DE3686365T2

DE3686365T2 - Herstellungsverfahren fuer humanes atriales natriuretisches polypeptid.

Info

Publication number: DE3686365T2
Application number: DE8686304723T
Authority: DE
Inventors: Yoshinori Ishii; Mineo Niwa; Yoshimasa Saito; Ikuo Ueda; Hisashi Yamada
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-06-20
Filing date: 1986-06-19
Publication date: 1993-01-14
Anticipated expiration: 2006-06-20
Also published as: EP0206769B1; EP0206769A2; US20030170811A1; EP0206769A3; EP0440311A1; ATE79409T1; DE3686365D1; US6403336B1; EP0206769B2; JPH067187A; DE3686365T3; JPH0633316B2

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Schutzpeptid-kondensiertes α-humanes atriales natriuretisches Polypeptid (nachfolgend hier mit der Abkürzung "α-hANP" bezeichnet), das durch rekombinante DNA-Technik erhältlich ist. Insbesondere betrifft sie ein neues Schutzpeptid-kondensiertes α-hANP, dafür codierende Gene, einen entsprechenden rekombinanten Vektor und eine diesen enthaltende Transformante.
Das α-hANP ist ein bekanntes Polypeptid mit diuretischen, natriuretischen, vasorelaxierenden und antihypertensiven Wirksamkeiten. Es kann daher bei der klinischen Behandlung der Hypertension als antihypertensives diuretisches Mittel nützlich sein und hat die folgende Struktur
(Cf. Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 12, Seite 131 (1984).
Die Erfinder für die vorliegende Erfindung haben ein neues Verfahren entwickelt für die Herstellung von α-hANP durch rekombinante DNA-Technik unter Einsatz eines Expressionsvektors, der ein synthetisches Gen enthält, das die Aminosäuresequenz (I) von α-hANP codiert. Nach diesem Verfahren kann α-hANP in hoher Ausbeute erhalten werden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von α-hANP durch (1) Kultivieren eines Mikroorganismus, der mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der ein synthetisches Gen enthält, das eine Aminosäuresequenz eines Schutzpeptid-kondensierten α-hANP in einem Nährmedium codiert, (2) Rückgewinnung des Schutzpeptid-kondensierten α-hANP aus der Kulturbrühe und (3) Entfernung des Schutzpeptidteiles von dem Schutzpeptid-kondensierten α-hANP. Das Schutzpeptid weist Lysin als sein C-Terminal auf.
Zu den obigen Verfahren werden Einzelheiten detaillierter im folgenden Teil beschrieben.
Der Mikroorganismus ist eine Wirtszelle und kann einschließen Bakterien, Fungi, kultivierte humane und tierische Zellen und kultivierte Pflanzenzellen. Zu bevorzugten Beispielen des Mikroorganismus können Bakterien gehören, insbesondere ein zur Gattung Escherichia gehörender (z.B. E. coli HB 101 (ATCC 33694), E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli χ 1776 (ATCC 31537) usw.)
Der Expressionsvektor besteht üblicherweise aus einer DNA, die wenigstens einen Promoter-Operater-Bereich, ein Initiierungscodon, synthetisches geschütztes Peptid-Gen, synthetisches α-hANP-Gen, Terminationscodon(s) und eine replikatierbare Einheit aufweist.
Der Promoter-Operater-Bereich umfaßt den Promoter, den Operater und die Shine-Dalgarno(SD)-Sequenz (z.B. AAGG usw.). Die Entfernung zwischen der SD- Sequenz und dem Initiierungscodon beträgt vorzugsweise 8 bis 12 b.p., und im bevorzugtesten Fall, wie aus den unten ausgeführten Ausführungsbeispielen hervorgeht, ist die Entfernung zwischen der SD-Sequenz und dem Initiierungscodon (ATG) 11 b.p.. Beispiele für den Promoter-Operater-Bereich können einschließen einen herkömmlich angewandten Promoter-Operater-Bereich, (z.B. Lactose-Operon, PL-Promoter, trp-Promoter usw.) sowie einen synthetischen Promoter-Operater- Bereich. Bevorzugte Beispiele für den Promoter-Operater-Bereich sind synthetischer trp Promoter I, II und III, die durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung kürzlich synthetisiert worden sind, sowie Sequenzen davon, wie aus Fig.1, 2 und 3 zu entnehmen. Im Verfahren können 1 bis 3 aufeinanderfolgende Promoter- Operater-Bereiche pro Expressionsvektor eingesetzt werden.
Das bevorzugte Initiierungscodon kann das Methionin-Codon (ATG) einschließen.
Das Schutzpeptid-Gen kann eine DNA-Sequenz einschließen, die einem beliebigen Peptid oder Protein entspricht, das in der Lage ist, ein kondensiertes Protein mit α-hANP zu bilden und den unerwünschten Abbau des kondensierten Proteins in der Wirtszelle oder in der Kulturbrühe inhibiert. Eines der bevorzugten Beispiele ist das "Peptid CD Gen" gebunden an "LH Protein Gen" (nachfolgend wird das "das an LH Protein Gen gebundene Peptid CD Gen" als "Peptid CLa Gen" bezeichnet), dessen DNA-Sequenz aus Fig.4 ersichtlich ist.
Die DNA-Sequenz des α-hANP Gens wird von der Aminosäuresequenz von α- hANP gestaltet, die einer Anzahl spezieller nicht-offensichtlicher Kriterien unterliegt. Ein bevorzugtes Beispiel der DNA-Sequenz des α-hANP Gens ist aus Fig.5 ersichtlich. In den unten aufgeführten Ausführungsbeispielen ist zwischen dem α- hANP Gen und dem Schutzpeptidgen eine die Aminosäure Lysin codierende DNA- Sequenz insertiert mit dem Ziel des Achromobacter protease I Abbaus an der Verbindung des kondensierten Proteins.
Das/die Terminationscodon(s) kann/können herkömmlich angewandte Terminationscodons sein (z.B. TAG, TGA usw.).
Die replikatierbare Einheit ist eine DNA-Sequenz, die zur Replikation der gesamten, in den Wirtszellen dazugehörenden DNA-Sequenz in der Lage ist, und dazu kann gehören ein natürliches Plasmid, ein künstlich modifiziertes Plasmid (z.B. ein aus einem natürlichem Plasmid hergestelltes DNA-Fragment) und ein synthetisches Plasmid. Zu bevorzugten Beispielen des Plasmids kann gehören das Plasmid pBR 322 oder eine künstliche Modifikation davon (ein DNA-Fragment, erhalten aus einer geeigneten Restriktionsenzymbehandlung von pBR 322). Die replikatierbare Einheit kann einen natürlichen oder einen synthetischen Terminator (z.B. den synthetischen fd Phage Terminator usw.) enthalten.
Die synthetische Herstellung des Promoter-Operator-Bereiches, des Initiierungscodons, des Schutzpeptid-Gens, des α-hANP Gens und des Terminator Codons kann in herkömmlicher Weise erfolgen, wie sie für die Herstellung von Polynucleotiden allgemein durchgeführt wird.
Der Promoter-Operater-Bereich, das Initiierungscodon, das Schutzpeptidgen, das α-hANP Gen und das/die Terminatorcodon(s) können nacheinander folgend und kreisförmig in einer adäquaten replikatierbaren Einheit (Plasmid) miteinander verbunden sein, gewünschtenfalls unter Verwendung adäquater DNA-Fragment(e) (z.B. Linker, eine andere Restriktionsstelle usw.) in herkömmlicher Weise (z.B. Abbau mit Restriktionsenzym, Phosphorylierung unter Einsatz von T4 Polynucleotidkinase, Ligierung unter Einsatz von T4 DNA-Ligase), um einen Expressionsvektor zu erzeugen.
Der Expressionsvektor kann in einen Mikroorganismus (Wirtszelle) insertiert werden. Die Insertion kann in herkömmlicher Weise durchgeführt werden (z.B. Transformation, Mikroinjektion usw.), um zu einer Transformante zu gelangen.
Für die Produktion von α-hANP im Verfahren dieser Erfindung wird die auf diese Weise erhaltene Transformante, die den Expressionsvektor enthält, in einem Nährmedium kultiviert.
Das Nährmedium enthält eine Kohlenstoffquelle (oder mehrere) (z.B. Glucose, Glycerin, Mannitol, Fructose, Lactose usw.) und eine anorganische oder organische Stickstoffquelle (oder mehrere) (Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Hydrolysat von Casein, Hefeextrakt, Polypepton, Bactotrypton, Rinderextrakte usw.). Falls gewünscht können dem Medium andere Nährstoffquellen (z.B. anorganische Salze (z.B. Natrium- oder Kaliumhydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumchlorid), Vitamine (z.B. Vitamin B1), Antibiotika (z.B. Ampicillin) usw.) hinzugesetzt werden.
Die Kultur der Transformante kann allgemein bei einem pH von 5,5 bis 8,5 (vorzugsweise pH 7 bis 7,5) und 18 bis 40 ºC (vorzugsweise 25 bis 38 ºC) für 5 bis 50 Stunden durchgeführt werden.
Da das auf diese Weise produzierte Peptid-kondensierte α-hANP im allgemeinen in den Zellen der kultivierten Transformante existiert, werden die Zellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren gesammelt, und ihre Zellwand und/oder Zellmembran wird in üblicher Weise zerstört (z.B. durch Behandlung mit Ultraschallwellen und/oder Lysozym usw.), um zu den Bruchstücken zu gelangen. Aus den Bruchstücken kann das Schutzpeptid-kondensierte α-hANP in üblicher Weise gereinigt und isoliert werden, wie dies allgemein für die Reinigung und Isolierung von natürlichen oder synthetischen Proteinen durchgeführt wird (z.B. Auflösung des Proteins mit einem entsprechenden Lösungsmittel (z.B. 8M wäßriger Harnstoff, 6M Guanidin usw.), Dialyse, Gelfiltration, Säulenchromatographie, Hochleistungs-Flüssigchromatographie usw.)
Das α-hANP kann durch Spaltung des Schutzpeptid-kondensierten α-hANP in Anwesenheit von Achromobacter Protease I (AP I) hergestellt werden.
Obgleich API ein bekanntes Enzym ist (Cf. Biochim. Biophys. Acta 660, 51 (1981)), ist bisher nicht darüber berichtet worden, daß kondensierte Proteine über die rekombinante DNA-Technik vorzugsweise durch die Behandlung mit API gespalten werden können. Dieses Verfahren kann vorzugsweise zur Spaltung eines kondensierten Proteins eingesetzt werden, das aus Peptiden zusammengesetzt ist, die ein Lysin zwischen einem Schutzpeptid und einem Zielpeptid, das kein Lysin in seinem Molekül hat, aufweisen.
Die Spaltung des kondensierten Proteins kann bei pH 5 bis 10 und 20 bis 40 ºC (vorzugsweise 35 bis 40 ºC) für 2 bis 15 Stunden in einer wäßrigen Lösung (z.B. Pufferlösung, wäßriger Harnstoff usw.) erfolgen.
In den unten aufgeführten Ausführungsbeispielen wird das kondensierte Protein mit API zuerst in einer 8 M Harnstoff enthaltenden Pufferlösung bei pH 5 und dann in einer 4 M Harnstoff enthaltenden Pufferlösung bei pH 9 behandelt. Unter diesen Bedingungen wird das kondensierte Protein an der Lysinstelle gespalten, und das hergestellte α-hANP wird spontan rückgefaltet.
Das auf diese Weise hergestellte α-hANP kann aus dem erhaltenen Reaktionsgemisch in herkömmlicher Weise, wie oben ausgeführt, gereinigt und isoliert werden.
Die der Beschreibung beigefügten Zeichnungen werden nachfolgend erläutert.
In den Figuren sind Oligonucleotide mit dem Symbol ___, ___ oder ___ erläutert (in diesem Symbol bedeutet der Punkt das 5'-phosphorylierte Ende durch T4 Polynucleotidkinase), und geblockte Oligonucleotide sind mit dem Symbol ___, ___, ___ , oder erläutert (in diesem Symbol bedeutet das Dreieck die ligierte Position).
In der DNA-Sequenz in dieser Beschreibung bedeuten A, G, C und T in dieser Reihenfolge
5'-Terminal A, G, C und T bedeuten in dieser Reihenfolge die Formel
3'-Terminal A, G, C und T bedeuten in dieser Reihenfolge ,wenn nichts anderes angegeben ist, die Formeln
In den folgenden Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Ap, Gp, Cp und Tp bedeuten in dieser Reihenfolge die Formeln
3'-Terminal AOH, GOH, COH und TOH bedeuten in dieser Reihenfolge die Formeln
5'-Terminal HOAp, HOGp, HOCp und HOTp bedeuten in dieser Reihenfolge die Formeln
ABzpo, GiBpo, CBzpo, Tpo und TO bedeuten in dieser Reihenfolge die Formeln
und DMTR ist Dimethoxytrityl und CE ist Cyanoethyl. Das Mono (oder Di- oder Tri)mere (der Olygunucleotide) kann hergestellt werden über zum Beispiel das Hirose-Verfahren, [Cf. Taripakushitsu Kakusan Kohso 25, 255 (1980)], und die Kupplung kann beispielsweise auf Cellulose oder einem Polystyrenpolymeren mittels einer Phosphotriestermethode [Cf. Nucleic Acid Research, 9, 1691 (1981), Nucleic Acid Research 10, 1755 (1982)] durchgeführt werden.
Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung der Erfindung, nicht jedoch zu deren Einschränkung aufgeführt.
In den Beispielen sind alle verwendeten Enzyme (z.B. Restriktionsenzym, T4 Polynucleotidkinase, T4 DNA Ligase) im Handel erhältlich, und die Bedingungen für den Einsatz der Enzyme sind für den Fachmann auf diesem Gebiet offenkundig, wobei auf die den handelsüblichen Enzymen beiliegende Beschreibung beispielsweise verwiesen wird.
Darüber hinaus bedeutet in den Beispielen der Begriff "Polystyrenpolymer" Amino-methyliertes Polystyren.HCl, Divinylbenzen 1 %, 100-200 Mesh (vertrieben durch Pepetide Institute Inc.).

Beispiel 1

Synthese von HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpTOH (AH7)

(1) Synthese von DMTrOTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymer

i) Herstellung von HOTO-succinyl-polysterenpolymer:

Zu einem DMTrO-TO-succinyl-polyterenpolymer (51,8 mg, 10,37 µMol) (hergestellt durch das Verfahren, beschrieben in Nucleic Acid Research 10, 1755 (1982) in einer Reaktionsspritze wurde 5 %-ige Dichloressigsäure(DCA)-Lösung in Dichlormethan (2 ml) hinzugegeben. Nach Stehenlassen für eine Minute wurde das Gemisch durch Filterglas unter Stickstoffgas filtriert. Die DCA-Behandlung wurde mehrmals wiederholt. Das Polymere wurde nacheinander gewaschen mit Dichlormethan (3 x 2 ml), Methanol (3 x 2 ml) und Pyridin (3 x 2 ml) und über einem Stickstoffgasstrom getrocknet, um das Polymeraddukt I zu ergeben.

ii) Herstellung von DMTrOTpoCBzpo-

DMTroTpoCBzpo-CE (32,4 mg, 8,12 µMol) wurde hergestellt mittels des Verfahrens, das in Taripakushitsu Kakusan Kohso 25, 255 (1980) beschrieben, wurde mit einem Gemisch von Triethylamin und Acetonitril (1:1 V/V, 5 ml) bei Raumtemperatur für 30 Minuten behandelt. Das Phosphodiesterdimere (DMTrOTpoCBzpo-), das auf diese Weise erhalten wurde, wurde getrocknet und das Wasser als Pyridin- Aceotrop (2 x 2 ml) abgetrennt.

iii) Kupplung

Das Dimere (DMTrOTpoCBzpo-)und Mesitylensulfonylnitrothiazolid (80 mg) wurden in Pyridin (0,5 ml) gelöst. Die Lösung wurde in die Reaktionsspritze mit dem Polymeraddukt I gegeben, und das Gemisch wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Filterglas über Stickstoffgas filtriert und mit Pyridin (3 x 2 ml) gewaschen, um zu dem Polymeraddukt II zu gelangen.

iv) Acetylierung von nichtreagierten 5'-Hydroxygruppen

Zu dem oben erhaltenen Polymeraddukt II wurden Pyridin (0,9 ml) und Essigsäureanhydrid (0,1 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten geschüttelt. Anschließend wurde die Reaktionslösung durch Filterglas entfernt und das erhaltenen Polymer wurde nacheinander mit Pyridin (3 x 2 ml), Methanol (3 x 2 ml) und Dichlormethan (3 x 2 ml) gewaschen und anschließend über einem Stickstoffgasstrom getrocknet. Das Polymeraddukt (DMTrOTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymer) kann für die nächste Kupplungsstufe eingesetzt werden.

(2) Synthese von DMTrOTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymersuccinyl-polystyrenpolymer

DMTrOTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymerwurdesynthestisiert aus DMTrOTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymer und DMTrOTpoCBzpoCE (44,9 mg) unter ähnlichen Bedingungen wie oben (1).

(3) Synthese von DMTrOABzpoGiBpoABzpo TpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinylpolystyrenpolymer

DMTrOABzpoGiBpoABzpoTpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymer wurde synthetisiert aus DMTrOTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymer und DMTrOABzpoGiBpoABzpoCE (48,5 mg) unter ähnlichen Bedingungen wie oben (1).

(4) Synthese von DMTrOCBzpoGiBpoTpoABzpoGiBpoABzpoTpoCBzPocBzpoTpoCBzpoTO- succinyl-polystyrenpolymer

DMTrOCBzpoGiBpoTpoABzpoGiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymer wurde synthetisiert aus DMTrOABzpoGiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymer und DMTrOCBzpoGiBpoTpoCE (45,1 mg) unter ähnlichen Bedingungen wie oben (1).

(5) Synthese von DMTrOCBzpoTpoGiBpoCBzpoGiBpoTpoABzpo-GiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymer

DMTrOCBzpoTpoGiBpoCBzpoGiBpoTpoABzpoGiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinylpolystyrenpolymer (60 mg) wurde synthetisiert aus DMTrOCBzpoGiBpoTpoABzpoGiBpo-ABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinyl-polystyrenpolymer und DMTrOCBzpoTpoGiBpoCE (45,1 mg) unter ähnlichen Bedingungen wie oben (1). Bei dieser Endstufe war es nicht erforderlich, die 5'-Hydroxygruppe mit einer Acetylgruppe zu schützen.

(6) Synthese von HPCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpTOH

DMTrOCBzpoTpoGiBpoCBzpoGiBpoTpoABzpoGiBpoABzpoTpoCBzpoCBzpoTpoCBzpoTO-succinylpolystyrenpolymer (60 mg) wurde behandelt mit 1M N,N,N',N'-Tetramethylenguanidinium-pyridin-2-aldoximat (in Dioxan-Wasser (1:1 V/V, 1 ml)) bei 37 ºC für 20 Stunden in einem verschlossenen Röhrchen. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 28 %ige (W/W) wäßrige Ammoniaklösung (12 ml) hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei 60 ºC für 5 Stunden erhitzt. Das feste Polymer wurde durch Filtration entfernt und mit Wasser (10 ml) gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung wurden bis zur Trockne eingeengt und der Rückstand wurde mit 80 %iger wäßriger Essigsäure (25 ml) bei Raumtemperatur für 15 Minuten behandelt. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand in 0,1 M Triethylammoniumcarbonat-Puffer (pH 7,5, 25 ml) gelöst und mit Diethylether (3 x 25 ml) gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde bis zur Trockne eingeengt und der Rückstand in 0,1 M Triethylammoniumcarbonat-Puffer (pH 7,5, 2 ml) gelöst. Man erhielt das rohe HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpTOH in der Lösung.

(7) Reinigung von HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpTOH

i) Die erste Reinigung des Rohprodukts wurde durch Säulenchromatographie über Biogel P2 (Biolad) (24 x 2,6 cm ID) durchgeführt. Die Fraktionen, die dem ersten eluierten Peak (50 mM Ammoniumacetat, enthaltend 0,1 mM EDTA, Fließgeschwindigkeit 1 ml/min) entsprachen, wurden gesammelt und gefriergetrocknet, um das erste gereinigte Produkt zu ergeben.
ii) Die zweite Reinigung des ersten gereinigten Produktes wurde durch Schnellchromatographie (HPLC) über CRD-10 (Mitsubishi Kasei) (25 cm x 4,6 mm ID) durchgeführt unter Verwendung eines linearen Gradienten von 1 M Ammoniumacetat-10 % (V/V) wäßrigem Ethanol bis 4,5 M Ammoniumacetat-10 % (V/V) wäßrigem Ethanol (80 Min, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute, 60 ºC), um zu dem zweiten gereinigten Produkt zu gelangen.
iii) Die dritte Reinigung des zweiten gereinigten Produktes wurde durchgeführt durch Umkehrphasen-HPLC (Rp-18-5µ (x77) (Merck), 15 cm, x 4 mm ID) unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0,1 M Ammoniumacetat bis 0,1 M Ammoniumacetat-15 % (V/V) wäßrigem Acetonitril (40 Min, 1,5 ml/Minute, Raumtemperatur), um das endgereinigte Produkt zu erhalten.

(HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpTOH

(8) Analyse des Olygonucleotids (HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpTOH)

i) Abbau durch Phosphodiesterase

Das Gemisch aus HOCpTpGpCpGpTpApGpApTpCpCpTpCpTOH (10 µg, 5,1 µl), 0,2 M MgCl&sub2; (20 µl), 0,2 M tris-HCl (pH 8,5) (20 µl) und 0,1 mM EDTA (144,9 µl) wurde behandelt mit Phosphodiesterase (10 Einheit, 10 µl) bei 37 ºC für 20 Minuten und anschließend bei 100 ºC für 2 Minuten.

ii) Analyse durch HPLC

Das Oligonucleotid in dem Reaktionsgemisch wurde analysiert durch HPLC (CDR-10 (Mitsubishi Kasei), 25 cm x 4,6 mm ID) unter Verwendung eines linearen Gradienten von Wasser bis 2,0 M Ammoniumacetat (pH 3,4) (40 Minuten, Fließgeschwindigkeit 1,5 ml/Minute, 60 ºC). Von jeder beobachteten Peak-Fläche wurde dessen Nucleotidzusammensetzung bestimmt und verglichen mit der Fläche einer Standardprobe.
Berechnet: pCOH 4,000, pAOH 2,000, pTOH 5,000, pGOH 3,000
Beobachtet: pCOH 3,770, pAOH 2,026, pTOH 5,237, pGOH 2,968

Beispiel 2

Synthese des Oligonucleotids

Die folgenden Oligonucleotide wurden in ähnlicher Weise hergestellt wie im Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3

Synthese der Oligonucleotide

Die folgenden Oligonucleotide wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.

Beispiel 4

Synthese der Oligonucleotide

Die folgenden Oligonucleotide wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt

Beispiel 5

Konstruktion und Klonieren des synthetischen trp Promoter II Gens (wie in Fig.5 und 6 erläutert)
Das trp Promoter II Gen wurde nach einer ähnlichen Methode, wie der im Beispiel 7 (wie in Fig 6 erläutert) konstruiert. Das synthetische Gen wurde ligiert mit dem dem EcoRI-BamHI-Fragment von pBR322 (im Handel erhältlich : Takarashuzo, NER usw.), und anschließend wurde E.coli HB 101 (ATCC 33694) mit dem Ligierungsprodukt transformiert. Das Plasmid, erhalten aus der Transformante von RAmP und STet wurde mit HpaI abgebaut, um ein Band (4,1 kbp) zu bestätigen, und anschließend mit BamHI abgebaut, um ein Band von 90 b.p. über PAGE zu bestätigen. Darüber hinaus wurde das Fragment von 56 b.p. durch EcoRI-BamHI-Abbau bestätigt über den Vergleich mit dem Größenmarker über PAGE. Dieses Plasmid wurde PTrpEB7 genannt und zur Konstruktion des Expressiohsvektors eingesetzt.

Beispiel 6

Konstruktion und Klonieren des trp Promotervektors (pBR322trp) (wie erläutert in Fig.8)
Das Plasmid pBR322 (9µg) wurde mit EcoI und BamHI als Restriktionsendonucleasen abgebaut. Die Reaktion wurde beendet durch Erhitzen auf 65 ºC für 5 Minuten, und die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 0,8 % Argarosegel getrennt, um das kleine Fragment (500 ng) von 375 b.p. zu erhalten. Andererseits wurde das Plasmid pTrpEB7 (10 µg) mit EcoRI und BamHI abgebaut, gefolgt von einer präparativen Gel-Elektrophorese, um das große Fragment (5 µg) von 4094 b.p. zu ergeben.
Das pTrpEB7 EcoRI-BamHI-Fragment (4094 b.p., 200 µg) wurde ligiert mit dem pBR322 EcoRI-BamHI-Fragment (375 b.p., 100 ng) in dem Ligierungspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM Spermidin, 50 µg/ml BSA) (20 µl), enthaltend T4 DNA-Ligase (Takarashuzo: 360 Einheiten) bei 15 ºC über Nacht. Das ligierte Gemisch wurde in E.coli HB 101 transformiert mittels des Kushiner-Verfahrens (Cf T. Maniatis et al. Molecular Cloning, S. 252 (1982), Cold Spring Harbor Laboratory), und man erhielt Tetracyclin-resistente Transformanten auf der Platte, enthaltend Tetracyclin (25 µg/ml). Das aus der Transformante isolierte Plasmid pBR322trp wurde mit EcoRI-BamHI (375 b.p., 4094 b.p.) und HpaI (4469 b.p.) abgebaut, um das trp Promoter Gen zu bestätigen durch 7,5 % PAGE und 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese.

Beispiel 7

Konstruktion des synthetischen trp Promoter III Gen (wie in Fig.9 erläutert).
Jedes Oligonucleotid (B-M') (jeweils 0,2 n Mol) der Blöcke I', II' und III' wurde mit T4 Polynucleotidkinase (BRL; 2,5 Einheiten) in dem Ligationspuffer (70 µl) bei 37 ºC für eine Stunde phosphoryliert. Zu dem Reaktionsgemisch von jedem Block wurde T4 DNA-Ligase (300 Einheiten) und 20 mM ATP (2 µl) hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei 15 ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 65 ºC für 10 Minuten beendet. Das Reaktionsgemisch dieser Blöcke (I', II' und III') wurde zusammengegeben und mit unphosphorylierten Oligonucleotiden (A, N') in Gegenwart von T4 DNA-Ligase (360 Einheiten) und 20 mM ATP (2 µl) vermischt. Nach der Inkubation des Gemisches bei 15 ºC für eine Stunde wurde das letzte Ligierungsprodukt gereinigt mit einem 2-16 % Gradient Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE), um zu dem 106 b.p. synthetischen trp Promoter III Gen zu gelangen.

Beispiel 8

Konstruktion und Klonieren des Doppel-trp Promotervektor (p322dtrpS) (wie erläutert in Fig.10)
Das Plasmid pBR322trp wurde mit EcoRI und ClaI abgebaut, gefolgt von einer präparativen Agarose-Gel-Elektrophorese, um zu dem großen Fragment von 4446 b.p. zu gelangen. Dieses Fragment (4446 b.p.) wurde mit dem in Beispiel 7 erhaltenen trp Promoter III Gen (106 b.p.) ligiert in Gegenwart von T4 DNA-Ligase. Das ligierte Gemisch wurde in E.coli HB101 transformiert, wobei man Transformanten mit Ampicillin- und Tetracyclin Resistenz erhielt. Das Plasmid p322 dtrpS, erhalten aus der Transformante, wurde durch Restriktionsendonucleasen-Analyse mit ClaI-BamHI (352 b.p.) Hpa I (107 b.p.) und AatII-ClaI (287 b.p.) bestätigt.

Beispiel 9

Konstruktion des Peptid Cd Gen mit einem Teil des DNA-Fragments des synthetischen trp Promoter III (wie in Fig.11 und 12 erläutert)
Jedes Nuoligonucleotid (0,2 n Mol) (Np1-Cd8, in Beispiel 4 gezeigt) der Blöcke I ", II" und III" wurde mit T4 Polynucleotidkinase (2,5 Einheiten) in Ligierungspuffer (60 µl) bei 37 ºC für eine Stunde phosphoryliert. Zu dem Reaktionsgemisch von jedem Block wurde T4 DNA-Ligase (360 Einheiten) und ATP (2 µl) hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei 15 ºC für eine Stunde inkubiert. Das Reaktionsgemisch dieser Blöcke (I", II" und III") wurde zusammengegeben und mit T4 DNA-Ligase (360 Einheiten) und 20 mM ATP (2 µl) bei 15 ºC über Nacht inkubiert und anschließend bei 80 ºC für 10 Minuten erhitzt. Zu dem Gemisch wurden 500 mM NaCl (20 µl) und EcoRI (20 Einheiten) hinzugegeben. Nach der Inkubierung bei 37 ºC für zwei Stunden wurde das letzte Ligierungsprodukt durch 15 % PAGE gereinigt, um zu dem Peptid Cd Gen mit einem Teil des DNA-Fragments des synthetischen trp Promoter III (125 b.p.) zu gelangen, wobei die DNA-Sequenz davon in Fig.12 erläutert ist.

Beispiel 10

Konstruktion und Klonierung des Plasmids pCdγ (wie in Fig. 13 erläutert)

Das Plasmid pγtrp (544 b.p.) (Cf. GB-A-2164650, veröffentlicht am 26. März 1986); Escherichia coli F-9, das dieses Plasmid pγtrp enthielt, wurde beim FRI (Japan) unter der Nummer FERM BP-905 am 20. September 1984 hinterlegt) wurde mit HpaI und EcoRI abgebaut, wobei man ein großes Fragment erhielt, das mit dem Peptid Cd Gen mit einem Teil des DNA-Fragmentes des synthetischen Promoters III (125 b.p.), wie in Beispiel 9 erhalten, in Gegenwart von T4 DNA- Ligase ligiert wurde. Das ligierte Gemisch wurde transformiert in E. coli HB101. Das aus der Transformante von RAmp erhaltene Plasmid (pCdγ) wurde durch Restriktioonsendonucleasen-Analyse bestätigt:
ClaI-BamHI (543 b.p.), ClaI-HindIII (273 b.p.), ClaI-EcoRI (93 b.p.) und AatII-ClaI (180 b.p.).

Beispiel 11

Konstruktion und Klonierung des Plasmids pCdγtrpSd (wie in Fig. 14 erläutert

Das Plasmid pCdγ wurde mit ClaI und BamHI abgebaut zu dem kleineren Fragment (543 b.p.), das mit dem ClaI-BamHI-Fragment (4223 b.p.) von p322dtrpS (Beispiel 7) in Gegenwart von T4 DNA-Ligase ligiert wurde. Das ligierte Gemisch wurde in E.coli HB101 transformiert. Das aus der Transformante von RAmp erhaltene Plasmid (pCdγ+cpSd) wurde durch Restriktiuonsendonucleasen-Analyse bestätigt: HpaI-BamHI (107575 b.p.), ClaI-BamHI (543 b.p.), PstI-EcoRI (1057 b.p.), EcoRI- BamHI (450 b.p.), HindIII-BamHI (270 b.p.), ClaI-HindIII (273 b.p.).

Beispiel 12

Herstellung von α-hANP Gen mit Linker-DNA (wie in Fig. 15 erläutert)

Jedes Oligonucleotid (AH2-AH17) (jeweils 0,2n Mol) von Block I"' und 11"' wurde mit T4 Polynucleotidkinase (2,5 Einheiten) in dem Ligierungspuffer (70 µl) bei 37 ºC für 1 Stunde phosphoryliert. Zu dem Reaktionsgemisch eines jeden Blocks wurde T4 DNA-Linase (300 Einheiten) und 20 mM ATP (2 µl) hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei 15 ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen für 10 Minuten auf 65 ºC beendet. Das Reaktionsgemisch der beiden Blöcke (I"' und II"') wurde zusammengegeben und mit unphosphorylierten Oligonucleotiden (AH1, AH18) in Gegenwart von T4 DNA-Ligase (300 Einheiten) und 20 mM ATP (2 µl) vermischt. Nach der Inkubierung der Mischung bei 15 ºC für 1 Stunde wurde das letztere Ligierungsprodukt durch 2-16 % Gradient PAGE gereinigt um das 134 b.p. α-hANP Gen mit Linker-DNA zu erhalten (wie in Fig. 5 erläutert).

Beispiel 13

Konstruktion und Klonierung des α-hANP Expressionsvektors pCLaHtrpSd (wie in Fig. 16 erläutert)

Das Plasmid pCdγtrpSd wurde mit HindIII und BamHI abgebaut, um das größere Fragment (4743 b.p.) zu erhalten, das mit dem α-hANP Gen mit Linker- DNA (134 b.p.) in Gegenwart von T4 DNA-Ligase ligiert wurde. Das ligierte Gemisch wurde in E.coli HB101 transformiert, um die Transformante H1 zu erhalten. Das Plasmid (pCLaHtrpSd) (das CLaH Protein(Peptid CLa-kondensiertes α-hANP Protein) Gen enthielt, dessen DNA-Sequenz in Fig. 17 erläutert wurde), erhalten aus der Transformante von RAmp (E.coli H1), wurde durch Restriktionsendonucleasen-Analyse bestätigt:
AatII-ClaI (287 b.p.), ClaI-BamHI (407 b.p.), ClaI-EcoRI (93, 198 b.p.), EcoRI-BamHI (116, 198 b.p.), HindIII-BamHI (134 b.p.), HpaI-BamHI (107, 439 b.p.).

Beispiel 14

Expression eines Gens, codierend für das Peptid CLa-kondensiertes α-hANP(CLaH Protein)

Eine Übernacht-Kultur von E.coli H1, enthaltend den Expressionsvektor, Plasmid pCLaHtrpSd in L-Brühe (20 ml), enthaltend 50 µg/ml Ampicillin, wurde verdünnt in M9-Medium (400 ml), das 0,2 % Glucose, 0,5 % Casaminosäure (Säurehydrolysiertes Casein), 50 µg/ml Vitamin B1 und 25 µl/ml Ampicillin enthielt, und das E.coli bei 37 ºC kultiviert. Als die A600 (Absorption bei 600 nm) der Kulturbrühe 0,5 betrug, wurde β-Indolacrylsäure (2 mg/ml Ethanol, 2 ml) hinzugegeben, und die Zellen wurden für 3 Stunden inkubiert (Endwert der A600=1,85). Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugieren (6000 U/min, 4 ºC, 5 Minuten) abgetrennt.

Beispiel 15

Isolierung und Reinigung von α-hANP

(1) Isolierung und Reinigung des Peptid CLa-kondensierten α-hANP (CLaH Protein)

Die wie in Beispiel 14 hergestellte feuchte Zellpaste aus der Kulturbrühe (600 ml) wurde in 8 ml 10 mM PBS-EDTA (pH 7,4) (NaCl (0.8 g), KCl (0,2 g), Na&sub2;HPO&sub4;.12 H&sub2;O (2,9 g) KH&sub2;PO&sub4; (0,2 g). EDTA (3.73 g) pro Liter) suspendiert, und die Zellen wurden durch Ultraschall bei 0 ºC zerstört. Das Pellet wurde durch Zentrifugieren bei 15000 U/min für 20 Minuten (4 ºC) erhalten und in 8 ml 6 M Guanidin-HCl. 10 mM PDS-EDTA und 2mM β-Mercaptoethanol suspendiert. Die Suspension wurde durch Ultraschall bei 0 ºC behandelt. Die Suspension wurde bei 15000 U/min für 20 Minuten (4 ºC) behandelt und das Überstehende über Nacht bei 4 ºC gegen 10 mM PBS-EDTA-Lösung, die p-Nitrophenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthielt, dialysiert. Nachdem die dialysierte Fraktion zentrifugiert worden war (15000 U/min, 4 ºC, 20 Minuten), wurde das Pellet in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8.0) (8 ml), der 6 M Guanidin-HCl, 10 mM EDTA und 100 mM Dithiothreitol enthielt, gelöst, und die Lösung wurde über Nacht stehen gelassen. Die Lösung wurde gegen 1 M Essigsäure (0,5 Liter), die 10 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, zweimal dialysiert und auf pH 8,0 mit Trisaminomethan eingestellt. Der erhaltene Niederschlag (kondensiertes Protein; 15,2 mg) wurde druch Zentrifugieren gesammelt (3000 U/min, 10 Minuten) und mit 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0) gewaschen.

(2) Eliminierung des Peptid CLa aus dem Peptid CLa-kondensierten α-hANP mit Achromobacter Protease I (API)

Das oben erhaltene kondensierte Protein wurde in 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0) (30 ml). enthaltend 8 M Harnstoff, suspendiert. Die Suspension wurde mit Achromobacter Protease I (AIP) (0,25 Einheiten) (Wako Pure Chemical Ind. Ltd.) bei 37 ºC für 2 Stunden inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit destilliertem Wasser (30 ml) verdünnt, mit Trisaminomethan auf pH 9,0 eingestellt und im Anschluß daran mit zusätzlichem API (0,25 Einheiten) bei 37 ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Reaktionslösung wurde verdünnt mit 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0) (120 ml) und mit Essigsäure auf pH 7,0 eingestellt. Die Lösung wurde auf eine Sp- Sephadex C-25 Säule (15 ml) aufgegeben, die mit 10 mM Natriumphosphat-Puffer äquilibriert wurde (pH 7,0). Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und mit 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 8,0) eluiert, der 0,5 M wäßriges Natriumchlorid enthielt, um die ein teilweise gereinigtes α-hANP (0,4 mg) enthaltenden Fraktionen zu erhalten.

(3) Hochleistungs-Flüssigchromatografie (HPLC)

Die unter (2) erhaltene Sammelfraktion wurde im Vakuum aufkonzentriert, gegen Wasser dialysiert (300 ml) und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, um das reine α-hANP (0,3 mg) zu erhalten.

HPLC-Bedingungen

(Präparation)

Säule : Beckmann Ultrapore semi-prep. ( 10 x 250 mm)
Fließgeschwindigkeit : linearer Gradient von 10 % bis 60 % Acetonitril in 0,01 M Trifluoressigsäure über 50 Minuten.
Monitorabsorption bei 214 nm

(Analyse)

Säule : Beckmann Ulrapore RPSC ( 4,6 x 75 mm)
Fließgeschwindigkeit : 1 ml/min
Eluierung : gleiche Bedingungen wie bei Präparation
Retentionszeit : 11,9 Minuten
Die α-hANP deckte sich mit authentischer α-hANP (bezogen von Funakoshi).

(4) Aminosäureanalyse von α-hANP

Die Probe wurde reduziert und carboxymethyliert und anschließend mit 6 N HCl bei 110 ºC für 24 Stunden hydrolysiert. Die Aminosäurezusammensetzung von α-hANP wurde unter Verwendung von Waters Aminosäureanalyse-System erhalten.
Die Aminosäurezusammensetzungen (Reste pro Mol) von α-hANP waren mit den erwarteten Werten übereinstimmend.

(5) Aminosäure-Sequenzanalyse von α-hANP

Die N-terminale Aminosäuresequenz von α-hANP wurde durch die Edman- Methode (DABITC-Methode) [beschrieben in FEBS Lett., 93, 205 (1978)] bestimmt, um die N-terminale Ser- und Leu-Sequenz zu bestätigen. Die C-terminalen Aminosäuren (Ser-Phe-Arg-Tyr) wurden durch Abbau mit Carboxypeptidase bestimmt und die folgende Aminosäureanalyse unter Verwendung von Waters Aminosäureanalyse- System. Die gesamte Aminosäuresequenz von α-hANP, die in dem obigen Beispiel erhalten wurde, wurde unter Einsatz beider Methoden bestimmt, und sie war mit der bekannten Sequenz von α-hANP identisch.

Beispiel 16

Konstruktion und Klonierung des Plasmids pBR322trpSs (wie in Fig. 18 erläutert)

Das Plasmid pBR322 wurde mit EcoRI und ClaI abgebaut. Das große Fragment (4340 bp) wurde mit 0,8 % Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt und zu dem synthetischen trp Promoter III Gen in Gegenwart von T4 DNA-Ligase und 1 mM ATP ligiert. Das ligierte Gemisch wurde dazu verwendet, E.coli HB101 zu transformieren. Die Plasmid-DNA (pBR322trpSs) wurde aus einem transformierten Klon (RAmp) isoliert und durch Restriktionsendonucleasen-Analyse charakterisiert.
Analysendaten : Hpa I; 4445 bp, ClaI-Pst I; 834 bp

Beispiel 17

Konstruktion und Klonierung des Plasmids pCLaHtrp-2 (wie in Fig. 19 erläutert)

Das Plasmid pCLaHtrpSd wurde mit ClaI und BamHI abgebaut. Das kleine Fragment (407 bp) wurde isoliert. Zum anderen wurde pBR322trpSs mit ClaI und BamHI abgebaut. Das größere Fragment (4093 bp) wurde isoliert und mit der früheren DNA (407 bp) ligiert. Nach der Transformation von E.coli HB101 mit dem Ligierungsgemisch wurde das gewünschte Plasmid (pCLaHtrp-2) aus einem transformierten Klon (RAmp) isoliert und durch Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert: ClaI-Pst I: 834 bp, ClaI-BamHI; 407 bp.

Beispiel 18

Synthese der Oligonucleotide

Die folgenden Oligonucleotide wurden in ähnlicher Weise wie in der von Beispiel 1 hergestellt.

Beispiel 19

Konstruktion und Klonierung des synthetischen fd Phage Terminator (wie in Fig. 20 und 21 erläutert)

Der synthetische fd Phage Terminator wurde mittels einer ähnlichen Methode wie der in Beispiel 7 beschriebenen konstruiert (wie in Fig. 20 erläutert).
Die DNA-Oligomeren T2, T3, T4 und T5 (jeweils 0,4 nMol) wurden vermischt und phosphoryliert mit T4 Polynucleotidkinase in Anwesenheit von 1mM ATP. Das Reaktionsgemisch wurde bei 65 ºC für 10 Minuten erhitzt um das Enzym zu inaktivieren. Zu dem erhaltenen Gemisch wurden die DNA-Oligomeren T1 und T6 (jeweils 0,8 nMol) und T4 DNA-Ligase hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei 15 ºC für 30 Minuten inkubiert und einer 2 -> 16 % Gradient Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese unterzogen. Das gewünschte DNA-Fragment (47 bp) wurde durch Elektroeluierung wiedergewonnen und an das größere Fragment von pBR322 ligiert. das mit BamHI und Sal I abgebaut worden war (4088 bp). Nach der Transformierung von E.coli HB101 mit dem Ligierungsgemisch wurde das gewünschte Plasmid (pter) aus dem transformierten Klon isoliert (RAmp) Restriktionsenzym-Analyse: BamHI-Sal I; 47 bp, Ava I; 817 bp.

Beispiel 20

Konstruktion und Klonierung des α-hANP Expressionsvektorplasmids pCLaHtrp3t (wie in Fig. 22 erläutert)

Das Plasmid pCLatrp-2 wurde mit PstI und BamHI abgebaut. Aus dem abgebauten Gemisch wurde das kleine Fragment (1241 bp) isoliert und an das große Fragment von pter 21 ligiert, das aus dem Abbau von pter 21 mit PstI und BamHI erhalten worden war (3005 bp).
Das Ligationsgemisch wurde in E.coli HB101 transformiert, wobei eine Transformante E.coli H2 erhalten wurde. Das Plasmid CLaHtrp3t (das das CLaH Protein- Gen enthält), erhalten aus der Transformante von RAmp (E.coli H2), wurde durch Restriktionsendonucleasen-Analyse bestätigt: ClaI-EcoRI; 93 bp, 198 bp, HindIII- BamHI; 134 bp, PstI-ClaI-XhoI; 834 bp, 411 bp.

Beispiel 21

Produktion von α-hANP unter Verwendung von E.coli H2

α-hANP wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 14 und 15 beschrieben, erhalten, unter Verwendung von E.coli H2 anstelle von E.coli H1.
Die Aminosäuresequenz des auf diese Weise erhaltenen α-hANP war identisch mit der bekannten Sequenz von α-hANP.

Claims

1. Synthetisches Gen, codierend eine Aminosäuresequenz eines Schutzpeptid-kondensierten α-hANP (α-humanes atriales natriuretisches Polypeptid), worin das synthetische Gen eine Aminosäuresequenz umfaßt, die für Lysin als den C-terminalen Rest des Schutzpeptids codiert.

2. Expressionsvektor, umfassend das synthetische Gen von Anspruch 1.

3. Mikroorganismus, transformiert mit dem Expressionsvektor von Anspruch 2.

4. Schutzpeptid-kondensiertes α-hANP, worin das Schutzpeptid Lysin als sein C- Terminal aufweist.