DE3688613T2

DE3688613T2 - Polychelierende stoffe für abbildung- und spektralerhöhung (und spektrale verschiebung).

Info

Publication number: DE3688613T2
Application number: DE86907195T
Authority: DE
Inventors: David Ranney
Original assignee: Access Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Abeona Therapeutics Inc
Priority date: 1985-11-18
Filing date: 1986-11-18
Publication date: 1994-01-13
Anticipated expiration: 2006-11-19
Also published as: ATE90879T1; CA1280364C; EP0247156B1; DE3688613D1; JPH07110815B2; JPS63501798A; WO1987002893A1; EP0247156A1; AU6621586A; US5155215A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf bildverstärkende Mittel, Kontrastmittel oder spektralverschiebende Mittel zur Verstärkung von Gewebe- oder Organbildern oder Kernspektren, die mittels Ultraschallabbildung, Radioisotopabtastung oder NMR-Abbildung oder -Spektroskopie von lebenden Tieren erhalten werden.
Die bildliche Darstellung innerer Strukturen und Organe von Lebewesen ist seit dem ersten Einsatz der Röntgenstrahlung zu diesem Zweck ein wichtiger Aspekt der Medizin. Unter den in letzter Zeit für diese bildlichen Darstellungen entwickelten Verfahren sind solche, die ein Auf spüren der Teilchenstrahlung von im Inneren befindlichen Radioisotopen einschließen. Diese Radioisotope emittieren vorzugsweise Gammaquanten und sind allgemein Isotope metallischer Elemente. Ein generelles Problem bei der diagnostischen Anwendung dieser Gammaquanten emittierenden Radioisotope betrifft die Lokalisierung dieser Stoffe an besonders interessierenden Stellen, im Gegensatz zur zufälligen Verteilung und raschen Ausscheidung, z. B. durch die Niere. Ein anderes Problem dieser radioisotopvermittelten bildlichen Darstellungen betrifft die Optimierung der Kreislaufhalbwertszeit der Radioisotope, z. B. durch verhindern oder Verstärken ihrer Bindung an Serumproteine (Z.B. Albumin) oder durch vorherige Kupplung (Komplexierung) an polymere Träger oder rezeptorbindende Substanzen.
Eine zweite Klasse bildlicher Darstellungen des Körperinneren, die eine schnelle Verbreitung bei der klinischen Anwendung erfährt, ist die bildliche Darstellung durch Ultraschall. Sie beruht auf der Messung der Unterschiede der inneren Geschwindigkeiten (Reflektivität) gerichteter Hochfrequenzschallwellen. Es werden an den Grenzflächen zwischen Gewebe mit unterschiedlicher natürlicher Dichte und Ultraschallreflektivität Unterschiede in der Bildhelligkeit erzeugt. Zur Zeit besteht ein klinisches Problem in der Schwierigkeit, Schädigungen im Magen, Dick- und Dünndarm, in der Blase und den Hohlräumen des weiblichen Geschlechtsapparates sichtbar zu machen, was auf Ähnlichkeiten zwischen diesen Organen und den unmittelbar benachbarten Gewebe in Bezug auf die Ultraschallgeschwindigkeit zurückzuführen ist. Die diagnostische Einführung eines dichten, nichtradioaktiven metallischen Elements oder -Ions in ausreichender Konzentration kann die signifikanten Unterschiede in der Ultraschallreflektivität hervorrufen, die nötig sind, um andernfalls nicht erkennbare Tumore und entzündliche Verletzungen sichtbar zu machen.
In den letzten Jahren wurde gezeigt, daß bildliche Darstellungen der NMR-Intensität und -Ausbreitung ein drittes wichtiges Verfahren zur Abbildung innerer Strukturen und Organe von Lebewesen darstellen. Die klinische magnetische Resonanzabbildung (MRI) ist eine rasch anwachsende neue Form der bildlichen Gehirn- und Körperdarstellung. Die Niedrigfeld-(Protonen)-MRI ermittelt chemische Meßgrößen in der unmittelbaren Umgebung der Protonen in Körpergeweben (überwiegend Wasserprotonen, aufgrund ihrer relativen Häufigkeit). Veränderungen dieser Meßgrößen treten bei Krankheiten sehr früh auf und sind unabhängig von den physikalischen Dichten, die durch ionisierende Strahlung ermittelt werden. Im Gehirn und im zentralen Nervensystem ermöglichte die MRI die Erkennung von Tumoren in einem früheren klinischen Stadium und mit weniger Abbildungsartefakten als dies mit computerisierter Axialtomographie (CAT) möglich ist [Runge et al, (1983), Am. J. Radiol Vol. 141, S. 1209]. Unter optimalen Bedingungen liegt die Bildauflösung im Bereich unterhalb eines Millimeters.
Sieben Faktoren machen die Entwicklung nicht-toxischer MRI-bildverstärkender Mittel, die den für CAT erhältlichen Mitteln entsprechen, bedeutsam. 1. Sie erhöhen die Spezifität der MRI-Diagnose. 2. Kleine Schädigungen können schneller festgestellt werden. 3. Bildverstärkende Mittel verstärken Tumormassen anders als die umgebende Ödemflüssigkeit oder Abszesse. Dies erlaubt es, das Ausmaß und das Eindringen eines Tumors genauer zu bestimmen. Schädigungen mit infiltrierendem Wachstum (z. B. bestimmte metastatische Karzinome und Glioblastome) machen Kontrastmittel zur Unterscheidung von Tumor- und Ödemflüssigkeit notwendig [Felix et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol 2, S. 831]. 4. Bildverstärkende Mittel verbessern die Unterscheidung zwischen einem wiederkehrenden Tumor und dem Fasergewebe, das durch Operation oder Bestrahlung verursacht wird. 5. Bildverstärkende Mittel können die pro Abtastung erforderliche Zeit und gegebenenfalls die erforderliche Anzahl der Abtastungen je Untersuchung verringern. Dies erhöht den Umfang der Untersuchungen und mindert ihre Kosten. 6. Die bildliche Darstellung des Körpers hat eine erheblich geringere Auflösung (typischer weise 0,5-1,0 cm) und Empfindlichkeit (vermindertes Signal-Rauschverhältnis) als die bildliche Darstellung des Gehirns [Wesbey et al., (1983), Radiology V 149, S. 175].
Diese Unterschiede sind bedingt durch die größeren Ungleichmäßigkeiten des magnetischen Feldes; die größere Radiofrequenzspule; das Pulsieren von tiefen, bzw. flachen Kernen in unterschiedlichen Phasen; und Bewegungsartefakte, die durch Atmung, Herzsystole, Peristaltik des Verdauungstraktes und willkürliche Muskelbewegungen hervorgerufen werden; und 7. fortschrittliche (polymere und Mikrokugel-) Formen von Kontrastmitteln (siehe unten) scheinen zur optimalen Gewinnung und Auswertung von bildlichen Darstellungen des Blutflusses und der Gewebedurchblutung und verwandter spektraler (Phasen-) Information nötig zu sein.
Die diskreten Intensitäten eines zweidimensionalen, Fourrier-transformierten Bildes werden durch die folgende allgemeine Formel (für Spin-Echo-Pulssequenzen) beschrieben:
Intensität = N(H)·f (v)·exp(-TE/T2)·[1 - Exp.(TE- TR/T1)], wobei:
N(H) = Anzahl der Protonen in dem bestimmten Gewebevolumen (Spin-Dichte);
f(v) = eine Funktion der Protonengeschwindigkeit und des Anteils der sich bewegenden Protonen (z. B. durch den Blutstrom);
TE = Zeit zwischen dem Radiofrequenz-(RF)-Puls und der Messung des Signals (Spin-Echo);
TR = die Spanne zwischen der Wiederholung des RF- Pulses;
T1 = die Zeitspanne im Zusammenhang mit der Protonenenergieübertragungsgeschwindigkeit auf das umgebende chemische Umfeld (Spin-Gitter-Relaxation);
T2 = die Zeitspanne im Zusammenhang mit der Geschwindigkeit der Protonenenergieübertragung von einem Proton auf andere (Spin-Spinrelaxation).
Die Zeiten T1 und T2 haben entgegengesetzte Auswirkungen auf die Bildintensität. Die Intensität wird entweder durch Verkürzen von T1 oder Verlängern von T2 erhöht. Ein Gewebekontrast tritt natürlicherweise auf und steht mit Schwankungen der chemischen Umgebungen von Wasserprotonen (großer Beitrag) und Lipidprotonen (allgemein geringer Beitrag) im Zusammenhang. Chemische Mittel wurden dazu benutzt, um diesen natürlichen Kontrast zu verstärken. Klinisch am häufigsten wurde das paramagnetische Metallion Gadolinium (Gd³&spplus;) getestet [Runge et al., (1983), Am. J. Radiol Vol. 141, S. 1209 und Weinman et al., (1984), Am. J. Radiol Vol. 142, S. 619]. Obwohl Gadolinium sowohl T1, als auch T2 verkürzt, überwiegt bei den geringen Dosen, die für klinische Abbildungen verwendet werden, der T1- Effekt und das Bild wird heller. Die RF-Pulsabfolge kann auch so programmiert werden, daß sie T1-Änderungen verstärkt und solche, die auf T2 zurückzuführen sind, vermindert [Runge et al., (1983), Am. J. Radiol Vol. 141, S. 1209]. Somit kann durch Auswahl der geeignetsten Gd-Dosis und RF-Pulsabfolge eine "T1-gewichtete" Verstärkung erzielt werden.
Die Verkürzung der Protonenrelaxationszeiten durch Gd wird durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen zwischen seinen ungepaarten Elektronen und den benachbarten Wasserprotonen vermittelt. Die Wirksamkeit des magnetischen Dipols von Gd fällt als Funktion seiner Entfernung von diesen Protonen rasch ab (in der sechsten Potenz des Radius) [Brown, (1985), Mag. Res. Imag. Vol. 3, S. 3]. Folglich werden nur diejenigen Protönen wirkungsvoll relaxiert, denen es gelingt, die erste oder zweite Koordinationshülle des Gd während der Zeitspanne zwischen dem RF-Puls und der Signalmessung zu erreichen. Diese Zahl liegt im Bereich zwischen 10&sup5; und 10&sup6; Protonen/Sekunde [Brown, (1985), Mag. Res. Imag. Vol. 3, S. 3]. Da Gd die größte Zahl an ungepaarten Elektronen (sieben) in seinem 4f-Orbital besitzt, hat es den größten paramagnetischen Dipol (7,9 Bohr-Magnetonen) und übt von allen Elementen die größte paramagnetische Relaxationswirkung aus [Runge et al., (1983), Am. J. Radiol Vol. 141, S. 1209 und Weinman et al., (1984), Am. J. Radiol Vol. 142, S. 619]. Daher besitzt Gd von allen Elementen das größte Potential zur Bildverstärkung. Die freie Form des Gd ist jedoch ziemlich toxisch. Dies ist zum Teil eine Folge der Präzipitation aus Lösungen bei Körper-pH (in Form des Hydroxids). Um die Löslichkeit zu erhöhen und die Toxizität zu senken, wurde Gd chemisch mit kleinen organischen Molekülen cheliert. Bis heute ist Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) das zufriedenstellendste Cheliermittel in Bezug auf allgemeine Verwendbarkeit, Aktivität und Toxizität [Runge et al., (1983), Am. J. Radiol Vol. 141, S. 1209 und Weinman et al., (1984), Am. J. Radiol Vol. 142, S. 619]. Die erste Rezeptur dieses Cheliermittels, die in großem Umfang klinisch getestet wurde, wurde von der Schering AG - Berlex Imaging nach einer Patentanmeldung von Gries, Rosenberg und Weinmann [DE-OS-3129906 A1 (1981)] entwickelt. Sie besteht aus Gd-DTPA, das mit der organischen Base N-Methyl-D-Glucamin (Meglumin) pH-neutralisiert und stabilisiert wurde. Das Schering-Berlex-Mittel nähert sich dem Abschluß der klinischen Tests in der Phase III an ausgewählten Zentren über die gesamten Vereinigten Staaten und im Ausland. Die Ergebnisse vorläufiger Studien deuten darauf hin, daß fast alle menschlichen Hirntumore eine bedeutende Verstärkung erfahren [Felix et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 831 und K. Maravilla, Persönliche Mitteilung]. Diese schließen metastasierende Karzinome, Meningiome, Gliome, Adenome und Neurome ein. Nierentumore werden ebenfalls auf befriedigende Weise verstärkt [Lanaido et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 877 und Brasch et al., (1983) Am. J. Radiol. Vol. 141, S. 1019]. Die Schering-Berlex-Rezeptur soll voraussichtlich 1987 für die allgemeine klinische Anwendung verfügbar sein.
Trotz seiner zufriedenstellenden Relaxationswirkung und Toxizität, hat diese Zusammensetzung vier Hauptnachteile.
(1) Die Chelierung des Gd verringert deutlich seine Relaxationswirkung (um eine halbe Größenordnung). Der Grund dafür ist, daß die Cheliermittel fast alle inneren Koordinationsstellen des Gd, die mit dem stärksten Anteil des paramagnetischen Dipols übereinstimmen, besetzen [Koenig, (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 833 und Geraldes et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 860].
(2) Wie bei allen kleinen paramagnetischen Metall- Cheliermitteln verschlechtert sich die Relaxationswirkung von Gd-DTPA-Dimeglumin bei den hohen Radiofrequenzen, die in der Klinik zur bildlichen Protonendarstellung verwendet werden (typischerweise 15 MHZ) [Geraldes et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 860].
(3) Aufgrund seines geringen Molekulargewichts wird Gd-DTPA Dimeglumin sehr schnell aus dem Blutstrom (50% in 20 Minuten) und auch aus Gewebeschädigungen (Tumoren) entfernt [Weinman et al., (1984), Am. J. Radiol Vol. 142, S. 619]. Dies begrenzt das Abbildungsfenster (etwa 30 bis 45 Minuten); beschränkt die Anzahl der bestmöglichen Bilder nach jeder Injektion (auf etwa 2); und erhöht die erforderliche Dosis und relative Toxizität des Mittels.
(4) Die biologische Verteilung von Gd-DTPA ist für Auf nahmen von Körpertumoren (im Gegensatz zu Gehirntumoren) und Infektionen nicht optimal. Dies ist auf die geringe Molekülgröße zurückzuführen. Bei intravenöser Verabreichung wechselt Gd-DTPA rasch in das extrazelluläre Wasser des normalen Gewebes über, genauso wie es sich in Tumoren und Infektionen anreichert. Dies wird durch die Abwesenheit einer "Blut-Hirn"-Schranke, die teilweise das Überwechseln von Gd-DTPA in die extrazelluläre Flüssigkeit des normalen (im Gegensatz zum erkrankten) Gehirn begrenzt, in Körperorganen erleichtert. In den Körperorganen ist ein verminderter Unterschied in der Konzentration von Gd-DTPA zwischen gesunden und kranken Gewebeabschnitten, und somit ein verminderter Bildkontrast zwischen den gesunden und kranken Organabschnitten die Folge. Außerdem wird eine unverhältnismäßig große Menge (> 90%) Gd-DTPA sehr schnell in den Nieren sequestriert [Weinman et al., (1984), Am. J. Radiol Vol. 142, S. 619]. Von großem Interesse für die Körper-MRI sind die Stellen des Unterleibs, die bei der frühen Erkennung und Einordnung der Entwicklungsstufe von Tumoren (besonders die Leber und auch Milz, Knochenmark, Dickdarm und Bauchspeicheldrüse), eine Rolle spielen.
Bei dem Versuch, diese Nachteile zu überwinden, wurden drei Ansätze verfolgt.
(1) Es wurden alternative kleine chelierende Moleküle getestet. Diese verbessern die Zugänglichkeit von Gd für Wasserprotonen, chelieren das Metall jedoch noch mit genügender Affinität, um seine Toxizität in vivo gegebenenfalls zu kontrollieren. Das wirkungsamste dieser Cheliermittel ist DOTA, der polyazamakrocyclische Ligand, 1,4,7,10-Tetraacacyclododecan-N,N',N''-Tetraessigsäure [Geraldes et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 860]. Seine Relaxationswirkung ist über einen weiten Bereich von Larmor-Frequenzen ungefähr zweimal so groß wie die von Gd-DTPA. Es ist jedoch immer noch weniger aktiv als freies Gd.
(2) Gd und Gd-Chelate wurden chemisch an Makromoleküle, in erster Linie an die Proteine Albumin [Bulman et al., (1981) Health Physics Vol. 40, S. 228 und Lauffer et al., (1985), Mag. Res. Imaging Vol. 3, S. 11], Asialofetuin [Bulman et al., (1981) Health Physics Vol. 40, S.
228], und Immunglobuline [Lauffer et al., (1985), Mag. Res. Imaging Vol. 3, S. 11, und Brady et al., (1983), Soc. Mag. Res., 2nd Ann. Mtg, Laufende Arbeiten, San Francisco, CA] gebunden.
Dies erhöht die Relaxationswirkung von Gd durch Verlangsamung der Moleküldrehungen (Rotations-Korrelationszeit) [Lauffer et al., (1985), Mag. Res. Imaging Vol. 3, S. 11]. Das verbessert die Kupplung des Energieübertragungsvorgangs zwischen Protonen und Gd [Geraldes et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. vol. 2, S. 860, Lauffer et al., (1985), Mag. Res. Imaging Vol. 3, S. 11, und Brown et al., (1977), Biochemistry Vol. 16, S. 3883]. Die Relaxationswirkungen werden um das 5 bis 10-fache im Verhältnis zu Gd-DTPA erhöht (bei Vergleich der R1=1/T1- Werte bei 1 millimolarer Gd-Konzentration), und um das 2,5 bis 5,0-fache (bei Vergleich der Molaritäten von Gd, die erforderlich sind, um eine bestimmte Senkung von T1 in Bezug auf eine Kontrollösung (physiologische Kochsalzlösung)) zu erzeugen.
Die Gründe für die Anwendung des letztgenannten Vergleichsverfahrens sind, daß 1) millimolare Konzentrationen von Gd in vivo niemals erreicht werden - die tatsächlichen Gewebekonzentrationen, die bei der gewöhnlichen Bildverstärkung erzielt werden, liegen zwischen 20 und 100 Mikromol Gd; 2) die Steigungen der R1- Graphen für verschiedene bildverstärkende Mittel häufig nicht parallel verlaufen; 3) das zweite Verfahren einen Vergleich der Mittel in Bezug auf das handelsüblichere chemische Aktivitätsverhältnis erlaubt, mit anderen Worten, die Konzentration, die nötig ist, um eine bestimmte prozentuale Senkung der T1 (oder T2)- Relaxationszeit hervorzurufen. Obwohl weiter unten R1- Meßwerte für Literaturvergleiche angegeben werden, wird das zweite Verfahren als das zu bevorzugende betrachtet und wird für den Rest der Anmeldung zu internen Vergleichen der Wirksamkeit verwendet. Der große Nachteil der Bindung von DTPA an Proteinträger zur Verwendung bei der NMR-Bildverstärkung ist, daß es schwierig war, mehr als 5 DTPA's (und somit Gd's) je Albuminmolekül stabil zu binden [Bulman et al., (1981), Health Physics Vol. 40, S. 228, Lauffer et al., (1985), Mag. Res. Imaging Vol. 3, S. 11, und Hnatowich et al., (1982), Int. J. Appl. Radiat. Isot. Vol. 33, S. 327].
Vergleichsweise niedrige Austauschverhältnisse (auf das Molekulargewicht abgeglichen) wurden für Immunglobuline [Lauffer et al., (1985), Mag. Res. Imaging Vol. 3, S. 11, und Brady et al., (1983), Soc. Mag. Res., 2nd Ann. Mtg, Laufende Arbeiten, San Francisco, CA] und Fibrinogen [Layne et al., (1982), J. Nucl. Med. Vol. 23, S. 627] beschrieben. Dies ist eine Folge der Schwierigkeit, Amidbindungen zu bilden, der verhältnismäßig geringen Anzahl frei liegender Aminogruppen, die für die Bindung zur Verfügung stehen, auf typischen Proteinen, und der relativ raschen Hydrolyse des DTPA-Anhydrid-Bindungssubstrats, welche in den wäßrigen Lösungsmitteln auftritt, die zur Minimierung der Proteindenaturierung während der Bindung nötig sind [Hnatowich et al., (1982), Int. J. Appl. Radiat. Isot. Vol. 33, S. 327 und Krejcarek et al., (1977), Biochem. Biophys. Res. Comm. Vol. 77, S. 581]. Die Gesamtwirkung dieser suboptimalen Bedingungen ist, daß eine sehr hohe Dosis Trägermaterial benötigt wird, um nennenswerte in vivo-Wirkungen auf MR-Bilder zu erzielen. Bei dieser hohen Dosis erzeugt der Träger durch einen osmotischen Mechanismus eine unakzeptable akute Ausdehnung des Blutvolumens des Empfängers. Die niedrigen Austauschverhältnisse haben tatsächlich die Verwendung dieser Protein-Cheliermittel-Metallkomplexe allgemein auf die empfindlicheren (Niedrigdosis-), radiopharmazeutischen Anwendungen beschränkt [Layne et al., (1982), J. Nucl. Med. Vol. 23, S. 627].
Mit der Bindung von DTPA an den Nicht-Proteinträger Cellulose wurde der Versuch unternommen, dieses niedrige Austauschverhältnis zu überwinden [Bulman et al., (1981) Health Physics Vol. 40, S. 228], jedoch führt das angewendete chemische Verfahren zu einem fortgesetzten suboptimalen Austausch von DTPA an den Träger. Die fehlende biologische Abbaubarkeit von Cellulose und ihrer wasserlöslichen Derivate und die berichtete Bildung von Molekülaggregaten als Folge der Bindung von mit CNBr aktivierter Cellulose an die Diaminohexyl-Abstandsgruppen, die den Träger an DTPA binden, in organischen Lösungsmitteln (Dimethylformamid), machte diese Klasse von Trägerverbindungen zur intravenösen Verabreichung der Dosen, die für eine MR-Bildverstärkung nötig sind, unakzeptabel.
Eine sehr wichtige Überlegung bei der Bildverstärkung fester Tumoren und entzündlicher Schädigungen mit Hilfe polymerer Kontrastmittel besteht darin, daß diese Mittel, damit sie den Mikrokreislauf rasch verlassen und in die benachbarten kranken Gewebe übertreten können, vollständig löslich sein müssen - d. h., nicht mit intermolekularen oder supramolekularen Mikroaggregaten verunreinigt sein dürfen. Ein optimaler Zugang zum und die Lokalisierung auf den Tumor machen es erforderlich, daß die Molekülgröße eines solchen Mittels allgemein weniger als etwa 2.000.000 Dalton (etwa 2 bis 3 Nanometer Moleküldurchmesser) und vorzugsweise weniger als 500.000 Dalton (etwa 0,5 bis 1 Nanometer Moleküldurchmesser) beträgt [Jain, (1985), Biotechnology Progress Vol. 1, S. 81]. Aus diesem Grund reichern sich die Kontrastmittel in Partikel- und Mikroaggregatform (einschließlich der Liposomen, Kolloide, Emulsionen, Partikel, Mikrokugeln und Mikroaggregate, wie unten beschrieben) bis auf seltene Ausnahmen in den meisten festen Tumoren und entzündlichen Schädigungen nicht wirksam an. Statt dessen werden diese Mittel von Supramolekülgröße nach ihrer intravenösen Verabreichung: a) zunächst über relativ kurze Zeiträume im Blutstrom zirkuliert (25 Minuten bis 24 Stunden, in Abhängigkeit der Größe), was gegebenenfalls eine direkte Bildverstärkung des Systems (Plasmateils) ermöglicht; und b) anschließend durch spezialisierte (Freß-)Zellen des Retikuloendothelialgewebes (Leber, Milz und Knochenmark) beseitigt, was gegebenenfalls die selektive Verstärkung dieser gesunden Gewebe ermöglicht, jedoch indirekte (negative) Verstärkungen von Schädigungen innerhalb dieser Gewebe hervorruft (durch Ausschluß der Mittel aus den kranken Abschnitten). Zusätzlich können diese Mittel in Partikel- und mikroaggregater Form nach ihrem Einbau in den gastrointestinalen Trakt und andere Körperhohlräume eine direkte Bildverstärkung der Flüssigkeiten in diesen Aushöhlungen hervorrufen und dadurch gegebenenfalls Gewebeänderungen aufzeigen, die in die Innenräume und Aushöhlungen eindringen. Sowohl Mikrokugeln als auch Mikroaggregate haben supramolekulare Größe. Die Mittel in Mikroaggregatform werden (beabsichtigt oder unbeabsichtigt) durch a) molekulare Vernetzung einzelner Polymermoleküle oder b) sekundäre Aggregation zuvor einzelner (löslicher) Polymere, wie sie durch Ladungsanziehung oder hydrophobe Bindungsmechanismen hervorgerufen werden, produziert. Sie unterscheiden sich von den Mitteln in Mikrokugelform durch ihre kleinere Partikelgröße, die im Bereich zwischen ungefähr 2.000.000 Dalton (etwa 2 bis 3 Nanometer Durchmesser) und 0,1 Mikrometer (= 100 Nanometer Durchmesser) liegen. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, daß Mikroaggregate durch retikuloendo-theliale Freßzellen mit deutlich geringerer Effizienz und Geschwindigkeit beseitigt werden als Mikrokugeln. Allgemein führt diese Eigenschaft dazu, daß Mikroaggregate unter den gewöhnlichen Bedingungen klinischer Aufnahmen, für die eine unverzügliche Kontrastverstärkung nach der Injektion erforderlich ist, eine weniger bevorzugte Form von Mitteln zur Abbildung der Leber, der Milz und des Knochenmarks sind.
(3) Gd-DTPA wurde in Liposomen eingeschlossen [Buonocore et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 838], um Abbildungen der retikuloendothelialen Organe (Leber, Milz und Knochenmark) und gegebenenfalls der Lungen zu verstärken. Die Ausscheidung aus der Leber erfolgt durch Freßzellen (Kupfer-Zellen), die die kleinen (0,05 bis 0,1 um) Partikel spontan aus dem Blutstrom entfernen [Buonocore et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med Vol. 2, S. 838]. (Partikel, die größer als 3 bis 5 um sind, befinden sich aufgrund des embolischen Einschlusses in die Lungenkapillaren bevorzugt in den Lungen). Ein neuerer Bericht zeigt, daß Gd-Liposomen kleiner Größe wirksame Senkungen der T1-Werte der Leber hervorrufen (spektroskopisch ohne Bildaufnahme bestimmt) [Buonocore et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 838]. Es wurde außerdem kürzlich berichtet, daß unlösliche Gd-DTPA- Kolloide unter in vivo-Bedingungen MR-Bilder von Kaninchenlebern verstärken [Wolf et al., (1984), Radiographics Vol. 4, S. 66]. Drei Hauptprobleme beschränken jedoch die diagnostische Anwendbarkeit dieser Hilfsmittel. Die aus vielen Lamellen bestehende Lipidhüllen von Liposomen scheinen die freie Diffusion von Wasserprotonen in die zentralen hydrophoben Kerne dieser Träger zu behindern, was anhand der höheren Gd-Dosierungen, die erforderlich sind, um ein mit Gd-DTPA Dimeglumin in vitro vergleichbares Relaxationsverhalten zu erhalten, festzustellen ist [Buonocore et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 838]. Dies erhöht die relative Toxizität jedes Gd- Atoms.
Noch wichtiger ist jedoch, daß dieselben Lipidbestandteile eine Wechselwirkung der Träger mit Zellmembranen der Zielorgane hervorrufen, die zu einer bedeutenden Verlängerung der Verweildauer im Gewebe führt (mit Beseitigungszeiten bis zu einigen Monaten) [Graybill et al., (1982), J. Infect. Dis. Vol. 145, S. 748 und Tayler et al., (1982), Am. Rev. Resp. Dis. Vol. 125, S. 610]; und G. Kabala, (persönliche Mitteilung). Daraus ergeben sich zwei gegensätzliche Konsequenzen. Erstens geht die Bildverstärkung nicht innerhalb einer günstigen Zeit auf das Grundniveau zurück. Dies schließt wiederholte Aufnahmen in kurzen Zeitintervallen (etwa ein bis drei Wochen) aus, die benötigt werden, um akute Krankheitsfortschritte und Behandlungswirkungen zu beurteilen. Zweitens können erhebliche Mengen des in Liposomen eingeschlossenen Gd- DTPA in die Membran der Empfängerzellen übertragen werden [Blank et al., (1980), Health Physics Vol. 39, S. 913 und Chan et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 846]. Dies kann die zelluläre Verweildauer und Toxizität dieser liposomalen Mittel bedeutend erhöhen. Über die Auswirkungen auf die Toxizität des Gd wurde bis jetzt noch nicht berichtet. Protein (Albumin)-Mikrokugeln mit eingeschlossenem Gd oder Gd-Chelaten wurden vom Anmelder und anderen [Saini et al., (1985), Proc. Soc. Mag. Res. Med. Vol. 2, S. 896] hergestellt, und es wurde festgestellt, daß sie nur mäßige Auswirkungen auf die invitro-T1-Relaxationswirkung haben. Der Grund dafür ist, daß sowohl Gd als auch andere Einschlußmaterialien [Widder et al., (1980), Cancer Res. Vol. 40, S. 3512] zunächst in das Innere dieser Kugeln abgeschieden werden und sehr langsam freigesetzt werden, wenn die Kugeln hydratisiert werden (mit T1/2-Werten in der Größenordnung von Stunden) [Widder et al., (1980), Cancer Res. Vol. 40, S. 3512]. Der Anmelder hat gefunden, daß dieses Phänomen die akute Relaxationswirkung (30 bis 90 Minuten) jedes Gd-Atoms bedeutend absenkt, und zwar auf etwa 1/10 derjenigen von Gd-DTPA-Dimeglumin. Somit sind sowohl die Menge an Trägermaterial als auch die Toxizität von Gd unnötig hoch.
Emulsionen unlöslicher Gadoliniumoxidteilchen wurden, mit bedeutenden bildverstärkenden Wirkungen auf die Leber, in Versuchstiere gespritzt [Burnett et al., (1985), Magnetic Res. Imaging Vol. 3, S. 65]. Diese Teilchen sind jedoch bedeutend toxischer als alle oben beschriebenen Materialien, weshalb sie zur Anwendung beim Menschen ungeeignet sind. Aufgrund der bedeutenden Nachteile vorhandener MR-Bildkontrastmittel hat der Anmelder verbesserte Prototypmittel der zweiten Generation mit verminderter Toxizität, erhöhter Selektivität von Tumor- und Organaufnahme, sowie mit bedeutendem Potential zur Verstärkung von Blutflußbildern formuliert.
Viele der Vorteile, die für die derzeitigen Entwicklungen im Bereich der NMR-bildverstärkenden Mittel (hier auch als MIR-Kontrastmittel oder MR- (magnetische Resonanz-) Kontrastmittel bezeichnet) gezeigt werden, sind auch auf andere Gebiete übertragbar; z. B. gewinnt die mit hohen Feldstärken arbeitende NMR-Obflächenspulenspektroskopie von ¹H-, ¹³C-, ¹&sup9;F-, ²³Na- und 31P-Kernen in räumlich lokalisierten Gewebevolumina an Bedeutung, und man beginnt sie experimentell auf die nichtinvasive klinische Überwachung von genetischen und Stoffwechselstörungen; Stoffwechsel und Infarkten des Herzmuskels; Gehirn-, Leber- und Tumorstoffwechsel; Verteilung und Stoffwechsel von Wirkstoffen; Messungen des Blutflusses und der Gewebedurchblutungen; und die Temperaturüberwachung bei regionaler Hyperthermie, anzuwenden. Gadolinium und verwandte Mittel können charakterisierende Veränderungen in dem NMR- Spektrum benachbarter NMR-empfindlicher Kerne hervorrufen. Diese Veränderungen umfassen: Veränderungen der Position, Breite, Intensität und Relaxationsgeschwindigkeiten (welche die Intensität beeinflussen) der Emissionssignalspitzen. Somit können Störungen der Spektren durch diese chemischen Verschiebungs-Relaxations-Wirkstoffe benutzt werden, um die Quelle der NMR-Signale in Bezug auf die Organlage, den Gewebeteil (intravaskulär im Gegensatz zu extravaskulär), den Zelltyp innerhalb des Gewebes und gegebenenfalls bestimmte Stoffwechselwege in Zellen, die durch Wirkstoffe oder Krankheit verändert sind, zu lokalisieren und zu identifizieren. In bestimmten Situationen sind auch Ultraschallbilder oder Körperabtastungen von Radioisotopemissionen besonders nützlich, um Einblick in innere Strukturen zu bekommen. Die am häufigsten abgetasteten Radioisotopemissionen sind diejenigen von metallischen Radioisotopen, die Gammaquanten ausstrahlen, jedoch erfährt die Positronen-Emissionstomographie eine erweiterte klinische Anwendung. Die molekulare Zusammensetzung und Art der Verabreichung dieser radioisotopen Metalle hat bedeutende Auswirkungen auf die innere Lokalisierung und Halbwertszeit dieser Radioisotope im Körper, was möglicherweise zu einer verstärkten diagnostischen Anwendung dieser bildlichen Ultraschalldarstellungen und Strahlungsabtastungen führen wird.
Entsprechend wird nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines bildverstärkenden Mittels oder eines spektralverstärkenden Mittels bereitgestellt, wobei ein biologisch abbaubares, wasserlösliches Polymer, das sich wiederholende hydrophile monomere Einheiten mit Amino- und/oder Hydroxylgruppen enthält, mit einem Cheliermittel kovalent gekuppelt wird, wobei sich die funktionellen Gruppen des Cheliermittels mit den reaktiven Gruppen der monomeren Einheiten des Polymers verbinden und das Cheliermittel mit einem Metallion assoziiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Kupplung des wasserlöslichen Polymers und des Cheliermittels in einem wäßrigen protonenhaltigen Lösungsmittel durchgeführt wird und daß das Cheliermittel bei physiologischen Temperaturen und pH-Werten eine Bildungskonstante für zweiwertige und dreiwertige Metall-Kationen von mindestens 10&sup8; hat.
Die Cheliermittel enthalten funktionelle Gruppen, die an ein Amino-, quaternäre Ammonium- oder eine andere reaktive Stickstoffgruppe; Hydroxyl-; Carboxy-; Sulfhydryl-; Sulfat- oder Sulfoniumgruppe der monomeren Einheiten gebunden sind. Diese Cheliermittel haben bei physiologischen Temperaturen und pH-Werten eine Bildungskonstante für zweiwertige oder dreiwertige Metall-Kationen von mindestens 10&sup8; (und typischerweise > 10¹³). Die Bindung chelierender Gruppen an das Polymer (oder bei der Bildung des Copolymers) wird unter solchen chemischen Bedingungen und in Lösungsmitteln durchgeführt, die eine vollständig lösliche (Einzel-)Form des Trägers erzeugen und eine nennenswerte Verunreinigung mit Mikroaggregaten verhindern. Das molare Verhältnis von Cheliermittel zu monomerer Einheit liegt vorzugsweise zwischen 1/5 und 1/25. Dieses bildverstärkende Mittel ist biologisch zu Stoffwechselzwischenprodukten, rasch ausscheidbaren Chelaten, Polymeren, Oligomeren, Monomeren und Kombinationen davon, von denen alle eine niedrige Toxizität besitzen und die hervorragend über die Nieren ausgeschieden werden, abbaubar. Der hier verwendete Ausdruck "niedrige Toxizität" bedeutet, daß bei üblichen Dosierungen des bildverstärkenden Mittels weniger signifikante toxische Effekte auftreten.
Diese bildverstärkenden Mittel können weiterhin zur Verstärkung der Bilder oder Spektren, die aus induzierten magnetischen Resonanzsignalen entstehen, ein paramagnetisches Metall, Übergangselement, oder Seltenerdion enthalten. In der hier verwendeten Definition bezieht sich der Ausdruck "Metallionen" auf die Fähigkeit jedes dieser Materialien, positiv geladene Ionen zu bilden. Die polymere (oder mikrokugelförmige - siehe unten) Beschaffenheit dieser Mittel ist so, daß sie eine bedeutende Erhöhung der NMR-Stärke jedes paramagnetischen Metallions, im Vergleich zu kleinen Metallchelaten, hervorruft.
Bilder, die durch das Abtasten von Gamma- oder Positronenteilchenemissionen entstanden sind, können verstärkt werden, wenn das erfindungsgemäße bildverstärkende Mittel ein radioisotopes Metall, Übergangselement oder Seltenerdion (oder Oxide der voranstehenden Einheiten) enthält, das Gamma- oder Positronenteilchen ausstrahlt.
Bilder, die durch Ultraschallabtastung entstehen, können durch Veränderungen der natürlichen Gewebereflektivität (Geschwindigkeit) von Hochfrequenzschallwellen verstärkt werden, wenn das erfindungsgemäße bildverstärkende Mittel eines der relativ dichten, nicht-radioaktiven Metalle oder Metallionen enthält.
Nach einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird das zunächst wasserlösliche bildverstärkende, nach der oben beschriebenen Methode hergestellte Mittel in eine Mikrokugel umgewandelt, die durch Ölphasenemulsionsbildung entsteht.
Die physikalische Umwandlung dieses löslichen, bildverstärkenden Mittels in Mikrokugeln (mit einem Durchmesser von ≤ 100 nm) erlaubt einen gezielten Einsatz des bildverstärkenden Mittels im Körperinneren, entweder, bei oraler Verabreichung, auf den Verdauungstrakt oder, bei intravenöser Verabreichung, auf Organe mit der Fähigkeit zur Phagozytose (hauptsächlich Leber, Milz und Knochenmark).
Nach einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird das zunächst wasserlösliche, nach der oben beschriebenen Methode hergestellte, bildverstärkende Mittel durch Ionenbindung (gepaarte Ionen) in eine Mikroaggregatform umgewandelt.
Die alternative Umwandlung dieser löslichen bildverstärkenden Mittel zu Mikroaggregaten (3 bis 100 Nanometer Durchmesser) erlaubt auch ihren gezielten inneren Einsatz in phagozytierenden Organen, jedoch mit bedeutend geringerer Effizienz und Geschwindigkeit im Vergleich zu Mikrokugeln.
Abbildungen der inneren Strukturen eines Lebewesens können nach vielen, dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Auf einem allgemeinen Gebiet bildlicher Darstellungen werden Metalle, Übergangselemente und Seltenerden enthaltende Markierungsstoffe verwendet. Diese Markierungsstoffe können aufgrund der physikalischen Eigenschaften ihrer Metallbestandteile dazu verwendet werden, um die Qualität von Bildern, die auf unterschiedlichste Weise hergestellt wurden, zu verbessern.
Zu den Abbildungsverfahren, bei denen metallische Übergangselemente und Seltenerd-Markierungsstoffe vorteilhaft eingesetzt werden können, zählen die magnetischen Resonanz-(MR)-Abbildungen, Ultraschallbilder und Abtastungen von Gamma- und Positronenteilchenemissionen. Als bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steht an vorderster Stelle die Verstärkung von Bildern, die durch magnetische Kernresonanz-(NMR)-Abbildung ganzer Lebewesen oder Teile davon hergestellt wurden. Die Ausdrücke magnetische Resonanz-(MR)-Abbildung und magnetische Kernresonanz-(NMR)-Abbildung werden hierbei als Synonyme verwendet.
Die vorliegende Erfindung bietet neue Wege, Metall- oder paramagnetische Metallchelatkomplexe in biologisch abbaubare, hydrophile polymere Mikroträger einzuschließen. Zunächst wird das Chelat in großer Zahl chemisch an hydrophile Polymere, wie langkettige Dextrane (1-6 verknüpfte, lösliche, mäßig-verzweigte Polymere aus Glucose), gebunden. Diese hydrophilen Polymere sind biologisch abbaubar und wasserlöslich. Sie sind entweder synthetisch oder aus Eukaryonten, Prokaryonten, Hybridorganismen oder Pflanzen derivatisiert und enthalten sich wiederholende hydrophile monomere Einheiten mit Amino-, Hydroxyl- oder Sulfatgruppen. Sie können weiter derivatisiert sein und Carbonsäure-, Sulfonium- oder Sulfhydrylgruppen; oder quaternäre Ammonium- oder andere reaktive Stickstoffgruppen enthalten. Die negativ geladenen, natürlich vorkommenden, sich wiederholenden Hydroxyl- oder Sulfatgruppen können zur Stabilisierung der Bindung positiv geladener Gd-Ionen über die Bindungsstabilität hinaus, die durch die kovalentgebundenen Cheliermittel vermittelt werden, beitragen.
Die erfindungsgemäßen bildverstärkenden Mittel enthalten Chelate oder Cheliermittel mit funktionellen Gruppen, die an Hydroxyl-, Amino-, quaternäre Ammonium- (oder andere funktionelle Stickstoffgruppen), Carboxyl-, Sulfhydryl-, Sulfonium- oder Sulfatgruppen der monomeren Einheiten des Polymers gebunden sind. Diese Cheliermittel sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie Bildungs-(Stabilitäts-) konstanten für zweiwertige oder dreiwertige Metallkationen von mindestens 10&sup8;, und typischerweise von mehr als 10¹³, bei pH-Werten und Temperaturen besitzen, die für Säuger physiologisch sind.
Alle oben beschriebenen, bildverstärkenden Mittel sind dadurch gekennzeichnet, daß sie von Säugern biologisch zu Stoffwechselzwischenprodukten oder ausscheidbaren Chelaten, Polymeren, Oligomeren, Monomeren oder Kombinationen davon, die alle eine niedrige Toxizität besitzen, abbaubar sind.
Die Cheliermittel mit den oben beschriebenen Eigenschaften haben zwei weitere grundlegende Eigenschaften, nämlich eine Affinität für zwei- oder dreiwertige Metalle, sowie die Fähigkeit, an eine oder mehrere reaktive Gruppen, wie sie zwei Absätze weiter oben aufgelistet sind, und die selbst an das Polymer gebunden sind, zu binden. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Cheliermittel sind, u. a. EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure); DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure); TTHA (Triethylentetramin-hexaessigsäure); und DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure).
Ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes bildverstärkendes Mittel enthält ein Dextranpolymer und ein DTPA- Cheliermittel, wobei das Bindungsverfahren zu einem Polymerchelat führt, das vollständig wasserlöslich ist - d. h. eine Mikroaggragation vermeidet - (siehe unten). Es wurde gefunden, daß dieses besonders bevorzugte Mittel, in Kombination mit Gadolinium, innere (in vivo)-Bilder, die aus induzierten magnetischen Resonanzsignalen entstehen, sehr wirkungsvoll verstärkt. Alternative Elemente (Ionen) zur Verwendung bei bildlichen MRI-Darstellungen können solche mit Atomzahlen von 21 bis 29 und 57 bis 70 einschließen, mit besonderer Betonung der Zahlen 24-29 und 62-69.
Das Polymer der hier beschriebenen bildverstärkenden Mittel ist vorzugsweise ein Polysaccharid oder Oligosaccharid, besonders bevorzugt Dextran. Es sind auch Polyaminosubstanzen, z. B. Poly-L-Lysin brauchbar; sie werden aber wegen ihrer polymeren (dicht gepackten) positiven Netto-Ladungen bei physiologischen pH-Werten allgemein nicht bevorzugt, obwohl unter gewissen Umständen dieser Polymertyp wünschenswert sein kann. In jedem Fall sollten die erfindungsgemäßen Polymere biologisch abbaubar sein. Der Ausdruck "biologische Abbaubarkeit", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß in Säugern vorhandenen Enzyme oder Bedingungen zum Abbau das Polymers führen, insbesondere zu einer ausscheidbaren und nicht toxischen Form. Daher werden biologisch nicht abbaubare Polysaccharide, wie Cellulose und ihre wasserlöslichen Derivate, bei der erfindungsgemäßen Anwendung nicht bevorzugt. Biologische Abbaubarkeit kann weiterhin bedeuten, daß Enzyme oder Bedingungen in Säugern zu einer Spaltung der chemischen Bindung führen, wodurch das Metallcheliermittel an die Polymer oder an das wechselnden monomeren Einheiten des Copolymers gebunden wird.
In Bezug auf die Größe sollten die erfindungsgemäßen Polymere ein Molekulargewicht zwischen 1.000 und 2.000.000 Dalton besitzen. Ein bevorzugterer Größenbereich liegt für die meisten Anwendungen zwischen 40.000 Dalton und 75.000 Dalton, wobei dieser Bereich häufig ein Optimum für die ungleichartigen Zielsetzungen darstellt, nämlich die Relaxationswirkung jedes Gd-Atoms zu verstärken, das Auswandern eines zunächst intravaskulären Mittels aus dem Gefäß heraus und die Lokalisierung dieses Mittels auf Tumore und entzündliche Schädigungen zu ermöglichen und die Ausscheidung dieser polymeren Mittel durch die Niere im Vergleich zu Mitteln mit niedrigerem Molekulargewicht, wie Gd:DTPA (Dimeglumin), leicht bis mäßig zu verzögern oder auf andere Weise zu modifizieren.
Die funktionellen Gruppen der Cheliermittel sind vorzugsweise durch eine kovalente Bindung an die monomeren Einheiten des Polymers gebunden, obwohl in bestimmten Fällen auch eine starke nicht-kovalente Bindung brauchbar sein kann. Die am besten geeignete kovalente Bindungsform eines Cheliermittels an das Polymer ist, wegen ihrer leichten Bildung, wegen der für den gezielten biologischen Einsatz angemessenen Stabilität und wegen der optimalen Anfälligkeit für enzymatische Spaltung zur anschließenden Ausscheidung (nach der Abbildung) der Metallchelate aus den Zielzellen und dem Körper, eine Esterbindung.
Das zur Bindung des Cheliermittels an den Träger angewendete Verfahren ist vom Standpunkt der Löslichkeit und somit der biologischen Verteilung, Leistung und Verträglichkeit dieser löslichen Polymere in vivo von entscheidender Wichtigkeit. Um eine hohe Austauschgeschwindigkeit des Cheliermittels an den Träger zu erhalten und, am wichtigsten, um ein Vernetzen der Polymereinzelstücke zu vermeiden (um eine Mikroaggregation zu verhindern), sowie die Cheliermittelbindung zu vereinfachen, Reagenzkosten zu minimieren, und den anschließenden biologischen Abbau in vivo zu erleichtern, wird die Verknüpfung der Cheliermittelgruppen, wenn sie in der üblichen Seitenketten- Konfiguration stattfindet, vorzugsweise nach einem einstufigen Verfahren durchgeführt, das die Kupplung des Dianhydridsubstrats des Cheliermittels an das Trägerdextran der gewünschten Molekülgröße in wäßriger Phase bei einem physiologischen pH-Wert von weniger als 8,5 erfordert. Eine Größe des Trägers von mehr als etwa 10.000 bis 20.000 Dalton wird bevorzugt, wobei der zusätzliche Vorteil erzielt wird, daß die anfängliche biologische Verteilung der Mittel fast ausschließlich auf das Blutgefäßsystem beschränkt ist [Grotte, (1956), Acta Chirurgica Scandanavia Vol. 211 (Anhang), S. 5]. Diese Merkmale sind erforderlich, um: a) den Zugang des Mittels zu der normalen extrazellulären Flüssigkeit des Körpers zu minimieren und somit eine maximale Selektivität im Hinblick auf Tumorabbildungen zu schaffen; b) ein maximales Auswandern des Mittels aus den Gefäßen in die Tumore und die entzündlichen Schädigungen zu ermöglichen (aufgrund der Fähigkeit der vollständig löslichen - d. h. nicht aggregierten - Polymere dieser Größenordnung, durch die mäßig vergrößerten "Poren", die in Kleinstgefäßen von Tumoren, im Gegensatz zu normalen Kleinstgefäßen, vorhanden sind, auszuwandern); und c) die Beseitigung durch retikuloendotheliale Freßzellen zu minimieren (die die Leistungsfähigkeit des Mittels dadurch verringern würden, daß sie es aus dem Blutsystem entfernen und somit unerreichbar für die Tumore machen). Diese verfahrensmäßigen Betrachtungen sind von höchster Wichtigkeit, um die Nützlichkeit, Annahmefähigkeit und Potenz des Mittels in vivo zu maximieren; die Ausscheidung durch die Nieren zu optimieren; und die Toxizität für den Körper zu minimieren.
Die physikalische Umwandlung des löslichen polymeren Mittels in Mikroaggregate ist möglich, wird aber nicht bevorzugt. Sie tritt jedoch unbeabsichtigt auf und kann bewußt durch eines der folgenden chemischen Verfahren herbeigeführt werden; a) indem die Cheliermittel-Trägerverknüpfung in einem beliebigen, nicht protonenhaltigen (organischen) Lösungsmittel durchgeführt wird. Dies erleichtert die Vernetzung (Mikroaggregation) benachbarter Polymermoleküle, da eine Hydrolyse der zweiten (nicht umgesetzten) Anhydridgruppe des Cheliermittels durch Wasser nicht so schnell erfolgen kann, wie es nach der Umsetzung des ersten Anhydrids mit einem Dextranmolekül nötig wäre; oder b) indem man die lösliche (nicht aggregierte) Form des Polymer-Cheliermittel-Metallkomplexes pH-Werten von etwa 8,5 oder darüber aussetzt, was eine Mikroaggregation aufgrund von elektrostatischen (Ladungs-) Effekten hervorrufen kann.
Eine zweite bevorzugte physikalische Zustandsform des erfindungsgemäßen bildverstärkenden Mittels ist die von Mikrokugeln. Der bevorzugte Größenbereich dieser Mikrokugeln liegt zwischen 0,1 um und 250 um. Ein NMR- bildverstärkendes Mittel kann entweder vor oder nach der Zugabe eines paramagnetischen Metallions, wie Gadolinium, in die Form von Mikrokugeln gebracht werden. Es wurde gefunden, daß die entstandenen Mikrokugeln, wenn sie einem Säuger mit Durchmessern von weniger als 3 um intravenös gespritzt werden, durch Organe, wie die Leber, die Milz und das Knochenmark aufgenommen werden. Somit werden z. B. die normalen Gewebebestandteile dieser Organe selektiv und bevorzugt in die Lage versetzt, verbesserte Bilder, die aus induzierten magnetischen Resonanzsignalen entstehen, zu erzielen. Aufgrund unterschiedlicher Ausscheidung aus den Organen, sind Mikrokugeln mit einer Größe von 0,1 bis 3 um für Bildverstärkungen der Leber, der Milz und des Knochenmarks vorzuziehen; während Mikrokugeln mit einer Größe von 3 bis 250 um für Bildverstärkungen der Lunge vorzuziehen sind.
Ein anderer bemerkenswerter Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die weitere rasche Kupplung der in Form der Chelat-Polymere vorliegenden bildverstärkenden Mittel selbst an Proteine, wie Hormone, polyklonale oder monoklonale Antikörper oder an eine Substanz, die sekundär entweder native oder derivatisierte Antikörper bindet, (d. h. Protein A, Biotin oder Avidin), umfassen. Diese Kupplung kann z. B. die Oxidation benachbarter Zuckerhydroxylgruppen, wie der eines Polysaccharids, mit Natriumperiodat und die Reduktion Schiff'scher Basen durch Natriumborhydrid zu verwandten, stabilen, kovalenten Bindungen mit Protein-Aminogruppen, einschließen. Die besonderen Bindungseigenschaften von Antikörpern bei Zugabe von mehrfach in Form von Chelaten gebundenen Metallionen, können dazu verwendet werden, um eine bestimmte Lokalisierung einer großen Anzahl paramagnetischer oder Teilchen-ausstrahlender Ionen in den interessierenden Zielen im Körperinneren zu erzeugen, und somit die signalmodulierenden Effekte jeder spezifisch lokalisierten Substanz sehr zu verstärken und auch die Spezifität, Affinität und Avidität der Antikörperbindung zu erhalten oder zu verbessern.
Die erfindungsgemäßen bildverstärkenden Mittel sind auch zur Verstärkung von Bildern, die durch das Abtasten von Gamma- und Positronenteilchenemissionen und mit Ultraschallmeßgeräten hergestellt wurden, verwendbar. Bei dieser Anwendung gelten die meisten der allgemeinen Prinzipien der NMR-Bildverstärkung - mit Ausnahme der Dosis des Mittels -, wobei der Hauptunterschied darin besteht, daß das chelierte Metallion jetzt ein Radioisotop ist, das Gammaquanten ausstrahlt, oder eines der praktisch nicht radioaktiven Isotope, die die Geschwindigkeit von übertragenen und reflektierten Ultraschallwellen verändern. Bevorzugte Radioisotopmetalle umfassen &sup5;¹Chrom, &sup6;&sup8;Gallium, ¹¹¹Indium, 99mTechnetium und ihre Oxide. Brauchbare Ultraschallmetalle (-ionen) umfassen diejenigen mit den Atomzahlen 20 (Calcium), 25 und 26 (Mangan bzw. Eisen), vorzugsweise 57-70 (die Reihe der seltenen Erden), und am besten 64 (Gadolinium).
Ein allgemeines Ziel der vorliegenden Erfindung umfaßt die Formulierung und die Anwendung eines bildverstärkenden Mittels, insbesondere für Bilder, die durch magnetische Resonanz erzeugt wurden. Dieses bildverstärkende Mittel enthält ein Cheliermittel, das an ein wasserlösliches, biologisch abbaubares Polymer gebunden ist. Das Mittel kann in löslicher Form oder in Form von Mikrokugeln verwendet werden. In der löslichen Form ist das bildverstärkende Mittel - bei Verabreichung an ein Lebewesen - in erster Linie auf den Blutkreislauf und die Niere verteilt, und hat außerdem besonders bei Molekulargewichten zwischen 20.000 und 5.000.000 die Fähigkeit, das Gefäßsystem selektiv in Tumorbereichen und Entzündungsbereichen zu verlassen und diese Gewebeschädigungen erkennbar zu machen.
In Form von kleinen Mikrokugeln wird das bildverstärkende Mittel, wenn es Lebewesen durch Injektion verabreicht wird, vorzugsweise durch Leber, Milz und Knochenmark beseitigt und auf diese Organe umverteilt. Bei oraler Verabreichung können Mikrokugeln in den Verdauungstrakt eingeführt werden, um diesen Bereich in Bildern sichtbar zu machen. Bei dem anschließenden biologischen Abbau in Dünn- und Dickdarm bildet das bevorzugte Metall (d. h. Gadolinium) unlösliche Oxide, die im Körperinneren nicht absorbiert werden und deshalb ungiftig sind.
Die unmittelbare Verstärkung von Blutflußbildern, zum Beispiel in den Herz- oder Hirngefäßen, kann mit löslichen polymeren bildverstärkenden Mitteln erreicht werden und wird mit der Mikrokugelform sogar noch wirksamer durchgeführt.
Ein bedeutender Vorteil der Bildverstärkung mit Cheliermitteln in Polymer- und Mikrokugelform, in Verbindung mit den kaum toxischen Metallen, besonders den paramagnetischen, wie Gadolinium, besteht in einer weiteren Senkung der erforderlichen Metalldosis und der Verringerung der Toxizität über das hinaus, was durch einfache Cheliermittel (mit niedrigem Molekulargewicht) alleine erzielt werden kann.
Der relativ rasche biologische Abbau und die kurzen Metallbeseitigungzeiten, sowie die sich daraus ergebenden kürzeren Zeitspannen bis zur erneuten Abbildung stellen besondere erfindungsgemäße Vorteile im Vergleich zu anderen Polymeren und teilchenförmigen Metallchelaten dar.
Die erfindungsgemäßen bildverstärkenden Mittel lassen sich in löslicher Form oder als Mikrokugeln leicht zur Verabreichung an Lebewesen oder Patienten zubereiten.
Diese Zubereitung umfaßt ein einfaches Mischen durch Verwirbeln, im Vergleich zur Ultraschallbehandlung in Detergentien, wie sie für Mikrokugeln auf Proteinbasis angewendet wird.
Die erfindungsgemäßen bildverstärkenden Mittel sind leicht in jedem Meß- oder Bildsystem verwendbar, das die Verabreichung von zweiwertigen oder dreiwertigen Metallionen zur Markierung umfaßt. Das entsprechende Metall muß nur dem Polymer-Chelat-Komplex bei pH-Werten, die mit stabiler Chelatbindung (typischerweise ≥ 3,0 bis 3,5) in Einklang stehen, zugefügt werden, oder der Polymer-Chelat-Komplex muß in Form von hitzestabilisierten oder verschieden ummantelte Mikrokugeln zubereitet werden, um Chelatverlusten beim Durchgang durch das saure Medium des Magens (typischer pH-Wert = 1,0-2,0) vorzubeugen.
Die erfindungsgemäßen bildverstärkenden oder spektralverstärkenden Mittel erlauben kürze Bildaufnahmezeiten für zufriedenstellende Auflösungen im Körperinneren. Kürzere Bildaufnahmezeiten sind wegen der größeren Signalverstärkung und des höheren Bildkontrasts, die pro Einheit des chelierten Markierungsstoffes und von der Gesamtmenge des Mittels erzeugt werden, allgemein ausreichend, um zufriedenstellende Abbildungen des Körperinneren zu erzeugen.
Das Potential zur spezifischen Lokalisierung einer großen Anzahl von markierenden Metallionen durch eine geringe Anzahl monoklonaler Antikörper, Nicht-Peptid- und Peptidhormone und rezeptorbindender Substanzen, die mit einem oder mehreren bildverstärkenden Mitteln markiert sind, wird als ein Hauptvorteil für die Diagnostik und für die zukünftige Anwendung angesehen.
Weiterhin ist es bei Verwendung der vorliegenden bildverstärkenden Mittel möglich, wegen des hohen Kontrasts und der mäßigen Ausdehnung der Verweildauer in Schädigungen (lösliche Polymere) sowie in Leber, Milz und Knochenmark (Mikrokugeln) (einige Stunden im Vergleich zu Minuten für kleine Molekülformen), mit einer einzigen Verabreichung des Mittels eine größere Zahl von Serienbildern im verstärkten Zustand aufzunehmen.
Aus chemischer Sicht können einige erfindungsgemäße Vorteile wie folgt zusammengefaßt werden. Wenn NMR-bildverstärkende Mittel paramagnetische Metalle, wie Gadoliniumionen enthalten, übt jedes Gadoliniumion eine erhöhte Relaxationswirkung auf benachbarte magnetische Kerne (d. h. Protonen) aus, und ergibt somit eine höhere Verstärkung des T1-Signals. Diese erhöhte Relaxationswirkung steht mit einer erhöhten Dipolwechselwirkungszeit von Gd aufgrund langsamerer molekularer Rotation des polymeren Gd (des hydrophilen Polymers) in Beziehung (welches vollständig hydratisiert wird und ein schnelles Binden/Lösen benachbarter paramagnetischer Kerne (Protonen) (und somit eine Relaxation)) ermöglicht. Abstandsgruppen zwischen dem Metallchelat und dem polymeren Träger sind nicht erforderlich, um eine optimale paramagnetische Relaxationswirkung zu erhalten; sie können jedoch eingeführt werden, falls sie aus anderen Gründen vorteilhaft erscheinen. Bei Verwendung von Mikrokugeln erlaubt die geringe Größe der Mikrokugeln den Zugang der hydratisierten magnetischen Kerne zu praktisch allen chelierten paramagnetischen Ionen.
Durch die chemisch festgelegte Beschaffenheit der bevorzugten Cheliermittel-Polymerkombinationen läßt sich die Einheitlichkeit zwischen den einzelnen Chargen im Hinblick auf verbesserte pharmazeutische Rezepturen und auf eine leichtere Anerkennung durch die FDA bequem herstellen.
Viele erfindungsgemäß bevorzugte Bestandteile, z. B. bestimmte Dextrane (Molekulargewicht 40.000 und 70.000), DTPA und Gd (als DTPA-Chelat) wurden bereits einzeln von der FDA vorläufig oder endgültig zugelassen.
Zur parenteralen Verabreichung werden diese Mittel vorzugsweise als sterile, physiologisch eingestellte, wäßrige Lösungen (oder Suspensionen) formuliert, deren pH-Wert zum Zweck der intravenösen Verabreichung entweder a) zur biologischen Verteilung und Lokalisierung der löslichen Polymere, Mikrokugeln oder vorgeformten Mikroaggregate bei etwa 6,0 bis 7,5 liegt; oder b) zur biologischen Verteilung und Lokalisierung von Mikroaggregaten, die nach der Bindung des Cheliermittels an das lösliche Polymer durch elektrostatische Aggregation geformt wurden, 8,5 oder höher ist. Diese Mittel können aber auch lyophilisiert und in der getrockneten Form geliefert werden, so daß sie unmittelbar vor der Verabreichung in physiologischen Lösungen wiederaufgenommen werden können. Zur Verabreichung in den Verdauungstrakt (oral oder rektal) oder Injektion in die Körperhöhlungen (wie Blase, Uterus, Eileiter, Nasenhöhlen, oder das Ventrikulocerebrospinalsystem) können diese Mittel als physiologische Lösungen (oder Suspensionen) formuliert werden, die zusätzliche Stoffe zur Erhöhung der Viskosität oder Osmolalität enthalten. Bei oraler Verabreichung können die Mittel weiterhin nach pharmazeutischen Standardverfahren als umhüllte oder nicht-umhüllte Mikro- oder Makrotabletten formuliert werden, um einen zusätzlichen Schutz gegen den sauren pH-Wert des Magens zu bieten und somit die Freisetzung der chelierten Metallionen zu vermeiden, die typischerweise bei den pH-Werten im Magen auftritt. Andere Zusätze, wie Geschmacks- und Farbstoffe, können nach den pharmazeutischen Standardverfahren ebenfalls beigefügt werden.
Bei parenteraler Verabreichung liegt die Konzentration des gesamten aktiven Mittels (Polymer-Metallchelat) zwischen 0,1% und 30% (Gewicht/Volumen), typischerweise zwischen 5% und 25%, und vorzugsweise bei 20%. Die Dosierung der löslichen Polymere und Mittel in Mikrokugelform schwankt in Abhängigkeit vom paramagnetischen Metall und der Art der Verabreichung. Die folgenden Dosen werden zur intravenösen Verabreichung verwendet. Zur Tumorbildverstärkung mit der bevorzugten Ausführungsform, dem löslichem Gd-DTPA-Dextran 70, liegt die Dosis zwischen 0,01 und 0,075 mMol Gd je Kilogramm Körpergewicht, wobei optimale Bildverstärkung typischerweise bei oder unterhalb von 0,03 Mmol Gd pro Kilogramm auftritt. Bei der Verstärkung von Leber, Milz und/oder Knochenmark mit der bevorzugten Ausführungsform, dem Gd-DTPA-Dextran 70-Mikrokugeln, liegt die Dosis zwischen 0,008 und 0,05 Millimol Gd je Kilogramm, wobei eine optimale Bildverstärkung typischerweise bei oder unterhalb von 0,01 mMol je Kilogramm auftritt. Zur Verstärkung des Blutes in den Herzkranzgefäßen liegt die optimale Dosis an löslichem Gd- DTPA-Dextran 70 bzw. Gd-DTPA-Dextran 70-Mikrokugeln bei oder unterhalb von 0,08 bzw. 0.04 mMol Gd je Kilogramm.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und ihrer Anwendung bei MR-Bildern.

BEISPIEL I

Vergleich der spezifischen Aktivitäten und R1-Relaxationswirkungen von Eisen in Dextran 70-Komplexen und ionischen Eisenverbindungen mit niedrigem Molekulargewicht (Eisen(III)nitrat und Ferritin-Eisen)

Fe³&spplus; in Form des Dextran-Eisenoxids (in dem Eisen locker an die Hydroxylgruppen des Dextrans komplexiert ist) wurde als "Proferdex" (20% Eisen, Gew/Gew) (Fisons Pharmaceuticals) erhalten und vor und nach ausgiebiger Dialyse, (um locker gebundenes Eisen zu entfernen), in Bezug auf NMR T1-verstärkende Aktivität in vitro (unter Verwendung eines IBM PC20-Minispektrometers, 20 MHz) getestet. Dieses Ergebnis wurde mit denen von Fe³&spplus; in Form von Eisen(III)nitrat [Fe(NO&sub3;)&sub3;·9H&sub2;O, von Sigma Chemicals, St. Louis, MO] und Eisen-Ferritin (als-Apoferritin, gesättigt mit Eisen bei 8,5% (Gew/Gew) (Polysciences, Inc.)), in welchem des Fe³&spplus; im zentralen Hohlraum des Apoproteins in einem molaren Verhältnis zum Protein von bis zu 4,500 : 1 eingeschlossen ist, die Rotationskorrelationszeit des ionischen Eisens aber nicht aufgrund direkter Bindung an das Protein verlängert ist), verglichen. Die folgende Tabelle 1 beschreibt viele der obigen Ergebnisse. Tabelle 1 Verbindung Konzentration (ug/ml), die eine 50%ige Abnahme der Wasser-Tl-Zeit erzeugt R1 Relaxationswirkung Dextran-Fe Eisen(III)nitrat Fe-Ferritin
Die Bestinunung (der Fe³&spplus;-Konzentration, die eine 50%ige Abnahme der Wasserprotonen T1-Zeit bewirkt) mit Hilfe des genaueren Verfahrens zeigte, daß die lockere Bindung des Eisens an makromolekulares Dextran die spezifische paramagnetische Aktivität von Fe³&spplus; um das 2,21-fache im Vergleich zu Eisen(III)nitrat (42/19 ug/ml) erhöht - niedrigere Fe-Konzentrationen zeigen eine höhere ¹H-Relaxationswirkung pro Fe-Atom. Diese erhöhte T1-verstärkende Potenz des Dextran-Eisens geht auf die langsamere Rotationskorrelationszeit des Eisens nach Komplexbildung mit dem größeren Dextranträger zurück. Ferritin-Fe war weniger wirksam als Eisen(III)nitrat (50% Aktivitätsvielfaches = 0,42, entsprechend 42/100 ug/ml). Diese verminderte Potenz beruht auf der teilweisen Sequestrierung des ionischen Eisens im zentrale Hohlraum des Apoferritin-Proteins, die die An/Ab-Austauschgeschwindigkeit der externen Wasserprotonen während der T1-Relaxationsphase senkt. Diese Senkung der Potenz ist sogar unter Bedingungen zu beobachten, bei denen durch die monomolekulare Hülle des Einschlußproteins eine sehr geringfügige Diffusionsschranke erzeugt wird. Sie bekräftigt die noch größeren Senkungen der Relaxationspotenz, die oben für paramagnetische Metalle, die in Liposomen und stabilisierten Albumin-Mikrokugeln eingeschlossen sind, berichtet und beobachtet wurden.
Obwohl durch die bedeutende Verstärkung der Potenz, die für Dextraneisen ("Poferdex") beobachtet wurde, zusammen mit seiner makromolekularen Beschaffenheit, nahe gelegt wurde, daß es ein geeigneter Prototyp eines T1-Kontrastmittels zur intravenösen Verabreichung und begrenzten biologischen Verteilung (zunächst innerhalb des Blutgefäßsystems) sein könnte, hatten extensive klinische Untersuchungen (zur Behandlung von Eisenmangelanämie) gezeigt, daß seine intravenöse (im Gegensatz zur intramuskulären) Verabreichung häufig eine systemische Hypotonie zur Folge hatte [Physicians Desk Reference, (1986), S. 1228]. Dies traf besonders zu, wenn das Mittel über einen Zeitraum von einigen Minuten verabreicht wurde, wie es zur MR-Bildverstärkung nötig ist. Diese in vivo-Toxizität wurde als Folge der raschen Freisetzung des schwach komplexierten Eisen(-oxids) angesehen. Um dies zu überprüfen, wurde Dextran-Eisen ausgiebig dialysiert, und die NMR-T1-Aktivitätsverhältnisse der gesamten Moleküle wurden mit dem 50% Konzentrationsverfahren (siehe oben) verglichen. Bei diesem Verfahren blieben nur etwa 17,7% des Eisens vor der Dialyse an dem Dextranträger komplexiert. Dies erklärt einerseits die in vivo-Toxizität und zeigt andererseits, warum es unwahrscheinlich ist, daß Dextran-Eisen- (und vermutlich auch andere Dextran-Metall) Oxidkomplexe bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen. Aus diesen Ergebnissen war ersichtlich, daß die bevorzugte(n) Ausführungsform(en) zur intravenösen Anwendung mit größerer Wahrscheinlichkeit Dextranträger mit kovalent gebundenen Cheliergruppen enthalten dürften, die Stabilitätskonstanten für die Metallchelatbildung besitzen, die bedeutend höher liegen als diejenigen für Dextran-Eisenoxidkomplexbildung (siehe die folgenden Beispiele). Das Dextran-Eisen könnte jedoch bei der Anwendung im Verdauungstrakt und anderen parenteralen Anwendungen, bei denen die Eisenfreisetzung aus dem Träger unkritischer ist, von bedeutendem Nutzen sein.

BEISPIEL 2

Herstellung von DTPA-Dextran

A. Verknüpfung in wäßrigen Lösungsmitteln

1. Herstellung und Aufrechterhaltung von vollständig löslichen (nicht-aggregierten) Polymerverbindungen.

Das cyclische Dianhydrid von DTPA, hergestellt nach dem Verfahren von Eckelmann et al. [J. Pharm. Sci. Vol. 64, S. 704-706, (1975)] wurde in hochreiner Form von der Calbiochem-Behring Corp. erhalten. 6,0 g des cyclischen Dianhydrids wurden schrittweise zu 1,72 g Dextran T70 (durchschnittliches MG 70.000 Dalton, Pharmacia Chemicals) in einem Reaktionslösungsmittel, das einen HEPES-Puffer (115 mg/100 ml destilliertes Wasser, pH 7,0 bis 8,0 (maximal)) enthielt, zugegeben. Die Umsetzung wurde unter kräftigem Rühren bei Raumtemperatur eine Stunde lang durchgeführt, wobei der pH-Wert nach jeder Teilzugabe von DTPA-Dianhydrid mit Hilfe von NaOH wieder auf pH 7,0 bis 8,0 eingestellt wurde. Das Dextran-DTPA-Produkt wurde von dem nicht gebundenen DTPA durch Dialyse gegen 200 Volumteile destilliertes Wasser bei pH 5,5 abgetrennt. Durch Molekularfiltration wurde festgestellt, daß 97,8% des Dextran-DTPA-Produkts ein Molekulargewicht von weniger als 100.000 Dalton, und nur 1,6% ein Molekulargewicht von mehr als 300.000 Dalton hatten. Die verdünnte Lösung des dialysierten Dextran-DTPA wurde nach einer von drei Methoden auf 5 bis 20% (Gew./Vol.) konzentriert: a) erzwungene Verdampfung mit gefilterter Luft bei Raumtemperatur (bevorzugt); b) Zurückhalten über einem 10.000-MG- Ausschlußfilter (Amicon Corporation) unter Stickstoffdruck; oder c) Lyophilisierung und Wiederaufnahme in physiologischen Lösungen. Nach keinem dieser Verfahren wurde ein nennenswerter Anstieg des mittleren Molekulargewichts erhalten, was durch Molekularfiltration festgestellt wurde (siehe oben). Dies deutete darauf hin, daß nach keinem der drei Konzentrationsverfahren eine nennenswerte intermolekulare Aggregation induziert wurde. Bei den ersten beiden Verfahren (a und b, siehe oben) wurden konzentrierte Salze und Puffer in der benötigten Menge zugegeben, um die endgültigen Präparate zur anschließenden Injektion physiologisch einzustellen. In jedem Fall wurde sorgfältig darauf geachtet, daß der pH-Wert bei oder unterhalb 8,0 gehalten wurde (allgemein zwischen 6,5 und 7,0), um eine Aggregation des Dextran-DTPA nach der Konjugatbildung zu verhindern. (Zur absichtlichen Herstellung von Mikroaggregaten aus diesem löslichem Polymer, siehe weiter unten).
2,1 g Gadolinium in Form von GdCl&sub3;·7,05 H&sub2;O (Alfa Laboratories) in 10 ml destilliertem Wasser wurden zu 1,38 g des konzentrierten Dextran-DTPA-Konjugats in destilliertem Wasser, (mit NaOH auf ein pH-Wert von 5,5 eingestellt), gegeben. Das nicht gebundene Gadolinium wurde mit Hilfe der Molekularfiltration durch ein MG-10.000-Ausschlußfilter aus dem Dextran-DTPA-Gadoliniumkomplex abgetrennt. Das freie Gadolinium wurde mit Hilfe von Standardtitrationen zur Komplexbestimmung mit Xylenol-Orange [Lyle et al., (1963), Talanta Vol. 10, S. 1177] bestimmt und für jede Zubereitung minimiert. Als bevorzugte Alternative wurde die Bindungskapazität des Polymers im Voraus bestimmt und die Menge an Gd genau stöchiometrisch angeglichen, wodurch weder freies Gd, noch freies polymeres DTPA übrigblieben. Diese Standardtitrationen zur Komplexbestimmung wurde auch angewendet, um die Gesamtmenge Gadolinium in jedem Präparat nach der oxidativen Säurehydrolyse der organischen Matrix und der anschließenden Neutralisation des freigesetzten Gd zu bestimmen. Frisch hergestellt ist jeder 12,2-te Zuckerbaustein an einen aktiven DTPA-Bindungspartner gebunden, bei insgesamt 32 Gd-Bindungspartnern je 389 Glucosebausteinen. (Voraussichtlich können durch Erhöhung der Menge an DTPA-Anhydrid und Aufrechterhaltung einer kontinuierlicheren Einstellung des Reaktions-pH-Wertes mit einem pH-Stat, bedeutend höhere Derivatisierungsverhältnisse erzielt werden, ohne daß eine nennenswerte Trägervernetzung erfolgt.) Die in vitro-T1-Relaxationswirkung, R1, in physiologischer Kochsalzlösung ist größer als 100/(mM·Sek.) (IBM PC20 Minispektrometer, IBM Instruments). (Zum Vergleich, die R1 von GdCl&sub3; lag bei 3,03/(inM·Sek.)). Die Osmolalität von löslichem Gd-DTPA-Dextran T70, bestimmt nach dem Dampfdruckverfahren (Wescor Model 5100B Osmometer, Wescor Instruments), liegt bei oder unterhalb 3590 mOsm/kg Produkt. Als letzte Qualitätskontrolle wurde das konzentrierte Produkt (Gd-DTPA-Dextran) in einem Analysegerät für ionisiertes Calcium (Orion Biomedical Instruments) getestet, um sicherzustellen, daß es eine zu vernachlässigende Kalziumbindungskapazität hatte. Dies wurde sowohl als zusätzliche Überprüfung der Gd-Bindungsstöchiometrie, als auch als Sicherheitsmaßnahme durchgeführt, um jede Möglichkeit einer akuten Senkung des Calciumspiegels im Serum nach intravenöser Injektion auszuschließen (wodurch Komplikationen der Herzkranzgefäße und Starrkrämpfe vermieden werden).
Es wurden zwei andere lösliche DTPA-Dextran-Derivate mit unterschiedlichen Molekulargewichten aus Dextranen mit MG 100.000 (Dextran T10, Pharmacia Chemicals) und MG 40.000 (Dextran T40, Pharmacia Chemicals) synthetisch hergestellt. Die Umsetzungen wurden analog zu der eben beschriebenen Weise durchgeführt, und die entstandenen Konjugate wurden mit Gd in stöchiometrischen Mengen cheliert (bestimmt durch Titration von Gd + EDTA gegen Xylenol-Orange zur Komplexbestimung), um a) lösliches Gd- DTPA-Dextran T10 (MG = 11.000; R1 = 4,24/(mM·Sek.)); und b) Gd-DTPA-Dextran T40 (MG = 43.000) zu bilden.

2. Herstellung von Mikroaggregaten aus dem löslichen Polymerkonjugat

Falls gewünscht, werden Mikroaggregate (mit einem Durchmesser im Bereich von 3 bis 100 nm) direkt, durch Zugabe von NaOH zu dem Produkt (in einer Konzentration von mindestens 8% (Gew./Vol.) in 0,02 M Phosphatpuffer + 0,15 M NaCl), bis der End-pH-Wert bei oder oberhalb 8,2 liegt (vorzugsweise 8,5 bis 9,0), und Inkubation des Produkts, entweder bei Raumtemperatur, oder 4ºC über einen Zeitraum von 16-48 Stunden, aus dem löslichen Gd-DTPA-Dextran-T70 Polymer hergestellt. Es bilden sich Mikroaggregate infolge von Ionenladungseffekten, die nach intravenöser Verabreichung vom Standpunkt der biologischen Verteilung auf retikuloendotheliale Organe stabil sind (siehe Beispiel 3).

B. Konjugatbildung in nicht-wäßrigem Lösungsmittel

Diese wurde wie oben durchgeführt, mit der Abweichung, daß die Ausgangsreaktanten in N,N-Dimethylformamid suspendiert wurden (das wegen der günstigen Temperaturstabilität bevorzugt wurde). Ein zweites Lösungsmittel, das erwartungsgemäß eine vergleichbare Konjugatbildung erlauben sollte, ist N,N-Diethylacetamid; dieses kann auf Grund der verbesserten Stoffwechselanfälligkeit seiner Zwei-Kohlenstoff- Fragmente und der somit verminderten Toxizität in vivo biologisch vorteilhaft sein, falls Spuren des organischen Lösungsmittels nach der Dialyse im DTPA-Dextran zurückbleiben. Da keines der Substrate (weder Dextran noch DTPA- Anhydrid) vollständig in N,N-Dimethylformamid löslich ist, ist die Kinetik der Konjugatbildung recht langsam (etwa 12 bis 16 Stunden). Folglich wurden für die vorliegende Umsetzung 44 mg hochreines bis-cyclisches DTPA-Anhydrid (Calbiochem-Behring Corp.) zu 20 mg Dextran T70 (durchschnittliches MG = 70.000 Dalton, Pharmacia Chemicals), das in 1,5 ml trockenem N,N-Dimethylformamid (Baker Chemicals) suspendiert worden-war, zugegeben, wobei die Konjugatbildung mit oder ohne Kühlung bei 4ºC (beide Temperaturen ergaben gleichwertige Ergebnisse) durch Ultraschallbehandlung und kräftiges Rühren des Reaktionsgemisches beschleunigt wurde. Unter diesen Bedingungen schritt die DTPA-Konjugatbildung rasch voran und erreichte nach 15 bis 30 Minuten ein Plateau. An diesem Punkt wurde NaOH zugegeben, entweder a) in Form von pulverisierten Tabletten zum Zeitpunkt der vollständigen Konjugation, unmittelbar vor der Hydrolyse eines etwaigen Überschusses an nicht umgesetztem DTPA-Dianhydrid mit einem zweifachen Überschuß Wasser (unter kräftigem Rühren und Ultraschallbehandlung); oder b) in Form einer wäßrigen Lösung, gleichzeitig mit der Hydrolyse eines etwaigen Überschusses an nicht umgesetztem DTPA-Dianhydrid (beide Verfahren ergaben gleichwertige Ergebnisse). Bei Versuchen zur Minimierung der durch den pH-Wert verursachten Mikroaggregation wurde die NaOH-Menge sorgfältig so eingestellt, daß sich bei der Bildung der wäßrigen Mischung ein pH-Wert von 6,0 ergab. Dieses nicht-wäßrige Verfahren hatte eine 1,7-fache Erhöhung der Komplexierungsverhältnisse von Gd zu Dextran T70 zur Folge und senkte die erforderliche Menge an DTPA-Dianhydrid um einen Faktor von 1,8. Bei einem frisch hergestellten Präparat in N,N- Dimethylformamid war jeder 7,2te Zuckerbaustein an einem aktiven DTPA-Bindungspartner konjugiert, bei insgesamt 54 Gd-Bindungspartnern auf 389 Glucosebausteine. Das erhaltene Produkt hatte ein R1 in physiologischer Kochsalzlösung von mehr als 50/(mM·Sek.). Nach den Bestimmungen a) in vitro durch Mikroskopie und Lichtstreuung und b) in vivo durch biologische Verteilungsmuster (siehe unten) war die physikalische Form dieses DTPA-Dextran-Konjugats in der organischen Phase mäßig bis stark und vorwiegend mikroaggregiert, mit einem Durchmesser bis zu 0,1 bis 0,2 Mikrometer.
Es wurde eine analoge Synthese in organischer Phase durchgeführt, indem dieselben Mengen (siehe oben) an DTPA- Anhydrid und Dextran T70 getrennt in Dimethylsulfoxid gelöst wurden, worauf diese, nachdem die einzelnen Reagenzien maximal gelöst waren, zusammengemischt wurden, die Mischung 8 bis 18 Stunden entweder bei 4ºC oder bei 22ºC (beide Verfahren ergaben gleichwertige Ergebnisse) gerührt wurde und die Konjugate langsam (unter Rühren) mit destilliertem Wasser unter Beibehaltung eines pH-Werts von 7,0 hydratisiert wurden. Beide Verfahren ergaben Konjugate, deren physikalische Form mäßig bis stark mikroaggregiert war, mit einem Durchmesser bis zu 0,1 bis 0,2 Mikrometern (in vitro, wie oben beschrieben, bestimmt).
Im Vergleich zu dem vorangegangenen Verfahren in wäßriger Phase werden die geringfügigen Vorteile, die bei dieser Synthese in organischem Lösungsmittel durch Substrateinsparungen und Derivatisierungsverhältnisse zu beobachten sind, deutlich aufgewogen durch: a) die intermolekulare Vernetzung (kovalente Mikroaggregationen), die bei der Konjugatbildung in organischer Phase (wegen der sehr langsamen Hydrolysegeschwindigkeit der Anhydride der zweiten Gruppe in nicht-protonenhaltigen Lösungsmitteln) auftritt (und dafür typisch ist); und b) die verminderte Gd-Relaxationswirkung, die offensichtlich auf eine mikroaggregatinduzierte Behinderung der Wasserprotonenaustauschgeschwindigkeiten (siehe Beispiel 4, Tabelle) zurückzuführen ist. Dies führt wiederum zu deutlichen Nachteilen bei der biologischen Verteilung des Produkts, den Beseitigungsgeschwindigkeiten und dem Zugang zum Tumor nach intravenöser Verabreichung (siehe Beispiel 3). Somit sind die Konjugatbildungen in wäßriger Phase gegenüber denen in organischer Phase die bevorzugten Verfahren zur Synthese polymerer intravaskulärer Kontrastmittel, da die Synthese in organischer Phase die Zubereitung vollständig löslicher (nichtvernetzter) Produkte nicht erlaubt. Diese Eigenschaft ist für die medizinische Brauchbarkeit und die regulatorische Verträglichkeit unabdingbar.

C. Allgemeine Eigenschaften von DTPA-Dextranen.

Es wurden bildverstärkende Mittel aus Dextran-DTPA, besonders mit Gadolinium bei unterschiedlichen Bedingungen und mit verschiedenen Dextranen in unterschiedlichen Ansätzen hergestellt. Jeder Ansatz wurde lyophilisiert und war, wie festgestellt wurde, bei Lagerung bei Raumtemperatur (22ºC) länger als ein Jahr stabil. Physiologische Lösungen dieser Mittel waren ebenfalls stabil und ergaben nach einem Jahr bei 4ºC keine Freisetzung von freiem Gd. Es wurden spezielle Ansätze von bildverstärkenden Mitteln aus Dextran- DTPA mit Molekulargewichten von 10.000, 40.000 und 70.000 Dalton hergestellt, obwohl das Verfahren auch über einen Größenbereich von mindestens 1.000 Dalton bis 2.000.000 Dalton brauchbar ist. Das hohe Derivatisierungsverhältnis, das sowohl für wäßrige als auch für nichtwäßrige Konjugatbildungen beobachtet wurde, geht auf die leichtere Bildung von Esterbindungen im Vergleich zu Amidbindungen, die in Konjugatbildungen mit primären Proteinaminen (siehe Hintergrund) entstehen, zurück. Während Esterbindungen ausreichend stabil sind, um zunächst eine gezielte Einbringung und eine Gewebe- und Zellaufnahme, die der des Trägermoleküls entspricht, zu ermöglichen, werden sie in den betroffenen Zellen und im Serum auch rascher als Peptitbindungen biologisch abgebaut. Dadurch wird die Toxizität vermindert, indem eine schnellere Abspaltung des Gd-DTPA von dem lokalisierten Träger und somit eine schnellere Freisetzung von diesen ursprünglichen Lokalisierungen (Einschlußstellen) und eine raschere und vollständigere Ausscheidung von Gd-DTPA aus dem Körper durch Nierenausscheidung (siehe Beispiel 3) ermöglicht wird. Die erhöhte Rotationskorrelationszeit des Dextran-Makromoleküls und seine hydrophile Beschaffenheit (die die rasche Bindung/Abspaltung von Wasserprotonen erlaubt) verstärken die paramagnetische Effizienz (spezifische Aktivität) jedes Gd bei wäßrigen Konjugaten (löslich) um das 4,5-fache, und bei den nichtwäßrigen Konjugaten (Mikroaggregaten) um das 2,2-fache (siehe Beispiel 4, Tabelle). Die gesamte negative Ladung der Hydroxylgruppen der Glucosebausteine (die bei einem physiologischen pH-Wert schwach ionisiert sind) trägt zur Stabilisierung der Gd³&spplus;-Bindung durch elektrostatische Effekte bei und erhöht somit die Gd-Stabilitätskonstante auf deutlich über 1017. Die Kombination dieser Eigenschaften führt zur wesentlichen Senkung der Dosis, des biologischen Austausches in vivo und der Toxizität des Gd. Das hohe Derivatisierungsverhältnis (Gd-DTPA je Dextran) minimiert auch die benötigte Menge an Trägermaterial zur MR-Bildverstärkung in vivo. Dadurch wird die Gesamtosmolalität auf Werte herabgesetzt, die die unmittelbare intravenöse Injektion von MRI-Dosierungen erlauben, ohne daß eine unakzeptable akute Ausdehnung des Plasmavolumens erfolgt.

BEISPIEL 3

In vivo Pharmakokinetik und biologische Verteilung der bildverstärkenden Mittel

A. Lösliche Mittel

Die in Beispiel 1 beschriebenen löslichen, MG-78.000-Dextran-DTPA-Gadolinium-Chelate (wäßriges Lösungsmittel-Verfahren) wurden direkt in Mäuse und Ratten gespritzt. Bei den gewöhnlichen Dosen von 25 bis 250 mg/kg bei Ratten verschwindet das chelierte Gd im Blut mit Halbwertszeiten von etwa 50 und 180 Minuten für die beiden Hauptbestandteile, was mit Hilfe des Radioisotops ¹&sup5;³Gd festgestellt wurde. Dies bedeutet eine bis zu 3-fache Erhöhung des MR- Abbildungsfensters im Vergleich zu Gd-DTPA. Eine Anpassung zur-Kupplung von DTPA an biologisch verträgliche Kohlenhydratträger mit unterschiedlichen Molekulargewichten von 1.000 bis 2.000.000 Dalton ist möglich. Durch die Verwendung von Kettenlängen kürzer als 70.000 Dalton (d. h. 1.500 bis 40.000 Dalton) konnten die Beseitigungszeiten bis auf die von Gd-DTPA-verkürzt werden. Dadurch kann auch die Neigung des Kontrastmittels zu Auswanderung aus den Gefäßen in die Tumore und die entzündlichen Schädigungen leicht erhöht werden. Andere mögliche Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide umfassen auch Alpha-, Beta-, und Gamma- Cyclodextrine, Poly-Cyclodextrine, Glucose, Glykogen, Maltose, Stärke (und seine Derivate, d. h., Hydroxyethyl-, Carboxymethyl- und Aminoethyl-) Blutgruppenoligosaccharide und ihre Aminderivate, Mucopolysaccharide und ihre Oligomere, Heparine, Heparan, Heparansulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und verwandte, natürliche und synthetische, wasserlösliche Polykohlenhydrate und ihre Derivate.
Bei Mäusen verschwindet das Gd als ¹&sup5;³Gd-DTPA-Dextran 70 aus dem Blut in der halben oder einem Drittel der Halbwertszeit, die bei Ratten beobachtet wurde (siehe oben). Obwohl die Beseitigungsgeschwindigkeit bei Ratten mehr über die beim Menschen zu erwartende aussagt, hat diese beschleunigte Ausscheidungsgeschwindigkeit bei Mäusen wichtige Auswirkungen auf die anschließenden Beispiele, die sich mit in vivo-Potenzen befassen (sowohl als T1-Relaxationswirkung als auch MR-Abbildungsarten): Erstens läßt der Vergleich dieser NMR-Veränderungen in einer festgelegten Zeitspanne (d. h. 30 Minuten nach der Injektion) das lösliche Polymer in Ratten wirksamer als in Mäusen erscheinen, während beim Vergleich der Zeiten mit gleichen Blutwerten die beiden Tierarten gleichwertige Ergebnisse liefern. Zweitens erscheint beim Vergleich des löslichen Polymers mit seiner Mikrokugelform (hergestellt aus demselben löslichen Polymer), z. B. innerhalb eines 30-Minuten-Zeitraums nach der Injektion, die Mikrokugelzubereitung beträchtlich wirksamer (bei der Leberverstärkung) als das lösliche Polymer (bei der Tumorverstärkung). Das liegt daran, daß die Ausscheidung der Mikrokugeln aus der Leber eine Größenordnung langsamer erfolgt (siehe unten) als die Ausscheidung des löslichen Polymers aus einem typischen Tumor. Bei der Überwachung von entsprechend kürzeren Zeiträumen nach der Injektion (20 Minuten bei Mäusen; 30-45 Minuten bei Ratten) ist das lösliche Polymer jedoch den Mikrokugeln in der Potenz tatsächlich sehr ähnlich.

B. Mittel in Mikrokugelform.

Sowohl bei Ratten als auch bei Mäusen beträgt die Halbwertszeit für die Ausscheidung des Gd in Gd-DTPA-Dextran- Mikrokugeln (0,1 bis 0,5 Mikrometer Durchmesser) aus dem Blut etwa 15-20 Minuten (bestimmt durch NMR-T1-Veränderungen in den frisch herausgeschnittenen Organen). Bei Ratten werden etwa 50% des Gd in Mikrokugeln innerhalb von etwa 2 Stunden durch die Nieren ausgeschieden (gleiches Verfahren). Erste Untersuchungen (Methode mit radioisotopem ¹&sup5;³Gd und NMR-T1-Methode) zeigen, daß der restliche Anteil des Gd in Mikrokugeln, der über zwei Stunden hinaus in der Leber eingeschlossen bleibt, mit einer Halbwertszeit von 5-6 Tagen ausgeschieden wird. Diese langsamere Ausscheidung erfolgt sowohl auf dem Verdauungsweg (hauptsächlich), als auch über die Niere (wenig) und ist in Bezug auf die Geschwindigkeit mit derjenigen von nativem Dextran 70, bei Ausscheidung über die Leber, vergleichbar.

C. Mittel in Mikroaggregatform.

Bei Mäusen verschwindet das Gd in Gd-DTPA-Dextran-Mikroaggregaten (3-100 Nanometer Durchmesser) aus dem Blut in Abhängigkeit von ihrer Größe (die t1/2-Werte steigen mit kleinerer Größe - ¹&sup5;³Gd-Verfahren) in 60 bis 240 Minuten. Die biologischen Verteilungen variierten ebenfalls in Abhängigkeit von der Größe, jedoch wurden typischerweise 40 bis 75% des Mittels durch die Leber ausgeschieden. Maximale Leberkonzentrationen traten 24 Stunden nach der Injektion auf. Die anschließende Ausscheidung durch die Leber erfolgte mit einer Halbwertszeit von 5-6 Tagen (gleiches Verfahren).

D. Vergleichende biologische Verteilungen von löslichen und mikroaggregierten Gd-DTPA-Dextranen.

Die folgende Tabelle veranschaulicht typische Ergebnisse der biologischen Verteilung, die 33 Minuten nach der Injektion von ¹&sup5;³Gd-DTPA-Dextran T70 in Spurenmengen, als lösliches Polymer oder Mikroaggregate, in schweizer Nacktmäuse mit menschlichen Melanomtumoren (BRO), erhalten wurden. Organkonzentrationen von Gd (uM) Organ Lösliches Mittel Mikroaggregiertes Mittel Leber Tumor (maximal) Niere * Die Sequestrierung dieser Mikroaggregate in der Leber steigt mit der Zeit weiter an und erreicht nach etwa 24 Stunden bei 130% des 33 Minuten-Wertes den Höhepunkt. (Dieser verzögerte Anstieg wird bei dem löslichen Mittel nicht beobachtet.)
Bei dem mikroaggregierten Mittel waren die Tumorkonzentrationen insgesamt gesenkt, was auf: a) eine starke kompetitive Aufnahme durch die Leber und b) die Unzugänglichkeit der Tumore für die supramolekularen Aggregate aufgrund der kleineren Größe der Tumorkapillar-"Poren" zurückzuführen ist.

BEISPIEL 4

Herstellung und Verwendung von Mikrokugeln

Das lösliche Polymer nach Beispiel 2 wurde auch durch eine Modifikation des Verfahrens, die vom Anmelder in einer neueren Ausgabe von Science [Vol. 227, S. 182, (1985)] veröffentlicht wurde, in die Form von sehr kleinen (0,1- 0,5 um) hydrophilen Mikrokugeln gebracht. Zusammenfassend wurde bei diesem Verfahren zunächst eine Emulsion des Dextran-DTPA-Gd-Komplexes in einem Öl, wie Baumwollsamenöl, erzeugt. Der emulsierte Komplex wurde dann ultraschallbehandelt, um kleinere Mikrokugeln zu erzeugen. Das Öl wurde mit einem flüchtigen organischen Lösungsmittel extrahiert (Äther oder Hexan), und die Mikrokugeln wurden lyophilisiert. Im Gegensatz zu den vorstehend erwähnten Liposomen und Kolloiden ermöglichen diese neuen, sehr kleinen hydrophilen Mikrokugeln einen fast vollständigen Zugang und einen raschen Austausch von Wasserprotonen mit dem gesamten Gd über die Kugelmatrix. Der R1-Wert der Mikrokugeln in physiologischer Kochsalzlösung ist größer als 90/(mM·Sek.). Somit hat das Gd in den Mikrokugeln und in der Polymerform fast Identische in vitro T1-Aktivitäten. Dies stimmt mit dem berichteten Befund überein, daß Zunahmen der Relaxationswirkung von Gd, die durch Makromolekülkupplung hervorgerufen werden, bei Makromolekülgewichten von ≥ 65.000 Dalton ein Plateau erreichen. Somit ist nicht zu erwarten, daß die langsamere Rotation der Mikrokugeln im Vergleich zu dem löslichen Polymer eine weitere Verbesserung der Relaxationswirkung des Gd in Mikrokugelform gegenüber den löslichen makromolekularen Gd ergibt (außer gegebenenfalls unter Flußbedingungen, siehe Beispiel 8, unten) [Lauffer et al., (1985), Mag. Res. Imaging Vol. 3, S. 11].
Bei intravenöser Injektion werden die (zunächst eingefangenen) Mikrokugeln spontan von der Leber, der Milz und dem Knochenmark von Mäusen und Ratten (mit einer Halbwertszeit von etwa 15 Minuten) ausgeschieden. Hier werden sie mit einer Halbwertszeit von 30 Minuten kontrolliert zu löslichem Polymer aufgelöst. Dadurch werden die NMR- Bilder der vorgenannten Organe selektiv verstärkt. Optimale T1-Senkungen wurden in der Leber von Mäusen erzielt, indem niedrigere Gd-Injektionsdosen (0,01 bis 0,02 mMol/kg) verwendet wurden, als sie normalerweise zur Standardkontrastverstärkung in klinischen Abbildungen verwendet werden (Gd-DTPA, 0,10 bis 0,30 mMol/kg). Das letztgenannte Mittel ergibt minimale Veränderungen der Leber T1-Werte während der üblichen Aufnahmezeit von 30 Minuten.
Bei Versuchen mit Ratten wird eine Verstärkung von Leberbildern mit Mikrokugeldosen erzielt, die 10 bis 27-mal niedriger als die für Gd-DTPA erforderlichen Dosen liegen. Dieser bedeutende Dosisvorteil ist durch die kombinierte Wirkung von vier Formmerkmalen bedingt: die erhöhte Rotationskorrelationszeit von Gd in Mikrokugelform, das verbesserte Eindringen von Wasserprotonen in die hydrophile Matrix und die rasche Anbindung/Ablösung an (oder nahe an) Gd, den extrem kleine Durchmesser der Mikrokugeln, und die selektive Aufnahme der Mikrokugeln durch die Zielorgane. Folglich sind diese Mikrokugeln in vivo in den geringsten Dosen aller angegebenen Zusammensetzungen wirksam (bis herab zu 0,007 mMol/kg).
Die folgende Tabelle gibt viele der oben beschriebenen Ergebnisse wieder. Konzentrationen an Gesamtmaterial und Gadolinium, die zur Erzeugung einer 50%-Senkung der T1 von Wasserprotonen (in vitro) nötig sind (IBM PC 20 Minispektrometer, 20 MHz) Probenmaterial Materialkonzentration (ug/ml) Gadoliniumkonzentration Spez.Gd.-.Aktivitätsverh.* Lösliches Gd-DTPA-Dimeglumin (Schering) In Mikrokugeln eingeschlossenes, aber unkonjugiertes Gd-DTPA (Dimeglumin) Lösliches Dextran-DTPA-Gd-Polymer (1 DTPA/22 Glucose) (MG = 78.000 Dalton) Mikrokugeln, hergestellt aus dem 78.000 Dalton Dextran-DTPA-Gd-Polymer Mikroaggregae aus Dextran-DTPA-Gd, die in DMF als org. Lösungsmittel synthetisiert wurden (1 DTPA/7 Glucose * Niedrigere Gadoliniumkonzentrationen zeigen eine höhere ¹H-Relaxationswirkung je Gd-Atom an. Ein höheres spezifisches Aktivitätsverhältnis für T1 entspricht einer Erhöhung der MR-Signalintensität, die pro Gadoliniumatom erzielt wird (und eine erhöhte, in vivo erzielte Bildintensität). ** Diese Linien zeigen die Beziehungen an, die die Verhältnisse ergeben.

BEISPIEL 5

In vivo NMR-Verstärkung normaler Gewebe:

Leber, Milz und Knochenmark

Sprague-Dawley Ratten wurden mit einem klinischem 0,35- Tesla, Diasonic MR-Bildsystem und einer 30 cm RF-Spule abgebildet. Es wurden drei klinisch bedeutsame Pulssequenzen verwendet: 1) Spin-Echo mit einer TR von 0,5 Sekunden (bei T1-gewichteten Bildern), 2) Inversionsregeneration (IR) (bei T1-gewichteten Bildern) und 3) Spin- Echo mit einer TR von 2,0 Sekunden (bei T2-gewichteten Bildern). Es wurden die Diasonics-Programme verwendet, um die flächengemittelten Gewebeintensitäten vor und nach der Injektion der Kontrastmittel zu berechnen. Weiterhin wurden Zwei-Pulssequenzen (Spin-Echo, mit TR-Werten von 0,5 und 1,5 Sekunden oder 1,0 und 2,0 Sekunden) verwendet, um die in vivo T1-Relaxationszeiten zu berechnen. Nach Abschluß der Aufnahmen wurden die Leber, die Milz und die Nieren herausgeschnitten und ihre T1 (IR) und T2-(Carr- Purcell-Meiboom-Gill) Relaxationszeiten bei 37ºC mit einem IBM PC 20 Minispektrometer bestimmt. Für diese in vitro Experimente wurden nicht injizierte Ratten anstelle von Präinjektionskontrollen verwendet.
Es wurden zwei Kontrastmittel bei gleichwertigen in vitro Dosierungen verglichen: 1) Gd:DTPA Dimeglumin (0,3 mMol/kg; Schering AG) und 2) die 0,1-0,5 um hydrophilen Gd:DTPA-Dextran-Mikrokugeln, die von dem Anmelder von Nr. 2 hergestellt wurden (0,009 mMol/kg); mit der 4,1-fachen in vitro Leistungsfähigkeit von Gd:DTPA-Dimeglumin. Es wurden Bildserien nach der Kontrastbildung, beginnend unmittelbar nach der intravenösen Injektion der Kontrastmittel, auf genommen und danach über mehrere Stunden fortgesetzt. 30 Minuten nach der Injektion senkten die drei verstärkenden Mittel die T1-Werte der Abbildungen wie folgt: %-Senkung von T1 (30 Minuten nachher, bzw. vorher) Leber Niere GD : DTPA-Dimeglumin Gd : DTPA-Dextran-Mikrokugeln
Die Bildintensitäten waren umgekehrt proportional zu der Senkung der T1-Relaxationszeiten erhöht (verstärkt). Das Organmuster der T1-Veränderungen (Tabelle oben) belegte die selektive Aufnahme der Gd:Mikrokugeln, nicht aber von Gd:DTPA-Dimeglumin (das statt dessen in der Niere konzentriert wurde) durch die Leber. Die Leberverstärkung durch Gd:Mikrokugeln blieb über einen Zeitraum von 2,5 Stunden nach der Gd:Mikrokugelgabe, nicht aber nach der Gd:DTPA- Dimgelumingabe unverändert (bei dem letztgenannten Mittel ging die gesamte Leberverstärkung nach 50 Minuten verloren). Somit wurde eine optimale selektive Verstärkung der Leber mit Gd:DTPA-Dextran-Mikrokugeln bei einer Gd- Dosis erreicht, die 10 bis 20-mal unter derjenigen lag, die für das Gd:DTPA-Dimeglumin-Mittel erforderlich ist. Die Gd-Mikrokugeln verlängerten außerdem die Zeitspanne der Bildverstärkung von Minuten auf Stunden. Auf den Post- Injektonsbildern von Lebewesen, die Gd-Mikrokugeln (nicht aber Gd:DTPA-Dimeglumin) erhalten hatten, waren die dem Knochenmark entsprechenden Bildpunkte dem visuellen Eindruck nach ähnlich verstärkt, jedoch war die Zahl der Bildpunkte, die jedem Rattenknochen entsprach, zu klein, um sie zahlenmäßig zu quantifizieren. Die Milz von Ratten konnte aufgrund ihrer kleinen Größe und der Nähe zur Leber nicht abgebildet werden, jedoch zeigten die in vitro T1- Veränderungen der frisch herausgeschnittenen Organe, daß die Milz verstärkte T1-Werte im Verhältnis zu denen der Leber hatte (siehe nächster Absatz). Die T1-Werte vor der Verabreichung wurden mit den T1-Werten von Milzorganen 35 Minuten nach Verabreichung der Mittel verglichen.
Die T1 und T2-Relaxationszeiten der frisch herausgeschnittenen Organe (gemessen mit einem IBM PC20 Minispektrometer) sanken im Verhältnis zu denjenigen, die mit Hilfe des Bildaufnahmegeräts erhalten wurden. Die T1- Veränderungen übertrafen alle die Veränderungen der T2- Zeiten. Die normalisierten in vitro T1-Veränderungen in den Milzorganen von Ratten waren im einzelnen:

%-Senkung der Milz-T1

(35 Minuten nach bzw. vor)

1. Gd:DTPA-Dimeglumin 14,4
2. Gd:DTPA-Dextran-Mikrokugeln 61,2
Somit zeigten die in vivo und in vitro Analysen zusammen, daß die Gd:DTPA-Dextran-Mikrokugeln eine deutlich verbesserte Verstärkung der MR-Bilder und/oder der T1-Relaxationswirkung in den vorausgesagten Zielorganen ergab: in der Leber, dem Knochenmark und der Milz.

BEISPIEL 6

In vivo NMR-Bildverstärkung eines primären Lebertumors (Hepatom)

Mit Hilfe einer direkten Nadel-Einstich-Technik wurden Zellsuspensionen des syngenen, transplantierbaren, metastasierenden Morris-Hepatoms (Linie 7777) orthotopisch in die rechten Leberlappen von 650 g schweren Ratten der Buffalo-Linie injiziert. Nach zwei oder drei Wochen hatten die lokalen Tumore einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,5 bis 1,5 cm erreicht. Die Ratten wurden vor und nach der intravenösen Injektion von Gd-DTPA oder mikrokugelförmigem Gd-DTPA abgebildet. MR-Abbildungen wurden in einer 30 cm RF-Spule mit einem klinischen 0,35 Tesla MRI-System von Diasonics (wie oben beschrieben) erzeugt. Die Bilder wurden nach der Kontrastierung als Serie, die unmittelbar nach der Injektion begann und sich über einige Stunden danach fortsetzte, auf genommen.
Die Gd:DTPA-Dextran-Mikrokugeln erzeugten im Verhältnis zur umgebenden normalen Leber und allen anderen Organen der Ratte eine selektive Verstärkung des Tumors (anhand visueller Beurteilung). Die Tumorverstärkung war in der T1-Stellung (Spin-Echo mit TR-Zeiten von 0,5 und 1,0 Sekunden; und Inversionsregeneration) maximal, war jedoch auch bei der T2-Einstellung (Spin-Echo mit TR-Zeiten von 2,0 Sekunden) zu beobachten. Die Tumorverstärkung wurde 25 Minuten nach der Injektion deutlich und blieb während der Abbildungen über einen Zeitraum von 2,5 Stunden nach der Injektion unverändert. Gd: DTPA-Dextran-Mikrokugeln (bei 0,011 mMol/kg) ergaben eine Bildverstärkung, die in Bezug auf die Intensität mit der von Gd-DTPA-Dimeglumin (bei 0,1 mMol/kg) vergleichbar war.
Die Hauptunterschiede zwischen diesen beiden Mitteln waren die Dosis (Gd-Mikrokugeln ergaben eine gleichmäßigere Verstärkung mit verbesserter Abgrenzung (Kontrast) zwischen den Tumorgrenzen und der benachbarten normalen Leber), und die Fortdauer des Kontrasts (der Gd:DTPA-Dimeglumin- Kontrast war 1,5 Stunden nach der Injektion bedeutend verringert). Eine in vivo Quantifizierung des Anstiegs der Tumorbildintensität war wegen des geringen Volumens des Tumorgewebes und der Ungleichmäßigkeit der Tumore schwierig zu erhalten. Die in vitro T1-Messungen, die an dem herausgeschnittenen Tumor und der Leber nach 2,5 Stunden durchgeführt wurden, bestärkten jedoch die in vivo beobachtete Gesamtverstärkung des Tumors wie folgt: Buffalo-Rattengewebe in vitro T1 (mSek.) Tumor (Hepatom) Benachbarte normale Leber Vor der Injektion Nach der Injektion (2,5 Stunden)
Die prozentuale Senkung der T2-Relaxation des Tumorgewebes nach der Injektion war etwa 2/3 der für T1 beobachteten. Das Ergebnis der Verstärkung war eine Aufhellung des Tumorbildes im Vergleich zu der umgebenden normalen Leber und den anderen abdominalen Organen.

BEISPIEL 7

Bestimmung der in vitro NMR-T1-Relaxation eines Nicht-Leber-Tumors (RIF Sarcom) nach in vivo Infektion von Gd:DTPA-Dextran-Mikrokugeln

Die selektive Aufnahme von Gd-Mikrokugeln durch einen primären Lebertumor (Hepatom) auf Kosten der umgebenden normalen Leber und der anderen Körperorgane war zwar unerwartet, aber mit der 7777-Hepatom-Linie reproduzierbar. Es wurde vermutet, daß dieses zufällige Ergebnis für die meisten festen Tumore, aufgrund der allgemeinen Abwesenheit von Freßzellen, die für die Aufnahme von mikrokugelförmigen Gd verantwortlich sind, in diesen Tumoren untypisch ist. Dies wurde weiter durch die Injektion von syngenen transplantablen RIF-Sarkomen in die Beine von C3H-Mäusen, das Züchten der Tumore bis zu einem Durchmesser von 1 cm und die anschließende intravenöse Injektion der Mäuse mit einer Gd:DTPA-Dextran-Mikrokugeldosis, die mit der oben verwendeten vergleichbar ist, überprüft. Tumore, Leber und Nieren wurden vor und nach der Injektion (45 Minuten) herausgeschnitten und mit einem IBM PC20 Minispektometer auf den Einfluß der Gd-Mikrokugeln auf die T1-Relaxationszeiten untersucht. Die Ergebnisse waren wie folgt: Organ/Gewebe Tl der Kontrolle (mSek.) %-Abnahme nach der Injektion Tumor Leber Nieren
Obwohl diese letztgenannten Tumore sich eher an als in der Leber befanden, legen die Ergebnisse doch sehr nah?, daß das Tumorgewebe in dem üblichen Fall eines nicht-primären Lebertumors, der, wie vorausgesagt, in die Leber eindringt, das Mikrokugel-Gd selektiv ausschließt, während die umgebende normale Leber das Mikrokugelmittel relativ stark anreichert, was zu einem verstärkten Kontrast mit umgekehrtem Bildmuster, im Vergleich zu dem für die vorgenannten Hepatome beobachteten, führt, nämlich einer aufgehellten normalen Leber, die von vergleichsweise dunkleren Tumorknoten umgeben ist.
Die Vorteile der Gd:DTPA-Dextran-Mikrokugeln als bildverstärkendes Mittel für Leberschädigungen (und auch für Milz- und Knochenmarksschädigungen) sind:
1. Erkennung der Schädigungen bei kleineren Größen (gegebenenfalls Millimeter);
2. verbesserte Abgrenzung der Tumorgrenzen zur Beurteilung der chirurgischen Entfernbarkeit;
3. verlängerte Verstärkungszeitspanne (Stunden) zur Erzeugung serieller MR-Bilder und Verkürzung der pro Bild benötigten Zeit;
4. Verabreichung der niedrigsten Gd-Dosis (0,007 bis 0,024 mMol/kg) unter Erzeugung der kleinstmöglichen Toxizität eines leberspezifischen paramagnetischen Verstärkungsmittels.

BEISPIEL 8

Bestimmung der in vitro NMR-T1-Relaxation eines Nicht-Lebertumors (RIF Sarcom) nach in vivo Injektion von zwei löslichen Gd:DTPA-Dextran-Polymeren

C3H-Mäusen, die in ihren Beinen 1 cm große, transplantierbare, syngene RIF-Sarkome trugen (siehe Beispiel oben), wurden zwei lösliche polymere Formen von Gd:DTPA-Dextran mit einer Gd-Dosis von 0,09 mMol/kg intravenös injiziert. Die Tumore, Leberorgane und Nieren wurden vor und nach der Injektion aus den Tieren herausgeschnitten (60 bis 75 Minuten nach der Injektion), worauf die Wirkungen des lokalisierten Gd auf die T1- Relaxationszeiten der Organe und Tumore mit einem IBM PC20 Minispektrometer bestimmt wurden. Organ/Gewebe MG des Polymers (/1000) Tl der Kontrolle (Millisek.) %-Abnahme nach der Injektion 1. Tumor 2. Leber 3. Nieren
Diese Ergebnisse zeigen, daß, wie für einen nicht-primären Lebertumor, wie RIF, vorausgesagt wurde, die größere (MG 70.000) lösliche polymere Form des Gd:DTPA-Dextrans das umgekehrte Muster der Tumor- und Leberaufnahme im Vergleich zu demjenigen, das gerade für die Gd-Mikrokugel- Rezeptur belegt wurde, ergibt. Dieses Muster ist mit dem MG-10.000-Polymer wegen seiner relativ raschen Ausscheidung durch die Nieren (siehe obige Tabelle) nicht zu sehen. Falls der RIF-Tumor in der Leber, anstatt im Bein der Mäuse gezüchtet würde, wäre zu erwarten, daß die selektive Aufnahme des löslichen MG-70.000-Gd-Dextran- Polymers durch den RIF-Tumor in der Leber eine Bildaufhellung des Tumors und eine unveränderte Bildintensität der umgebenden normalen Leber bewirkt (ein Muster der Bildkontrastverstärkung, das dem oben für die Gd-Mikrokugel-Verstärkung von Leberhepatomen gezeigten entspricht).

BEISPIEL 9

Verstärkte Blut-NMR-Bilder, basierend auf differenziellem Blutfluß in den Herzkammern

Es wurden Versuche durchgeführt, die zeigten, daß intravenös verabreichte Mikrokugeln die T1-gewichteten Blutflußbilder der Rattenherzkammern (ungefilterte 5 Minuten- Bilder) in Zeiträumen bis zu 20 Minuten nach der Injektion verstärkten. Gd-DTPA-Dextran-Mikrokugeln (mit 0,3 mMol Gd/kg) wurden zum Zeitpunkt 0 in Spraque-Dawley-Ratten intravenös injiziert, und Bilder wurden sofort und serienmäßig alle 5 Minuten vierfach (Spin-Echo, Multi-Echo, Tk = 0,5 und 1,5) aufgenommen. Unter normalen Flußbedingungen war die Bildverstärkung in den Bereichen mit langsam fließendem Blut entlang der Herzinnenwände am deutlichsten verstärkt. Unter den Bedingungen eines allgemein niedrigen Blutflusses (hervorgerufen durch Coinjektion eines polykationischen Polymers zum Zeitpunkt 0), ergaben dagegen alle Teile der Herzkammern verstärkte T1-gewichtete Blutbilder. Das lösliche Gd-DTPA-Dextran-Polymer ergab bei Injektion einer vergleichbaren Gd-Dosis analoge, aber etwas schwächere Verstärkungen. Das bessere Verhalten von Mikrokugeln unter Flußbedingungen zeigt, daß Faktoren, die mit Strömungsturbulenzen in Zusammenhang stehen, besser von Teilchen als von molekularen Trägern und besser von größeren Molekülen als von kleineren bewältigt werden. Diese Auslegung wird durch den Befund unterstützt, daß das verstarkende Mittel mit sehr kleinem MG, Gd-DTPA (Dimeglumin), fast völlig unwirksam war. Diese Unwirksamkeit war sogar auch dann zu beobachten, wenn direkt in das Herz injiziert wurde und Aufnahmen sofort mit einem Herzsignalfenster durchgeführt wurden (R. Peshock, unveröffentlichte Untersuchungen). Somit scheint es, daß die beiden neuen Kontrastmittel die einzigen mit einer genügend hohen Potenz sind, um mit den verfügbaren Verfahren der klinischen MR-Herzabbildung eine nicht-invasive Verstärkung der Blutflußbilder zu erzeugen.

BEISPIEL 10

Toxikologie

A. Lösliches Gd-DTPA-Dextran T70

Die LD&sub5;&sub0; für intravenös injiziertes Gd-DTPA-Dextran T70 lag in CBA-Mäusen bei 12,3 g/kg. Diese war mit der LD&sub5;&sub0; von nativen Dextran identisch und war durch die akuten osmotischen Wirkungen des Dextran-Trägers bedingt. Bei dem verwendeten Präparat entsprach diese Gesamtdosis 2,26 mMol Gd je kg. Das Verhältnis von toxischer/wirksamer Dosis betrug 90 (= 2,26/0,025 mMol Gd/kg). Außerdem war die LD&sub5;&sub0; von Gd-DTPA-Dextran T70 fünfmal so hoch wie die LD&sub5;&sub0; von GdCl&sub3;. Dies zeigte eine vernachlässigbare in vivo Freisetzung (biologischer Austausch) von cheliertem Gd an.
Nach Verabreichung der 5-fachen Menge der wirksamen MR- Dosis war anhand von histologischen Untersuchungen keine nennenswerte akute oder subakute Leber- oder Nierentoxizität festzustellen. Alle Mäuse blieben normal aktiv, fraßen und tranken normale Mengen, und nahmen genauso schnell wie nicht injizierte Kontrollmäuse zu.

B. Mikrokugelförmiges Gd-DTPA-Dextran T70

Die LD&sub2;&sub0; von Gd-DTPA-Dextran-Mikrokugeln war nach toxikologischen Untersuchungen > 1,250 mg/kg. Um dies einordnen zu können, sei darauf hingewiesen, daß die Bildverstärkung je nach dem verwendeten Präparat mit weniger als 1/5 bis 1/11 der LD&sub2;&sub0;-Dosis durchgeführt wird. Außerdem ergab die histologische Untersuchung der Hauptorgane, die nach der MR-Spektroskopie (in CBA-Mäusen) und der MR-Abbildung (in Sprague-Dawley- und Buffalo-Ratten) herausgeschnitten wurden, kein Hinweis auf eine akute Toxizität (30 bis 60 Minuten).
Es wurden vorläufige subakute toxikologische Untersuchungen wurden in CBA-Mäusen durchgeführt, indem diese zum Zeitpunkt 0 mit einer Gd:DTPA-Dextran-Mikrokugeldosis (250 mg/kg; 0,06 mMol/kg Gd) injiziert wurden, die etwa dem 2,3-fachen der Standarddosis entsprach, die bei bildlichen Darstellungsverfahren verwendet wird. Darauf folgten kleine Anstiege (≤ 2-fach) des Leberenzyms Serumglutamat- Oxaloacetattransaminase (SGOT), das am Tag 3 bis 4 bei 140% der oberen Normalgrenzwerte seinen Höhepunkt erreichte, und bis zum Tag 7 nach der Injektion annähernd in den Bereich der Kontrollen abfiel.
Die subakute histologische Untersuchung der Leber, (die sowohl vom Anmelder, als auch von einem Spezialisten für Leberpathologie durchgeführt wurde), zeigte kleine Veränderungen in den Zonen 1 und 2 auf, die 6 Stunden nach der Injektion begannen und sich in einem leichten Anschwellen und Vakuolenbildung der Leberzellen äußerten. Dies gipfelte am Tag 3-4 in einem äußerst seltenen Einzelzellverlust ohne Veränderungen des Umfangs oder des Aussehens des Stütz- und Bindegewebes oder der Portalgebiete. Diese Veränderungen lösten sich bis zum Tag 7 weitgehend auf. Über den 7 Tage-Untersuchungszeitraum wurden keine nennenswerten Veränderungen des Serumkreatinins (als Indikator der Nierenfunktion) oder der Nierenhistologie beobachtet. Die Mäuse blieben normal aktiv, fraßen und tranken normale Mengen und nahmen etwa genauso schnell wie die nicht injizierten Kontrollmäuse an Gewicht zu.

BEISPIEL 11

Herstellung und Untersuchung des Glycerin-DTPA-Copolymers

Getrocknetes Glycerin (0,4 ml, 0,55 mMol) wurde zu cyclischem DTPA-Dianhydrid (296 mg), das in 0,4 ml getrocknetem N,N-Dimethylformamid (durch Ultraschallbehandlung) suspendiert war, zugegeben. Die gemischte Suspension wurde weitere 3 Minuten mit einer speziellen Mikrospitze (Heat Systems, Inc.) bei 20.000 Hz ultraschallbehandelt und 7 Stunden bei 135ºC erhitzt, um eine kontrollierte Polymerisation zu erhalten, sowie weitere 2 Stunden bei 155ºC erhitzt, um das Reaktionslösungsmittel auszutreiben (SP = 149-156ºC). Das erhaltene Harz wurde segmentweise unter Ultraschallbehandlung in 60 ml destilliertes Wasser (pH 5) überführt und 20 Minuten mit einem Waring-Mixer bei hoher Geschwindigkeit geschert. GdCl&sub3;·7,05 H&sub2;O (327 mg) wurde auf pH 5 eingestellt, tropfenweise zu dem DTPA-Glycerinrückstand zugegeben und nochmals 3 Stunden geschert, um das Material maximal in Lösung zu bringen. Das zurückbleibende, größerenteils gelförmige Material wurde durch 15-minütige Zentrifugieren bei 250 g abgetrennt; die kleinere lösliche Fraktion wurde aufbewahrt und von dem restlichen freien Gd durch Molekularfiltration (mit 4 Waschschritten mit destilliertem Wasser, pH 5,0) mit einem 1000-MG-Ausschlußfilter unter Stickstoffdruck abgetrennt. Der Rückstand wurde aufbewahrt und weitere 15 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde auf bewahrt und über einen Zeitraum von 16 Stunden lyophilisiert.
Das erhaltene Glycerin-DTPA:Gd-Copolymer war, obwohl es ursprünglich das Aussehen eines Gels hatte, minimal bis vernachlässigbar vernetzt; Die Molekularfiltration ergab einen Größenbereich (für 95% des Materials) von MG = 1.000 bis 10.000, mit einem geschätzten Mittelwert von MG = 2.200. Dies bestätigte, daß die Copolymereinheiten löslich waren, aber bei der vorliegenden Rezeptur die Tendenz hatten, bei hoher Konzentration eine ionische intermolekulare Aggregation zu durchlaufen, die bei einer geringen Konzentration reversibel war.
Die in vitro Untersuchung der T1-Relaxationswirkung mit dem IBM PC20 Minispektrometer ergab die folgenden Ergebnisse (vergl., z. B., die Tabelle von Beispiel 3): Dosis, die T1 um 50% senkt Gesamtgewicht (ug/ml) GD:DTPA-Glycerin-Copolymer
Somit war das Gd:DTPA-Glycerin-Copolymer auf der Basis der Gd-Molarität 1,9-mal aktiver als Gd:DTPA-Dimeglumin. Sein R1-Wert war größer als 100/(mM und Sek.).
Es wurden in vivo Untersuchungen durchgeführt, indem CBA- Mäuse mit 130 mg/kg Gd:DTPA-Glycerin-Copolymer intravenös injiziert und die Wirkungen auf die T1-Relaxationszeiten der Organe bestimmt wurden, die 30 Minuten nach der Verabreichung des Mittels frisch herausgeschnitten wurden. Kontroll-Tl (mSek.) Injektions-Tl (mSek.) %-Senkung Leber Niere
Somit war das Gd:DTPA-Glycerin-Copolymer nach der vorliegenden Rezeptur sowohl auf der Grundlage des Gewichts, als auch der Gd-Molarität, als Leber-MR-verstärktes Mittel wesentlich aktiver als das Gd:DTPA-Dimeglumin. (Es wird erwartet, daß dieser Effekt durch Rezepturen, die die intermolekulare Aggregation durch Veränderung der elektrostatischen Ladung oder des pH-Wertes herabsetzen, oder durch Zusatz von inerten, kettentrennenden Molekülen überwunden werden kann). Vorläufige Untersuchungen der akuten Toxizität ergaben Werte, die ganz wenig unterhalb der des löslichen Gd:DTPA-Dextran-Polymers lagen. Man nimmt an, daß diese Toxizität durch den Austausch des 6-zähnigen Cheliermittels TTHA durch DTPA verbessert wird. Dadurch würden 4 Carbonsäuregruppen zur Gd-Chelatbildung übrig bleiben (wie bei DTPA-Dextran) und somit theoretisch den biologischen Austausch von Gd in vivo senken.

BEISPIEL 12

Konjugatbildung von Bindungsgruppen an die Gd:DTPA-Dextran-Polymere und Mikrokugeln

Etwa 50 mg des Dextran-DTPA-Polymers oder 150 mg der Teilchen wurden in 9,5 ml destilliertem Wasser mit 0,05 M NaCl suspendiert. Es wurde Natriumperiodat (0,05 M, 300 ul) zugegeben und die Mischung wurde 30 Minuten bei 22ºC gerührt. Das Präparat wurde mit destilliertem Wasser gewaschen (durch Molekularfiltration (Polymer); oder Zentrifugation (Mikrokugeln)) und mit destilliertem Wasser oder Kochsalzlösung auf 15 ml aufgefüllt. Die Materialien, die kovalent konjugiert werden sollten, wurden zu dem periodatoxidierten Präparat zugegeben: Antikörper, Avidin oder Biotinhydrazid, jeweils 1-3 mg, in Abhängigkeit von der Zahl der reaktiven Gruppen des Zusatzes. Diese Mischung wurde erneut 30 Minuten gerührt, im Anschluß daran wurde NaBH&sub4; (8 mg) zugegeben, um die Schiff'sche Base (oder ihr Äquivalent) zu reduzieren; dann wurde weitere 15 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt, und das stabilisierte Präparat wurde gewaschen und in 1 ml einer 0,25%-igen Dextran T70-Lösung, die 0,02 M phosphatgepuffert war und 0,15 M NaCl enthielt, resuspendiert. Die Mikrokugeln, die nach diesem Verfahren derivatisiert wurden, hatten 2500 bis 5000 verfügbare Bindungsstellen je 0,5 um Kugel, was durch die hochstabile, spezifische Bindung von ¹²&sup5;I-Avidin an biotinylierte Mikrokugeln, die mit Biotinhydrazid hergestellt wurden, bestimmt wurde.
Dieses Verfahren erlaubt die direkte kovalente Konjugatbindung von Antikörpern oder anderen rezeptor-bindenden Proteinen oder Peptiden über ihre reaktiven Aminogruppen; sowie die indirekte Kupplung von (a) biotinylierten Antikörpern (kommerziell erhältlich) an Avidin-derivatisierte Polymere oder Kugeln; oder (b) von nativen Antikörpern an Polymere oder Kugeln, die mit Protein A (Pharmacia Chemicals), das die Fc-Regionen von Antikörpern mit hohen Affinitäten bindet, vorab derivatisiert wurden.

BEISPIEL 13

Herstellung und Untersuchung von Albumin-Mikrokugeln, die den eingeschlossenen, nicht kovalent gebundenen Metallion-Chelat-Komplex, Gadolinium- Diethylentriaminpentaessigsäure (Gd:DTPA), enthalten

0,25 ml einer 0,95 M Lösung von Gd:DTPA in Dimeglumin (2· N-Methylglucamin)-Salzform (Schering Ag, Deutschland/Berlex Laboratories, Inc., USA) wurden zu einer maximal konzentrierten Lösung von humanem Serumalbumin (125 mg, Sigma Chemical Co.) in destilliertem Wasser (0,25 ml) gegeben. Die Mischung wurde 20 Minuten gerührt, zu 30 ml Baumwollsamenöl (Sargent Welch Scientific) zugetropft und 20 Minuten mit einem Hochgeschwindigkeits-Waring-Mixer geschert, um Tröpfchen im Submikrometerbereich (0,1-0,6 um Durchmesser) zu erzeugen. Diese Emulsion wurde zu einem vorgeheizten (140ºC), schnell gerührten 100-ml Volumen Baumwollsamenöl zugetropft, um die Albuminmatrix durch Hitze zu denaturieren (zu stabilisieren) und den Zusammenhalt der Teilchen sowie den Einschluß des Gd-DTPA, bei der anschließenden Suspension im Injektionsmedium zu ermöglichen. Das Erhitzen bei 140ºC wurde über einen Zeitraum von 10 Minuten unter Hochgeschwindigkeitsscherung fortgesetzt. Die Emulsion wurde unter fortgesetztem Mischen auf 22ºC abgekühlt. Das Öl wurde mit 6·60 ml frischen Diethyläther (mit Antioxidans) extrahiert (Fisher Scientific Co.) und die erhaltenen Mikrokugeln wurden 16 Stunden lyophilisiert, um den restlichen Äther zu entfernen. Die Teilchen lagen im Bereich von 0,1-0,5 um (Durchmesser) bei einem Mittelwert von 0,3 um (überprüft durch Licht- und Elektronenmikroskopie).
Die Mikrokugeln (Gd:DTPA:Dimeglumin:Albumin) wurden mit einem mit 20 MHz gepulsten magnetischen Kernresonanz- (NMR)Spektrometer in vitro auf ihre Fähigkeit, die T1- Relaxationszeiten von Wasserprotonen in physiologischer Kochsalzlösung (0,02 M phosphat-gepuffert, 0,15 M NaCl) zu senken, untersucht. Die Aktivität wurde in Form der Materialkonzentration ausgedrückt, die erforderlich ist, um die T1-Relaxationszeit auf 50% des Wertes für phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (ID&sub5;&sub0;) zu senken. Die Mikrokugeln wurden durch kurze Ultraschallbehandlung in einer Konzentration von 1 mg/ml suspendiert. Da die Albuminmikrokugeln eine Gd: DTPA-Komponente mit schneller Freisetzung (Oberfläche) sowie eine Komponente mit kontrollierter Freisetzung (Inneres) besitzen, wurden die Kugeln gewaschen, resuspendiert und zur Untersuchung serienmäßig verdünnt.
Material ID&sub5;&sub0; (Gesamtgewicht)
Ungewaschene Mikrokugelsuspension 0,25 mg/ml
Überstand der schnellen Freisetzung 0,30 mg/ml
Gewaschene Mikrokugeln 3,8 mg/ml
Gd: DTPA-Dimeglumin 0,084 mg/ml
Die Mikrokugeln (Gd:DTPA:Dimeglumin:Albumin) wurden in vivo untersucht, indem sie intravenös in 25 g schwere CBA- Mäuse (2 Tiere je Gruppe) injiziert wurden, worauf zur Aufnahme und Abscheidung durch die Kupferzellen der Leber 30 Minuten gewartet wurde, die Mäuse geopfert und die herausgeschnittenen Organe untersucht wurden. Die akute (30 Minuten) biologische Verteilung wurde durch Injektion von Mikrokugeln, die mit ¹²&sup5;I-Albumin markiert waren, bestimmt. Die Radioisotope wurden in einem Standard-Gammazähler quantifiziert. Organ ¹²&sup5;I-Messungen: % des Gesamtwerts nach 30 Minuten ¹²&sup5;I-Messungen: je g Zielorgan Blut Milz Leber Lungen Nieren Gesamt:
Das Muster der Aufnahme durch Leber und Milz (mit mäßiger akuter Sequestrierung in der Lunge) ist typisch für kleine (< 3 um) Teilchen.
Die T1-gewichteten Protonenrelaxationszeiten von Mäuselebern wurden quantifiziert, indem die T1-Relaxationszeit des Gesamtorgans mit einem 20 MHz NMR-Spektrometer gemessen wurde. Injiziertes Material Leber Tl (mSek.) % der Kontrolle Kochsalzlösung (0,15 M) Kontrolle Albuminmikrokugeln GD:DTPA-Dimeglumin
Bei gleichwertiger Dosierung (abgeglichen auf die T1- Potenz in vitro) war die Gd:DTPA:Dimeglumin-Albumin- Mikrokugelrezeptur etwas wirksamer als lösliches Gd:DTPA- Dimeglumin. Die hohe Dosis des Albuminträgers, die nötig war, um diese mäßige T1-Relaxation zu erzielen, macht Albumin zu einem suboptimalen Matrixmaterial, um Gd bei Anwendungen, die speziell magnetische Resonanzabbildung und Spektroskopie einschließen, in die Leber einzubringen. Diese hohe Dosis wurde durch die starke Sequestrierung von Gd im das Inneren der Mikrokugeln und die sehr langsame Freisetzung (50% in 8 Stunden) von Gd:DTPA aus Kugeln, die für eine wirksame Einbringung in die Leber genügend stabilisiert waren, erforderlich.

BEISPIEL 14

Herstellung eines löslichen Gd:DTPA: Diethylaminoethyl-Dextran-Polymers und von Gd:DTPA:Diethylaminoehtyl-Mikrokugeln, die nicht-kovalent gebundenes Gd:DTPA enthalten (mit starker Ionenbindung zwischen DTPA und den DEAE-Dextransubstituenten); und von nicht-beladenen DTPA: Diethylaminoethyl- Dextran-Mikrokuqeln (ohne cheliertes Gd)

Lösung 1. 0,72 g Diethylenetriaminpentaessigsäure (DTPA, Sigma Chemical Co.) wurden in 2,5 ml destilliertem Wasser gelöst, der pH-Wert mit NaOH auf 7,2 eingestellt, die Lösung mit 0,34 g GdCl&sub3;·6 H&sub2;O gemischt, wieder auf pH 7,2 eingestellt und 20 Minuten gerührt, um eine vollständige Gd-Chelatbildung zu ermöglichen. Lösung 2. Diethylaminoethyl-Dextran (DEAE Dextran, MG = 500.00, mit einer positiv geladenen Gruppe auf 3 Glucosebausteine, Sigma Chemical Co.) wurde durch Erwärmen einer gesättigten Lösung von 1 g in 2,5 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösungen 1 und 2 wurden unter kräftigem Rühren gemischt, um die lösliche polymere Form von Gd:DTPA:DEAE-Dextran herzustellen; der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt, und die Mischung wurde zweimal mit destilliertem Wasser (20 ml je Waschschritt) gewaschen, um nicht gebundenes Gd zu entfernen. Das lösliche Polymer wurde durch Molekularfiltration durch ein MG-100.000-Ausschlußfilter (Amicon Corporation, XM 100) unter Stickstoffdruck auf 50-100 mg/ml aufkonzentriert. Zur Herstellung der Mikrokugelform von Gd:DTPA:DEAE-Dextran wurde DEAE-Dextran unter kräftigem Rühren zu 30 ml Baumwollsamenöl (Sargent Welch Scientific) gegeben, bis eine gleichmäßige Emulsion erhalten wurde. Dazu wurde 1 ml Lösung 1 (tropfenweise) zugegeben. Diese Emulsion wurde über einen Zeitraum von 6 Minuten mit einem 20.000 Hz Ultraschallgerät und einer speziellen 3 mm Mikrospritze (Heat Systems, Inc.) ultraschallbehandelt (unter fortgesetztem magnetischem Rühren), um die wäßrige Phase in Mikrotröpfchen von 0,2-0,4 um zu zerteilen. Die Mikroteilchen wurden stabilisiert, und Wasser wurde durch Erhitzen auf 120ºC unter kräftigem Rühren über einen Zeitraum von 20 Minuten entfernt. Nach dem Abkühlen wurde das Öl mit 3·60 ml frischem Diethylether (mit Antioxidans) (Fisher Scientific Co.) entfernt, und die Probe wurde 16 Stunden lyophilisiert. Die Mikrokugeln lagen im Bereich von 0,1 bis 0,3 um, bei einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,2 um.
Nicht-beladene DTPA:DEAE-Dextran-Mikrokugeln. Ein alternatives Mikrokugelpräparat wurde ohne cheliertes Gd (oder andere Metallionen) hergestellt, indem DTPA gelöst, der pH-Wert auf 7,2 eingestellt und mit einer Lösung von 1 g DEAE-Dextran gemischt wurde, wobei alle Substanzen, wie oben beschrieben, zubereitet wurde. Die wäßrige Phase wurde in Baumwollsamenöl emulsiert und, wie oben beschrieben, weiterverarbeitet.

BEISPIEL 15

Beladen (Chelatbildung) der DTPA: DEAE-Dextran-Mikrokugeln mit den paramagnetischen Metallionen Gd³&spplus; und Fe³&spplus;

a. Gd³&spplus;-Chelatbildung. Zu 100 mg DTPA:DEAE-Dextran- Mikrokugeln aus Beispiel 13 wurden 280 mg GdCl&sub3;·6 H&sub2;O, das in 2 ml destilliertem Wasser gelöst war, zugegeben und 30 Minuten gerührt. Nicht gebundenes Gadolinium wurde durch zweimaliges Waschen mit 20 ml destilliertem Wasser (pH 5,5), mit Hilfe eines MG-300.000-Ausschlußfilters (43 mm Durchmesser, Amicon Corporation, XM300) unter Stickstoffdruck, entfernt. Die Mikrokugeln wurden mit 2 ml destilliertem Wasser vom Filter entfernt und bis zur Trockenheit lyophilisiert (16 Stunden). Die Mikrokugeln hatten einen Durchmesser von 0,1 bis 0,5 um
b. Fe³&spplus;-Chelation. 100 mg DTPA: DEAE-Dextran-Mikrokugeln aus Beispiel 14 wurden zu 350 mg FeCl&sub3;·6 H&sub2;O zugegeben und, wie in Beispiel 15. a. (oben), weiter verarbeitet, um nicht-gebundenes Fe³&spplus; zu entfernen. Die Teilchen hatten einen Durchmesser von 0,15 bis 0,6 um

BEISPIEL 16

In vitro-Untersuchung der in den Beispiel 14 und 15 hergestellten löslichen Gd:DTPA-Polymere und Gd:DTPA-Mikrokugeln.

Die Testmaterialien wurden serienmäßig verdünnt und mit einem 20 MHz gepulsten NMR-Spektrometer, wie in Beispiel 3 beschrieben, auf ihre Protonen-T1-Relaxationswirkung untersucht. Diese Materialien enthielten sehr geringe Anteile an schnell freigesetztem Gd und Gd:DTPA-Chelat (weniger als 2% der Gesamtmengen). Daher war es nicht nötig, die Materialien vor der NMR-Untersuchung zu waschen und zu resuspendieren. Die ID&sub5;&sub0;-Konzentrationen waren:
Material ID&sub5;&sub0; (Gesamtgewicht)
Lösliches Gd:DTPA:DEAE-Dextran- Polymer 0,125 mg/ml*
Gd:DTPA:DEAE-Dextran-Mikrokugeln 0,160 mg/ml
DTPA:DEAE-Dextran-Mikrokugeln, anschließend mit Gd beladen 0,175 mg/ml
Gd:DTPA-Dimeglumin 0,084 mg/ml*
* Molare Konzentration von Gd = 4,6·10&supmin;&sup5; M für das lösliche Gd:DTPA:DEAE-Dextran-Polymer und 9,0·10&supmin;&sup5; M für Gd:DTPA-Dimeglumin.
Das lösliche Gd:DTPA:DEAE-Dextran-Polymer war 1,96-mal wirksamer als Gd:DTPA-Dimeglumin. Diese verbesserte Relaxationswirkung war auf die starke, nicht-kovalente Bindung des negativ geladenen DTPA-Anteils von Gd:DTPA an die positiv geladenen DEAE-Austauschgruppen des Dextranpolymers zurückzuführen. Die beträchtliche Größe dieses Polymers (MG 300.000) hatte eine längere Rotationskorrelationszeit jedes nicht-kovalent gebundenen Gd:DTPA's zur Folge und erlaubte einen verbesserten Energietransfer von den Wasserprotonen auf die paramagnetischen Gd-Ionen.

BEISPIEL 17

In vitro histologische Färbung der nach Beispiel 15 hergestellten Fe:DTPA-Mikrokugeln

Fe:DTPA:DEAE-Dextran-Mikrokugeln wurden mit einer Konzentration von 1 mg/ml in einer 70%-igen Ethanol- Wasserlösung gelöst, 10-50 ul-Aliquots wurden auf zytologische Glasobjektträger auf getragen, die Mikrokugeln wurden 12 Minuten bei 750 g in einer Zellzentrifuge sedimentiert, die Objektträger wurden luftgetrocknet und das Mikrokugel:Fe³&spplus; wurde nach dem Preußischblau-Verfahren mit saurem Eisen(II)-Eisen(III)cyanid zur histologischen Analyse angefärbt. Das dunkelblaue Umsetzungsprodukt bildete sich über jeder Mikrokugel, wie durch Standardlichtmikroskopie festgestellt wurde. Somit wurde das chelierte Fe³&spplus;, das zunächst bei neutralem pH-Wert an das DTPA der Mikrokugeln gebunden war, durch den sauren pH-Wert der Färbelösung ausreichend in Lösung gebracht, um den histochemischen Nachweis in vitro zu führen.

BEISPIEL 18

In vivo-Untersuchung der nach den Beispielen 15 und 16 hergestellten, löslichen Gd:DTPA-Polymere und Gd:DTPA-Mikrokugeln

a. Protonen-T1-Relaxationszeiten in Organen von Mäusen

Die Testmaterialien wurden intravenös in 25 g schwere CBA- Mäuse injiziert. Nach 30 Minuten wurden die Mäuse durch Decapitation geopfert (ausgeblutet) und die herausgeschnittenen Lebern und Nieren wurden auf Veränderungen der Protonen-T1-Relaxationszeiten untersucht (20 MHz; IR- Pulssequenz). Die Dosierungen der Testmaterialien wurden auf Grundlage der in vitro-Potenz (ID&sub5;&sub0;-Analyse) abgeglichen. Material Dosis (mMol/kg) Tl (% der Kontrolle)* Leber Niere Lösliches GD:DTPA:DEAE-Dextran-Polymer GD:DTPA:DEAE-Dextran-Mikrokugeln GD:DTPA-Dimeglumin * Die T1-Werte der Kontrollorgane betrugen 330 mSek. für die Leber und 385 mSek. für die Niere.
Das lösliche polymere Präparat aus Gd:DTPA:DEAE-Dextran war für die Leber die wirksamste Substanz (etwa 4-mal wirksamer als Gd:DTPA-Dimeglumin, das eine sehr viel größere Erhöhung in der Niere hervorrief). Die Mikrokugelform des Gd:DTPA:DEAE-Dextrans war in der Leber etwa 2-mal wirksamer als Gd:DTPA-Dimeglumin. Wegen der selektiven Organaufnahme durch die Leber rief es in der Niere einen viel kleineren Effekt hervor. Gd: DTPA-Dimeglumin war sogar bei sehr hohen Dosen, die markante Senkungen in der Niere hervorriefen, bezüglich der Senkung der T1-Werte der Leber relativ unwirksam. (Die gewöhnliche Dosis an Dimegluminpräparat, die bei klinischen Tests in der Phase III verwendet wird, ist 0,1 mMol/kg).

b. Magnetische Protonenresonanzabbildungen und die Beziehung zu den Protonen-T1-Relaxationszeiten bei Ratten.

Die Testmaterialien wurden intravenös in 500 g schwere Sprague-Dawley-Ratten injiziert. Nach etwa 30 Minuten wurden die Ratten in die Kopfspule eines klinischen 0,35 Tesla-Abbildungsgerätes (Diasonics Corp.) gesetzt und es wurden T1-gewichtete Bilder, (sowohl mit einer Spin-Echo- Pulssequenz bei TR-Zeiten von 0,5, 1,5 und 2,0 als auch eine Inversionsregenerationssequenz), auf Bildschnitten mit einer Dicke von 0,5 cm durch die Leber und Nieren erhalten. Die T1-Relaxationszeiten wurden durch Flächenabgleich der Signalintensitäten und ein geeignetes Anwendungsprogramm zur Berechnung aus den TR = 0,5 und 2,0- Meßwerten bestimmt. Nach der Fertigstellung der Abbildungen wurden die Ratten durch Decapitation (Ausbluten) geopfert. Ihre Leber, Nieren und Milzorgane wurden herausgeschnitten, auf ihre in vitro Übereinstimmung mit den in vivo Veränderungen der Protonen-T1-Relaxationszeiten untersucht und dann zur histopathologischen Beurteilung in eine gepufferte Formalinfixierlösung gegeben.
Die Dosierungen der Testmaterialien waren wie folgt:
Gd (mMol/kg)
Lösliches Gd:DTPA:DEAE-Dextran-Polymer 0,30
Gd:DTPA:DEAE-Dextran-Mikrokugeln 0,15
Gd: DTPA-Dimeglumin 0,30 Testmaterial Organ Tl (% der Kontrolle) in vivo in vitro* Lösliches Polymer Leber Milz Niere Mikrokugeln Dimeglumin * Die Protonen-T1-Werte der Kontrollen waren: Leber, 275 mSek.; Milz, 464 mSek.; Nieren, 492 mSek. ** Nicht bestimmt. Bilder der Milz konnten wegen der sehr geringen Organgröße und der unmittelbaren anatomischen Nachbarschaft zur Leber in der Ratte nicht erhalten werden.
Es gab eine direkte Beziehung zwischen den in vivo- und den in vitro-T1-Relaxationszeiten der Leber. Bei der Niere waren aufgrund der Schwierigkeit, (a) die durchschnittlichen Bildstärken dieser viel kleineren Organe zu bestimmen und (b) scharfe Trennlinien zwischen den unterschiedlichen verstärkenden anatomischen Teilregionen der Niere (Cortex und Medulla) zu erhalten, die Korrelationen nur schwach. Die Bildintensitäten nahmen im umgekehrten Verhältnis zu den T1-Veränderungen zu. Das lösliche polymere Gd und das mikrokugelförmige Gd ergaben im Vergleich zur Niere eine bevorzugte Bildverstärkung der Leber, während mit Gd:DTPA-Dimeglumin die umgekehrten Veränderungen erhalten wurden. Nach dem Abgleich auf die Dosis und die Bildintensität war das mikrokugelförmige Gd bei der Verstärkung der Leber fünfmal wirksamer als Gd: DTPA-Dimeglumin, und das lösliche polymere Gd war 2,5-mal wirksamer. Das Knochenmark wurde durch das lösliche polymere und das mikrokugelförmige Gd ebenfalls bevorzugt verstärkt. Diese Veränderungen wurden visuell festgestellt, konnten aber wegen der geringen Zahl der Bildpunkte, die den Knochen der Ratten entsprachen, nicht quantifiziert werden.

BEISPIEL 19

Histologische Beurteilung der selektiven Aufnahme von Mikrokugeln, die das paramagnetische Metallion Fe³&spplus; enthalten, durch Leber und Milz

Fe³&spplus;:DTPA:DEAE-Dextran-Mikrokugeln (hergestellt wie in Beispiel 14) wurden mit einer Dosis von 140 mg/kg in CBA- Mäuse injiziert. 30 Minuten nach der Injektion wurden die Tiere geopfert und die Leber und Milz herausgeschnitten. Die Gewebe wurden in Formalin fixiert und unter Anwendung des Preußischblau-(saures Eisen(II)-Eisen(III)cyanid) Färbeverfahrens fixiert, um die zelluläre Lokalisation des mikrokugelförmigen Eisens zu bestimmen. Nach der mikroskopischen Auswertung waren in den Kupfferzellen der Leber und den sinusförmigen Makrophagen der Milz 0,1-0,6 um große (Durchmesser) Anhäufungen (3+, 4+) von eisenhaltigen Teilchen vorhanden. Andere parenchymatische Zellen der Leber (Hepatozyten) und der Milz waren bei der Eisenfärbung negativ, genauso wie andere Organe (Knochenmark wurde nicht getestet). Diese Ergebnisse zeigen, daß das Fe³&spplus;:DTPA-Cheliermittel mit genügend großer Affinität (nicht-kovalent) an das DEAE-Dextran gebunden war, um den in vivo-Transport durch den Blutstrom zu überstehen und in Form von intaktem, teilchenassoziertem Eisen durch die Freßzellen der Leber und Milz unverzüglich beseitigt zu werden. Die histologischen Ergebnisse belegen, daß die bevorzugte MR-Verstärkung der Leberbilder und die bevorzugten T1-Veränderungen der Wasserprotonenrelaxationszeiten der Milz (siehe oben) durch die selektive Aufnahme der paramagnetischen markierten Teilchen durch Freßzellen in den "Ziel"organen verursacht wurden.

BEISPIEL 20

Beurteilung der akuten Toxizität des löslichen Gd:DTPA:DEAE-Dextran-Polymers und der Gd:DTPA:DEAE-Dextran-Mikrokugeln aus Beispiel 14

Die Ratten aus Beispiel 17, die mit dem löslichen polymeren und mikrokugelförmigen Gd, das nicht-kovalent (gepaarte Ionen) an DEAE-Dextran gebunden war, injiziert worden waren, entwickelten im Zeitraum zwischen 90 und 120 Minuten nach der Injektion der Testmaterialien leichte bis mäßige Atmungsstörungen. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde eine histologische Beurteilung der formalinfixierten Organe (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Milz und Nieren) dieser Ratten und von CBA-Mäusen, die mit dem gleichen Material und den gleichen Dosierungen injiziert worden waren, durchgeführt. Die Lunge, Leber und Nieren der Ratten und der Mäuse zeigten eine leichte bis mäßige akute Anhäufung von roten Blutkörperchen in den kleinen Blutgefäßen. Zusätzlich zeigten die Nieren mäßige akute Ödeme im Bereich des Cortex (Anhäufung von proteinarmer Flüssigkeit). Diese histologischen Veränderungen belegten einen akuten toxischen Effekt der beiden Gd-Präparate auf DEAE-Dextranbasis. Die histologischen Veränderungen in den CBA-Mäusen waren alle ausgeprägter als die in den Sprague- Dawley-Ratten, die für die magnetische Resonanzabbildung verwendet wurden. Diese Unterschiede zwischen den Arten machte es ungewiß, ob ähnliche Effekte beim Menschen auftreten würden. Die Natur der histologischen Hauptveränderung, eine akute Anhäufung, deutete sehr darauf hin, daß die mehrfach positivgeladenen DEAE-Gruppen der Dextranmatrix wahrscheinlich mit den negativgeladenen Oberflächen der Zellen, die die Wände der Blutgefäße auskleiden (Endothelzellen), in Wechselwirkung getreten waren, und Veränderungen des Endothels hervorgerufen hatten, die zur Anhaftung und Anhäufung von roten Blutkörperchen führten. Im Hinblick auf die Interpretation der Bildverstärkung und T1-Veränderungen nach Beispiel 14 ist es wichtig, daß die eben beschriebenen histologischen Veränderungen nicht zu dem Zeitpunkt, an dem die Bilder aufgenommen wurden (30 Minuten nach der Injektion der Testmaterialien), auftraten, sondern 90 bis 120 Minuten nach der Injektion. Somit zeigen die Beispiele 16 und 18 die Wirksamkeit (nicht aber die biologische Verträglichkeit) von Gd:DTPA, das nicht-kovalent an polykationische Träger gebunden ist, als Prototyppräparate zur bevorzugten MR-Bildverstärkung der Leber, der Milz und des Knochenmarks.

BEISPIEL 21

Herstellung von Heparin-stabilisierten Gd: DTPA-Dimeglumin-Mikrokugeln

Eine 0,95 M Lösung von Gd:DTPA-Dimeglumin (Schering AG- Berlex) wurde durch Eindampfen unter Stickstoff aufkonzentriert, auf einen pH-Wert von 10,0 eingestellt, in einer Menge von 1,8 ml zu 100 ml Baumwollsamenöl gegeben und 15 Minuten mit einem Waring-Hochgeschwindigkeitsmixer homogenisiert, um feine Mikrotröpfchen (0,2 bis 0,5 um) zu erzeugen. Diese Emulsion wurde unter fortgesetzter Scherung bei 130ºC über einen Zeitraum von 20 Minuten stabilisiert. Dann wurden 5000 Einheiten Heparin (Upjohn Co. klinischer Reinheitsgrad aus Rinderlunge) zugegeben, um die gesamte positive Ladung der äußeren Oberfläche dieser Teilchen zu neutralisieren und die Stabilität der Teilchen für die anschließende Resuspension zu verstärken. Die positive Oberflächenladung (die, wie in Beispiel 19 gefunden wurde, eine akute Gefäßtoxizität hervorruft), erhielten die Teilchen (im vorliegenden Beispiel) durch die Amingruppen des N-Methylglucamins (Dimeglumin). Der Grund für die Beschichtung der Teilchenoberflächen mit Heparin lag in der Neutralisation dieser positiven Ladung und dem Ausschalten der damit verbundenen akuten Toxizität. Das Öl wurde mit Dietylether extrahiert und die Teilchen, wie in Beispiel 12, lyophilisiert. Die erhaltenen Mikrokugeln hatten einen Durchmesser von 0,1-0,4 um. Die in vitro-NMR-Protonen-T1-Aktivität war:
Material ID&sub5;&sub0;
Gd:DTPA:Dimeglumin:Heparin-Mikrokugeln 0,045 mg/ml
Gd:DTPA:Dimeglumin 0,084 mg/ml
Auf der Grundlage der molaren Konzentration von Gd war das Mikrokugelpräparat etwa doppelt so aktiv wie das lösliche.

BEISPIEL 22

In vivo-Untersuchung der mit Heparin beschichteten Gd:DTPA:Dimeglumin-Mikrokugeln

Die Mikrokugeln wurden intravenös mit einer Dosis, die so berechnet war, daß 0,19 mMol Gd/kg verabreicht wurden, in CBA-Mäuse injiziert. Die prozentualen Senkungen der T1-Relaxationen der Versuchs- bzw. Kontroll-(nicht-injizierten)organe, die nach 30 Minuten herausgeschnitten wurden, waren:
Leber 6%
Niere 53%
Somit waren diese Mikrokugeln nicht ausreichend stabilisiert, um für eine Ausscheidung durch die Leber und Milz lange genug intakt zu bleiben (was etwa 15 Minuten erfordert). Der Zusatz von ergänzenden Matrixmaterialien, wie MG-70.000-Dextran, sollte wohl diese erforderliche Stabilität verleihen.
Die histologische Beurteilung der akuten Gefäßtoxizität wurde, wie in Beispiel 20 beschrieben, bei CBA-Mäusen durchgeführt. Es wurden weder Anhäufungen noch Ödeme beobachtet.
Auf der Grundlage der vorangegangenen Beispiele der Effizienz, Stabilität und Toxizität von Polymeren und Mikrokugeln waren die bevorzugten Ausführungsformen kovalent gebundene Dextran-DTPA-Polymere und Mikrokugeln in Verbindung mit cheliertem Gd.

BEISPIEL 23

In vitro-T1-Effekte von Fe³&spplus;, das an ein lösliches DTPA-Dextran-Polymer gebunden ist

FeCl&sub3;·6 H&sub2;O wurde in stöchometrischer Menge zu DTPA-Dextran T10 (MG 11.000, lösliches Polymer) zugegeben und die T1- ID&sub5;&sub0;-Werte wurden mit denjenigen von vergleichbar beladenem Fe:DTPA und Fe:Desferrioxamin (ein Eisencheliermittel bakteriellen Ursprungs mit niedrigem Molekulargewicht) verglichen.
Substanz T1 (ID&sub5;&sub0;) Fe (M/10&supmin;&sup5;)
Fe:DTPA-Dextran MG 11.000 lösliches Polymer 18
Fe:Desferrioxamin 113
Fe:DTPA 37
Das Fe:DTPA-Dextran-Polymer war von den 3 getesteten Mitteln das wirksamste (2-mal so wirksam wie Fe:DTPA).

BEISPIEL 24

In vivo-Abbildung eines menschlichen BRO-Melanoms (gezüchtet in Nacktmäusen) mit löslichem Gd-Dextran T70

Diese Untersuchungen wurden unter Verwendung des sich rasch vermehrenden, nicht-pigmentierten (amelanotischen) menschlichen BRO-Melanoms durchgeführt, das in den weichen Achselgeweben von Schweizer Nacktmäusen bis zu einem Gewicht von 2,0 bis 6,0 g gezüchtet wurde. Die nicht-pigmentierte Beschaffenheit des Tumors vermeidet jede Änderungsmöglichkeit der nicht-verstärkten Geweberelaxationszeiten durch natürlich vorkommende, paramagnetische Substanzen, die bei pigmentierten Melanomen beschrieben worden sind. Die Lokalisation der Tumore in den Achseln erlaubt die Abbildung des Tumors und der Leber in benachbarten Schnitten. Dies verkürzt die Aufnahmezeit für jede Gruppe von Mäusen und ermöglicht eine maximale anatomische Trennung der Tumore von den Nieren und der Blase, die eine höhere Bildintensität besitzen. Die MR-Abbildung wird mit einem Diasonic 0,35T-Gerät mit einer 30 cm RF-Spule und einer T1-gewichteten Spin-Echo-Pulssequenz (TR 500, TE 40) durchgeführt. Zur Betäubung der Tiere wird Pentobarbital verwendet, um eine Veränderung der Bildintensitäten durch den Wirkstoff zu vermeiden. Die T1-Relaxationen wurden mit den frisch herausgeschnittenen Organen durchgeführt. Allgemein sanken diese T1-Werte im Verhältnis zu den erhöhten Bildintensitäten. Abweichungen von dieser Beziehung wurden bei der Verstärkung mit Gd-DTPA-Dimeglumin beobachtet, wenn die Zeitspanne zwischen dem Höhepunkt des Bildkontrasts und der Opferung der Tiere ungewöhnlich verlängert wurde. Die Potenzen von Gd-DTPA-Dextran T70 und Gd-DTPA (Dimeglumin) wurden verglichen, indem beiden Mittel mit der für Gd:DTPA-Dimeglumin limitierenden Dosis von 0,03 mMol Gd je kg injiziert wurden. Unter diesen limitierenden Bedingungen trat die Verstärkung des BRO- Melanoms mit Gd:DTPA-Dextran T70 deutlich hervor, war jedoch mit Gd:DTPA-Dimeglumin, das eine um 1/2 log höhere Dosis erforderte, kaum wahrnehmbar. Der Bildkontrast wurde im Vergleich zu Gd:DTPA-Dimeglumin mit Gd:DTPA*-Dextran T70 über einen deutlich längeren Zeitraum nach der Injektion aufrechterhalten. Das neue lösliche polymere Mittel hatte die folgenden Vorteile:
1. Verbesserte Gd-Potenz in vivo (um einen Faktor 3,3);
2. verbesserter Kontrastgradient zwischen Tumor und umgebenden normalen Geweben, wodurch der Nachweis von Körpertumoren verbessert wird;
3. verbesserte Unterscheidung von inneren Tumorstrukturen;
4. Vorhandensein einer frühen Gefäßphase der Tumorverstärkung, die den Nachweis von kleinen und infiltrierenden Tumoren an ihren am schnellsten wachsenden Grenzen verbessern kann;
5. Verlängerung des Tumorkontrasts.

BEISPIEL 25

Alternative chemische Verfahren zur Bindung von chelierenden Substanzen an Trägerpolymere

Unter bestimmten Umständen können chemische Vorteile, wie erhöhte Stabilität der Metallionchelatbildung oder erhöhte Flexibilität des Trägerpolymers, durch Anwendung anderer Bindungsreaktionen anstelle der direkten Derivatisierung mit dizyklischem DTPA-anhydrid erzielt werden. Zum Beispiel können die mittleren Acetatgruppen von DTPA selektiv mit Ethylendiamin umgesetzt werden, bevor die stärker chelierenden Carbonsäuranhydride aufgebrochen werden. Dies kann erreicht werden, indem die Konjugatbildung unter Anwendung der üblichen Verfahren mit organisch-löslichen Carbodiimiden in getrockneten organischen Lösungsmitteln, wie N,N-Diemthylformamid oder N,N-Diethylacetamid, durchgeführt wird.
Das mit Amin derivatisierte DTPA kann dann in wäßrigen Lösungsmitteln unter Verwendung wasserlöslicher Carbodiimidreagenzien mit den OH-Gruppen von nativem Dextran, den Aldehydgruppen von mit Natriumperiodat oxidiertem Dextran (reaktiver) oder den Carbonsäuregruppen von succinyliertem Dextran (am reaktivsten), das durch vorherige Umsetzung mit Succinanhydrid hergestellt wurde, umgesetzt werden. Als Alternative kann das einfache DTPA-Chelat in seinem bevorzugtesten Chelationszustand stabilisiert werden, indem Gd vorab gebunden wird, gefolgt von der Bindung an Ethylendiamin in wäßrigen Lösungsmitteln unter Verwendung von wasserlöslichem Carbodiimid. Derartige Metallschutztechniken sind übliche Verfahren zum Schutz von aktiven Enzymzentren während der chemischen Umsetzung bzw. Reinigung von Enzymen. Das erhaltene Dextrankonjugat kann sogar eine höhere Bindungsstabilität für Gd und andere paramagnetische Metalle besitzen als das vollständig verträgliche Konjugat, das in der vorliegenden Anmeldung als die bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde.
Zusätzliche alternative Verfahren, nach denen die Konjugatbildung verbessert oder variiert werden kann, umfassen (1) modifizierte säurekatalysierte Umsetzungen von Dianhydriden und Alkoholen [W.C, Eckelmann et al., J. Pharm. Sci., (1975), 643 : 704]; (2) Amid-Kupplungsverknüpfungen zwischen Ethylendiamin-derivatisiertem DTPA und succinyliertem Dextran, abgeleitet aus [D.J. Hnatowich et al., J Nuc. Med., (1981), 22 : 810] oder direkte Kupplungsverfahren, die die Pentatriethylammonium-DTPA-, Isobutylchlorformiat und Trieethylaminhydrochlorid-Fällung umfassen, um die reaktive Spezies, das Carboxykohlensäureanhydrid von DTPA, das für verschiedene alternative Konjugatbildungen verwendet werden kann [G.E. Krejcarek und K.L. Tucker, Biochem. Biophys. Res. Comm., (1977), 77 : 581], zu bilden. Es wird erwartet, daß diese Umsetzungen die bereits zufriedenstellenden Verfahren nach der vorliegenden Anmeldung erweitern und gegebenenfalls verbessern.
In den oben beschriebenen Untersuchungen wurde die Radionuklidquantifizierung der Gd-Bindung an das lösliche DTPA-Dextran-Polymer in Zusammenarbeit mit Dr. Padmaker Kulkarni [Radiologie, Abbildungszentrum, Zentrum für Gesundheitswissenschaften der Universität Texas, Dallas, (UTHSCD)] mit ¹&sup5;³Gd durchgeführt; die magnetische Resonanzabbildung wurde in Zusammenarbeit mit Jeffrey Weinreb, M.D., William Erdman, M.D., Jesse Cohen, M.D., [NMR-Abbildungszentrum-Radiologie, Zentrum für Gesundheitswissenschaften der Universität Texas, Dallas, Texas] mit dem klinischen Diasonics 0,35T-Magnet der Universität in einer 30 cm RF-Kopfspule unter Anwendung von T1-gewichteten Spin-Echo und Inversionsregenerationspulssequenzen, durchgeführt.
Es können Veränderungen in der Konstruktion, Bedienung und Anordnung der verschiedenen Teile, Elemente, Schritte und Vorgänge, die hier beschrieben wurden, vorgenommen werden, ohne daß das Konzept und der Rahmen der Erfindung, wie sie in den folgenden Ansprüchen festgelegt ist, verlassen werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines bildverstärkenden Mittels oder eines spektral verstärkenden Mittels, wobei ein biologisch abbaubares, wasserlösliches Polymer, das sich wiederholende hydrophile monomere Einheiten mit Amino- und/oder Hydroxylgruppen enthält, mit einem Cheliermittel kovalent gekuppelt wird, wobei sich die funktionellen Gruppen des Cheliermittels mit den reaktiven Gruppen der monomeren Einheiten des Polymers verbinden und das Cheliermittel mit einem Metallion assoziiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Kupplung des wasserlöslichen Polymers und des Cheliermittels in einem wäßrigen, protonenhaltigen Lösungsmittel durchgeführt wird und daß das Cheliermittel bei physiologischen Temperaturen und pH-Werten eine Bildungskonstante für zweiwertige oder dreiwertige Metallkationen von mindestens 10&sup8; hat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das bildverstärkende Mittel oder das spektral verstärkende Mittel ein Molekulargewicht im Bereich von 1000-2.000.000 Dalton hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das bildverstärkende Mittel oder das spektral verstärkende Mittel weniger als 5% (Gew./Gew.) vernetzte oder mikroaggregierte Bestandteile enthält und biologisch abbaubar ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Cheliermittel bei physiologischen Temperaturen und pH-Werten eine Bildungskonstante für zweiwertige oder dreiwertige Metallionen von mindestens 10&sup8; hat.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Cheliermittel bei physiologischen Temperaturen und pH-Werten eine Bildungskonstante für zweiwertige oder dreiwertige Metallkationen von mindestens 10¹&sup7; hat.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Kupplung unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß

das Polymer ausreichend verdünnt ist, um eine kovalente intermolekulare Vernetzung zu vermeiden, wenn eine Vorstufe des Cheliermittels graduell, kontinuierlich oder stufenweise unter kräftigem Mischen zugesetzt wird, und der pH-Wert der Lösung so eingestellt wird, daß ein zunächst gebildetes lösliches Polymer-Cheliermittel-Konjugat sowohl vor als auch nach der Chelierung der Metallionen in einem vollständig wasserlöslichen Zustand gehalten wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Metallion ein paramagnetisches Metallion ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das paramagnetische Metallion ein Ion des Gadoliniums, Eisens, Nickels, Kupfers, Erbiums, Europiums, Dysprosiums, Holmiums, Chroms oder Mangans, vorzugsweise des Gadoliniums, ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Metallion ein nicht-radioisotopes Metallion ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Metallion ein radioisotopes Metallion ist, das Gammastrahlen emittiert.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Cheliermittel Triethylentetraminhexaessigsäure (TTHA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder 1,4,7,10-Tetraazacyclodecan- N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA), oder ein synthetisches Derivat von TTHA, DTPA, EDTA oder DOTA ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Cheliermittel DTPA ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das wasserlösliche Polymer ein Mono-, Di-, Poly- oder Oligosaccharid und deren Aminderivate, Mucopolysaccharide und deren Oligomere, Heparin, Heparan, Heparan-SO&sub4;, Chondroitin-SO&sub4;, Dermatan-SO&sub4; und verwandte natürliche und synthetische wasserlösliche Polykohlenhydrate und deren Derivate umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das wasserlösliche Polymer Heparin, Heparansulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Stärke, Carboxymethylstärke oder Hydroxyethylstärke, einzeln, in Kombination miteinander oder mit DEAE-Dextran umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das wasserlösliche Polymer Heparin und das Cheliermittel DTPA in Anwesenheit des N-Methylglucamin-Gegenions darstellt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das Polymer ein Molekulargewicht zwischen 1000 Dalton und 2.000.000 Dalton, vorzugsweise zwischen 40.000 Dalton und 75.000 Dalton, hat.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die funktionellen Gruppen Carboxylgruppen darstellen, die über eine Esterbindung an das Polymer gebunden sind, wobei das Cheliermittel vorzugsweise DTPA oder DOTA ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin das bildverstärkende Mittel das Produkt eines Cheliermittels, welches mindestens zwei Carboxylgruppen im Überschuß über die zur wirksamen Chelierung von zweiwertigem oder dreiwertigem Metall-Kationen erforderlichen besitzt, und eines Polyalkohols oder Kohlenhydrats darstellt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin das Cheliermittel DTPA und/oder der Polyalkohol oder das Kohlenhydrat Glycerin darstellt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, worin das bildverstärkende Mittel Dextran, DTPA, das an das Dextran in einem DTPA/Monosaccharideinheit-Molverhältnis zwischen 1/5 und 1/25, sowie Gadolinium, das an das DTPA gebunden ist, enthält, wobei das Dextran ein Molekulargewicht zwischen 1000 Dalton und 2.000.000 Dalton hat.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Dextran ein Molekulargewicht zwischen 40.000 Dalton und 75.000 Dalton hat.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, worin das Mittel eine mindestens 5 gew.-%ige DTPA darstellt.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, worin das Cheliermittel DTPA und das Polymer Dextran darstellt und worin bei der Konjugation des DTPA an das Dextran jeweils unter kräftigem Vermischen, das Dextran in destilliertem Wasser in einer Menge von 1,7 bis 2,0 g je 100 ml gelöst wird und 6 bis 8 g biscyclisches DTPA-Anhydrid stufenweise in Aliquots von etwa 0,3 g zugesetzt werden, während der pH-Wert der Reaktion zwischen 6,0 und 8,0 und der End-pH-Wert bei oder unterhalb 8,0 gehalten wird, und zwar sowohl vor als auch nach der Chelierung des Metallions in stöchiometrischen Mengen.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, worin das bildverstärkende Mittel anschließend an einen Antikörper oder an eine Substanz, die sekundär native oder derivatisierte Antikörper bindet, gebunden wird.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Mittel in einer im wesentlichen vollständig wasserlöslichen Form erzeugt wird und zur bildlichen Darstellung von:

inneren Tumoren mit einer Potenz, die bei intravenöser Verabreichung mindestens das 3,3-fache von Gd-DTPA beträgt; und

Körperhohlräumen sowie dem gastrointestinalen Trakt bei direkter Einführung

brauchbar ist.

26. Verfahren zur Herstellung eines bildverstärkenden Mittels, welches die physikalische Form von stabilisierten hydrophilen Mikrokugeln hat, die einen Durchmesser von 0,1 um bis 250 um, vorzugsweise von 0,1 um bis 0,5 um haben, wobei das Verfahren die Emulgierung des zunächst wasserlöslichen bildverstärkenden Mittels, welches nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23 erzeugt worden ist, in einer Ölphase umfaßt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, worin die gewünschten Mikrokugeldurchmesser von 0,1 um bis 250 um durch Ultraschallbehandlung, Hochgeschwindigkeitsscherung oder eine vergleichbare alternative Ultrahomogenisierungsmethode erhalten werden und/oder die gewünschten Auflösungsgeschwindigkeiten der Mikrokugeln in wäßrigen Lösungsmitteln durch Hitzestabilisierung, chemische Vernetzung, Ionenbindung (gepaarte Ionen) oder Kombinationen dieser physikalischen und chemischen Verfahren erzielt werden; worin das Öl extrahiert und das Präparat unter Verwendung von Ether, Hexan oder vergleichbaren flüchtigen organischen Lösungsmitteln sterilisiert wird; und worin die erhaltenen Mikrokugeln zur Trockenlagerung lyophilisiert werden.

28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, worin die polymere Matrix Dextran oder Heparin enthält, worin die Stabilisierung der Mikrokugeln gegen Auflösung in Wasser durch Erhitzen einer Ölphasen-Emulsion der Mikrokugeln bei 115ºC bis 135ºC über einen Zeitraum von 20 bis 40 Minuten vor der Extraktion des Öls mit einem organischen Lösungsmittel erreicht wird, worin das physikalisch eingeschlossene Cheliermittel DTPA ist und worin das paramagnetische Metallion Gadolinium ist.

29. Verfahren nach Anspruch 28, worin die polymere Matrix Dextran ist und die Mikrokugeln einen gewünschten Mikrokugeldurchmesser zwischen 0,1 um und 250 um haben, der durch Ultraschallbehandlung unter kräftigem Rühren erzielt wird, wobei das Öl extrahiert und das Präparat unter Verwendung von Hexan sterilisiert wird.

30. Verfahren nach Anspruch 27, worin die polymere Matrix Heparin und das Cheliermittel DTPA ist und die Auflösungsgeschwindigkeiten der Mikrokugeln in wäßrigen Lösungsmitteln durch Ionenbindung (gepaarte Ionen) von positiv geladenen quaternären Ammoniumionen erreicht werden.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, worin das Metallion nicht-radioaktiv ist und aus der Gruppe der Elemente mit Atomzahlen von 21 bis 29 und 57 bis 70 ausgewählt ist.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 31, worin das erzeugte Mittel in der physikalischen Form von stabilisierten hydrophilen Mikrokugeln vorliegt, die einen Durchmesser von 0,1 um bis 0,5 um haben und wobei das Mittel zur bildlichen Darstellung von

a) Leber, Milz und Knochenmark mit einer Potenz, die bei intravenöser Verabreichung mindestens das 7-fache von Gd-DTPA beträgt; und

b) allen Körperhohlräumen sowie dem gastrointestinalen Trakt bei direkter Einführung

brauchbar ist.

33. Verwendung eines Mittels, das nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32 hergestellt worden ist, bei der Herstellung einer Rezeptur zur Verstärkung der NMR-Bilder eines Patienten.

34. Verwendung eines Mittels, das nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32 hergestellt worden ist, bei der Herstellung einer Zubereitung zur bildlichen Ultraschall-Darstellung.

35. Bildverstärkendes Mittel oder spektral verstärkendes Mittel, hergestellt durch kovalente Kupplung in einem wäßrigen protonenhaltigen Lösungsmittel:

eines biologisch abbaubaren, wasserlöslichen Polymers, das sich wiederholende hydrophile monomere Einheiten mit Amino-und/oder Hydroxylgruppen enthält;

eines Cheliermittels, das bei physiologischen Temperaturen und pH-Werten eine Bildungskonstante für zweiwertige oder dreiwertige Metall-Kationen von mindestens 10&sup8; hat, wobei sich die funktionellen Gruppen des Cheliermittels mit den reaktiven Gruppen der monomeren Einheiten des Polymers verbinden;

und eines Metallions, das mit dem Cheliermittel assoziiert Ist,

wobei das bildverstärkende Mittel ein Molekulargewicht im Bereich von 1000 bis 2.000.000 Dalton hat und weniger als 5% (Gew./Gew.) vernetzte oder mikroaggregierte Bestandteile enthält und biologisch abbaubar ist.

36. Bildverstärkendes Mittel oder spektral verstärkendes Mittel nach Anspruch 35, worin das bei seiner Bildung verwendete Cheliermittel bei physiologischen Temperaturen und pH-Werten eine Bildungskonstante für zweiwertige oder dreiwertige Metallkationen von mindestens etwa 10¹³ hat.

37. Bildverstärkendes Mittel oderspektral verstärkendes Mittel nach Anspruch 35, worin das bei seiner Bildung verwendete Cheliermittel bei physiologischen Temperaturen und pH-Werten eine Bildungskonstante für zweiwertige oder dreiwertige Metallkationen von mindestens etwa 10¹&sup7; hat.

38. Bildverstärkendes Mittel oder spektral verstärkendes Mittel nach einem der Ansprüche 35 bis 37, welches durch das spezifische Merkmal nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 23 modifiziert ist.

39. Bildverstärkendes Mittel oder spektral verstärkendes Mittel nach einem der Ansprüche 35 bis 38, worin das wasserlösliche Polymer Dextran enthält und das Cheliermittel DTPA und das Metallion Gadolinium sind.

40. Bildverstärkendes Mittel oder spektral verstärkendes Mittel nach einem der Ansprüche 35 bis 38, worin das Metallion Eisen ist.

41. Bildverstärkendes Mittel oder spektral verstärkendes Mittel nach Anspruch 40, worin das Polymer Dextran enthält und das Cheliermittel DTPA ist.

42. Bildverstärkendes Mittel oder spektral verstärkendes Mittel in der physikalischen Form von stabilisierten hydrophilen Mikrokugeln, die einen Durchmesser von 0,1 um bis 250 um haben und wobei das Mittel nach einem Verfahren hergestellt ist, welches die Stufe der Ölphasen-Emulgierung eines zunächst wasserlöslichen bildverstärkenden Mittels, das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23 hergestellt worden ist, umfaßt.

43. Mittel nach Anspruch 42, worin die gewünschten Mikrokugeldurchmesser von 0,1 um bis 250 um durch Ultraschallbehandlung, Hochgeschwindigkeitsscherung oder ein vergleichbares alternatives Ultrahomogenisierungsverfahren erhalten worden sind und worin die gewünschten Auflösungsgeschwindigkeit der Mikrokugeln in wäßrigen Lösungsmitteln durch Hitzestabilisierung, chemische Vernetzung, Ionenbindung (gepaarte Ionen) oder Kombinationen dieser physikalischen und chemischen Verfahren erzielt worden sind.

44. Mittel nach Anspruch 43, worin das Öl extrahiert und das Präparat unter Verwendung von Ethern, Hexanen oder vergleichbaren flüchtigen organischen Lösungsmitteln stabilisiert worden ist, und worin die Mikrokugeln gegebenenfalls für die Trockenlagerung lyophilisiert worden sind.

45. Verfahren zur Herstellung eines bildverstärkenden Mittels oder eine spektral verstärkenden Mittels in der physikalischen Form von hydrophilen Mikroaggregaten, welches die Ionenbindung (gepaarte Ionen) eines zunächst wasserlöslichen bildverstärkenden Mittels, das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23 hergestellt worden ist, umfaßt.

46. Bildverstärkendes Mittel oder spektral verstärkendes Mittel in der physikalischen Form von hydrophilen Mikroaggregaten, welches durch Ionenbindung (gepaarte Ionen) eines zunächst wasserlöslichen bildverstärkenden Mittels nach einem der Ansprüche 35 bis 41 hergestellt worden ist.