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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Das
Gebiet der Erfindung betrifft Therapeutika und Diagnostika, die
Makromoleküle
als Transportmittel nutzen.
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Die
Verwendung oder die hypothetische Verwendung bestimmter Makromoleküle als Transportmittel
zum Targeting von daran gebundenen Wirkstoffen und diagnostischen
Mitteln ist bekannt, zur Zeit aber nicht ohne schwerwiegende Einschränkungen.
Versuche mit Therapeutika waren mangels preiswerter und nichttoxischer
molekularer Grundgerüste,
an die sich Wirkstoffe und Targetsubstrate in ausreichender Beladung
binden lassen, klinisch nur begrenzt erfolgreich. Ähnliche
Problemen treten bei den aktuellen Verfahren zur kardiovaskulären Darstellung
und zur Tumordarstellung auf, die gebundene Stoffe für Kernspintomographie
(Magnetresonanztomographie, MRI) und Computertomographie (CT) gebundene
Stoffe verwenden.
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Daher
hat sich das Interesse auf das molekulare Grundgerüst des Trägermittels
konzentriert, dessen Funktion es ist, Wirkstoffe, Substrate und
Moleküle
zur Bilddarstellung und andere diagnostische Moleküle zu tragen,
um sie zu spezifischen Zellgeweben zu transportieren. Die zur Zeit
am häufigsten
eingesetzten Grundgerüste
sind Dextran, Polylysin, synthetische Copolymere, Starburst-Dendrimere
und humanes Serumalbumin.
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Für Dextran,
ein verzweigtes Glucosepolymer, gibt es umfangreiche Erfahrungen
mit der Verwendung am Menschen, und Dextran bietet das höchste Verhältnis von
Bindungsstellen pro Molmasse. Es ist ferner sehr hydrophil, was
ein geringes Injektionsvolumen ermöglicht. Dextran ist zwar relativ preiswert,
es hat aber den Nachteil, daß seine üblichen
Bindungsstellen chemisch nicht genügend flexibel sind und daß es als
Folge der zur Bindung üblicherweise
eingesetzten Mittel sehr häufig
zu unerwünschten
Vernetzungen kommt.
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Auf
der anderen Seite ist Polylysin ausgesprochen teuer und es gibt
nur sehr begrenzte Erfahrungen mit der Verwendung am Menschen. Ungeachtet
dessen hat Polylysin einerseits den Vorteil, daß es in verschiedenen Kettenlängen zur
Verfügung steht,
und andererseits hat es den weiteren Vorteil, daß seine Seitenketten für die chemische
Bindung von Wirkstoffen und Rezeptorsubstraten leicht zugänglich sind.
Daher wird Polylysin häufig
verwendet, um aussichtsreiche Wirkstofftransportsysteme an Tieren
zu testen.
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Synthetische
Copolymere, wie sie z.B. von Krinick et al., Makromol. Chem. 191:839–856 (1990) beschrieben
werden, bieten Linearität
und eine neutrale Nettoladung, die die Diffusion verbessert. Synthetische
Copolymere bieten insoweit einen weiteren Vorteil, als sie in Masse
synthetisiert werden können. Ihre
Synthese erfordert jedoch zahlreiche Schritte, die, selbst wenn
sie nicht komplex sind, doch zeitaufwendig, teuer und daher ineffizient
sind. Ferner gibt es für
synthetische Copolymere nur begrenzte Erfahrungen mit der Verwendung
am Menschen.
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Starburst-Dendrimere
(siehe Tomalia et al. (1985) Polymer J. 17:117–132) sind insoweit vorteilhaft,
als ihr Molekulargewicht weniger heterogen ist und sie daher leichter
reproduzierbar und vorhersagbar sind. Sie haben jedoch den Nachteil,
daß sie
(1) nur eine geringe, unzureichende Zahl von Bindungsstellen pro
Grundgerüst
bieten und es (2) nur begrenzte Erfahrungen mit der Verwendung am
Menschen gibt. Ähnliche
Nachteile gibt es bei der Verwendung von humanem Serumalbumin.
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Angesichts
dessen wird dringend ein preiswertes und nichttoxisches molekulares
Grundgerüst als
Transportvehikel benötigt,
das in hoher Dichte Stellen besitzt, die in der Lage sind, Moleküle zu binden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein oder mehrere der oben genannten
Probleme auf diesem Gebiet zu lösen
oder leichter zu machen und brauchbare Alternativen zu schaffen.
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Im
einzelnen besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, ein neues oder
verbessertes makromolekulares Transportsystem für Stoffe aller Art bereitzustellen,
seien sie diagnostischer, therapeutischer oder sonstiger Art.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein relativ untoxisches
Makromolekül
bereitzustellen, das gegenüber
dem, was bislang im Stand der Technik beschriebenen wurde, eine
hohe Dichte von Bindungsstellen aufweist.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, bei Methoden, bei denen
makromolekulare Grundgerüste
als Transportvehikel verwendet werden, den Erfolg beim Transport
zu verbessern und die Verabreichungsvolumina zu verringern.
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Noch
eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Makromolekül bereitzustellen,
das leicht erhältlich,
relativ preiswert und von nachweisbarem Wert bei der wissenschaftlichen
Forschung und in der Medizin ist.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die chemische Synthese
und die Produktion neuer chemischer Seitenketten mit geeigneter
Flexibilität
für die
Bindung zu beschreiben.
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Entsprechend
einer oder mehreren dieser Aufgaben ist ein erster Gegenstand der
Erfindung ein Trägermolekül, das ein
Grundgerüst
umfaßt,
wobei an das Grundgerüst
eine Vielzahl von Seitenkettengruppen mit der Struktur -O(CH2)3S(CH2)2NH2 gebunden sind.
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Bei
bevorzugten Ausführungsformen
leitet sich das Grundgerüst
von einem Polysaccharid ab, vorzugsweise Dextran, und die Seitenkettenstrukturen
stammen aus der Reaktion einer Allylgruppe mit Aminoethanthiol.
Wenn Dextran verwendet wird, kann dieses aus jedem beliebigen Molekulargewicht ausgewählt sein,
das sich für
die letztendliche Verwendung des Moleküls, seine Seitenketten und
seine Konjugate eignet. Für
verschiedene diagnostische und therapeutische Anwendungen benötigt man,
wie dem Durchschnittsfachmann bewußt ist, Dextrane mit unterschiedlichem
MG.
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Bei
den vorteilhaftesten Ausführungsformen ist
bevorzugt, daß wenigstens
eine chemische Gruppe über
die Aminogruppen der Seitenketten an das Grundgerüst konjugiert
ist. Diese chemischen Gruppen können
aus vielen verschiedenen Verbindungen ausgewählt werden, die eine geeignete
therapeutische oder diagnostische Verwendungsmöglichkeit besitzen, einschließlich und
ohne darauf beschränkt zu
sein: Chelatoren, Rezeptorliganden, Lectinen, Enzymsubstraten, Nucleinsäuren, Peptiden,
Polysacchariden, Monosacchariden, Radiosensibilisatoren, Radioprotektoren
und Farbstoffen. Die Gruppen müssen
nicht direkten Nutzen bringen, sondern sie können auch indirekt nutzbringend
sein, indem sie ein Targeting zu einem gegebenen Zell- oder Gewebetyp
ermöglichen,
so daß eine
andere funktionelle Einheit, die an das Grundgerüst gebunden ist, die gewünschte positive
oder negative Funktion ausüben kann.
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Die
hohe Beladung mit und die hohe Dichte von Seitenketten pro nichttoxischem
Grundgerüst
ist wegen der signifikanten kinetischen Vorteile bei Bindung und
Transport ein wichtiger Aspekt der Erfindung. Es können entsprechend
mehr therapeutische oder diagnostische Moleküle transportiert werden, um
ihren Zweck zu erfüllen.
Dies kann den sehr allgemeinen Fall umfassen, daß Liganden in hoher Dichte
einfach an das Molekül
des Grundgerüsts
gebunden werden können,
damit sie bestimmte Rezeptoren effektiver blockieren, wenn sie ihnen
zugeführt oder
mit ihnen in Kontakt gebracht werden. Rezeptoren spielen bei zellulären biochemischen
Funktionen eine Rolle. Die Blockade dieser Funktion kann bei einer
gegebenen Indikation und im gegebenem Kontext therapeutisch wertvoll
sein. Daher kommen Antagonisten in Betracht, die zu einer kompetitiven
oder nichtkompetitiven Hemmung mit normalen oder anomalen biologischen
Stoffen in der Lage sind.
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Auch
Agonisten können
verwendet werden, um die gewünschte
Wirkung zu erzielen, soweit sie die Endozytose der Grundgerüsteinheit
und der Stoffe, an die sie gebunden sind, signalisieren oder stimulieren
können
oder eine intrazelluläre
Kaskade auslösen
können.
Der Fachmann erkennt das breite Gebiet von Anwendungsmöglichkeiten
der zahlreichen Ausführungsformen
der Erfindung und welchen Nutzen dies bringt:
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Bei
besonders bevorzugten Ausführungsformen
trägt das
Grundgerüst
sowohl einen Liganden mit einer spezifischen Affinität für einen
gegebenen Gewebe- oder Zelltyp als auch ein Chelatormolekül. Der Chelator
hat normalerweise Stickstoffgruppen mit freien Elektronen, die fest
an positiv geladene Metallatome und Ionen binden. Bevorzugte Chelatoren,
die bei der Erfindung verwendet werden können, umfassen DOTA, MAG3 und
DTPA. DOTA ist besonders bevorzugt, weil seine Geometrie passend
für das
Gadoliniumatom ist, das sowohl zur Computertomographie (CT) als
auch zur Kernspintomographie (Magnetresonanztomographie, MRI) verwendet
werden kann, und dieses fest aufnimmt. Der MAG3-Chelator wird bei
einer Komplexbildung mit dem Radioelement Technetium-99m (Tc-99m)
bevorzugt, das eine relativ kurze Halbwertszeit von 6 Stunden hat. Diese
Halbwertszeit ist mit biologischen Prozessen und klinischen Protokollen
kompatibel, was zur Detektion von Wächterlymphknoten ausreichend
lang ist und es einem Chirurgen ermöglicht, den genauen Ort und
das Ausmaß von
beispielsweise Tumorwachstum oder Metastasen zu bestimmen und diese zu
entfernen. Diese besondere Kombination läßt sich daher ausgezeichnet
in der Nuklearmedizin anwenden.
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In
anderen, sich nicht notwendigerweise gegenseitig ausschließenden Ausführungsformen
kann der Chelator mit einem Nicht-Radioisotop oder -element, z.B.
einem absorbierenden Element (hohe Dichte), oder einem paramagnetischen
Atom kombiniert werden, für
die jeweils spezielle Anwendungsmöglichkeiten bei den Methoden
der Computertomographie bzw. der Kernspin- oder Magnetresonanztomographie
existieren. Hierbei handelt es sich um diagnostische Methoden, die
es ermöglichen,
unterschiedliche physiologische oder anatomische Strukturen mittels
der charakteristischen Eigenschaften der eingeführten hochdichten oder paramagnetischen
Atome bildlich darzustellen. Solche diagnostischen Methoden können therapeutische
Methoden einleiten, müssen
es aber nicht.
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Mit
Hilfe der Ausführungsformen
der Erfindung lassen sich außerdem
gleichzeitig sowohl diagnostische als auch therapeutische Methoden
durchführen,
z. B. wenn man einige der Seitengruppen des Grundgerüsts mit
einem diagnostischen Mittel konjugiert und andere mit einem therapeutischen
Mittel konjugiert.
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Für die Detektion
von Wächterlymphknoten macht
sich diese besondere diagnostische Methode die von der Erfindung
gebotene hohe Stabilität,
die Nichttoxizität
und die hohe Beladung und Affinität zunutze, um die Differenzierung,
die Isolierung und die Exzision zu verbessern. Bei dieser Methode
wird üblicherweise
ein an eine erfindungsgemäße Seitenkette
gebundener Chelator eingesetzt, an den außerdem ein Radioatom wie Technetium-99m
gebunden sein kann. Weitere Möglichkeiten
für die
Erfindung umfassen die Verwendung von Gadolinium, Dysprosium, Ytterbium,
Indium und anderen Elementen mit nützlichen Eigenschaften.
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Das
Targeting der obigen macht es erforderlich, daß zusätzlich ein Rezeptorsubstrat
verwendet und eingesetzt wird, z.B. Mannose, Galactose, Peptide
usw. Der Begriff Substrat weist nicht zwingend darauf hin, daß ein Enzym
angreifen kann, er kann sich auch, und tut dies vorzugsweise, auf
eine einfache Bindung von Ligand:Rezeptor beziehen. Der Begriff "Ligand" kann somit viele
Formen und Konstitutionen annehmen und kann synonym mit dem Begriff "Rezeptorsubstrat", wie er hier verwendet
wird, gebraucht werden. Die Wahl eines gewünschten Liganden oder Rezeptorsubstrats
zum Targeting eines gegebenen Rezeptors ist allgemeines Fachwissen.
Für eine
gegebene Anwendung sind buchstäblich
tausende von Wechselwirkungen bekannt, die man sich zunutze machen
kann. Ferner kann sich der gezielt angesteuerte Rezeptor auch von
Viren, Bakterien, Protozoen, Pilzen, Pflanzen und Insekten und nicht notwendig
nur von Tieren oder Säugern
ableiten.
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Was
den Grad der Allylierung, der Bindung der Seitenketten und der Konjugation
betrifft, so kann dieser irgendwo zwischen 1 und 100 liegen, wobei 100
bevorzugt ist. Wenn jedoch nicht alle Seitenketten vollständig konjugiert
sind, so kann bei weiteren Ausführungsformen
das Anhängen
eines ungeladenen "Blockierungs"-Moleküls in Betracht
kommen, z.B. einer Methyl-, Alkyl- oder Arylgruppe an den oder die
freien Aminoterminus bzw. -termini, so daß das Gesamtmolekül weniger
geladen ist. Wie dem Fachmann bewußt, ist die geringere Ladung
für viele
Anwendungen besser.
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Ein
zweiter Gegenstand der Erfindung neben den Produkten und Anwendungsmöglichkeiten
des ersten Gegenstandes sind Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen
vernetzungsfreien Trägermolekülen, die
eine Vielzahl aminoterminierter Seitenketten aufweisen. Unter "im wesentlichen vernetzungsfrei" versteht man künstlich
eingebrachte Vernetzungen zwischen Molekülen des gleichen Typs, z.B.
Glucoseeinheiten im gleichen Dextranmolekül. Der Begriff soll nicht die
hier beschriebene spezifische, beabsichtigte Konjugation von Heteromolekülen an die Seitenketten
des Grundgerüsts
umfassen. Es wird ferner anerkannt, daß Grundgerüste, z.B. Polysaccharide, von
Anfang an natürlich
vernetzt sein können;
der Begriff "im
wesentlichen vernetzungsfrei" nimmt
speziell solche Phänomene
aus.
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Der
Begriff "im wesentlichen" wird in dem Wissen
verwendet, daß doch
geringfügig
noch unerwünschte
Vernetzungen auftreten können,
z.B. durch die Anwesenheit von Verunreinigungen oder die Anwendung
suboptimaler Bedingungen für
die Bindung, daß eine
solch begrenzte Vernetzung jedoch tolerabel ist. Im Hinblick darauf
wird der Begriff verwendet, um darauf hinzuweisen, daß eine große Aufgabe
der Erfindung (nämlich
die, künstliche
Vernetzungsphänomene,
die mit der Einführung üblicher
Seitenketten in ein Grundgerüst
zusammenhängen,
zu vermeiden, zu kontrollieren oder zu minimieren) nicht signifikant beeinträchtigt wird.
Wie ausgeführt
haben herkömmliche
Verfahren in dieser Hinsicht versagt und die Erfindung korrigiert
dies signifikant, indem beispielsweise bifunktionellen Gruppen werwendet
werden, wie in der bevorzugten Ausführungsform, bei der Aminoethanthiol
verwendet wird. Bis zu dieser Erfindung war es schwierig, wenn nicht
sogar unmöglich,
solche unbeabsichtigten "Nebenreaktionen" zu kontrollieren,
deren Ergebnis es war, daß das
Molekulargewicht über
tolerierbare und geeignete Grenzen erhöht und die Löslichkeit
unter solche Grenzen gesenkt wurde.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens umfaßt
vorzugsweise das Bereitstellen eines Grundgerüstmoleküls mit einer Vielzahl von Hydroxygruppen,
Allylieren wenigstens eines Teils dieser Hydroxygruppen an dem Grundgerüstmolekül unter Herstellung
eines Allylderivats des Grundgerüsts, Umsetzen
dieser Allylgruppen des Allylderivats mit einer Verbindung, die
einen Aminoterminus und einen zweiten Terminus umfaßt, wobei
dieser zweite Terminus spezifisch mit den Allylgruppen des Allylderivats
reagieren kann; und Umsetzen des Allylderivats mit der Verbindung
unter Herstellung eines im wesentlichen vernetzungsfreien Trägermoleküls, das eine
Vielzahl aminoterminierter Seitenketten aufweist.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist das Grundgerüst
wiederum ein Polysaccharid, vorzugsweise Dextran. Vorzugsweise,
aber nicht zwingend, ist die Verbindung, die verwendet wird, um die
Seitenketten an dem allylderivatisierten Grundgerüstmolekül zu erzeugen
und zu binden, Aminoethanthiol.
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Bei
weiteren Ausführungsformen
des Verfahrens kommt eine Konjugation in Betracht, wie sie für den ersten
Gegenstand beschrieben wurde, z.B. unter Verwendung wenigstens eines
Mitglieds, das ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Chelatoren, Rezeptorliganden; Enzymsubstraten,
Nucleinsäuren,
Peptiden, Polysacchariden, Monosacchariden, Radiosensibilisatoren,
Radioprotektoren und Farbstoffen. Die Farbstoffe können fluoreszierend oder
in anderer Weise mit Hilfe von auf diesem Gebiet üblichen
Licht- und/oder Hilfsmitteln unterschieden werden.
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Andere
Ausführungsformen
des Verfahrens entsprechen denjenigen, die bereits im Zusammenhang
mit dem ersten Gegenstand angegeben wurden.
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Weitere
Aspekte der Erfindung betreffen speziellere Produkte und "Product-by-Processes". Beispielsweise
wird ein aus dem Molekül
des ersten Gegenstandes synthetisiertes MRI-Mittel beansprucht sowie ein gemäß den Verfahren
des zweiten Gegenstandes hergestelltes MRI-Mittel. Ferner wird ein
aus oder gemäß irgendeinem
der ersten beiden Gegenstände
synthetisiertes CT-Mittel beansprucht. Schließlich werden Kontrastmittel
für Wächterlymphknoten
beansprucht, die den ersten oder zweiten Gegenstand wiedergeben
oder einsetzen, und jede denkbare Kombination spezieller Ausführungsformen
jener Gegenstände.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
eine Ausführungsform
mit einer Folge von Reaktionsschritten zur kovalenten Kopplung von
Bindungssstellen an ein makromolekulares Grundgerüst.
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2 zeigt
eine Ausführungsform
der Erfindung, bei der es sich um ein Mittel zur Blutpool-CT handelt,
das ein Grundgerüst
(Dextran), einen Chelator (DPTA) und ein paramagnetisches Atom (Dysprosium)
umfaßt.
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3 zeigt
eine Ausführungsform
mit einer Folge von Reaktionsschritten zur Kopplung von DTPA an
Bindungsstellen.
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4 zeigt
eine Ausführungsform
mit einer Folge von Reaktionsschritten zur Kopplung von DOTA an
Bindungsstellen.
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5 zeigt
eine Ausführungsform
mit einer Folge von Reaktionsschritten zur Kopplung von MAG3 an
Bindungsstellen.
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6 zeigt
eine Ausführungsform
für ein
Mittel zur Lymphknoten-MRI, das ein Rezeptorsubstrat (Mannose),
ein Grundgerüst
(Dextran), einen Chelator (DOTA) und einen MRI-Reporter (Gadolinium) umfaßt.
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7 zeigt
die Formel für
eine Ausführungsform
eines Mittels zur Detektion von Wächterlymphknoten, das ein Rezeptorsubstrat
(Mannose), ein Grundgerüst
(Dextran), einen Chelator (DTPA) und ein radioaktives Atom (Tc-99)
umfaßt.
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8 zeigt
eine Ausführungsform
eines Verfahrens zur Kopplung von Mannose an die Bindungsstellen.
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9 zeigt
die Formel für
eine Ausführungsform
eines Mittels zur Detektion von Wächterlymphknoten, das ein Rezeptorsubstrat
(Mannose), ein Grundgerüst
(Dextran), einen Chelator (MAG3) und ein radioaktives Atom (Tc-99m)
umfaßt.
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10 ist
ein Diagramm des Prozentsatzes der injizierten. Dosis gegen die
Zeit, das die Aufnahme von TcMAG3-Mannosyl-Dextran (gefüllte Symbole) und Tc-Schwefel-Kolloid
(offene Symbole) durch Wächterlymphknoten
zeigt.
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11 ist
ein Diagramm des Prozentsatzes der injizierten Dosis in logarithmischer
Auftragung gegen die Zeit, das die Clearance der Injektionsstelle von
TcMAG3-Mannosyl-Dextran (gefüllte
Symbole) und Tc-Schwefel-Kolloid (offene Symbole) zeigt.
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12 zeigt
axilläre
Lymphknoten von Kaninchen (angezeigt durch Pfeile), die 15 Minuten nach
subkutaner Verabreichung von TcMAG3-Mannosyl-Dextran (rechter Fußballen)
und TcSC (linker Fußballen)
tomographiert wurden. Die Injektionsstellen liegen oben auf der
Aufnahme. Auf jeder Seite des Kaninchens befindet sich ein Paar
von Standards. Neben den bilateralen Wächterlymphknoten könnte ein
Aktivitätsfokus
medial benachbart zum linken Wächterlymphknoten
TcSC-Aktivität
in einem distalen Knoten darstellen.
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13a zeigt die Formel für eine Ausführungsform eines MR-Kontrastmittels
zum Hepatocyten-Targeting, das ein Rezeptorsubstrat (Galactose), ein
Grundgerüst
(Dextran), einen Chelator (DOTA) und ein paramagnetisches Atom (Gd)
umfaßt.
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13b zeigt die Formel für eine Ausführungsform eines Mittels für ein Hepatocyten-Targeting
beim Nuclear Imaging, das ein Rezeptorsubstrat (Galactose), ein
Grundgerüst
(Dextran), einen Chelator (MAG3) und ein radioaktives Atom (Tc-99m)
umfaßt.
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14a zeigt den zeitlichen Verlauf bei Kontrastmittelverstärkung in
der inferioren Vena cava, der Leber und dem Tumor nach einer Injektion
eines CT-Blutpool-Kontrastmittels
unter Verwendung einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen DyDTPA-Dextrans.
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14b zeigt den zeitlichen Verlauf bei Kontrastmittelverstärkung in
Nierenrinde, Nierenmark und Milz nach einer Injektion eines CT-Blutpool-Kotrastmittels
unter Verwendung einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen DyDTPA-Dextrans.
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14c zeigt den zeitlichen Verlauf bei Kontrastmittelverstärkung in
der inferioren Vena cava und der Leber nach einer Injektion eines
handelsüblichen
CT-Kontrastmittels,
Optiray-320.
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14d zeigt den zeitlichen Verlauf in der Nierenrinde
und im Nierenmark nach einer Injektion eines handelsüblichen
CT-Kontrastmittels, Optiray-320.
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15a zeigt die Größenverteilung von humanem Serumalbumin,
gemessen mittels FPLC. Das Hohlraumvolumen (Vo) und das Gesamtvolumen
(Vt) der Säule
sind angegeben.
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15b zeigt die Größenverteilung einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Dy-DTPA-Dextrans,
gemessen mittels FPLC. Das Hohlraumvolumen (Vo) und das Gesamtvolumen
(Vt) der Säule
sind angegeben.
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16a und 16b sind
Beispiele für
Blutpool-MRIs, die Aufnahmen eines tumortragenden Kaninchens vor
(16a) und eine Stunde nach (16b)
GdDTPA-Dextran-Injektion zeigen.
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17a–e sind
Beispiele für
CT-Aufnahmen von Blutpools eines tumortragenden Kaninchens, aufgenommen
vor Injektion und 2, 5, 30 bzw. 37 Minuten nach [Dy]DTPA-T40-Injektion.
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18a, 18b, 18c und 18d sind
CT-Aufnahmen von Blutpools, die eine zeitliche Reihe von Leberquerschnitten
vor (18a) sowie 2 Minuten (18b), 5 Minuten (18c)
und 10 Minuten (18d) nach einer Injektion von
Optiray-320 in ein gesundes Kaninchen zeigen.
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19a–b sind
Beispiele für
eine Blutpool-MRI unter Verwendung einer Ausführungsform der Erfindung, wobei 19a eine Projektionsaufnahme eines gesunden Kaninchens
mit maximaler Intensität
ist, die 15 Minuten nach Injektion von GdDTPA-Dextran (MG = 398.000
g/mol, 515 Gd pro Dextran) erhalten wurde, und 19b eine ähnliche Aufnahme
desselben Tiers ist, die drei Stunden nach Injektion erhalten wurde.
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Die
vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der nachfolgenden ausführlichen
Beschreibung beispielhafter Ausführungsformen
der Erfindung besser verständlich.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG
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Die
Erfindung betrifft das gewebespezifische Targeting von Wirkstoffen
und diagnostischen Mitteln unter Verwendung eines makromolekularen
Transportvehikels. Bislang hatte man mit solchen Vehikeln mangels
preiswerter und nichttoxischer molekularer Grundgerüste, an
die Wirkstoffe und Targetsubstrate gebunden werden können, nur
begrenzten Erfolg. Die Erfindung ändert dies, indem sie neue
Makromoleküle
bereitstellt, die nach neuen Verfahren hergestellt wurden, die eine
unerwünschte
Vernetzung unter gleichzeitiger Wahrung der Nichttoxizität unterdrücken und
die Seitenketten- und Beladungskapazität bezogen auf die Größe des Grundgerüsts optimieren.
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Obwohl
auch bei Kombination oder Konjugation mit therapeutischen Mitteln
nützlich,
ist die Erfindung besonders zur kardiovaskulären Darstellung und/oder zur
Tumordarstellung geeignet. Ein erfolgreiches kardiovaskuläres und
Tumorkontrastmittel für die
Kernspintomographie (MRI) oder Computertomographie (CT) sollte ein
preiswertes und nichttoxisches molekulares Grundgerüst besitzen,
das in der Lage ist, eine große
Zahl von Kontrastsubstraten zu tragen. Vor der Erfindung war dies
nicht der Fall.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung ist durch ein chemisches Schema gekennzeichnet, das ein
preiswertes Makromolekül
mit einer großen
Zahl von Bindungsstellen, Seitenketten ("Leashes") genannt, liefert. Eine große Zahl
(hunderte) von Seitenketten pro Grundgerüstmolekül erlaubt die Bindung von Substraten,
Wirkstoffen und/oder anderen Moleküleinheiten in hoher Dichte.
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Ein
weiteres nützliches
Merkmal findet sich in einer bevorzugten Ausführungsform, bei der das Grundgerüst des Makromoleküls Dextran
ist. Dextran besitzt ausgezeichnete Sicherheitswerte als kardiovaskulärer Volumenexpander.
Die umfangreiche Verwendung von Dextran am Menschen erhöht die Wahrscheinlichkeit,
daß der
transportierte Wirkstoff oder das transportierte diagnostische Mittel
ebenfalls nichttoxisch sind.
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Es
gibt viele potentielle Verwendungsmöglichkeiten für die Erfindung,
z.B. als Pharmazeutika (z.B. Therapeutika) und als Diagnostika (z.B.
Sonden). Obwohl theoretisch nahezu jeder Wirkstoff für die Erfindung
verwendet werden kann, sind besonders die folgenden Verwendungsmöglichkeiten
vorgesehen: Bindung von Radioprotektoren wie WR2721 (Rasey JS et
al. Specific protection of different normal tissues. Pharmac Ther
39:33–43,
1988), Chemoprotektoren wie Amifostin (Ethyol) (Capizzi RL. Protection
of normal tissues from the cytotoxic effects of chemotherapy by
amifostine (ethyol): clinical experiences. Semin Oncol 21(S11):8–15 (1994))
und Radiosensibilisatoren wie Misonidazol (Phillips TL. Sensitizers
and protectors in clinical oncology. Semin Oncol 8:67–82, 1881)
und geeignete Rezeptorsubstrate zum gewebespezifischen Schutz oder
zur gewebespezifische Sensibilisierung; Bindung antiviraler Wirkstoffe
und geeigneter Rezeptorsubstrate zur gewebespezifischen antiviralen
Therapie, z.B. zur Behandlung von Hepatitis; Bindung von Immunmodulatoren
und geeigneten Rezeptorsubstraten oder Liganden zur gewebespezifischen
Immuntherapie; Bindung von DNA und geeigneten Rezeptorsubstraten
zur gewebespezifischen Gentherapie, z.B. zum Targeting von p52 oder
Suizidgenen in Krebszellen zur Apoptoseinduktion, zum Immuntargeting
usw.; und Bindung von Peptiden und Mono- oder Polysacchariden zum
Targeting spezifischer Rezeptoren. Siehe z.B. Molteni L (1979),
Dextrans as drug carriers. In: Gregoriadis G, Hrsg. Drug Carriers
in Biology and Medicine. San Diego, Academic Press; 107–125.
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Was
Diagnostika betrifft, so kommen besonders die folgenden Anwendungsmöglichkeiten
in Betracht: Bindung von Gadoliniumkomplexen zur Kernspintomographie
(MRI) des kardiovaskulären
Systems und/oder von Tumoren; Bindung iodierter Moleküle zur computertomographischen
(CT) Darstellung des kardiovaskulären Systems und/oder von Tumoren;
Bindung von Ytterbium, Dysprosium oder anderen Schwermetallkomplexen
zur computertomographischen (CT) Darstellung des kardiovaskulären Systems
und/oder von Tumoren; Bindung von Technetium-99m-Komplexen zur szintigraphischen Darstellung
des kardiovaskulären
Systems und/oder von Tumoren; Bindung von Gadoliniumkomplexen und geeigneten
Rezeptorsubstraten zur gewebespezifischen Darstellung der Leber,
der Lymphknoten, des Knochenmarks und/oder anderer Gewebe; Bindung iodierter
Moleküle
und geeigneter Rezeptorsubstrate zur gewebespezifischen CT-Darstellung;
Bindung von Ytterbium, Dysprosium oder anderen Schwermetallkomplexen
und geeigneten Rezeptorsubstraten zur gewebespezifischen CT-Darstellung;
Bindung von Technetium-99m-Komplexen und geeigneten Rezeptorsubstraten
zur gewebespezifischen Szintigraphie; und Bindung von Farbstoffen
und fluoreszierenden Stoffen zur optischen Darstellung.
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Wiederum
dienen die vorangehenden Verwendungsmöglichkeiten lediglich der Veranschaulichung
der zahlreichen möglichen
Anwendungsformen, bei denen die Erfindung eingesetzt werden kann.
Es folgen spezielle Beispiele für
einige dieser Anwendungsmöglichkeiten;
andere Anwendungsmöglichkeiten
sind ohne weiteres ersichtlich und können von einem Durchschnittsfachmann,
der sich mit der Anmeldung befaßt,
durchgeführt
werden.
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Beispiel 1:
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Bindung von
Seitenketten an ein molekulares Grundgerüst
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Dextran,
eine bevorzugte Ausführungsform des
molekularen Grundgerüsts
der Erfindung, besitzt wie viele Polysaccharide und verzweigte Polysaccharide
eine Vielzahl reaktiver Hydroxygruppen, an denen eine chemische
Bindung erfolgen kann. Dextran ist ein natürliches Produkt, das aus Bakterien stammt.
Es wird in hochmolekularer Form isoliert und kann auf kontrollierte
Weise zu verschiedenen niedermolekulareren Gebrauchsformen, z.B.
vom Molekulargewicht ("MG") 1000, 10.000, 40.000,
70.000, 110.000, 150.000 und 500.000 (Amersham Pharmacia Biotech,
USA), hydrolysiert und aufgereinigt werden. Jede der aufgeführten MG-Spezies
kann für
die Erfindung verwendet werden und jede kann bei einer gegebenen
Verwendung eine mehr oder weniger geeignete Wirkung besitzen. Beispielsweise
würde man zur
Tumordarstellung ein Dextran mit einer Größe wählen, das nach Konjugation
von Seitenketten und Reportergruppen ein Endmolekulargewicht im
Bereich von 50–70
Kilodalton (kD) liefert. Dies würde
die selektive Diffusion in Tumoren erlauben, die eine größere Permeabilität als normales
Gewebe besitzen (siehe Seymour LW. Passive tumor targeting of soluble
macromolecules and drug conjugates. Critical Reviews of Therapeutic
Drug Carrier Systems 9:135–187
(1992)). Die Bilddarstellung kardiovaskulärer Strukturen erfordert Konjugate
mit Molekulargewichten im Bereich von 70–100 kD. Die untere Grenze
ergibt sich aus dem Wunsch, die Renalfiltration zu minimieren. Die
obere Grenze ergibt sich aus der erhöhten Viskosität hochmolekularer
Makromoleküle, die
zu Problemen bei der Verabreichung führt.
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Wie
zuvor ausgeführt,
stehen für
Dextran als Folge seiner weitreichenden Verwendung als Plasmavolumenexpander,
bei der gezeigt wurde, daß es mehrere
Wochen nach Infusion in Patienten persistiert und während dieser
Zeit allmählich
zu kleineren Formen oxidiert und über die Nieren geklärt wird,
viel pharmakologische Daten zur Verfügung. Siehe Goodman and Gilman's The Pharmacological
Basis of Therapeutics, B. Auflage, S. 690–91, Pergamon Press, New York,
(1990).
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Das
Anbinden von Seitenketten war ein zweistufiges Verfahren, wie es
in 1 gezeigt ist. Der erste Schritt ist die Aktivierung
der Hydroxyeinheiten des Dextrans mit Allylbromid (Holmberg, 1993;
Gedda, 1996). Diese Aktivierung mit Allylbromid und die nachfolgende
Reaktion mit Cysteamin ist den Reaktionen ähnlich, die zur Bildung von
Sepharoseharzen für
chromatographische Trennungen verwendet werden (siehe beispielsweise
WO 97/25139). Diese Reaktion, bei der 10 g PM10 in 75 ml deionisiertem
Wasser eingesetzt werden, und wird bei 50°C und pH 11 (durch Zutropfen
von 2,5 N NaOH eingehalten) in Gegenwart von Natriumhydroxid (2,5 g)
und Natriumborhydrid (0,2 g) durchgeführt. Nach 3 Stunden wird die
Lösung
mit Essigsäure
(2,5 M) neutralisiert, der Reaktionsansatz wird 2 Stunden bei 5°C in einen
Kühlschrank
gestellt und die obere organische Phase wird dekantiert. Nach Zugabe
von 100 ml deionisiertem Wasser wird die resultierende Lösung in
eine Ultrafiltrationszelle (MWCO = 3000) filtriert (5 mm) und mit
10 Austauschvolumina deionisiertem Wasser dialysiert. Das Produkt,
Allyldextran, wird konzentriert, lyophilisiert und bei –80°C aufbewahrt. Der
mittlere Moleküldurchmesser
wird durch Laserlichtstreuung gemessen (Honeywell MicroTrac UPA150).
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Die
durchschnittliche Anzahl von Allylgruppen pro Dextran wird auf folgende
Weise berechnet. Das lyophilisierte Allyldextran wird in Kochsalzlösung gelöst und die
Glucosekonzentration der Probe wird nach der Schwefelsäuremethode
(Dubios, 1956) unter Verwendung von lyophilisiertem Dextran als
Standard gemessen. Die Allyldichte wird berechnet, indem man die
Glucosemenge in der Probe vom Gesamtgewicht der Probe abzieht. Das
Ergebnis wird als die Menge Allylkohlenwasserstoff in der Probe angenommen.
Die Allylkonzentration wird dann durch die Glucosekonzentration
geteilt und anschließend
mit der durchschnittlichen Anahl der Glucoseeinheiten pro Dextran
multipliziert.
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Im
zweiten Schritt wurden die Allylgruppen mit 7,5 g Aminoethanthiol
(Cysteamin) in DMSO (30 ml) umgesetzt, um die aminoterminierten
Seitenketten zu bilden. Diese Reaktion wird mit Ammoniumpersulfat
(99,99%, 1,0 g) initiiert und unter einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Nach
3 Stunden wird das Reaktionsvolumen mit deionisiertem Wasser verdoppelt
und die Lösung
wird mit Natriumhydroxid (2,5 N) auf pH 4 eingestellt. Nach Zugabe
von 140 ml Natriumacetatpuffer (0,02 M, pH 4) wird das Produkt in
eine Ultrafiltrationszelle filtriert (5 mm) und mit fünf Austauschvolumina
Acetatpuffer (0,02 M, pH 4) und anschließend fünf Austauschvolumina deionisiertem
Wasser dialysiert. Nach Einengen wird das aminoterminierte Dextran
lyophilisiert. Dann wird eine Probe auf die durchschnittliche Anzahl
von Aminogruppen pro Dextran getestet, die als Amindichte definiert
wird. Dieses lyophilisierte Produkt wird bei –80°C aufbewahrt. Der mittlere Moleküldurchmesser wird
durch Laserlichtstreuung gemessen.
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Mit
diesen Methoden wurden für
Aminodextran T70, das durchschnittlich 388 Glucosereste enthält, die über α-1,6- und
-1,4-glycosidische Bindungen verknüpft sind, Substitutionsgrade
von 516 Aminogruppen pro Molekül
festgestellt. Der mittlere Durchmesser dieses Präparats von Aminodextran T70
in 0,9%iger Kochsalzlösung
war 10,8 nm; der mittlere Durchmesser von Dextran T70 in Kochsalzlösung war
10,6 nm. Bei T500, das durchschnittlich 2881 Glucoseeinheiten enthält, wurden
im Durchschnitt 2900 Aminoseitenketten als Substituenten gefunden.
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Die
durchschnittliche Anzahl von Aminogruppen pro Dextran wird auf folgende
Weise berechnet. Das lyophilisierte Dextrankonjugat wird in Kochsalzlösung gelöst und die
Aminkonzentration wird mittels des TNBS-Tests (Fields, 1972) mit
Hexylamin als Standard gemessen. Die Glucosekonzentration der gleichen
Probe wird mit der Schwefelsäuremethode (Dubios,
1956) ebenfalls gemessen. Die Amindichte wird berechnet, indem man
die Aminkonzentration durch die Glucosekonzentration teilt und anschließend mit
der durchschnittlichen Anzahl der Glucoseeinheiten pro Dextran multipliziert.
Es folgen Beispiele, wie man Aminodextran, so wie es oben formuliert
wurde, mit anderen Verbindungen konjugieren kann, um verschiedene
diagnostische Mittel zu synthetisieren.
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Beispiel 2: Bindung eines
Chelators (DTPA) zur Blutpool-Darstellung
mittels Kernspin- oder Computertomographie
-
Bindung
von Diethylentriaminpentaessigsäure
(DTPA) an Aminodextran liefert DTPA-Aminodextran, das wiederum mit
Gadolinium oder Dysprosium markiert werden kann (siehe Figur 2A),
um ein Blutpool-Kontrastmittel zur Kernspintomographie oder Computertomographie
herzustellen. Es wird die Mischanhydrid-Methode von Krejcarek et
al. (1977), Biochem. Biophys. Res. Commun. 77:581–583 angewandt.
Dies erfolgt neben der neuen Chemie, die verwendet wird, um zuerst
die Seitenketten zu etablieren. Dieses Verfahren fördert die
Vernetzung des Dextrans nicht, wenn DTPA (im Vergleich mit dem Aktivierungsreagens,
IBCF) im Überschuß eingesetzt
wird.
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Die
Mischanhydrid-Methode (Krejcarek, 1977) wurde verwendet, um DTPA
an das Dextrangerüst
zu konjugieren. Die Synthese beginnt mit der Aktivierung von DTPA
(Diethylentriaminpentaessigsäure)
(20 g) mit Isobutylchlorformiat (IBCF) (3,1 ml). Sie wird bei –30°C in Acetonitril
(83 ml) durchgeführt. Die
aktivierte DTPA wird bei 4°C
langsam zu dem aminoterminierten Dextran (2 g) in Bicarbonatpuffer (0,1
M, pH 9) gegeben (siehe 3). Diese Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Nach ausgiebiger Diafiltration des Produkts mit fünf Austauschvolumina
Bicarbonatpuffer (0,1 M, pH 9) und anschließend fünf Austauschvolumina deionisiertem Wasser
wird das Retentat eingeengt und gefriergetrocknet. Dann wird eine
Probe auf DTPA- und Amindichte getestet. Dieses lyophilisierte Produkt
wird bei –80°C aufbewahrt.
Der mittlere Moleküldurchmesser wird
durch Laserlichtstreuung gemessen.
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Die
durchschnittliche Anzahl von DTPA-Einheiten pro Dextran wird auf
folgende Weise berechnet. Lyophilisiertes DTPA-Dextran wird in 0,1
mmol/l Triethanolamin-HCl (pH = 6,0) gelöst. Wir gaben einen 1,5-fachen
(mol/mol, bezogen auf DTPA) Überschuß von Gadolinium
in einer 66 mM Lösung
(filtriert, 0,2 μ)
in 0,1 N HCl zu und stellten dann den pH mit 2,5 N NaOH auf 6 ein.
Nach 24 Stunden Rühren bei
37°C wird
die Lösung
auf ein AMICON-Ultrafiltrationssystem
zur Diafiltration mit einem Molekulargewichtsausschluß von 3000
Da überführt. Nach
10 Austauschvolumina deionisiertem Wasser und anschließend weiteren
10 Austauschvolumina Acetatpuffer (0,2 M, pH 4) wird das Retentat
eingeengt und die Gadoliniumkonzentration wird mittels ICP-Spektrometrie
(Vera, 1995) getestet. Die Glucosekonzentration der gleichen Probe
wird mit der Schwefelsäuremethode
(Dubios, 1856) ebenfalls gemessen. Die DTPA-Dichte wird berechnet,
indem man die Gadoliniumkonzentration durch die Glucosekonzentration teilt
und anschließend
mit der durchschnittlichen Anzahl der Glucoseeinheiten pro Dextran
multipliziert.
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Verfahren
zur Kopplung anderer Chelatoren, einschließlich DOTA und MAG3, an Bindungsstellen sind
in den 4 bzw. 5 gezeigt.
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Beispiel 3:
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Bindung von
Mannose zur Lymphknoten- und Leberdarstellung
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Die
Gegenwart von Mannose, die an dem Dextrangerüst hängt, lenkt die Verbindung,
abhängig von
der Verabreichungsart, gezielt zu einem Rezeptor (Mannose-bindendes
Protein), der sich auf der Leber, der Milz, der Lunge, dem Knochenmark
und den Lymphknoten befindet. Steer CJ, Ashwell G (1990). Receptormediated
endocytosis: Mechanisms, biologic function, and molecular properties.
In: Hepatology. A Textbook of Liver Disease. (2. Aufl.) Zakim D,
Boyer TD, Hrsg. W.B. Saunders, Philadelphia. Wenn die Verbindung
subkutan verabreicht wird, tritt das mannoseterminierte Dextran
in das Lymphsystem ein und bindet an Rezeptoren in Lymphknoten;
bei intravenöser
Verabreichung erfolgt eine Bindung an die Leber, die Milz, die Lunge
und das Knochenmark. Es ist ferner bekannt, daß Mannosebindendes Protein
eine erhöhte
Affinität
gegenüber
Glycoclustern, z.B. Mannose und Mannose-derivatisierten Verbindungen,
zeigt.
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Wenn
das Dextrangerüst
außerdem
so gemacht ist, daß es
einen Chelatbildner wie DTPA oder DOTA trägt (Sieving et al. (1990),
Bioconj. Chem. 1:65–71),
kann die resultierende Kombination außerdem mit Gadolinium, Technetium-99m
oder Ytterbium markiert werden. Gadolinium (siehe z.B. 6) erlaubt
den Nachweis von Leber- oder Lymphknotentumoren mittels Kernspintomographie.
Der Radiomarker Technetium-99m (siehe z.B. 7) erlaubt Leber-
oder Lymphknotendarstellung mittels Szintigraphie. Ytterbium erlaubt
wie Gadolinium und Dysprosium eine Darstellung mittels Computertomographie.
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Die
chemische Bindung von Mannose an Aminodextran kann mit einer Reihe
von Verfahren erfolgen, z.B. der, die zur Bindung an humanes Serumalbumin
beschrieben wurde (Vera et al. (1985) J. Nucl. Med. 26:1157–1167) und
der, die zur Bindung an Polylysin beschrieben wurde (Vera et al.
(1995) Acad. Radiol. 2:497–596).
Siehe z.B. 8. Diese Bindung kann wie oben
für Galactose
beschrieben erfolgen.
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Konjugation
von DTPA-Dextran mit Mannose efolgt durch reduktive Alkylierung
(Vera, 1997). Das Mannosyl-Kopplungsreagens, Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-mannosid (CNM-Thiomannose),
wird auf folgendem Wege synthetisiert. Tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosylbromid (dieses
Kohlenhydrat ist nicht im Handel erhältlich) wird durch eine zweistufige
Reaktion in Chloroform hergestellt (Lee, 1994). Nach Eindampfen
zu einem Sirup am Rotationsverdampfer wird das Produkt sofort mit
Thioharnstoff zu 2-S-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl)-2-pseudothioharnstoffhydrobromid
(Chipowsky, 1973) umgesetzt, welches aus Aceton umkristallisiert
wird.
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Unmittelbar
vor der Mannosylkonjugation wird dieses Produkt mit Natriummethoxid
(0,05 mg/ml) in trockenem, frisch destilliertem Methanol (250 ml)
bei einer CNM-Thiomannose-Konzentration von 0,04 g pro ml Methanol
deacetyliert. Nach Entfernung des Methanols am Rotationsverdampfer
wird die Kopplungsreaktion durch Zugabe einer passenden Menge DTPA-Dextran
(0,5 g) in einer 20 mg/ml-Bicarbonatpufferlösung (0,2 M, pH 9,0) durchgeführt. Die
Umsetzung erfolgt 2 Stunden bei Raumtemperatur (8).
Nach Diafiltration des Produkts mit fünf Austauschvolumina Bicarbonatpuffer
(0,1 M, pH 9) und anschließend
weiteren fünf
Austauschvolumina deionisiertem Wasser wird das Retentat eingeengt
und gefriergetrocknet. Dann wird eine Probe auf Mannose-, DTPA-
und Amindichte getestet. Dieses lyophilisierte Produkt wird bei –80°C aufbewahrt. Der
mittlere Moleküldurchmesser,
gemessen durch Laserlichtstreuung, beträgt 7,6 nm.
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Die
durchschnittliche Anzahl von Mannosegruppen pro Dextran wird auf
folgende Weise berechnet. Das lyophilisierte Dextrankonjugat wird
in Triethanolamin gelöst
und wie oben beschrieben mit Gadolinium markiert. Nach Diafiltration
und Messung der DTPA-Konzentration wird auch die Mannosekonzentration
der gleichen Probe nach der Schwefelsäuremethode (Dubios, 1956) gemessen.
Die Mannosedichte wird berechnet, indem man die Mannosekonzentration
durch die Dextrankonzentration teilt, die auf Basis der bekannten
DTPA-Dichte des DTPA-Dextrankonjugats berechnet wird.
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Ein
Mittel zur Wächterlymphknotendarstellung,
DTPA-Mannosyldextran,
wurde mit Dextran pharmazeutischen Grades, PM10, synthetisiert.
Siehe z.B. 7. Dieses Präparat besaß einen mittleren Durchmesser
von 7,6 nm, eine Mannosedichte von 44 Einheiten pro Dextran, eine
Amindichte von 23 Einheiten pro Dextran und eine DTPA-Dichte von
8 Einheiten pro Dextran. Das Molekulargewicht betrug 36,288 g/mol.
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Beispiel 4: Bindung von
Galactose zur Leberdarstellung
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Die
Anwesenheit des Substrats Galactose kann das Dextran zu einem Rezeptor
führen,
der sich ausschließlich
in der Leber befindet. Wenn das Dextran außerdem DTPA trägt, kann
es mit Gadolinium oder Technetium-99m markiert werden. Die Verwendung
von Gadolinium erlaubt den Nachweis von Leberkrebs mittels Kernspintomographie.
Der radioaktive Marker Technetium-99m erlaubt eine Leberdarstellung
mittels Szintigraphie.
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Die
chemische Bindung von Galactose an Aminodextran kann mit Hilfe einer
Reihe von Verfahren erfolgen, beispielsweise wie für die Bindung
an humanes Serumalbumin (Vera et al. (1985) J. Nucl. Med. 26:1157–1167) und
an Polylysin (Vera et al. (1995) Acad. Radiol. 2:497–596) beschrieben.
Die Kopplungsreaktion für
die Bindung von Galactose an aminoterminiertes Dextran ist die gleiche
wie für
die Bindung (siehe unten) von Mannose. Die 13A und 13B sind Beispiele für ein MR-Leber-Kontrastmittel
und ein nuklearmedizinisches Kontrastmittel, die beide eine Ausführungsform
der Erfindung verwenden.
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Beispiel 5: Bindung des
MAG3-Chelators zum Nuclear Imaging
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Die
Konjugation von aminoterminiertem Dextran beginnt mit der Aktivierung
von Mercaptoacetylglycylglycylglycin (MAG3) (Fritzberg, 1986) durch
Tetrafluorphenol (TFP). Sie erfolgt mit einer äquivalenten Menge von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC) in N,N-Dimethylformamid (DMF) bei Raumtemperatur. Diese Lösung wird
am Rotationsverdampfer eingedampft, in Chloroform gelöst und filtriert.
Die resultierende Lösung
wird am Rotationsverdampfer eingedampft und das Lösungsprodukt,
TFP-MAG3, im Gefrierschrank aufbewahrt. Schließlich wird das aminoterminierte
Dextran in einer DMSO/Wasser-Lösung (1:10)
mit TFP-MAG3 in
einer ähnlichen
Lösung
vereinigt. Diese Lösung
wird über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Nach ausgiebiger Diafiltration mit Wasser wird das Produkt eingeengt
und gefriergetrocknet.
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Darstellung von Wächterlymphknoten:
Aussichten für eine
verbesserte Diagnose und Behandlung von Krebs, z.B. Brustkrebs,
Melanom und Kolorektalkrebs.
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In
einem Versuch, die Morbidität
und die Nachweiskosten für
Lymphknotenmetastasen zu verringern, haben chirurgische Onkologen
ein Verfahren entwickelt, durch das der Wächterlymphknoten (der erste
drainierende Lymphknoten) intraoperativ identifiziert und entfernt
wird (Morton et al. (1992) Arch. Surg. 127:292–299). Diese Methode, die als
Wächterlymphknotenbiopsie
bezeichnet wird, hat extrem hohe negative Vorhersagewerte für Melanom-
und Brustkrebsmetastasen (Giuliano et al. (1994) Arch. Surg. 220:391–401); die
falschnegativen Raten reichen von 0–9% für beide Krebsarten. Außerdem gibt es
zunehmend Hinweise, daß Wächterlymphknotenbiopsie
das Management von Kolorektalkrebs signifikant beeinflußt (Saha
et al. (1998) J. Surg. Oncol. 69:183).
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Wie
ausgeführt,
ist die Wächterlymphknotendarstellung
eine nuklearmedizinische Prüfung,
die für den
Chirurgen den ersten Lymphknoten identifiziert, der Lymphfluß von der
Stelle des Primärtumors
erhält.
Dieser Knoten wird entfernt und zum Nachweis maligner Zellen zur
Gefrierschnittanalyse geschickt. Durch Identifizierung des Wächterlymphknotens
vor der Operation genügt
ein kleiner Schnitt zur Entfernung des Knotens und es muß weniger
herausgeschnitten werden. Der extrem hohe negative Vorhersagewert
der Methode scheint ein genaues Staging zu liefern und kann Patienten,
die Wächterlymphknoten-negativ
sind, die Morbidität
einer vollständigen Lymphknotendissektion
ersparen. Folglich kann ein Staging des Krebses durch Lymphknotendarstellung äquivalent
zu einer axillären
Lymphknotendissektion ohne die begleitende postchirurgische Morbidität sein.
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Bei
Durchführung
einer Wächterlymphknotenbiopsie
wird das Kontrastmittel um die Tumorstelle injiziert und um den
Wächterlymphknoten
aufzufinden und zu entfernen wird eine Hand-Gammasonde verwendet. Häufig schwappt
die nukleare Aktivität
jedoch entweder in die Drainageregion der Knoten über, was
eine Differenzierung zwischen Lymphknoten und Tumor schwierig macht,
oder sie verteilt sich auf zahlreiche Lymphknoten, was dazu führt, daß mehr Lymphknoten
als nötig
entfernt werden.
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Ein
ideales Kontrastmittel für
Wächterlymphknoten
sollte rasche Clearance von der Injektionsstelle, hohe Retention
im Lymphkanal, rasche, vollständige
und langanhaltende Aufnahme durch den Wächterlymphknoten und wenig
Aufnahme durch die übrigen
Lymphknoten zeigen. Bei Brustkrebsfällen findet man den Wächterlymphknoten
manchmal nicht, weil der Tumor so nahe am Wächterlymphknoten liegt und
die Radioaktivität
zwischen den beiden Stellen nicht zu unterscheiden ist. Ferner gelten
die üblichen
Kriterien von geringer Strahlungsabsorption, hoher biologischer
Sicherheit, einfacher, rascher und stabiler Markierung mit Technetium-99m
und biochemischer Reinheit.
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Filtrierte
Kolloide zeigen eine schlechte Clearance von der Injektionsstelle.
Die Halbwertszeiten für
filtriertes Tc-Albumin-Kolloid
und Tc-Schwefel-Kolloid betragen 5,5 h bzw. 10,5 h (Glass, 1995). Dies
entspricht etwa 65% und 85% der Dosis an der Injektionsstelle 3
Stunden nach Injektion, der optimalen Zeit für die intraoperative Suche
nach dem Wächterlymphknoten
(Uren, 1995). Dagegen zeigen die markierten Makromoleküle wie Tc-Dextran
und TC-HSA (T1/2 = 2,8 h) die schnellste
Clearance (Henze, 1982; Glass, 1995).
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Die
für die
vorliegende Erfindung beschriebenen Verfahrensweisen verbessern
die Kombination von Technetium-99m-markiertem MAG3-Mannosyldextran. Dieses
Mittel hat sich bereits als wirksam erwiesen, selbst wenn es mit
den suboptimalen, für Vernetzungen
anfälligen
Verfahren des Standes der Technik hergestellt wurde. Technetium-99m-markiertes
MAG3- Mannosyldextran
ist, wie bereits beschrieben, ein 10 kD-Dextranmolekül, an das zahlreiche Mannose-
und MAG3-Einheiten gebunden sind. Dieses Molekül besitzt einen mittleren Durchmesser
von 5,5 Nanometer (nm), was deutlich kleiner als Tc-99m-Antimontrisulfid
(10 nm), filtriertes Tc-99m-Schwefel-Kolloid (50 nm) und unfiltriertes Tc-99m-Schwefel-Kolloid
(650 nm) ist, die früher
die vorherrschenden Standards waren. Die eingesetzte Mannose fungiert
als Substrat für
den Rezeptor des Mannose-bindenden Proteins und das MAG3 dient als
Chelatbildner für
die Markierung mit Technetium-99m (9). Das
resultierende radiomarkierte Konjugat verschwindet rasch von der
Injektionsstelle und bindet an den Wächterlymphknoten. Diese frühere Untersuchung
wird nachfolgend reproduziert; die Verwendung der hier beschriebenen
verbesserten Chemie verspricht nur eine Verbesserung des schon erhaltenen
Erfolgs.
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Beispiel 6:
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Demonstration
der Wächterlymphknotendarstellung in
Kaninchen
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Nach
Betäubung
durch eine intramuskuläre Injektion
von Ketamin und Xylazin wurden 0,5 ml TcMAG3-Mannosyldextran (19.000
g/mol) in den rechten vorderen (0,42 mCi) und den rechten hinteren
(0,43 mCi) Fußballen
und 0,5 ml filtriertes Tc-Schwefel-Kolloid in den linken vorderen
(0,41 mCi) und den linken hinteren (0,42 mCi) Fußballen injiziert. Das Kaninchen
wurde mit 10 cm3 Kochsalzlösung hydratisiert,
die alle 60 Minuten in den Hals infundiert wurde. Nach Injektion
eines jeden Radiopharmazeutikums wurden die Fußballen 5 Minuten massiert.
Periodische statische Aufnahmen (1000 kcts, 256 × 256 × 16) wurden auf einer Großfeld-Gammakamera
(hohe Auflösung,
Niederenergiekollimator) nach 15, 45, 100 und 135 Minuten mit den
vorderen Gliedmaßen
und den axillären
Lymphknoten in der Ansicht und nach 21, 53, 109 und 154 Minuten
mit den hinteren Gliedmaßen
und den poplitealen Gliedmaßen
in der Ansicht erhalten. Die Gliedmaßen wurden vor jeder Aufnahme
15 Minuten lang bewegt. Imaging-Standards (10× Verdünnung) sowohl von TcMAG3-Mannosyldextran
als auch von TcSC wurden ebenfalls im Gesichtsfeld positioniert. Etwa
150 Minuten nach der Injektion wurde das Kaninchen euthanasiert.
Alle Wächterlymphknoten
wurden exzidiert und mit verdünnten
(zweifach) Proben der TcMAG3-Mannosyldextran- und TcSC-Dosen auf Radioaktivität getestet.
Diese Werte wurden mit jedem Imaging-Standard normiert, um die %ID
des Wächterlymphknotens
zu erhalten, die dann als Funktion der Zeit aufgetragen wurden (10).
Für jede
Aufnahmereihe wurden Regions-of-Interest (ROIs) um die Injektionsstelle,
den Wächterlymphknoten
und die Imaging-Standards gezogen. Dann wurden die gesamten Counts
innerhalb jeder ROI mit einer üblichen
Software für
die Nuklearmedizin berechnet. Anschließend wurden die absoluten Counts in
den ROIs der Injektionsstelle durch die Counts des Standards geteilt
und es wurde der Bruchteil der injizierten Dosis berechnet. Diese
Werte wurden dann, wie in 11 gezeigt,
logarithmisch aufgetragen.
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Die
erhaltenen Daten zeigen, daß die
bildgebenden Eigenschaften von Tc99m-MAG3-Mannosyldextran denen
des filtrierten Tc99m-Schwefel-Kolloids überlegen sind. Der Prozentsatz
der injizierten Dosis, aufgetragen in 10, zeigte
sowohl in axillären
als auch in poplitealen Wächterlymphknoten über eine
Dauer von 150 Minuten eine größere Aufnahme von
TcMAG3-Mannoxyldextran durch die Lymphknoten. Daneben zeigte TcMAG3-Mannosyldextran
eine signifikant schnellere Clearance von der Injektionsstelle,
was durch die untere Kurve von 11 gezeigt
wird.
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Axilläre Lymphknoten,
die 15 Minuten nach Verabreichung von TcMAG3-Mannosyldextran und TcSC
dargestellt wurden, hatten das in 12 gezeigte
Aussehen. Die Injektionsstellen sind oben auf der Aufnahme (TcMAG3-Mannosyldextran
auf der linken und filtriertes TcSC auf der rechten Seite). Auf jeder
Seite des Kaninchens befindet sich ein Paar von Standards. neben
den bilateralen Wächterlymphknoten
könnte
ein Aktivitätsfokus
medial benachbart zum linken Wächterlymphknoten
TcSC-Aktivität
in einem distalen Knoten darstellen, was dem häufig beobachteten Verhalten
von TcSC entspricht, mit dem gewöhnlich
distale Lymphknoten in Spätaufnahmen
beobachtet werden. Diese Aktivität
hier könnte
jedoch einen mediastinalen Lymphknoten darstellen, der von beiden
Seiten der axillären Lymphknotenkette
geteilt wird, und für
diesen Fall ist diese Beobachtung nicht von großer Bedeutung.
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Die
rasche Clearance der Injektionsstelle von TcMAG3-Mannosyldextran kann durch die geringe
Größe der Partikel
(5,5 nm) erklärt
werden, die es ihnen erlaubt, auch in die Blutkapillaren einzudringen.
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Die
Aufnahme von TcMG3-Mannoxyldextran durch die Lymphknoten für die drei
Kaninchenuntersuchungen lag zwischen 1,2 und 2,5% der injizierten Dosis.
Der Bereich für
filtriertes Tc-Schwefel-Kolloid war 1,5 – 4,9%.
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Beispiel 7:
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Demonstration
einer Blutpool-Kernspintomographie in Kaninchen
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Die
Kernspintomographie mit GdDTPA-Dextran erfolgte sowohl mit einem
gesunden als auch mit einem tumortragenden Kaninchen, die 3,0 bzw.
2,7 kg wogen. Jedes Kaninchen wurde mit einer Mischung aus 50 mg/kg
Ketamin und 8,8 mg/kg Xylazin betäubt. Nach der Betäubung wurde
jedes Kaninchen mit einem 3 mm-Trachealtubus
intubiert und im Scanfeld positioniert. Jedes Kaninchen wurde bei
60 Schlägen/min
(bpm) mit einem Schlagvolumen von 25 cm3 ventiliert,
was ein "Respiratory
Gating" erlaubte.
Beide Kaninchen erhielten eine Dosis von 0,17 mmol Gadolinium/kg
(0,13 g GdDTPA-Dx/kg) von GdDTPA-Dextran
(MG = 398.000 g/mol, 515 Gd pro Dextran). Aufnahmen wurden mit einer
GE SignaTM 1.5 T-Kernspintomographie-Einheit
(Softwareversion 4.83) (GE Medical Systems, Milwaukee, WI) erhalten,
wobei jedes Kaninchen in einer Kniespule plaziert war. Wir untersuchten
eine Reihe von Akquisitionsparametern; am erfolgreichsten war eine 3D-Flugzeit
(Time of Flight, TOF) Fast Spoiled-Gradientenechosequenz (FSPGR):
TR = 15,1 ms, TE = 4,2 ms, Kippwinkel = 30°, 256 × 192-Matrix, 16 cm FOV, 80
Schnitte von 1,5 mm Dicke. Aufnahmen des gesunden Kaninchens (3
kg) wurden vor Injektion (2,0 ml) und 15, 28, 33, 46 Minuten und
3 Stunden nach Injektion erhalten. Mit Ausnahme des 28-Minuten-Scans, der
in der Koronarebene erfolgte, wurden alle Scans in der Axialprojektion
erhalten. Die nicht korrigierten Signalintensitäten in der Aorta auf Höhe der rechten
Niere waren: vor Injektion, 193; 28 Minuten, 552; 33 Minuten, 516;
und 46 Minuten, 472. 19a ist eine Projektionsaufnahme
maximaler Intensität
des gesunden Kaninchens, die 15 Minuten nach Injektion erhalten
wurde. 19b ist eine ähnliche
Aufnahme desselben Tiers, die drei Stunden nach Injektion erhalten
wurde.
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Die 16a und 16b sind
Kernspintomographien des tumortragenden Kaninchens (2,7 kg). Der
Tumor ist ein VX2-Karzinom
im rechten Hinterbein. Die Tumorgefäße sind in 16a nicht sichtbar, die vor der GdDTPA-Dextran-Injektion
(1,8 ml, 0,17 mmol Gd/kg) erhalten wurde. Eine Stunde nach Verabreichung
von GdDTPA-Dextran sind die Tumorgefäße leicht sichtbar (16b). Auf Basis axialer 3D-FSPGR-Aufnahmen (TR
= 15,1 ms, TE = 4,2 ms) berechneten wir das Kontrast-Rausch-Verhältnis CNR
durch Messen der mittleren Signalintensität in der Region-of-Interest
(ROI) des Tumors, Subtrahieren der mittleren Signalintensität aus Muskel
und Dividieren des Ergebnisses durch die Standardabweichung einer
ROI, die von einer Region außerhalb
des Körpers
genommen wurde. Das CNR für
eine Region im Zentrum des Tumors war 0,63 vor der Injektion und
9,6 54 Minuten nach Verabreichung von GdDTPA-Dextran. Das CNR für Blutgefäße im Tumor
war –21,4
vor der Injektion und 120 nach Verabreichung. Die negative Zahl
ist das Ergebnis eines höheren
Signals für
Muskel als für
das nicht kontrastmittelverstärkte
Tumorgefäß.
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Unser
54-Minuten-CNR von 120 ist etwa dreimal höher als die typischen Werte
(CNR = 42), die in der humanen Aorta mit MS-325, dem Albumin-targetierten Mittel,
nach einer ähnlichen
Zeit nach der Injektion beschrieben wurden (Grist TM et al. Radiology
207:539–544).
-
Beispiel 8:
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Demonstration
einer Blutpool-Computertomographie in Kaninchen
-
Zwei
Kaninchen wurden auf einem G.E. 9800 QuickTM CT-Scanner gescannt.
Ein Kaninchen (2,6 kg), das einen großen VX2-Tumor trug, wurde mit DyDTPA-T40 (MG
= 101,537 g/mol, 95 Dy pro T40) tomographiert und ein zweites gesundes
Kaninchen (3 kg) wurde mit Optiray-320 (MG = 807 g/mol) tomographiert.
Jedes Kaninchen wurde mit einer Mischung aus 50 mg/kg Ketamin und
8,8 mg/kg Xylazin betäubt.
Nach der Betäubung
wurde jedes Kaninchen mit einem 3 mm-Trachealtubus intubiert und
im Scanfeld positioniert. Jedes Kaninchen wurde bei 60 bpm mit einem
Schlagvolumen von 25 cm3 ventiliert, um
ein Atemanhalten während
jeder Aufnahme zu ermöglichen.
Dann wurde eine Lokalisationsaufnahme erhalten, um die Lage des
Herzens, des Tumors, des rechten Leberlappens, der Niere und der
Milz zu unterscheiden. Alle anschließenden Aufnahmen wurden mit
120 KV, 200 mA, 3 mm-Schnittdicke, 2 s Scanzeit, 512 Matrix und
FOV 16 cm erhalten. Serienaufnahmen, im Abstand von 3 mm, wurden
von der Mitte des Herzens bis zur Mitte der linken Niere aufgenommen.
Aus dieser Aufnahmeserie wurden axiale Positionen für das Herz,
die Leber, den Tumor, die Niere und die Milz ausgewählt. Nach
drei Aufnahmen in jeder Position injizierten wir [Dy]DTPA-T40 (5
ml, 190 mg Dy/kg, 37 mmol Dy/kg) über eine Dauer von 120 Sekunden
und erhielten Aufnahmen 2, 5, 7, 15, 30 und 37 Minuten nach Injektion.
Aufnahmen des tumortragenden Kaninchens, die vor der Injektion und 2,
5, 30 und 37 Minuten nach Injektion aufgenommen wurden, sind in
den 17a–e gezeigt.
Wir injizierten das Optiray-320 (640 mg l/kg, 5,0 mmol l/kg) über eine
Dauer von 60 Sekunden und tomographierten von 2 bis 10 Minuten in
Abständen
von einer Minute sowie 20 Minuten nach Injektion.
-
Die 18a, 18b, 18c und 18d sind
eine zeitliche Reihe von Leberquerschnitten vor und 2, 5 und 10
Minuten nach einer Injektion von Optiray-320 in ein gesundes Kaninchen. Nur
die Fünfminutenaufnahme
zeigt die Aorta, die IVC und die Pfortader mit einer größeren Intensität als die
Leber. Die Zwei- und Fünfminutenaufnahmen (18b bzw. 18c)
in der zeitlichen Reihe mit DyDTPA-T40 zeigen diese Gefäße sowie
intrahepatische Gefäße mit einer
größeren Intensität als die
umgebende Leber. Die um das Grundrauschen der IVC und der Leber
korrigierten Kurven (14a–d) sind
für beide
Mittel mit den Aufnahmen konsistent. Am wichtigsten ist, daß die IVC-Kurve
für DyDPTA-T40 wenigstens 10
Minuten beständig
ist, während
die IVC-Kurve mit Optiray-320 mit einer Halbwertszeit von etwa zwei
Minuten rasch abfiel. Die y-Achse der Kurven in den 14a–d wurde berechnet,
indem die CT# der IVC-ROI von der Leber-CT# abgezogen wurde. Unser
Ziel war es, das Grundrauschen zu beseitigen und die Differenz zwischen
Gefäß- und Lebersignalen
beizubehalten. Signifikant ist auch die fehlende Aufnahme von DyDTPA-Dx
durch die Milz und die Nierenrinde, wie in 14b gezeigt
ist. Die Intensität
des Nierenmarks zeigt Filtration entweder von intaktem Makromolekül, von aus
dem Chelat dissoziiertem Dy oder von einem Dy-Abbauprodukt an.
-
Um
auf Anzeichen zu testen, ob aufgrund unserer Chemie zur Anbindung
von Seitenketten Dextranvernetzung erfolgt war, chromatographierten
wir ein aminoterminiertes T10-Konjugat (NT 10) mit Sephacryl S-300HR
(27 × 1
cm) und 0,9%iger Kochsalzlösung
als mobiler Phase (30 ml/h). Wir verfolgten die Elution bei 226
nm. Pharmacia gibt den geeigneten Fraktionierungsbereich für Dextran
mit 2 × 103 bis
1 × 105
Da an. 15a ist ein Chromatogramm von
humanem Serumalbumin; das Hohlraumvolumen ist bei Vo und das Gesamtvolumen
bei Vt. 15b ist ein Chromatogramm des
aminoterminierten T10-Konjugats,
das 105 Seitenketten besitzt; dies ist eine Seitenkettendichte von
1,8 Aminogruppen pro Glucoseeinheit. Ein Hinweis auf Vernetzung sollte
beim Hohlraumvolumen auftreten, wo das Extinktionsprofil in Reaktion
auf die Anwesenheit von hochmolekularem Dextran sofort ansteigen
sollte. Der mittlere Durchmesser dieses Konjugats, gemessen mittels
dynamischer Laserlichtstreuung (Honeywell MicrotracTM UPA150),
betrug 0,043 μ bei
einer Standardabweichung von 0,0010 μ. Das Albumin wurde bei 0,0092 ± 0,0011 μ gemessen,
was etwas höher
ist als der veröffentlichte
Durchmesser von 0,0072 μ.
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Diskussion
-
Die
Vorteile und nützlichen
Beiträge
des hier beschriebenen zweistufigen Schemas für die Anbindung der Seitenketten
sind: hohe Ausbeute bei der Bindung, geringe Vernetzung und fehlende
Ladung an der Bindungsstelle. Das Dextrangerüst bietet ferner geringe Kosten
und umfangreiche Erfahrungen bei der Verwendung am Menschen. Die
Existenz einer großen
Anzahl Seitenketten (d.h. Aminogruppen) pro Dextranmolekül erlaubt
auch die Bindung einer hohen Dichte von Substraten und/oder Wirkstoffen an
jedes Dextrangerüst.
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Verfahren
vor der Erfindung führten
zu einer unerwünschten
Vernetzung des molekularen Grundgerüsts. Siehe z.B. Rebizak et
al. (1997), Bioconj. Chem. 8:605–610; Rebizak et al. (1998),
Bioconj, Chem. 9:94–99
(die die Umsetzung von Ethylendiamin mit Dextrancarbonsäure in Gegenwart
von 2-Ethoxy-1-(ethoxycarbonyl)-1,2-dihydrochinolin (EEDQ)
beschreiben). Vernetzung ist ein ernsthaftes Problem, weil sie das
Molekulargewicht des Grundgerüsts
erhöht
und folglich die Löslichkeit
des Produkts verringert. Außerdem
kann sie Toxizität
induzieren, indem sie die Komplexbildungskonstante zwischen dem
hochtoxischen Radiotracer (z.B. Gd3+) und
der chelatbildenden Gruppe in solchen makromolekularen Strukturen
destabilisiert. Folglich können
diese herkömmlichen
Reaktionsschemata nur verwendet werden, um eine geringere Dichte
von Seitenketten pro Dextranmolekül zu binden; dementsprechend
kann das Dextranmolekül
bei herkömmlichen
Verfahren nur ein paar wenige Substrate und/oder Wirkstoffe tragen,
weshalb höhere
Dextrandosen benötigt
werden, um den gewünschten
diagnostischen Effekt oder Wirkstoffeffekt zu erreichen. Dies erhöht die Kosten,
verringert die Sicherheit und führt
auch zu Löslichkeitsproblemen
(eine höhere Vernetzung
verringert die Löslichkeit).
Die Menge an Geweberezeptor limitiert auch die Anzahl von Dextranmolekülen, die
an den Rezeptor binden und in die Zellen eindringen können. Die
resultierende geringe Dichte an Wirkstoff oder an diagnostischem
Mittel kann nicht die zum Erzielen des gewünschten Effekts adäquate Menge
liefern.
-
Die
Erfindung löst
diese Probleme, indem sie ein Trägermolekül mit einer
ausreichend hohen Dichte von Seitenketten ("Leashes") mit Bindungsstellen bereitstellt.
-
Die
Erfindung beseitigt ferner den Nachteil geringer Bindungsflexibilität bei anderen
Schemata, z.B. Gedda et al. (1996), Bioconj. Chem. 7:584–591 und
Holmberg et al. (1993), Bioconj. Chem. 4:570–573, die nicht-aminoterminierte
Seitenkettensysteme beschreiben. Die fehlende Flexibilität bei den
Methoden des Standes der Technik beschränkt den möglichen Anwendungsbereich.
Die Erfindung vermeidet solche Beschränkungen und sorgt so für einen
breiteren Anwendungsbereich.
-
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