JPH08231421A - パータッシス毒素の無毒化方法 - Google Patents

パータッシス毒素の無毒化方法

Info

Publication number
JPH08231421A
JPH08231421A JP7333415A JP33341595A JPH08231421A JP H08231421 A JPH08231421 A JP H08231421A JP 7333415 A JP7333415 A JP 7333415A JP 33341595 A JP33341595 A JP 33341595A JP H08231421 A JPH08231421 A JP H08231421A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
buffer
solution
pertussis toxin
pertussis
toxin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP7333415A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2599260B2 (ja
Inventor
Marie-Jose B Quentin-Millet
クンタン−ミレ・マリー−ジヨゼ，ベ．
Francois Arminjon
アルマンジヨン・フランソワ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Merieux SA
Original Assignee
Institut Merieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Merieux SA filed Critical Institut Merieux SA
Publication of JPH08231421A publication Critical patent/JPH08231421A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2599260B2 publication Critical patent/JP2599260B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明はパータッシス毒素の無毒化方法を提供
することを目的とする。 【解決手段】本発明のパータッシス毒素の無毒化方法は
パータッシス毒素を通常の無毒化剤により無毒化するに
あたり、上記無毒化をpH8.3〜11.6の炭酸塩緩衝液中で
行うことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は無細胞ワクチンを得るこ
とを目的とするボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の無毒化
に関する。
【０００２】
【従来の技術及び解決すべき課題】ボルデテラ属細菌、
例えば百日咳菌（ボルデテラ・パータッシス(Bordetell
apertusis)、パラ百日咳菌（ボルデテラ・パラパータッ
シス(Bordetellaparapertusis)及び気管支敗血症菌（ボ
ルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetellabronchiseptic
a)の培養により、F-HA（線状血球凝集素(FilamentousHe
magglutin)を産生し得ることは公知である。また、百日
咳菌の培養により蛋白質外毒素:パータッシス毒素[LPF
又はLPF-HA（白血球増多症促進因子-血球凝集素:Leukoc
ytosis Promoting Factor Hemagglutin)とも呼ばれる]
も生ずる。
【０００３】ボルデテラ属細菌は公知の病原菌である。
特に、百日咳菌は百日咳の病原菌であることまたその工
業的培養が百日咳ワクチンの産生に利用されていること
は公知である。
【０００４】また、パータッシス毒素抗原及びF-HAが無
細胞の百日咳ワクチンの組成物中で有利に使用し得るこ
とは公知である。
【０００５】パータッシス毒素の精製は一般にアフィニ
テイークロマトグラフィーによる精製工程を包含してい
る。
【０００６】アフィニテイークロマトグラフィーの担体
からのパータッシス毒素の溶出は、一般に、高濃度の塩
及び/又はカオトロピック薬剤又は変性剤例えば塩化マ
グネシウム、尿素、チオシアン酸ナトリウム又はカリウ
ム、グアニジン塩酸塩などを含んでいる緩衝液によって
行われる。しかしながら、これらの物質の存在下におい
て得られた有効成分はそのままではワクチンの調製に利
用できない。従って、毒素含有溶出液について、更に、
カオトロピック薬剤の完全な除去及び/又は塩濃度の低
減を目的とする補足的工程を行わなければならない。こ
の補足的工程は例えば徹底的な透析又はゲル濾過を行う
ことからなる（例えば米国特許第4,500,639号明細書及
び欧州特許出願第0140386号明細書参照）。
【０００７】そのほかに、これらの溶出方法の利用には
一般に有効成分の部分的かつ非可逆的な不溶化が伴う。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は特殊な緩衝溶液
を利用するパータッシス毒素の無毒化に関する。この緩
衝液を利用することにより、アフィニテイークロマトグ
ラフィー担体からパータッシス毒素を溶出させ得る。該
緩衝液を利用することにより単一の工程でかつ高い収率
でパータッシス毒素を溶出させ、従って、また精製し得
る。更に、上記緩衝液に界面活性剤を添加したものを利
用することにより、パータッシス毒素及びF-HAの損失を
伴うことなしに、これらを可溶化できる。この緩衝液は
またパータッシス毒素の無毒化(detoxification)法にお
いて溶媒の役割を果し、アナトキシンを溶液中に維持す
ることもできる。
【０００９】そのほか、通常用いられる緩衝液とは異な
って、本発明の特殊な緩衝液はワクチン製剤と両立でき
る。換言すれば、この緩衝液中に溶解している抗原は直
接ワクチンの調製に利用できる。
【００１０】従って、本発明は、パータッシス毒素を通
常の無毒化剤により無毒化するにあたり、上記無毒化を
pH8.3〜11.6の炭酸塩緩衝液中で行うことを特徴とする
パータッシス毒素の無毒化方法を提供することを目的と
する。
【００１１】この種の緩衝液は従来の方法、例えばアル
カリ金属（アルカリ金属はナトリウム又はカリウムであ
る）の重炭酸塩（炭酸水素塩）と炭酸塩との混合物の水
溶液を調製するか又はアルカリ金属（ナトリウム又はカ
リウム）水酸化物の水溶液とアルカリ金属炭酸水素塩の
水溶液との混合により調製し得る。
【００１２】炭酸塩緩衝液のモル濃度は0.025〜0.5Mで
あること、また、pHは8.3〜11.6であるとが望ましい。
【００１３】本発明に用いられる炭酸塩緩衝液は、更
に、界面活性剤例えばトウィーン80(Tween 80、ポリオ
キシエチレン(20)モノオレイン酸ソルビタンの商品名）
のごとき非イオン系界面活性剤を含むこともできる。
【００１４】一般的には、沈殿又は凍結乾燥品の形の生
成物（パータッシス毒素又はF-HA）を可溶化するために
は、必要ならば、界面活性剤を含んでいる緩衝液を用い
ることが望ましい。その場合、緩衝液中の界面活性剤の
濃度は通常、１重量％未満、多くの場合、0.5重量％未
満である。パータッシス毒素の溶出に関しては界面活性
剤を含有していない炭酸塩緩衝液を用いることが望まし
い。
【００１５】本発明に従って炭酸塩緩衝液を用いること
により以下に述べる通りの利点が得られる。
【００１６】炭酸塩緩衝液はアフィニテイー・クロマト
グラフィー担体からパータッシス毒素を溶出させること
ができる。クロマトグラフィーにかける液体はボルデテ
ラ属細菌培地の上澄液でもよく、パータッシス毒素が富
化されているフラクションでもよい。
【００１７】無細胞ワクチンにおいてはパータッシス毒
素を使用する場合には、予め無毒化処理例えばホルモー
ル又はグルタルアルデヒドを用いる処理を行う必要があ
ることは公知である。無毒化は特にマウスのリンパ球増
多症導入の効果、ヒスタミンに対する鋭敏化、ADP-リボ
シルトランスフェラーゼ活性、CH0（チャイニーズハム
スター卵巣）細胞に及ぼす細胞病原効果などを排除する
ことを目的とする。
【００１８】この種の無毒化、例えばホルモールによる
無毒化は毒素を不溶化し、これが均質な精製された調剤
の取得を困難にする（例えば米国特許第4455297号明細
書参照）。
【００１９】場合により界面活性剤を添加した炭酸塩緩
衝液を使用することにより、溶液中での無毒化処理の実
施及び得られたアナトキシンを溶液中に維持することが
可能になる。
【００２０】最後に、前述した通り、アナトキシン・パ
ータッシスの炭酸塩緩衝液中の溶液は、直接、無細胞ワ
クチンの調製に使用し得る。
【００２１】更に、炭酸塩緩衝液（場合によりトウィー
ン80のごとき非イオン系界面活性剤を添加したもの）は
F-HAを溶液とするのに有利に作用する。
【００２２】ボルデテラ属細菌の培地中で生成する蛋白
質抗原は、培地上澄液又はパータッシス毒素が富化され
ているフラクションを、パータッシス毒素を固定し得る
クロマトグラフィー固体担体と接触させ、次に毒素を該
固体担体から、pH8.3〜11.6の炭酸塩緩衝液により溶出
することにより精製し得る。
【００２３】特殊な実施形式においては、pHを６〜８、
望ましくは７に調節した後に、培地上澄液又はパータッ
シス毒素が富化されているフラクションを、パータッシ
ス毒素に対して親和力のあるグリコプロテイン、特に、
アシアログリコプロテイン（例えばアシアロフェチュイ
ン）を固体クロマトグラフィー担体に結合したものと接
触させる。使用するクロマトグラフィー担体の量は出発
溶液の容積及び/又は精製すべきフラクション中のパー
タッシス毒素の濃度によって変動する。接触は２〜30℃
のカラム内温度において行われる。
【００２４】パータッシス毒素に対して親和力のあるグ
リコプロテインは公知である：例えばハプトグロビン、
フェチュインなどが挙げられる。しかしながら、アフィ
ニテイー・クロマトグラフィーを、予め脱シアル酸(des
ialylation)処理を施したこれらの蛋白質に行うことが
好ましい；この脱シアル酸処理は公知の方法に従って穏
和な酸性加水分解によって行われる（例えばSpiro ほ
か、J.Biol.chem.1974,249,5704-5717参照）。
【００２５】グリコプロテイン又は脱シアル酸処理した
グリコプロテイン（アシアログリコプロテイン）の結合
(coupling)は公知の方法に従って行うことができる。担
体はアフィニテイー・クロマトグラフィーにおいて通常
用いられる従来の任意の固体担体であり得る。
【００２６】担体は特にセルロース誘導体、架橋デキス
トラン、アガロースゲル又はセファロース4B(Sepharose
-4B)などの多糖類(polyosidique)誘導体又はIBF社(Indu
strtie Biologique Rrancaise)から市販のトリスアクリ
ル(Trisacryl)などのアクリル誘導体基質の担体であ
る。
【００２７】グリコプロテインは例えばCNBrで活性化さ
れた担体を用いて担体上に固定できる。
【００２８】担体はまた架橋DEAEデキストランで被覆し
た多孔質シリカ担体であり得る。例えばDEAEデキストラ
ンで被覆したスフェロシル(Spherosil)が使用できる。
【００２９】溶出後、パータッシス毒素は、例えば飽和
濃度の50〜80％の硫酸アンモニウムにより沈殿させるか
又は直接に無毒化工程で処理することができる。
【００３０】かくして精製した毒素は硫酸アンモニウム
を用いて生成させた沈殿又は凍結乾燥品の形で保存し得
る。沈殿又は凍結乾燥品はトウィーン80のごとき界面活
性剤を約0.05〜0.5％の最終濃度で含有し得る、pH8.3〜
11.6のかつモル濃度が25mMを越える炭酸塩緩衝液、望ま
しくはトウィーン80を0.05％含有する、pH9.6、100mMの
炭酸塩緩衝液（以下、緩衝液CTWという）に溶解させる
ことができる。
【００３１】残存硫酸アンモニウム又は凍結乾燥担体を
除去する目的で、温度２〜30℃の倍数の容積の同じ緩衝
液に対して、溶液の透析を４〜72時間の持続時間行う。
緩衝液の組成により完全な可溶化ができる。溶液は孔径
0.22μmの膜で濾過できる。これにより、無菌環境中で
の無毒化工程又は有効成分の完全な可溶化が必要である
か又はこれを容易にする化学的又は生物学的実験の実施
を行うことを可能にするという利点が得られる。
【００３２】パータッシス毒素の無毒化は一般に毒素に
ついて用いられる方法と同様にして行われる。本発明に
よれば、無毒化の方法は上述した通りの炭酸塩緩衝液で
あって望ましくは、毒素の可溶化と無毒化工程の実施
中、該毒素を溶液中に維持することに有利に作用する界
面活性剤を含有する炭酸塩緩衝液中において行われる。
かくして無毒化工程の収率は100 ％に近いものとなる。
用いられる無毒化剤は例えばホルモール又はグルタルア
ルデヒドである。
【００３３】例えば、温度４〜40℃において行われ得る
無毒化の後に、痕跡の無毒化剤の全てを除去する目的
で、アナトキシン含有溶液を緩衝液CTW に対して透析に
かけることのできる。かくして得られたアナトキシンは
溶液中の残留し、孔径0.22μmの滅菌膜で濾過でき、か
くして、ワクチン製剤に包含させることができるものと
なる。
【００３４】上記の通り、本発明において使用するため
の炭酸塩緩衝液はボルデテラ属細菌の培地上澄液から単
離される別の蛋白質：H-FAの完全な可溶化を可能にす
る。
【００３５】F-HAの可溶化工程における該緩衝液の使用
により、パータッシス毒素の場合について述べた種々の
利点、即ち、特に有効成分を損失することなしに0.22μ
m膜での滅菌濾過工程に着手し得るという利点あ得られ
る。この形でのF-HAは直接ワクチン製剤中に包含させる
ことができる。
【００３６】例えば硫酸アンモニウムによる沈殿の形で
保存されたF-HAはパータッシス毒素について前述した方
法に従って再溶解される。沈殿を遠心分離し、緩衝液CT
Wに溶解し、室温又は４〜８℃の温度で４〜72時間透析
する。緩衝液CTWはF-HAを完全に可溶化できる。
【００３７】本発明はまたアナトキシン・パータッシス
及びF-HAから選ばれた有効成分の少なくとも１種を含有
しかつ該有効成分が上記の通り炭酸塩緩衝液、特に、緩
衝液CTWのごとき界面活性剤を含有する炭酸塩緩衝液中
に溶解されている無細胞百日咳ワクチンにも関する。
【００３８】アナトキシン・パータッシス及びF-HAは炭
酸塩緩衝液中の溶液として直接ワクチン製剤中に包含さ
せることができる。ワクチンはアナトキシンを単独で又
はアナトキシンとF-HAとの所望の比率の混合物として含
有できる。ワクチンの最終pH値を７〜８に修正する目的
で緩衝生理学的食塩水（緩衝液PBS)若干量濃酸溶液で酸
性にしたものを添加する。添加量は製剤中に存在する炭
酸塩緩衝液の量及びモル濃度により変動する。その場
合、有効成分の濃度は必要量の緩衝液PBSを添加して所
望値に修正する。この段階において混合物に他の抗原
（例えば、ジフテリア抗原、破傷風抗原、小児麻痺抗
原、血友病抗原等）、メチルチオラート又はフェノキシ
エタノールのごとき防腐剤及びアルミナゲル又は燐酸カ
ルシウムのごとき添加剤を添加し得る。
【００３９】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す実施例１ （参考例） アフィニテイー・クロマトグラフィーによるパータッシ
ス毒素の精製 a)パータッシス毒素のアフィニテイー担体への吸着 30リッター発酵槽中で培養した百日咳菌フェーズIの細
胞懸濁液の遠心分離及び濃縮後に得られたパータッシス
毒素富化フラクションを、流量６ml/cm2/時で、アシア
ロフェチュインと結合させたSepharose 4Bクロマトグラ
フィー担体120ml を収容している直径４cmのカラムに通
送した。Sepharose 4Bは下記のようにしてアシアロフェ
チュインと結合させた。
【００４０】CNBrで活性化したSepharose 4B(Pharmacia
社）30gを１mM HCl ６リッター中で約15分間膨潤させ
た。ついでゲルを１mM HCl ６リッターで３回洗浄し
た。アシアロフェチュイン１mg/ml、NaHCO3 0.1M及びNa
Cl 0.5Mを含んでいる溶液400mlをゲルに添加した。
【００４１】この混合物を+４℃において穏和に攪拌し
ながら１夜、反応させた。エタノールアミン５M 溶液(p
H 8.0)125mlを混合物に加えた。室温に４時間保持した
後、ゲルを順次、NaCl１Mを含有する0.1M酢酸ナトリウ
ム緩衝液(pH4.0) 500ml、次にNaCl１Mを含有する50mMト
リス−HCl緩衝液(pH7.5) 500mlで洗浄した。この洗浄サ
イクルを３回反復した。
【００４２】引続いてゲルを1/10000(w/v)の濃度のマー
チオレート(Merthiolate)のごとき防腐剤の存在下で50m
Mトリス−HCl緩衝液(pH7.5) 500mlで３回洗浄した。
【００４３】アフィニテイー・クロマトグラフィーにお
いて結合剤として用いるアシアロフェチュインは下記の
ようにして調製した。
【００４４】フェチュイン(Sigma社フェチュインIII
型）の水溶液を0.05N H2SO4により80℃において１時間
加水分解した。加水分解後、遊離シアル酸を除去する目
的で溶液を複数の蒸留水浴に対して+4℃において24時間
透析した。アシアロフェチュイン溶液は排除限界(Seuil
de coupure)が10000に等しい膜を備えた限外濾過によ
り濃縮することができた。
【００４５】シアル酸の除去は加水分解の前又は後の蛋
白質上のシアル酸の特殊比色定量により検査した。
【００４６】b)パータッシス毒素の溶出 ゲルをカラムの２倍の容積の50mMトリス−HCl緩衝液(pH
7.5)を使用して、即ち、278nmの紫外線吸収が全く消失
するまで洗浄し、次にカラムと同容積の、1MNaClを含有
する50mMトリス−HCl緩衝液(pH7.5)で洗浄した。パータ
ッシス毒素は100mM炭酸塩緩衝液(pH9.6) 400mlで溶出し
た。
【００４７】炭酸塩緩衝液は下記のようにして調製し
た。
【００４８】0.1M NaHCO3溶液500mlに0.1M Na2CO3溶液
を最終pH9.5となるまで添加した：添加したNa2CO3溶液
は約250mlであった。
【００４９】かく得られた炭酸塩緩衝液を孔径0.22μm
の膜で濾過し、+4℃で保存した。
【００５０】カラム出口で捕集したフラクションの光学
的濃度及び赤血球凝集活性を測定した。有効成分含有フ
ラクション、即ち、コレステロールにより抑止されない
強い赤血球凝集活性を有するものを捕集した。
【００５１】引続いて、パータッシス毒素は最終濃度が
飽和濃度の70％に相当する硫酸アンモニウムにより沈殿
させた。
【００５２】かくして精製したパータッシス毒素は強い
リンパ球増多症を誘発し、マウス１匹当り、0.04μgの
投薬量でマウスCFWをヒスタミンに対して鋭敏化させ
た。CHO細胞上にクラスター生成を誘発する毒素の性能
は65000〜260000cpu/μg程度の比活性により特徴づけら
れる。
【００５３】物理−化学的検査及び生物学活性（偶発的
汚染物質、DNA、RNA、糖類の比色法定量；内毒素比率の
定量；SDS媒体中又は酸性媒体中の電気泳動など）の結
果は、高度に精製された有効成分を含有する均質な最終
製剤に有利であるとを示した。 初めの培地上澄液中及
び最終沈殿中のパータッシス毒素含有量の分析結果は90
％を越える精製収率を示した。
【００５４】実施例２（参考例） 種々の緩衝液中のパータッシス毒素の溶解及びその後の
滅菌濾過の比較試験。硫酸アンモニウムによる沈殿の形
のパータッシス毒素を2.6mg/ml含有する懸濁液1.2mlを
採取し、10000 x gで10分間遠心分離した。上澄液を除
き、残渣を緩衝液CTW ４mlに溶解し、同じ緩衝液に対し
て透析した。毒素溶液を孔径0.22μmの膜で濾過した。
濾過の前及び後の溶液の蛋白質濃度をロウリー(Lowry)
法に従った定量法により測定した。測定結果は濾過収率
（濾過後の毒素の濃度/濾過前の毒素の濃度）x 100；又
は緩衝液CTW中の濾過収率を任意に100％とし、これに対
して算出した相対百分率で表した。結果を表Ｉに示す。
【００５５】 実施例３ パータッシス毒素の無毒化 a)ホルモールによる無毒化 硫酸アンモニウムによる沈殿の形のパータッシス毒素を
５mg/ml含有する懸濁液２ml(即ち、パータッシス毒素10
mg)を10000 x gで15分間遠心分離した。上澄液を除き、
残渣を緩衝液CTW 10mlに溶解した。
【００５６】溶液を緩衝液CTW ２リッターに対して+4℃
において一夜透析した。透析の終了時に溶液を孔径0.22
μmの膜で濾過した。溶液についてLowryの方法に従って
蛋白質定量を行い、緩衝液CTWを加えて蛋白質濃度を0.4
mg/mlとした。0.4mg/mlの毒素溶液23mlに、緩衝液CTW中
のリシンの１M 溶液1.22ml及びホルモールの37％溶液
0.265mlを加えた。21時間、+4℃に保持した。引続いて
痕跡のホルモールの全てを除去する目的で反応混合物を
緩衝液CTWに対して+4℃において48時間透析した。引続
いてアナトキシンを孔径0.22μmの膜で滅菌濾過した。
この形のアナトキシンパータッシスをワクチン製剤中に
包含させることができる。
【００５７】b)グルタルアルデヒドによる無毒化 緩衝液CTW中のパータッシス毒素500mg/mlの溶液を前記
の通り調製した。グルタルアルデヒド0.10％を含む緩衝
液CTW ５mlを毒素溶液に加えた。
【００５８】無毒化は+4℃〜40℃の種々の温度で実施で
きる；グルタルアルデヒドの存在下における毒素の保温
時間は温度によって変動する。例えば混合物を+4℃で48
時間保持することができる。
【００５９】保温後に緩衝液CTW中のリシンの１M溶液18
0μlを混合物に加え、溶液を緩衝液CTWに対して+4℃に
おいて48時間透析した。透析後にアナトキシンパータッ
シスを孔径0.22μmの膜で濾過した。この形でアナトキ
シンをワクチン製剤中に包含させることができる。
【００６０】実施例４（参考例） 炭酸塩緩衝液によるF-HAの可溶化 この実施例で使用するF-HAはSATO Y,COWELL J.L.,SATO
H.,BURSTYND.G 及びMANCLARK C.R. “Separation and P
urification of the Hemagglutins fromBordetella per
tusis ”Infect.and Immun,.1983, 41,1,313-320に記載
の方法に従って調製した。
【００６１】F-HAは飽和濃度の70％の硫酸アンモニウム
による沈殿の形で保存した。
【００６２】a)硫酸アンモニウムによる沈殿の形のF-HA
1.2mg/mlの懸濁液25mlを30000 x gで20分間遠心分離し
た。上澄液を除き、残渣を緩衝液CTW 30mlに溶解した。
【００６３】溶液を緩衝液CTWに対して+4℃において一
夜透析した。溶液を孔径0.22μmの膜で濾過した。F-HA
はこの形でワクチン製剤中に包含させることができる。
【００６４】b)孔径0.22μmの膜での滅菌濾過収率の比
較試験 硫酸アンモニウムにより沈殿させたF-HAの5.88mg/ml懸
濁液450μlを採取し、10000 x g で10分間遠心分離し
た。上澄液を除去した。
【００６５】残渣を緩衝液３mlに溶解し、同じ緩衝液に
対して透析した。F-HA溶液を孔径0.22μmの膜で濾過し
た。濾過の前及び後の溶液の蛋白質濃度をLowryによる
定量法により測定し、結果をは濾過収率（濾過後の毒素
の濃度/濾過前の毒素の濃度）x 100；又は緩衝液CTW 中
の濾過収率を任意に100％とし、これに対して算出した
相対的収率で表した。結果を表ＩIに示す。
【００６６】 実施例５（参考例） 無細胞百日咳ワクチンの調製 精製した抗原−アナトキシンパータッシス及びF-HAを含
有している無細胞百日咳ワクチンを下記の方法で調製し
た。
【００６７】緩衝液CTW中に溶解した両抗原を別個に孔
径0.22μmの膜で濾過して滅菌し、例えばLowryの方法に
従って比色定量によりそれらの濃度を測定した。
【００６８】有効成分をそれぞれ50μg/ml含有している
無細胞百日咳ワクチン１リッターを調製する目的で、無
菌状態で下記の溶液を混合した。
【００６９】 −緩衝液CTW 中のアナトキシンパータッシス 0.38mg/mlの溶液 132 ml −緩衝液CTW中のF-HAの1.1mg/mlの溶液 46 ml −50mM HCl含有、緩衝生理学的食塩水（PBS) 202 ml −水酸化アルミニウム溶液（Al 10mg/ml) 20 ml −マーチオレート１％(w/v)含有PBS 10 ml −PBS を加えて 1リッター このワクチン調剤は下記の諸特性を示した： −アナトキシンパータッシス 50μg/ml −F-HA 50μg/ml −アルミニウム 200μg/ml −pH 7.6 −浸透 265mosm/kg −マーチオレート 1/10000

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 パータッシス毒素を通常の無毒化剤によ
    り無毒化するにあたり、上記無毒化をpH8.3〜11.6の炭
    酸塩緩衝液中で行うことを特徴とするパータッシス毒素
    の無毒化方法。
  2. 〔請求項２〕 炭酸塩緩衝液はアルカリ
    金属炭酸水素塩とアルカリ金属炭酸塩との混合物であ
    る、請求項１に記載の方法。
  3. 〔請求項３〕 炭酸塩緩衝
    液は0.025〜0.5Mのモル濃度である、請求項１又は２に
    記載の方法。
  4. 〔請求項４〕 該緩衝液は、更に、濃度１
    重量％未満の界面活性剤を含んでいる、請求項１〜３の
    いずれかに記載の方法。
JP7333415A 1986-04-16 1995-12-21 パータッシス毒素の無毒化方法 Expired - Lifetime JP2599260B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8605456 1986-04-16
FR8605456A FR2597344B1 (fr) 1986-04-16 1986-04-16 Perfectionnement au procede de purification d'antigenes proteiques de bacteries appartenant au genre bordetella, en vue de l'obtention d'un vaccin acellulaire.

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62092149A Division JP2563797B2 (ja) 1986-04-16 1987-04-16 ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08231421A true JPH08231421A (ja) 1996-09-10
JP2599260B2 JP2599260B2 (ja) 1997-04-09

Family

ID=9334300

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62092149A Expired - Lifetime JP2563797B2 (ja) 1986-04-16 1987-04-16 ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製方法
JP7333415A Expired - Lifetime JP2599260B2 (ja) 1986-04-16 1995-12-21 パータッシス毒素の無毒化方法
JP7333413A Expired - Lifetime JP2599259B2 (ja) 1986-04-16 1995-12-21 ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の可溶化方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62092149A Expired - Lifetime JP2563797B2 (ja) 1986-04-16 1987-04-16 ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7333413A Expired - Lifetime JP2599259B2 (ja) 1986-04-16 1995-12-21 ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の可溶化方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4774086A (ja)
EP (1) EP0242301B1 (ja)
JP (3) JP2563797B2 (ja)
AT (1) ATE81782T1 (ja)
AU (1) AU601415B2 (ja)
CA (1) CA1328070C (ja)
DE (3) DE242301T1 (ja)
ES (1) ES2000435T3 (ja)
FR (1) FR2597344B1 (ja)
GR (2) GR880300043T1 (ja)
LU (1) LU90378I2 (ja)
ZA (1) ZA872712B (ja)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5237053A (en) * 1986-06-24 1993-08-17 Immuno Aktiengesellschaft Preparation active against Pseudomonas aeruginosa infections and methods of producing them
AT391080B (de) * 1986-06-24 1990-08-10 Immuno Ag Verfahren zur herstellung von gegen pseudomonas aeruginosa infektionen wirksamen praeparationen
US5032398A (en) * 1986-08-01 1991-07-16 Kaslow Harvey R Selective modification of the catalytic subunit of pertussis toxin
US5165927A (en) * 1986-08-01 1992-11-24 University Of Southern California Composition with modified pertussis toxin
US4845036A (en) * 1987-02-03 1989-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for isolation of the B oligomer of pertussis toxin
JP2706792B2 (ja) * 1988-11-29 1998-01-28 財団法人化学及血清療法研究所 百日咳毒素のトキソイド化法
EP0484621A3 (en) * 1990-07-11 1992-08-26 American Cyanamid Company Efficacious vaccines against bordetella pertussis comprising a combination of individually purified pertussis antigens
FR2672895B1 (fr) * 1991-02-15 1995-05-12 Transgene Sa Procede de purification d'une proteine fortement glycosylee.
US5445817A (en) * 1992-08-21 1995-08-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Pertussis toxin used as a carrier protein with non-charged saccharides in conjugate vaccines
KR102426041B1 (ko) * 2017-08-01 2022-07-29 주식회사 녹십자 냉동 및 해동 과정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2047886A1 (en) * 1969-06-30 1971-03-19 Merieux Inst Non-toxic anti-whooping cough vaccine
US4247452A (en) * 1978-03-01 1981-01-27 The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland Purification of pertussis haemagglutinins
JPS5750925A (en) * 1980-09-12 1982-03-25 Takeda Chem Ind Ltd Preparation of pertussis toxoid
US4500639A (en) * 1981-10-15 1985-02-19 Teijin Limited Culturing Bordetella in media containing etherified cyclodextrin
CA1213234A (en) * 1983-03-30 1986-10-28 Akihiro Ginnaga Method for the production of ha fraction containing protective antigens of bordetella pertussis and pertussis vaccine
US4551429A (en) * 1983-09-15 1985-11-05 American Home Products Corporation Stimulation of antigen production by Bordetella pertussis
JPS6098988A (ja) * 1983-11-01 1985-06-01 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｌｐｆ−ｈａの精製法
JPS60237027A (ja) * 1984-05-07 1985-11-25 Chemo Sero Therapeut Res Inst 線維状赤血球凝集素の精製方法
CA1237998A (en) * 1984-04-14 1988-06-14 Akihiro Ginnaga Method for purification of filamentous hemagglutinin
GB8412207D0 (en) * 1984-05-12 1984-06-20 Wellcome Found Antigenic preparations
US4705686A (en) * 1986-05-09 1987-11-10 American Cyanamid Process for the preparation of acellular Bordetalla pertussis vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
ATE81782T1 (de) 1992-11-15
AU7158187A (en) 1987-10-22
EP0242301B1 (fr) 1992-10-28
ZA872712B (en) 1987-10-05
JPS62258326A (ja) 1987-11-10
ES2000435A4 (es) 1988-03-01
DE3782356D1 (de) 1992-12-03
GR3006840T3 (ja) 1993-06-30
JP2563797B2 (ja) 1996-12-18
JP2599260B2 (ja) 1997-04-09
FR2597344B1 (fr) 1989-06-23
JP2599259B2 (ja) 1997-04-09
US4774086A (en) 1988-09-27
JPH08225463A (ja) 1996-09-03
AU601415B2 (en) 1990-09-13
LU90378I2 (fr) 1999-05-31
DE242301T1 (de) 1988-06-09
DE3782356T2 (de) 1993-04-29
EP0242301A1 (fr) 1987-10-21
GR880300043T1 (en) 1988-10-18
CA1328070C (fr) 1994-03-29
DE19875021I2 (de) 2010-07-01
FR2597344A1 (fr) 1987-10-23
ES2000435T3 (es) 1994-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2549225B2 (ja) 百日咳菌外膜蛋白質の精製方法
JP2599260B2 (ja) パータッシス毒素の無毒化方法
JPH02218699A (ja) 精製されたプロテインａ組成物及びそれらの調製方法
JP2950970B2 (ja) 百日咳菌からの６９０００ダルトンの抗原性タンパク質の精製方法
JP4426720B2 (ja) ワクチンの菌体内毒素除去方法
EP0003916B1 (en) Purification of pertussis haemagglutinins
US4565697A (en) Process for producing a hepatitis B infection preventing vaccine
Fernandes et al. Preparation of a stable intravenous gamma‐globulin: process design and scale‐up
US4985144A (en) Affinity chromatography material for antigens of the bacteria of the Bordetella genus
JPH11500910A (ja) 生物源からｉｘ因子を調製する方法
JP3148895B2 (ja) 精製方法
Williams et al. Application of antigen-antibody reactions on supporting media to the purification of proteins. I. A model system using bovine serum albumin and bovine γ-globulin
JPS61171432A (ja) 免疫原性蛋白質またはペプチド複合体からなるワクチン
JPH09504532A (ja) クロマトグラフィー法による第８因子を含むウィルス不活性化分画の製造方法
SE430753B (sv) Kombinerat haemophilus influenzae-bordetella pertussis-vaccin
JP3747077B2 (ja) 百日咳菌由来感染防御成分の分離取得方法
US20020015711A1 (en) Purification of a pertussis outer membrane protein
JPH0774161B2 (ja) 毒素のトキソイド化法
CA2224052C (en) Pertussis outer membrane protein
Irons Substrate Specificity and the Purification by Affinity Combination Methods of the Two Bordetella pertussis Hemagglutinins LI Irons and AP MacLennan
US20010051163A1 (en) Purification of a pertussis outer membrane protein

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080109

Year of fee payment: 11