DE3109252A1 - Verfahren und zusammensetzung zur bestimmung einzelner leukozyten durch metachromatische farbstoffdifferentialabsorption - Google Patents
Verfahren und zusammensetzung zur bestimmung einzelner leukozyten durch metachromatische farbstoffdifferentialabsorptionInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine Verbesserung auf zytologischem
Gebiet und bezieht sich insbesondere auf ein mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse,
bei dem unter Einstrahlung eines normalen weißen Lichts auf ein mikroskopisches Feld eine optische Differenzierung,
Identifizierung, Vergleiche und eine Aufzählung jeder von fünf weißen Blutzellen ermöglicht wird, indem
ein einziger reiner Farbstoff ohne Fixiermittel verwenden wird, und das genauer und schneller ist als das
bisher manuell oder mittels eines Leukozytendifferentialzählers automatisch durchgeführte Verfahren.
Ehrlich machte biologische Elemente bei der mikroskopischen Überprüfung und photographischen Beobachtung
15 durch Anfärben mit Farbstoffen (Anilin-Farbstoffe)
leichter und einfacher erkennbar, um bestimmte weiße Blutzellen zu identifizieren. Ehrlich war der erste, der
feststellte, daß einige Farbstoffe metachromatisch sind, wobei er beobachtete, daß das Anfärben der Zelle dazu
führt, daß die Zelle eine Farbe annimmt, die anders ist als die Farbe des Farbstoffs oder die Farbe, die aufgrund
des Farbstoffs zu erwarten ist. Beispielsweise wurde bei Basophilen festgestellt, daß sie eine andere Farbe
als die des Farbstoffs annehmen. Über andere histologische Proben als Blutzellen wird gleichfalls berichtet, daß
sie in einer Vielzahl identifizierbarer unterschiedlicher Farben mit Farbstoff anfärbbar sind.
Ein Überblick des Standes der Technik zeigt, daß es eine fast weltweite Praxis ist, vor dem Anfärben (bei
dem im allgemeinen ein Gemisch aus einer Vielzahl chemisch unterschiedlicher Farbstoffe verwendet wird) ein Fixierverfahren
durchzuführen, das eine Behandlung bis zu einer
halben Stunde erfordern kann, bevor die biologische Probe dem Farbstoff ausgesetzt wird. Fixiermittel sind
im allgemeinen Konservierungsmittel und Denaturierungsmittel, die die Empfindlichkeit der Farbstoffabsorption
häufig beeinträchtigen. Beispielsweise enthalten Fixiermittel Formaldehyd sowohl als Flüssigkeit wie als Dampf,
absolute Alkohole (Methyl), Picroformal usw. Sehr häufig werden lebende Zellen nicht angefärbt, wenn vitalfarbstoffe
verwendet werden, wobei sich Fixiermittel als wesentlieh erwiesen haben, um Proben anzufärben. In der Zy tochemie
gibt es eine umfangreiche Literatur über Verfahren, die entwickelt wurden, um ein reproduzierbares Anfärben
von Blutzellen zu ermöglichen. Viele wesentliche Zusätze
sind normalerweise nicht stabil und zersetzen sich schnell, so daß die Zellen-Identifizierung schwierig und manchmal
unzuverlässig wird. Dr. Thomas E. Necheles hat in Bezug auf Leukozytenanalyse festgestellt, daß dieses "System
sich in 50 Jahren wenig oder gar nicht geändert hat".
Das Anfärben mit Farbstoff stellt jedoch ein Mittel zur Unterscheidung sonst nicht unterscheidbarer Details durch
Übertragung einer Farbreaktion auf die Zellen und deren anfärbbare Teile dar, und zwar metabolisch, funktionell
oder pathologisch.
In den Krankenhäusern in den USA begann die Leukozytenzählung in den frühen 1900er Jahren, wobei die Zählung
als Anhaltspunkt dafür dient, ob beispielsweise eine Notoperation notwendig ist oder nicht. Allein in den USA
werden täglich mehr als eine halbe Million Differentialzählungen durchgeführt, die meisten nach manuellen Verfahren.
Es ist wichtig, daß die Gesamtzählung der weißen Zellen und die Differentialzellenzählung ohne Verzögerungen
durchgeführt und mitgeteilt werden. Die Zeit ist
essentiell und die erforderliche Analyse schneller zu haben, ist ein Bedürfnis und ein Wunsch.
Durch den Wert der Leukozytenzählung, die sich etabliert hatte, entwickelte sich das Bedürfnis nach einer schnellen
Blutanalyse derart, daß die etwa zu Beginn der 1950er Jahre durch Arbeiten von Mellors und Papaincolaou (1952) %
eingeleitete Entwicklung automatischer Differentialleuko- Γ" zytenzähleinrichtungen 1980 zu einer Vielzahl von Geräten
führte. Die "CYDAK"-Anlage wurde frühzeitig dazu benutzt,
um die Ausführbarkeit der Blutzellenklassifizierung zu untersuchen, die die Bedeutung von spezialisierten Anfärbeverfahren
aufzeigte, wobei die Merkmale der optischen Densitäts-Hystogramme, jedes Zellenbildes entnommen wurden.
Durch das Verfahren wurde festgestellt, daß die Zellen in vier oder fünf Klassen von Leukozyten differenziert
werden können, nämlich Neutrophile, Eosinophile, Lymphozyten und MDnozyten. Young veröffentlichte Ergebnisse
(1969) über eine automatische Klassifizierung von fünf * Klassen von Zellen und Bacus dehnte die Differenzierung
1971 aus.
Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die automatischen Differentialsysteme gegenwärtig auf einem Vielfarbstoffeinsatz
beruhen, sowie auf Farbstoff-Abbausystemen oder indirektei Fluoreszenzmaßnahmen unter Verwendung von fluoreszierenden
Farbstoffen. Die letzteren werden von Kleinemann in den ÜS-PS 3 916 205 und 4 146 604 beschrieben, die hier
miteinbezogen werden und den gegenwärtigen Stand der Technik bei einigen Maßnahmen zeigen. Wie festzustellen ist,
werden auch hier wieder Fixiermittel als Standardpraxis bei dem Verfahren des Patentinhabers verwendet.
Bei dem Anfärben von Blut nach dem Stand der Technik ist festgestellt worden, daß es die Praxis ist, einen
oder mehrere Farbstoffe in Kombination zu verwenden (Romanowski, Giemsa und Wright-Anfärbungen). Bei diesen
Methoden ist es in der Praxis schwierig, eine Qualitätskontrolle vorzusehen. Diese Methoden erfordern eine
Standardisierung bei der Herstellung jedes Farbstoffbestandteile sowie bei dem Verfahren der Probeanfärbung.
Bei der Entwicklung von erfolgreichen automatischen
<- 10 Leukozytenzählern ist die Reproduzierbarkeit der Anfärbung
sogar noch wichtiger für eine kontrollierbare Analyse.
Es wird berichtet, daß das "LARC"-Anfärbemittel (das
in den kommerziellen automatischen Differentialleukozytenzählern verwendet wird), ein Gemisch von etwa 10 Thiazinfarbstoffen,
Eosin Y und 2,4,5 Tribromfluorescein
ist (Mogler 1973) (P. N. Marshall). Die gegenwärtigen Anfärbemittel liegen häufig in einer alkoholischen Lösung
mit einem Fixiermittel vor, wobei zwei oder mehr Farbstoffe in Kombination zum Einsatz kommen. Eine genaue
Analyse durch Vitalblutanfärbung ist sehr schwierig. Durch die Schwierigkeit, die sich durch eine kontrollierte
Oxidation von Methylen-Blau ergeben, was bei den Romanowski-Farbstoffen beispielsweise wesentlich ist, werden die Schwierigkeiten
einer Qualitätskontrolle von zehn einzelnen unterschiedlichen zugegebenen Farbstoffen, die in Kombination
benutzt werden, sehr groß.
Es ist festgestellt worden, daß die weit verbreitete Standardisierung
und die Verwendung einer beschränkten Anzahl von Farbstoffen eine größere Genauigkeit und Reproduzierbarkeit
bei zytologischen Studien sicherstellen würde. Wenn Fixiermittel verwendet werden, ist eine ernsthafte
Beeinträchtigung durch Artifakte beobachtet worden, was Schwierigkeiten bei der Interpretation und Mißinterpretationen
bei der Leukozytendifferenzierung und -aufzählung verursacht. pH-Einstellungen und Schwermetallkationen
sollen zytochemische Versuche daran hindern, in der erwarteten
Weise zu arbeiten. Es wurde festgestellt, daß einige Farbstoffe, insbesondere Azofarbstoffe eine nicht
spezifische Ausfällung um die Zellen zeigen. Andere degenerative Veränderungen der fixierten Blutprobe sind Vacuole,
Kleeblattbildung der Kerne, Verzerrung der Zellenform sowie Verschmierung und Störung eines idealen Anfärbens.
Die Bedeutung der Durchführung von Differentialzählungen an fast lebenden Zellen in der kürzestmöglichen Zeit,
um optimal brauchbare und verwertbare Blutzellenanalysen zu erhalten, ist erkannt worden. Alkoholische Farbstofflösungen
beeinträchtigen das supravitale Anfärben. Soweit bekannt, zeigen frisch zubereitete wasserlösliche Anfärbemittel
den geringsten denaturierenden Effekt auf das supravitale Blut bei der Untersuchung. Alle Farbstoffe sind
für die Blutzellen mehr oder weniger toxisch, jedoch sind es einige mehr als andere. Es ist wesentlich, daß die
Zellen bei der Untersuchung so lang wie möglich am Leben bleiben. Die Schnelligkeit des Anfärbens verkürzt offenbar
die Aussetzungszeit, so daß die Möglichkeit größer ist, die Leukozytenzellen zu untersuchen, bevor sie ihre Vitalität
verloren haben. Es besteht ein Bedürfnis nach einer automatischen Differentialleukozytenzählung innerhalb
weniger Minuten.
Studien und ein Überblick des Standes der Technik hinsichtlich der Durchführung von mikroskopischen Blutanalysen
und Krankheitsdiagnosen haben gezeigt, daß es für den Pathologen nicht unüblich ist, den Farbstoff und die Blut-
probe auf Körpertemperatur (etwa 37° C) vor dem Kontakt zu erwärmen. Dr. Sabin hatte eine "Wärmebox", um eine Temperaturkontrolle
sicherzustellen.
Es ist auch festgestellt worden, daß einige nach dem Stand der Technik verwendete Farbstoffe sehr temperaturempfindlich
sind. In der Literatur wird berichtet, daß Cresylecht-Violett kein brauchbares Anfärbemittel oberhalb 30° C ist
und das häufiger benutzte Neutralrot nicht oberhalb etwa 32° C anfärbt. Es wird für den Zweck der hier beschriebenen
Methode als wesentlich angesehen, daß der Farbstoff in der Lage ist, Leukozyten bei einer Temperatur von 37° C
anzufärben, und es konnten keine Schwierigkeiten bei den ausgewählten Farbstoffen bei Temperaturen bis etwa 40° C
15 beobachtet werden.
Es hat sich herausgestellt, daß diese Erfindung auf basische kationische Farbstoffe beschränkt ist, welche eine Klasse
darstellen, die eine relativ kleine Zahl umfaßt im Vergleich zu all den vielen Klassifikationen bekannter Farbstoffe.
Der "Colour Index" für 1956 bis 1963 führt etwa 3000 synthetische organische Farbstoffe auf. Von diesen
sind lediglich 190 kationisch. Aus der relativ großen Katalogliste erhältlicher basischer kationischer Farbstoffe
wurden 61 angegebene Arten erfindungsgemäß getestet. Von der gesamten Anzahl, die getestet wurde, haben sich drei
für den Zweck und innerhalb des Bereichs dieser Erfindung als geeignet erwiesen. Bei einer anderen Übersicht über
18 basische quaternäre Farbstoffe in einer veröffentlichten Farbstoffangebotsliste hat sich lediglich einer als geeignet
erwiesen, eine Art der Leukozyten metachromatisch anzufärben.
Soweit bekannt, gehört es nicht zum Stand der Technik,
daß basische kationische quaternäre Farbstoffe in der Lage sind, selektiv Leukozytenarten anzufärben, ractachromatisch
wirksam zu sein, und zwar bei Temperaturen zwischen 37° C und 4O° C. Nach dem Stand der Technik
werden keine spezifischen Farbstoffe beschrieben, die dazu verwendet werden, Monozyten sofort von anderen Leukozytenarten
zu unterscheiden. Zum Stand der Technik gehört kein einfaches Verfahren zur Identifikation und zur Zählung
von Lymphozyten.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Fortschritt auf zytologischem Gebiet dar, indem sie eine Reihe von weniger
als einem Dutzend basischer quaternärer kationischer organischer Farbstoffe bereitstellt, die selektiv durch ein
oder mehrere peripherale Blutzellenleukozyten absorbiert werden, wodurch eine ungewöhnliche Verbesserung der Identifikation
und Differenzierung zwischen Teilen von Arten weißer Blutzellen erreicht wird. Die peripheralen Blutzellenleukozytenarten
umfassen: polymorphonukleare Leukozyten oder Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Lymphozyten und
Monozyten. Bisher mußten zytochemische Maßnahmen und komplexe Färbemittel zur Differenzierung verwendet werden,
wobei häufig eine Stunde und mehr an mühsamen Präparationen erforderlich war, um eine einzige Art zu präparieren und
25 mikroskopisch zu analysieren.
Durch die Erfindung ist es nunmehr möglich, differenziert
anzufärben und mit einem einzigen reinen Farbstoff in einem einfachen wässrigen Kontakt eine peripherale
venösen Blutprobe ohne Fixiermittel bei Körpertemperatur zu identifizieren oder eine leukozytenangereicherte Probe
davon, und zwar jede der fünf Arten der weißen Blutzellen, wie angegeben. Diese Identifizierung erfolgt sehr schnell,
I. \J
und zwar ohne sorgfältige zystochemische oder schwierige
Präparation.
Durch Absorption oder Nicht-Absorption des Farbstoffes
in einigen Fällen wird jede der Leukozytenarten differenziert, indem ein Bild reflektiert wird, das spektral
identifizierbare unterschiedliche Farben aufweist, wobei andere Farben innerhalb des normalen Lichtspektrums absorbiert
werden, das hauptsächlich den sichtbaren Lichtbereich IQ einschließt, jedoch Infrarot- und Ultraviolettbereiche
nicht ausschließt, welche bei einer automatischen Einrichtung Bedeutung haben, die nicht auf das Ansprechen des menschlichen
Auges beschränkt ist.
Dadurch kann jede einzelne Art von ihren Nachbarn differenziert werden, wobei jede Art gezählt wird, die Gesamtleukozytenzählung
festgestellt wird, jede Art hinsichtlich ihrer Morphologie untersucht werden kann und viele
Bestimmungen gemacht werden können, die von großem medizini-
2o sehen Wert sind.
Grundsätzlich absorbiert jeder der vorstehend genannten Leukozyte differentiell Licht von dem gleichen reinen
Farbstoff, in Abhängigkeit von der Qualität des Farbstoffs und der Art der angefärbten Leukozyten.
Wenn keine Fixiermittel vorhanden sind, wird ein basischer Farbstoff metachromatisch absorbiert, so daß jede Klasse,
Art und Gattung der Leukozyten ein charakteristisches Lichtspektrum oder Farbe reflektiert, die sich von jeder
anderen Klasse, Art und Gattung von Leukozyten, die in der Probe vorhanden sind, unterscheidet. Die Metachromosie
der acht erfindungsgemäßen Grundfarbstoffe dürfte einzig-
.310 9Z5
artig sein. Die ersten vier Farbstoffe, die in Tabelle I angegeben sind, färben jede Klasse, Art und Gattung von
Leukozyten, so daß sie eine identifizierbare unterschiedliche Spektralfarbe reflektieren- Diese Farbstoffe machen
jeder für sich die Durchführung der Erfindung möglich. Die zweiten vier Farbstoffe, die in Tabelle I angegeben
sind, färben metachromatisch, jede Klasse, Typ oder Gattung von Leukozyten, ausgenommen Lymphozyten. Jede Art
absorbiert den metachromatischen Farbstoff, so daß ein unterscheidbares Lichtspektrum oder Farbe im sichtbaren
Lichtbereich reflektiert wird. Kombinationen der erfindungsgemäßen
Farbstoffe können für einige Leukozytenanalysen geeignet sein.
Das primäre Bezugssystem zur Identifizierung dieser neuen Klasse von Farbstoffen sind deren Spektralkurven.
Jeder Farbstoff wird durch einen Standardnamen identifiziert, soweit der Name bekannt ist, und mit einem Namen
versehen, soweit derselbe nicht bekannt ist. Ein sekundäres Bezugssystem zur Identifizierung ist eine Standard-"Colour
Index"-Zahl oder eine "Michrome"-Zahl, sofern dieselbe bekannt ist. In den nachstehenden Beispielen und .der Beschreibung
werden manchmal chemische Strukturformeln angegeben, soweit dieselben bekannt sind, um die geeigneten
Farbstoffe dieser Erfindung zu identifizieren.
In lediglich einem Fall ist der geeignete Farbstoff von solcher obskurer Natur, daß es sich als unmöglich herausgestellt
hat, seine Geschichte, Chemie oder Verwendung zu erhellen. Dieser obskure Farbstoff ist als Greifswalder
Blau bekannt. In einem zweiten Fall zeigte ein obskurer Literaturhinweis, der nach einer umfangreichen Recherche
gefunden wurde, daß der Farbstoff,der dort als Borreis
Blau (Borreis1 blue oder blue borrel) bezeichnet wurde,
sich direkt vom Methylenblau ableitet. Das Verfahren ist nachstehend angegeben. Aufgrund der Information über die
Herstellung und die Struktur von Methylenblau hat sich herausgestellt, daß die wahrscheinliche Farbstruktur
nach der allgemeinen chemischen Klassendefinition Borrel-Blau umfaßt.
Die hier benutzen Klassifikationsangaben zur Identifizierung der einzigartigen Farbstoffe, die für den hier
angegebenen Zweck geeignet sind, nämlich basische quaternäre metachromatische kationische organische Farbstoffe, umfassen
alle bekannten reinen Farbstoffe, die in den Tabellen I, Il und III angegeben sind und sich für den erfindungsgemäßen
Zweck als geeignet erwiesen haben. Die bekannten Farbstoffzusammensetzungen
sind alle strukturell : verwandt und liegen im Rahmen der vorstehenden Klassifikationsangaben.
Die drei Farbstoffe in Tabelle II sind metachromatisch in einem eingeschränkten Sinn nach Ehrlich, jedoch sind
sie ebenfalls sehr unüblich, indem sie lediglich für Monozyten spezifisch sind. Lediglich Monozyten werden bei wässrigem
Kontakt mit diesen Farbstoffen angefärbt. Ihre Verwendung ist ebenfalls in Verbindung mit den Farbstoffen
25 der Tabelle I möglich.
Die Definition "supravital", wie sie vorliegend verwendet wird, stellt eine wichtige Einschränkung dar. Sie wird
für die Originalblutprobe verwendet, sowie für lebende Zellen, die von einem lebenden Organismus frisch entnommen
worden sind, oder von einem frisch Getöteten oder dergleichen. So wie die Bezeichnung hier verwendet wird,
sollen alle Fixiermittel ausgeschlossen werden, jedoch
soll der Einsatz von Antikoagulantien (Heparin, E.D.T.A.
und dergleichen) möglich sein. Die Blutzellen können vom Knochenmark, Urin oder anderen biologischen Proben, die
sie enthalten, entnommen sein.
5
5
In allen Fällen sollen die mikroskopischen Beobachtungen die Einstrahlung von weißem Licht einschließen, das in
der klinischen Mikroskopie der Standard ist. Eine automatische Differentialleukozytenzählung ist gegenwärtig
durch Einstrahlung von normalem weißen Licht möglich, jedoch ist, soweit bekannt, kein gegenwärtig im Handel befindliches
Gerät bekannt, das hier direkt nutzbar wäre. Das erfindungsgemäße Verfahren ist durchführbar und beseitigtviele Probleme,
die eine erfolgreiche Entwicklung von computerbezogenen automatischen Differentialleukozytenzähleinrichtungen
gehemmt haben.
Die einzigartigen Farbstoffe, die zu dem erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden, werden in einer gefilterten
wässrigen Lösung mit einer Konzentration des reinen Farbstoffs von etwa 1 % verwendet. Die Farbstoffkonzentration
ist jedoch nicht besonders kritisch, sondern kann variiert werden. Vorzugsweise werden die wässrigen Lösungen im
frischen Zustand eingesetzt, wobei toxische Zusätze ausgeschlossen
sein sollen. Die Interferenz der metachromatischen Reaktion zwischen Farbstoff und spezifischer Art oder
Klasse des Leukozyten kann durch den Einsatz der herkömmlichen Fixiermittel völlig verhindert werden.
Die Bezeichnung "metachromatisch" dürfte zuerst von Ehrlich benutzt worden sein, um einen Farbstoff zu beschreiben,
der seine Farbe deutlich ändert, wenn er von bestimmten Zellen absorbiert wird. Ein solcher Farbstoff zeigt Metachromosie,
welche eine Eigenschaft relativ weniger reiner Farbstoffe ist, hauptsächlich basischer Farbstoffe, die Gewebeelemente
in verschiedenen Farben anfärben. Metachromosie
setzt auch voraus, daß verschiedene Substanzen zu verschiedenen Farbspektren führen, wenn sie mit dem gleichen Farbstoff
angefärbt werden. In der Zytologie sind metachromatische
Körper jene, die eine Farbe annehmen, die anders ist als die des Farbstoffs, der zu ihrer Anfärbung benutzt
wurde.
IO
IO
Im Zusammenhang mit der vorstehenden Erörterung der Bezeichnungen "metachromatisch" und "Metachromosie" sind
zwei Faktoren zu nennen. Einer ist die biologische Zelle (und ihre spezialisierten Teile), die "metachromatisch"
oder "chromotrop" bezeichnet wird und ein Qualitätsmerkmal oder eine Eigenschaft der biologischen Zellprobe darstellt,
und der andere ist die Qualität des Farbstoffs. Sehr wenige Farbstoffe besitzen die wesentliche Eigenschaft,
eine Struktur oder Strukturen in der Zelle zu stimulieren, um Metachromosie zu zeigen. Conn (9. Auflage) berichtet
"es gibt nur eine geringe Anzahl reiner Farbstoffe, die diese Reaktion zeigen". Es konnten wenige Berichte festgestellt
werden, die andeuten, daß dieses Phänomen mehr als zwei unterschiedliche Farbspektren umfaßt. In einem Fall wurde
von "einem hellgrün-blauen Kern-Färbemittel mit einer violetten Metachromosie für Knorpel" berichtet. Bei Farbstoffen,
die normalerweise bei fixierten Geweben angewendet werden, deren chemische und physikalische Natur sich durch das übliche
Präparationsverfahren vor dem Anfärben ändert, also die wesentliche Wechselwirkung zwischen dem Charakter der
natürlichen biologischen Strukturen innerhalb einer Zellprobe (kann sich hierdurch ändern und unempfindlich werden
gegenüber etwas, was sonst reagiert), so daß eine Färb-
stoffabsorption nicht erfolgt.
Der Umstand, daß lediglich wenige Farbstoffe "metachromatisch" sind und gegenüber verschiedenen Teilen der Zelle
sich metachromatisch verhalten, verdeutlicht den Zufall bei der Auffindung der hier beschriebenen überraschend
wirksamen Wechselwirkung zwischen Leukozyten und den Farbstoffen dieser Erfindung.
' 10 Die große Klasse basischer Farbstoffe, die die metachromatischen
Farbstoffe dieser Erfindung einschließt, umfaßt jene, bei denen die auxochrome Gruppe eine primäre, sekundäre
oder tertiäre Amingruppe ist. Einem Stickstoff kommt wenigstens die Funktion eines quaternären Stickstoffatoms zu,
wobei bei Zugabe eines farblosen Anions, am häufigsten einer Halogensäure, sich ein Salz bilden kann. Da die
Halogensäuren relativ stark sind, verglichen mit der Immoniumbase, reagieren sie meistens schwach sauer oder zeigen
einen sauren pH. Die organische chromophore Gruppe ist ein Kation, das eine positive Ladung trägt, wobei das Halogenion
ein Anion oder eine negative Ladung darstellt.
Die Neuheit und die Brauchbarkeit des hier beschriebenen Verfahrens beruht auf mehreren Konzepten. Zum ersten
Mal kann man leicht, einfach und schnell sämtliche peripheralen weißen Blutzellen oder Leukozyten in einer lebenden
Zellprobe anfärben, wobei im wesentlichen nur ein einziger reiner Farbstoff verwendet wird. Beispielsweise ermöglicht
eine Methode die Identifizierung, Differenzierung und das Studium ausschließlich von Lymphozyten, indem ein Farbstoff
verwendet wird, nämlich Borrel-Blau, bei einer Temperatur
von etwa 21-25° C. Der gleiche Farbstoff führt, wenn er bei normaler Bluttemperatur (37° C) benutzt wird, zu
Differentialanfärbungen und identifiziert jede Art von
Leukozyten durch eine unterschiedliche reflektierte Spektralfarbe.
Monozyten, die bisher mittels komplexer zytochemischer
Verfahren identifiziert wurden, die eine mühsame Stunde sorgfältiger Zytochemie erforderten, können mit einem ausgewählten
einzigen reinen Farbstoff der Erfindung sofort identifiziert und zu diagnostischen Zwecken studiert werden.
v 10
Die allgemeine Durchführung der Erfindung wird nachstehend erläutert:
Eine l%ige Lösung in destilliertem Wasser ist aus einem ausgewählten
basischen quaternären kationischen Farbstoff hergestellt worden. Wenn es sich in der Praxis als erforderlich
erweisen sollte, können einer oder mehrere der betreffenden Farbstoffe miteinander als Lösungen vermischt werden.
Wenn ausschließlich Monozyten von Bedeutung sind, wird ein basischer quaternärer kationischer Farbstoff verwendet,
der aus einer Klasse ausgewählt wird, die aus Carbocyanin K-5 und den Methin- und Polymethinfarbstoffen besteht, die
aus einer Klasse ausgewählt werden, die aus Basisch Rot (Spektralkurve 9) und Basisch Violett 16 (Spektralkurve 8)
besteht.
Wenn andererseits die spezifischen Leukozyten von Interesse Lymphozyten sind, dann ist ausschließlich für die Lymphozytenuntersuchung
Borrel-Blau bei einer eingestellten Temperatur zwischen 2O und 25° C spezifisch, wobei die
Aufrechterhaltung der Temperatur des Farbstoffs und der Temperatur der supravitalen Blutprobe unterhalb Bluttemperatur
völlig überraschend dazu führt, daß ausschließlich
Lymphozyten selektiv angefärbt werden. Es hat sich herausgestellt,
daß dieser Farbstoff keine anderen Leukozyten als Lymphozyten in diesem niedrigen Temperaturbereich anfärbt.
Bei einer geringen Zunahme der Bluttemperatur oder der Körpertemperatur (37 - 4O° C) ermöglicht Borrel-Blau
jedoch, wenn es als einzelner reiner Farbstoff vorliegt, eine spektrale Definition und Differenzierung sämtlicher
fünf Leukozyten.
Für den weiteren Einsatz wird eine frische Probe intakten Blutes (ohne Fixiermittel) hergestellt, die mit bekannten
Mitteln, beispielsweise Heparin, E.D.T.A oder Citrat antikoaguliert
worden ist, von der die Erytrozyten durch Zentrifugieren, hypotone Lyse, Dichtegradientensedimentation
oder ein anderes ähnliches · Verfahren entfernt worden sind, oder eine Plasmaprobe, die mit Leukozyten (oder weißen Blutzellen)
nach einer von mehreren physiko-chemisehen Verfahren, wie sie vorstehend genannt sind, angereichert worden ist.
Die wässrige Lösung des ausgewählten einzigen reinen Farbstoffs oder der Kombination eines oder mehrerer reiner Farbstoffe,
wie in Tabelle I und II angegeben (wie in Tabelle III erläutert), wird vermischt, um eine einfache wässrige Farbstoff
lösung zu bilden.(Die Beachtung der verschiedenen volumetrischen Verhältnisse der wässrigen Farbstofflösung
und der verschiedenen Stärken der wässrigen Farbstofflösungen kann zu optimalen Bedingungen bei den verschiedenen spezifischen
zytologischen Analysen führen). Einige Versuche können zu spezifischen Kombinationen führen, die besondere Vorteile
aufweisen und in Erwägung zu ziehen sind, jedoch außerhalb des Rahmens dieser Beschreibung.
Die Blutproben können von den unterschiedlichsten Quellen
stammen, jedoch werden frische Proben venösen Blutes bevorzugt, aus dem dieErythrozyten entfernt worden sind (Zentrifugieren,
hypotone Lyse, Sedimentation durch Schwerkraft, Dichtegradientsedimentation usw.), oder die Probe
kann ein Plasma sein, das mit weißen Blutzellen durch physiko-chemische Verfahren angereichert worden ist, zu
denen auch die vorstehend Erwähnten gehören.
Es wird vorgezogen, den wässrigen Farbstoff und die Blut-
-w 10 probe zu vereinigen, wobei beide frisch hergestellt worden
sind, und zwar bei normaler Temperatur des Blutes oder Körpers (etwa 36 - 40° C), sofern die geplanten Analysen
dies anzeigen. Bei einer höheren Temperatur wird im allgemeinen ein schärferes Anfärben erhalten.
Die Farbstoff- und die Blut-Lösungen verhalten sich gut, wenn sie in einem Volumenverhältnis von etwa 1:4 vereinigt
werden. Das Gemisch wird einige Sekunden leicht gerührt und es wird ein Tropfen des Gemische sofort als nasse Aufbringung
unter Verwendung eines Glasdeckstreifens unter
einem Lichtmikroskop oder mittels eines automatischen Differentialleukozytenzählgeräts,
sofern verfügbar, untersucht. ~ Andere Mittel für den Kontakt zwischen dem Farbstoff und
den Blutzellen umfassen bekannte Medien, beispielsweise Gelatin, Emulsionen usw., die mit dem Farbstoff mit einer
Farbstoffkonzentration von etwa 1 % imprägniert sind. Es
ist allerdings sehr wichtig, die Blutprobe nicht zu fixieren, wie es meistens geschieht. Eine Fixierung der Probe führt
zu einer ernsthaften Beeinträchtigung des ungewöhnlichen metachromatischen Verhaltens der Farbstoffe der Erfindung.
Jede der Leukozyten oder weißen Blutzellen kann identifiziert und von einer anderen Art, Klasse oder Gattung durch
die absorbierte Differentialspektralfarbe oder die unterschiedliche
Spektralreflektion von jeder der charakteristisch angefärbten Arten unterschieden werden. Die nachstehenden
Beispiele erläutern dem Fachmann den Umfang des vorgeschlagenen neuen Verfahrens. Die Vorteile des Verfahrens
sind nicht zuletzt die Leukozytenzählung (insgesamt), die Leukozytenzählung der Arten, Krankheitsdiagnosen, insbesondere
von Leukämie, sowie die Überwachung von Patienten, die einer Reihe kritischer Behandlungemanterzogen werden,
beispielsweise einer Chemotherapie, einer Bestrahlungsthearpie, ACTH usw.
Es ist bekannt, daß die Identifizierung und die Aufzählung sämtlicher Leukozytenarten von wesentlicher Bedeutung bei
der Diagnose und der Behandlung vieler Krankheiten ist.
Die nachstehenden Beispiele sollen die Brauchbarkeit der Erfindung
und deren Ausführung verdeutlichen. Sie sind freilich nicht erschöpfend oder einschränkend zu verstehen.
Durch die Erfindung wird eine einzige einzigartige reine
Farbstoffzusammensetzung sowie ein Verfahren zur Unterscheidung jeder Art, Gattung und Klasse einer Serie von im Blut
vorliegenden Leukozyten von einer anderen bereitgestellt, einschließlich Polymorphonuklearleukozyten (ausgereifte
und noch nicht ausgereifte Neutrophile), Eosinophile, Basophile, Lymphozyten und Monozyten, und zwar durch mikroskopische
Untersuchung einer einzigen Probe einer supravitalen Blutprobe, wobei die Einstrahlung des üblichen weißen Lichtes
die Differenzierung ,Identifizierung, den Vergleich, die
Diagnose und die Aufzählung jeder der vorstehend genannten Leukozytenarten ermöglicht.
Wenigstens eine supravitale Blutprobe wird in einem Zustand ohne Fixiermittel in innige Berührung in wässriger
Lösung mit wenigstens einem wässrigen basischen quaternären kationischen organischen Farbstoff gebracht, der in der
Lage ist, wenigstens vier der fünf vorstehend genannten Leukozytenarten metachromatisch bei normaler Körpertemperatur
(Temperatur des normalen Blutes - etwa 37° C) anzufärben.
._. 10 Obwohl es sehr ungewöhnlich und sehr praktisch ist, daß man
nur einen der vorstehend genannten reinen Farbstoffe bei einer bestimmten Leukozytenanalyse verwendet, ist es nicht
wesentlich, daß lediglich ein einziger der reinen Farbstoffe der Erfindung zu dem genannten Zweck eingesetzt wird,
d. h- Kombinationen werden dadurch nicht ausgeschlossen. Aufgrund der gegenwärtigen Erfahrungen mit basischen
quaternären kationischen Farbstoffen, wird es als außergewöhnlich angesehen, von den vielen Untersuchten herausgefunden
zu haben, daß nur wenige in der Lage sind, vier oder sämtliche Leukozytenarten differentiell anzufärben.
Von den vier ersten Farbstoffen in Tabelle I färben alle
v sämtliche Leukozytenarten mit einem ausreichenden unterschiedlichen
spektralen Ansprechen im Bereich des sichtbaren Lichts an, um die Identifikation, Differenzierung und Aufzählung
jeder der fünf Arten zu ermöglichen. Drei der vorstehend genannten Färbstoffarten werden durch ihre chemische
Struktur ausreichend identifiziert, um sicherzustellen, daß sie basische quaternäre kationische organische Farbstoffe
sind, die die beobachtete ungewöhnliche metaChromatisehe
Eigenschaft aufweisen, d. h. der gleiche Farbstoff färbt jede der Leukozyten mit einer individuell unterschiedlichen
Spektralfarbe an.
Aus Tabelle I geht auch hervor, daß es vier weitere Farbstoffe gibt, die in den vorstehend gezogenen Rahmen der
gleichen Klasse fallen. Diese vier Farbstoffe sind jedoch nicht in der Lage, Lymphozyten anzufärben. Der Einsatz
eines dieser reinen Farbstoffe in Verbindung mit Borrel-Blau bei etwa 21 - 40° C führt jedoch ebenfalls zu einer
vollständigen Differentialanfärbung sämtlicher Leukozyten, wie es bei den ersten vier Farbstoffen in Tabelle I der
Fall ist.
Borrel-Blau in Tabelle I ist überaus außergewöhnlich in
seiner Eigenschaft, ausschließlich Lymphozyten bei niederer Temperatur (beispielsweise 21 - 25° C) anzufärben. Dadurch
werden Einzeluntersuchungen der Arten der weißen Blutzellen ohne weitere Beeinträchtigung möglich. Wenn jedoch bei
normaler Bluttemperatur mit der Probe und dem Farbstoff gearbeitet wird, können sämtliche Arten gleichzeitig untersucht
werden, wenn eine Blutprobe sowie Borrel-Blau-Farbstoff
verwendet werden.
Der erste Farbstoff der Tabelle I, Greifswalder Blau, ist
im Handel erhältlich. Nach umfangreichen Nachforschungen und einigen vorläufigen chemischen und physikalischen Untersuchungen
konnte jedoch keine Literaturstelle gefunden werden,
um dessen chemische Struktur zu identifizieren. Wie es bei Farbstoffen manchmal der Fall ist, stellt die Spektralanalyse
eine positive Identifizierung dieses sehr brauchbaren Farbstoffs dar, wobei er durch seine Spektralkurve Nr. 1 wiedergegeben
wird. In Beispiel I hat sich die Dünnschichtchromato-
30 graphie ebenfalls als zuverlässig erwiesen.
Es ist weiterhin darauf hinzuweisen, daß die Farbstoffe der Erfindung, sofern ihre chemische Struktur sicher ist,
manchmal als Methin- oder Polymethinfarbstoffe bezeichnet
METACHROMATISCHER SPEKTRALKURVE, FARBSTOFF ART und HERSTELLER
POLYMORPHONU- EOSINOPHILE
KLEARE LEUKOZYTEN
(NEUTROPHILE)
KLEARE LEUKOZYTEN
(NEUTROPHILE)
BASOPHILE LYMPHOZYTEN
MONOZYTEN
1. | GREIFSWALDER BLAU 21 - 40° C |
Spektralkurve 1 keine CI Nr. (Chroma) |
GELBE Körnchen |
GRÜNE Körnchen |
BLAUE Körnchen |
BLAUGRÜNER Kern |
PURPURFAR BENER Kern |
2. | BORREL-BLAU 21 - 25° C BORREL-BLAU 37 - 40° C |
Spektralkurve 2 Michrorae 376 (Chroma) |
(nicht angefärbt) BLAUE Körnchen |
(nicht ange-. färbt) PURPURFAR BENE Körn chen |
(nicht an gefärbt) ROTE Körnchen |
BLAUGRÜNER Kern BLAUGRÜNES Zytoplasma und Kern |
(nicht angefärbt) PURPURFAR BENES Zyto plasma ROSAROTE Körnchen |
3. | RHODANIL-BLAU 21 - 40° C |
Spektralkurve 3 Mi chrome 1156 E. Merck |
MAGENTAFARBENE Körnchen ROTES Zytoplasma |
PURPURFARBENE Körnchen |
ROTE Körnchen |
BLAUGRÜNER Kern |
LILA Zytoplasma |
33. | TOLUYLEN-BLAU 21 - 40° C |
Spektralkurve 11 CI 49410 (Math. CoIe & Bell, Norwood) |
BLAUER Kern GELBE Körnchen |
PURPURFAR BENE Körnchen |
ROTE Kern |
GRÜNER Kern |
PURPURFAR BENER Kem und Zyto plasma |
4. | NACHTBLAU 21 - 40° C |
Spektralkurve 4 CI 44085 (Chroma) |
GRÜNE Körnchen | BLAUE Körnchen |
PURPURFAR BENE Körn chen |
(nicht angefärbt) |
PURPURFAR BENER Kem GRÜNES Zy toplasma |
(Portsetzung)
METACHROMATIS CHER FARBSTOFF
SPEKTRALKURVE, ART und HERSTELLER
POLYMORPHONU-KLEARE LEUKOZYTEN (NEUTROPHILE)
EOSINOPHILE
BASOPHILE LYMPHOZYTEN
MONOZYTEN
5. | PFLAUMENECHT (GALLO BLAU E) 21 - 40° C |
Spektralkurve 5 DI 51040 (Chroma) |
BRAUNE Körnchen |
GRÜNE Körnchen |
PURPURFAR BENE Körn chen |
(nicht an gefärbt) |
. PURPURFAR BENER Kern |
6·.- | HOFMANNS VIOLETT 21 - 40° C |
Spektralkurve 6 CI 42530 (Chroma) |
GRÜNE Körnchen |
PURPURFAR BENE Körn chen |
ROTE Körnchen |
(nicht an gefärbt) |
PURPURFAR BENER Kern ROTE Körn chen |
7. | BASISCH ORANGE 21 21 - 40° C |
Spektralkurve 7 CI 48035 (Bayer) |
DUNKELGELBE Körnchen (reif) ORANGEFARBENE Körnchen (unreif) |
BRAUNE Körnchen |
ROTE Körnchen |
(nicht anr gefärbt) |
ORANGEROTE zytoplas- mische Körn chen |
3T09Z52"
oder klassifiziert werden, und manchmal Carbocyaninfarbstoff
e genannt werden. Die Methin- oder Polymethin-Bezeichnung oder -Klasse dürfte in Beziehung stehen zu der Brücke
zwischen den komplexen aromatischen Ringstrukturen, die wenigstens ein quaternäres Stickstoffatom in ihren Ringstrukturen
aufweisen. Die chromophoren Gruppen sind kationisch. Diese aromatischen stickstoffhaltigen Ringstrukturen dürften
die Ursache für die "Carboncyanin"-Nomenklatur sein. In der US-PS 2 126 852 wird eine Gruppe der Methinbrücken
"-<· 10 aufweisenden, komplexen basischen quaternären kationischen
FarbstoffStrukturen der Carbocyanin-Gruppe geschildert.
Der letzte Farbstoff in Tabelle I, der als basisches Orange 21 bezeichnet wird, ist ebenfalls einzigartig, da
er es dem geübten Beobachter ermöglicht, spektral zwischen reifen und unreifen Körnchen polymorphonukearer Leukozyten
oder Neutrophile zu unterscheiden. Auch ist das deutliche spektrale Ansprechen zur Identifizierung von Monozyten von
Vorteil bei zytologischen Untersuchungen, worauf nachstehend >, 20 nochmals eingegangen werden wird.
Sämtliche organischen Farbstoffe im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in wässriger Lösung eingesetzt.
Die Konzentration kann sich je nach den besonderen Bedingungen einer bestimmten Untersuchung ändern, jedoch hat
es sich im allgemeinen als brauchbar erwiesen, frisch hergestellte gefilterte Lösungen der reinen Farbstoffe in
destilliertem Wasser mit einer Farbstoffkonzentration von etwa 1% zu verwenden.
30
Bei der Herstellung der mikroskopischen Blättchen für die visuelle oder die automatische Differentialleukozytenanalyse
ist es von Bedeutung, die präparierte Blutprobe ohne Zusatz
von Fixiermitteln zu verwenden, wobei in fast allen Fällen
es vorgezogen wird, eine Temperatur zwischen 36 und 4O° C oder Körpertemperatur bei Anfärbungsberührung zu verwenden.
Ein Überblick über die Veröffentlichungen hat gezeigt, daß Sabin und andere hervorragende Forscher auf dem Gebiet
der Blutchemie es vorziehen, in diesem Bereich zu arbeiten.
Abgesehen von dem ungewöhnlichen Verhalten von Borrel-Blau
(vgl. Beispiel 2 und Spektralkurve 2), liegt der vorteilhafteste Einsatz im allgemeinen bei etwa 37° C. Sämtliche
Farbstoffe, einschließlich Borrel-Blau führen, wenn sie bei etwa 37 C verwendet werden, zu einer schärferen, intensiveren
spektralen Differenzierung der Identifizierung der Farbspektren mit einer spektralscharfen Metachromasie.
Sämtliche Farbstoffe der Erfindung stellten sich jedoch bei Raumtemperatur von etwa 21 bis 23° C als wirksam heraus.
Wie vorstehend erwähnt, erweist sich Borrel-Blau im unteren Temperaturbereich als einzigartig. Es bewirkt dann lediglieh
eine blaugrüne Anfärbung der Lymphozyten und zeigt nicht die außergewöhnliche völlig metachromatische Qualität,
wie sie in Tabelle I dargestellt ist, in diesem kälteren Temperaturbereich.
Borrel-Blau ist damit der einzige bekannte Farbstoff unter den Farbstoffen dieser Erfindung, der ausschließlich zur
Anfärbung von Lymphozyten verwendet werden kann. Lymphozyten können ausschließlich in einer fxxiermittelfreien wässrigen
Umgebung bei beispielsweise 22° C angefärbt werden, und es sind ausschließlich Lymphozyten, die dann differentiell
mit einem charakteristischen Spektrum entwickelt und ausschließlich studiert werden können.
Wie Tabelle I zu entnehmen, ist jedoch die mit Borrel-Blau
angefärbte Blutprobe bei normaler Bluttemperatur universal, wodurch eine differentielle Anfärbung und spektrale Differenzierung
jedes der fünf Leukozytenarten möglich ist, wie es bei Greifswalder Blau, Rhodanil-Blau und Toluylen-Blau
auch der Fall ist.
Es ist jedoch zu betonen, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Fixiermittel vermieden werden. Es ist auch klar,
daß die Bezeichnung "supravital" als eine einschränkende Bezeichnung gebraucht wird, die in engem Zusammenhang steht
mit dem fixiermittelfreien Blut. Damit eine supravitale Probe vorliegt, die die Blutzellen enthält, werden die Blutzellen
dem lebenden Organismus oder einem frisch getöteten Organismus·oder dergleichen entnommen. Die Zellen sollten
während ihrer Entnahme lebende Zellen sein und während der Präparation des mikroskopischen Blättchens unter möglichst
normalen Lebensbedingungen vorliegen, sofern es möglich ist, auch hinsichtlich der Temperatur.
Ohne daß dies theoretisch erhärtet ist, ist es bekannt, daß fast alle fremden Zusätze die Tendenz besitzen, proteinhaltige
Materialien zu denaturieren. Bisher war die Verwendung von Fixiermitteln bei der Präparierung der Blutproben
zur Anfärbung die weltweite Praxis. Die Erfahrung hat gezeigt, daß das Fixieren die Wechselwirkung zwischen
der Metachromatie der Zellen und der metachromatischen Eigenschaft der Farbstoffe der Erfindung stört. Störende
Artifakte werden dadurch auf dem Gebiet ebenfalls ver-
30 mieden.
Es ist Praxis, Antikoagulantien in der frisch gezogenen Blutprobe zu verwenden, beispielsweise Heparin und E.D.T.A.
Je geringer jedoch die Beeinträchtigung der lebenden Natur der Leukozytenzellen, die nach dem Anfärben untersucht
werden sollen, ist, umso größer ist die zu erwartende Genauigkeit der Analyse.
5
5
Die Leukozytenfarbstoffe der Erfindung färben metachromatisch
und supravital in der Mehrzahl der Fälle alle fünf Arten von weißen Blutzellen an, wenn die ausgewählte Praxis diese
^. Methode bevorzugt. Das Anfärben ist hinreichend schnell,
ν IO so daß bei normaler Bluttemperatur (37° C) der Zytologe
nicht zu warten braucht oder sich auf die feinere Zytochemie zurückziehen muß, bevor die Parbentwicklung der Zellen erfolgt,
wobei die spektrale Differenzierung zwischen den fünf Mitgliedern der Familie der Leukozytenzellen durchgeführt
werden kann, bevor die mikroskopischen Untersuchungen entweder manuell oder mittels automatischer Differentialleukozytenzähleinrichtungen
beginnen.
Es können folgende Arten fixiermittelfreier Blutproben verwendet werden:
^" 1. Antikoaguliertes (E.D.T.A., Citrat, Heparin) Ge
samtblut .
2. Suspensionen von Leukozyten, die mittels Dextran und/oder Schwerkraftsedimentierung des antikoagu-
lierten Gesamtblutes erhalten worden sind.
3. Proben des Gesamtblutes, das mit einer hypotonischen Lösung behandelt worden ist, um eine Auflösung der
roten Blutzellen zu bewirken, wobei primär weiße Blutzellen und Plättchen zurückbleiben.
4. Proben anderer Körperflüssigkeiten, wie Rückenmarkflüssigkeit oder Rippenfellflüssigkeit oder Bauchwasserflüssigkeit,
sowie Proben vereinigter Flüssigkeiten, sofern die weißen Blutzellen von Interesse sind.
3Ί 09252
Obgleich die Erfindung nicht spezifisch auf eine automatische Differentialleukozytenzähleinrichtung abgestellt
ist, sind derartige Einrichtungen einer genauen Überprüfung unterzogen worden.
5
5
Das Kolleg der amerikanischen pathologischen Konferenz in Aspen, Colorado, August 1975 hat eine Reihe von Druckschriften
veröffentlicht, die zu dieser Zeit in Form einer Sammlung herausgegeben wurden, die den Titel "Differentialleukozytenzählung"
trägt. Diese Berichte geben Auskunft über die Entwicklung und den Stand der Technik auf
dem Gebiet der automatischen Differentialblutzellenzählcomputer. Auch ist auf die US-PS 3 916 205 sowie die US-PS
4 146 604 (Kleinerman) hinzuweisen, wonach bestimmte fluoreszierende Farbstoffe in bestimmten Kombinationen
zur automatischen Differenzierung bestimmter Leukozyten
und anderer Blutzellen aufgrund des Ansprechends des fluoreszierenden
Lichtes verwendet werden. Diese Literaturstellen sind hinsichtlich des Gegenstandes und der Aufgabe dieser
Lehre relevant. Es ist darauf hinzuweisen, daß Kleinenerman nicht von der bei der mikroskopischen Untersuchung
von Leukozyten üblichen Fixierung der Zellen abgeht.
Nach dem Stand der Technik werden verschiedene Grade der Diskriminierung in dem Verhalten bei der Leukozytendifferentialzählung
getroffen. Grundlegend oder primär ist die Differenzierung zwischen polymorphonuklearen Zellen und
mononuklearen Zellen. Dazwischen liegt die Differenzierung der Polymorphen in Neutrophile, Eosinophile und Basophile
sowie die Trennung der Mononuklearen in Monozyten und Lymphozyten, was im Prinzip als möglich bezeichnet wird.
Bei dem anscheinend dritten Grad der Schwierigkeit, der
die Differenzierung der Neutrophilen in Unreife und Reife betrifft sowie die Aufteilung der Lymphozyten in normale
und reaktive Typen, ist jedoch eine Kontroverse festzustellen.
5
5
Der gegenwärtige Stand der Technik bei den automatischen Differentialleukozytenzählern befindet sich deutlich in
einem Entwicklungsstadium. Manuelle Differentiale scheinen die zu sein, auf die man sich hauptsächlich verläßt. Die
automatischen Differentialzähler werden in zwei Hauptklassen
oder Gruppen eingeteilt: 1. Bilderkennungssysteme und 2. zytochemische Differenzierungssysteme. Es ist darauf
hinzuweisen, daß nach dem Stand der Technik Anfärbemethoden mit mehr oder weniger großem Erfolg angewendet wurden,
wobei die Bedienungsperson des Geräts den Betrieb Zelle für Zelle überwachen kann. Im allgemeinen werden lediglich
100 Zellendifferentialzählungen durchgeführt. Obgleich sie genau sind, müssen für die zytochemischen Systeme noch zufriedenstellende
Kalibratoren entwickelt werden, desgleichen
20 erfordern sie hochqualifizierte Bedienungspersonen.
Bei dem "LARC'-System wird eine konventionelle Lichtmikroskopie
durchgeführt. Anfragen deuten jedoch an, daß das "LARC'-System nicht länger zur Verfügung steht.
Wie vorstehend erwähnt, gehen aus den Kleinerman-Patenten Zusammensetzungen sowie ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur Differentialzähung und Klassifizierung von Leukozytenarten hervor, wodurch bestimmte Leukozyten unterschieden
werden, nämlich Eosinophile, Monozyten, Lymphozyten, reife
und nicht reife Neutrophile (jedoch sind keine Einzelheiten ober Basophile genannt), indem allen (!) Leukozyten eine
charakteristische Fluoreszenz verliehen wird.
Das durch Bestrahlung mit Fluoreszenzlicht emittierte Licht wird gemessen und die Leukozytenarten werden nach
der relativen Intensität des emittierten Lichtes in den charakteristischen Wellenlängenbereichen jedes Fluoreszenzfarbstoffes
klassifiziert. Es wird ein System beschrieben, durch das eine automatische Differentialzählung
der genannten spezifischen Leukozyten möglich ist.
Folgende Punkte sind bei dem patentierten Verfahren festzuhalten. 1. Es sind wenigstens zwei Lichtquellen wesentlich,
enschließlich violettem und ultraviolettem Licht;
2. eine dritte Lichtquelle wird offenbar auch gebraucht.
3. Das System erfordert eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen,
um die Leukozytenarten zu identifizieren und zu differenzieren. 4. Das System erfordert alkoholfixierte
Blutabstriche. 5. Die erforderliche Anfärbezeit liegt in der Größenordnung von 10 Minuten, wobei ein Abspülen von
einer Minute, das von einem Trocken gefolgt wird, erforderlich ist. 6. Es scheint eine Abnahme der Fluoreszenz zu
geben in der Reihenfolge von a) Eosinophilen zu b) Neutrophilen zu c) Monozyten zu d) Lymphozyten. (Die Identifizierung
der Basophile wird nicht beschrieben.) 7. In einem Strömungsrohrsystem werden die Blutzellen mit Formaldehyd
fixiert und mit drei verschiedenen Farbstoffen angefärbt.
8. Die festgestellten Leukozytenfluoreszenzen werden differential gezählt und mittels Fluoreszenzlichtverhältnissen
klassifiziert. 9. Das Beispiel 11 des Patentes zeigt die Identifizierung von lediglich vier der fünf Leukozytenarten.
10. Es werden drei Fluoreszenzfarbstoffe genannt, die kombiniert werden müssen, um eine einzige Farbstoffzusammensetzung
zu ergeben, welche Kombination von Farbstoffen für die Arbeitsweise oder das Verfahren wesentlich, also nicht
lediglich vorteilhaft, zu sein scheint.
Nach der vorliegenden Erfindung wird lediglich gewöhnliches
weißes Licht benötigt. Es ist keine Änderung von dessen Intensität erforderlich. Der Einsatz eines spezifischen
der erfindungsgemäßen Farbstoffe oder Färbemittel erfolgt
wirklich mit einem einzigen reinen Farbstoff in brauchbarer Form. Jedoch ist festgestellt worden, daß
die reinen Farbstoffe auch sowohl kombiniert wie allein verwendet werden können, um die spektrale Differenzierung
zu verbessern oder zu erhöhen, falls dies erforderlich ist, und zwar bei jeder der fünf Arten oder einzelnen Mitglieder
der Leukozytenzellen, wobei die Kombinationen einen beträchtlichen Fortschritt gegenüber der offensichtlichen
Einschränkung der Mehrfach-Fluoreszenzfarbstoffmethode von Kleinermann bringen, was zu einem vereinfachten individuellen
Grundspektrum der Intensität des weißen Lichtes führt, was wesentlich dazu beiträgt, daß automatische Differentialleukozytenzähleinrichtungen
produktiver und bei der Identifizierung, Differenzierung und Aufzählung der einzelnen
Leukozytenzellen wie bei den Gesamtmengen genauer sind. Aufgrund der supravitalen Technik ist auch ein kontinuierliches
Überwachungssystem bei der Krankenhausdiagnose und -behandlung möglich, wo eine kritische kontinuierliche
Leukozytenüberwachung ein erwünschtes Ziel wäre.
Der Ausdruck supravitaler Farbstoff oder Färbemittel und supravitales Anfärben schließt die Möglichkeit einer
kontinuierlichen Perfusion durch die Blutgefäße eines lebenden Organismuses und die kontinuierliche Überwachung sämtlicher
fünf Arten von weißen Blutzellen nicht aus, wenn dieselben durch ein entsprechendes Rohr zur Beobachtung
und zum Zählen hindurchtreten.
Es ist bekannt, daß die meisten Farbstoffe toxisch sind, wenn sie unter supravitalen Bedingungen eingesetzt werden.
Es ist festgestellt worden, daß die weißen Zellen sehr leicht beschädigt werden, wenn sämtliche rote Zellen in
einer Wärmebox bei 37° C angefärbt werden. Aus dem Stand der Technik ist es auch bekannt, daß, wenn eine Gruppe
von Zellen stimuliert oder beschädigt wird, die Reaktion gegenüber den Farbstoffen sich deutlich ändert. Es ist
nicht ungewöhnlich, daß das Anfärben mit einigen Farbstof- < fen relativ lange Zeit in Anspruch nimmt, in der Größenordnung
von einer halben Stunde, um eine maximale Farbintensität zu erreichen. Die Leukozytenfarbstoffe dieser Erfindung
färben beinahe augenblicklich an, d. h. es ist keine weitere Zeit nach dem Kontakt nötig. Die Zellen werden daher
der Überprüfung in der am wenigsten denaturierten Form, die bisher bekannt ist, unterzogen.
15
15
Im Hinblick auf die Spektralkurven 1 bis 10 der Beschreibung ist festzustellen, daß es zwei getrennte Kurven gibt, die
durch das gleiche Gerät in das Diagramm eingezeichnet werden. Die oberen Kurven, die im allgemeinen die niedrigeren Peaks
«. 20 und die häufigeren Änderungen des Anstiegs aufweisen, geben
das Ansprechen auf ultraviolettes Licht wieder, während die w ursprünglichen unteren Kurven, die im allgemeinen weniger
und höhere Peaks aufweisen,die Ansprechkurven des sichtbaren
Lichts wiedergeben.
25
25
Eine positive Identifizierung der Farbstoffe durch eine genaue chemische Strukturformel ist meistens nur dem Hersteller
möglich, wenn überhaupt. Sogar die Namen der Farbstoffe sind mit einer Unsicherheit behaftet. Eine systematische
Nomenklatur ist nicht die Stärke der Färberei. Die Verwendung von "Colour Index"-Nummern dürfte eine verläßliche
Identifizierung darstellen, soweit dieselben bekannt sind. Es bestehen andere Farbindexsysteme (Miochrom Nummern),
die zur weiteren Identifizierung benutzt worden sind, sofern sie bekannt sind.
Die Namen, die hier benutzt werden, sollen der Identifizierung im Zusammenhang der Spektralkurven dienen, die
den Farbnamen tragen. Soweit erhältlich wurden die "Colour-Index" -Zahl und der Hersteller (Quelle) des Farbstoffs
angegeben (vgl. Tabelle I). Die chemische Struktur, soweit sie bekannt ist, ist in den Beispielen angegeben. Sämtliehe
hier benutzten Farbstoffe wurden in der reinsten Form, in der sie erhältlich sind, benutzt. Eine Überprüfung
der Spektralkurven zeigte in der Hauptsache relativ reine Farbstoffe. Wenn die tatsächliche chemische Struktur bekannt
und angegeben ist, dann gibt es einen herausragenden relativ scharfen Peak in der Ansprechkurve des sichtbaren
Lichts, was die Wahrscheinlichkeit und die Tatsache der vermuteten Farbstoffreinheit anzeigt.
Definitionsgemäß geben im vorliegenden Zusammenhang bei Zweifeln über die verwendete Identität der Namen der Farbstoffe
die Farbspektralkurven 1 bis 11, die diesen Namen zugeordnet sind, den Ausschlag. Diese Kurven sind leicht
zugänglich und relativ reproduzierbar, und gelten hier als "Fingerabdruck" für die letztendliche Identifikation
der erfindungsgemäß verwendeten geeigneten Farbstoffe zum differentiellen Zytoanfärben- von fünf Arten von Leukozyten,
nämlich polymorphonukleare Leukozyten oder Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Lymphozyten und Monozyten, welche
alle von Interesse in der Zytologie weißer Blutzellen und bei der Diagnose unterschiedlicher Krankheiten sind.
Die Farbstoffe der Tabelle I sind sehr unüblich, da sie eine spektrale Differenzierung der großen Klasse weißer
Blutzellen oder Leukozyten zulassen, so daß eine Zytoabsorptionsfarbstofftechnik
zur Differenzierung der fünf Arten von Leukozyten möglich wird. Es ist darauf hinzuweisen,
daß jeder einzelne Farbstoff in Tabelle I nicht nur ein metachromatisches Anfärben von wenigstens vier Arten von
weißen Blutzellen zuläßt, sondern eine Differenzierung der einzelnen angefärbten Leukozytenarten oder -klassen
aufgrund unterschiedlicher Spektralfarben erlaubt.
Im Hinblick auf die drei Farbstoffe, die in Tabelle II angegeben sind, ist festzustellen, daß sie nicht die intensive
Breite und ungewöhnlich vielfältige metachromatische Qualität der Farbstoffe der Tabelle I besitzen.
Obgleich sie metachromatisch in einem beschränkteren oder
geringeren Ausmaß sind, sind sie, wenn sie auf eine Art der Leukozyten einwirken, spezifisch und von ungewöhnlicher
Natur, da jeder ein spezifischer Farbstoff für nur eine Art, nämlich die Monozyten, darstellt. Aufgrund der sofortigen
Kernanfärbung dieser Zellen und von nichts anderem, ermöglichen diese Farbstoffe eine einfache, schnelle und genaue
Identifizierung und Differenzierung der Monozyten allein.
Nach dem Stand der Technik erfolgt die Identifizierung und
Differenzierung der Monozyten durch eine zeitraubende und verwickelte zytochemische Behandlung der Zellen, die eine
Nicht-Esterase-Reaktion, eine Präparation fixierter Zellen, eine Hexazotisation, eine pH-Einstellung und ein Anfärben
mit einer Vielzahl von Farbstoffen umfaßt, und etwa 60 min dauert, was mit irgendeinem dieser drei Farbstoffe allein
oder in Kombination, falls erwünscht in weniger als 1 min durch einfachen Kontakt des Farbstoffs und der Blutprobe
in einem wässrigen System erreicht werden kann. Nach dem
SPEZIFISCHE FARBSTOFFE
POLYMORPHONUKLEARE
LEUKOZYTEN
(NEUTROPHILE)
EOSINOPHILE
BASOPHILE LYMPHOZYTEN
MONOZYTEN
8. | BASISCH ROT 13 Spektralkurve 8 (General Analine) |
(nicht angefärbt) |
(nicht angefärbt) |
(nicht angefärbt) |
(nicht angefärbt) |
ROTER Kern ROTES Zyto- plasma |
9. | BASISCH VIOLETT 16 Spektralkurve 9 (DuPont) |
(nicht angefärbt) |
(nicht angefärbt) |
(nicht angefärbt) |
(nicht angefärbt) |
ROSA Kern ROSA Zyto- plasma |
10. | CARBOCYANIN K-5 Spektralkurve 10 (Kodak) |
(nicht angefärbt) |
(nicht angefärbt) |
(nicht angefärbt) |
(nicht angefärbt) |
ROTER Kern ROSA Zyto- plasma |
FARBSTOFFZUSAMMENSTELLUNGEN
POLYMORPHONUKLEARE
LEUKOZYTEN
(NEUTROPHILE)
EOSINOPHILE
BASOPHILE
LYMPHOZYTEN
MONOZYTEN
11: | CARBOCYANIN K-5 + RHODANIL- BLAU (21 - 40° C) |
BLAUE Körnchen |
PURPURFARBENE Körnchen |
ROTE Körnchen |
BLAUGRÜN | ROTBRAUCHER Kern ROTBRAUNES Zyto- plasma |
12. | BASISCH VIOLETT 16 + BORREL-BLAU (37 - 40° C) |
BLAUE Körnchen |
PURPURFARBENE Körnchen |
ROTE Körnchen |
blaugrUner Kern |
(kräftigerer) ROSA Kern ROSAROTES Zyto- plasma |
13. | BASISCH VIOLETT 16 + BASISCH ORAGNE 21 (37 - 40° C) |
DUNKELGELBE Körnchen , '..ν. i:. λ: |
BRAUNE Körnchen |
ROTE Körnchen |
(nicht angefärbt) |
ROTER Kern ROTE Zytoplasma- körnchen |
14. | CARBOCYANIN K-5 + BASISCH ORANGE 21 (37 - 40° C) |
Farbe wie bei 7 intensiver kontrastreich |
Farbe wie bei 7 intensiver |
Farbe wie bei 7 besser defi nierbar |
(nicht angefärbt) |
Synergistisch 7 und 10 intensivere Farben hervorragend |
15. | NACHTBLAU + BORREL-BLAU (37 - 40° C) |
GRÜNE Körnchen |
BLAUE Körnchen |
PURPURFARBEN Körnchen |
blaugrUner Kern |
PURPURFARBENER Kern GRÜNES Zytolasma |
cn .,ο
TABELLE III (Fortsetzung)
FARBSTOFF ZUSAMMENSTELLUNGEN |
POLYMORPHONUKLEARE LEUKOZYTEN (NEUTROPHILE) |
EOSINOPHILE | BASOPHILE | LYMPHOZYTEN | MONOZYTEN |
ie. PFLAUMENECHT BORREL-BLAU (37 - 40° C) |
BRAUNE Körnchen |
GRÜNE Körnchen |
PURPURFARBENE Körnchen |
BLAUGRÜNER Kern |
PURPURFARBENER Kern HELLROTE Körnchen intensivere Farben |
17. BASISCH ORANGE 21 BORREL-BLAU (37 - 40° C) |
GRÜNE Körnchen |
GELBE Körnchen |
ROTE Körnchen |
BLAUGRÜNER Kern |
BLAUES Zytoplasma |
NJ Cn NJ
vorliegenden, hier beschriebenen Verfahren erfolgt eine sofortige bevorzugte Anfärbung des Kerns der Monozyten.
Nachdem der Farbstoffkontakt etwa IO min erfolgt ist, kann
man die schwache Metachromasie des Farbstoffs in den Zellen, die keine Monozyten sind, beobachten. Dies erfolgt jedoch
mit Verzögerung, ist nicht stark, führt nicht zu Irrtümern und die Monozytenanalyse kann mit hinreichender Genauigkeit
und Reproduzierbarkeit mit den Farbstoffen der Tabelle II vollständig durchgeführt werden.
Bei den Arbeiten, die zu der Erfindung geführt haben, wurde eine sehr große Zahl eines breiten Spektrums von Farbstoffklassen
in Betracht gezogen. Die einzige allgemeine Klasse, die aufgrund ihrer Chemie sich für den erfindungsgemäßen
Zweck als geeignet erwies, waren die basischen quaternären kationischen Farbstoffe. Von sämtlichen erhältlichen Farbstoffen
dieser untersuchten Klasse stellten sich jedoch lediglich jene, die in Tabelle I angegeben sind, als stark
metachromatisch heraus, wobei das differentielle spektrale
Ansprechen sich bei wenigstens vier verschiedenen Leukozytenarten schnell entwickelt. Die in Tabelle II angegebenen
Farbstoffe werden durch ihre Spektralkurven (Spektralkurve
8, 9 und 10) identifiziert. Obgleich diese drei Farbstoffe bei sämtlichen Leukozytenarten nur einen beschränkten
metachromatischen Synergismus gezeigt haben, ist die festgestellte Spezifität dieser spezifischen Farbstoffe gegenüber
Monozyten von einzigartiger Bedeutung.
Die Identifizierung und Aufzählung der Monozyten wird durch diesen Satz ungewöhnlicher Farbstoffe vereinfacht. Die
übliche fluoridempfindliche" unspezifische Esterase-Reaktion,.
die zytochemisch zur Monozytenidentifizierung benutzt wird, dauert oft eine Stunde und mehr, bis sie fertig ist, und
"3*10 9 752
erfordert ein genaues zytochemisches Arbeiten, damit sie zum Erfolg führt. Mit einem der vorstehend angegebenen
Farbstoffe kann das Färben einer Speckhautsuspension oder von Gesamtblut sowie die Untersuchung auf einfache Weise
durchgeführt werden, ohne chemische Einstellungen in der Größenordnung von Minuten. Das Anfärben der Monozyten
durch das vorliegende Verfahren erfolgt sofort, und zwar bis zum Kern.
( 10 Bei Beginn des Einsatzes der Farbstoffe der Tabelle II
werden die Monozyten sofort durch eine charakteristische Anfärbung des Kerns identifiziert. Soweit festgestellt
werden konnte, ist bisher kein sofortiges Anfärbeverfahren bekannt, durch das der Kern der Monozyten spezifisch angefärbt
wird.
Der Farbstoff der Spektralkurve 10, der hier Carbocyanin K-5 genannt wird, war der einzige basische Carbocyaninfarbstoff
unter 18 Farbstoffen dieser Klasse, die vom Hersteller (Kodak) zu Untersuchungszwecken angeboten wurden, der
sich als wirksam herausstellte, irgendeine der Leukozyten anzufärben. Die zunehmende Intensität der Kernanfärbung
^- während einer kurzen Kontaktzeit, läßt eine ungewöhnliche
Affinität des Carbocyanin K-5-Farbstoffs gegenüber Substan-
" zen des Kerns von Monozyten vermuten.
Die Identifizierung, Differenzierung und Aufzählung der
Monozyten ist von großer diagnostischer Bedeutung. Eine Zunahme der Zahl der Monozyten im Blut kann die Gegenwart
-*° von offener Tuberkulose, Septicämie oder einer Blutvergiftung
oder eines Lymphomas, wie die Hodgkinsche Krankheit, bei der Diagnose anzeigen. Die erhöhte Anzahl von
Monozyten im Blut von Personen, die von.einer hypoplastischen
oder aplastischen Anämie genesen, kann eine günstige Prognose für den Patienten anzeigen. Schnelle und genaue
mikroskopische Analysen von Monozyten nach diesem Verfahren begünstigen einen weiten Anwendungsbereich einer
wertvollen Technik.
Die Ermittlung, Identifizierung und Aufzähung der polymorphonuklearen
Leukozyten (Neutrophile) stellt einen kritischen Parameter bei sämtlichen Blutuntersuchungen
dar. Sie sind besonders wichtig bei der Diagnose akuter Infektionen, wie der Lungenentzündung oder der Bauchfellentzündung,
wo die Anzahl der Neutrophilenerhöht ist. Sie sind wichtig, um Patienten zu überwachen, die einer Chemotherapie
oder einer Bestrahlungstherapie unterworfen sind.
Eine verminderte Anzahl kann bei einer starken Infektion auftreten sowie eine Arzneimittelvergiftung, Hyperaktivität
der Bauchspeicheldrüse und eine akute Leukämie anzeigen.
Wenn die absolute Neutrophilenzählung unter 1000 mm abfällt,
erhöht sich das Infektionsrisiko beträchtlich. Die Farbstoffe dieser Erfindung färben im allgemeinen sofort
die Körnchen oder Lyosome an, welche die charakteristische Identifizierungsstruktur der polymorphonuklearen Leukozyten
oder Neutrophilen sind.
25
25
Eosinophile spielen bei allergischen Reaktionen eine Rolle, desgleichen die Basophile. Lymphozyten spielen bei Entzündungen
eine Rolle, und in einem größeren Ausmaß bei Immunreaktionen und als Reaktion auf Antigene (Fremdkörper) .
30
Die Zählungen der Eosinophile werden dazu benutzt, die medizinische Verabreichung des adrenocorticotropen Hormons
(ACTH) bei der Behandlung unter klinischen Bedingungen zu
verfolgen.
Die bisher eingeführten Methoden führten zu Verwechslungen von Artifakten und nicht definierbaren Formen, die Eosinophilen
zum Verwechseln ähnlich sind. Die Genauigkeit der Blutzellenzählung nach dem Stand der Technik nimmt mit
der Zeit zwischen der Präparation der Blutprobe und der Beendigung der Zählung ab. Vielfachfarbstoffe werden im
wesentlichen benutzt. Ein Säure- oder Base-Anfärben ist häufig erforderlich. Die Farbstoffe neigen dazu, aus der
Lösung beim Stehen auszukristallisieren.
Lymphozyten, die mit Borrel-Blau spezifisch identifizierbar
sind, hängen bekanntlich mit Entzündungen und der Immunitat zusammen. Ihre Zahl erhöht sich im Blut von Personen
mit chronischer lymphatischer Leukämie und bei Personen mit Pertusis (Keuchhusten). Die Zählrate kann bei Patienten
herabgesetzt sein, die einer Chemotherapie oder Radiotherapie unterzogen werden, bei Patienten mit Lymphoma und
bei verschiedenen Arten von vererbbaren immunologischen Störungen.
Basophile haben ein Zytoplasma, das große Körnchen enthält, die reich an kationischen Substanzen, wie Heparin, Serotonin
und Histamin sind. Sie spielen beispielsweise bei allergischen Reaktionen eine Rolle.
Der Hauptvorteil der Erfindung ist darin zu sehen, herausgefunden zu haben, daß es sehr wenige einzigartige Farbstoffe
gibt, die Leukozyten differentiell anfärben, sowie die Identität dieser wenigen Farbstoffe, und daß sie
einzeln in reiner Form sowohl bei der manuellen wie der automatischen Identifizierung und Untersuchung jeder Art
von Leukozyten verwendbar sind. Es ist klar, daß potentielle Vorteile auffindbar sind, wenn Kombinationen
dieser einzigartigen brauchbaren Farbstoffe für zytologische Zwecke verwendet werden. Tabelle III veranschaulicht
das Ergebnis der Vewendung von Kombinationen der spezifischen Farbstoffe der Tabelle I und II. Die Verwendung von
Carbocyanin K-5 und Basisch Orange 21 ermöglicht bei Bluttemperatur eine merklich bessere Identifizierung und
spektrale Bestimmung zwischen Neutrophilen, Eosinophilen, /*~ 10 Basophilen und Monozyten, als bei Basisch Orange 21 allein.
Die Tabelle III gibt fünf Kombinationen von grundsätzlich brauchbaren und universellen Farbstoffen der Erfindung in
Kombinationen wieder, insbesondere von Pflaumenecht und Borrel-Blau, welche Kombination zu einer synergetischen
Aktivität führen dürfte, die die spektrale Bestimmung der einzelnen Farbstoffe der ersten Reihe der basischen quaternären
kationischen metachromatischen Farbstoffe bei fünf Migliedern der angegebenen Leukozyten intensiviert. Die Mitglieder der
Tabelle II erweisen sich ebenfalls als nützlich zu diesem Zweck, wie durch die Kombinationen der Tabelle III veranschaulicht.
Die acht Farbstoffe, die in Tabelle I angegeben und durch ihre Spektralkurven genau identifizierbar sind, sind ungewöhnlich
stark metachromatisch. Sie färben nicht nur in klassischer Weise die Zellen mit einer anderen Spektralfarbe
als ihrer eigenen Farbe an, vielmehr färben alle in Tabelle I angegebenen Farbstoffe jeweils eine der fünf
Leukozytenarten an, und zwar in spektral unterscheidbaren unterschiedlichen Farben bei den ersten fünf Farbstoffen,
wobei jede Art der fünf Leukozyten mit dem zweiten Satz
" von vier metachromatischen Farbstoffen der Tabelle I angefärbt
wird. Aus einem nicht bekannten Grund bleiben
' "3Ί09Ζ52"
die Lymphozyten bei dem zweiten Satz von vier Farbstoffen
unangefärbt. Die Lymphozyten können allein mit Borrel-Blau
bei 25° C für eine spezifische Untersuchung angefärbt werden, was eine sehr interessante und nützliche Abweichung
dieses spezifischen Farbstoffs darstellt.
Die Untersuchung der acht Farbstoffe in Tabelle I, deren chemische Identität bekannt ist und die eine ungewöhnliche
Metachromasie zeigen, wenn sie bei fixiermittelfreien Blutproben verwendet werden, zeigt an, daß diese Farbstoffe
gattungsmäßig als basische, metachromatisehe, kationische
Farbstoffe klassifizierbar sind, die durch die Gegenwart eines quaternären Stickstoffatoms in ihrer Struktur charakterisiert
werden, wobei ihr anionischer Teil ein farbloses Ion darstellt, zweckmäßigerweise ein Halogenion, und zwar
am häufigsten das Chloridion.
Eine weitere Eigenschaft der wirksamen Farbstoffe der Tabelle I und der Tabelle II der Erfindung besteht darin,
daß sie innerhalb eines Temperaturbereichs zwischen etwa 21 und etwa 4O° C wirksam sind. Innerhalb dieses Temperaturbereichs
ist ihre Anfärbequalität hinsichtlich der spektralen Differenz, wenn Leukozytenarten angefärbt werden,
aufgrund der Morphologie der Zellen keinen Änderungen unterworfen (anderen als denen der Farbe). Soweit bekannt, ist
das Ausmaß des Synergismus zwischen jeder der Leukozytenarten und den Farbstoffen der Tabelle I der Erfindung in
deren metachromatischem Ansprechen durch Kombination des Farbstoffs mit deren zellulären Bestandteilen außerordent-
30 lieh einzigartig.
BEISPIEL 1
(Greifswalder Blau - Spektralkurve 1)
(Greifswalder Blau - Spektralkurve 1)
Sechs Patienten mit typischer chronischer lymphozytischer
Leukämie wurden 50 ml Proben peripheren venösen Blutes (heparinisiert) entnommen. Die Spender hatten Lymphadenopathie,
Hepatomegalie,Splenomegalie, Knochenmark, das einen virtuellen Ersatz durch reif erscheinende Lympho-,
zyten zeigte, sowie weiße Blutzellenzählraten zwischen 50.000 und lOO.OOO/mm3.
Zehn als normal angesehenenPersonen wurden Blutproben entnommen,
desgleichen zwei Patienten mit viralen Syndromen, die eine weiße Blutzellenzählrate zwischen 11.000 und 15.000
mm und 7O bis 80% atypische Lymphozyten in ihrem peripheralen
Blut aufwiesen. Diese Proben wurden zum Vergleich und zur Kontrolle verwendet.
In ein 10 χ 75 mm Reagenzglas, das fünf Tropfen Gesamtblut enthielt, wurde ein Tropfen einer frisch hergestellten
gefilterten wässrigen Lösung von Greifswalder Blau (Chroma) mit pH 2,1 gegeben. Das Gemisch wurde vorsichtig bewegt
und es wurde ein Tropfen der Mischung sofort als nasse Auftragung unter einem Lichtmikroskop untersucht, und
danach in 60 see Abständen bis zu 15 min nach der Farbstoffzugabe zu der Blutprobe mit dem Antikoagulanz (heparinisiert)
. (Ansonsten mit keinem anderen denaturierenden Zusatz fixiert).
Bei den normalen Blutproben färbt das Greifswalder Blau den Kern und das Zytoplasma der normalen Lymphozyten mit
blaugrüner Farbe an. Die Neutrophile zeigten gelbe Körner, die Eosinophile grüne Körner, die Basophile blaue Körner
f * ψ Λ * Λ _ »»
- 51 -
und die Monozyten einen purpurfarbenen Kern. Damit ermöglicht
ein Farbstoff eine eindeutige Identifizierung sämtlicher normaler weißen Zellenklassen, und zwar jede mit
einem unterscheidbaren identifizierbaren Spektralwert. 5
Es hat sich auch herausgestellt, daß die Farbstoff-Blutproben
gegenüber einem Erwärmen auf eine Temperatur von 37 C (Bluttemperatur) stabil sind, ohne daß die charakteristische
Differenzierung der in den Proben vorhandenen Leukozyten geändert wurde.
Bei einem Vergleich der normalen Blutproben mit jenen der Patienten mit chronischer lymphozytischer Leukämie
zeigte es sich, daß der Kern und das Zytoplasma der leukämischen
Lymphozyten tief rotbraun angefärbt war. Auf diese Weise können normale Lymphozyten von leukämischen Lymphozyten
aufgrund der verschiedenen Anfärbung unterschieden werden.
Es wird angenommen, daß die Anwendungen dieser Technik der Zytoabsorption des vitalen Blutes mit sehr ausgewählten
metachromat!sehen Farbstoffen, die entweder sämtliche der
weißen Blutzellenleukozyten mit identifizierbaren unterschiedlichen
Spektralfarben anfärben oder eine Klasse nicht anfärben, die Zytochemie der Blutanalyse verbessert. Die
Aufzählung der verschiedenen Zellen sowohl manuell wie durch automatische Differentialleukozytenzählung und der
Beitrag der Bestätigung von Krankheiten durch positive Identifikation wird erhöht.
Greifswalder Blau ist der einzigartigste Farbstoff, da
er bei Temperaturen, die normalerweise in der Zytochemie
von Interesse sind, also bei Umgebungstemperatur (25° C)
31 Ü9252"
•bis Bluttemperatur (37° C) , jede der fünf hier erörterten
Leukozytenklassen anfärbt, und zwar charakterisiert durch eine verschiedene identifizierbare unterscheidbare Spektralfarbe.
Dies ist als ungewöhnlich und einzigartig metachromatisch zu betrachten.
Greifswalder Blau wird ohne "Colour Index"-Nummer angegeben.
Der Farbstoff ist von der Firma Chroma Gesellschaft Schmid & Company, Stuttgart, Untertürkheim, Deutschland, erhältlieh.
Andere biologische Farbstoffe der Erfindung, die Chroma als Quelle angeben, können ebenfalls von dieser
Firma erhalten werden.
Die dunnschichtchromatographische Analyse von Greifwalder
Blau bestätigt, daß dieser Farbstoff ein Gemisch von vorwiegend drei basischen quaternären kationischen Farbstoffen
ist. Angaben, die nicht vollständig sind, zeigen an, daß diese drei Farbstoffe wahrscheinlich Safranin "0" (CI 5O24O),
Methylenblau (CI 52015) und Methylviolett (CI 42535) oder ähnliches sind.
Obgleich Greifwalder Blau nachweislich kein reiner Farbstoff ist, ist jeder der vorstehend genannten Bestandteile richtig
als basischer quaternärer kationischer Farbstoff klassifiziert. Es ist deshalb richtig, den betreffenden Farbstoff
in dieser Klasse zu definieren.
BEISPIEL 2 (Borrel-Blau - Spektralkurve 2)
Heparinisierte peripherale venöse Blutproben wurden während
der Diagnose oder vor der Behandlung sechs Patienten entnommen, die akute lymphoplastische Leukämie hatten, desgleichen
acht Patienten mit akuter myeloplastischer Leukämie, zehn Patienten mit akuter myelomonozytischer Leukämie und zehn
anscheinendnormalen Probanden.
Bei den 24 bekannten Krankheitsfällen wurden routinemäßige zytochemische Untersuchungen durchgeführt. Im Falle der
akuten lymphoplastisehen Leukämie zeigten immunologische Untersuchungen, daß ein Fall ein B-Zellentyp war, drei
Fälle T-Zellentypen waren und zwei Fälle NUli-Zellentypen.
Der B-Zellentyp-Fall erwies sich gegenüber der terminalen Deoxynukleotidyl-Transferase als positiv. Sämtliche akuten
Leukämiefälle wurden als typisch sowohl in morphologischer wie in zytochemischer Hinsicht angesehen.
Ein leukozytenreiches Plasma wurde aus heparinisierten Proben
durch Sedimentation der Erytrozyten bei 4C innerhalb sechzig (60) Minuten erhalten.
Zu fünf Tropfen des auf diese Weise von jeder Probe erhaltenen leukozytenreichen Plasmas in einem 10 χ 75 mm Reagenzglas
wurde ein Tropfen einer frisch hergestellten gefilterten wässrigen Lösung von Borrel-Blau gegeben, worauf
die Reagenzgläser leicht wenige Sekunden bewegt wurden.
In Intervallen zwischen 1 und 10 Minuten wurden bei einer Temperatur von etwa 21° C Proben des Gemischs aus Zellen
und Farbstoff entnommen und mikroskopisch bei nasser Aufbringung untersucht. Wegen der mutmaßlichen Ähnlichkeit
von Methylenblau und Borrel-Blau wurde ein Versuch durchgeführt,
bei dem eine l%ige wässrige Lösung von Methylenblau-Farbstoff zu separaten Proben von normalen und leukämischen
Leukozyten gegeben wurde. Sämtliche Proben wurden ähnlich behandelt und untersucht. Zum Aufbringen des
Mediums wurde Immersionsöl benutzt, da zuvor ein Verblassen mit "Permount" festgestellt worden war.
Unmittelbar nach der Farbstoffzugabe wurde die Adhäsion
kleiner Farbstoffteilchen im mikroskopischen Feld entlang
der Zellmembranen der normalen Lymphozyten und der leukämischen
Lymphoplasten aller Patienten mit akuter lymphoplastischer Leukämie beobachtet. Bei allen normalen und
anderen zytologischen Typen leukämischer Zerstörung trat die Adhäsion von Farbstoff an der Zellmembran nicht
sichtbar auf.
Bei Glasplättchen, die die Adhäsion der Farbstoffteilchen
zeigten, schien die Zellmembran mit kleinen Auswüchsen aufgerauht zu sein. In diesen Zellen trat eine hellblaue
Kernanfärbung nach wenigen Minuten auf, die innerhalb von fünf Minuten dunkelblau wurde. Zu diesem Zeitpunkt sahen
die normalen Lymphozyten und leukämischen Lymphoplasten zerstört aus, und zwar mit zerissenem Kern und Zytoplasma.
Die dunkelblaue Kernanfärbung, die bei den leukämischen Lymphoplasten festgestellt wurde, wurde bei den leukämischen
Monozyten und leukämischen Myeloplasten nicht beobachtet. Die lymphoiden Zellen waren dunkelblaugrün.
Nach lediglich IO Minuten wurde eine hellgelbe Kernanfärbung und eine hellgrüne Körnchenanfärbung bei den Neutrophilen,
den Eosinophilen und Basophilen festgestellt. Bei Monozyten wurden blau angefärbte stäbchenförmige Strukturen
(vermutlich Mytochondria) festgestellt.
Der Methylenblau-Vergleich ergab eine schwache aber feststellbare
Kernanfärbung bei normalen Lymphozyten und leukämischen Lymphoplasten, jedoch von wesentlich geringerer
definierbarer Spektralintensität als bei Borrel-Blau.
5
Bei einem separaten Versuch, der mit ähnlich sedimentierten
normalen menschlichen Blutproben durchgeführt wurde, wurde bei einer Temperatur von etwa 37° C (Bluttemperatur) eine
sehr interessante Abweichung beim Anfärben der Leukozyten festgestellt. Bei dieser Temperatur wurden alle Leukozyten
angefärbt (so wie alle Leukozyten mit Greifswalder Blau nach dem Beispiel 1 bei etwa 22° C). Die Neutrophilen
zeigten hier blaue Körner, die Eosinophilen purpurfarbene Körner, die Basophilen rote Körner, die Lymphozyten blaugrünes
Zytoplasma nebst Kern und die Monozyten ein purpurfarbenes
Zytoplasma mit rot bis rosanen Körnern.
Bei Borrel-Blau besitzen also bei niedriger Raumtemperatur (unterhalb etwa 25° C) nur die Lymphozyten eine starke
spektrale Farbstoffabsorption, während bei Bluttemperatur
(37° C) alle Lymphozyten differentiell durch eine einzige charakteristische Spektralfarbenabsorption identifizierbar
sind.
Die Temperaturempfindlichkeit dieses ungewöhnlichen basischen quaternären kationischen metachromatisehen Farbstoffs
ermöglicht eine eindeutige Differenzierung der Lymphozyten, wobei er den Kern der Lymphozyten bei etwa 21 bis
25 C blaugrün anfärbt.
Alle andere Leukozyten werden nicht angefärbt und jene mikroskopischen zytologischen Studien, die vollzogen werden
sollen, können bei der tieferen Temperatur durchgeführt werden. Bei der Temperatur des normalen warmen Blutes
(37 C) unterscheiden sich jedoch alle übrigen Leukozyten durch den Einsatz dieses einzigen metachromat!sehen Farbstoffs,
nämlich Neutrophile, Eosinophile, Basophile und Monozyten.
5
5
Gemische von Borrel-Blau mit Basisch Violett 16, die
bei 37 - 40° C (Tabelle III) untersucht worden sind, ergaben nur eine geringe Änderung, außer daß sämtliche
Farben etwas lebhafter und kräftiger erschienen, was die Monozyten anbelangt, die außerdem einen rosa Kern zeigten.
Es ist wahrscheinlich, daß die Computerzählung bei der geräteoptischen Differenzierung mit Farbstoffgemischen genauer
gemacht werden kann, insbesondere was die Monozyten-Untersuchungen angeht. Beispielsweise zeigte Borrel-Blau
zusammen mit Basisch Violett 16 (Tabelle III), wenn es bei warmem Blut (37° C) angewendet wurde, daß alle Farben
der angefärbten Leukozyten etwas dunkler und schärfer waren, als wenn Borrel-Blau-Farbstoff allein bei dieser
20 Temperatur benutzt wurde.
Die genaue Struktur von Borrel-Blau konnte durch umfangreiche Untersuchungen nicht ermittelt werden. Jedoch wurden
Anleitungen zu seiner Herstellung in "Microtomists Formulary
and Guide", herausgegeben von Blaikston & Company, New York (1956) gefunden, worin einer, nämlich Peter Gray, die
Herstellung beschreibt, und zwar indem zuerst eine alkalische Lösung von Silbernitrat hergestellt wird, indem eine
3%ige wässrige Lösung von Natriumhydroxid zu loo ml einer 1/2% Silbernitratlösung gegeben wird, bis kein weiterer
Niederschlag mehr auftritt. Der Niederschlag wird gewaschen und durch Dekantieren gereinigt. Zu dem Niederschlag wird
eine l%ige wässrige Lösung von Methylenblau gegeben. Nach fünfminütigem Kochen, Kühlen und Filtrieren wird Borrel-Blau
erhalten.
Damit ist klar, daß der erzeugte Farbstoff ein basischer quaternärer, kationischer metachromatischer Farbstoff
ist, bei dem wahrscheinlich das ursprüngliche Halogenanion durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, oder
mit einer Silbergruppe komplexiert ist.
Der Farbstoff wird als Borrel-Blau, Michrome Nr. 376
in dem letzten (Ed. Gurr) E. Merck Katalog angegeben.
BEISPIEL 3 (Rhodanil-Blau - Spektralkurve 3)
Mehrere Proben von peripheralem venösen Blut wurden sowohl
von normalen wie leukämischen Probanden erhalten. Lederhautleukozyten wurden daraus entweder durch Zentrifugieren
von heparinisierten 5O ml Aliquots und Entfernung der Lederhautschicht durch Resuspension in autologem Plasma
erhalten, oder durch Sedimentation des Gesamtblutes, das 5 ml 6%iges Dextran in physiologischer Kochsalzlösung
enthielt, wonach die Leukozyten von der Plasmaschicht abgetrennt wurden. Bei einer entsprechenden Serie wurde
Gesamtblut verwendet.
Zu den Probanden gehörten Patienten mit akuter monozytischer Leukämie, akuter myeloplastischer Leukämie, akuter lymphoplastischer
Leukämie, chronischer granulozytischer Leukämie, chronischer lymphozytischer Leukämie und Plasmazellenleukämie
sowie Patienten mit I
30 mit Septicämie zusammenhängt.
leukämie sowie Patienten mit Monozytosis(500/mm ), die
Zu Proben normalen und leukämischen Blutes, die 6 χ 1,0 ml
Leukozyten pro ml aufwiesen, wurden zwei Tropfen einer
frisch hergestellten gefilterten l%igen wässrigen Lösung
von Rhodanil-Blau (Gurr - vgl. Spektralkurve 3) bei pH 3,1 in einem 10 χ 75 nun Reagenzglas gegeben. Die das
Gemisch enthaltenden Reagenzgläser wurden einige Sekunden bewegt und dann fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
In Abständen von einer Minute nach der Zugabe wurde ein Tropfen des Gemischs durch feuchte Aufbringung unter
einem sauberen Glasdeckstreifen untersucht, wobei die herkömmliche Lichtmikroskopie angewandt wurde.
Bei Proben von normalem Blut und von Blut von Patienten mit Septizämie und Monozytis, enthielten die Neutrophilen
zahlreiche magenta·angefärbte Körnchen, die der Größe,
der Anordnung und der Zahl nach den Körnern entsprachen, die bei den konventionellen panoptischen Anfärbungen
sichtbar werden. Das Zytoplasma der Neutrophilen wurde rot angefärbt. Die Lymphozyten und Monozyten enthielten
lediglich einige kleine blaue Körner sowie staubähnliche Strukturen. Die Eosinophilen enthielten dunkelviolette
oder purpurfarbene Körner, und die Basophilen enthielten rote Körner. Die Kerne der Lymphozyten wurden intensiv
blaugrün angefärbt. Es wurde eine blaßlila zytoplasmische Anfärbung der Monozyten beobachtet. Die Kerne sämtlicher
peripheraler Blutleukozyten wurden blaßgrün angefärbt.
In den Proben des Blutes von Patienten mit akuter myeloplastischer
Leukämie und akuter lymphoplastischer Leukämie konnten wenige kleine blaue Körnerstrukturen in dem
leukämisch zerstörten Zytoplasma beobachtet werden. Sie scheinen bei leukämischen Myeloplasten häufiger zu sein.
Ein Anfärben des Zytoplasma unter den Versuchsbedingungen konnte nicht festgestellt werden,
Bei den leukämischen Monozyten von Patienten mit akuter
monozytischer Leukämie wurden blaue punktförmige Strukturen
im Zytoplasma der meisten Blast-Zellen festgestellt.
Innerhalb einer Minute nach der Zugabe des Farbstoffs zeigten die Blast-Zellen sämtlicher Patienten
mit akuter monozytischer Leukämie eine einzigartige tief rosarote Anfärbung des Zytoplasmas. In einigen Fällen
nahm diese Anfärbung eine laminare gestreifte Konfiguration an. In anderen Fällen war die Anfärbung dunkel und diffus.
Die Kerne dieser und anderer Arten leukämischer Blast-Zellen
zeigten eine schwach violette Anfärbung.
Beim Blut von Patienten mit chronischer granulozytischer Leukämie, chronischer lymphοzytiseher Leukämie sowie
Plasmazellenleukämie, zeigten die Monozyten keine rosarote zytoplasmatische Anfärbung. Desgleichen zeigten leukämische
Lymphozyten und neoplastische Plasmazellen keine unterscheidbare zytoplasmatische Anfäbung mit Rhodanil-Blau.
Rhodanil-Blau ist ein obskurer Farbstoff, der durch Kondensation
von Rhodamin B mit Nilblau gebildet wird (vgl. Spektralkurve 3). Bis heute ist die Verwendung dieses Farbstoffs
in der Zytochemie begrenzt. Untersuchungen haben eine einzigartige rosarote metachromatische Anfärbung des zytoplasmas
von leukämischen Monozyten durch Rhodanil-Blau gezeigt, einem Farbstoff, der normalerweise eine blaue
Farbe aufweist. Diese Spektralfarbe wurde bei normalen Monozyten nicht beobachtet. Die Anfärbung von monozytischen
Zellen mit Rhodanil-Blau dürfte sich als nützlich erweisen, um normale Monozyten,die eine schwach purpurfarbene oder
lila metachromatische Anfärbung zeigen, von leukämischen Monozyten, die eine intensive positive rosarote metachromatische
Reaktion zeigen, zu unterscheiden. Wenn ein konventioneller Farbstoff für metachromatische Substanzen ver-
'· - "TTU 9 2 52
wendet wurde, konnten diese Materialien bei Untersuchungen nicht gezeigt werden, wenn sie bei fixierten Zellen verwendet
wurden. Blaue punktförmig erscheinende Strukturen in dem Zytoplasma von leukamischen Blast-Zellen, die mit
Rhodanil-Blau vital angefärbt sind, können als Lyosome
und/oder Mitochondria interpretiert werden. Die Substanz oder die Substanzen in dem Zytoplasma, die mit Rhodanil-Blau
bei lebenden Zellen im Zytoplasma für die beobachtete rote Metachromasie verantwortlich sind, konnten nicht
identifiziert werden. Die rote Metachromasie mit Rhodanil-Blau vervollständigt den bereits bestehenden Test für
monozytischen Eigenschaften, wobei Fluorid verwendet wird, das gegenüber Esterase unspezifisch ist. Obgleich er
als Markierung der Zellen von monozytischem Ursprung wertvoll ist, ist dieser zytochemische Test in seiner Spezifität
beschränkt, da viele Arten von Zellen eine unspezifische Esteraseaktivität zeigen. Die Empfindlichkeit des Fluorids
dürfte auf eine Erhöhung der Spezifität der nicht-spezifischen
Esterase vom monozytischen Typ zurückzuführen sein.
Es wird gegenwärtig berichtet, daß der zytochemische Test für nicht-spezifische Esterase häufig schwierig durchzuführen
ist, da er abhängt von einer genauen pH-Einstellung sowie von frischen Substraten und komplexen Wechselwirkungen
zwischen Farbstoff und Kupplern.
Verglichen mit der nicht-spezifischen Esterasereaktion bei normalen und leukamischen Monozyten besitzt die metachromatische
Reaktion mit Rhodanil-Blau einige Vorteile. Sie ist vorteilhaft bei der Identifizierung von leukämischen
Blast-Zellen. Die Selektivität hinsichtlich leukämischer Monozyten läßt das Vorhandensein einer einzigartigen
und bisher nicht identifizierten Anomalie dieser Zellen vermuten, verglichen mit normalen Monozyten. Der
Farbstoff ist auch dadurch vorteilhaft, daß er bei lebenden akut leukämischen Zellen angewandt werden kann, die nicht
den verschiedenen Arten der Fixierung unterworfen worden sind, wie es bei den konventionellen zytochemischen Verfahren
der Fall ist. Es ist darauf hinzuweisen, daß dieses supravitale Anfärbeverfahren die Probleme herabsetzt, die
durch das Anfärben und Fixieren der Artefakte auftreten, was bei Proben erfolgen kann, die in üblicher Art und
Weise behandelt werden.
Der Rhodanil-Blau-Test verläuft schnell (in weniger als
einer Minute zwischen Anfang und Ende) verglichen mit einer Stunde oder mehr bei der üblichen zytochemischen
Anfärbung für nicht-spezifische Esterase. Darüber hinaus erfordert die rosarote Metachromasie mit Rhodanil-Blau
nicht den Einsatz eines Inhibitors, wie Natriumfluorid, da
bisher kein anderer Typ von leukämischen Blutzellen die rosarote metachromatische Reaktion zeigt. Die Erfahrung hat
gezeigt, daß insbesondere bei anderen Arten von Leukämie einschließlich der Haarzellenleukämie und der leukämischen
Phase der histiozytischen Lymphomie, die rosarote metachromatische Reaktion, die mit Rhodanil-Blau erzeugt wird,
verspricht, ein wichtiger Beitrag zur Zytochemie von akuten leukämischen Zellen zu werden.
In der Tabelle I ist die normale Leukozytenanfärbung mit Rhodanil-Blau wiedergegeben. Rhodanil-Blau hat die nachstehend
angegebene Struktur:
N(C1HA !
: mol. WL 780.402
Die exakte zytotopische Diagnose ist von Bedeutung, da heuzutage eine spezifische Behandlung für jeden
zytotopischen Typ von akuter Leukämie vorhanden ist. Borrel-Blau, Rhodanil-Blau und Carbocyanin K-5 haben
sich alle als erfolgreich bei den hier beschriebenen Untersuchungen erwiesen, um eine Art von akuter leukämischer
Zelle von einer anderen zu unterscheiden.
BEISPIEL 4
(Nachtblau - Spektralkurve 3)
(Nachtblau - Spektralkurve 3)
Lederhautleukozyten (5 χ 16 ml Endkonzentration) wurden
aus 60 ml heparinisiertem venösen Blut von jedem von zehn normalen Probanden hergestellt. Diese wurden sowohl durch
Zentrifugieren von 50 ml heparinisiertem peripheralem Blut und Entfernung der Lederhautschicht sowie durch
r~ Resuspension in autologem Plasma oder durch Sedimentation
erhalten. In getrennten Untersuchungen wurde auch Gesamtblut eingesetzt.
Ein Tropfen einer l%igen filtrierten wässrigen Lösung
von Nachtblau (Chroma), die frisch hergestellt worden war,'
wurde 5 Tropfen der vorstehend angegebenen Blutprobe einverleibt. Die Leukozyten- und Farbstoffgemische wurden
leicht bewegt und ein Tropfen des Gemisches wurde sofort durch feuchte Aufbringung unter einem Lichtmikroskop untersucht,
ferner in 60 Sekundenabständen bis zu 15 Minuten nach der Zugabe des Farbstoffs zu der Blutprobe. Wenn die konventionelle
zytochemische Technik für Myeloperoxidase (9), spezifische Esterase (11), unspezifische Esterase mit Fluorid
(2, 11) und PAS (9) verwendet wurde:., zeigten die peripheralen Blutleukozyten typische Reaktionen.
25
Um die lyosomalen Anfärbeeigenschaften des Farbstoffs sicherzustellen, wurden Lyosome (Körner) aus den granulolytischen
Zellen (polymorphonukleare Leukozyten, Eosinophile,
Basophile) aus 100 ml peripheralem venösen Blut abgetrennt, das von jedem der fünf anscheinend normalen
Probanden erhalten wurde, und zwar nach etablierten Methoden,
30 Sekunden nach der Zugabe von Nachtblau zu einer her-
gestellten Leukozytensuspension der vorstehend angegebenen Blutproben oder zu dem Gesamtblut waren die Körner
der polymorphonuklearen Leukozyten gelbbraun gefärbt. Innerhalb einer Minute waren die Körner dunkelgrün gefärbt.
Die Kerne der polymorphonuklearen Leukozyten waren blaßgrün gefärbt. Nach einer Minute waren die Kerne der
Lymphozyten nicht angefärbt (oder schwach lavendelfarbig).
Einige der Lymphozyten enthielten grün aussehende stabförmige Strukturen, die ihrer Größe und ihrer Form nach
Mytochondrien entsprachen, wie sie mit Janusgrün B sichtbar werden. Das Zytoplasma der Lymphozyten war nicht angefärbt
.
Nach einer Minute sahen die Kerne der Monozyten blaß lavendelfarbig aus, und nach zwei Minuten sahen die Kerne
der Monozyten tief purpurfarben aus. Das Zytoplasma der
Monozyten sah intensiv grün aus und enthielt blaue körnig aussehende Strukturen sowie grüne faserförmig aussehende
Strukturen. Bei voll entwickelter Färbung konnten die Monozyten leicht von anderen peripheralen Blutleukozyten
unterschieden werden. Innerhalb einer Minute nach der Zugabe des Farbstoffs zu den Zellpräparationen färbten sich
die Körner der Eosinophile blau und die Körner der Basophile
metachromatisch purpurfarben. Die Kerne dieser Zellen
sahen praktisch ungefärbt aus (sehr schwach lavendelfarben).
Aufgrund der Beschränkungen, die den panoptisch angefärbten Proben eigen ist, wurden in den zurückliegenden Dekaden
zytochemische Verfahren entwickelt, um einen Blutzellentyp von einem anderen genauer zu unterscheiden. Im allgemeinen
sind diese Versuche darauf ausgelegt, die Zunahme eines Typs einer Substanz in einer bestimmten Zelle festzustellen,
verglichen mit einer anderen oder eine Substanz oder Sub-
stanzen innerhalb einer charakteristischen zellulären Organelle in einer Zelle gegenüber einer anderen festzustellen.
Beispielsweise ist die Aktivität der unspezifischen Esterase in Monozyten ungewöhnlich hoch, und
diese Aktivität scheint besonders empfindlich gegenüber der Inhibierung durch Natriumfluorid zu sein. Desgleichen
hängt die Identifizierung von granulolytischen Zellen
im wesentlichen von der Demonstration der Eigenschaften der Lyosome ab. Aus diesen Gründen haben sich die Bestimmung
der Myeloperoxidase- und der spezifischen Esteraseaktivitäten als zytochemische Verfahren als nützlich erwiesen.
Die lyosomalen Körner der Eosinophile enthalten Myeloperoxidase, die gegenüber der Inhibierung durch Natriumcyanid
resistent ist, und die Körner der Basophilen werden metachromatisch durch eine Vielzahl von Farbstoffen angefärbt,
und zwar zum Teil wegen ihres hohen Gehaltes an kationischen Substanzen, wie Heparin. Bis jetzt ist jedoch
noch kein allgemein akzeptiertes zytochemisches Verfahren für lymphoide Zellen beschrieben worden.
Bei den hier zur Diskussion stehenden Untersuchungen ist die schnelle supravitale Anfärbung der peripheralen Blutleukozyten
durch Nachtblau zu nennen. Nachtblau ist ein obskurer basischer Farbstoff (vgl. die Struktur, die
dem Beispiel folgt). Es wird bei biologischen Anfärbungen
selten verwendet. Die Vitalänfärbung von normalen menschlichen granulozytischen Zellen mit Nachtblau zeigt schnell,
daß diese Zellen voneinander anfgrund der Anfärbeeigenschaften und der Größe der Lyosome unterschieden werden können,
desgleichen von anderen Blutzellen, die nicht diese Art von Lyosome enthalten. Weiterhin erleichtert das praktische
Nichtvorhandensein einer Anfärbung der Lymphozyten mit dem
Farbstoff die Identifizierung der Lymphozyten.
- 66 -
Monozyten zeigen eine besonders intensive Kernanfärbungsreaktion,
desgleichen eine zytoplasmatische Anfärbung. Obgleich der Farbstoff selbst in Lösung blau ist und
einen einzigen Absorptionspeak bei 616 nm (vgl. Spektralkurve
4) aufweist, werden die Kerne der Monozyten tief purpurfarben angefärbt und das Zytoplasma der Monozyten
wird blaugün bis tief grün angefärbt. Das Zytoplasma der Monozyten enthält grüne gefärbte faserförmige Strukturen,
die auf einfache Weise mit der Vitalanfärbungstechnik identifizierbar sind. Diese Strukturen dürften den ähnlichen
laminar fadenförmigen Strukturen, die bei ultrastrukturellen Untersuchungen der menschlichen Monozyten beobachtet
werden, analog sein. Da sie bei keinem andern Typ von normalen menschlichen Leukozyten gefunden worden sind,
können die grünen faserförmigen Strukturen auch dazu benutzt werden, um Monozyten von anderen Arten von Leukozyten zu
unterscheiden.
Verglichen mit den konventionellen zytochemischen Anfärbungen
zur Identifizierung von Monozyten, Neutrophilen, Leukozyten,
Eosinophilen und Basophilen weist die Vitalanfärbung der peripheralen Blutleukozyten mit Nachtblau einige Vorteile
auf. Sie ist vorteilhaft, weil sie schnell ist und weniger als zwei Minuten bis zur maximalen Farbentwicklung benötigt.
Sie ist auch vorteilhaft, weil sie den Einsatz synthetischer Substrate und von komplexen Azofarbstoffen
und Kupplern, die bei den konventionellen zytochemischen Verfahren verwendet werden, vermeidet. Die zytochemischen
Verfahren des Standes der Technik sind schwer zu interpretieren, weil eine nicht-spezifische Ausfällung von
Farbreagenzien, eine Verschlechterung der Substrate erfolgt und eine verwickelte Anpassung des pH und des Gehalts
metallischer Ionen erforderlich ist.
Die vorstehende supravitale Anfärbungstechnik unter Verwendung
lebender Blutzellen und deren Differentialaffinität für die supravitale Anfärbung dieser Zellen mit
Nachtblau vermeidet Artefakte, die bei konventionellen Fixiermitteln häufig auftreten. Es ist darauf hinzuweisen,
daß die Vitalanfärbungstechnik, die hier geschildert wird, eine genauere Beobachtung der zellulären Lokalisation des
Farbstoffs (z. B. Lyosome, fibrilläre Strukturen, nukleares Chromatin) ermöglicht, als es bisher bei herkömmlichen
Farbstoffen der Fall war. Mitzunehmender Erfahrung und
Verbesserungen in der automatisierten Technologie der DifferentialblutZeilenzählung dürfte die supravitale Anfärbung
der peripheralen Blutleukozyten mit Nachtblau ein wichtiger Beitrag zur Zytochemie von Blut und von Knochenmarkzellen
darstellen.
Nachtblau hat die folgende chemische Formel:
IQ"]
C»H41N,Cl
Molekulargewicht 576 Gewicht des Kations 541
BEISPIEL 5
(Pflaumenecht - Spektralkurve 5)
(Pflaumenecht - Spektralkurve 5)
Ein Tropfen einer l%igen wässrigen Lösung von Pflaumenecht-Farbstoff
(das auch als Galloblau E bekannt ist) (Spektralkurve 5), die vor ihrer Verwendung frisch hergestellt
worden ist, wurde zu fünf Tropfen einer Lederhautleukozytensuspension (5 χ IO ml/Endkonzentration) gegeben, die aus
60 ml heparinisiertem venösem Blut von jedem von zehn
normalen Probanden hergestellt worden ist. In einer getrennten Versuchsserie wurde venöses Gesamtblut anstelle
von Lederhaut verwendet. Die Temperatur der Blutprobe und des Farbstoffs wurde auf etwa 37° C (Körpertemperatur)
gehalten, wobei vorhergegangene Versuche gezeigt haben, daß der Farbstoff zwischen etwa 21° und etwa 40 C wirksam
ist.
Nach etwa zwei Minuten war das Nukleoplasma der Monozyten intensiv purpurfarben angefärbt, insbesondere die Bereiche
des Heterochromatins. Das Zytoplasma der Monozyten sah purpurfarben aus. Die Kerne der Lymphozyten waren
sehr schwach lavendelfarben angefärbt (wenn überhaupt). Die polymorphonuklearen Leukozyten zeigten braune Körner, die
Eosinophilen grüne Körner und die Basophilen wurden durch purpurfarbene Körner identifiziert. Die Erytrozyten und
die Plättchen zeigten keine sichtbare Anfärbung.
Es wurde eine unerwartete neue Anwendung für einen obskuren
Farbstoff gefunden, der bisher hauptsächlich in der Textilfärberei verwendet wurde. Die Anfärbung der Kerne
und des Zytoplasmas erfolgte rasch und erlaubte eine einfache Unterscheidung zwischen vier Klassen von Leukozyten,
die den Farbstoff annahmen, sowie eines restlichen Mitglieds
der Gruppe der weißen Zellen, der Lymphozyten, die sich
einer metachromatischen Anfärbung dieses basischen quaternären kationischen Farbstoffs widersetzten, der
folgende Strukturformel aufweist:
Pflaumenecht
N COOCH, ° OH
Molekulargewicht 350, 761
BEISPIEL 6
(Hofmanns Violett - Spektralkureve 6)
(Hofmanns Violett - Spektralkureve 6)
Es wurde eine Serie von 60 ml heparinisierten venösen Blutproben eines jeden von zehn normalen Probanden benutzt,
um einen Satz von IO χ 75 mm Reagenzgläser mit Proben, die Lederhautleukozyten enthielten,zu präparieren,
sowie einen Satz, der Gesamtblut (fünf Tropfen) enthielt.
Es wurde eine Lösung, die 1% Hofmanns Violett-enthielt, einen
basischen metachromatischen quaternären kationischen Farbstoff mit der "Colour Index"-Nummer CI4253O, hergestellt.
Es ist davon auszugehen, daß die nachstehende Strukturformel Hofmanns Violett wiedergibt. Die angegebene
Spektralkurve stellt jedoch einen "Fingerabdruck" des Farbstoffs dar und diese soll im Zweifel gelten, wenn
hier dieser Name benutzt wird.
Es ist davon auszugehen, daß Hofmanns Violett die nachstehende
Strukturformel besitzt. Die Bedeutung der Zahl und die Auswirkung der Alkyl-(Methyl- und Äthyl-)Substituenten
wurde bisher nicht untersucht.
ία"]
CH3
Molekulargewicht 576; Gewicht des Kations
Es wurde ein Tropfen einer l%igen wässrigen frisch hergestellten
Lösung des basischen metachromatischen kationischen
Farbstoffs, der durch die Spektralkurve 6 wiedergegeben wird, in jedes der Reagenzgläser bei der Temperatur des
normalen Blutes (37° C) gegeben. Es wurden Tropfen der Proben als nasse Aufbringung unter dem Lichtmikroskop in
Abständen von einer Minute bis zu 15 Minuten nach der Zugabe des Farbstoffs zu der Blutprobe untersucht.
Die Monozyten zeigten eine intensive purpurfarbene Anfärbung des Kerns und des Zytoplasmas, wobei die Körner
rot angefärbt waren. Nach zwei Minuten waren sämtliche peripheralen Blutleukozyten mit Ausnahme der Lymphozyten
spektral differenziert. Die Neutrophilen zeigten grüne
Körner, die Eosinophilen purpurfarbene Körner und die
Basophilen rote Körner, während die Lymphozyten praktisch nicht angefärbt wurden und die Monozyten durch einen purpurfarbenen
Kern und rote Körner gekennzeichnet waren. Die Metachromasie des Farbstoffs trat deutlich hervor. Der
Einsatz der vorstehend angegebenen supravitalen Anfärbung verringerte einige der Probleme, die bei der Fixierung
auftreten, sowie durch den Einsatz synthetischer Substrate wie durch verwickelte Zwischenreaktionen zwischen den Produkten
der enzymatischen Katalyse und nicht stabilen Azofarbstoffen.
Durch die Verwendung der normalen Lichtmikroskopie , die durch die metachromatischen Eigenschaften dieses
spezifischen Farbstoffs möglich'ist, neben den anderen Farbstoffen,
die, wie hier ausgeführt, eine ausserordentliche
Metachromasie bei der Differenzierung der vorstehend erwähnten Leukozyten zeigen, dürfte der Einsatz automatischer Differentialleukozytenzähleinrichtungen
leichter möglich sein.
BEISPIEL 7
(Basisch Orange 21 - Spektralkurve 7)
(Basisch Orange 21 - Spektralkurve 7)
Es wurde eine Serie von Methin- und Polymethinfarbstoffen,
die chemisch spezifisch identifiziert wurde, in einer Konzentration von 1% in einem wässrigen Medium hergestellt.
Von dieser großen Gruppe erwies sich nur ein einziger unter den basisch quaternären kationischen Farbstoffen als
metachromatisch. Dieser einzige metachromatische Farbstoff färbte die Körner der Eosinophilen (braun), Basophile
(rot) und Monozyten (zytoplasmische Körner orange), so daß sich spektraldifferenzierte Mitglieder der Leukozytengruppe
ergaben. Sehr bemerkenswert ist, daß festgestellt wurde, daß die Differentxalanfärbung sowohl der reifen wie der
nicht reifen Neutrophile spezifischer war als bei irgendeinem anderen Farbstoff, der die metachromatische Eigenschaft
des differentiellen Anfärbens einer Vielzahl von Leukozyten besitzt. Es. stellte sich heraus, daß die reifen Neutrophilen
durch dunkelgelbe Körner spektral identifizierbar waren, während die unreifen Körner durch ihre orangefarbene Spektralreflexion
identifiziarbarwaren. Lediglich die Lymphozyten
zeigten keine Absorption des Farbstoffs, d. h. sie wurden nicht in Form eines identifizierbaren Spektrums angefärbt.
In Kombination mit Borrel-Blau waren jedoch sämtliehe
fünf spezifischen Leukozyten spektralidentifizierbar
(vgl. Tabelle III).
Der Polymethinfarbstoff stellt einen basischen quaternären
kationischen metachromatischen Farbstoff dar, der die
Spektralkurve 7 aufweist. Der Farbstoff wurde spezifisch als Basisch Orange 21 identifiziert (ebenso als Albright-Orange
und Astrazon-Orange G (200) bekannt). Die chemische Struktur ist nachstehend wiedergegeben, wobei er weiterhin
als CI 48035 identifiziert wird.
Wie in Tabelle III angegeben, hat sich herausgestellt, daß Kombinationen von Carbocyanin K-5 und Basisch Orange
21 eine verbesserte Spektraldifferenzierung bei der Unterscheidung
und der Identifizierung zur Aufzählung der Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen und Monozyten einer
einzigen Blutprobe aufweisen. Die Monozytenbestimmung erfolgt erheblich genauer als bei Verwendung eines anderen
Farbstoffs allein, was einen synergetischen Effekt andeutet .
Basisch Orange 21
CI 48035
CI 48035
CH,
Basisch Rot 13 - Spektralkurve 8 - CI 48015 Basisch Violett 16 - Spektralkurve 9 - CI 48013
Es wurden 22 im Handel erhältliche Farbstoffe überprüft. Von diesen erwies sich lediglich einer als herausragend
metachromatisch. Dies ist Basisch Orange 21 (Spektralkurve 7) des Beispiels 7. Zwei weitere dieser Serie erwiesen
sich als sehr ungewöhnlich, da sie, wie Carbocyanin K-5 w ίο des Beispiels 10 (Spektralkurve 10), lediglich Monozyten
spezifisch anfärbten, und zwar sofort.
Diese beiden letzteren Farbstoffe sind, wie sämtliche für diese Erfindung geeignete Farbstoffe, deren Struktur
bekannt ist, basische quaternäre, kationische organische Farbstoffe, die in der Lage sind, Leukozyten anzufärben,
wobei diese Einzelgruppe nur Monozyten spezifisch anfärbt. Die zuletzt genannten beiden Farbstoffe sind vorstehend
identifiziert.
Zehn mutmaßlich normale Personen spendeten venöse Blutproben,
jede Probe wurde in Heparin gezogen, als Gesamtblut verwendet und als Lederhautsuspension ohne Fixierung
präpariert. Es wurden wässrige Lösungen mit einer Konzentration von etwa 1 X aus jedem der vorstehend angegebenen
reinen Farbstoffe frisch in destilliertem Wasser hergestellt und filtriert. Fünf Tropfen des Gesamtblutes oder
der leukozytenreichen Suspension in zwei aufeinanderfolgenden Serien von Blutproben jedes der zehn Patienten
wurde mit einem Tropfen der Basisch Rot 13-Farbstofflösung
versetzt, wobei in der zweiten Serie die Basisch Violett 16-Farbstofflösung
gewählt wurde. Bei Versuchen in der ersten und der zweiten Serie (mit beiden vorstehend angegebenen
Farbstoffen) wurden lediglich die Monozyten sofort angefärbt. Im Falle von Basisch Rot wurde sowohl der Kern wie
das Zytoplasma rot angefärbt. Bei der Basisch Violett 16-Serie war der Kern rosafarbener und das Zytoplasma wurde
ebenfalls allgemein hinsichtlich der Farbe so klassifiziert.
Obgleich die Farben spektral unterschiedlich aussahen, war kein Gerät in der Lage, genaue Tristimulus-Werte zu
liefern. Obgleich die Anfärbung der Monozyten wiederum einzigartig war, wie mit Carbocyanin K-5 des Beispiels 10,
gab jeder der drei Farbstoffe bei der Anfärbung ein ausreichendes Farbdifferential, so daß mit dem Auge festgestellt
werden konnte, daß Unterschiede bestanden (Tabelle II).
Diese drei Farbstoffe wurden gleichfalls in Kombinationen mit den Hauptfarbstoffen der Tabelle I verwendet, wie
in Tabelle III angegeben.
Es wurde beobachtet, daß, obgleich ein einziger reiner Farbstoff (wie in Tabelle I) ein ausreichend unterschiedliches
Spektralansprechen zeigt, um jede der Leukozytenarten eindeutig identifizieren zu können, einige Kombinationen,
insbesondere mit diesen drei Farbstoffen, nämlich Carbocyanin K-5, Basisch Rot 13 und Basisch Violett 16, zu einem beobachteten
Synergismus bezüglich der Farbintensität in der Lage waren.
Basisch Rot 13 hat die nachstehende chemische Struktur:
Basisch Rot 13 CI 48O15
CH2CH2CI
C2H5
Cl
Basisch Violett 16 hat die nachstehende chemische Struktur:
Basisch Violett 16 CI 48013
5iJ__c==c_
-C2H5
C2H5
Cl
Aus der US-PS 2 179 895 gehen Farbstoffe hervor,""die der
Methinserie zugerechnet werden, einschließlich Basisch Rot 13. Dies ist auch als Genacyl Pink G, Astrazon Rose
FG, Astrazon Pink FG, Basisch Rosa 2S, kationisches Rosa
usw. bekannt.
Andere Namen für Basisch Violett 16 sind: Astrazon Red Violet 3R, Astraviolet 3R, Sevron brillant red 2-B, usw.
BEISPIEL 9 Toluylen-Blau - Spektralkurve 11
Aus Toluylen-Blau, das durch Kondensation von m-Toluylendiamin
mit p-Nitroso-dimethylanilin-hydrochlorid hergestellt
worden war, wurde eine l%ige wässrige Lösung hergestellt, die, wie bei den vorstehenden Beispielen, filtriert wurde.
Das venöse Blut jedes von zehn normalen Probanden wurde in zwei Serien von Blutproben untersucht, wie in den vorstehenden
Beispielen. Aus einer Serie wurde eine Lederhautleukozytensuspension hergestellt. Die zweite Serie
wurde als venöses Gesamtblut gehandhabt. Die Proben wurden in einer Wärmebox bei etwa 37° C aufbewahrt.
In der Reihenfolge ihrer Untersuchung wurde jeder der Proben ein Tropfen der Farbstofflösung zugesetzt. In jedem der
vorstehend angegebenen Fälle wurde die den Farbstoff enthaltende Probe lichtmikroskopisch untersucht, was das allgemeine
Verfahren bei der manuellen Untersuchung von Leukozyten darstellt. In allen Fällen entwickelten innerhalb
von fünf Minuten nach dem Zusatz des wässrigen Farbstoffs und ohne Verwendung irgendwelcher Fixiermittel, wie Methylalkohol,
Formalin usw., bei der Darstellung der Blutproben die Neutrophilen blaue Kerne und gelbe Körner, während
sich die Eosinophilen durch purpurfarbene Körner unterschieden, die Basophilen rote Körner entwickelten, die
Lymphozyten grüne Körner zeigten und die Monozyten einen purpurfarbenen Kern und ein purpurfarbenes Zytoplasma entwickelten.
Jede Art der weißen Blutzellen wurde durch die Verwendung eines einzigen reinen metachromatischen Farbstoffs
voneinander differenziert, der durch seine kationische Natur ein quaternäres Stickstoffatom und ein Halogenanion
gekennzeichnet ist. Obgleich es bereits bekannt ist, daß
bestimmte Farben biologische Proben mit einer anderen Farbe als der des Farbstoffs anfärben (Metachromasie),
ist bisher nicht beschrieben worden, daß ein einziger basischer Farbstoff ohne äußere pH-Einstellung und andere
Präparationen dazu benutzt werden kann, Leukozyten bei Körpertemperatur in einer wässrigen Umgebung anzufärben,
und zwar ohne Fixierung, um durch Spektralunterschiede jede der fünf individuellen Leukozytenarten zu unterscheiden.
Toluylen-Blau weist folgende allgemeine Strukturformel
auf:
15 ™ W ,. =N(CH3)2
Molekulargewicht 291; Gewicht des Kations
(1,l1-Diethyl-2/21-cyaninbromid)
Spektralkurve 10
18 Carbocyaninfarbstoffe, die die chemische Struktur und die abgestuften Redoxpotentiale aufweisen, die in "Science"
April 1974, und "Scientific American",·'Mai 1974 (Kodak-Anzeige)
angegeben sind, wurden darauf untersucht, ob sie sich bei vitalen leukämischen Blutuntersuchungen mit
Vorteil eignen.
TEIL I
Zweifache Testserien, nämlich Proben von leukozytenreichem Plasma und Gesamtblut von normalen Proben und von Patienten
mit akuter Leukämie, wurden mit der gesamten Serie der vorstehend genannten 18 Farbstoffe abgestuften Redoxpotentials
angefärbt. Ein Tropfen einer l%igen wässrigen Lösung des reinen Farbstoffs wurde unter leichter Bewegung mit fünf
Tropfen der leukozytenhaltigen heparinisierten Blutproben vermischt.
* 1 1
Lediglich das vorstehend angegebene 1,1 -Diäthyl-2,2 cyaninbromid
(das hier Carbocyanin K-5 genannt wird) ergab eine sofortige starke spektrale Absorption oder Anfärbung
der Leukozyten und dann eine spezifische der Monozyten. Eine zunehmende Rotanfärbung des Kerns dauerte über eine
halbe Stunde an. Der Grund für diese eigenartige Selektivität dieses Farbstoffs ausschließlich hinsichtlich des
Kerns der Monozyten ist nicht völlig verständlich. Er stellt jedoch einen basischen quaternären kationischen
Farbstoff mit einer einzigartigen Eigenschaft dar.
TEIL II %
Supravitale Blutproben der nachstehenden normalen Personen und Patienten, die eine unbehandelte Leukämie besaßen,
wurden einer Anfärbung mit Carbocyanin K-5 unterzogen. Es wurden Blutproben sowohl von schwerkraftsedimentiertem
leukozytenreichem Plasma wie von venösem Gesamtblut einer Anfärbung unterzogen. Es konnte kein signifikanter Unterschied
festgestellt werden, wenn die Proben des Gesamtblutes mit den Proben des leukozytenreichen Plasmas bei
den Testserien verglichen wurden.
20 normale Personen
20 normale Personen
8 Personen - akute lymphoplastische Leukämie 6 Personen - akute myeloplastische Leukämie
10 Personen - akute monozytische Leukämie
In allen Fällen wurden die Blutproben routinemäßigen zytochemischen
Anfärbungen nach dem Stand der Technik unterworfen, wobei spezifische Esterase, nicht-spezifische
Esterase mit Fluoridinhibierung, PAS (periodische Säure Schiff) und Myeloperoxidase eingesetzt wurden, um die
morphologische Bestimmung dieser leukämischen Arten zu bestätigen. Alle Fälle erwiesen sich als typisch, und zwar
sowohl morphologisch wie zytochemisch.
Ein Tropfen (l%ige wässrige Lösung) des ausgewählten Cyaninfarbstoffes
wurde zu fünf Tropfen des Gesamtblutes in einem 10 χ 75 mm Reagenzglas der Vitalblutprobe gegeben.
Die Zellenkonzentration wurde auf etwa 5 χ IO Zellen pro ml eingestellt. Der pH war 6,2. Aufgrund laufender zytochemischer
Versuche zur Unterscheidung der Zellenarten wurden diese Zellen als 1) polymorphonukleare Leukozyten
2) Lymphozyten, 3) Eosinophile 4) Basophile und 5) Monozyten ermittelt, desgleichen durch die Wrights-Anfärbung.
Etwa eine Minute nach der Zugabe des Farbstoffs zu den
Proben des normalen Blutes wurden 5 bis 20 orangefarbene stäbchenförmige Strukturen in dem Zytoplasma der Monozyten
und Lymphozyten festgestellt. Innerhalb der nächsten Minuten färbte sich der Kern der normalen und der leukämisehen
Leukozyten zunächst blaßrosa. Innerhalb IO Minuten wurde der Kern tief rosa und schliesslich hellorangerot mit
etwas Lumineszenz (Glühlichtbeleuchtung).Unter einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop
zeigten der Kern und das Zytoplasma der normalen Monozyten Fluoreszenz.
Die Kerne der übrigen normalen peripheralen Blutleukozyten färbten sich, wenn überhaupt, nur schwach an. Die
Körner der anderen Leukozyten, nämlich der polymorphonuklearen
Eosinophilen und Basophilen, wurden mit einem schwachen
unterscheidbaren Blaßgelb bis Grüngelb angefärbt. Die Erytrozyten zeigten keine sichtbare Anfärbung.
Die Blutproben der Patienten mit akuter lymphoplastischer Leukämie zeigten lediglich eine mitochondriale Anfärbung,
desgleichen die leukämischen Myeloplasten der Patienten mit myeloplastischer Leukämie. Patienten mit akuter mono-,
zytischer Leukämie zeigten dagegen eine rotorangene Kernanfärbung und eine rote Kernfluoreszenz nach fünf bis zehn
Minuten, ebenso wie die normalen Monozyten.
Die vorstehenden Beobachtungen und andere zeigen deutlich die ungewöhnliche charakterisitische Affinität dieses
einzigen spezifischen Carbocyaninfarbstoffs hinsichtlich
der Kernsubstanzen der Monozyten.
Aus Analysen der Humanuntersuchungen geht hervor, daß die automatischen Differentialzellenzähler nützlicher und
umfangreicher eingesetzt werden können, um mit Vorteil die
vorstehende Anfärbungstechnik zum Differenzieren, Aufzählen
und Klassifizieren verschiedener Leukozyten anzuwenden, und zwar, wie hier, insbesondere der Monozyten,
mittels eines einzigen wässrigen Farbstoffs in Kontakt mit einer supravitalen Blutprobe, ohne vorherige Fixierung
und Denaturierung, um Artefakte einzuführen.
Der weitere experimentelle Einsatz von Carbocyanin K-5 in Kombination mit metachromatischen Farbstoffen dieser
Erfindung zeigte besonders ungewöhnliche Ergebnisse bei einer 1:1-Kombination mit Basisch Orange 21 (Spektralkurve
7). Bei Einsatz der vorstehend genannten Kombination wurden die weißen Blutzellenleukozyten in jedem Falle schärfer und
intensiver mit einer besseren spektralen Differenzierung angefärbt, als dies mit Basisch Orange 21 allein der Fall
war, jedoch mit im wesentlichen der gleichen sichtbaren Farbe. Es wurden lediglich Lymphozyten angefärbt. Dieses
Farbstoffgemisch stellt eine hervorragende Kombination zur
deutlichen Differenzierung und Aufzählung von Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen und Monozyten dar.
Carbocyanin K-5 wurde ebenfalls in Kombination mit Rhodanil-Blau
eingesetzt. Der Vorteil war deutlich und erkennbar, jedoch war die synergetische Qualität geringer als jene,
die mit der Basisch Orange 21-Carbocyanin K-5-Koinbination festgestellt wurde (vgl. Tabelle III).
Die chemische Struktur von Carbocyanin K-5 ist nachstehend wiedergegeben. Das Chlorid kann irgendein anderes Halogen
sein.
C\"
In der vorstehenden Beschreibung und den Beispielen ist die Bedeutung der Vorteile der Erfindung im Hinblick auf
automatische Differentialleukozytencomputer hervorgehoben. Es ist kein serienmäßiges Gerät bekannt, das gegenwärtig
ohne Modifizierung in der Lage wäre, die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, das manuell durchgeführt wurde,
zu verwirklichen. Die Fachleute auf dem Gebiet der medizinischen Technologie wissen jedoch um die Bedeutung einer
raschen, genauen Bestimmung der verschiedenen Differentialleukozytenzählungen
zu verschiedenen Zwecken. Es ist geschätzt worden, daß in den USA jeden Tag eine halbe Million
Differentialleukozytenzählungen durchgeführt werden, die meisten manuell mit jährlichen Kosten von 750 Millionen
US-Dollar.
Diese Zählungen, ob manuell oder automatisch, stellen ein
grundlegendes Erfordernis bei der Identifizierung, Spektraldifferenzierung,
Aufzählung und ein diagnostisches Hilfsmittel
in der Praxis der Medizin dar. Der vorstehende umrissene grundlegende Fortschritt wird zweifellos zu Fortschritten
bei automatischen Zusatzeinrichtungen führen, wie angegeben.
Blutzählungen, ob manuell oder automatisch, wie sie hier beschrieben
werden, sind lebenswichtige Hilfsmittel bei der Untersuchung und der Bestimmung der Natur einer Krankheit.
Fieber unbekannten Ursprungs, ob virulent oder als nicht pyrogene Infektion, Pyrogene, die den Blinddarm, die
Gallenblase, die Eileiter betreffen, die Prognose bei Patienten mit verschiedenen Krankheiten unterschiedlicher
Stadien, maligne Stadien, einschließlich der Hodgkinschen Krankheit, die Lungenkrankheit, die Überwachung der Behandlung
von Patienten mit adrenokortischen Steroiden, un-
terschiedliche Arten akuter und chronischer Leukämie, die Differenzierung der Diagnose zwischen antiseptischer
Knocheninfektion und Ostiomyelitis, bakterielle Infektionen und viele andere medizinische Fragen werden bei der Diagnose,
Prognose und der Behandlung durch eine genaue Leukozytenzählung, Analyse und zytologisches Studium erleichtert.
Die klinischen Interpretationen und Schlußfolgerungen, die aus angefärbten Leukozytenzellen gezogen werden, ob von venösem
Blut, Knochenmark, Urin oder anderen Quellen vitalen Blutes, einschließlich dunkler Blutproben, können angewendet
werden, indem die Methoden benutzt werden, die der vorstehend genannten Aufzählung eigen sind.
Die Bezeichnung "metachromatisch", wie sie hier benutzt wird, bezieht sich nicht nur auf die außergewöhnliche und sonderbare
Eigenschaft der beschriebenen Farbstoffe, sondern auch auf die Eigenschaft der verschiedenen Bestandteile, beispielsweise
des Kerns und des Zytoplasmas, jedes der individuellen Arten der Leukozyten, die metachromatisch in einer
einem Synergismus ähnlichen Weise reagieren, um eine Differenzierung hinsichtlich des spektralen Ansprechens zu erzeugen,
die zu den beschriebenen zytochemisch möglichen Fortschritten führt. Im wesentlichen absorbiert (oder absorbiert nicht)
jede weiße Blutzellenart einen einzigen metachromatischen Farbstoff in etwas ungewöhnlicher und einzigartiger Art und
Weise, so daß jede Zelle mit absorbierten Farbstoff ein individuelles und unterschiedliches Lichtspektrum wiedergibt
.
Leerseite
Claims (1)
- Verfahren und Zusammensetzung zur Bestimmung einzelner Leukozyten durch metachromatische FarbstoffdifferentialabsorptionPatentansprüche:Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse, bei dem eine optische Differenzierung, eine Identifikation, ein Vergleich und eine Aufzählung der Leukozyten, einschließlich polymorphonuklearer Leukozyten (Neutrophile), Eosinophile, Basophile, Lymphozyten, und Monozyten, individuell spektraldeterminant durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine supravitale Blutprobe in einem Zustand ohne Fixiermittel durch Kontakt in einer wässrigen Umgebung mit wenigstens einem wässrigen quaternären kationischen organischen Farbstoff angefärbt wird,der in der Lage ist, Leukozyten bei Bluttemperatur (37° C) anzufärben, wobei die Anfärbung der einzelnen vorstehend genannten Leukozytenarten durch Absorption oder Nicht-Absorption des Farbstoffs durch deren ZeIlstruktur innerhalb des Lichtspektrums differenziert und die chromatische Lichtreflektion jeder einzelnen Farbstoff absorbierenden Leukozytenart sich in ihrer Spektralreflektion in einer Größenordnung unterscheidet, die ausreicht, um jede der auf den Farbstoff ansprechenden Arten zu identifizieren, zu vergleichen und aufzuzählen.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nur ein einziger reiner basischer quaternärer metachromatischer kationischer organischer bei Bluttemperatur wirksamer Farbstoff angewendet wird, wodurch jede der fünf genannten Leukozyten mit einer spektral differenzierenden und identifizierenden chromatischen Lichtreflektion im Bereich des Licht-2O spektrums angefärbt wird.3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der einzige reine quaternäre kationische Farbstoff aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Greifswalder Blau (Spektralkurve 1), Borrel-Blau (Spektralkurve 2), Rhodanil-Blau (Spektralkurve 3) und Toluylen-Blau (Spektralkurve 11) besteht.4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -zeichnet, daß der einzige ausgewählte basische quaternäre metachromatisehe kationische Farbstoff spektral im wesentlichen so anspricht wie Greifswalder~ 3 ~ 'NAL-i-.^LFiEiCHBlau (Spektralkurve 1), Toluylen-Blau (Spektralkurve 11), Borrel-Blau (Spektralkurve 2), Rhodanil-Blau (Spektralkurve 3), Nachtblau (Spektralkurve 4),Pflaumenecht (Spektralkurve 5), Hofmann's Violett (Spektralkurve 6) und Basisch Orange Nr. 21 (Spektralkurve 7).5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η nzeichnet, daß mehr als ein reiner basischer quaternärer kationischer organischer bei Bluttemperatur (37 C) ansprechender Farbstoff in wässriger Umgebungverwendet wird und die reinen Farbstoffe die Kombination von Nachtblau (Spektralkurve 4) und Borrel-Blau (Spektralkurve 2) umfassen.6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als ein einziger reiner Farbstoff in einer Kombination verwendet wird, die Borell-Blau (Spektralkurve 2) und Carbocyanin K-5 (Spektralkurve lo) umfaßt.t7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η - *"*** zeichnet, daß die in Kombination verwendetenFarbstoffe Rhodanil-Blau (Spektralkurve 3) und Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10) umfassen.
258. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als ein einziger reiner Farbstoff in einer Kombination verwendet wird, die Basisch Orange (Spektralkurve 7) und Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 1O) umfaßt.9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß mehr als ein einziger reinerNACh 3 f:HEOHTFarbstoff in einer Kombination verwendet wird, die Pflaumenecht (Spektralkurve 5) und Borrel-Blau (Spektralkurve 2) umfaßt.lo. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als ein einziger reiner basischer quaternärer metachromatischer kationischer organischer bei Bluttemperatur (37° C) wirksamer Farbstoff in wässriger Umgebung verwendet wird, wobei ein erster Farbstoff, der aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Toluylen-Blau (Spektralkurve 11), Borrel-Blau (Spektralkurve 2), Rhodanil-Blau (Spektralkurve 3), Nachtblau (Spektralkurve 4), Pflaumenecht (Spektralkurve 5), Hofmanns Violett (Spektralkurve 6) und Basisch Orange Nr. 21 (Spektralkurve 10) und aus Kombinationen davon besteht und ein zweiter reiner basischer quaternärer kationischer organischer bei Bluttemperatur (37 C) wirksamer Farbstoff, der spezifisch für Monozyten ist und aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Basisch Rot 13 (Spektralkurve 8), Basisch Violett 16 (Spektralkurve 9) und Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10) in einer wirksamen Leukozytenanfärbungskombination verwendet werden.11. Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse, bei dem eine optische Differenzierung, ein Vergleich und eine Aufzählung der Leukozyten individuell spektraldeterminant durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzige supravitale Blutprobe in einem Zustand ohne Fixiermittel durch Kontakt der Blutprobe in einer wässrigen Umgebung mit Borrel-Blau (Spektralkurve 2) unterhalb normaler Bluttemperatur (37° C) jedoch bei nicht weniger als 21° C-δ-angefärbt wird und diese analytischen Bestimmungen an den Leukozyten durchgeführt werden, die dabei selektiv und einzigartig angefärbt werden, falls dies erforderlich ist.
512. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der einzige basische quaternäre metachromatische Farbstoff Borrel-Blau (Spektralkurve 2) ist.13. Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse von Monozyten, die mittels eines basischen quaternären kationischen organischen Farbstoffs, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Basisch Rot 13 (Spektralkurve 8), Basisch Violett 16 (Spektralkurve 9) und Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10) und Gemischen davon besteht, differentiell angefärbt werden, dadurch gekennzei chnet, daß wenigstens eine supravitale Blutprobe in einem Zustand ohne Fixiermittel durch Kontakt in einer wässrigen Umgebung bei einer Temperatur zwischen etwa 21° C und 40° C nach der vorstehend angegebenen Farbstoffauswahl angefärbt wird, wobei die Monozyten selektiv angefärbt und die optische Differenzierung, Vergleich, Aufzählung und Untersuchung der gefärbten Monozyten durchgeführt werden, sofern es erforderlich ist.14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Differenzierung und Aufzählung der normalen weißen Blutzellen mit einer physikalischen auf das Lichtspektrum ansprechenden Einrichtung durchgeführt wird.|NACh-.u:,..:;CHT15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Differenzierung, Identifizierung und Aufzählung sowie die Krankheitsdiagnose der aufgeführten weißen Blutzellenelemente erforderlichenfalls durch Humanbeobachtung durchgeführt wird.16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß einer der wesentlichen organischen Farbstoffe Greifswalder Blau (Spektralkurve 1)10 ist.17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der organische Farbstoff aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Basisch Orange Nr. 21 (Spektralkurve 7), Hofmanns Violett (Spektralkurve 6), Pflaumenecht (Spektralkurve 5) und Nachtblau (Spektralkurve 4) sowie Kombinationen davon besteht, wobei alle Leukozytenzellen durch metachromatische Anfärbung optisch differenziert werden, mit20 Ausnahme der Lymphozyten.18. Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse, bei dem eine optische Differenzierung, ein Vergleich und eine Aufzählung von zwei ausgewählten und spezifischen Leukozyten erfolgt, nämlich Lymphozyten und Monozyten, welche in einer einzigen Blutprobenuntersuchung spektraldeterminant gemacht werden, dadurch gekennz ei chnet, daß eine einzige supravitale Blutprobe in einem Zustand ohne Fixiermittel durch Kontakt der Blutprobe in einer wässrigen Umgebung mit Borrel-Blau (Spektralkurve 2) in Kombination mit einem zweiten Farbstoff, der aus einer Gruppe ausgewähltwird, die aus Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10), Basisch Violett 16 (Spektralkurve 9) und Basisch Rot 13 (Spektralkurve 8) und Gemischen davon besteht, bei Umgebungstemperatur (21 bis 25° C) angefärbt wird. .19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η ζ ei chnet, daß eine einzige Blutprobe einer wässrigen Anfärbung durch Kontakt mit wenigstens/**■." einem wässrigen basischen quaternären metachromatischenkationischen organischen Farbstoff, der zur Anfärbung individueller Leukozyten, die in der Probe vorhanden sind, wirksam ist, metachromatisch bei Bluttemperatur (37° C) unterworfen wird, wobei die angefärbten Zellen einer Differenzierung und Aufzählung unterworfen werden mit einer Differenzierung durch Auswahl eines farbempfindlichen Filterteils mit einem einstellbaren Spektralbereich, der empfindlich gegenüber dem Spektrum ist, das von jeder der differentiell gefärbten weißen Blutzellen in der Probe reflektiert wird, und einer Zähleinrichtung, die durch Anregung durch reflektiertes Licht betätigt wird, wobei die Anzahl jeder der einzelnen Arten der Leukozyten, die in der untersuchten Probe vorhanden sind, unter und innerhalb eines vorgegebenen mikroskopischen Feldes differentiell25 gezählt wird.20. Zusammensetzung zur differentiellen Anfärbung, Identifizierung und Differenzierung von Leukozytenarten bei einer Temperatur zwischen etwa 21° C und 40° C, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Kombination von wenigstens zwei Farbstoffen umfaßt, wobei wenigstens einer davon ein Farbstoff ist, der aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus GreifswalderBlau (Spektralkurve 1), Borrel-Blau (Spektralkurve 2), Rhodanil-Blau (Spektralkurve 3), Toluylen-Blau (Spektralkurve 11), Nachtblau (Spektralkurve 4), Pflaumenecht (Spektralkurve 5), Hofmanns Violett (Spektralkurve 6), Basisch Orange Nr. 21 (Spektralkurve 7), Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10), Basisch Rot 13 (Spektralkurve 8) und Basisch Violett 16 (Spektralkurve 9) besteht.21. Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse, bei dem die Monozyten gegenüber den übrigen Leukozytenarten individuell spektraldeterminant gemacht werden, dadurch gekennz eichnet, daß wenigstens eine supravitale Blutprobe in einem Zustand ohne Fixiermittel in einer wässrigen Umgebung mit einem oder mehreren wässrigen! basischen quaternären kationischen organischen Farbstoffen angefärbt wird, der bzw. die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die aus Carbocyanin K-5 (Spektralkurve 10), Basisch Violett 16 (Spektralkurve 9) und Basisch Rot 13 (Spektralkurve 8) besteht .
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