isoelektrischer Punkt

Der durch Polyacrylamidgel-Isoelektrofokussieren bestimmte isoelektrische Punkt wurde mit 5,2 ermittelt.

(10) Bestimmung der Aktivität

Zu 2,5 ml Tris-Imidazol-Natriumacetat-Pufferlösung (die jeweils 0,12 M enthaltende Lösung wird mit 4 N NaOH auf pH 9,5 eingestellt) werden 0,2 ml 15 mM NADP⁺-Lösung gegeben. Nach 5 Minuten bei 37°C werden 0,1 ml einer Enzymlösung zugefügt, und es werden 0,2 ml 150 mM L-Fucoselösung zu dem System gegeben, um die Reaktion zu beginnen. Sofort danach wird die Reaktionsmischung in eine Zelle für die Absorptionsmessung (1 cm Lichtweg) transferiert, die bei 37°C gehalten wird, und es wird die Absorption bei der Wellenlänge von 340 nm 2 Minuten lang oder, falls notwendig, über einen längeren Zeitraum gemessen. Eine Einheit ist eine Menge an Enzym, die 1 µMol NADPH in 1 Minute erzeugt.

Wie vorstehend beschrieben, stellt das Enzym neue L-FDH dar, welche bisher insofern unbekannt war, als NADP⁺ als ihr Coenzym verwendet wird.

Als nächstes wird ein Verfahren zur Herstellung des neuen Enzyms L-FDH gemäß der vorliegenden Erfindung nachstehend beschrieben.

Als Mikroorganismus wird ein Stamm verwendet, der zum Genus Pseudomonas gehört und zur Herstellung von L-FDH befähigt ist. Ein spezifisches Beispiel ist Pseudomonas sp. Nr. 1143. Varianten und Mutanten dieses Stammes können ebenfalls verwendet werden. Pseudomonas sp. Nr. 1143 ist ein von den hier auftretenden Erfindern aus dem Boden isolierter Stamm. Seine bakteriologischen Eigenschaften werden nachfolgend dargelegt.

(a) Morphologie

Betrachtung unter dem Mikroskop (24°C, Agarmediumbrühe, 16 Stunden lang gezüchtet).

1. Zellengröße: Stäbe von 0,4 bis 0,5 × 0,7 bis 1,0 µm
2. Pleomorphismus: Es liegen einheitliche Stäbe vor. Ebenso wird ein kurzkettiger Zustand von Stäben beobachtet, die an den Enden miteinander verbunden sind.
3. Beweglichkeit: Positiv (polare Flagellen). Eine Kette von zwei Stäben rotiert.
4. Sporen: Es werden keine Sporen gebildet.
5. Gram-Färbung: Negativ
6. Verhalten gegen Acid-fast: Negativ

(b) Wachstumsbedingungen in verschiedenen Medien

1. Agar-Plattenkulturbrühe: Die Kultur ergibt bei 30°C über 2 Tage scheibchenförmige Kolonien mit einem Durchmesser von 1 mm und ist blaßgelb sowie ölartig. Die Peripherie ist irgendwie wellenförmig, wird jedoch nach einem weiteren Zeitablauf vollständig.
2. Agar-Schrägkulturbrühe: Sie wächst normal. Die Bakterien sind leicht gelb und ölartig, und die Oberfläche ist glatt. Es wird keine Färbung des Mediums festgestellt.
3. Flüssige Kulturbrühe: Sie wächst gut bei 30°C in einem Tag durch Schüttelkultur, beginnt ca. 5 Tage danach zu lysieren und lysiert 7 Tage danach vollständig, um durchsichtig zu werden. In statischer Kultur bei 30°C bildet sie einen leichten Ring auf der Oberfläche sowie kleine weiße Präzipitate und wird als Ganzes leicht trüb.
4. Agar-Stichkulturbrühe: (gezüchtet 7 Tage lang bei 30°C) Sie wächst langsam entlang von Stäben, um faserförmig zu werden.
5. Lackmusmilch: Der untere Teil wird leicht reduziert, entfärbt und wird leicht sauer.
6. BCP-Milch: Sie wird leicht sauer.
7. Gelatine-Stichkultur: Durch Züchtung bei 24°C über 7 Tage wird die Oberfläche ein wenig verflüssigt.

(c) Physiologische Eigenschaften

1. Reduktion von Nitrat: Positiv
2. Denitrifizierung: anaerobes Wachstum wird festgestellt, es wird aber kein Gas gebildet.
3. MR-Test: negativ
4. VP-Test: negativ
5. Bildung von Indol: negativ
6. Bildung von Hydrogensulfat: positiv (durch Bleiacetat-Testpapier)
7. Zersetzung von Stärke: positiv
8. Verwendung von Citrat: negativ
9. Verwendung anorganischer Stickstoffquellen: Ammoniumsalze werden verwendet, jedoch keine Nitrate.
10. Bildung von Farbstoff: Es wird ein gelber, nicht-diffundierbarer Farbstoff gebildet.
11. Urease: negativ
12. Oxidase: negativ
13. Katalase: positiv
14. Wachstumsbereich: Die Temperatur liegt bei 16 bis 38°C (optimale Temperatur bei ca. 27°C), der pH bei 5,0 bis 9,8 (optimaler pH bei ca. 7).
15. Verhalten gegen Sauerstoff: aerob
16. O-F-Test: keine Veränderung
17. Bildung von Säure und Gas aus Zuckern:

(d) Andere Eigenschaften

1. Intrazellulare Akkumulation von Polyhydroxybutyrat: negativ
2. Erzeugung einer fluoreszierenden Substanz: positiv
3. Erzeugung von Arginin-Dihydrolase: negativ.

Bei Vergleich der vorstehenden taxonomischen Eigenschaften dieses Stammes, der zur Erzeugung neuer L-FDH befähigt ist, mit der Klassifikation in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1984), Bd. 1, sollte dieser Stamm zum Genus Pseudomonas gehören, da gram-negative, aerobe und Katalyse-positive Stäbe vorliegen, die keine Sporen tragen, jedoch polare Flagellen aufweisen. Von dem Stamm wird angenommen, daß er mit Pseudomonas syringae oder Pseudomonas viridiflava verwandt ist, da er in den Zellen Polyhydroxybutyrat nicht akkumuliert, jedoch eine fluoreszierende Substanz erzeugt, Arginin-Dihydrolase nicht erzeugt und Oxidase-negativ ist. Der Stamm unterscheidet sich jedoch von diesem Stämmen bezüglich Zersetzung von Stärke, Denitrifikation, Erzeugung eines gelben Farbstoffes usw., und es wird angenommen, daß er ein neuer Stamm ist, der bisher unbekannt war.

Aus den vorstehenden Gründen wurde der Stamm Pseudomonas sp. Nr. 1143 genannt. Pseudomonas sp. Nr. 1143 ist beim Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan unter der Eingangsnummer 2056 (FERM BP-2056) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt worden.

Jedes synthetische und natürliche Medium kann als erfindungsgemäß zu verwendendes Medium eingesetzt werden, solange das Medium in geeigneter Weise Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Stoffe und andere Nährstoffe enthält.

Als Kohlenstoffquellen können Glucose; Lactose, Fructose, Maltose, Glycerin usw. eingesetzt werden. Als Stickstoffquellen können vorzugsweise Ammoniumsalze und stickstoffhaltige organische Stoffe, wie Pepton, Caseinzersetzungsprodukte, Natriumglutamat, Hefeextrakt usw., verwendet werden. Als anorganische Stoffe können Salze von Natrium, Kalium, Magnesium, Mangan, Kalzium, Eisen usw. verwendet werden.

In der vorliegenden Erfindung wird der L-FDH erzeugende Stamm in einem Medium gezüchtet, das L-Fucose enthält, wodurch L-FDH in guter Ausbeute erhalten werden kann. Ein bevorzugtes Beispiel des Züchtungsmediums ist ein Medium (pH 7,0), enthaltend 0,3% L-Fucose, 0,1% Pepton, 0,1% Hefeextrakt, 0,09% Monokaliumphosphat, 0,11% Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,001% Eisensulfat. Wenn der Stamm in dem Medium bei 30°C 24 Stunden lang aerob gezüchtet wird, steigt der Produktionstiter auf ein 10- bis 100faches dessen an, was im Falle der Verwendung anderer Kohlenstoffquellen anstatt L-Fucose erreicht wird.

Die Züchtungstemperatur liegt im allgemeinen in einem Bereich von 20 bis 35°C, vorzugsweise bei ca. 30°C. Der pH liegt im allgemeinen in einem Bereich von 6 bis 8, vorzugsweise bei ca. 7, und zwar wenn die Kultur gestartet wird. Wenn die Kultur 20 bis 40 Stunden lang unter diesen Bedingungen geschüttelt oder tiefgedreht wird, wird L-FDH erzeugt und in der Kultur angereichert.

Da L-FDH im allgemeinen in den Zellen vorhanden ist, wird die Kultur vorzugsweise zentrifugiert oder filtriert usw., um die Zellen alleine zu isolieren. Die Zellen werden in einer geeigneten Menge Pufferlösung disintegriert, um das Enzym zur Auflösung zu bringen und dabei das Enzym in die Lösung freizusetzen.

Die Zellen werden durch physikalische Maßnahmen durch Verwendung einer Dynomill, einer French press, durch Anwendung von Ultraschall usw., durch chemische Mittel unter Verwendung von Triton X-100, Natriumlaurylsulfat, EDTA usw. oder durch enzymatische Mittel unter Verwendung von Lysozym usw., einzeln oder in Kombination, disintegriert. Aus der so erhaltenen Lösung von abgetrennten Zellen wird Nucleinsäure in üblicher Weise entfernt, und unlösliche Materialien werden durch Filtration oder Zentrifugation entfernt, um L-FDH zu ergeben. Falls notwendig und erwünscht, kann L-FDH durch übliche Verfahren weiter gereinigt werden, um das Enzym zu isolieren und zu reinigen, z. B. (1) Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, (2) Säulenchromatografie an Phenyl-Sepharose, (3) Säulenchromatografie an DEAE-Sephadex, (4) Gelfiltration durch Sephadex-G-100 usw. oder in Kombination mit anderen Verfahren, falls notwendig. Auf diese Weise kann gereinigtes L-FDH erhalten werden.

Als nächstes werden das Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose und der Kit zur quantitativen Bestimmung gemäß der vorliegenden Erfindung detailliert beschrieben.

Das Prinzip der quantitativen Bestimmung gemäß der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend gezeigt:

L-Fucose + NADP⁺ → L-Fuconolacton + NADPH + H⁺

L-Fucose kann bestimmt werden, indem man L-FDH auf L-Fucose in einer Probe einwirken läßt und erzeugtes NADPH durch bekannte Verfahren mißt, z. B. durch Messung der Absorption bei 340 nm im ultravioletten Bereich.

L-FDH eines jeden Urprungs ist als L-FDH in der vorliegenden Erfindung einsetzbar, solange sie NADP⁺ als Coenzym verwendet, es ist jedoch bevorzugt, L-FDH zu verwenden, die durch Züchtung eines Mikroorganismus erhalten wird, insbesondere eines Stammes, ausgewählt aus Bakterien, die zum Genus Pseudomonas gehören.

Als das Enzym erzeugende Bakterium, das zum Genus Pseudomonas gehört, wird beispielsweise Pseudomonas sp. Nr. 1143 (FERM BP-2056) exemplifiziert.

Wenn die oben beschriebene L-FDH mit L-Fucose in einer Probe zur Reaktion gebracht wird, wird die Reaktion bei einem pH im Bereich von 7 bis 10 und einer Temperatur unter 60°C, vorzugsweise bei pH von 8 bis 10 und einer Temperatur von 35 bis 50°C, im allgemeinen ungefähr 2 bis 20 Minuten lang durchgeführt. Zur Einstellung des pH-Wertes werden gegebenenfalls Pufferlösungen verwendet, die den oben angegebenen pH-Bereich aufrecht erhalten können und die Enzymreaktion nicht inhibieren. Beispiele der Pufferlösung, die vorteilhafterweise eingesetzt werden können, schließen Kaliumphosphatpuffer, Tris-Salzsäurepuffer, Glycin-Natriumhydroxid-Puffer, Natriumcarbonatpuffer usw. ein.

Zur quantitativen Bestimmung von erzeugtem NADPH durch die Reaktion von L-FDH kann jedes Verfahren angewandt werden, die am meisten angewandte Methode schließt jedoch die Messung der Adsorption bei 340 nm im ultravioletten Bereich ein. Für die quantitative Bestimmung durch Überführung in einen Farbstoff mit einer Absorption im sichtbaren Bereich ist ein Verfahren bekannt, bei dem man NADPH mit Phenazinmethosulfat und Nitrolblautetrazolium reagieren läßt und die Adsorption des gebildeten Diformazan bei 570 nm mißt. Es gibt auch ein Verfahren, bei dem man NADPH mit Phenazinmethosulfat oder dem entsprechenden Elektrontransfer oder Metallionen reagieren läßt, wobei eine Farbbildungsreaktion des erzeugten Wasserstoffperoxids zusammen mit Peroxidase und verschiedenen Chromophoren hervorgerufen wird, und die Adsorption bei einer geeigneten Wellenlänge des jeweils gefärbten Stoffes mißt. Das System mit Wasserstoffperoxid kann auch durch Lichtemission mit Luminol nachgewiesen werden. Des weiteren wird durch Zusammenbringen mit einer Vielzahl von entsprechend ausgewählten Oxidations-Reduktions-Indikatoren und Elektrontransfers die Charakteristik der Farbtöne untersucht und dadurch L-Fucose halbquantitativ bestimmt.

Diese Nachweismethoden können abhängig von ihren charakteristischen Merkmalen angewandt werden.

Bei der quantitativen Bestimmung von L-Fucose ist es notwendig, daß L-Fucose in der Probe in freiem Zustand vorliegt. Wenn L-Fucose, die als Teil von Glycokonjugaten gebunden vorliegt, bestimmt wird, ist es notwendig, alpha-L-L-Fucosidase usw. auf die Konjugate einwirken zu lassen, um L-Fucose in einen freien Zustand zu überführen. alpha-L-Fucosidase jeglichen Ursprungs kann in diesem Fall eingesetzt werden, es ist jedoch notwendig, das in den Glycokonjugaten gebundene alpha-L-Fucosid rasch zu spalten. Beispiele von alpha-L-Fucosidase schließen alpha-L-Fucosidase aus dem Genus Aspergillus (J. Biol. Chem., Bd. 245, 299-304 (1970)), alpha-L-Fucosidase aus Meeresschnecken (J. Biochem., Bd. 70, 75-78 (1971)) und alpha-L-Fucosidase tierischen Ursprungs (J. Biol. Chem., Bd. 247, 23-32 (1972)) usw. ein.

Der Kit zur erfindungsgemäßen quantitativen Bestimmung von L-Fucose umfaßt L-FDH, NADP⁺ und Enzyme und Reagenzien zur quantitativen Bestimmung von erzeugtem NADPH, wie auch Pufferlösungen für den glatten Ablauf dieser Reaktionen. Die Reagenzien und Enzyme werden als flüssige, feste oder gefriergetrocknete Präparationen zubereitet und, je nachdem, in Pufferlösungen vor dem Gebrauch aufgelöst, um die Reagenzien für den Assay bereitzustellen.

L-Fucose wird wie folgt bestimmt. Durch direkte Reaktion mit einer L-Fucose enthaltenden Probe wird NADPH erzeugt. NADPH wird bestimmt, wie es ist, oder es werden die Reagenzien zur quantitativen Bestimmung von NADPH zugefügt. Der Assay kann entweder mittels eines Einzel- oder eines Zwei- oder ferner eines Multi-Reagenziensystems durchgeführt werden.

Durch Verwendung der neuen L-FDH der vorliegenden Erfindung können L-Fucose mit guter Genauigkeit quantitativ bestimmt und nützliche Informationen für die Diagnose pathologischer Zustände von Lungenkrebs oder dergleichen erhalten werden. Ferner ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung einfach, und es kann ein quantitatives Bestimmungsverfahren für L-Fucose bereitgestellt werden, das nicht durch vorhandene(s) Gucose, Pyruvat, Lactat, Lactat-Dehydrogenase usw. beeinflußt wird und in hohem Maße genau ist. Die vorliegende Erfindung ist äußerst signifikant auf dem Gebiet der Untersuchung von Glycokonjugaten.

Als nächstes wird die vorliegende Erfindung unter Bezug auf die nachstehenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Pseudomonas sp. Nr. 1143 (FERM BP-2056) wurde 30 ml sterilem Keimmedium (0,3% L-Fucose, 0,1% Pepton, 0,1% Hefeextrakt, 0,09% Monokaliumphosphat, 0,11% Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,001% Eisensulfat, pH 7,0) eingeimpft, welches sich in einem Erlenmeyer-Kolben von 150 ml befand, worauf eine Schüttelkultur bei 30°C erfolgte. Die Keimkultur, 10 ml, wurde 2 l Medium mit derselben Zusammensetzung eingeimpft, das in einen Kolbenfermenter (hergestellt von K. K. Iwashiya Biological Science) gegeben worden war, worauf eine belüftende (2 l/Min.), drehende (400 Upm) Züchtung bei 30°C über 24 Stunden erfolgte. Die Kulturlösung wurde bei 8000 Upm 20 Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. L-FDH war im Zellenanteil angereichert.

Beispiel 2

1,1 kg Zellen aus der Flasche, die in derselben Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet und deren gesammelte Zellen bei -20°C gefroren aufbewahrt worden waren, wurden in 50 l 0,02 M Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) (nachfolgend als Standardpuffer bezeichnet) und 25 g Lysozym (hergestellt von Nagase & Co., Ltd.) dispergiert. Die Mischung wurde 18 Stunden lang bei 24°C stehen gelassen. Der Mischung wurden 1,32 kg Ammoniumsulfat und 500 ml 10%ige wäßrige Lösung von Triton-X-100 zugefügt. Die Mischung wurde homogen gerührt, und es wurden dann 80 ml einer wäßrigen Lösung von Ethyleniminpolymer (10%, pH 8,0) der Mischung anteilweise zugefügt. Die gebildeten Präzipitate wurden durch Filtration entfernt.

Das Filtrat wurde durch eine Hohlfaser-Ultrafiltrationseinrichtung (AIL-2011, hergestellt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) auf 5 l aufkonzentriert. Nach Kühlung wurden 1,08 kg Ammoniumsulfat zu dem Konzentrat gegeben und aufgelöst. Nach 2stündigem Stehenlassen wurden die gebildeten Präzipitate durch 20minütige Zentrifugation bei 8000 Upm entfernt. Ferner wurden 0,74 kg Ammoniumsulfat dem resultierenden Überstand zugefügt und die Mischung erneut 2 Stunden lang stehen gelassen. Die gebildeten Präzipitate wurden durch 20minütige Zentrifugation bei 8000 Upm gesammelt. Die Präzipitate wurden in 1 l Standardpuffer gelöst und 140 g Ammoniumsulfat der Lösung zugefügt und aufgelöst. Die entstandene Lösung wurde auf eine Säule (Durchmesser 13,3 cm, Höhe 38 cm) von Phenyl-Sepharose-Cl-4B (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals Inc., Schweden) gegeben, die zuvor mit Standardpuffer, enthaltend 14% Ammoniumsulfat, equilibriert worden war, um das Enzym an der Säule zu adsorbieren. Das Enzym wurde mit 50 l Standardpufferlösungen mit einem Dichtegradienten (0 bis 30%) an Ethylenglykol und einem umgekehrten Dichtegradienten (14 bis 0%) an Ammoniumsulfat eluiert.

Die aktive Fraktion wurde mit der Hohlfaser-Ultrafiltrationsvorrichtung auf 500 ml aufkonzentriert und das Konzentrat unter Verwendung von 3 l Standardpuffer, enthaltend 0,1 M Kaliumchlorid, dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule (Durchmesser 6 cm, Höhe 35 cm) von DEAE-Sephadex-A-50 gegeben, die vorher mit Standardpuffer, enthaltend 0,1 M Kaliumchlorid, equilibriert worden war, um das Enzym an der Säule zu adsorbieren. Das Enzym wurde mit 10 l Standardpuffer mit einem Dichtegradienten (0,1 bis 0,8 M) Kaliumchlorid eluiert. Die aktive Fraktion wurde mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung (hergestellt von Amicon Corp., USA) auf 15 ml aufkonzentriert, und 2 ml des Konzentrates wurden auf eine Sephadex-G-100-Säule (Durchmesser 2,5 cm, Höhe 100 cm) gegeben, die vorher mit Standardpuffer, enthaltend 0,1 M Kaliumchlorid, equilibriert worden war, um eine Gelfiltration durchzuführen. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und aufkonzentriert. Alle Enzyme wurden der Gelfiltration unterworfen. Als Ergebnis wurden 34 000 Einheiten L-Fucose-Dehydrogenase erhalten. Wie in Fig. 5 gezeigt, stellte das Enzym eine Zubereitung dar, die nahezu eine Einzelbande zeigte.

Beispiel 3

Die Konzentration von L-Fucose in einer Lösung wurde unter Verwendung der nachstehenden Reagenzien durch die folgende Methode bestimmt.

(1) Reagenzien
0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0)\|1,57 ml
NADP⁺ (15 mM)	0,065 ml
L-FDH (44 Einheiten/ml)	0,065 ml
Probenlösung	0,30 ml

(2) Quantitative Bestimmungsmethode

Es wurde eine definierte Menge eines jeden Reagenzes in ein Teströhrchen gegeben. Die Reagenzien wurden bei 37°C 5 Minuten lang zur Reaktion gebracht und die Absorption bei 340 nm gemessen. Die Absorption, die im Falle der Zugabe derselben Menge Wasser anstatt der Probe und durch Reaktion in ähnlicher Weise erhalten wurde, wurde von der vorherigen Absorption abgezogen, was die Absorption der Probe ergab.

Getrennt davon wurden L-Fucoselösungen mit bekannten Konzentrationen in ähnlicher Weise behandelt, um eine Eichkurve zu erhalten. Auf der Grundlage der Eichkurve wurde die Konzentration von L-Fucose ermittelt. Die Eichkurve ist in Fig. 6 gezeigt.

Beispiel 4

(1) Reagenzien
0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) (enthaltend 0,1% Triton X-100)\|150 µl
Phenazinmethosulfat (1 mg/ml)	5 µl
Nitroblautetrazolium (10 mg/ml)	5 µl
NADP⁺ (15 mM)	15 µl
L-FDH (44 Einheiten/ml)	15 µl
Probenlösung	10 µl

(2) Quantitative Bestimmungsmethode

Eine definierte Menge eines jeden Reagenzes wurde in ein Teströhrchen gegeben. Die Reagenzien wurden bei 37°C 10 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Dann wurden 2,0 ml 0,3 N Salzsäure zugegeben und die Mischung gründlich vermischt.

Die Absorption des gebildeten Farbstoffes wurde bei 570 nm gemessen. Die Absorption, die im Falle der Zugabe derselben Menge Wasser anstatt der Probenlösung und durch Reaktion in ähnlicher Weise erhalten wurde, wurde von der vorherigen Absorption als Nullprobe abgezogen.

Getrennt davon wurden L-Fucoselösungen mit bekannten Konzentrationen in ähnlicher Weise behandelt, um eine Eichkurve zu erhalten. Auf der Grundlage der Eichkurve wurde die Konzentration von L-Fucose ermittelt.

Beispiel 5

Die Konzentration von L-Fucose in 2′-Fucosyl-Lactose wurde unter Verwendung der nachstehenden Reagenzien durch die folgende Methode bestimmt.

(1) Reagenzien
0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0)\|215 µl
NADP⁺ (15 mM)	15 µl
L-FDH (44 Einheiten/ml)	60 µl
alpha-L-Fucosidase (aus Rinderepithelium) (12 Einheiten/ml)	100 µl

(2) Quantitative Bestimmungsmethode

Eine definierte Menge eines jeden Reagenzes wurde in eine Mikroküvette gegeben. Nach 5 Minuten bei 37°C wurden 10 µl von jeweils 0,3, 0,6, 0,9 und 1,2 mM Lösungen von 2′-Fucosyl-Lactose zugefügt. Nach 15minütiger Reaktion bei 37°C wurde die Absorption bei 340 nm gemessen. Die Absorption, die im Falle der Zugabe derselben Menge Wasser anstatt der 2′-Fucosyl-Lactose-Lösung und durch Reaktion in ähnlicher Weise erhalten wurde, wurde von der vorherigen Absorption als Nullprobe abgezogen. Als Ergebnis wurde eine gute lineare Beziehung zwischen der zugefügten 2′-Fucosyl-Lactose und der Zunahme der Absorption bei 340 nm festgestellt.

Claims

1. L-Fucose-Dehydrogenase, die Wasserstoff von L-Fucose abzieht und L-Fucose in L-Fuconolactam überführt und gleichzeitig Coenzym NADP⁺ zu NADPH reduziert.

2. L-Fucose-Dehydrogenase mit den folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:

(1) Wirkung und Substratspezifität:
sie zieht Wasserstoff von L-Fucose ab und überführt sie in L-Fuconolacton und reduziert gleichzeitig Coenzym NADP⁺ zu NADPH;
(2) Optimaler pH und stabiler pH-Bereich:
bei Verwendung von Tris-Imidazol-Natriumacetat- Pufferlösung liegen der optimale pH in einem Bereich von 9,0 bis 10,0 und der stabile pH-Bereich zwischen 8,0 und 10,5.

3. Verfahren zur Herstellung von L-Fucose-Dehydrogenase, die NADP⁺ als Coenzym verwendet, wobei man einen L-Fucose-Dehydrogenase erzeugenden Stamm, der zum Genus Pseudomonas gehört, in einem Medium züchtet und die gebildete L-Fucose-Dehydrogenase aus der Kultur gewinnt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der L-Fucose-Dehydrogenase erzeugende Strom Pseudomonas sp. Nr. 1143 (FERM BP-2056) ist.

5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose, wobei man eine L-Fucose enthaltende Probe mit L-Fucose-Dehydrogenase, die NADP⁺ als Coenzym erfordert, zur Reaktion bringt und gebildetes NADPH mißt.

6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose, wobei man eine L-Fucose enthaltende Probe mit L-Fucosidase und L-Fucose-Dehydrogenase, die NADP⁺ als Coenzym erfordert, aufeinanderfolgend oder gleichzeitig zur Reaktion bringt und gebildetes NADPH mißt.

7. Kit zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose, umfassend L-Fucose-Dehydrogenase, NADP⁺ und eine Pufferlösung.