CN102706869B - 碱性磷酸酶标记信号放大*** - Google Patents
碱性磷酸酶标记信号放大*** Download PDFInfo
- Publication number
- CN102706869B CN102706869B CN201210185739.5A CN201210185739A CN102706869B CN 102706869 B CN102706869 B CN 102706869B CN 201210185739 A CN201210185739 A CN 201210185739A CN 102706869 B CN102706869 B CN 102706869B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alkaline phosphatase
- enzyme
- alcohol
- alkyl
- mark signal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种碱性磷酸酶标记信号放大***，以烷烃，烯烃或炔烃醇磷酸酯为底物，在碱性磷酸酶作用下产生游离的磷酸及相应的醇化合物，醇化合物在氧气的参与下经醇类氧化酶作用生产醛或酮化合物及过氧化氢（H2O2），生成的醛和酮化合物在NADH存在下经醇类脱氢酶作用还原成醇化合物，生成的醇化合物继续参与循环反应。循环生成的大量H2O2配合不同底物经过氧化物酶催化后可通过比色法、电化学法、化学发光法或荧光法进行检测。因此，本***可灵敏的对单独的碱性磷酸酶或与抗原，半抗原，抗体，蛋白质，核酸及寡聚核苷酸相连接的碱性磷酸酶进行检测，起到放大信号作用。所述的底物结构式如下：
Description
技术领域
本发明涉及一种超灵敏的信号倍增***，具体地说，涉及一种新的碱性磷酸酶标记信号放大***。
背景技术
酶作为灵敏的标记物已被广泛用于各种生化检测***，如免疫测定（ELISA），核酸测定（PCR和基因测序）等，其酶活力大小可用在一定条件下催化某一化学反应的速度来表示，催化反应速度愈大，活力愈高，反之则活力愈低，因此，测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度常用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，单独一个酶分子可以催化大量底物（如一分子高纯度酶在lmin内可催化10000-1000000分子的底物），因而通过对产物生成及底物或共反应物消耗来反应的酶活力，检测的不是酶本身，而是大量生成的底物或消耗的产物，从而提供了高度放大的信号。
目前利用工具酶结合其他分析检测手段的信号放大技术因其具有特异、灵敏、简便、快速等特点，已在生物医学研究领域及临床疾病的诊疗中得到广泛应用。相较于放射免疫（RIA）技术，酶联技术具有试剂半衰期长，对环境污染小，试验废物易于处理等优点，但其测定敏感性仍比不上RIA技术，在一些方面尤其在微量物质测定方面还不能替代RIA。但由于放射性物质对人体、环境有极大危害，并且其操作和处理极为不便，因此，如何提高酶联技术的测试灵敏度，使其达到甚至超越RIA技术，一直是科研界的研究热点。
酶循环法是在原始标记酶催化基础上附加了一个反应***（如酶底物反应循环或酶级联反应），利用酶的底物特异性来放大靶物质（被测物）的测定方法。传统的酶反应只能按靶物质的量生成相应的产物量，而酶循环法则可在一定的反应时间内通过靶物质的重复反应来增加产物的量。因此，通过延长反应时间和／或增加酶的用量可加速循环，增加循环次数，从而提高检测灵敏度。这种由数个催化反应耦联而构建的放大方法，是酶循环法标记技术放大的根本之所在，其敏感性的提高来源于真正的信号放大，而不是简单地将一个分子转变为更多的易于测定的分子，并且酶循环法仅循环靶物质，减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或对靶物质进行提取，是一种临床应用前景十分广阔的测定技术。
单分子检测一直是科学家长期以来梦寐以求的一项富有挑战性的前沿领域，其技术的实现可使检测灵敏度达到极限，在低含量物质检测中更是具有里程碑的意义。酶循环法通过偶联数个催化反应，可使单一底物通过循环反应生成大量的产物，从而实现高度的信号放大。因此，将酶循环法运用至酶标技术中，可实现酶标技术质的飞跃，大大的提高其检测灵敏度，实现对微量甚至是痕量物质的检测，进一步可以替代RIA法，实现技术更替。
自1971年Engvall等学者创立了酶免疫分析技术以来，至今已有二十多种酶被应用于此项技术，其中碱性磷酸酶因具有高活性、高敏感性，在室温下稳定，反应产物易于显现，能商品化生产，染色背景低等优点，应用日益广泛，尤其在免疫检测、核酸测定等方面。
发明内容
本发明针对现有酶联技术灵敏度低的不足，提供了一种通过循环酶法放大碱性磷酸酶标记信号的***即碱性磷酸酶标记信号放大***。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种碱性磷酸酶标记信号放大***，包括：
（1）一种碱性磷酸酶底物，其结构通式如下式（I）所示：
其中：
A是烷基，烯烃基或炔烃基中的一种；
R’’为H，C1-C4烷基，C5-C10环烷基中的一种；
n是1-8的整数；
通式（I）的化合物在碱性磷酸酶作用下可以水解成结构通式如(II)的化合物和磷酸；
当n为1时，通式(II)化合物就可以表示为通式如下所示的(IIB)的化合物：
如果R’’为H，则羟基所连接的为伯碳，此时(IIB)为一级醇；
一级醇在氧气的参与下被醇氧化酶（EC1.1.3.13）氧化成醛化合物，而生成的醛化合物在辅酶NADH及醇脱氢酶（EC1.1.1.1）作用下又可被还原成醇化合物，反应过程如下反应式（I）所示：
如果羟基所连接的为仲碳，则此时(IIB)为二级醇；
二级醇在氧气参与下被二级醇氧化酶（EC1.1.3.18）氧化成酮化合物，而生成的酮化合物在辅酶NADH及S-二级醇脱氢酶（EC1.1.1.B3）作用下又可被还原成醇化合物，反应过程如下反应式（II）所示：
2、碱性磷酸酶标记信号放大组合物，包括结构通式为式（I）的碱性磷酸酶底物，醇类氧化酶、醇类脱氢酶及NADH；底物在碱性磷酸酶作用下产生游离的磷酸及相应的醇化合物，醇化合物可被醇类氧化酶氧化成醛或酮化合物，同时生成H2O2，醛和酮化合物在NADH存在下经醇类脱氢酶作用又还原成醇化合物，从而形成循环***，其反应过程如下反应式（III）所示：
通过监测上述循环反应氧化过程中产生的H2O2，或还原反应中消耗的NADH，可比简单监测碱性磷酸酶底物消耗更加显著的提高反应灵敏度，真正起到放大检测信号的作用。
通常情况下，本发明上述式（I）的烷基，烯烃基和炔烃基包括直链，支链和环状烃基及其组合，“环烷基”包括非芳香环的碳环；具体包含C1-10的烷基或C2-10烯烃基或炔烃基；或C1-10烷基或C2-10烯烃基或炔烃基的取代基。优选C1-8烷基或C2-8烯烃基或炔烃基。进一步优选为1-4C烷基或2-4C烯烃基或炔烃基。可以是烷基、烯烃基或炔烃基等多种形式的组合，但不包括共轭双键。
所述的C1-10烷基或C2-10烯烃基或炔烃基的取代基：典型的取代基包括但不仅限于卤代,=O,=N-CN,=N-OR,=NR,OR,NR2,SR,SO2R,SO2NR2,NRSO2R,NRCONR2,NRCOOR,NRCOR,CN,COOR,CONR2,OOCR,COR和NO2，其中每个R可以是H，C1-C8烷基，C2-C8杂烷，C4-C10杂环烷，C1-C8酰基，C2-C8杂酰基，C2-C8烯，C2-C8杂卤代烯烃，C2-C8炔，C2-C8杂炔或C5-C10杂环，并且R也可被卤代,=O,=N-CN,=N-OR’,=NR’,OR’,NR’2,SR’,SO2R’,SO2NR’2,NR’SO2R’,NR’CONR’2,NR’COOR’,NR’COR’,CN,COOR’,CONR’2,OOCR’,COR’和NO2取代，其中每个R’可以是H，C1-C8烷基，C2-C8杂烷，C4-C10杂环烷，C1-C8酰基，C2-C8杂酰基，C2-C8烯，C2-C8杂卤代烯烃，C2-C8炔，C2-C8杂炔或C5-C10杂环取代，每个取代又可被上述典型的取代基取代。如果取代基R或R'在相同或相邻的原子上（如-NR2，或NR-C（O）R），两者可形成5-8碳的环状化合物，并且环上可以包含一个杂原子（如N，O或S）。
本发明上述的H2O2可采用比色法、电化学法、化学发光法或荧光法进行检测。
比色法可采用众所周知的Trinder反应，检测试剂包括辣根过氧化物酶，4-AA（4-乙酰氧基氮杂环丁酮），酚类化合物（如2-氯酚，2,4-二氯苯酚，4-氯酚，2,6-二氯苯酚），和/或苯胺类似物（如N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐，N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐）。
化学发光法检测试剂包括发光底物（如鲁米诺、异鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺、N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺、异硫氰酸异鲁米诺、N-(4-异硫氰基丁基)-N-乙基异鲁米诺、吖啶酯、光泽精、洛粉碱，邻菲罗林）和/或催化剂（如Cu2+，Co2+，铁氰酸盐，过氧化物酶）。
也可通过常规方法检测NADH的消耗量来推算碱性磷酸酶的量。
本发明所述底物和/或组合物用来检测样品中存在的碱性磷酸酶或目标分子，目标分子可以是酶标记的一个分子，如抗原，抗体，蛋白质，核酸或寡聚核苷酸。特殊情况下，碱性磷酸酶本身就是被检测的对象。
可以使用任何形式的试剂和/或酶，如醇氧化酶，二级醇氧化酶，醇脱氢酶，S-二级醇脱氢酶。可单独或混合使用。
本发明的组合物，可用于免疫反应，如：酶联免疫试验（ELISA），免疫印迹，免疫沉淀，免疫组化，侧流免疫，U-捕获检测，抑制试验和亲和力试验，蛋白质测序，核酸测定等。
本文中使用的术语“碱性磷酸酶（ALP）”是指能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，例如对来源于细菌的ALP来说，其最适pH是8.0，而对于源于牛的ALP则是8.5。用于本发明的碱性磷酸酶可以是各种来源的碱性磷酸酶，包括但不限于自然提取和工程菌表达制备的碱性磷酸酶、表面糖基化处理或去糖基处理的碱性磷酸酶，以及其它基团修饰处理的碱性磷酸酶。所有合适的碱性磷酸酶都包括在本发明中。
除非另有说明，本文中使用的术语“烷基”，“烯”和“炔”，包括直链，支链和环状烃基及其组合，如果未被取代，则只包含C和H，如甲醇，乙醇，异丁酯，环己烷，环戊烷，2丙烯，3-丁烷等。当基团中最多可包含10个碳原子时可表示为1-10C或C1-C10或C1-10。当存在杂原子（例N，O和S）取代时，应将杂原子数计入，如C1-C6代表基团中所有环状或链状烃中碳原子及其取代的杂原子数总和。
本文中使用的术语“烷烃”指饱和烃，是只有碳碳单键和碳氢键的烃。烷烃分子里的碳原子之间以单键结合。“烯烃”和“炔烃”分别指含有C=C键（碳-碳双键）（烯键）或C≡C键（碳-碳三键）（炔键）的碳氢化合物，属于不饱和烃。
本文中使用的术语“杂烷”，“杂烯”和“杂炔”指相应的烃基组（烷基，烯烃基和炔烃基），此处“杂”是指包含1-3O，S或N杂原子或其组合，因此至少有一个相应的烷，烯或炔烃基碳原子被特定杂原子取代，形成“杂烷”，“杂烯”和“杂炔”。优选大小与相应烃基取代相同的杂烷。考虑到化合物的稳定性，除N或S以硝基或磺酰形式取代外，不推荐相邻杂原子取代。
本文中使用的术语“烷基”还包括环烷基和烷基环烷基，此处“环烷基”特指非芳香环的碳环，此处的“烷基环烷基”指烷基上连接有非芳香环的碳环化合物。“杂环烷”是含有至少一个杂原子的非芳香环碳环，如含S或N；“烷基杂环烷”指烷基上连接含有至少一个杂原子的非芳香环碳环。优选大小与相应烃基取代相同的环烷基、烷基环烷基、杂环烷和烷基杂环烷。此处所述的环还包括含一个或两个双键的非芳香环。
本文中使用的术语“烯烃基”是指二价烃基组，因为它是二价，它可以链接其他两个基团。通常它指–(CH2)n-，n选1-8，优选1-4，它还可以被其他基团取代，长度可以改变，并且二价键不需要在链两端。本文所述烷基的相关定义也适用于烯烃基。
本文中使用的术语“酰”指羰基碳原子一端连有烷基，烯烃基，炔烃基自由基的基团，“杂酰”指相应的碳原子而非羰基碳被杂原子N，O和S取代，例如，-C(=O)OR和–C(=O)NR2。酰基和杂酰羰基碳原子两侧可以连接任何基团和分子。通常为C1-C8酰基，如甲酰基，乙酰，特戊酰和苯甲酰，或C2-C8杂酰基，如甲氧乙酰基，乙氧羰基和4-吡啶酰基。包含酰基或杂酰基的烃基及其杂原子取代基亦可被本发明所述的取代基取代。
本文中使用的术语“杂原子取代形式”是指烷基或酰基指定碳环中至少有一个碳原子被N，O或S取代。因此，烷基，烯烃基，炔烃基，酰基的杂原子取代形式分别为杂烷基，杂烯烃基，杂炔烃基，杂酰基。除氧连接到N或S上形成硝基或磺酰基外，通常不超过两个N，O或S原子顺序连接。
本文中使用的术语“任意取代”指基团没有非氢取代，或有一个或多个非氢取代。如果没有特殊情况，这种取代总数与基团未被取代时的氢原子数目相等。如果有双键连接，如羰基氧（=O），那么总取代数根据键的数目相应减少。
本文中使用的术语“卤代”包括氟代，氯代，溴代和碘代。优选氟代和氯代。
本文中使用的术语“氨基”是指NH2，包括“取代”或“任意取代”的形式，NR’R”，其中每个R'和R”可以是H，烷基，烯烃基，炔烃基，酰基及其杂原子取代形式，这些烷基，烯烃基，炔烃基，酰基如本文所述可被相应的基团取代。R'和R”还可形成3-8个原子的环，可是饱和的，也可以是不饱和的，并且可以被本文所述的烷基取代基取代。
一般情况下，烷基，烯，炔，酰基及其杂原子基团作为取代基同样也会被本发明所述典型取代基取代。如果没有特殊说明，这些取代基的性质与原始取代基类似。
本文中使用的术语“醇氧化酶（EC1.1.3.13）”是指一种酶，能催化以下的化学反应：伯醇+O2→醛+H2O2。
本文中使用的术语“醇脱氢酶（EC1.1.1.1）（ADH）”是指生物体内一种脱氢酶，大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性，能以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应：-CH2OH+NAD+→-CHO+NADH+H+。
本文中使用的术语“二级醇氧化酶（EC1.1.3.18）”是指在氧气存在下，能催化与仲碳相连的羟基转变为酮的酶，一般对五个或更多的碳相连的醇或分子量超过300的烯醇活性较大。
本文中使用的术语“S-二级醇脱氢酶（EC1.1.1.B3）”是指能以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）为辅酶，催化仲醇和酮之间的可逆反应：-CHOH+NAD+→-CHO+NADH+H+。
本文中使用的术语“NADH”是指还原型的NAD+或合适的衍生物如乙酰-NADH或硫代-NADH。
本文中使用的术语“抗体”不仅指完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段（如Fab,Fab’,F(ab’)2,Fv），单链（ScFv），微型双功能抗体，多特异性抗体，突变体及其融合蛋白，包括抗体部分和其他任何修饰的免疫球蛋白分子，及所需的特异性抗原识别位点。任何类型的IgG，IgA或IgM及其子类均可以使用，并不需要任何特定类别的抗体。
本文中使用的术语“核酸”是指由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物，植物细胞及微生物内，生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸，简称RNA和脱氧核糖核酸，简称DNA。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用。
本文中使用的术语“Trinder反应”又称“偶联终点比色法”，其原理为被测物质通过酶作用产生的H2O2在4-AA、辣根过氧化物酶、苯酚或其类似物的存在下，可生成红色醌亚胺化合物。此反应首先由Trinder于1969年提出，故名Trinder反应。最初使用苯酚作生色剂，后来有许多作者提出十余种化合物替代苯酚（如2.4-二氯酚等），使反应的灵敏度得以显著提高。
具体的，本发明上述的碱性磷酸酶标记信号放大组合物：除包括上述碱性磷酸酶底物外，还需包括以下几项：
（1）醇类氧化酶，如醇氧化酶（EC1.1.3.13）或二级醇氧化酶（EC1.1.3.18），可将碱性磷酸酶水解碱性磷酸酶底物生成的产物氧化成醛或酮化合物。
（2）醇类脱氢酶，如醇脱氢酶（EC1.1.1.1）或S-二级醇脱氢酶（EC1.1.1.B3），可使生成的醛和酮化合物转化为醇化物。
（3）参与还原反应的共反应物，如NADH，其与醇类脱氢酶共同作用可将生成的醛和酮化合物转化为醇化合物。
（3）用于检测副产物H2O2的试剂。
本发明上述的醇氧化酶（EC1.1.3.13）包括但不限于自然提取、工程菌表达制备及基团修饰处理的乙醇氧化酶；也可使用任何合适的醇氧化酶。例如美国专利7160708，5166329，4956290，4729956和4619898中披露和/或声称都可以使用。Janssen和Ruelius在Biochim.Biophys.Acta.,151(2):330–342(1968)中及Suye在Curr.Microbiol.,34(6):374–7(1997)中提及的也可以使用。
本发明上述的二级醇氧化酶（EC1.1.3.18）包括但不限于自然提取、工程菌表达制备及基团修饰处理的二级醇氧化酶。也可以使用任何合适的二级醇氧化酶。例如美国专利7282067，5538517，7288120中披露和/或声称都可以使用。Vaclavkova,T.等在Appl.Microbiol.Biotechnol.76：911-917（2007）中及Qian,D.等在WorldJ.Microbiol.Biotechnol.20：587-591（2004）中提及的也可以使用。上述的二级醇氧化酶（EC1.1.3.18）包括但不限于自然提取、工程菌表达制备及基团修饰处理的二级醇氧化酶。
本发明上述的醇类脱氢酶可以包括如醇脱氢酶（EC1.1.1.1）或S-二级醇脱氢酶（EC1.1.1.B3），可使生成的醛和酮化合物转化为醇化物。例如，美国专利7750135，7354751，6552249，6432688，6255092，6225099，5908924，5855881，5695973，5445943，5385833，5344777，5162516，5162203，4241184，4131727，和4111751中披露和/或声称都可以使用。YakushiandMatsushita在ApplMicrobiolBiotechnol.,86(5):1257-65(2010)中及Yin在AlcoholAlcoholSuppl.,2:113-9(1994)中提及的也可以使用。
本发明上述的S-二级醇脱氢酶（EC1.1.1.B3）包括但不限于自然提取、工程菌表达制备的及基团修饰处理的S-二级醇脱氢酶。也可以使用任何合适的S-二级醇脱氢酶。如Rocha-Martin等在ProcessBiochem.,44:1004-1012(2009)中及Pennacchio,A等在Extremophiles,13:751-761(2009)中提及的。
本发明上述的NADH包括还原型的NAD+或合适的衍生物如乙酰-NADH或硫代-NADH。
本发明上述测量副产物H2O2的试剂包括通过比色法、电化学法、化学发光法或荧光法进行检测的试剂。其中比色法可采用众所周知的Trinder反应，检测试剂至少包括过辣根氧化物酶，4-AA，苯酚（如2-氯酚，2,4-二氯苯酚，4-氯酚，2,6-二氯苯酚），和/或苯胺类似物（如N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐，N-(2-羟基-3-磺丙基)-35-二甲氧基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐）；化学发光法检测试剂包括发光底物（如鲁米诺、异鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺、N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺、异硫氰酸异鲁米诺、N-(4-异硫氰基丁基)-N-乙基异鲁米诺、吖啶酯、光泽精、洛粉碱，邻菲罗林）和/或催化剂（如Cu2+，Co2+，铁氰酸盐，过氧化物酶）。
本发明上述碱性磷酸酶包括单独的碱性磷酸酶或与抗原，半抗原，抗体，蛋白质，核酸或寡聚核苷酸相连接的碱性磷酸酶；“抗体”不仅指完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段（如Fab,Fab’,F(ab’)2,Fv），单链（ScFv），微型双功能抗体，多特异性抗体，突变体及其融合蛋白，包括抗体部分和其他任何修饰的免疫球蛋白分子及所需的特异性抗原识别位点。任何类型的IgG，IgA或IgM及其子类均可以使用。
本发明上述碱性磷酸酶底物及其碱性磷酸酶标记信号放大组合物中，除碱性磷酸酶（被检测物）是限量（<100nM）外，其他所有酶包括循环与检测步骤中的酶都过量加入反应体系。底物磷酸酯也过量加入反应体系。比如；乙醇氧化酶与乙醇脱氢酶的量可以在10-500U/mL的范围，以20-100U/mL为常用。底物磷酸酯的浓度可在0.1-10mM范围，以1-3mM为常用。鲁米诺与辣根过氧化酶的量与常用的ELISA中的用量一样。反应时间根据信号放大倍数需要而定，一般在5-60min之间，以10-30min为常用。本发明上述碱性磷酸酶底物及其碱性磷酸酶标记信号放大组合物可做成试剂盒的形式，该试剂盒可以是每个组分单独包装，也可以根据试剂的性质将有些组分混合包装，该试剂盒还应包括用于校准检测***的一个或多个标准及检测说明。
若做成试剂盒其缓冲***包括但不限于TAE缓冲***、磷酸盐缓冲***、醋酸盐缓冲***、EDTA缓冲***、EGTA缓冲***、Tris-HCl缓冲***、柠檬酸盐缓冲***、SSC缓冲***、SSPE缓冲***、MES缓冲***、PIPES缓冲***。
总之，本发明提供了一种碱性磷酸酶测定的方法，其中包括本发明提及的碱性磷酸酶底物及其组合物。可将上述组合物做成试剂盒的形式，该试剂盒可以是每个组分单独包装，也可以根据试剂的性质将有些组分混合包装，该试剂盒还包括一个或多个标准，用于校准检测***，该试剂盒还应包含检测说明。
本发明的优点和有益效果：本发明的组合物或称放大方法，可用于免疫反应，如：酶联免疫试验（ELISA），免疫印迹，免疫沉淀，免疫组化，侧流免疫，U-捕获检测，抑制试验和亲和力试验，蛋白质测序，核酸测定等。具有灵敏度高，通过循环酶法实现放大碱性磷酸酶标记信号的***的优点。
本领域技术人员应理解，本文中所述的各个方面和特征可相互组合，组合形成的各种技术方案都包括在本发明中。
具体实施方式：
下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
底物七氟戊-2-醇磷酸酯的制备
称取五氧化二磷5g于三口烧瓶中，用20ml苯溶解.搅拌30min后，把水浴锅的温度设置在70～90℃，待温度上升到设定的温度后，用滴液漏斗向三口烧瓶中缓慢地加七氟戊-2-醇（CAS登录号375-14-4）15g，待反应3h后，停止搅拌，向三口烧瓶加人适量的双氧水脱色，待温度冷却到室温后，蒸馏2h去除其中的苯即得，其结构如下所示：
实施例2
底物1-环己基-2-丁烯醇磷酸酯的制备
用移液管准确移取磷酸5ml，加入到烧瓶中，准确称取五氧化二磷3g，缓慢加入到磷酸溶液中，并不断搅拌，直至五氧化二磷全部溶解。将烧瓶放在油浴锅中（130～150℃），5min后，缓慢加入1-环己基-2-丁烯醇（CAS登录号18736-82-8）26g，并不断搅拌，待反应3h后，停止搅拌，再抽真空2h即得，其结构如下所示：
实施例3
底物1-BOC-2-氮杂环丁烷甲醇磷酸酯的制备
称取五氧化二磷10g于三口烧瓶中，用20ml苯溶解.搅拌30min后，把水浴锅的温度设置在70～90℃，待温度上升到设定的温度后，用滴液漏斗向三口烧瓶中缓慢地加1-BOC-2-氮杂环丁烷甲醇（CAS登录号161511-85-9）10g，待反应24h后，停止搅拌，，待温度冷却到室温后，蒸馏2h去除其中的苯即得，其结构如下所示：
实施例4
底物4-(1-甲基乙烯烃基)-1-环己烯-1-甲醇磷酸酯的制备
称取五氧化二磷12g于三口烧瓶中，用16ml苯溶解.搅拌120min后，把水浴锅的温度设置在80～90℃，待温度上升到设定的温度后，用滴液漏斗向三口烧瓶中缓慢加入4-(1-甲基乙烯烃基)-1-环己烯-1-甲醇（CAS登录号536-59-4）20g，并不断搅拌，待反应72h后，停止搅拌，再抽真空2h即得，其结构如下所示：
实施例5
底物4-庚炔-2-醇磷酸酯的制备
用移液管准确移取磷酸5ml，加入到烧瓶中，准确称取五氧化二磷3g，缓慢加入到磷酸溶液中，并不断搅拌，直至五氧化二磷全部溶解。将烧瓶放在油浴锅中（130～150℃），5min后，缓慢加入4-庚炔-2-醇（CAS登录号19781-81-8）20g，并不断搅拌，待反应6h后，停止搅拌，再抽真空4h即得，其结构如下所示：
实施例6
底物N-叔丁氧羰基-D-蛋氨醇磷酸酯的制备
用移液管准确移取磷酸5ml，加入到烧瓶中，准确称取五氧化二磷3g，缓慢加入到磷酸溶液中，并不断搅拌，直至五氧化二磷全部溶解。将烧瓶放在油浴锅中（130～150℃），5min后，缓慢加入N-叔丁氧羰基-D-蛋氨醇（CAS登录号91177-57-0）80g，并不断搅拌，待反应72h后，停止搅拌，再抽真空1h即得，其结构如下所示：
实施例7
试剂1
Tris-HCl缓冲，pH值9.0，100mM
戊基二氢磷酸酯（CAS登录号12789-46-7）：3mM
乙醇氧化酶（来自酵母）：20U/ml
乙醇脱氢酶（来自酵母）：30U/ml
NADH的：2mM
试剂2：
磷酸盐缓冲液，pH值6.3，100mM
4-AA：5mM
toos：5mM
辣根过氧化物酶：10U/ml
180μl试剂1和20μl样品37℃孵育5min，加入60μl试剂2，37℃孵育2-4min，测量546nm处吸光度，结果见表1。
实施例8
试剂1
Tris-HCl缓冲，pH值9.0，50mM
2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-甲基磷酸酯：10mM
二级醇氧化酶（来自假单胞菌）：200U/ml
S-二级醇脱氢酶（来自栖热菌）：300U/mlNADH的：2mM
试剂2：
MES缓冲液，pH值6.3，100mM
4-AA：5mM
toos：5mM
辣根过氧化物酶：10U/ml
180μl试剂1和20μl样品37℃孵育5min，加入60μl试剂2，37℃孵育2-4min，测量546nm处吸光度，结果见表1。
对比实施例9
市售碱性磷酸酶试剂盒（AMP缓冲液法）
240μl试剂1和6μl样品37℃孵育5min，加入60μl试剂2，37℃孵育1min，在405nm处测量1-3min吸光度变化，结果见表1。结果显示，使用本发明的信号倍增***，试剂的检测灵敏度大为提高。
表1 各方法检测碱性磷酸酶对比结果
| 实施例7 | 实施例8 | 对比实施例9 | |
| 低值样本（85U/L） | 0.5434 | 0.4598 | 0.0422 |
| 高值样本（200U/L） | 1.2536 | 1.0964 | 0.0972 |
实施例10
试剂1
TAE缓冲，pH值9.0，50mM
磷酸氢二（甲基丙烯酰氧乙基）酯（CAS登录号32120-16-4）：5mM
乙醇氧化酶（来自酵母）：40U/ml
乙醇脱氢酶（来自酵母）：50U/ml
NADH的：2mM
试剂2：
鲁米诺：10mM
辣根过氧化物酶：10U/ml
向20μl样本中加入50μl泌乳素抗体包被的磁珠（泌乳素试剂盒R1a，美国贝克曼库尔特有限公司），室温温育（22℃）30min，再加入100μl碱性磷酸酶-泌乳素抗体结合物（泌乳素试剂盒R1b，美国贝克曼库尔特有限公司），孵育反应后清洗，加入50μl试剂1，37℃孵育5min，加入50μl试剂2，用滨松9507半自动化学发光仪测量20s发光值，结果见表2。
实施例11
试剂1
PIPES缓冲液，pH值9.0，100mM
1-环己基-2-丙烯磷酸酯：30mM
二级醇氧化酶（来自假单胞菌）：100U/ml
二级醇脱氢酶（来自栖热菌）：300U/ml
NADH的：2mM
试剂2：
鲁米诺：10mM
氢氧化钠：0.5M
向20μl样本中加入50μl泌乳素抗体包被的磁珠（泌乳素试剂盒R1a，美国贝克曼库尔特有限公司），室温温育（22℃）30min，再加入100μl碱性磷酸酶-泌乳素抗体结合物（泌乳素试剂盒R1b，美国贝克曼库尔特有限公司），孵育反应后清洗，加入50μl试剂1，37℃孵育5min，加入50μl试剂2，用滨松9507半自动化学发光仪测量20s发光值，结果见表2。
对比实施例12
市售泌乳素试剂盒（美国贝克曼库尔特有限公司）
向20μl样本中加入50μl泌乳素抗体包被的磁珠（泌乳素试剂盒R1a，美国贝克曼库尔特有限公司），室温温育（22℃）30min，再加入100μl碱性磷酸酶-泌乳素抗体结合物（泌乳素试剂盒R1b，美国贝克曼库尔特有限公司），孵育反应后清洗，，加入200μl化学发光液lumiphos530（购于beckman公司）用滨松9507半自动化学发光仪测量20s发光值，结果见表2。结果显示，使用本发明的信号倍增***，试剂的检测灵敏度大为提高。
表2 各方法检测泌乳素对比结果
Claims (8)
1.一种碱性磷酸酶标记信号放大***，其特征在于：该***包括：
（1）碱性磷酸酶底物，其结构通式如下式（I）所示：
(I)
其中：
A是烷基，烯烃基或炔烃基中的一种；
R’’为H，C1- C4烷基，C5- C10环烷基中的一种；
n是1-8的整数；
（2）碱性磷酸酶标记信号放大组合物，包括结构通式为式（I）的碱性磷酸酶底物，醇类氧化酶、醇类脱氢酶及NADH；底物在碱性磷酸酶作用下产生游离的磷酸及相应的醇化合物，醇化合物在氧气参与下被醇类氧化酶氧化成醛或酮化合物，同时生成H2O2，醛和酮化物在NADH存在下经醇类脱氢酶作用又还原成醇化物，从而形成循环***。
2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶标记信号放大***，其特征在于：式（I）中所述的烷基，烯烃基和炔烃基为C1-10的烷基、C2-10的烯烃基或炔烃基。
3.根据权利要求2所述的碱性磷酸酶标记信号放大***，其特征在于：所述的C1-10的烷基、C2-10的烯烃基或炔烃基可被卤代，=O，=N-CN，=N-OR，=NR，OR，NR2，SR, SO2R，SO2NR2，NRSO2R，NRCONR2，NRCOOR，NRCOR，CN，COOR，CONR2，OOCR，COR和NO2取代，其中每个R可以是H，C1-C8烷基，C2 -C8杂烷，C3-C8环烷，C4-C10杂环烷，C1-C8酰基，C2-C8杂酰基，C2-C8烯，C2-C8杂卤代烯烃，C2-C8炔，C2 - C8 杂炔或C5-C10杂环；其中R也可被卤代, =O，=N-CN，=N-OR’，=NR’，OR’，NR’2，SR’，SO2R’，SO2NR’2，NR’SO2R’，NR’CONR’2，NR’COOR’，NR’COR’，CN，COOR’，CONR’2，OOCR’，COR’ 和 NO2取代，其中每个R’可以是H，C1-C8烷基，C2 -C8杂烷，C3-C8环烷，C4-C10杂环烷，C1-C8酰基，C2-C8杂酰基，C2-C8烯，C2-C8杂卤代烯烃，C2-C8炔，C2-C8 杂炔或C5-C10杂环；如果取代基R或R'在相同或相邻的原子上，两者可形成5-8碳的环，并且环上可以包含一个杂原子。
4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶标记信号放大***，其特征在于，所述的碱性磷酸酶标记信号放大组合物，包括了碱性磷酸酶底物，具体还包括以下几项：
（1）醇类氧化酶，能分别将碱性磷酸酶水解碱性磷酸酶底物生成的伯醇或叔醇氧化成相应的醛或酮化合物；
（2）醇类脱氢酶，能将生成的醛和酮化合物转化为醇化合物；
（3）参与还原反应的共反应物——NADH，其与醇类脱氢酶共同作用能将生成的醛和酮化物转化为醇化物；
（4）用于检测副产物H2O2的试剂。
5.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶标记信号放大***，其特征在于：所述的醇类氧化酶包括醇氧化酶或二级醇氧化酶；所述的醇类脱氢酶包括醇脱氢酶或S-二级醇脱氢酶。
6.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶标记信号放大***，其特征在于：所述的NADH包括还原型的NAD+或乙酰- NADH或硫代- NADH。
7.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶标记信号放大***，其特征在于：所述碱性磷酸酶包括单独的碱性磷酸酶或与抗原，半抗原，抗体，蛋白质或核酸相连接的碱性磷酸酶。
8.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶标记信号放大***，其特征在于：所述碱性磷酸酶底物及其碱性磷酸酶标记信号放大组合物做成试剂盒的形式，该试剂盒为每个组分单独包装或根据试剂的性质将有些组分混合包装，该试剂盒还包括用于校准检测***的一个或多个标准及检测说明。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210185739.5A CN102706869B (zh) | 2012-06-05 | 2012-06-05 | 碱性磷酸酶标记信号放大*** |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210185739.5A CN102706869B (zh) | 2012-06-05 | 2012-06-05 | 碱性磷酸酶标记信号放大*** |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102706869A CN102706869A (zh) | 2012-10-03 |
| CN102706869B true CN102706869B (zh) | 2014-09-17 |
Family
ID=46899810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210185739.5A Active CN102706869B (zh) | 2012-06-05 | 2012-06-05 | 碱性磷酸酶标记信号放大*** |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102706869B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103868913B (zh) * | 2014-02-11 | 2017-07-14 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液 |
| CN104297492A (zh) * | 2014-10-23 | 2015-01-21 | 沈鹤霄 | 一种基于循环酶法的标记方法及其应用 |
| CN108872205A (zh) * | 2018-06-19 | 2018-11-23 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 目标物含量检测方法以及检测试剂在该检测方法中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0243125A2 (en) * | 1986-04-19 | 1987-10-28 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Method of measuring phenol and alpha-naphthol, and method of measuring the activity of enzymes |
| JP2006317201A (ja) * | 2005-05-11 | 2006-11-24 | Kitasato Inst:The | 核酸増幅反応の新規短時間検出方法 |
| CN101281200A (zh) * | 2007-04-03 | 2008-10-08 | 希森美康株式会社 | 碱性磷酸酶标记试剂盒、免疫测定试剂盒及免疫测定方法 |
| WO2012027137A1 (en) * | 2010-08-24 | 2012-03-01 | Microchips, Inc. | Implantable biosensor device and methods of use thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1173954C (zh) * | 1996-01-16 | 2004-11-03 | 鲁米根公司 | 与磷酸酶反应产生化学发光的化合物、组合物和方法 |
| US20060205090A1 (en) * | 2005-03-14 | 2006-09-14 | Newton Michael W | Water-soluble conjugates for electrochemical detection |
| CN101620142A (zh) * | 2008-06-30 | 2010-01-06 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)浓度测定方法 |
-
2012
- 2012-06-05 CN CN201210185739.5A patent/CN102706869B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0243125A2 (en) * | 1986-04-19 | 1987-10-28 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Method of measuring phenol and alpha-naphthol, and method of measuring the activity of enzymes |
| JP2006317201A (ja) * | 2005-05-11 | 2006-11-24 | Kitasato Inst:The | 核酸増幅反応の新規短時間検出方法 |
| CN101281200A (zh) * | 2007-04-03 | 2008-10-08 | 希森美康株式会社 | 碱性磷酸酶标记试剂盒、免疫测定试剂盒及免疫测定方法 |
| WO2012027137A1 (en) * | 2010-08-24 | 2012-03-01 | Microchips, Inc. | Implantable biosensor device and methods of use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102706869A (zh) | 2012-10-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vojinović et al. | Assay of H2O2 by HRP catalysed co-oxidation of phenol-4-sulphonic acid and 4-aminoantipyrine: characterisation and optimisation | |
| CN102706869B (zh) | 碱性磷酸酶标记信号放大*** | |
| US5589328A (en) | Chemiluminescence assays based on indoxyl substrates, thioindoxyl substrates and other substrates | |
| CN108034694B (zh) | 一种1,5-脱水山梨醇的检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN101655493A (zh) | 一种测定葡萄糖含量及葡萄糖氧化酶活性的比色分析法 | |
| CN103889997B (zh) | 水解酶酶底物及其应用 | |
| US10125385B2 (en) | Electrochemiluminescence (ECL) detection reagents and related methods for measuring enzyme activity | |
| JPS6357040B2 (zh) | ||
| Baggetto et al. | Effects of ATP on various steps controlling the rate of oxidative phosphorylation in newborn rat liver mitochondria | |
| Guo et al. | Study and analytical application of bromopyrogallol red as a hydrogen donor substrate for peroxidase | |
| CA1179929A (en) | Process and reagent for determination of glycerol | |
| CN102262066A (zh) | 一种检测单胺氧化酶含量的方法和试剂盒 | |
| CN109541238A (zh) | 直接胆红素测定方法及试剂盒 | |
| CN113640283A (zh) | Tet酶活性测定方法及tet酶活性小分子激活剂或抑制剂的高通量筛选方法 | |
| SE449004B (sv) | Bioluminiscensbestemning av nadh och/eller nadph | |
| FR2540137A1 (fr) | Procede tres sensible d'analyse quantitative enzymatique | |
| JPH0231697A (ja) | 被分析物の存在を測定する分析方法及び試験組成物 | |
| Ndeh et al. | Serum Amino Transaminases Activities and De Ritis Ratio amongst Apparently Healthy Secretors and Non-Secretors of ABH Substances Dwelling in Uyo Urban, Akwa Ibom State, Nigeria | |
| AU595993B2 (en) | Dicyanoethylaryl derivatives and process for their preparation | |
| Kricka et al. | Bioluminescence and Chemiluminescence Literature: The 1995 Literature: Part 2 | |
| Srivastava | Search for the marker of physiological state in Clostridium acetobutylicum | |
| Bijkerk | The dynamics of yeast growth | |
| JP2658113B2 (ja) | 発光バクテリアのルシフェラーゼによる過酸化水素の定量法 | |
| JPH03119997A (ja) | 成分の測定法 | |
| JPH03285697A (ja) | 化学発光検定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 315104 Zhejiang city of Ningbo province Yinzhou District Qiming Road No. 299 Patentee after: Meikang biological Polytron Technologies Inc Address before: 315104 Ningbo, Yinzhou, Central District, No. Qiming South Road, No. 299 Patentee before: Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd. |