DE3782356T2

DE3782356T2 - Reinigungsverfahren der proteischen antigene von bordetella-bakterien zur gewinnung eines azellularen vakzins.

Info

Publication number: DE3782356T2
Application number: DE8787400877T
Authority: DE
Inventors: Francois Arminjon; Marie-Jose Quentin-Millet
Original assignee: Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1986-04-16
Filing date: 1987-04-16
Publication date: 1993-04-29
Anticipated expiration: 2007-04-17
Also published as: ATE81782T1; AU7158187A; EP0242301B1; ZA872712B; JPS62258326A; ES2000435A4; DE3782356D1; JPH08231421A; GR3006840T3; JP2563797B2; JP2599260B2; FR2597344B1; JP2599259B2; US4774086A; JPH08225463A; AU601415B2; LU90378I2; DE242301T1; EP0242301A1; GR880300043T1

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung des Verfahrens zur Reinigung von proteinischen Antigenen der Bakterien, die zur Gattung Bordetella gehören, um einen azellulären Impfstoff zu erzeugen.
Es ist bekannt, daß aus der Kultur der Bakterien der Gattung Bordetella, beispielsweise Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis und Bordetella bronchiseptica, das F-HA-Protein (filamentäres Hemagglutinin) erzeugt werden kann; weiterhin kann aus der Kultur von B. pertussis auch ein proteinisches Exotoxin erzeugt werden: das Keuchhusten-Toxin (auch LPF oder LPF-HA genannt: Leukocytosis Promoting Factor-Hemagglutinin).
Die Bakterien der Gattung Bordetella sind bekannte pathogene Wirkstoffe. Es ist insbesondere bekannt, daß das Bakterium Bordetella pertussis der pathogene Wirkstoff des Keuchhustens ist und daß seine industrielle Züchtung zur Herstellung von Impfstoffen gegen Keuchhusten angewendet wird.
Es ist bekannt weiterhin, daß die Antigene Keuchhusten-Toxin und F-HA als Bestandteil eines azellulären Impfstoffes gegen Keuchhusten geeignet sind.
Die Reinigung des Keuchhusten-Toxins umfaßt im allgemeinen eine Reinigungsschritt durch Affinitätschromatographie.
Die Elution des Keuchhusten-Toxins von dem affinitätschromatographischen Trägerstoff wird im allgemeinen mittels Pufferlösungen durchgeführt, die erhöhte Konzentrationen an Salzen und/oder chaotropischen oder denaturierenden Wirkstoffen enthalten, wie Magnesiumchlorid, Harnstoff, Natrium- oder Kaliumthiocyanat, Guanidinchlorhydrat etc. Der aktive Bestandteil, der somit in Gegenwart dieser Produkte gewonnen wird, kann so in einer Impfstoffpräparation nicht verwendet werden. Daher muß das Eluat, das das Toxin enthält, einem zusätzlichen Schritt unterzogen werden, durch den eine völlige Entfernung der chaotropischen Wirkstoffe und/oder eine Verringerung der Salzkonzentrationen erreicht wird. Dieser zusätzliche Schritt kann beispielsweise in einer gründlichen Dialyse oder Gelfiltration bestehen; siehe beispielsweise U.S. Patentschrift 4,500,639 und europäische Patentanmeldung Nr. 0 140 386.
Weiterhin führt die Anwendung dieser Elutionstechniken im allgemeinen dazu, daß der aktive Bestandteil teilweise und irreversibel unlöslich gemacht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer speziellen Pufferlösung, die die Reinigung des Keuchhusten- Toxins ermöglicht. Die Verwendung dieses speziellen Puffers erlaubt die Elution des Keuchhusten-Toxins von dem affinitätschromatographischen Trägermaterial. Die Verwendung dieser Pufferlösung ermöglicht die Elution und daher die Reinigung des Keuchhusten-Toxins in einem einzigen Schritt mit hohen Ausbeuten. Die Verwendung desselben Puffers, versetzt mit einem oberflächenaktiven Mittel, ermöglicht weiterhin die verlustfreie Solubilisierung des Keuchhusten-Toxins und von F-HA. Dieser Puffer dient auch bei dem Entgiftungsverfahren des Keuchhusten-Toxins als Lösungsmittel und erlaubt es, das Anatoxin in Lösung zu halten.
Weiterhin ist der erfindungsgemäße spezielle Puffer im Gegensatz zu den herkömmlich verwendeten Puffern mit der Herstellung eines Impfstoffes kompatibel. Anders ausgedrückt, können die Antigene, die sich in diesem Puffer in Lösung befinden, direkt bei der Impfstoffherstellung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft also die Verwendung eines Carbonatpuffers, der einen pH-Wert von 8,3 bis 11,6 aufweist, bei der Solubilisierung und/oder Entgiftung des Keuchhusten- Toxins und von F-HA der Bakterien aus der Gattung Bordetella. Ein solcher Puffer kann auf herkömmliche Weise erzeugt werden, beispielsweise durch Herstellung einer wäßrigen Lösung aus einem Gemisch eines Bicarbonats (Hydrogencarbonats) und eines Alkalicarbonats (wobei das Alkalimetall Natrium oder Kalium ist) oder auch durch Mischen eines Alkalibicarbonats und eines Alkalimetallhydroxids (Natrium- oder Kaliumhydroxid) in wäßriger Lösung.
Vorzugsweise weist der Carbonatpuffer eine Molarität von 0,025 bis 0,05 mol und einen pH-Wert von 8,3 bis 11,6 auf.
Der erfindungsgemäß verwendete Carbonatpuffer kann weiterhin ein oberflächenaktives Mittel enthalten, beispielsweise ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, wie Tween 80 (Warenzeichen für Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat).
Im allgemeinen wird vorzugsweise ein Puffer mit einem oberflächenaktiven Mittel verwendet, wenn dieses zur Solubilisierung des Produkts (Keuchhusten-Toxin oder F-HA) nötig ist, das in Form eines Niederschlags oder eines Lyophilisats vorliegt. Die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in dem Puffer liegt im allgemeinen unterhalb von 1 Gew.-% und am häufigsten unterhalb von 0,5 Gew.-%. Soll das Keuchhusten- Toxin eluiert werden, wird vorzugsweise der Carbonatpuffer ohne das oberflächenaktive Mittel verwendet.
Die erfindungsgemäße Verwendung solcher Carbonatpuffer hat die im folgenden beschriebenen Vorteile.
Der Carbonatpuffer ermöglicht die Elution des Keuchhusten- Toxins von einem affinitätschromatographischen Trägermaterial. Die chromatographierte Flüssigkeit kann entweder ein Überstand der Kultur von Bakterien aus der Gattung Bordetella oder eine mit Keuchhusten-Toxin angereicherte Fraktion sein.
Es ist bekannt, daß die Verwendung des Keuchhusten-Toxins in einem azellulären Impfstoff ein Vorentgiftungsverfahren erforderlich macht, beispielsweise eine Behandlung mit Formaldehydlösung oder Glutaraldehyd. Die Entgiftung wird durchgeführt, um insbesondere den Induktionseffekt von Lymphocytose bei der Maus, die Sensibilisierung auf Histamin, die ADP-Ribosyl-Transferase-Aktivität, den cytopathogenen Effekt auf die CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) etc. auszuschalten.
Eine solche Entgiftung, beispielsweise mittels Formaldehydlösung, führt zur Unlöslichkeit des Toxins, was die Erzeugung einer gereinigten homogenen Präparation erschwert; siehe beispielsweise die U.S. Patentschrift 4,455,297.
Die Verwendung von Carbonatpuffer, dem gegebenenfalls ein oberflächenaktives Mittel zugesetzt wird, erlaubt die Durchführung eines Entgiftungsverfahrens in Lösung und das Verbleibenen des erzeugten Anatoxins in Lösung.
Schließlich kann, wie zuvor erwähnt, die Lösung des Keuchhusten-Anatoxins in dem Carbonatpuffer direkt zur Herstellung von azellulärem Impfstoff verwendet werden.
Weiterhin wurde gefunden, daß der Carbonatpuffer (gegebenenfalls mit einem oberflächenaktiven Mittel versetzt, beispielsweise einem nichtionischen, oberflächenaktiven Mittel, wie Tween 80 ) die Löslichkeit von F-HA fördert.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Reinigung von proteinischen Antigenen, die in den Kulturmedien der Bakterien aus der Gattung Bordetella hergestellt worden sind, wobei das Verfahren durch die Tatsache gekennzeichnet ist, daß der Überstand der Kultur oder einer mit Keuchhusten-Toxin angereicherten Fraktion mit einem festen chromatographischen Trägermaterial in Kontakt gebracht wird, das in der Lage ist, das Keuchhusten-Toxin zu binden und daß dann das Toxin von dem genannten festen Trägermaterial mittels eines Carbonatpuffers, der einen pH-Wert von 8,3 bis 11,6 aufweist, eluiert wird und daß das Eluat gegebenfalls einem Entgiftungsverfahren unterzogen wird.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform wird der Überstand der Kultur oder die mit dem Keuchhusten-Toxin angereicherte Fraktion, nachdem der pH-Wert auf einen Wert zwischen 6 und 8, vorzugsweise 7, eingestellt worden ist, mit einem Glycoprotein in Kontakt gebracht, das gegenüber dem Keuchhusten- Toxin eine Affinität aufweist, insbesondere mit einem Asialoglycoprotein (beispielsweise Asialofetuin), das an ein festes chromatographisches Trägermaterial gebunden ist. Die Menge des chromatographischen Trägermaterials, das verwendet wird, ist eine Funktion des Volumens der Anfangslösung und/oder der Konzentration an Keuchhusten-Toxin in der zu reinigenden Fraktion. Der Kontakt mit der Säule wird beispielsweise bei einer Temperatur von 2 bis 30ºC durchgeführt.
Die Glycoproteine, die gegenüber dem Keuchhusten-Toxin Affinität aufweisen, sind bekannt. Als Beispiele können Haptoglobin, Fetuin etc. angeführt werden. In jedem Falle wird die Affinitätschromatographie vorzugsweise auf Proteine angewendet, die vorher einer Desialylierungsbehandlung unterzogen worden waren, wobei diese Desialylierung durch eine schwache saure Hydrolyse nach bekannten Verfahren durchgeführt wird; siehe beispielsweise SPIRO et al., J. Biol. Chem. 1974, 249, 5704-5717.
Die Kupplung des Glycoproteins oder des desialylierten Glycoproteins kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Das Trägermaterial kann ein ganz klassisches festes Trägermaterial sein, das bei der Affinitätschromatographie gewöhnlich verwendet wird.
Das Trägermaterial ist insbesondere ein Polyolderivat, wie ein Cellulosederivat, ein vernetztes Dextran, ein Agarosegel oder Sepharose 4B oder auch ein Trägermaterial auf der Grundlage von Acrylderivaten, wie Trisacryl, das durch die Firma IBF (Industrie Biologigue Francaise) vertrieben wird.
Das Glycoprotein kann auf das Trägermaterial fixiert sein, indem beispielsweise ein CNBr-aktiviertes Trägermaterial verwendet wird.
Das Trägermaterial kann weiterhin ein Trägermaterial aus porösem Kieselsäureanhydrid sein, das mit vernetztem DEAE- Dextran beschichtet ist. Beispielsweise kann Spherosil, das mit DEAE-Dextran überzogen ist, verwendet werden.
Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Carbonatpuffer ist vorzugsweise ein Puffer, der eine Molarität von 0,025M bis 0,5M und einen pH-Wert von 8,3 bis 11,6 aufweist.
Nach der Elution kann das Keuchhusten-Toxin beispielsweise durch Ammoniumsulfat bei einer Sättigung von 50 bis 80% ausgefällt werden oder es wird direkt einem Entgiftungsschritt unterzogen.
Das so gereinigte Toxin kann in Form eines Ammoniumsulfatniederschlags oder in lyophilisierter Form aufbewahrt werden. Der Niederschlag oder das Lyophilisat können in einem Carbonatpuffer einer Molarität größer als 25mM, pH 8,3 bis 11,6, der ein Detergens wie Tween 80 in einer Endkonzentration im Bereich von 0,05 bis 0,5%, vorzugsweise in einem Carbonatpuffer von 100mM, pH 9,6, der 0,05% Tween 80 enthält (im folgenden als CTW-Puffer bezeichnet), wieder in Lösung gebracht werden.
Zur Abtrennung des Ammoniumsulfatrückstandes oder des Lyophilisationsträgermaterials wird die Lösung gegen mehrere Volumen desselben Puffers bei einer Temperatur von 2 bis 30ºC 4 bis 72 Stunden lang einer Dialyse unterzogen. Die Zusammensetzung des Puffers erlaubt dabei eine vollständige Solubilisierung, die Lösung kann über eine Membran der Porosität 0,22 um filtriert werden. Dies hat den Vorteil, daß die Entgiftungsschritte in steriler Umgebung und die Durchführung der chemischen oder biologischen Versuche fortgesetzt werden können, zu deren Durchführung eine völlige Solubilisierung des aktiven Bestandteils notwendig ist oder deren Durchführung durch eine völlige Solubilisierung erleichtert wird.
Die mögliche Entgiftung des Keuchhusten-Toxins wird auf eine Art durchgeführt, die der gleicht, die für Toxine im allgemeinen verwendet wird. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Entgiftungsverfahren in einem wie oben definierten Carbonatpuffer durchgeführt, der vorzugsweise ein oberflächenaktives Mittel enthält, das zugleich die Solubilisierung des Toxins und sein Verbleiben in Lösung im Verlauf der Entgiftungsreaktion fördert. Somit liegt die Ausbeute des Entgiftungsschrittes nahe bei 100%. Die verwendeten Entgiftungsmittel sind beispielsweise eine Formaldehydlösung oder Glutaraldehyd.
Nach der Entgiftung, die beispielsweise bei einer Temperatur von 4 bis 40ºC durchgeführt werden kann, kann die Lösung, die das Anatoxin enthält, gegen den CTW-Puffer dialysiert werden, um sämtliche Spuren des Entgiftungsmittels zu beseitigen. Das so erhaltene Anatoxin bleibt in Lösung, es kann über eine Sterilmembran der Porosität 0,22 um filtriert werden und ist bereit, um in eine Impfstoffpräparation eingearbeitet zu werden.
Wie oben erwähnt, erlaubt der erfindungsgemäß beschriebene Carbonatpuffer weiterhin die vollständige Solubilisierung eines weiteren isolierten Proteins, das aus den Überständen des Kulturmediums der Bakterien der Gattung Bordetella isoliert worden ist: des F-HA-Proteins. Die Verwendung dieses Puffers bei dem Solubilisierungsschritt von F-HA hat die für den Fall des Keuchhusten-Toxins beschriebenen Vorteile, d.h. insbesondere mit einem Schritt fortzufahren, bei dem über eine Membran von 0,22 um ohne Verlust an aktivem Bestandteil sterilfiltriert wird. In dieser Form kann F-HA direkt in eine Impfstoffpräparation eingearbeitet werden.
Beispielsweise wird F-HA, das in Form eines Ammoniumsulfatniederschlages aufbewahrt worden ist, gemäß der zuvor beschriebenen Technik für das Keuchhusten-Toxin wieder in Lösung gebracht. Der Niederschlag wird zentrifugiert, in CTW- Puffer aufgenommen und bei Umgebungstemperatur oder 4 bis 8ºC 4 bis 72 Stunden lang dialysiert. Der CTW-Puffer erlaubt die vollständige Solubilisierung von F-HA.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen azellulären Impfstoff gegen Keuchhusten, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er mindestens einen aktiven Bestandteil, ausgewählt aus dem Keuchhusten-Anatoxin und F-HA, enthält, wobei der oder die genannten aktiven Bestandteile in einem wie oben beschriebenen Carbonatpuffer in Lösung vorliegen, insbesondere in einem Carbonatpuffer, der ein oberflächenaktives Mittel enthält, wie CTW-Puffer.
Das Keuchhusten-Anatoxin und F-HA, die sich in dem Carbonatpuffer in Lösung befinden, können direkt in die Impfstoffpräparationen eingearbeitet werden. Diese können entweder das Anatoxin allein oder eine Mischung aus Anatoxin und F-HA in den gewünschten Anteilen enthalten. Um den End-pH- Wert des Impfstoffes auf einen Wert zwischen 7 und 8 zu korrigieren, wird ein bestimmtes Volumen einer gepufferten, wäßrigen physiologischen Lösung (PBS-Puffer) hinzugegeben, die mittels einer Lösung aus konzentrierter Säure angesäuert worden ist. Das zugesetzte Volumen ist eine Funktion des Volumens der Molarität des in der Präparation vorliegenden Carbonatpuffers. Die Konzentration an aktivem Bestandteil/ aktiven Bestandteilen wird demnach durch Zugabe des nötigen Volumens PBS-Puffer auf den gewünschten Wert eingestellt. Zu diesem Zeitpunkt können zu der Mischung weitere Antigene (Diphterie-Antigene, Tetanus-, Polio-, Hemophilus-Antigene, etc.), ein Konservierungsstoff, wie Merthiolat oder Phenoxyethanol, und ein Adjuvans, wie Aluminiumoxidgel oder Calciumphosphat, gegeben werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.

BEISPIEL 1

Reinigung des Keuchhusten-Toxins durch Affinitäts-chromatographie

a) Adsorption des Keuchhusten-Toxins an das Affinitätsträgermaterial

Eine mit Keuchhusten-Toxin angereicherte Fraktion, erhalten nach Zentrifugation und Konzentration einer bakteriellen Suspension von Bordetella pertussis aus Phase I, kultiviert in einem 30 Liter-Fermenter, wird mit einer Aufgabegeschwindigkeit von 6 ml/cm²/Stunde über eine Säule von 4 cm Durchmesser laufen gelassen, die 120 ml Chromatographie-Trägermaterial Sepharose 4B, gekuppelt mit Asialofetuin, enthält.
Die Sepharose 4B wurde auf folgende Weise mit Asialofetuin gekuppelt:
30 g CNBr-aktivierte Sepharose 4B(Pharmacia) werden in 6 l 1 mM HCl-Lösung etwa 15 Minuten lang quellen gelassen. Das Gel wird anschließend dreimal mit 6 l 1 mM HCl gewaschen. 400 ml einer Lösung, die 1 mg/ml Asialofetuin, 0,1 M NaHCO&sub3; und 0,5 M NaCl enthält, werden zu dem Gel gegeben.
Das Gemisch wird bei +4ºC unter leichtem Rühren eine Nacht lang umgesetzt. 125 ml einer 5 M Ethanolaminlösung, pH 8,0, werden zu der Mischung gegeben. Nach 4stündiger Inkubation bei Umgebungstemperatur wird das Gel nacheinander mit 500 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,0, der 1 M NaCl enthält, 500 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, der 1 M NaCl enthält, gewaschen. Dieser Waschzyklus wird dreimal wiederholt.
Das Gel wird anschließend dreimal mit 500 ml, 50 mM Tris- HCl-Puffer, pH 7,5, in Gegenwart eines Konservierungsstoffes, wie Merthiolat, in einer Konzentration von 1:10000 (Gew./Vol.), gewaschen.
Das als Ligand bei der Affinitätschromatographie verwendete Asialofetuin wird auffolgende Weise erzeugt:
Eine wäßrige Fetuinlösung (Fetuintyp III, Sigma) wird mittels 0,05 N H&sub2;SO&sub4; bei 80ºC 1 Stunde lang hydrolysiert. Nach der Hydrolyse wird die Lösung gegen mehrere destillierte Wasserbäder 24 Stunden lang bei +4ºC dialysiert, um die freien Sialinsäuren zu entfernen. Die Asialofetuinlösung kann durch Ultrafiltration mit Hilfe eines Systems konzentriert werden, das mit Membranen ausgestattet ist, deren Ausschlußschwelle gleich 10000 beträgt.
Die Entfernung der Sialinsäuren wird durch eine spezielle kolorimetrische Bestimmung der Sialinsäuren auf dem Protein vor und nach der Hydrolyse kontrolliert.

b) Elution des Keuchhusten-Toxins

Das Gel wird mit 2 Säulenvolumen 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, gewaschen, d.h. bis zum vollständigen Verschwinden der UV-Absorption bei 278 nm, dann wird mit einem Säulenvolumen 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, der 1 M NaCl enthält, gewaschen. Das Keuchhusten-Toxin wird mit 400 ml 100 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, eluiert.
Der Carbonatpuffer wird wie folgt hergestellt:
Zu 500 ml einer 0,1 M NaHCO&sub3;-Lösung wird eine 0,1 M Na&sub2;CO&sub3;-Lösung bis zu einem End-pH-Wert von 9,6 zugegeben. Es müssen etwa 250 ml Na&sub2;CO&sub3;-Lösung zugegeben werden.
Der so erzeugte Carbonatpuffer wird über eine Membran der Porosität 0,22 um filtriert und bei +4ºC aufbewahrt.
Die optische Dichte und Hemagglutinat-Aktivität der am Säulenausgang gesammelten Fraktionen werden gemessen.
Die Fraktionen, die den aktiven Bestandteil enthalten, d.h. die, die eine starke Hemagglutinat-Aktivität, die nicht durch Cholesterin gehemmt wird, aufweisen, werden vereinigt.
Das Keuchhusten-Toxin wird anschließend mittels Ammoniumsulfat bei einer Endkonzentration, entsprechend einer 70%igen Sättigung, ausgefällt.
Das so gereinigte Keuchhusten-Toxin induziert eine starke Lymphozytose und sensibilisiert in einer Dosis von 0,04 ug/Maus die CFW-Mäuse gegenüber Histamin. Die Fähigkeit des Toxins, die Bildung von Clustern auf den CHO-Zellen zu induzieren, wird durch eine spezifische Aktivität im Bereich von 65000 bis 260000 CPU/ug charakterisiert.
Die Ergebnisse der physikochemischen Kontrollen und der biologischen Aktivitäten (kolorimetrische Bestimmungen der möglichen Verunreinigungen, ADN, ARN, Zucker, Bestimmung des Endotoxingehaltes, Elektrophorese in SDS-Lösung oder saurer Lösung etc.) sprechen für eine homogene Endpräparation, die einen hochgereinigten aktiven Bestandteil enthält.
Die Analysen des Keuchhusten-Toxingehaltes im Überstand des Anfangskulturmediums und im Endniederschlag zeigen einen Reinigungsgrad von über 90%.

BEISPIEL 2

Vergleichsstudie über die Auflösung des Keuchhusten-Toxins in verschiedenen Pufferlösungen nach Sterilfiltration

1,2 ml einer Keuchhusten-Toxinsuspension in Form eines Ammoniumsulfatniederschlages von 2,6 mg/ml werden abgenommen und 10 Minuten lang bei 10000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, der Rückstand wird in 4 ml CTW-Puffer aufgenommen und gegen denselben Puffer dialysiert. Die Toxinlösung wird über eine Membran der Porosität 0,22 um filtriert. Die Konzentration an Protein der Lösung vor und nach der Filtration wird durch eine Messung nach dem Verfahren von Lowry bestimmt. Die Ergebnisse werden entweder als Filtrationsausbeute ausgedrückt (Toxinkonzentration nach der Filtration/Toxinkonzentration vor der Filtration) x 100 oder als relativer Prozentsatz, der bezogen auf die Filtrationsausbeute in CTW-Puffer, dem willkürlich die Ausbeute 100% zugeordnet wird, berechnet wird.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt TABELLE 1 Vergleichsstudie über die Filtrationsausbeuten an Keuchhusten-Toxin in verschiedenen Pufferlösungen Puffer Filtrationsausbeute % % relativ bezüglich CTW-Puffer 20 mM Natriumphosphat 0,5 M NaCl pH 7,2 mit 1% Zwittergent TM 3-14* 20 mM Natriumphosphat 0,5 M NaCl pH 7,2 mit 3,5 10&supmin;&sup6;M β-Cyclodextrin 20 mM Natriumphosphat 0,5 M NaCL pH 7,2 mit 0,05% Tween 80 20 mM Natriumphosphat 0,5 M Nacl pH 7,2 mit 1 M Harnstoff 100 mM Citrat pH 7,0 100 mM Carbonat pH 9,6 CTW * Handelsname für N-Tetradecyl-N,N'-dimethyl-3-ammonio- 1-propansulfonat

BEISPIEL 3

Beispiel für die Entgiftung des Keuchhusten-Toxins

a) Entgiftung mittels Formaldehydlösung

2 ml einer Suspension des Keuchhusten-Toxins in Form eines Ammoniumsulfatniederschlags von 5 mg/ml (d.h. 10 mg Keuchhusten-Toxin) werden 15 Minuten lang bei 10000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und der Rückstand in 10 ml CTW-Puffer aufgenommen.
Die Lösung wird bei +4ºC eine Nacht lang gegen 2 l CTW-Puffer dialysiert. Am Ende der Dialyse wird die Lösung über eine Membran der Porosität 0,22 um filtriert. Eine Messung der Proteine nach dem Verfahren von Lowry wird mit der filtrierten Lösung durchgeführt. Die Konzentration an Proteinen wird durch Zugabe von CTW-Puffer auf 0,4 mg/ml eingestellt. Zu 23 ml der Toxinlösung mit 0,4 mg/ml werden 1,22ml 1 M Lysin in CTW-Pufferlösung und 0,265 ml 37%ige Formaldehydlösung gegeben. Beispielsweise wird bei 4ºC 21 Tage lang inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird anschließend gegen CTW-Puffer bei +4ºC 48 Stunden lang dialysiert, um sämtliche Formaldehydspuren zu beseitigen. Das Anatoxin wird anschließend über eine Membran der Porosität 0,22 um sterilfiltriert. In dieser Form kann das Keuchhusten-Anatoxin in eine Impfstoff-Präparation eingearbeitet werden.

b) Entgiftung mittels Glutaraldehyd

15 ml einer Keuchhusten-Toxinlösung von 500 ug/ml in CTW- Puffer werden wie zuvor beschrieben hergestellt. 5 ml 0,10% Glutaraldehyd in CTW-Puffer werden zu der Toxinlösung gegeben.
Die Entgiftung kann bei verschiedenen Temperaturen von +4ºC bis 40ºC durchgeführt werden. Die Inkubationszeiten des Toxins in Gegenwart von Glutaraldehyd sind eine Funktion der Temperatur. Beispielsweise kann das Gemisch bei 4ºC 48 Stunden lang inkubiert werden.
Nach der Inkubation werden 180 ul 1 M Lysin in einer Lösung des CTW-Puffers zu dem Gemisch gegeben, und die Lösung wird bei 4ºC 48 Stunden lang gegen CTW-Puffer dialysiert. Nach der Dialyse wird das Keuchhusten-Anatoxin über eine Membran der Porosität 0,22 um filtriert. In dieser Form kann es in eine Impfstoff-Präparation eingearbeitet werden.

BEISPIEL 4

Beispiele für die Solubilisierung von F-HA durch Carbonatpuffer

Das in diesen Beispielen erwähnte F-HA wurde gemäß der in der Veröffentlichung von SATO Y., COWELL J.L., SATO H., BURSTYN D.G. und MANCLARK C.R. "Separation and Purification of Hemagglutinins from Bordetella pertussis" Infect. and Immun., 1983, 41, 1, 313, 320 beschriebenen Technik hergestellt.
F-HA wird in Form des Ammoniumsulfatniederschlags bei einer Sättigung von 70% aufbewahrt.
a) 25 ml einer F-HA-Suspension von 1,2 mg/ml in Form des Ammoniumsulfatniederschlags werden 20 Minuten lang bei 30000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, und der Rückstand wird in 30 ml CTW-Puffer aufgenommen.
Die Lösung wird eine Nacht lang bei +4ºC gegen CTW-Puffer dialysiert. Die Lösung wird über eine Membran der Porosität 0,22 um filtriert. F-HA kann in dieser Form in eine Impfstoff-Präparation eingearbeitet werden.
b) Es wurde eine Vergleichsstudie über die Ausbeuten der Sterilfiltration über eine Membran der Porosität 0,22 um durchgeführt.
450 ul einer F-HA-Suspension, die durch Ammoniumsulfat ausgefällt worden war, mit einer Konzentration von 5,88 mg/ml, werden abgenommen und bei 10000 x g 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt.
Der Rückstand wird in 3ml Puffer aufgenommen und gegen denselben Puffer dialysiert. Die F-HA-Lösung wird über eine Membran der Porosität 0,22 um filtriert. Die Konzentration an Proteinen in der Lösung vor und nach der Filtration wird durch eine Messung nach Lowry bestimmt. Die Ergebnisse werden entweder in Filtrationsausbeuten ausgedrückt (Konzentration nach der Filtration/Konzentration vor der Filtration) x 100 oder in Prozent, berechnet relativ, bezogen auf die Filtrationsausbeute in CTW-Puffer, dem willkürlich die Ausbeute 100% zugeteilt wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle II unten dargestellt. Vergleichsstudie über die Filtrationsausbeuten an F-HA, das in verschiedenen Puffern gelöst worden ist Puffer Filtrationsausbeute % % relativ bezüglich CTW-Puffer 0,1 M Ammoniumphosphat pH 4,5 0,1 M Ammoniumphosphat, das 0,5 M NaCl enthält 0,1 M Ammoniumphosphat mit 0,05% Tween 80 0,1 M Monokaliumphosphat pH 4,4 0,1 M Monokaliumphosphat, das 0,5 M NaCl enthält 0,1 M Monokaliumphosphat mit 0,05% Tween 80 50 mM Tris HCl pH 7,4, das 0,5 M NaCl enthält CTW

BEISPIEL 5

Herstellung eines azellulären Keuchhusten-Impfstoffes

Ein azellulärer Keuchhusten-Impfstoff, der die gereingten Antigene Keuchhusten-Anatoxin und F-HA enthält, kann auf die folgende Weise hergestellt werden:
Die beiden Antigene in einer CTW-Pufferlösung werden durch Filtration über eine Membran der Porosität 0,22 um getrennt sterilisiert und ihre Konzentration durch eine kolorimetrische Messung, beispielsweise nach dem Verfahren von Lowry, bestimmt.
Zur Herstellung von einem Liter azellulärem Keuchhusten- Impfstoff, der 50 ug/ml jedes aktiven Bestandteils enthält, werden die folgenden Lösungen steril vermischt:
- Keuchhusten-Anatoxinlösung mit 0,38 mg/ml in CTW-Puffer 132 ml
- F-HA-Lösung mit 1,1 mg/ml in CTW-Puffer 46 ml
- physiologisches, gepuffertes Wasser (PBS) mit 50 mM HCl 202 ml
- Aluminiumhydroxid mit 10 mg Al/ml 20 ml
- 1% Merthiolat in PBS (Gew./Vol.) 10 ml
- PBS auf 1 l
Diese Impfstoff-Präparation zeigt die folgenden Eigenschaften:
- Keuchhusten-Anatoxin 50 ug/ml
- F-H 50 ug/ml
- Aluminium 200 ug/ml
- pH 7,6
- Osmolalität 265 mosm/kg
- Merthiolat 1/10000

Claims

1. Verwendung eines Carbonatpuffers mit einem pH-Wert 8,3 bis 11,6 zur Reinigung, Solubilisation und/oder Entgiftung von proteinischen Antigenen von Bakterien des Stammes Bordetella.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Carbonatpuffer ein Gemisch aus einem Bicarbonat und einem Carbonat eines Alkalimetalls ist.

3. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Carbonatpuffer eine Molarität von 0,025 bis 0,5 hat.

4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer weiterhin ein oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration unter 1 Gew.% enthält.

5. Verfahren zur Reinigung von proteinischen Antigenen, die in einem Kulturmilieu von Bakterien des Stammes Bordetella erzeugt worden sind, dadurch gekennzeichnet, dass man die überstehende Flüssigkeit der Kultur oder eine Fraktion, die mit Keuchhusten-Toxin angereichert ist, mit einem festen chromatographischen Trägermaterial in Berührung bringt, das in der Lage ist, das Keuchhusten-Toxin zu fixieren, und dass man das auf dem festen Trägermaterial befindliche Toxin mittels eines Carbonatpuffers vom pH-Wert 8,3 bis 11,6 eluiert und gegebenenfalls das Eluat einer Entgiftungsbehandlung unterzieht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Carbonatpuffer eine Molarität von 0,025 bis 0,5 hat.

7. Verfahren zur Solubilisierung von proteinischen Antigenen, die in einem Kulturmilieu von Bakterien des Stamms Bordetella erzeugt worden sind, dadurch gekennzeichnet, dass man die Antigene in Lösung bringt unter Bildung eines Niederschlags oder eines Lyophilisats in einem Carbonatpuffer von pH-Wert 8,3 bis 11,6 und unter Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels einer Konzentration unter 1 Gew.%.

8. Verfahren zur Entgiftung von Keuchhusten-Toxin mittels eines üblichen Entgiftungsmittels, dadurch gekennzeichnet, dass man die Entgiftung in einem Carbonatpuffer durchführt,wie er in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist.

9. Zellfreie Vaccine gegen Keuchhusten, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen Wirkstoff enthält, ausgewählt aus Keuchhusten-Anatoxin und F-HA, wobei einer dieser Wirkstoffe in Lösung in einem Carbonatpuffer vorliegt, wie er definiert ist in einem der Ansprüche 1 bis 4.