DE68922846T2 - Enzymimmuntest für menschliches typiv-collagen gemäss dem sandwichverfahren. - Google Patents
Enzymimmuntest für menschliches typiv-collagen gemäss dem sandwichverfahren.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung des menschlichen Typ IV-Kollagens mittels eines Sandwich-Enzymimmuntests, das in einfacher Weise zur Diagnose von Lebererkrankungen verwendbar ist.
- Genauer stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Quantifizierung des großen, zentralen, tripelhelicalen Bereichs des menschlichen Typ IV-Kollagens sowie zur Quantifizierung der 7-S-Domäne menschlichen Typ IV-Kollagens mittels eines auf dem Einschritt-Sandwich-Verfahren basierenden Enzymimmuntests, wobei monoclonale Antikörper gegen menschliches Typ IV-Kollagen verwendet werden.
- Es wurde bereits von Radioimmuntests für das N-terminale Peptid des menschlichen Typ III-Prokollagens und der 7-S- Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens sowie des C-terminalen Peptids der NC1-Domäne in Serum mittels der entsprechenden polyclonalen Antikörper berichtet (Rohde et al., Eur. J. Clin. Invest. 9 (1979), 451-459; Högemann et al., Clin. Chim. Acta 144 (1984), 1-10; Schuppan et al., J. Clin. Invest. 78 (1986), 244-248. American J. Pathol. 108 (1982), 310-318 und J. Biochem. 103 (1988), 829-835, offenbaren gegen den tripelhelicalen Bereich des Typ IV-Kollagens gerichtete monoclonale Antikörper, wobei letztere nur den Stand der Technik gemäß Art. 54(3) EPÜ darstellt.
- Es wurde jedoch nichts über die Quantifizierung des großen, zentralen, tripelheticalen Bereichs und der 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens in Serum berichtet.
- Als Ergebnis umfassender von den gegenwärtigen Erfindern vorgenommener Untersuchungen von Verfahren zur Quantifizierung menschlichen Typ IV-Kollagens in spezifischer Weise wurde die vorliegende Erfindung erfolgreich vollendet. Diese stellt ein Verfahren bereit, das die Durchführungder Quantifizierung von menschlichem Typ IV-Kollagenpeptidin präziser und schneller Weise mit kleinen Probemengen ermöglicht, wobei ein auf dem Einschritt-Sandwich-Verfahren basierender Enzymimmuntest mittels monoclonaler Antikörper gegen Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen oder gegen die 7-S- Domäne menschlichen Typ IV-Kollagens durchgeführt wird.
- Das bisher bekannte Sandwich-Verfahren umfaßt die erste Reaktion, d.h. eine Reaktion zwischen den an einer festen Phase immobilisierten Antikörpern und den Antigenen in den Proben, die zweite Reaktion, d.h. eine Reaktion zwischen den an einer festen Phase immobilisierten Antikörper-Antigen-Komplexen und Enzym-markierten Antikörpern und die dritte Reaktion, d.h. eine Farbreaktion mit Enzymsubstraten. So sind zwei immunologische Reaktionsschritte vor der Farbreaktion erforderlich. Im Gegensatz zu einem derartigen Sandwich-Verfahren beruht das erfindungsgemäße Verfahren auf dem Einschritt-Sandwich- Verfahren, wobei die erste und die zweite Reaktion gleichzeitig ausgeführt werden. So wird die Durchführung vonTests mit einer großen Anzahl von Proben innerhalb kürzererzeitspannen mit größerer Präzision ermöglicht.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Quantifizierung des menschlichen Typ IV-Kollagens mittels eines auf dem Einschritt-Sandwich-Verfahren basierenden Enzymimmuntests bereit, wie nachstehend in (1) und (2) beschrieben:
- 1. Verfahren zur Quantifizierung des großen, zentralen, tripelhelicalen Bereichs des menschlichen Typ IV-Kollagens mittels eines auf dem Sandwich-Verfahren basierenden Enzymimmuntests unter Verwendung monoclonaler Antikörper gegen Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen, wobei
- (a) eine Probenlösung, hergestellt durch Verdünnen einer zu untersuchenden Probe mit einer Lösung eines Enzym-markierten Antikörpers in einem Puffer, wobei der Antikörper erhalten wird, indem mit einem Enzym ein monoclonaler Antikörper markiert wird, der mit dem großen, zentralen, tripelhelicalen Bereich von Pepsin-solubilisiertem, menschlichem Typ IV-Kollagen reagiert, und
- (b) eine Antikörper-überzogene feste Phase, die einen an einen Festphasen-Träger gebundenen monoclonalen Antikörper umfaßt, der nur mit Pepsin-solubilisiertem, menschlichem Typ IV-Kollagen reagiert,
- verwendet werden, und wobei die Antikörper-überzogene feste Phase (b) mit der Lösung (a) gemischt wird, wodurch eine Immunreaktion zwischen dem in der zu untersuchenden Probe vorhandenen menschlichen Typ IV-Kollagen, dem Enzym-markierten Antikörper und dem an den Festphasen-Träger gebundenen Antikörper auftritt, der Festphasen-Träger isoliert und die an die feste Phase gebundene Enzymaktivität gemessen wird, um so den großen, zentralen, tripelhelicalen Bereich des menschlichen Typ IV-Kollagens zu quantifizieren.
- 2. Verfahren zur Quantifizierung der 7-S-Domäne menschlichen Typ IV-Kollagens mittels eines auf dem Sandwich- Verfahren basierenden Enzymimmuntests unter Verwendung monoclonaler Antikörper gegen die 7-S-Domäne menschlichen Typ IV-Kollagens, wobei
- (a) eine Probenlösung, hergestellt durch Verdünnen einer zu untersuchenden Probe mit einer Lösung eines Enzym-markierten Antikörpers in einem Puffer, wobei der Antikörper erhalten wird, indem mit einem Enzym ein monoclonaler Antikörper markiert wird, der mit der Pepsin-solubilisierten 7-S-Domäne menschlichen Typ IV-Kollagens reagiert, und
- (b) eine Antikörper-überzogene feste Phase, die einen an einen Festphasen-Träger gebundenen monoclonalen Antikörper umfaßt, der nur mit der 7-S-Domäne menschlichen Typ IV-Kollagens reagiert,
- verwendet werden, und wobei die Antikörper-überzogene feste Phase (b) mit der Lösung (a) gemischt wird, wodurch eine Immunreaktion zwischen der in der zu untersuchenden Probe vorhandenen 7-S-Domäne menschlichen Typ IV-Kollagens, dem Enzym-markierten Antikörper und dem an den Festphasen-Träger gebundenen Antikörper auftritt, der Festphasen-Träger isoliert und die an die feste Phase gebundene Enzymaktivität gemessen wird, um so die 7-S-Domäne menschlichen Typ IV-Kollagens zu quantifizieren.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde eine IgG-Fraktion als der mit einem Enzym zu markierende Antikörper verwendet, die durch Fraktionierung von Antikörper-haltigem Material mit Ammoniumsulfat und anschließender Reinigung über DEAE-Sephacel und Protein-A-Affinitätssäulen erhalten wurde.
- Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt einesolche Ausführungsform, in der die verwendeten mono- undpolyclonalen Antikörper aus ihren spezifischen Bindungsstellen F(ab')&sub2; oder Fab' als solche bestehen können.
- Wie in den beiliegenden Figuren 2 und 5 dargestellt wird, sind nach Messung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die Peptidmengen des großen, zentralen, tripelhelicalen Bereichs und der 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens in Seren von Patienten mit Lebererkrankungen signifikant höher, als die in Seren von normalen, gesunden Versuchspersonen. Die Messung der Peptidmengen des großen, zentralen, tripelhelicalen Bereichs und der 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV- Kollagens in Serum ermöglicht die Vorhersage von Lebererkrankungen, besonders von Leberfibrose, Leberkarzinom und Metastasen in den Verdauungsorganen bildendem Leberkarzinom ohne auf die für die Patienten belastende Biopsie angewiesen zu sein.
- Wir haben bestätigt, daß Fibrose von Lebergewebe, Leberkarzinom und Metastasen in den Verdauungsorganen bildendes Leberkarzinom nicht mittels herkömmlicher auf ZTT (Zinksulfat- Trübungstest), GOT (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase), GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase), ALP (Alkalische Phosphatase), LDH (Lactat-Dehydrogenase), γ-GTP ( γ-Glutamyl- Transpeptidase) usw. beruhenden Leberfunktionstests bestimmt werden kann. Es wird daher erwartet, daß der Nachweis derartiger Erkrankungen in einem frühen Stadium durch Messung der Serumpeptidmengen des großen, zentralen, tripelhelicalen Bereichs und der 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ermöglicht wird, in Kombination mit dem von den gegenwärtigen Erfindern kürzlich offenbarten (Japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. Sho- 61-202162) Verfahren zur Bestimmung der Serummenge von menschlicher Prolyl 4-Hydroxylase.
- Die vorliegende Erfindung ist sehr nützlich, da gemäß dem vorliegenden Verfahren die Diagnose der Fibrose von Lebergewebe, des Leberkarzinoms und des Metastasen in den Verdauungsorganen bildenden Leberkarzinoms auf dermessung der Peptidmengen von menschlichem Typ IV-Kollagen basierend, gestellt werden kann.
- Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter in den folgenden Beispielen erläutert. Dies ist jedoch so zu deuten, daß der Schutzbereich dieser Erfindung durch diese spezifischen Beispiele nicht eingeschränkt wird.
- Menschliche Placenta wurde gemäß dem Verfahren von Mayne et al., Artery 7 (1980), 262-280 in 0.5 N Essigsäure homogenisiert, zum Solubilisieren der enthaltenen Kollagene mit Pepsin (1 mg/ml) gespalten und zur Fällung der Kollagene mit NACl zu einer Endkonzentration von 2 M versetzt. Das Präzipitat wurde in 0.5 N Essigsäure gelöst. Daraus wurde durch Dialyse gegen eine 0.7 M NaCl enthaltende 0.5 N Essigsäurelösung eine die Typ I- und Typ III-Kollageneenthaltende Fraktion erhalten und der Überstand anschließend gegen eine 1.2 M NaCl enthaltende 0.5 N Essigsäurelösung dialysiert, wobei eine die Typ IV- und V-Kollagene enthaltende Fraktion gefällt wurde. Die Typ IV- und V-Kollagene enthaltende Fraktion wurde in 0.5 M NaCl enthaltendem 50 mM Tris-HCl Puffer pH 7.4 gelöst und gegen 2.2 M NaCl enthaltenden 50 mM Tris- HCl-Puffer pH 7.4 dialysiert, wobei das Typ IV-Kollagen gefällt und von dem Typ V-Kollagen abgetrennt wurde. Die Reinheit des so erhaltenen Typ IV-Kollagens wurde gemäß dem Verfahren von Sykes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 72 (1976), 1472-1480 auf etwa 95% bestimmt, indem das Kollagen einer Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen wurde.
- In dieser SDS-PAGE wurden in Anwesenheit von Mercaptoethanol auch 11 verschiedene Banden nachgewiesen: 174 kD, 135 kD, 108 kd, 92 kD, 78 kD, 68 kD, 60 kD, 56 kD, 43 kD, 34 kD und 29.5 kD.
- Unter Verwendung von menschlicher Placenta und neugeborenen Ratten als Ausgangsmaterialien wurde das Verfahren, wie vorstehend in (a) beschrieben, durchgeführt. Pepsin-solubilisiertes Typ IV-Kollagen wurde ebenso wie Typ I-, III-, V- und VI-Kollagene aus menschlicher Placenta isoliert und gereinigt. Auch aus neugeborenen Ratten wurde Pepsin-solubilisiertes Typ IV-Kollagen hergestellt. Die lange N-terminale 7- S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens wurde gemäß dem Verfahren von Risteli et al., Eur. J. Biochem. 108 (1980), 239-250 aus dem vorstehend in (a) hergestellten Pepsin-solubilisierten Typ IV-Kollagen als Ausgangsmaterial hergestellt.
- Säure-extrahiertes Typ IV-Kollagen wurde gemäß dem Verfahren von Timpl et al., Eur. J. Biochem. 84 (1978), 43-52 und 95 (1979), 255-263 aus menschlicher Placenta als Ausgangsmaterial hergestellt. Die C-terminale NC1-Domäne des Typ IV-Kollagens wurde gemäß dem Verfahren von Timpl et al., Eur. J. Biochem. 120 (1981), 203-211 aus dem vorstehend erwähnten Säure-extrahierten Typ IV-Kollagen als Ausgangsmaterial hergestellt.
- Die Laminin P1-Fraktion wurde gemäß dem Verfahren von Risteli et al., Biochem. J. 193, 749-755 aus menschlicher Placenta als Ausgangsmaterial hergestellt.
- Zwei 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen wurden anfänglich 100 ug Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV- Kollagen in vollständigem Freund Adjuvans intraperitoneal injiziert. Nach der anfänglichen Verabreichung erhielten die Mäuse dann 2 bis 4 mal in 2 bis 4 Wochenabständen eine Auffrischungs-Impfung von 100 ug in 0.5 M NaCl enthaltendem 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7.4) gelöstem Antigen. Zur abschließenden Immunisierung erhielten die Mäuse 3 Tage vor der Entfernung ihrer Milz und der Präparation der Milzzellen eine intravenöse Verabreichung.
- Die verwendeten Materialien und Verfahren lauten wie folgt:
- RPMI 1640-Kulturmedium: durch Natrium-Bicarbonat (12 mM), Natrium-Pyruvat (1 mM), L-Glutamin (2 mM),Penicillin G Kalium (50 U/ml), Streptomycinsulfat (50ug/ml) und Amikacinsulfat (100 ug/ml) ergänztes, mit Trockeneis auf pH 7.2 eingestelltes und zur Sterilisation durch einen 0.2 um Toyo- Membranfilter filtriertes RPMI 1640 (Difco Laboratories).
- NS-1-Kulturmedium: das vorstehende durch 15% (V/V) sterilfiltriertes fetales Rinderserum (M.A. Bioproducts) ergänzte RPMI 1640-Kulturmedium.
- HAT-Kulturmedium: das vorstehende weiter durch Hypoxanthin (100 uM), Aminopterin (0.4 uM) und Thymidin (16 uM) ergänzte NS-1-Kulturmedium.
- HT-Kulturmedium: das gleiche Medium wie das vorstehende HAT- Medium, außer, daß kein Aminopterin enthalten ist.
- PEG 4000-Lösung: Serumfreies, 50% (Gew./Gew.) Polyethylenglykol 4000 (PEG 4000, Merck & Co., Inc.) enthaltendes RPMI 1640-Kulturmedium.
- Bei Tween, Sephacryl und Ultrogel handelt es sich um Warenzeichen.
- Die Zellfusion wurde mittels der 8-Azaguanin-resistenten Myelomzellinie NS-1 (P3-NS1-1) gemäß dem leicht modifizierten Verfahren von Oi et al., "Selected Method in Cellular Immunology", Hrsg. B. B. Mishell und S. M. Shiigi, W. H. Freeman und Company (1980), 351-372, durchgeführt. Die, wie vorstehend in (c) beschrieben, hergestellten Karyo-Splenocyten (Lebensfähigkeit der Zellen 95%) wurden im Verhältnis 5-6:1 mit Myelomzellen (Lebensfähigkeit der Zellen 95%) fusioniert. So wurden die Splenocyten und die Myelomzellen getrennt mit RPMI 1640-Kulturmedium gewaschen, anschließend in dem gleichen Medium suspendiert und zur Fusion in dem vorstehenden Verhältnis gemischt. In ein konisches 50 ml Styrenharz-Reaktionsgefäß (Iwaki Glass) wurden 40 ml des RPMI 1640- Kulturmediums gegeben und 10 Minuten bei 400xg zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Absaugen vollständig entfernt. Zu den präzipitierten Zellen wurde über einen Zeitraum von 1 Minute tropfenweise 1 ml auf 37ºC erwärmte PEG 4000-Lösung unter leichtem Rühren zugesetzt. Die Zellen wurden durch Rühren über eine weitere Minute resuspendiert und dispergiert. Anschließend wurde zu der Suspension über einen Zeitraum von 1 Minute tropfenweisel ml auf 37ºC erwärmtes RPMI 1640-Kulturmedium zugesetzt. Nach nochmaliger Wiederholung des gleichen Verfahrens wurden die Zellen durch tropfenweise Zugabe von 7 ml des gleichen Kulturmediums über einen Zeitraum von 2-3 Minuten unter ständigem Schütteln dispergiert. Die Dispersion wurde 10 Minuten bei 400xg zentrifugiert und der Überstand durch Absaugen vollständig entfernt. Zu den präziptierten Zellen wurden schnell 10 ml auf 37ºC erwärmtes NS-1-Kulturmedium gegeben und anschließend große Zellklumpen durch vorsichtiges Pipettieren mit einer 10 ml Pipette dispergiert. Die Dispersion wurde mit 20 ml des gleichen Kulturmediums verdünnt und auf einer aus Polystyren hergestellten 96 Vertiefungen enthaltenden Mikro-"well" (Iwaki Glass) verteilt, so daß sich in jeder Vertiefung 5.9 x 10&sup5; Zellen/0.1 ml befanden. Zur Vorbehandlung wurden die 96 Vertiefungen enthaltenden Mikro-"well" mit 0.2 ml NS-1-Kulturmedium über Nacht bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator behandelt. Das Kulturmedium wurde vor dem eigentlichen Gebrauch durch Absaugen daraus entfernt. Nach Abschluß der Zellfusion wurden die Mikrovertiefungen bei 37ºC in 7% CO&sub2;/93% Luft unter 100% Feuchtigkeit inkubiert.
- Am ersten Tag nach der Kultivierung wurden zwei Tropfen (ca. 0.1 ml) HAT-Kulturmedium mit einer Pasteurpipette zugesetzt. Am zweiten, dritten, fünften, achten und elften Tag wurde die Hälfte (0.1 ml) jedes Kulturmediums durch frisches HAT-Kulturmedium ersetzt. Am vierzehnten Tag wurde die Hälfte jedes Kulturmediums durch frisches HT-Kulturmedium ersetzt. Danach wurde das gleiche Verfahren in Intervallen von 3 bis 4 Tagen wiederholt. Normalerweise wurde ein ausreichendes Wachstum des Hybridoms nach zwei bis drei Wochen beobachtet. Alle gewachsene Hybridome enthaltenden Vertiefungen wurden mittels eines Festphasen-Antikörper-Bindungstests (ELISA) auf positive Vertiefungen getestet, wie nachstehend in (f) beschrieben. Alle Kulturen mit im vorstehenden Test positiven Hybridomen wurden auf eine 24 Vertiefungen enthaltende, aus Polystyren hergestellte (Iwaki Glass) Zell-"well" übertragen. Diese enthielt 1 ml 10&sup7; Maus-Thymocyten als Nährzellen enthaltendes HT-Kulturmedium. Die Kulturen wurden etwa eine Woche bei 37ºC in 7% CO&sub2; kultiviert, wie vorstehend in (d) beschrieben. Ein- oder zweimal wurden während des Kultivierungszeitraums 0.5 ml des Überstands in jeder Vertiefung durch 0.5 ml frisches HT-Kulturmedium ersetzt. Zu dem Zeitpunkt, an dem ausreichendes Wachstum der Hybridome beobachtet wurde, wurden die Kulturen nochmals mittels des ELISA-Verfahrens auf ihre Positivität überprüft und einem Clonierungsverfahren mittels des nachstehend in (g) beschriebenen Grenzverdünnungsverfahrens unterworfen. Die nach dem Clonieren zurückgebliebene Kultur wurde zur Herstellung einer gefrorenen Probe zur Lagerung in eine 25 cm² aus Polystyren hergestellte Gewebekulturflasche (Iwaki Glass) überführt.
- Bei dem in dem vorliegenden Beispiel verwendeten Verfahren handelt es sich um eine leichte Modifikation des Verfahrens von Rennard et al., Anal. Biochem. 104 (1980), 205-214, das für den Nachweis der Antikörperherstellung durch ein Hybridom geeignet ist.
- Jede Vertiefung der 96 Vertiefungen enthaltenden Mikrotiterplatte (Flow Laboratories, Inc.) wurde mit 0.5-1.0 ug Pepsinsolubilisiertem, menschlichem Typ IV-Kollagen beschichtet und der nicht-beschichtete Teil jeder Vertiefung mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Ein Teil des überstands aus den die gewachsenen Hybridome enthaltenden Vertiefungen wurde zu den Vertiefungen gegeben. Die Inkubation wurde etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Zugabe von mit Meerrettich-Peroxidase (POD) markiertem Anti-Maus-Immunglobulin aus der Ziege (Cappel Lab.) als sekundärem Antikörper wurde die Inkubation etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Durch Messung der Absorption bei 492 nm mittels eines Mikroplatten-Lesegeräts (MPR-A4, Toyo Soda Kogyo) wurde die Tiefe der nach der Zugabe der Substrate H&sub2;O&sub2; und o- Phenylendiamin (OPD) gebildeten braunen Farbe bestimmt.
- Zum Erhalt von Hybridomen mit der Fähigkeit, monoclonale Antikörper herzustellen, ist es erforderlich, die Clonierung gemäß dem Grenzverdünnungsverfahren durchzuführen, da jede Vertiefung zwei oder mehrere Arten von Hybridomen hervorbringen kann. Ein Kulturmedium zur Clonierung wurde hergestellt, das in NS-1-Kulturmedium 10&sup7; Mausthymocyten/ml als Nährzellen enthielt. 5, 1 und 0.5 Hybridomzellen/Vertiefung wurden zu 36, 36 bzw. 24 Vertiefungen einer 96 Vertiefungen enthaltenden Mikro-"well" gegeben. Ferner wurden am fünften und zwölften Tag etwa 0.1 ml NS-1-Kulturmedium zu jeder Vertiefung gegeben. Etwa 14-15 Tage nach der Clonierung nach Beobachtung eines ausreichenden Wachstums des Hybridoms wurde die Gruppe der Kulturen, in der mehr als 50% der Vertiefungen keine Koloniebildung aufwiesen, einem ELISA unterzogen. Zeigten nicht alle der getesteten Vertiefungenein positives Ergebnis, so wurden die Kolonien in den Antikörper-positiven Vertiefungen aufgelistet und von diesen 4-6 die Bildung einer einzigen Kolonie aufweisende Vertiefungen zum Reclonieren ausgewählt. Schließlich wurden 22 Clone mit der Fähigkeit erhalten, einen monoclonalen Antikörper gegen Pepsin-solubilisiertes Typ IV-Kollagen herzustellen.
- Monoclonale Antikörper können aus dem Überstand eines geeigneten Kulturmediums wie NS-1-Kulturmedium erhalten werden, in dem jeder der in (g) erhaltenen Clone kultiviert wurde (in vitro-Vermehrung) (die Konzentration des monoclonalen Antikörper-Proteins betrug 10-100 ug/ml). Falls eine große Antikörpermenge hergestellt werden soll, wird andererseits eine in vivo-Vermehrung durchgeführt, wie nachstehend beschrieben. Ein krebserregendes Reizmittel, Pristan (2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecan, Aldrich Chemical) wurde Tieren (Balb/c-Mäusen) intraperitoneal in einem Volumen von 0.5 ml pro Tier verabreicht. Diese Tiere stammten von dem syngenen Stamm, zu dem auch die Splenocyten und Myelomzellen bereitstellenden Tiere gehören. Ein bis drei Wochen nach der Verabreichung wurden wie vorstehend 1 x 10&sup7; Zellen jedes Hybridoms intraperitoneal verabreicht und monoclonales Antikörper-Protein in einer Konzentration von 4-7 mg/ml enthaltende Asciten nach 1 bis 2 Wochen erhalten.
- Zunächst wurde jeder der vorstehend in (h) erhaltenen Asciten in einer abgetrennten Reihe von mit Pepsin-solubilisiertem menschlichem Typ IV-Kollagen beschichteten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte placiert und der in jedem Ascit vorliegende monoclonale Antikörper wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen ELISA-Verfahren daran gebunden. Nach dem Waschen wurden Isotyp-spezifische Anti-Maus Ig-Antikörper aus Kaninchen (Zymed Laboratories) hinzugegeben. Nach dem Waschen wurde ein POD-markierter Anti-Kaninchen IgG (H + L) Antikörper aus der Ziege hinzugegeben und anschließend 2,2'-Azino-di(3- ethylbenzothiazolinsulfat-6) und Wasserstoffperoxid als Substrat zum Nachweis der Isotypen von schweren und leichten Ketten verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Unter den erhaltenen monoclonalen Antikörpern gegen Pepsin-solubilisiertes menschliches Typ IV-Kollagen wurden 16 die γ1/K Immunglobulin-Kette enthaltende Antikörper, 2 γ2b/K Antikörper, ein α/K Antikörper und 3 u/K Antikörper gefunden. Tabelle 1 In (g) erhaltener Clon Nr. Isotyp Kette
- Die Antikörper der vorstehend in (h) erhaltenen Ascites wurden mit Ammoniumsulfat fraktioniert (40% Sättigung). Die IgG- Klasse wurde zur Abtrennung einer nicht-adsorbierten Fraktion auf mit 0.06 M NaCl enthaltendem 40 mM Phosphatpuffer (pH 8.0) equilibriertes DEAE-Sephacel (Pharmacia) geladen. Das aus dem Kulturmedium stammende fetale Kalbsserum und von der Maus stammende Proteine wurden abgetrennt und entfernt.
- Zur Reinigung der IGA- und IGM-Klassen wurden diese einer Säulenchromatographie über mit 0.1 M NaCl enthaltendem 40 mM Phosphatpuffer (pH 8.0) equilibriertes DEAE-Sephacel unterzogen und die entsprechende Fraktionen mit einem NaCl-Gradienten von 0.1 M-1.0 M eluiert.
- Die IgG-Klasse wurde weiter zur Entfernung der nicht-adsorbierten Fraktion durch Adsorption der Fraktion an eine mit 0.15 M NaCl enthaltendem 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 8.6) equilibrierte Protein A-Cellulofine Säule (Seikagaku Kogyo) gereinigt und anschließend mit 0.15 M NaCl enthaltendem 50 mM Acetatpuffer (pH 4.0) eluiert. Die Eluate wurden direkt mit 1.5 M Tris-HCl Puffer (pH 8.9) neutralisiert.
- Quantifizierung des großen, zentralen, tripelhelicalen Bereichs des Typ IV-Kollagens in menschlichen Seren
- Die in Beispiel 1 (j) erhaltene IgG-Fraktion wurde in 0.1 M NaCl enthaltendem 0.1 M Acetatpuffer (pH 4.2) gelöst und der Lösung Pepsin zur Spaltung wie folgt zugesetzt. So wurde Pepsin zu der Fraktion zu 2% (Gew./Gew.) basierend auf dem darin enthaltenen IgG zugesetzt. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37ºC gespalten. Zum Abstoppen der Spaltung wurde der pH der das Spaltprodukt enthaltenden Lösung mit 2 M Tris auf 7.0 eingestellt. Das Produkt wurde über eine mit 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7.0) equilibrierte Ultrogel AcA 44 Säule (LKB) gelfiltriert. Man erhält eine F(ab')&sub2;-Fraktion.
- Die F(ab')&sub2;-Fraktion wurde gegen 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthaltenden 0.1 M Phosphatpuffer (pH 6.0) dialysiert und Aminoethanthiol (MEA) zu einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt, um für 1.5 Stunden bei 37ºC eine Reduktion zu bewirken. Das Produkt wurde über eine mit 5 mM EDTA enthaltendem 0.1 M Phosphatpuffer (pH 6.0) equilibrierte Ultrogel AcA 44 Säule gelfiltriert. Man erhält eine Fab'- Fraktion.
- Unabhängig von dem vorstehend in (1) erwähnten Verfahren wurde POD mit einer Maleimid-Verbindung wie folgt markiert. So wurde POD in 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7.0) zu 10 mg/ml gelöst und der Lösung 25 Mol pro Mol POD in Dimethylformamid gelöstes N-(ε-Maleimidcaproyloxy)succinimid (EMCS) zugesetzt. Die 30-minütige Reaktion erfolgte bei 30ºC. Das Produkt wurde über eine mit 0.1 M Phosphatpuffer (pH 6.0) equilibrierte Sephadex G-50 Säule gelfiltriert. Man erhält eine Maleimid-markierte POD-Fraktion.
- Die vorstehend in (1) und (2) hergestellten Fraktionen wurden so gemischt, daß equimolare Mengen des Fab' und des Maleimidmarkierten POD in den entsprechenden Fraktionen gemischt wurden. Das Gemisch wurde anschließend mit 5 mM EDTA enthaltendem 0.1 M Phosphatpuffer (pH 6.0) zu einer Endkonzentration von 100 uM bezogen auf Fab' und Maleimid-markierte POD verdünnt. Nach einer 20-stündigen Reaktion bei 4ºC wurden zum Blockieren der Thiolgruppen, die nicht reagiert hatten, pro Mol Fab' 10 Mol N-Ethylmaleimid zugesetzt. Das Produkt wurde über eine mit 0.1 M Phosphatpuffer (pH 6.5) equilibrierte Ultrogel AcA 44 Säule gelfiltriert. Man erhält eine Fab'-POD- Konjugat-haltige Fraktion. Zur Lagerung bei 4ºC wurden dieser 0.1% BSA und 0.005% Thimerosal zugesetzt.
- Der in Beispiel 1 (j) (Clon Nr. 4H12) erhaltene, gereinigte monoclonale Antikörper gegen Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen wurde in 0.1% Natriumazid enthaltendem 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7.5) zu einer Konzentration von 0.1 mg/ml gelöst. Die als Festphasen-Träger verwendeten Polystyrenkugeln wurden in diese Antikörperlösung getaucht, so daß die Polystyrenkugeln mit dem Antikörper beschichtet wurden. Die zum Eintauchen verwendete Antikörperlösung wurde dann zurückgewonnen und die Polystyrenkugeln mit 0.1% BSA, 0.1 M NaCl und 0.1% Natriumazid enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (ph 7.0) gewaschen und bei 4ºC gelagert. Zur tatsächlichen Verwendung wurden die Antikörper-beschichteten Polystyrenkugeln mit 0.1 M NaCl enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) gewaschen.
- Als Standardprobe wurde in Beispiel 1 (a) erhaltenes gereinigtes Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen verwendet. So wurde davon eine 40 ng/20 ul Lösung in 1% BSA, 0.1 M NaCl, 1/50 (V/V) Pferdeserum (M.A. Bioproducts) und 0.05% Thimerosal enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) hergestellt und die Lösung schrittweise verdünnt. Als zu untersuchende Probe wurde ein 20 ul Aliquot aus jeder Verdünnung entnommen.
- Als Serumproben wurden je 20 ul Serum jeder normalen Versuchsperson (NOR) und 20 ul Serum von jedem Patienten mit einem hepatocellulären Karzinom (HCC), einer Leberzirrhose (LC) oder mit chronischer aktiver Hepatitis (CAH) verwendet. Diese Proben wurden jeweils in 300 ul 0.8 ug/ml Fab' (Clon Nr. 1D3)-POD-Konjugat, 1% BSA, 0.1 M NaCl, 1/50 (V/V) Pferdeserum und 0.05% Thimerosal enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (ph 7.0) gelöst. Zu jeder dieser Standard- und Serumproben wurde die mit monoclonalem Antikörper beschichtete Polystyrenkugel gegeben. Das System wurde 45 Minuten bei 37ºC (Immunreaktion) inkubiert und die Kugel mit 0.1 M NaCl enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) gewaschen. Zu jeder Kugel wurden dann 300 ul einer Substratlösung für POD in 0.1 M Acetatpuffer (pH 5.5) gegeben, d.h. 0.0134% Tetramethylbenzidin (TMBZ). Nach weiterer Zugabe von 100 ul wäßrigem 0.01 %igen H&sub2;O&sub2; wurde das System 30 Minuten bei 37ºC inkubiert (Farbreaktion). Zum Abstoppen der Reaktion wurden 600 ul 1.33 N schweflige Säure zugesetzt. Nach dem Abstoppen der Reaktion wurde die Absorption bei 450 nm mittels eines Shimazu-"microflow"-Spectrophotometers (UV-730) (ultraviolettsichtbar) unter Verwendung von Wasser als Referenzgemessen. Die Differenz zwischen der Absorption der Leerprobe undder Probe wurde berechnet. Aus einer mit der Standardprobeerstellten Standardkurve wurde die der Absorption von 20 ul der Probe entsprechende Menge des Typ IV-Kollagenpeptidsabgelesen und mit 50 multipliziert. Man erhält die in 1 ml der Probe enthaltene Menge Typ IV-Kollagen (Tabelle 2). Tabelle 2 Probe Standard-Lösung zur Erstellung einer Standardkurve Reagentien für die Leerprobe Enzym-markierte Antikörperlösung Antikörper-beschichtete Kugel (Immunreaktion) (Waschen) Substratlösung Farb-Hilfreagenz (Farbreaktion) Reaktions-Abstopplösung (Colorimetrie) Kugel Mischen, gefolgt vom Stehenlassen und Erwärmen bei 37ºC für genau 45 Minuten Dreimaliges Waschen mit 3 ml Waschlösung unter Absaugen mit einem Absauger Stehenlassen und Erwärmen bei 37ºC für genau 30 Minuten Messung der Absorption bei 450 nm
- Figur 1 stellt die Standardkurve für Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen dar. Aus Figur 1 geht deutlich hervor, daß die Sensitivität dieses Sandwich-Verfahrens bei 0.31 ng/Reaktionsgefäß lag und die Linearität bei 0.31-40.0 ng/Reaktionsgefäß erhalten wurde. Der Variationskoeffizient (CV) des Tests betrug 2.6-9.5%. Die erforderlichen Reaktionszeiten bei diesem Kugel-Verfahren betrugen für die Immunreaktion 45 Minuten und 30 Minuten für die Farbreaktion. Dadurch wurde für die Bestimmungen weniger als die Hälfte der für das herkömmliche Zweischritt-Sandwich-Verfahren erforderlichen Zeit benötigt (z.B. japanische, offengelegte Patentanmeldung Nr. Sho-61-202162).
- Dieses Sandwich-Verfahren wurde zur Bestimmung des TYP IV- Kollagens in Seren von NOR, HCC, LC und CAH Patienten mit dem Ergebnis verwendet, daß wenn M (Mittelwert) + 25D (Standardabweichung) für NOR-Seren als oberer Referenzwert bei Lebererkrankungen genommen wurde, die Positivität bei 97%, 80% bzw. 80% lag (Fig.2).
- Bei einer aus 12 Patienten mit Magenkrebs ohne Metastasenbildung bestehenden Metastasen-negativen Gruppe (M(-)), einer aus 13 histologisch oder durch diagnostisches Sichtbarmachen("diagnostic imaging") bestätigten solchen Fällen bestehenden Lebermetastasen-Gruppe (HM) und einer aus 10 solchen Fällen bestehenden Lymphknotenmetastasen-Gruppe (LM) wurden die Typ IV-Kollagen Serummengen mittels dieses Sandwich-Verfahrens bestimmt. Aus Fig. 3 geht deutlich hervor, daß die Mengen an Typ IV-Kollagen bei HM, LM und M(-) 552 + 300, 199 ± 81 bzw. 104 ± 62 ng/ml (M ± SD) betrug. Wenn M + 2SD für NOR-Seren als oberer Referenzwert genommen wurde, betrug die Positivität für diese Erkrankungen 100%, 80% bzw. 25%.
- Der in Beispiel 1 (j) (Clon Nr. 4H12) erhaltene gereinigte monoclonale Antikörper gegen Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen wurde in 0.1% Natriumazid enthaltendem 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7.5) zu einer Konzentration von 0.1 mg/ml gelöst. Zu einer Polystyren-Mikroplatte als Festphasen- Träger wurden zur Beschichtung der Platte ausdieser Antikörperlösung 100 ul/Vertiefung gegeben. Die sobeschichtete Platte wurde dann bei 4ºC gelagert. Bei ihrer tatsächlichen Verwendung wurde die Platte mit 300 ul 1% BSA, 0.1 M NaCl und 0.1% Natriumazid enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) blockiert und anschließend mit 0.1 M NaCl und 0.1% (V/V) Tween 20 enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) gewaschen.
- Als Standardprobe wurde in Beispiel 1 (a) erhaltenes gereinigtes Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen verwendet. So wurde daraus eine 50 ng/50 ul Lösung in 1% BSA, 0.1 M NaCl, 1/50 (V/V) Pferdeserum und 0.05% Thimerosal enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) hergestellt und die Lösung schrittweise verdünnt. Aus jeder Verdünnung wurde ein 20 ul Aliquot zu jeder Vertiefung zugegeben. Als Serumproben wurden 20 ul Serum/Vertiefung von jeder normalen Versuchsperson (NOR) und 20 ul Serum/Vertiefung von jedem Patienten mit HCC, LC, CAH oder chronischer inaktiver Hepatitis (CIH) verwendet. Ein 50 ul Aliquot aus jeder Probe wurde in 200 ul 0.8 ug/ml Fab' (Clon Nr. 1D3)-POD-Konjugat, 1% BSA, 0.1 M NaCl, 1/50 (V/V) Pferdeserum und 0.05% Thimerosal enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) gelöst. Ein 100 ul/Vertiefung Aliquot wurde aus jeder derartigen Probelösung zu der mit monoclonalem Antikörper beschichteten Microplatte gegeben. Das System wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur (10- 30ºC) inkubiert (Immunreaktion). Zu jeder Vertiefung wurden dann zum Abstoppen der Immunreaktion 100 ul 0.1 M NaCl und 0.1% Tween 20 (V/V) enthaltender 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) gegeben. Jede Vertiefung wurde dann mit 0.1 M NaCl und 0.1% (V/V) Tween 20 enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) gewaschen. OPD 2HCl wurde in 0.02% H&sub2;O&sub2; enthaltendem Citrat-Phosphatpuffer (pH 6.0) zu einer Konzentration von 4 mg/ml gelöst und 100 ul der erhaltenen Lösung (pH 5.0) hinzugegeben. Das System wurde dann 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (Farbreaktion) und zum Abstoppen der Reaktion 100 ul 1.33 N schweflige Säure zugesetzt. Nach dem Abstoppen der Reaktion wurde die Absorption bei 492 nm mittels eines Microplatten-Lesegeräts gemessen und die Differenz zwischen der Absorption der Leerprobe und der Probe berechnet. Aus einer mit der Standardprobe erstellten Standardkurve wurde die der Absorption von 20 ul der Probe entsprechende Menge an Typ IV-Kollagenpeptid abgelesen und mit 50 multipliziert. Man erhält die in 1 ml der Probe enthaltene Typ IV-Kolllagenmenge. Tabelle 3 Probe Standardlösung zur Herstellung einer Standardkurve Enzym-markierte Antikörperlösung Antikörper-beschichtete Microplatte (Immunreaktion) Waschlösung (Waschen) Substratlösung (Farbreaktion) Reaktions-Abstopplösung (Colorimetrie) Vertiefungen Mischen und Zugabe von 100 ul der gemischten Lösung pro Vertiefung und anschließendes Stehenlassen bei Raumtemperatur für genau 60 Min. Viermaliges Waschen mit 300 ul Waschlösung unter Absaugen mit einem Absauger Stehenlassen bei Raumtemperatur für genau 15 Minuten Messung der Absorption bei 492 nm
- Fig. 4 stellt die Standardkurve für Pepsin-solubilisiertes menschliches Typ IV-Kollagen dar. Aus dieser Figur geht hervor, daß die Sensitivität dieses Sandwich-Verfahrens 0.16 ng/Vertiefung und die Linearität 0.16-20 ng/Vertiefung betrug. Der CV dieses Versuchssystems betrug 0.5-6.0%. Die erforderlichen Reaktionszeiten dieses Platten-Verfahrens betrugen für die Immunreaktion 60 Minuten und 15 Minuten für die Farbreaktion. Dadurch wurde für die Bestimmungen einer Anzahl von Proben weniger als die Hälfte der für das herkömmliche Zweischritt-Sandwich-Verfahren erforderlichen Zeit benötigt. Sehr zufriedenstellende Ergebnisse wurden auch wie in Tabelle 4 dargestellt hinsichtlich der Präzision erhalten, wenn wiederholte Bestimmungen der verschiedenen Proben im Intra-Test und der gleichen Probe im Inter-Test vorgenommen wurden (in beiden Fällen CV < 5%). Tabelle 4 (A) Intra-Test Variationen Probe Menschliches Typ IV-Kollagen (ng/ml) (B) Inter-Test Variationen Tag der Bestimmung Menschliches Typ IV-Kollagen (ng/ml) Probe Erster Tag Zweiter Tag
- Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Quantifizierung des Kollagenpeptids verwendet wurde, wurden signifikante Erhöhungen der Kollagenpeptid-Mengen in Seren von Patienten mit HCC, LC und CAH beobachtet. Wenn M + 2SD für NOR-Seren als oberer Referenzwert genommen wurde, betrug die Positivität für jede Erkrankung 92% (HCC), 87% (LC), 83% (CAH) bzw. 39% (CIH) (Fig.5). Derartige Erhöhungen der Kollagenpeptid-Mengen in Seren von Patienten mit Lebererkrankungen stimmen mit der bei Verwendung des Einschritt-Sandwich-Verfahrens mittels einer Polystyrenkugel als Festphasen-Träger beobachteten Tendenz überein.
- Das in Beispiel 1 (a) gereinigte Pepsin-solubilisierte, menschliche Typ IV-Kollagen wurde einer SDS-PAGE und einem Western-Blot gemäß dem Verfahren von Tanabe ("Saibo Kogaku" (Cell Technology) 1 & 2 (1983), 1061-1068) unter Verwendung des in Beispiel 2 (a) erhaltenen Fab'-POD-Konjugats unterzogen, wobei Muster der Enzym-Antikörper-Färbung erhalten wurden.
- Bei den Mustern, die mittels SDS-PAGE mit dem anschließenden Färben der Proteine mit Coomassie Brilliant Blau erhalten wurden, sowie bei denjenigen, die durch den Western-Blot jeder Nitrocellulosemembran erhalten wurden, gefolgt von dem immunologischen Färben mit dem in Beispiel 2 (a) erhaltenen Fab'-(Clon Nr. 1D3)-POD-Konjugat, wurden in Anwesenheit von Mercaptoethanol 5 Banden, die 190 kD, 175 kD, 125 kD, 94 kD und 86 kD entsprachen, sowie zwei Aggregate von über 200 kD (205 kD und 220 kD) beobachtet. In ähnlichen, durch immunologisches Färben mit dem Fab'-(Clon Nr. 4H12)-POD-Konjugat erhaltenen Mustern wurden 5 Banden, die 185 kD, 170 kD, 155 kd, 120 kD und 90 kD entsprachen, sowie zwei Aggregate von über 200 kD (200 kD und 220 kD) beobachtet, wie in Fig. 6 dargestellt.
- Die Größe des Molekulargewichts der durch die in den Beispielen 2(b) und (c) beschriebenen Enzymimmuntests für menschliches Typ IV-Kollagen bestimmten immunreaktiven Proteine wurde bestimmt. So wurden jeweils 300 ng menschliches Typ IV- Kollagen enthaltende Seren von NOR und Patienten mit HCC mittels Sephacryl S-300 (1.6 x 90 cm, Pharmacia) gelfiltriert, das mit 0.05% Tween 20 und 0.15 M NaCl enthaltendem 20 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) equilibriert worden war. Jede Fraktion wurde zur Quantifizierung der immunreaktiven Proteine dem in Beispiel 2(b) beschriebenen Einschritt-Sandwich-Verfahren mittels einer Polystyrenkugel unterzogen. Wie in Fig. 7 dargestellt, zeigen die immunreaktiven Proteine in Seren von den NOR (- -) und den Patienten mit Lebererkrankungen (-x-) einen einzigen Peak. Dessen Molekulargewicht lag etwas unter dem des als Referenz verwendeten Pepsin-solubilisierten, menschlichen Typ IV-Kollagenpeptids (300 ng, -o-). Das durchschnittliche Molekulargewicht der in den Seren enthaltenen immunreaktiven Proteine wurde anhand einer mit Fibrinogen, Immunglobulin, Rinderserum-Albumin und Peroxidase erstellten Standardkurve auf 620 kD geschätzt.
- Die, wie in Beispiel 1(b) hergestellten menschlichen Typ I, III, IV (Säure-extrahiert), V und VI-Kollagene, die 7-S- Domäne, NC1-Domäne, Laminin P1-Fraktion und das Pepsin-solubilisierte Ratten Typ IV-Kollagen wurden zum Vergleich mit dem Wert für Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen mittels des in Beispiel 2(b) beschriebenen Einschritt-Sandwich-Verfahrens unter Verwendung einer Polystyrenkugel quantifiziert. Wie in Tabelle 5 dargestellt, wurde keine Kreuzreaktion mit irgendeinem anderen Kollagen oder einer anderen Laminin P1-Fraktion gefunden. Nur mit dem Typ VI-Kollagen wurde eine leichte Kreuzreaktion (ca. 7%) beobachtet. Tabelle 5 Kreuzreaktivität verschiedener Kollagentypen, 7-S-Domäne des Typ IV-Kollagens, NC1-Domäne und Laminin P1-Fraktion Verschiedene Kollagentypen und Basalmembran-Komponenten Konzentration (2.5 ng/Reaktionsgefäß) Laminin * Säure-extrahiertes Typ IV-Kollagen ** Pepsin-solubilisiertes Ratten Typ IV-Kollagen Die Werte in dieser Tabelle sind in prozent im Verhältnis zu dem Wert für Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen angegeben.
- Zu zwei verschiedenen menschlichen Seren, d.h. eines mit einem Typ IV-Kollagengehalt von 0.93 ng/ml und ein anderes mit einem Gehalt von 234.0 ng/ml wurde Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen zu Konzentrationen im Bereich von 31-500 ng/ml gegeben. Ihre Rückgewinnung (%) wurde mittels des in Beispiel 2(b) oder 2(c) beschriebenen Einschritt-Sandwich-Verfahrens unter Verwendung einer Polystyrenkugel oder einer Polystyrenplatte überprüft. Wie in Fig. 8 dargestellt, betrug der Korrelations- und Rückgewinnungskoeffizient (%) des im Verhältnis zu dem zugesetzten Pepsin-solubilisierten Typ IV-Kollagen zurückgewonnenen Typ IV-Kollagens γ = 0.9997, 99.4 ± 10.3% (M ± SD) und γ = 0.9993, 101.6 ± 7.1 % für die Kugel- bzw. Platten-Verfahren.
- Wie aus dem in Fig. 6 dargestellten Muster eines Immunblots hervorgeht, unterscheiden sich die Antigen-Erkennungsstellen des bei dem in den Beispielen 2(b) und2(c) beschriebenen Einschritt-Sandwich-Verfahren mittels einer Kugel oder Platte verwendeten Festphasen-Antikörpers (Clonnr. 4H12) und POD- markierten Antikörpers (Clon Nr. 1D3) leicht. Zur Untersuchung der Antigen-Erkennungsstellen des Festphasen- und POD-markierten Antikörpers wurde die Hemmung (%) der Antigen- Antikörper-Reaktion bestimmt. So wurden 10 ng/Reaktionsgefäß Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen und 0-10 ug/Reaktionsgefäß des monoclonalen Antikörpers (Clon Nr. 1D3, 3A9 und 4H12) 60 Minuten bei 37ºC in 1% BSA und 0.1 M NaCl enthaltendem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) vorinkubiert. Zu jedem Reaktionsgefäß wurde eine mit einem monoclonalen Antikörper (Clon Nr. 4H12) beschichtete, gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 2(b) hergestellte Polystyrenkugel und 40 ng Fab' (Clon Nr. 3A9)-POD-Konjugat gegeben. Nach einer 60-minütigen Inkubation bei 37ºC und anschließender Zugabe von TMBZ und wäßrigem Wasserstoffperoxid wurde jedes Reaktionsgefäß 60 Minuten bei 30ºC stehengelassen und anschließend der Bestimmung von A&sub4;&sub5;&sub0; unterzogen. Wie in Fig. 9 dargestellt, wurde bei Behandlung des Standard-Pepsin-solubilisierten, menschlichen Typ IV-Kollagens mit dem monoclonalen Antikörper des Clons Nr. 1D3 (-x-) keine Hemmung der Antigen- Antikörper-Reaktion beobachtet. Andererseits wurde bei Behandlung mit den für den Festphasen-Antikörper und das Konjugat verwendeten monoclonalen Antikörpern der Clone Nr. 3A9 (- -) und Nr. 4H12 (-o-) eine Hemmung beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß der bei dem Einschritt-Sandwich-Verfahren verwendete hier offenbarte Festphasen-Antikörper (Clon Nr. 4H12) spezifisch mit einer sich von der des POD-markierten Antikörpers (Clon Nr. 1D3) unterscheidenden antigenen Determinante des Pepsin-solubilisierten, menschlichen Typ IV-Kollagens reagiert.
- So zeigen die Ergebnisse von (a) bis (e), daß das eine Kugel oder Microplatte, wie hier offenbart, verwendende Einschritt- Sandwich-Enzym-Immunverfahren ein Testsystem mit der Fähigkeit darstellt, ganz spezifisch den großen, zentralen, tripelhelicalen Bereich des Typ IV-Kollagens zu erkennen.
- Gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden 17 monoclonale Antikörper gegen die 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens hergestellt. Vier dieser Clone wiesen γ1/K Immunglobulin-Ketten und die anderen 13 u/K -Ketten auf (Tabelle 6). Tabelle 6 Isotyp Kette
- Eine Microplatte wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2(c) mit dem vorstehend in (a) (Clon Nr. 31-8G9) erhaltenen gereinigten monoclonalen Antikörper gegen die 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens beschichtet. POD-markierter Antikörper wurde gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren mittels in Beispiel 1 (Clon Nr. 4H12) erhaltenem monoclonalem Antikörper gegen Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagenpeptid hergestellt.
- Bei Verwendung der in Beispiel 1(b) als Standardprobe hergestellten 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens wurde eine Standardkurve gemäß dem in Tabelle 7 (Fig. 10) dargestellten Verfahren erstellt. Tabelle 7 Probe Standardlösung zur Erstellung einer Standardkurve Enzym-markierte Antikörperlösung Antikörper-beschichtete Microplatte (Immunreaktion) Waschlösung (Waschen) Substratlösung (Farbreaktion) Reaktions-Abstopplösung (Colorimetrie) Vertiefungen Mischen und Zugabe von 100 ul der gemischten Lösung pro Vertiefung und anschließendes Stehenlassen bei Raumtemperatur für genau 60 Min. Fünfmaliges Waschen mit 300 ul Waschlösung unter Absaugen mit einem Absauger. Stehenlassen bei Raumtemperatur für genau 30 Min. Messung der Absorption bei 492 nm
- Wie aus Fig.10 deutlich hervorgeht, lag die Sensitivität dieses Sandwich-Verfahrens bei 0.5 ng/Vertiefung und die Linearität wurde bei 0.5-54 ng/Vertiefung erhalten. Der CV des Tests betrug 0.3-6.8%. Die für dieses Platten-Verfahren erforderlichen Reaktionszeiten betrugen für die Immunreaktion 60 Minuten und 30 Minuten für die Farbreaktion. Dadurch wurden Bestimmungen der 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV- Kollagens mit hoher Sensitivität innerhalb einer kurzen Versuchszeit ermöglicht, wie es auch bei den in Beispiel2(c) gezeigten Bestimmungen des großen, zentralen, tripelhelicalen Bereichs des menschlichen Typ IV-Kollagens der Fall war.
- Dieses Sandwich-Verfahren wurde zur Bestimmung der 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens in Seren von NOR, LC und HCC Patienten mit dem Ergebnis verwendet, daß, wenn M + 2SD für NOR-Seren als oberer Referenzwert genommen wurde, die Positivität für LC und HCC bei 71% bzw. 100% lag (Tabelle 8). Tabelle 8 Probe Nr. NOR-Seren LC-Seren HCC-Seren Positivität (%)
- Zu einem 5 ng/ml der 7-S-Domäne des Typ IV-Kollagens enthaltenden menschlichen Serum wurde die 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens in Konzentrationen im Bereich von 40- 1280 ng/ml gegeben. Ihre Rückgewinnung (%) wurde mittels des Einschritt-Sandwich-Verfahrens, wie vorstehend in (b) beschrieben, unter Verwendung einer Microplatte überprüft. Wie in Fig. 11 dargestellt, betrug der Korrelations- und Rückgewinnungskoeffizient (%) der im Verhältnis zu der zugesetzten 7-S-Domäne zurückgewonnenen 7-S-Domäne γ = 0.9991 und 94.2 ± 14.7% (M ± SD). Diese Ergebnisse zeigen, daß das Einschritt- Sandwich-Verfahren mittels einer Microplatte, wie vorstehend in (b) beschrieben, ein spezifisches Verfahren zum Nachweis der 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens darstellt.
- Fig.1 stellt eine Standardkurve für Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen dar, die mittels des Einschritt- Sandwich-Verfahrens unter Verwendung einer Polystyrenkugel als Festphasen-Träger erstellt wurde (Kugel-Verfahren).
- Fig.2 stellt die mit dem Kugel-Verfahren bestimmten Serummengen des immunreaktiven Typ IV-Kollagenpeptids für NOR und für HCC, LC und CAH Patienten dar. In dieser Figur geben die horizontalen Balken M, die unterbrochene Linie M + 2SD für NOR und jede in Klammern gesetzte Zahl die Anzahl der Proben an.
- Fig.3 stellt die mit dem Kugel-Verfahren bestimmten Serummengen des immunreaktiven Typ-IV-Kollagens für HM, LM und M(-) Patienten dar. In dieser Figur geben die vertikalen Balken M ± SD, die unterbrochene Linie M + 2SD und jede in Klammern gesetzte Zahl die Anzahl der Proben an.
- Fig.4 stellt eine Standardkurve für Pepsin-solubilisiertes, menschliches Typ IV-Kollagen dar, die mittels des Einschritt- Sandwich-Verfahrens unter Verwendung einer Polystyren-Microplatte als Festphasen-Träger erstellt wurde (Platten-Verfahren).
- Fig.5 stellt die mit dem Platten-Verfahren bestimmten Serummengen des immunreaktiven Typ IV-Kollagenpeptids für NOR und für HCC, LC, CAH und CIH Patienten dar. In dieser Figur geben die horizontalen Balken M, die unterbrochen Linie M + 2SD und jede in Klammern gesetzte Zahl die Anzahl der Proben an.
- Fig. 6 stellt Muster von Immunblots von Standard-Pepsinsolubilisiertem, menschlichem Typ IV-Kollagenpeptid dar. A: Gefärbt mit Fab'-(Clon Nr. 1D3)-POD-Konjugat; B: gefärbt mit Fab'-(Clon Nr. 4H12)-POD-Konjugat.
- Fig. 7 stellt Gelfiltrations-Profile der immunreaktiven Proteine in menschlichen Seren dar.
- Fig. 8 stellt Korrelationen zwischen dem zurückgewonnenen Typ IV-Kollagen und dem zu menschlichen Seren für das Kugel- Verfahren (A) und das Platten-Verfahren (B) zugesetzten Pepsin-solubilisierten, menschlichen Typ IV-Kollagen dar.
- Fig.9 stellt die Hemmung (%) der Antigen-Antikörper-Reaktion für 3 Arten monoclonaler Antikörper dar.
- Fig.10 stellt eine Standardkurve für die 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens dar.
- Fig. 11 stellt eine Korrelation zwischen der zurückgewonnenen Kollagen-7-S-Domäne und der zu menschlichem Serum zugesetzten 7-S-Domäne des menschlichen Typ IV-Kollagens dar.
Claims (2)
1. Verfahren zur Quantifizierung des großen, zentralen,
tripelhelicalen Bereichs des menschlichen Typ IV-Kollagens
mittels eines auf dem Sandwich-Verfahren basierenden
Enzymimmuntests unter Verwendung monoclonaler Antikörper
gegen Pepsin-solubilisiertes menschliches Typ
IV-Kollagen, wobei
(a) eine Probenlösung, hergestellt durch Verdünnen
einer zu untersuchenden Probe mit einer Lösung eines
Enzym-markierten Antikörpers in einem Puffer, wobei
der Antikörper erhalten wird, indem mit einem Enzym
ein monoclonaler Antikörper markiert wird, der mit
dem großen, zentralen, tripelhelicalen Bereich von
Pepsin-solubilisiertem menschlichem Typ IV-Kollagen
reagiert, und
(b) eine Antikörper-überzogene feste Phase, die einen
an einen Festphasen-Träger gebundenen monoclonalen
Antikörper umfaßt, der nur mit
Pepsin-solubilisiertem menschlichem Typ IV-Kollagen reagiert,
verwendet werden, und wobei die Antikörper-überzogene
feste Phase (b) mit der Lösung (a) gemischt wird,
wodurch eine Immunreaktion zwischen dem in der zu
untersuchenden Probe vorhandenen menschlichen Typ
IV-Kollagen, dem Enzym-markierten Antikörper und dem an den
Festphasen-Träger gebundenen Antikörper auftritt, der
Festphasen-Träger isoliert und die an die feste Phase
gebundene Enzymaktivität gemessen wird, um so den
großen, zentralen, tripelhelicalen Bereich des
menschlichen Typ IV-Kollagens zu quantifizieren.
2. Verfahren zur Quantifizierung der 7-S-Domäne
menschlichen
Typ IV-Kollagens mittels eines auf dem Sandwich-
Verfahren basierenden Enzymimmuntests unter Verwendung
monoclonaler Antikörper gegen die 7-S-Domäne
menschlichen Typ IV-Kollagens, wobei
(a) eine Probenlösung, hergestellt durch Verdünnen
einer zu untersuchenden Probe mit einer Lösung eines
Enzym-markierten Antikörpers in einem Puffer, wobei
der Antikörper erhalten wird, indem mit einem Enzym
ein monoclonaler Antikörper markiert wird, der mit
der Pepsin-solubilisierten 7-S-Domäne menschlichen
Typ IV-Kollagens reagiert, und
(b) eine Antikörper-überzogene feste Phase, die einen
an einen Festphasen-Träger gebundenen monoclonalen
Antikörper umfaßt, der nur mit der 7-S-Domäne
menschlichen Typ IV-Kollagens reagiert,
verwendet werden, und wobei die Antikörper-überzogene
feste Phase (b) mit der Lösung (a) gemischt wird,
wodurch eine Immunreaktion zwischen der in der zu
untersuchenden Probe vorhandenen 7-S-Domäne menschlichen Typ
IV-Kollagens, dem Enzym-markierten Antikörper und dem an
den Festphasen-Träger gebundenen Antikörper auftritt,
der Festphasen-Träger isoliert und die an die feste
Phase gebundene Enzymaktivität gemessen wird, um so die
7-S-Domäne menschlichen Typ IV-Kollagens zu
quantifizieren.
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