DE3780315T2 - - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung eines Antigen-Antikörper-Komplexes.
  • In "Methods in Enzymology", Band 121 (1986), Seiten 548-556, wird ein Verfahren zur Verwendung von Anti-Immunoglobulin offenbart, das an rote Blutkörperchen in Agglutination von monoklonalen Antikörpern gebunden ist, insbesondere auf Seite 552 und in Tabelle 2.
  • Eins der herkömmlichen Reagenzien zur Bestimmung der Rh-Blutgruppe ist ein monoklonaler Human-Anti-D-Antikörper. Die Herstellung und die Verwendung dieses monoklonalen Human-Anti-D-Antikörpers werden in den Berichten der 13. "Japanese Society for Immunology" (1983), Seiten 416-417, und in den Japanischen Patentveröffentlichungen 58-500366, 59-138959 und 60-70361 beschrieben. Ein anderes Reagenz ist ein polyklonaler Human- Anti-D-Antikörper, der aus dem menschlichen Serum gewonnen wird. Dies ist ein allgemein verwendetes, offiziell genehmigtes Reagenz.
  • Zum Virusnachweis wird üblicherweise in passiver Hämagglutination ein Reagenz verwendet, das durch Sensibilisierung oder Verbinden von roten Schafs- Blutkörperchen mit einem monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörper hergestellt wird.
  • Die Reaktivität des oben erwähnten monoklonalen Antikörpers mit dem entsprechenden Antigen ist jedoch so gering, daß der Antikörper nur für einige Nachweisverfahren nützlich ist. So gibt es beispielsweise für die Bestimmung der Rh-Blutgruppe das Anti-Human-Globulin-Verfahren, das Bromelin-Verfahren, das Albumin-Verfahren und das Physiologische-Kochsalzlösung-Verfahren. Der auf der 13. "Japanese Society for Immunology" (1983) vorgestellte monoklonale Human-Anti-D-Antikörper kann bei dem Anti-Human-Globulinoder dem Bromelin-Verfahren Agglutination hervorrufen und die Blutgruppe eines Rh(D)-Antigens bestimmen, ist aber nicht in der Lage, Agglutination bei dem Album in- oder dem Kochsalzlösung-Verfahren hervorzurufen, wodurch seine Anwendbarkeit eingeschränkt ist.
  • Der polyklonale Human-Anti-D-Antikörper ist ein vom Menschen abstammendes Reagenz, das Humanserum oder dessen mit einem geeigneten Lösungsmittel verdünnte Lösung verwendet, und es ist schwer in größeren Mengen herzustellen, da das Humanserum üblicherweise dadurch erhalten wird, daß Rh-negativen Personen Rh-positives Blut verabreicht wird. Das an monoklonale Anti-HBs-Antikörper gebundene rote Schafs-Blutkörperchen hat eine geringe Nachweis-Sensibilität oder -Reaktivität mit dem Virus-Antigen.
  • Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verwendung eines Antigen-Antikörper-Komplexes zu schaffen, das für verschiedene Anwendungen, insbesondere für verschiedene Blutgruppenbestimmungsverfahren brauchbar ist.
  • Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Verwendung des Antigen-Antikörper-Komplexes gelöst, in dem zwei Moleküle eines einzelnen monoklonalen Antikörpers der IgG-Klasse verbunden sind mit einem oder zwei Molekülen eines monoklonalen oder polyklonalen Anti-IgG-Antikörpers, der spezifisch ist zu dem monoklonalen Antikörper der IgG-Klasse. Dieser Komplex reagiert mit Rh(D)-positiven Blutzellen und verursacht eine beobachtbare Agglutination.
  • Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, daß mit dem erfindungsgemäßen Antigen-Antikörper-Komplex eine Agglutination in einer einzigen Reaktion auftritt, so daß die Blutgruppe sofort bestimmt werden kann.
  • Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung.
  • Fig. 1 zeigt die Herstellung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung;
  • Fig. 2 zeigt die Agglutination von Rh(D)-positiven Zellen durch den Antigen-Antikörper-Komplex aus Fig. 1;
  • Fig. 3 zeigt die Herstellung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung;
  • Fig. 4 zeigt die Herstellung von an den Antigen-Antikörper- Komplex der Fig. 3 gebundenen roten Schafs-Blutkörperchen;
  • Fig. 5 zeigt die passive Hämagglutination des HBs-Antigens durch die an den Antigen-Antikörper-Komplex gebunden roten Schafs-Blutkörperchen aus Fig. 4;
  • Fig. 6 und 7 zeigen die Verwendung eines herkömmlichen monoklonalen Antikörpers in einem Anti-Human-Globulintest;
  • Fig. 8 zeigt die Herstellung von herkömmlichen an monoklonale Maus-Anti-HBs-Antikörper gebundene rote Schafs-Blutkörperchen; und
  • Fig. 9 zeigt die passive Hämagglutination des HBs-Antigens mit den monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörpern aus Fig. 8.
  • Der oben erwähnte monoklonale Antikörper der IgG-Klasse, der zur Bestimmung des Rote-Blutkörperchen-Oberflächen-Antigens (Blutgruppensubstanz) oder eines Virus-Antigens verwendet wurde, ist ein Antikörper gegen die Blutgruppe oder den Virus. Erfindungsgemäß ist der monoklonale Antikörper der IgG-Klasse an einen monoklonalen oder polyklonalen Anti-IgG-Antikörper gebunden, wie in Fig. 1 gezeigt wird. Demnach wird ein monoklonaler Antikörper der IgG-Klasse, wie z. B. ein monoklonaler Human-Anti-D-Antikörper, mit einem monoklonalen IgG-Antikörper, wie z. B. ein monoklonaler Anti-Human-IgG-Antikörper, oder mit einem polyklonalen Anti-IgG-Antikörper, wie z. B. ein polyklonaler Anti-Human-IgG-Antikörper, zu einem Antigen-Antikörper-Komplex verbunden, in dem zwei Moleküle des monoklonalen Antikörpers der IgG-Klasse an ein oder zwei Moleküle des monoklonalen IgG-Antikörpers gebunden sind. Wenn dieser Antigen-Antikörper-Komplex einem nachzuweisenden Antigen, wie z. B. einer Rh(D)-positiven Blutzelle, zugefügt wird, wird die Bindungsstelle des Antigen-Antikörper-Komplexes mit dem Antigen verbunden, so daß eine in Fig. 2 gezeigte Agglutination verursacht wird. Die Agglutination kann zum Nachweis des Antigens leicht beobachtet werden.
  • Fig. 6 und 7 zeigen die Agglutination in einem Anti-Human-Globulin-Test zum Nachweis eines Rh(D)-Blut-Antigens durch Verwendung eines herkömmlichen monoklonalen Human-Anti-D-Antikörpers. In Fig. 6 wird ein monoklonaler Human-Anti-D-Antikörper einer Rh(D)-positiven Blutzelle zugeführt und bei 37ºC für einige 10 Minuten inkubiert, so daß die Bindungsstelle des monoklonalen Human-Anti-D-Antikörpers mit dem Rh(D)-Antigen oder der Rh(D)-positiven Blutzelle verbunden und so eine an Anti-D-Antikörper gebundene Blutzelle gebildet wird. Da dieses nicht als Agglutination gesehen werden kann, wird ein Anti-Human-Globulin-Serum oder ein polyklonaler Anti- Human-IgG-Antikörper zugefügt, so daß die Bindungsstelle des polyklonalen Anti-Human-IgG-Antikörpers mit dem monoklonalen Human-Anti-D-Antikörper verbunden wird, was zu einer in Fig. 7 gezeigten beobachtbaren Agglutination führt.
  • Im Gegensatz dazu wird bei Verwendung des erfindungsgemäßen Antigen-Antikörper-Komplexes eine Agglutination durch eine einzige Reaktion gebildet, so daß die Blutgruppe sofort bestimmt werden kann.
  • Die Fig. 3 bis 5 zeigen die Verwendung des erfindungsgemaßen Antigen-Antikörper-Komplexes bei passiver Hämagglutination zum Nachweis eines Virus- Antigens. In Fig. 3 reagiert ein monoklonaler Antikörper der IgG-Klasse, wie z. B. ein monklonaler Maus-Anti-HBs-Antikörper, mit einem monoklonalen Anti-IgG-Antikörper, wie z. B. einem monoklonalen Anti-Maus-IgG-Antikörper, oder mit einem polyklonalen Anti-IgG-Antikörper, wie z. B. einem polyklonalen Anti-Maus-IgG-Antikörper, so daß ein Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird, in dem zwei Moleküle des monoklonalen Antikörpers der IgG-Klasse mit einem oder zwei Molekülen des monoklonalen oder polyklonalen Anti- IgG-Antikörpers verbunden sind.
  • In Fig. 4 ist der Antigen-Antikörper-Komplex an ein rotes Schafs-Blutkörperchen gebunden, das zur Verlängerung der Lagerzeit mit Glutaraldehyd behandelt wurde, so daß ein an den Antigen-Antikörper-Komplex gebundenes rotes Schafs-Blutkörperchen gebildet wird, was eine nützliche Virus-Antigen-Untersuchung darstellt.
  • Wenn dieses Reagenz, wie in Fig. 5 gezeigt, einem nachzuweisenden Antigen, wie z. B. einem HBs-Antigen, das ein Hepatitis-B-Virus-bezogenes Antigen ist, zugefügt wird, dann reagiert dieses Reagenz mit dem spezifischen Antikörper oder monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörper und verursacht eine beobachtbare Agglutination, so daß der Nachweis des Antigens ermöglicht wird.
  • Fig. 8 und 9 zeigen eine herkömmliche passive Hämagglutination zum Nachweis eines HBs-Antigens mit einem monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörper. Gemäß Fig. 8 wird ein monoklonaler Maus-Anti-HBs-Antikörper an das mit Glutaraldelhyd behandelte rote Schafs-Blutkörperchen gebunden, so daß ein an monoklonale Maus-Anti-HBs-Antikörper gebundenes rotes Schafs-Blutkörperchen gebildet wird, was als HBs-Antigen-Untersuchung verwendet wurde. Dieses Reagenz reagiert mit dem HBs-Antigen und bildet eine beobachtbare Agglutination, seine Reaktivität mit dem Virus-Antigen ist jedoch geringer als die der in Fig. 5 gezeigten Agglutination.
  • Es wird vermutet, daß die obige Agglutination durch die Tatsache gefördert wird, daß der Abstand zwischen den Blutzellen durch das Binden des Antigens vergrößert wird, so daß die Abstoßungskraft zwischen den Blutzellen verringert wird
    • BEISPIEL 1
  • In diesem Beispiel werden ein monoklonaler Human-Anti-D-Antikörper und ein monoklonaler Anti-Human-IgG-Antikörper als ein monoklonaler Antikörper der IgG-Klasse bzw. als ein monoklonaler Anti-IgG-Antikörper verwendet.
  • (1) Herstellung des monoklonalen Human-Anti-D-Antikörpers: Periphere Lymphzellen einer Rh(D)-negativen Person mit einem Anti-D-Antikörper wurden mit einem Epstein-Barr-Virus (EBV) infiziert. Die transformierten Zellen wurden in einem weichen Nähr-Agar geklont, so daß ein monoklonaler Human-Anti-D-Antikörper-Stamm (B2-1-Stamm) gebildet wird. Dieses Verfahren wird von Masatsune Uno et al. In den Berichten der 13. "Japanese Society for Immunology" (1983), Seiten 416-417, beschrieben.
  • Der derart geklonte B2-1-Stamm und ein JMS-3-Stamm (menschliche Zellen) werden in PEG-1500 fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden durch Grenzverdünnungstechnik geklont, so daß ein monoklonaler Human-Anti-D- Antikörper-Produktionsstamm (B-7-D-10-Stamm) gebildet wird. Dieser Anti-D-Antikörper wurde dadurch gereinigt, daß der IgG-Anteil durch ein 50%- Ammoniumsulfat-Verfahren abgetrennt und der monoklonale Human-Anti-D- Antikörper der IgG-Klasse mit 0,0175 Mol Phosphat-Pufferlösung (PBS), pH 6,8, unter Verwendung von DEAE-Sephacell (Pharmacia Co.) selektiert wurde.
  • (2) Herstellung des monoklonalen Anti-Human-IgG-Antikörpers: Eine BALB/C- Maus wurde mit dem Human-IgG immunisiert, das durch Reinigen von Humanserum mit DEAE-Sephacell erlangt wurde. Die geernteten Milzzellen wurden in PEG-4000 mit einem P3-X63-Ag8-U1-Stamm, der von einer BALB/C-Maus abstammt, fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden mit der Grenzverdünnungstechnik geklont, so daß ein monoklonaler Anti-Human- IgG-Antikörper-Produktionsstamm gebildet wird, gemäß dem Verfahren, das von Takeshi Watanabe in "Immunology Experimental Procedures" IX (1978), Seite 2963, beschrieben wird. Zum Erzielen eines monoklonalen Anti-Human-IgG-Antikörpers wird der Anti-IgG-Antikörper in derselben Weise wie oben in (1) gereinigt.
  • (3) Bestimmung des Titers des monoklonalen Human-Anti-D-Antikörpers: 0,1 ml des oben in (1) erhaltenen Anti-D-Antikörpers wurde zweimal nacheinander mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Eine Suspension aus 2% Rh-(D)-positiven Zellen in Kochsalzlösung wurde in jede der Verdünnungen durch Eintropfen zugefügt zur Reaktion bei 37ºC für 60 Minuten. Nachdem das Reaktionsprodukt dreimal mit Kochsalzlösung gewaschen wurde, wurden ihm 2 Tropfen Anti-Human-Globulin-Serum zugefügt und die Mischung für 15 Sekunden bei 3.400 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der größte Agglutination zeigende Verdünnungsfaktor wurde als der Titer genommen.
  • (4) Bestimmung des Titers des monoklonalen Anti-Human-IgG-Antikörpers: 0,1 ml des oben in (2) erlangten Anti-IgG-Antikörpers wurde zweimal nacheinander mit einem Lösungsmittel verdünnt, das 3% Fetal-Bovin-Serum (FBS) und 0,1% NaN&sub3; in Kochsalzlösung enthält. Eine 2% an Anti-D gebundene Zellen-Kochsalzlösung, die dadurch zubereitet wurde, daß ein Volumenteil einer 2%-Suspension aus R&sub1;- und/oder R&sub2;-Zellen in Kochsalzlösung mit einem Volumenteil eines 100fach mit Kochsalzlösung verdünnten Anti-D-Serums (Albumin-Antikörper) vermischt und diese Mischung bei 37ºC für eine Stunde inkubiert wurde, wurde in jede der Verdünnungen durch Eintropfen zugefügt. Die Mischung wurde für 15 Sekunden mit 3.400 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der größte Agglutination zeigende Verdünnungsfaktor wurde als Titer genommen.
  • (5) Herstellung des Antigen-Antikörper-Komplexes: Der oben in (1) erhaltene monoklonale Human-Anti-D-Antikörper wurde verdünnt mit 0,013 Mol PBS, pH 7,0, das 2% Bovin-Albumin und 0,1% NaN&sub3; enthält, so daß er im indirekten Anti-Globulin-Test mit Rh(D)-positiven Zellen einen Titer von 4.096 aufwies. Der oben in (2) erhaltene monoklonale Anti-Human-IgG-Antikörper wurde wie in (4) auf einen Titer von 256 eingestellt. Gleiche Volumenteile dieser Lösungen wurden vermischt und bei 37ºC für eine Stunde inkubiert, so daß ein Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird, in dem zwei Moleküle des monoklonalen Human-Anti-D-Antikörpers der IgG-Klasse (monoklonaler Antikörper) gebunden waren an ein oder zwei Moleküle des monoklonalen Human-IgG-Antikörpers (monoklonaler Anti-IgG-Antikörper), der spezifisch zu dem obigen Antikörper ist, s. Fig. 1.
  • (6) Verwendung des Antigen-Antikörper-Komplexes als Rh-Blutgruppen-Untersuchung: Der oben in (5) erhaltene Antigen-Antikörper-Komplex reagierte mit Rh(D)-positiven Zellen und zeige starke Agglutination, s. Fig. 2. Der Komplex reagierte allerdings nicht mit Rh(D)-negativen Zellen.
  • Tabelle 1 zeigt die Testergebnisse bei Verwendung eines herkömmlichen monoklonalen Human-Anti-D-Antikörpers und des erfindungsgemäßen Antigen-Antikörper-Komplexes im Kochsalzlösung-Verfahren. Die Ergebnisse zeigen, daß der erfindungsgemäße Antigen-Antikörper-Komplex eine starke Agglutination aufwies, wohingegen der monoklonale Human-Anti-D-Antikörper keinerlei Agglutination zeigte.
  • Tabelle 2 zeigt die Testergebnisse an denselben Proben wie die obigen bei Verwendung eines polyklonalen Anti-D-Antikörpers im Albumin -Verfahren und des erfindungsgemäßen Antigen-Antikörper-Komplexes im Kochsalzlösungs-Verfahren. Beide Reagenzien zeigten starke Agglutination mit Rh(D)positiven Zellen, so daß der Antigen-Antikörper-Komplex zur Bestimmung der Rh-Blutgruppe geeignet ist. Tabelle 1 Rh-Zellen-Bezeichnung Fälle Kochsalzlösungs-Verfahren MHAD-Antikörper¹) A-A-Komplex²) Rh(D) positiv Rh(D) negativ ccdEE ccdEe Ccdee ccdee ¹) Monoklonaler Human-Anti-D-Antikörper ²) erfindungsgemäßer Antigen-Antikörper-Komplex Tabelle 2 Rh-Zellen-Bezeichnung Fälle Kochsalzlösungs-Verfahren A-A-Komplex¹) Albumin-Verfahren MAD-Antikörper²) Rh(D) positiv Rh(D) negativ ccdEE ccdEe Ccdee ccdee ¹) erfindungsgemäßer Antigen-Antikörper-Komplex ²) Monoklonaler Anti-D-Antikörper (Ortho Diagnostic Systems Inc.)
    • BEISPIEL 2
  • In diesem Beispiel wurden ein monoklonaler Human-Anti-D-Antikörper und ein polyklonaler Anti-Human-IgG-Antikörper als ein monoklonaler Antikörper der IgG-Klasse bzw. als ein polyklonaler Anti-IgG-Antikörper verwendet.
  • (1) Die Herstellung und Titerbestimmung eines monoklonalen Human-Anti- D-Antikörpers wurden in derselben Weise wie in (1) bzw. (3) des Beispiels 1 durchgeführt.
  • (2) Herstellung des polyklonalen Anti-Human-IgG-Antikörpers: Der IgG-Anteil wurde vom normalen Humanserum mit einem 50%-Ammoniumsulfat- Verfahren getrennt und mit DEAE-Sephacell (Pharmacia Co.) gereinigt. Das gereinigte IgG wurde einem Kaninchen eingeimpft. Nachdem verschiedene Agglutinine von mit Neuraminidase behandelten Humanzellen absorbiert wurden, wurde der IgG-Anteil von dem entstandenen Serum mit einem 50%- Ammoniumsulfat-Verfahren getrennt und mit DEAE-Sephacell gereinigt, so daß ein polyklonal Human-IgG-Antikörper erhalten wird.
  • (3) Die Titerbestimmung und die Herstellung eines Antigen-Antikörper- Komplexes wurden in derselben Weise wie in (4) bzw. (5) des Beispiels 1 durchgeführt. In dem Antigen-Antikörper-Komplex sind zwei Moleküle eines monoklonalen Antikörpers der IgG-Klasse an ein oder zwei Moleküle eines polyklonalen Anti-IgG-Antikörpers gebunden, s. Fig. 1.
  • (4) Verwendung des Antigen-Antikörper-Komplexes als Rh-Blutgruppen-Untersuchung: Der oben in (3) erhaltene Antigen-Antikörper-Komplex reagierte mit Rh(D)-positiven Zellen und zeigte starke Agglutination, wohingegen er mit Rh(D)-negativen Zellen keine Agglutination zeigte.
  • Tabellen 3 und 4 zeigen die den Tabellen 1 und 2 entsprechenden Versuchsergebnisse. Aus diesen Tabellen ist ersichtlich, daß der Komplex des monoklonalen Human-Anti-D-Antikörpers und des polyklonalen Anti-Human-IgG- Antikörpers im Gegensatz zu dem rein monoklonalen Human-Anti-D-Antikörper starke Agglutination wie im Beispiel 1 zeigten, s. Fig. 1. Tabelle 3 Rh-Zellen-Bezeichnung Fälle Kochsalzlösungs-Verfahren MHAD-Antikörper¹) A-A-Komplex²) Rh(D) positiv Rh(D) negativ ccdEE ccdEe Ccdee ccdee ¹) Monoklonaler Human-Anti-D-Antikörper ²) erfindungsgemäßer Antigen-Antikörper-Komplex Tabelle 4 Rh-Zellen-Bezeichnung Fälle Kochsalzlösungs-Verfahren A-A-Komplex¹) Albumin-Verfahren MAD-Antikörper²) Rh(D) positiv Rh(D) negativ ccdEE ccdEe Ccdee ccdee ¹) erfindungsgemäßer Antigen-Antikörper-Komplex ²) Monoklonaler Anti-D-Antikörper (Ortho Diagnostic Systems Inc.)
  • Dieser Antigen-Antikörper-Komplex konnte in verschiedenen Verfahren zur Rh-Blutgruppenbestimmung agglutinieren, wie z. B. im Anti-Human-Verfahren, Bromelin-Verfahren, Albumin-Verfahren und im Kochsalzlösung-Verfahren. Außerdem konnte es bei passiver Hämagglutination verwendet werden, wie im folgenden in den Beispielen 3 und 4 beschrieben wird.
    • BEISPIEL 3
  • In diesem Beispiel wurden ein monoklonaler Maus-Anti-HBs-Antikörper und ein monoklonaler Anti-Maus-IgG-Antikörper als ein monoklonaler IgG-Antikörper bzw. als ein monoklolaner Anti-IgG-Antikörper verwendet
  • (1) Herstellung des monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörpers: Ein Hepatitis- B-Virus-Antigen, das durch Reinigen eines HBs-Antigen-positiven Serums mit einem Dichtegradient-Ultrazentrifugal-Trennverfahren erhalten wird, wurde in eine BALB/C-Maus eingeimpft, so daß ein monoklonaler Maus-Anti-HBs-Antikörper-Produktionsstamm in derselben Weise wie in (2) des Beispiels 1 gebildet wird. Der Stamm wurde mit 4 Mol Magnesiumchlorid durch Affinitäts- Chromatographie getrennt, bei der ein gereinigtes HBs-Antigen an Sepharose 4B (Parmacia Co.) gebunden wurde, so daß ein zu dem HBs-Antigen spezifischer monoklonaler Maus-Anti-HBs-Antikörper erhalten wird.
  • (2) Herstellung des monoklonalen Anti-Maus-IgG-Antikörpers: Ein monoklonaler Anti-Maus-IgG-Ratten-Antikörper, der einen Bovin-Albumin-Stabilisator (Immunotech Co.) enthält, wurde verwendet mit "Bluecelulophine" (Biochemical Industry Co.) und mit einer 0,1 Mol Tris-Salzsäure-Pufferlösung, pH 8,0, zum Erlangen eines Anteils, in dem das Bovin-Albumin an die Kolonne oder an einen monoklonalen Anti-Maus-IgG-Antikörper der IgG-Klasse gebunden war.
  • (3) Herstellung des Antigen-Antikörper-Komplexes: Gleiche Volumenteile des monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörpers aus (1), verdünnt mit 0,15 Mol PBS, pH 7,4, auf eine Konzentration von 10 mg/ml mit Hilfe eines 280 nm- Ultraviolett-Absorptionsverfahrens, und des monoklonalen Anti-Maus-IgG-Antikörpers aus (2), in derselben Weise auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt, wurden vermischt und reagierten 16 Stunden lang bei 4ºC zur Herstellung eines Antigen-Antikörper-Komplexes, s. Fig. 3.
  • (4) Verwendung des Antigen-Antikörper-Komplexes zum Testen von HBs- Antigen bei passiver Hämagglutination:
  • (a) Herstellung von gebundenen Zellen: Gleiche Volumenteile von mit Glutaraldehyd behandelten roten Schafs-Blutkörperchen und des Antigen-Antikörper-Komplexes aus (3) oder des monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörpers aus (1) wurden gemischt und reagierten eine Stunde lange bei 37ºC. Die Mischung wurde fünfmal in einer Zentrifuge mit PBS gewaschen und in 2%- Normal-Pferde-Serum enthaltender PBS zur Bildung einer 1%-Suspension suspendiert, die zur Herstellung eines gebundenen roten Schafs-Blutkörperchens (gebundene Zelle) verwendet wurde, s. Fig. 4.
  • (b) Verwendung als Untersuchung: Es wurde beobachtet, daß die Reaktivität des an den Antigen-Antikörper-Komplex gebundenen Reagenzes aus (4)(a) ungefähr fünfmal größer war als die des an einen herkömmlichen monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörper gebundenen Reagenzes.
  • Tabelle 5 zeigt die Versuchsergebnisse. Humanserum mit ungefähr 5 nm/ml HBs-Antigen wurde zum Erstellen von Proben auf einer V-förmigen permanenten Mikroplatte 1,5fach verdünnt. Diese Proben wurden mit Zellen getestet, die entweder an den herkömmlichen monoklonalen Anti-HBs-Antikörper oder an den erfindungsgemäßen Antigen-Antikörper-Komplex gebunden sind, s. Fig. 5. Tabelle 5 Verdünnung von HBs-Antigen-Positiv-Serum (HBs-Antigen-Gehalt in ng/ml) ¹) an monoklonale Maus-Anti-HBs-Antikörper gebundene Zellen ²) an Antigen-Antikörper-Komplex gebundene Zellen
  • Mit dem erfindungsgemäßen Antigen-Antikörper-Komplex wurde so lange Agglutination beobachtet, bis das HBs-Antigen 7,59fach (ungefähr 0,66 ng/ml) verdünnt war, wohingegen mit dem monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörper Agglutination beobachtet wurde, bis das HBS-Antigen 1,5fach (ungefähr 3,3 ng/ml) verdünnt war. Dies zeigt, daß die Reaktivität des Antigen-Antikörper-Komplexes auf das HBs-Antigen bei passiver Hämagglutination fünfmal größer ist als die des monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörpers.
    • BEISPIEL 4
  • In diesem Beispiel wurden ein monoklonaler Maus-Anti-HBs-Antikörper und ein polyklonaler Anti-Maus-IgG-Antikörper als ein monoklonaler Antikörper der IgG-Klasse bzw. als ein polyklonaler Anti-IgG-Antikörper verwendet.
  • (1) Herstellung des monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörpers: Der zum HBs- Antigen spezifische monoklonale Maus-Anti-HBs-Antikörper wurde mit demselben Verfahren wie in (1) des Beispiels (3) erhalten.
  • (2) Herstellung des polyklonalen Anti-Maus-IgG-Antikörpers: Der IgG-Anteil wurde von BALB/C-Maus-Serum mit Ammoniumsulfat getrennt, und das Maus-IgG-Fc wurde gemäß dem Verfahren gereinigt, das von R.R. Poter in Biochem., 73, Seite 119 (1959), beschrieben wird. Ein Kaninchen wurde mit diesem gereinigten IgG-Fc zusammen mit Freund-Komplett-Adjuvant immunisiert. Das aus dem Blut gewonnene Antiserum wurde zum Erhalten eines polyklonalen Anti-Maus-IgG-Antikörpers mit an Maus-IgG gebundener Sepharose 4B gereinigt.
  • (3) Herstellung des Antigen-Antikörper-Komplexes: Der in (1) erhaltene monoklonale Maus-Anti-HBs-Antikörper wurde mit 0,15 Mol PBS, pH 7,4, auf eine Konzentration von 10 mg/ml verdünnt, und der in (2) erhaltene polyklonale Anti-Maus-IgG-Antikörper wurde in derselben Weise auf eine Konzentration von 10 mg/ml eingestellt. Gleiche Volumenteile dieser Lösungen wurden vermischt und reagierten für 16 Stunden bei 4ºC zum Herstellen eines Antigen-Antikörper-Komplexes, s. Fig. 3.
  • (4) Verwendung des Antigen-Antikörper-Komplexes als HBs-Antigen-Untersuchung bei passiver Hämagglutination:
  • (a) Herstellung von gebundenen Zellen: Gleiche Volumenteile des Antigen- Antikörper-Komplexes aus (3) oder des monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörpers aus (1) wurden den mit Glutaraldehyd behandelten roten Schafs- Blutkörperchen zugefügt und reagierten eine Stunde lang bei 37ºC in Tannin. Die Mischung wurde fünfmal mit PBS in einer Zentrifuge gewaschen und in 2%-Normal-Pferde-Serum enthaltender PBS suspendiert zur Bildung einer 1%-Suspension aus gebundenen roten Schafs-Blutkörperchen (gebundene Zellen), vgl. Fig. 4.
  • (b) Seine Verwendung als Untersuchung: Es wurde beobachtet, daß die Reaktivität des an den Antigen-Antikörper-Komplex gebundenen Reagenzes aus (4) (a) ungefähr dreimal größer war als die des an herkömmlichen monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörper gebundenen Reagenzes.
  • Tabelle 6 zeigt die Versuchsergebnisse. Humanserum mit ungefähr 5 ng/ml HBs-Antigen wurde 1,5fach verdünnt, wobei V-förmige permanente Mikroplatten zur Erstellung von Proben verwendet wurden. Versuche wurden durchgeführt durch Verwendung von Zellen, die an den herkömmlichen monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörper und an den erfindungsgemäßen Antigen-Antikörper-Komplex gebunden waren, s. Fig. 5.
  • Mit dem Antigen-Antikörper-Komplex wurde Agglutination so lange beobachtet, bis das HBS-Antigen 5,06fach (ungefähr 0,99 ng/ml) verdünnt war, wohingegen mit dem monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörper Agglutination beobachtet wurde, bis das HBs-Antigen 1,50fach (ungefähr 3,3 ng/ml) verdünnt war. Dies zeigt, daß die Reaktivität des erfindungsgemäßen Antigen- Antikörper-Komplexes auf das HBs-Antigen bei passiver Hämagglutination ungefähr dreimal höher war als die des monoklonalen Maus-Anti-HBs-Antikörpers. Tabelle 6 Verdünnung von HBs-Antigen-Positiv-Serum (HBs-Antigen-Gehalt in ng/ml) ¹) an monoklonale Maus-Anti-HBs-Antikörper gebundene Zellen ²) an Antigen-Antikörper-Komplex gebundene Zellen
  • Dieser Antigen-Antikörper-Komplex ist verwendbar zur Latex-Agglutination sowie zu der obigen Blutkörperchen-Agglutination und der passiven Hämagglutination.
  • Das herkömmliche monoklonale Antikörper-Reagenz verursachte Agglutination nur bei einigen Blutgruppen-Bestimmungsverfahren und ist unpraktisch. Im Gegensatz dazu ist der erfindungsgemäße Antigen-Antikörper-Komplex brauchbar als Mittel zur Bestimmung der Rh-Blutgruppe bei allen auf Agglutination beruhenden Blutgruppen-Bestimmungsverfahren. Außerdem benötigt dieser Komplex kein Humanserum als polyklonaler Anti-D-Antikörper, so daß die Stoffe leicht beschafft werden können. Die an den Antigen-Antikörper- Komplex gebundenen roten Schafs-Blutkörperchen zeigen starke Agglutination bei einem Virus, wie z. B. einem HBs-Antigen, und haben eine Reaktivität, die ungefähr drei- bis fünfmal höher ist als die der an herkömmliche monoklonale Maus-Anti-HBs-Antikörper gebundene rote Schafs-Blutkörperchen.

Claims (3)

1. Verfahren zur Verwendung eines Antigen-Antikörper-Komplexes, in dem zwei Moleküle eines einzelnen Antikörpers der IgG-Klasse in Agglutination verbunden sind mit einem oder zwei Molekülen eines monoklonalen oder polyklonalen Anti-IgG-Antikörpers, der spezifisch ist in bezug auf den monoklonalen Antikörper der IgG-Klasse.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Agglutination verwendet wird für die Blutgruppenbestimmung.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Agglutination verwendet wird für die Entdeckung von Viren.
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