DE3685952T2

DE3685952T2 - Produkt auf basis von vernetzter zellulose, daraus geformte filme, verfahren und mikroorganismen zu dessen herstellung.

Info

Publication number: DE3685952T2
Application number: DE8686308092T
Authority: DE
Inventors: Yehoshua Aloni; Arie Ben-Bassat; Robert Bruner; Donald Curtis Johnson; Amar Nath Naogi; Sharon Payne Shoemaker; Harry Wong
Original assignee: Weyerhaeuser Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1985-10-18
Filing date: 1986-10-17
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2006-10-18
Also published as: IL80337A; JPH10310601A; IL80337A0; CA1335266C; EP0228779B1; DK499186D0; JPH0732703B2; NO864160L; EP0228779A3; JP3089269B2; AU6416086A; NO167675C; JPH0568538A; NZ217983A; IE862757L; DE3685952D1; ES2041643T3; FI864218A0; FI90992B; IE59032B1

Description

Die Erfindung betrifft Stämme von Acetobacter mit der Fähigkeit zur Produktion von Cellulose in Laborkultur. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Acetobacter-Stämme durch eine Fähigkeit zur Produktion großer Cellulosemengen in Schüttelkultur gekennzeichnet, ohne Instabilität zu zeigen, die zu einem Ausfall der Celluloseproduktion in Kultur führt. Zu den erfindungsgemäßen Acetobacterstämmen gehören Stämme mit der zusätzlichen Eigenschaft einer wesentlich verminderten Fähigkeit zur Gluconsäureproduktion. Die Celluloseproduktion unter Verwendung derartiger Gluconat-negativer Stämme (GlcA&supmin;) im Medium einer Laborkultur wird durch die nicht wesentliche Ansäuerung des Mediums durch diese Stämme erleichtert. Derartige Gluconatnegative Acetobacterstämme sind in Kulturen mit hoher Zellkonzentration nützlich.
Die Erfindung betrifft auch ein bakterielles Celluloseprodukt mit neuen Eigenschaften. Insbesondere betrifft die Erfindung ein netzartiges Celluloseprodukt. Dieses netzartige bakterielle Celluloseprodukt unterscheidet sich in kennzeichnender Weise durch eine andere mikroskopische Struktur von der unter statischen Kulturbedingungen von Cellulose produzierenden Mikroorganismen produzierten bakteriellen Cellulose.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion des netzartigen Celluloseproduktes durch Züchtung von Cellulose produzierenden Mikroorganismen unter Schüttelkulturbedingungen über längere Zeiträume, im allgemeinen mehr als vier Stunden. Die anhaltende und effiziente Produktion von bakterieller Cellulose unter Schüttelkulturbedingungen war unerwartet.
Die Celluloseproduktion von Acetobacter bildete spätestens seit den 30iger Jahren den Gegenstand intensiver Studien. 1947 wurde gezeigt, daß nicht-proliferierende Acetobacterzellen in Gegenwart von Glucose und Sauerstoff Cellulose synthetisieren. Hestrin, S., Aschner,M. und Mager,J., Nature 159 (1947), 64. Seit den Beobachtungen von Hestrin et al. züchtete man Acetobacter zum Erhalt von Cellulose unter einer Vielzahl von Bedingungen. Wenn man die Zellen zum Beispiel unter Reziprokschütteln bei etwa 90-100 Bewegungen pro Minute züchtet, werden sie in eine umfangreiche Gelmasse eingebaut. Wenn sie unter Kulturbedingungen, bei denen das Kulturmedium 4 Stunden lang mit einer Wirbelbewegung umgerührt wird, gezüchtet werden, bilden sich sternförmige Gelkörper, die aus Cellulose und Zellen bestehen. Wenn sie als Standkulturen gezüchtet werden, bildet sich eine Kahmhaut an der Luft/Medium- Phasengrenze. Die sich bildende, polsterartige Kahmhaut weist im allgemeinen dieselbe Oberflächenform und -ausdehnung wie die Flüssigkeitsoberfläche des Gefäßes mit der Kultur auf. Hestrin und Schramm, Biochem. Journal 58 (1954), 345-352. Hestrin und Schramm beobachteten eine schnelle Celluloseproduktion von gefriergetrockneten Acetobacterpräparationen mit weniger als 10% lebensfähiger Zellen. In diesen Experimenten wurde jedoch nur über einen relativ kurzen Zeitraum von drei bis vier Stunden die Celluloseproduktion derartiger gefriergetrockneter Präparationen unter Schüttelbedingungen gemessen, und die Experimente wurden unter den Bedingungen einer Citratpufferung zur Regulierung der durch die Gluconsäureproduktion von Acetobacter in Gegenwart von Glucose verursachten, bedeutenden pH-Änderungen ausgeführt.
Die Polysaccharidbiosynthese von Acetobacter ist von einigen Arbeitsgruppen unter Verwendung von nicht wachsenden Kulturen studiert worden. In einigen dieser Studien wurde der Acetobacterstamm NRRL B42 gezüchtet, von der Cellulosekahmhaut befreit, in 0,01 M Tris-EDTA resuspendiert, eingefroren und anschließend aufgetaut, gemäß Hestrin und Schramm (1954). Diese behandelten Zellen wurden zu biochemischen Studien unter Bedingungen verwendet, die nicht das Wachstum der Zellen unterstützten, die aber die Enzymaktivität mit der Möglichkeit der Cellulosesynthese durch die hergestellten Zellen erhielten.
Dieser Fortschritt bei der Ermittlung der Bedingungen für die Acetobacterzüchtung zur Celluloseproduktion bildete jedoch nicht den Gegenstand einer umfassenden Berichterstattung. Somit sind die Bedingungen für die Züchtung von Acetobacter gemäß der Beschreibung in der U.K. Patentanmeldung 2,131,701A, die die Priorität der am 16.Dezember 1982 eingereichten US-Patentanmeldung 450,324 beansprucht, die von Hestrin und Schramm (1954) beschriebenen, d.h., ein Anfangs-pH-Wert von etwa 6, Temperaturen in einem Bereich von 15ºC bis 35ºC und vorzugsweise 20ºC bis 28ºC.
Nach Deley et al., "Acetobacteracea" Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Hrsg.: Kreig und Holt) 1.Ausg. (1984 William und Wilkins, Baltimore und London), 267-278, stellen in absteigender Reihenfolge Ethanol, Glycerin und Milchsäure die besten Kohlenstoffquellen für die Züchtung dar. Die Säure entsteht aus n-Propanol, n-Butanol und D- Glucose. Zu den in der U.K. Anmeldung 2,131,701A beschriebenen Kohlenstoffquellen gehören Fructose, Mannit, Sorbit und Glucose, die alle eine schnelle Celluloseproduktion ergeben, und Glycerin, Galactose, Lactose, Maltose und Saccharose, die alle ein langsameres Wachstum zur Folge haben. Bei der Verwendung von Sorbose, Mannose, Cellobiose, Erythrit, Ethanol und Essigsäure wurde kein Wachstum beobachtet.
In der U.K. Patentanmeldung 2,131,701A wird als Ziel die Produktion eines zusammenhängenden, gelartigen Materials zur Verwendung als Wundverband nach der Aufarbeitung zur Entfernung des Kulturmediums angestrebt. Um diese geflechtartigen Gebilde zu erhalten, wird das Kulturmedium während des Zellwachstums und der Celluloseproduktion über einen Zeitraum von wenigen Stunden bis zu Tagen oder Wochen bewegungslos gehalten.
Obwohl die Bildung eines zusammenhängenden Geflechts oder einer Kahmhaut unter den Bedingungen einer bewegungslosen oder stehenden Kultur die in der U.K. Patentanmeldung 2,131,701A beschriebene Züchtungsart darstellt, erklärt dieses Patent darüberhinaus, daß das periodische Schütteln des Kulturmediums mit dem Cellulose synthetisierenden Acetobacter die Länge der Cellulosefaser bei der Produktion durch den Mikroorganismus regulieren kann. Periodisches Schütteln erzeugt Fasern von begrenzter Länge, die durch das Maß der linearen Ausdehnung der Faser durch den Mikroorganismus und durch die Zeitspanne zwischen den Schüttelscherungen der Faser von der Bakterienoberfläche bestimmt wird. Es wird jedoch nichts über die Auswirkungen beständigen Schüttelns auf das Celluloseprodukt berichtet.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0114481 beschreibt flüssigkeitsgetränkte Polster zur Verwendung als Verband für Wunden und Verbrennungen. Die Polster werden von Kahmhaut aus mikrobiell erzeugter Cellulose hergestellt. Die Cellulose wird unter statischen (d.h. nicht schüttelnden) Kulturbedingungen produziert. Wie es auf Seite 6 der Beschreibung festgestellt wird, "ist es entscheidend", daß für den Erhalt "des gewünschten zusammenhängenden, gelartigen Materials das Kulturmedium während der Züchtungsdauer im wesentlichen bewegungslos bleibt".
Die Celluloseproduktion von Acetobacter in kontinuierlichen Schüttelkulturen ist mit zahlreichen Problemen behaftet, von denen das schwierigste bisher in der Instabilität der Kultur lag. Diese Instabilität zeigt sich als Verlust der Fähigkeit zur Celluloseproduktion und als allmähliches Überwachsen der Cellulose produzierenden Zellen durch Cellulose nicht-produzierende Arten. Die Instabilität von Stämmen kann die Folge des Auftretens von spontanen Mutanten oder Varianten des Mikroorganismus, die keine Cellulose produzieren, sein. Das Auftreten von nicht- produzierenden Mikroorganismen ereignet sich anscheinend mit einer ausreichend hohen Häufigkeit, um während des Wachstums in einer Schüttelkultur das Populationsverhältnis einer Kultur von Cellulose produzierenden zugunsten von Cellulose nicht-produzierenden Arten zu verschieben. Der Verlust der Celluloseproduktion in Schüttelkulturen kann auch eher nur die Folge physiologischer Faktoren als die einer auf Grund von genetischen Veränderungen auftretenden Mutation zu Cellulose nicht-produzierenden Arten sein. Leisinger et al., "Über cellulosefreie Mutanten von Acetobacter xylinum", Arch. Mikrobiol. 54 (1966), 21-36. Obwohl der Grund nicht bekannt ist, wurde über die andauernde Produktion von bakterieller Cellulose im Medium einer Schüttelkultur bisher nicht berichtet.
Cellulose-negative Stämme von Acetobacter (Cel&supmin;) sind über eine chemische Mutagenese mit Ethylmethansulfonat (EMS), salpetriger Säure und N'-Nitro-N-nitrosoguanidin (NG) hergestellt worden. Bei der Züchtung in statischen Kulturen verwandelten sich sämtliche durch EMS und salpetrige Säure, und 90 % der durch NG mutierten Stämme in Cellulose produzierende Arten zurück. Valla et al., "Cellulose- Negative Mutants of Acetobacter xylinum", J. Gen. Microbiol. 128 (7) (1982), 1401-1408. Die Züchtung von Mischkulturen aus Cellulose produzierenden und nicht-produzierenden Stämmen in statischen Kulturen begünstigte in statischen Kulturen stark die Cellulose produzierenden Stämme, wohingegen die Züchtung derartiger Mischkulturen in Schüttelflaschen nicht-produzierende Stämme begünstigte. Valla et al. (1982). Dieses Ergebnis trägt zur Stützung der Hypothese bei, daß das von diesem Mikroorganismus produzierte Cellulosegeflecht oder -kahmhaut Acetobacterzellen dazu befähigt, die Oberfläche eines statischen Flüssigmediums zu erreichen, wo eine reichliche Sauerstoffversorgung vorhanden ist. Unter Schüttelbedingungen, bei denen die Sauerstofflösungsgeschwindigkeit und eine niedrige Sauerstofflöslichkeit das Wachstum begrenzen, werden Cellulose-negative Stämme auf Grund der selektiven Aggregation Cellulose produzierender Zellen und der sich daraus ergebenden begrenzten Sauerstoffdurchlässigkeit der Zellmasse begünstigt. Es liegt deswegen klar auf der Hand, daß die Identifizierung und Isolierung von Acetobacterstämmen, die stabile Celluloseproduzenten in einem Schüttelkulturmedium darstellen, eine entscheidende Bedeutung für die Cellulosemassenproduktion von Acetobacter in genügend konzentrierten Kulturen, die das Schütteln zur ausreichenden Sauerstoffversorgung des Mediums erfordern, aufweist.
Acetobacter stellt in kennzeichnender Weise ein gramnegatives, stabförmiges Bakterium von 0,6-0,8 um auf 1,0-4 µm dar. Es ist streng aerobisch; der Metabolismus ist respiratorisch, niemals fermentativ. Es unterscheidet sich desweiteren durch die Fähigkeit zur Produktion von mehreren mit Cellulose chemisch identischen Poly-β-1,4-Glucan-Ketten. Mehrere Celluloseketten aus Mikrofasern werden an Orten außerhalb der Zellmembran an der Bakterienoberfläche synthetisiert. Diese Mikrofasern weisen einen Querschnitt von etwa 1,6 nm x 5,8 nm auf. Unter statischen oder stehenden Kulturbedingungen lagern sich die Mikrofasern an der Bakterienoberfläche unter Bildung einer Faser mit einem Querschnitt von etwa 3,2 nm x 133 nm zusammen.
Obwohl die von diesen Mikroorganismen produzierten Cellulosefasern unter vielen Aspekten der aus Zellstoff hergestellten Cellulose chemisch ähnlich sind, unterscheiden sie sich in vielfacher Hinsicht. Die Unterschiede liegen hauptsächlich in der Querschnittsgröße dieser Fasern. Die von Acetobacter produzierten Cellulosefasern sind für gewöhnlich zwei Größenordnungen schmaler als die üblicherweise aus einem Aufschluß von Birken- oder Kiefernholz produzierten Cellulosefasern. Die kleine Querschnittsgröße dieser von Acetobacter produzierten Fasern, zusammen mit dem gleichzeitig größeren Oberflächenbereich als bei üblicher Cellulose aus Zellstoff und mit der der Cellulose innewohnenden Hydrophilie, führt zu einem Celluloseprodukt mit einer ungewöhnlich großen Aufnahmekapazität für wäßrige Lösungen.
Dieses hohe Aufnahmevermögen hat sich bei der Herstellung von Verbänden zur Behandlung von Verbrennungen oder von chirurgischen Verbänden zur Verhinderung der Austrocknung von Oberflächen exponierter Organe während ausgedehnter chirurgischer Eingriffe als nützlich erwiesen. Derartige Verwendungen und eine Vielzahl von mit Medikamenten getränkten Polstern, die man durch Behandlung von von Acetobacter produzierter, intakter Kahmhaut herstellt, werden in U.K. 2,131,701A beschrieben. Die Kahmhaut dieser U.K.-Anmeldung wird durch Züchtung von Acetobacter auf einem Objektträger mit unbewegt bleibendem Kulturmedium hergestellt. Die Celluloseproduktion von Acetobacter geschieht an der Gas-Flüssigkeits-Phasengrenze des Mediums, da Acetobacter ein obligater Aerobier ist, d.h. er kann in Abwesenheit von Sauerstoff nicht wachsen. Jedes Bakterium produziert kontinuierlich an der Gas-Flüssigkeits-Phasengrenze des Mediums eine Faser. Wenn neue Cellulose an der Oberfläche gebildet wird, wird die vorhandene Cellulose hinab in das Nährmedium verdrängt. Die unter statischen Kulturbedingungen produzierte Cellulosekahmhaut besteht als Folge davon aus Lagen von Cellulosefasern. Bedeutsamerweise wird das Volumen der so produzierten Cellulose von der Phasengrenze zwischen Luft und Kulturmedium begrenzt. Die Neigung von bekannten Acetobacterstämmen zur Entwicklung von Stämmen, die keine Cellulose produzieren, wenn sie unter Schüttelbedingungen bei einer erhöhten Konzentration von gelöstem Sauerstoff gezüchtet werden, begrenzt ernsthaft die Menge an wirtschaftlich herstellbarer Cellulose. Als Konsequenz daraus wurde zuvor nicht über eine hohe Produktivität pro Gefäßvolumeneinheit in ausgedehnten Schüttelfermentationen berichtet.
Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit der Celluloseproduktion durch Acetobacter in Batchkulturen, ob geschüttelt oder statisch, liegt in der Fähigkeit von Acetobacter zur Umwandlung von Glucose in Gluconsäure und Ketogluconsäuren. Der pH-Wert-Abfall im Zusammenhang mit einer derartigen Säureproduktion des Organismus begrenzt ebenso, besonders in Batchkulturen, die produzierte Cellulosemenge. Darüberhinaus entzieht die Gluconsäureproduktion auf Kosten der Celluloseproduktion Glucose aus dem Medium.
Die Erfindung stellt netzartige Cellulose bereit, erhältlich von einem als Acetobacter bezeichneten Mikroorganismus mit der Fähigkeit von Mikroorganismen, die erhältlich sind von ATCC 53264, ATCC 53263 und ATCC 53524, zur Produktion eines Celluloseproduktes unter Schüttelkulturbedingungen, wobei das Produkt unter Bedingungen einer kontinuierlichen Schüttelkultur erhältlich ist, die, unter einem Rasterelektronenmikroskop betrachtet, zu einer netzartig angelegten Struktur mit häufig verdickten Strängen führt, welche Verbindungen unter Entstehung eines gitterartigen Musters erzeugen, das sich in drei Dimensionen erstreckt und bei der Verformung zu Blättern durch Vorrichtungen zur Blattherstellung Widerstand gegen Verdichtung zeigt.
Unter einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von netzartiger Cellulose, wie vorstehend definiert, bereit, umfassend: a) Züchtung unter Schüttelbedingungen eines Mikroorganismus mit der Bezeichnung Acetobacter mit der Fähigkeit von Mikroorganismen, die erhältlich sind von ATCC 53264, ATCC 53263 und ATCC 53524, zur Produktion eines Celluloseproduktes unter Schüttelkulturbedingungen in einem für Celluloseproduktion geeigneten Flüssigmedium bei einer durchschnittlichen volumetrischen Produktivität von mindestens 0,1 g/l/Stunde über einen Zeitraum von mehr als 70 Stunden, wobei der Mikroorganismus unter Schüttelkulturbedingungen eine Änderungsfrequenz von Cellulose produzierenden Formen zu Cellulose nicht- produzierenden Formen von weniger als 0,5 % im Verlauf von 42 bis 45 Generationen aufweist, bestimmt durch das Auftreten von Cellulose nicht-produzierenden Kolonien auf festem Medium, und b) Entnahme des erhaltenen netzartigen Celluloseproduktes.
Die Erfindung stellt ebenso einen Mikroorganismus mit der Bezeichnung Acetobacter bereit mit der Fähigkeit von Mikroorganismen, die erhältlich sind von ATCC 53264, ATCC 53263 und ATCC 53524, zur Produktion eines Celluloseproduktes unter Schüttelkulturbedingungen, der unter Schüttelkulturbedingungen eine Änderungsfrequenz von Cellulose produzierenden Formen zu Cellulose nicht- produzierenden Formen, bestimmt durch das Auftreten von Cellulose nicht-produzierenden Kolonien auf festem Medium, von weniger als 0,5 % im Verlauf von 42 bis 45 Generationen aufweist.
Unter einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung einen Mikroorganismus mit der Bezeichnung Acetobacter mit der Fähigkeit von Mikroorganismen, die erhältlich sind von ATCC 53264, ATCC 53263 und ATCC 53524 zur Produktion eines Celluloseproduktes unter Schüttelkulturbedingungen, der bei der Züchtung auf einem D-Glucose enthaltenden Medium verminderte Mengen an Gluconsäure und Ketogluconsäuren produziert.
Diese unter bekannten statischen Kulturbedingungen produzierte bakterielle Cellulose wird durch eine nicht geordnete Schichtstruktur aus übereinanderliegenden und verwobenen einzelnen Cellulosesträngen oder -fasern gekennzeichnet. Diese nicht geordnete Schichtstruktur spiegelt das Wachstumsmuster von Cellulose produzierenden Mikroorganismen wieder, für die der Mikroorganismus Acetobacter ein typisches Beispiel ist. In statischen Kulturen wächst Acetobacter typischerweise an der Phasengrenze der Oberfläche des Flüssigmediums und der Sauerstoff enthaltenden Gasphase. Während des Zellwachstums werden die Cellulosefasern beständig entwickelt und tiefer ins Medium sinkend angesammelt. Die so gebildete Cellulosekahmhaut enthält eine Masse von zusammenhängenden Schichten von Cellulosefasern zur Stützung der wachsenden Population von Acetobacterzellen an der Luft-Medium Phasengrenze.
Die makroskopischen und mikroskopischen Strukturen der unter erfindungsgemäßen Schüttelkulturbedingungen produzierten Cellulose unterscheiden sich von denen, die bei Einhaltung der bekannten Schüttelkulturbedingungen entstehen. Makroskopisch gesehen bildet sich die erfindungsgemäße Cellulose in der Kultur eher in Form von Kügelchen als in Gestalt einer zusammenhängenden Kahmhaut an der Luft-Medium-Phasengrenze. Mikroskopisch gesehen ist das erfindungsgemäße Celluloseprodukt durch eine dreidimensionale, netzartige Struktur gekennzeichnet. Diese Struktur wird durch häufig verdickte Cellulosestränge gekennzeichnet, die untereinander verbunden sind, so daß ein gitterartiges, sich in drei Dimensionen erstreckendes Muster entsteht. Die in statischen Kulturen produzierte bakterielle Cellulose ist durch überlappende benachbarte Cellulosestränge mit einer vorherrschenden Ausrichtung von im Bezug auf die Längsachse des Stranges parallelen, aber nicht geordneten Ebenen gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu ist die netzartige Struktur des erfindungsgemäßen Celluloseproduktes eher durch verbindende, als durch überlappende Cellulosestränge gekennzeichnet. Diese verbindenden Stränge weisen sowohl annähernd senkrechte als auch annähernd parallele Ausrichtungen auf. Als Folge davon weist das netzartige, erfindungsgemäße Celluloseprodukt im Rasterelektronenmikroskop ein im allgemeinen stärker gefenstertes Aussehen auf, wohingegen die in statischer Kultur erzeugte Cellulose im Rasterelektronenmikroskop ein Aussehen von kreuz und quer übereinandergestapelten, aber im wesentlichen in jeder entsprechenden Schicht parallelen Strängen aufweist. Die Stränge des erfindungsgemäßen Celluloseproduktes sind im allgemeinen dicker als die in vergleichbaren Medien ohne Schütteln produzierten. Die netzartige Cellulose bestand aus verbindenden Fäden mit einer Weite von etwa 0,1 bis etwa 0,2 Micron. Die ohne Schütteln produzierten Cellulosefäden oder -stränge lagen in einem Bereich von etwa 0,05 bis etwa 0,2 Micron, mit vielen Strängen im Bereich von 0,05 bis 0,10 Micron.
Zusätzlich verzweigen und verbinden sich anscheinend die Fasern des nicht netzartigen Celluloseproduktes verglichen mit den Fasern des netzartigen Produktes weniger häufig. Obwohl das nicht netzartige Celluloseprodukt anscheinend viele sich untereinander berührende Fasern aufweist, liegen die Fasern eher übereinander, als daß sie sich verbinden. Im Gegensatz dazu weisen die Fasern der erfindungsgemäßen netzartigen Cellulose einen umfangreichen Anteil an sich verbindenden Fasern unter Ausbildung eines im wesentlichen kontinuierlichen Netzwerks von verbundenen Fasern auf.
Das netzartige erfindungsgemäße Celluloseprodukt besitzt mehrere Vorteile gegenüber der Cellulose, die bei der Produktion nicht geschüttelt wird. Das netzartige Celluloseprodukt kann mit üblichen Fermentationsverfahren für große Volumina hergestellt werden, da es in üblicher Weise in Schüttelkulturen von Cellulose produzierenden Mikroorganismen, wie Acetobacter, produziert wird. Deswegen kann, anders als bei der Produktion von Cellulosekahmhäuten in langsam wachsenden, nicht bewegten Kulturmedien des Standes der Technik, das netzartige, erfindungsgemäße Celluloseprodukt in schnell wachsenden Kulturen von Acetobacter mit einer großen volumetrischen Produktivität und hoher Konzentration an netzartigem Celluloseprodukt produziert werden.
Ein Weg zur Unterscheidung des netzartigen erfindungsgemäßen Celluloseproduktes von der ohne Schütteln produzierten bakteriellen Cellulose stellen seine Eigenschaften nach der Verdichtung zu einem papierähnlichen Blatt dar. Chargen des netzartigen Celluloseproduktes zeigen einen weiten Widerstandsbereich gegen Verdichtung nach der Verformung in ein Einzelblatt nach üblichen Verfahren, wie der Dispersion in Wasser mit einem British-Disintegrator mit einer anschließenden Formgebung in einem Schöpfsieb und mehrmaligem Pressen. Es wurde festgestellt, daß einige Chargen des netzartigen Celluloseproduktes wesentlichen Widerstand gegen Verdichtung nach der mit den vorstehend erwähnten Verfahren vorgenommenen Verformung in Einzelblätter zeigten. Bei der Verwendung von verschiedenen Gewichten für das Naßpressen wurde eine Serie von Blättern mit einer Dichte in einem Bereich von etwa 300 bis etwa 900 kg/m³ hergestellt, wobei die, die wesentlichen Widerstand gegen Verdichtung zeigten, eine Dichte von 300 bis etwa 500 kg/m³ aufwiesen. Trotz der niedrigen Dichte weisen diese papierähnlichen Blätter eine sehr hohe Zugfestigkeit auf, gemessen nach dem Verfahren T494 om-81 der Technical Association of the Pulp and Paper Industry (TAPPI) mit einem Instron-Universal-Testinstrument. Der Zugindex für Blätter des Dichtebereichs von 300-500 kg/m³ liegt üblicherweise zwischen 100 und 150 Newton-Meter/Gramm. Vergleichbare aus Kraftzellstoff hergestellte Blätter mit einer Dichte unterhalb von etwa 500 kg/m³ besitzen praktisch keine Zugfestigkeit.
Unter statischen Kulturbedingungen aus Cellulose hergestellte Einzelblätter zeigen den vorstehend erwähnten Widerstand gegen Verdichtung nicht. Üblicherweise weisen derartige, von nicht geschüttelten Kulturen stammende Celluloseblätter in Abhängigkeit von dem beim Naßpressen verwendeten Gewicht eine Dichte von etwa 500 bis etwa 750 kg/m³ auf.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines netzartigen Celluloseproduktes durch Züchtung von Cellulose produzierenden Mikroorganismen unter Schüttelkulturbedingungen über andauernde Zeiträume. Die Produktion von bakterieller Cellulose unter Schüttelkulturbedingungen erscheint im Licht der bekannten Tendenz von Schüttelkulturbedingungen zur Selektion von Cellulose nicht-produzierenden Acetobacterstämmen überraschend. Valla et al., (1982). Darüberhinaus ist die netzartige Struktur der unter diesen Bedingungen produzierten Cellulose völlig unerwartet.
Der hier verwendete Begriff Acetobacter bezieht sich auf eine Gattung von Mikroorganismen und insbesondere auf die Mitglieder der Cellulose produzierenden Gattung. Obwohl eine Reihe von der Beschreibung entsprechenden Mikroorganismen bekannt ist, war ihre taxonomische Einordnung umstritten. Zum Beispiel werden die in der 15. Katalogausgabe der American Type Culture Collection unter den Hinterlegungsnummern 10245, 10821 und 23769 aufgelisteten, Cellulose produzierenden Mikroorganismen sowohl als Acetobacter aceti subsp. xylinum als auch als Acetobacter pasteurianus klassifiziert. Deswegen wird jeder Cellulose produzierende Acetobacterstamm, ob als Acetobacter aceti subsp. xylinum, als Acetobacter pasteurianus oder anders klassifiziert, mit den Stabilitätskennzeichen unter Schüttelkulturbedingungen, wie nachstehend näher erklärt, als im Schutzbereich der Erfindung liegend angesehen.
Die Erfinder haben eine Anzahl von Acetobacterstämmen mit einer in langfristigen Kulturen unter Kulturbedingungen sowohl ohne Schütteln als auch mit Schütteln, einschließlich der Bedingungen eines Fermentationsverfahrens, beibehaltenen Stabilität entdeckt und entwickelt. Die Stabilität der Stämme wird unter Schüttelbedingungen gezeigt; die erfindungsgemäßen Stämme wandeln sich anscheinend im allgemeinen mit sehr geringer Häufigkeit in Cellulose nicht- produzierende Arten um, in der Regel weniger als 0,5 % am Ende eines Fermentationslaufs von 42-45 Generationen, wie es über die Koloniemorphologie durch Ausplattierung von in Flüssigmedium unter Schüttelbedingungen gezüchtetem Acetobacter auf festem Medium nachgewiesen wird.
Die erfindungsgemäßen Acetobacterstämme wurden mutagenisiert und eine Anzahl von Stammabkömmlingen selektiert. Einer der selektierten Stämme und seine Nachkommenschaft sind durch eine stark reduzierte Fähigkeit zur Produktion von Gluconsäure bei der Züchtung auf Glucose enthaltendem Medium gekennzeichnet. Derartige Stämme mit einer reduzierten Fähigkeit zur Produktion von Gluconsäure sind stabil. Am Ende eines Fermentationslaufs von 42-45 Generationen werden weniger als 0,5 % Gluconsäure produzierende Arten anhand der Unfähigkeit von Subkulturen aus Proben der Fermentationsbrühe zur Bildung von Calciumcarbonat auflösenden Kolonien auf einem Glucose enthaltenden Medium nachgewiesen. Diese Stämme sind im Hinblick auf die Umwandlung in die Cellulose nicht- produzierende Art und die Umwandlung in die Gluconsäure produzierende Art stabil.
Verschiedene Nährstoffvorräte können so lange als Kohlenstoffquelle für das Wachstum von Cellulose produzierenden Mikroorganismen und eines erfindungsgemäßen netzartigen Celluloseproduktes verwendet werden, wie die Versorgung frei von verunreinigenden Organismen ist. Zu den geeigneten Kohlenstoffquellen gehören die Monosaccharide und Disaccharide in reiner oder teilweise gereinigter Form oder als Monosaccharide und Disaccharide enthaltende Vorräte, wie die aus Maisstärke und Melasse stammende Glucose.
Die Celluloseproduktion mit den erfindungsgemäßen Stämmen kann unter Bedingungen ausgeführt werden, die eine höhere Konzentration an gelöstem Sauerstoff erlauben als dies unter statischen Bedingungen möglich ist. Die Fähigkeit des Stammes zur Aufrechterhaltung der Celluloseproduktion während des Schüttelns ermöglicht verschiedene Verfahren zur Erhöhung der gelösten Sauerstoffmenge im zu verwendenden Kulturmedium. Deswegen ist das direkte Rühren des Kulturmediums durch in das Medium eintauchende Rührpropeller erfolgreich verwendet worden, obwohl die Haftung der produzierten Cellulose an den Schaufeln des Propellers ein Nachteil sein kann. Verfahren zum Rühren der Kultur zur Erhöhung des gelösten Sauerstoffgehalts sind denen gut bekannt, die mit der mikrobiologischen Fermentation vertraut sind. Der Sauerstoffdruck in der Brühe kann zwischen 0,01 und 0,4 des atmosphärischen Sauerstoffs schwanken.
In Tests in einem Fermenter (14 Liter) mit einem Propeller zum Rühren der Brühe fand man, daß die Eigenschaften der Brühe (Viskosität) und der erhaltenen Cellulose (Teilchengröße und Morphologie, Absetzgeschwindigkeit, Einzelblattbildung) von hohen Propellergeschwindigkeiten (über etwa 600 Upm in den Betriebsläufen) beeinflußt werden. Je länger die Kulturen bei derartigen Geschwindigkeiten gerührt wurden, desto deutlicher traten diese Effekte auf. Es ist nicht bekannt, ob diese Ergebnisse auf sämtliche Fermentervolumen, Rühranlagen und/oder -verfahren zutreffen. In den ausgeführten Tests führten jedoch die höheren Propellergeschwindigkeiten/längeren Rührzeiten zu längeren Absetzzeiten der Teilchen, einer höheren Viskosität der Suspension und weniger Cellulose verblieb in Einzelblattests, und sie führten zu kleineren Teilchen. Dementsprechend kann in Abhängigkeit von der beabsichtigten Endnutzung der Cellulose die Vermeidung der Züchtung des Organismus unter derartigen Schüttelbedingungen wünschenswert sein. Es wird deswegen zur Vermeidung jedweder wesentlicher Eigenschaftsverschlechterung des Celluloseproduktes die Ausführung der Fermentation bei genügend niedrigen Rührgeschwindigkeiten und Rührzeiten vorgezogen.
Der wirksame pH-Bereich zur Züchtung der erfindungsgemäßen, Cellulose produzierenden Mikroorganismen liegt zwischen 4 und 6, mit einem bevorzugten Bereich von 4,5 bis 5,5. Der pH-Wert kann mit dem Kulturmedium zugesetzten Puffern, wie Citrat, kontrolliert werden; oder durch Zusatz einer Base oder Säure zum Medium in einer ausreichenden Menge zur Aufrechterhaltung des gewünschten pH-Bereichs.
Die Figuren 1A und 1B sind Photographien, die die makroskopische Struktur des erfindungsgemäßen netzartigen Celluloseproduktes zeigen. Die Figur 1A zeigt das Produkt vor der Basenextraktion; Die Figur 1B zeigt es nach der Basenextraktion und Reinigung. Die Trennungslinien liegen etwa 1 mm auseinander.
Die Figur 2 stellt eine Rasterelektronenmikroskopaufzeichnung mit einer 5000 fachen Vergrößerung von nicht netzartiger, ohne Schütteln produzierter Cellulose dar.
Die Figur 3 stellt eine Rasterelektronenmikroskopaufzeichnung mit einer 5000 fachen Vergrößerung der netzartigen, erfindungsgemäßen Cellulose dar.
Die Figur 4 stellt eine Rasterelektronenmikroskopaufzeichnung mit einer 10150 fachen Vergrößerung von nicht netzartiger, ohne Schütteln produzierter Cellulose dar.
Die Figur 5 stellt eine Rasterelektronenmikroskopaufzeichnung mit einer 10330 fachen Vergrößerung der netzartigen Cellulose dar.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In der nachfolgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung werden eine Anzahl von Kulturmedien erwähnt. Wenn nicht anders angegeben, werden die Medien wie nachstehend aufgeführt formuliert.
Das R20-2 Medium weist die nachfolgende Zusammensetzung auf:

R20-2

Bactopepton 5 g/l
Hefeextrakt 5 g/l
Na&sub2;HPO&sub4; 2,7 g/l
Citronensäure 1,15 g/l
Kohlenstoffquelle Wie angegeben (Wenn nicht angegeben, 2 % Glucose)
pH-Endwert 5,0 ± 0,2
R20 stellt dasselbe Medium wie vorstehend dar, nur der pH-Endwert beträgt 6,0. R20-3 stellt dasselbe Medium wie vorstehend dar, nur die Citronensäure wird weggelassen.
Das Y-1 Medium, das auch als Minimalmedium bezeichnet wird, weist die nachfolgende Zusammensetzung auf: Verbindung Endkonzentration (mM) Glucose pH-Wert = 5,0 2 % (Gew./Vol.) wenn nicht anders angegeben
Bei sämtlichen Studien mit dem Y-1 Medium wurde das nachfolgende Vitamingemisch in einer 100-fachen Verdünnung zu dem Minimalmedium zugesetzt: Vitamingemisch Verbindung Inosit Niacin Pyridoxin HCl Thiamin HCl Ca-Pantothenat Riboflavin p-Aminobenzoesäure Folsäure Biotin
Das Medium aus Maisquellwasser (CSL) weist die nachfolgende Zusammensetzung auf: Bestandteil Endkonzentration (mM) Vitamingemisch (vorstehend) Kohlenstoffquelle Maisquellwasser (Überstand nach Zentrifugation) Antischaummittel pH-Endwert = 5,0 ± 0,2 10 ml/Liter wie angegeben (gewöhnlich Glucose, 2 oder 4 %, Gew./Vol.) wie angegeben (gewöhnlich 2 oder 5 %, Vol./Vol.) 0,01 % (Vol./Vol.)
Die Zusammensetzung des Maisquellwassers schwankt in Abhängigkeit von der Herkunft und der Art der Behandlung. Eine typische Probe von Maisquellwasser, Lot E804, erhältlich von Corn Products Unit, CPC North America, Stockton, CA., wird nachstehend beschrieben: Hauptbestandteile Prozent Feststoffe Rohprotein Fett Rohfaser Asche Calcium Phosphor Stickstoffreier Extrakt Nicht Protein-gebundener Stickstoff Kalium Reduzierende Zucker (wie Dextrose) Stärke pH-Wert
Das Y3-3 Medium weist die nachfolgende Zusammensetzung auf: Bestandteil Konzentration Hefeextrakt Pepton Glucose pH-Wert
Ein Aspekt der Erfindung betrifft eine Anzahl von stabilen, Cellulose produzierenden Acetobacterstämmen. Die Stabilität von erfindungsgemäßen Acetobacterstämmen wird durch eine sehr niedrige Umwandlungshäufigkeit in Cellulose nicht-produzierende Phänotypen gezeigt. Die Umwandlungshäufigkeit in Cellulose nicht-produzierende Phänotypen ist geringer als 5 x 10&supmin;³, wie es durch die Koloniemorphologie bei der auf festem Medium erfolgenden Ausplattierung von Acetobactersubkulturen nach der Züchtung unter Schüttelbedingungen am Ende eines Fermentationszyklus von 42-45 Generationen nachgewiesen wurde. Die Kolonien der Cellulose produzierenden Stämme auf festem Medium sind im allgemeinen beige oder weiß, und sie sind klein, erhöht oder konvex und kompakt in ihrer Größe. Im Gegensatz dazu bilden Cellulose nicht-produzierende Stämme auf festem Medium ausgedehnte, für gewöhnlich flache Kolonien.
Die stabilen, erfindungsgemäßen Acetobacterstämme stammten von anfänglich isolierten Zellen eines A. xylinum Stammes, erhältlich von dem Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, USA, unter der Hinterlegungsnummer NRRL B42, ab. Die Züchtung des NRRL Stammes auf Agarplatten aus R20-2 Medium offenbarte zwei Koloniemorphologien, die eine weiß, die andere beigefarben. Mikroskopisch gesehen weisen die beigefarbenen Kolonien für den Acetobacterstamm typische längliche, stabförmige Zellen auf. Dieser Stamm wird mit 1306-3 bezeichnet. Anders als der parentale NRRL-B42 Stamm erzeugt der 1306-3 keine wasserlöslichen Polysaccharide, wie berichtet von Couso, R. O. et al., Biosynthesis of Polysaccharides in Acetobacter xylinum; Sequential Synthesis of a Heptasaccharide Diphosphate Prenol, Eur. J. Biochem. 123 (1982), 617-627. Die Kulturen von 1306-3 sind bei der Anlage von Subkulturen auf unterschiedlichen Medien mit verschiedenen Kohlenstoffquellen sowohl in der mikroskopischen Morphologie als auch in der makroskopischen Koloniemorphologie stabil. Darüberhinaus bleibt die Kolonie- und Zellmorphologie des erfindungsgemäßen Stammes, ob in statischen oder in geschüttelten Flüssigkulturen in verschiedenen Medien, stabil.
Der Stamm 1306-3 und seine Nachkommenschaft besitzen die Fähigkeit zur Produktion von Cellulose in verschiedenen Flüssigkulturmedien mit verschiedenen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen. Caseinhydrolysate, Hefeextrakt, Malzextrakt, Ammoniumsalze, Maisquellwasser und weitere stickstoffreiche Stoffe können als eine allgemeine Quelle für Aminosäuren, Stickstoff, Mineralien und Vitamine verwendet werden. Maisquellwasser ist in einem Bereich zwischen 0,1 % und 10 % (Vol./Vol.) bevorzugt. 5 % (Vol./Vol.) Maisquellwasser ist bei Schüttelkulturen in Flaschen bevorzugt. In Fermentern wird während der Fermentierung zu einer Anfangskonzentration von 2 % (Vol./Vol.) Maisquellwasser zusätzlich 2 % (Vol./Vol.) Maisquellwasser zugesetzt. Zu den zahlreichen verwendungsfähigen Kohlenstoffquellen gehören Mannit, Sorbit, Saccharose, Fructose und Glucose, obwohl der Stamm 1306-3 bei Verwendung der letzteren Kohlenstoffquelle D- Gluconsäure und Ketogluconsäuren, einschließlich der 2-Keto- D-gluconsäure oder der 5-Ketogluconsäure, produziert.
Erfindungsgemäße, D-Gluconsäuren in bedeutend geringeren Mengen produzierende Acetobacterstämme wurden ebenso von den Erfindern entwickelt und werden hier nachstehend näher beschrieben.
Die bei der Produktion des netzartigen Celluloseproduktes verwendeten Kohlenstoffquellen können als Monosaccharide oder Gemische davon, wie Glucose und Fructose, als Disaccharide wie Saccharose und als Gemische von Monosacchariden und Disacchariden gekennzeichnet werden. Zusätzlich kann die Kohlenstoffquelle als ein komplexes Zuckergemisch, wie Melasse, oder als Hydrolysat von pflanzlichen Biomassen, wie Holz-, Stroh-, Maisstiel-, Sorghum- und ähnliche Hydrolysate, eingebracht werden.
Die Konzentration des Monosaccharids und Saccharids oder der Gemische davon kann unterschiedlich sein. Glucose allein und Fructose allein wurden in einem Bereich von 0,5 bis 7 % (Gew./Vol.) bei einer bevorzugten Konzentration von etwa 4 % (Gew./Vol.) verwendet. Zusätzlich können Gemische von Glucose und Saccharose in einem Verhältnis von 1:10 bis 10:1 (Gew./Gew.) mit einem Anteil von 0,5 bis 7 % (Gew./Vol.) am Gesamtmedium verwendet werden. Eine Konzentration von 1 % (Gew./Vol.) Glucose und 2 % (Gew./Vol.) Saccharose wird bei Flaschenkulturen vorgezogen. Bei der Fed-Batch-Fermentation, bei der die Kohlenstoffquelle mit Unterbrechungen oder kontinuierlich während der Fermentation zugegeben wird, kann die Gesamtmenge des zugesetzten Kohlenstoffsubstrates zwischen 4 bis 30 % (Gew./Vol.) schwanken. Die Kohlenstoffquelle kann in Form eines gereinigten oder teilweise gereinigten Nährstoffvorrats oder in einer anderen Ausführungsform als ein komplexes Gemisch, wie Melasse, bereitgestellt werden. Derartige Kohlenstoffquellen werden in einer Vorbehandlung von verunreinigenden Organismen befreit.
Die Umwandlung von Glucose in D-Gluconsäure in einem Glucose enthaltenden Medium hat in der Batchkultur einen bedeutenden pH-Abfall im Medium zur Folge. Eine pH- Regulierung ist wünschenswert, da ein pH-Wert unter etwa 4,0 das Zellwachstum begrenzen kann. Die pH-Kontrolle in Flüssigkulturmedien von Gluconsäure produzierenden, erfindungsgemäßen Stämmen kann durch Verwendung von Puffern, wie Citratpuffern, vorgenommen werden. Jedoch ist die Puffermenge als neutralisierender Zusatz zur Säure begrenzt, und das Wachstum von Gluconat produzierenden Stämmen zu hoher Dichte wird von der Puffermenge, die zugegeben werden kann, begrenzt. Darüberhinaus kommt zu den Ausgaben für das Kulturmedium die Verwendung von Citrat oder anderen Salzen als Puffer noch hinzu. Die pH-Regulierung kann ebenso durch Verwendung von Fructose als Kohlenstoffquelle vorgenommen werden, da Acetobacter Fructose nicht zu Säure metabolisiert. Jedoch stellt Fructose ein teures Substrat dar und erhöht die Herstellungskosten der Cellulosefasern.
Durch Behandlung des Stammes 1306-3 mit einem mutagen wirkenden Stoff haben die Erfinder stabile Stammvarianten, die von den Stämmen 1306-11 und 1306-21 beispielhaft dargestellt werden, entwickelt. Diese Stämme produzieren bedeutend geringere Mengen an Gluconsäure, produzieren jedoch Cellulose auf die für den elterlichen Stamm 1306-3 kennzeichnende stabile Weise. Die Mutagenese wurde unter Verwendung einer ausreichenden Konzentration an Ethylmethansulfonat (EMS) für die Erzielung einer Überlebensrate von etwa 1 % erreicht. Im Fall des Stammes 1306-11 der überlebenden, mutagenisierten Bakterien wurden 8100 Kolonien abgesucht. Zwei isolierte Kolonien produzierten verringerte Mengen von Gluconsäure.
Stamm 1306-11 wurde ausgewählt durch Züchtung auf Platten von R20-CaCO&sub3; und durch Absuchen nach Kolonien mit einer ähnlichen Morphologie wie der elterliche Stamm 1306-3, aber ohne die Fähigkeit, eine Calciumcarbonattrübung im Medium aufzuklaren. Weitere pH-empfindliche Tests mit der Fähigkeit zum Nachweis der Abwesenheit von pH-erniedrigenden Stoffen wie Gluconat können verwendet werden.
Stamm 1306-21 wurde wie in Beispiel V nachstehend beschrieben selektiert.
Bakterienkulturen können mit jedem bekannten Verfahren zur Produktion einer Wirbelbewegung im Flüssigkulturmedium unter den Bedingungen einer Schüttelkultur gezüchtet werden. Derartige Verfahren sind dem Fachmann der Fermentationstechnik gut bekannt. In kleinem Umfang, im allgemeinen bei weniger als 10 Liter Kulturvolumen, können Flüssigkulturen von reziprok- oder rundschüttelnden Inkubatoren unter Übertragung einer wirbelnden Bewegung auf das Medium geschüttelt werden.
In großem Umfang, im allgemeinen bei Kulturvolumina von mehr als 10 Litern, kann die Kulturbrühe mit einer Anzahl von Verfahren einschließlich Rührpropellern, schwimmenden Hubfermentern, einschließlich Drucklufthubfermenter, Rückführung der Fermenterbrühe mit Pumpendruck oder Kombinationen davon gerührt werden. Verschiedene Reaktorauslegungen können für die in großem Maßstab erfolgende Herstellung des erfindungsgemäßen Celluloseproduktes geeignet sein. Vgl. z.B. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook 1.Ausg., Kap.7 (The Nature Press, New York, 1983), Hrsg.: Atkinson und Mavituna.
So lange das Kulturmedium gerührt wird, sind verschiedene Fermentationsverfahren zur Züchtung des Cellulose produzierenden Mikroorganismus über längere Zeiträume bei einer durchschnittlichen, volumetrischen, im Schutzbereich der Erfindung liegenden Produktivität an Cellulose von wenigstens 0,1 g/l/Std. geeignet. Zu den geeigneten Fermentationsverfahren gehören die Batch- Fermentation, Fed-Batch-Fermentation, wiederholte Batch- Fermentation und die kontinuierliche Fermentation. In Batch- Fermentationen wird ein Fermentationsgefäß mit dem Cellulose produzierenden Mikroorganismus beimpft und die Fermentation verläuft ohne weitere Kulturmedienzugabe. Am Ende der Fermentation werden die Inhalte der Fermentationsgefäße gesammelt und die Cellulose wird entnommen. Bei Fed-Batch- Fermentationen werden verschiedene Nährstoffe, wie Kohlenstoffquellen oder Stickstoffquellen, während des Fermentationsbetriebs ohne Entnahme von Fermentationsbrühe für eine Weiterverarbeitung bis zum Ende des Fermentationslaufs zugegeben. Die Nährstoffe können kontinuierlich, in vorher festgelegten Abständen oder bei Unterschreitung der gewünschten Werte des Nährstoffniveaus im Medium zugesetzt werden. Bei wiederholten Batch- Fermentationen wird ein Teilvolumen der Kulturbrühe für eine Weiterverarbeitung entnommen, ein Volumen von frischem Medium wird zu der im Kulturgefäß verbleibenden Kulturbrühe zugesetzt und die Fermentation wieder aufgenommen. Bei wiederholten Batch-Fermentationen, wie bei Fed-Batch- Fermentationen, können die Nährstoffe kontinuierlich, in vorher festgelegten Abständen oder bei Unterschreitung der gewünschten Werte des Nährstoffniveaus im Medium zugesetzt werden. Bei kontinuierlichen Fermentationen wird mit einer konstanten Rate die Brühe aus dem Fermentationsgefäß entfernt und mit frischem Medium ersetzt. Bei kontinuierlichen Fermentationen kann durch Einstellung des Flusses an Medium in das Gefäß und der Kulturbrühe aus dem Gefäß die Wachstumsrate der Cellulose produzierenden Mikroorganismen bei einer etwa konstanten Rate gehalten werden.
Batch-Fermentationen, Fed-Batch-Fermentationen, wiederholte Batch-Fermentationen und kontinuierliche Fermentationen eignen sich sämtlich so lange für ein durchschnittliches volumetrisches Produktivitätsziel von wenigstens 0,1 g/1/Std., wie die anfängliche Animpfung des Kulturmediums wenigstens 1 % (Vol./Vol.) beträgt. Eine Impfung des Kulturmediums in einem Bereich von 1-10 % (Vol./Vol.) reicht für ein durchschnittliches volumetrisches Produktivitätsziel an Cellulose von wenigstens 0,1 g/l/Std.. Eine Impfung des Kulturmediums von etwa 5-10 % (Vol./Vol.) ist bevorzugt. In kontinuierlichen Kulturen werden Medium, Cellulose produzierende Zellen und Cellulose entnommen und frisches Medium in einer Rate zugesetzt, die zur Beibehaltung der durchschnittlichen volumenbezogenen Produktivität von wenigstens 0,1 g/l/Std. ausreicht.
Zur Bestimmung von Cellulosekonzentration und volumetrischer Produktivität wird die in jedem der vorstehend erwähnten Fermentationsverfahren produzierte Cellulose aus der Fermentationsbrühe geerntet. Im allgemeinen kann jedes Verfahren zur Abtrennung der Cellulose verwendet werden, aber die Zentrifugation wird bevorzugt. Jede Charge an Fermentationsbrühe, die den Cellulose produzierenden Mikroorganismus, das verbrauchte Medium und die Cellulose enthält, wird zentrifugiert. Das Volumen des Mediumüberstandes wird bestimmt und der Überstand verworfen. Das Feststoffe einschließlich der Mikroorganismen und der Cellulose enthaltende Pellet wird zurückbehalten. Das Pellet wird zur Entfernung des restlichen Mediums zwei- bis dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Figur 1A zeigt die Makrostruktur des Pellets in diesem Stadium. Das zurückbehaltene Material wird wenigstens zwei Stunden lang bei 60-65ºC mit einer alkalischen Lösung, wie 0,1 M NaOH oder KOH, behandelt. Die Lösung kann zur Dispersion großer Zusammenballungen von Cellulose verrührt werden. Während der Alkalibehandlung wird das Gemisch langsam gerührt und bei 60-65ºC gehalten. Das mit Alkali behandelte Material wird zentrifugiert, und das Pellet wird anschließend drei oder viermal in entionisiertem Wasser gewaschen und zentrifugiert. Figur 1B zeigt die Makrostruktur der Cellulose in diesem Stadium. Die Cellulose wird anschließend in einem Vakuumofen getrocknet und gewogen. Die volumetrische Produktivität wird definiert als die Gesamtmasse an Cellulose, die von der Animpfung bis zur Ernte bei Batchkulturen (g/l/Std.) pro Volumen an verwendetem Medium pro Fermentationszeit produziert wird.
Die nachfolgenden Beispiele dienen nur als Beispiele für die Erfindung und sollen sie nicht einschränken.

Beispiel I

Dieses Beispiel zeigt die Celluloseproduktion von A. xylinum 1306-3 bei der ohne Schütteln erfolgenden Züchtung auf Fructose als Hauptsubstrat. Stamm 1499-1, erhalten von Dr. Moshe Benziman, Hebrew University, Jerusalem, Israel, wurde zu Vergleichszwecken unter identischen Bedingungen gezüchtet.
Zuchtkolben wurden eingerichtet mit 25 ml Y3-3 Medium mit 2 % Fructose in 50 ml Erlenmeyerkolben und von Schrägagar angeimpft. Die Kulturen züchtete man drei Tage lang bei 30ºC als statische Kulturen. Die Kolben wurden zur Freisetzung von Zellen heftig von Hand geschüttelt und 0,5 ml dieser Kultur (ohne Cellulosekahmhaut) überimpfte man in mehrere Kolben mit identischem Y3-3 Medium mit 2 % (Gew./Vol.) Fructose (25 ml in 50 ml Kolben). Die gleiche Impfung sämtlicher Stämme wurde unter Verwendung einer Zellsuspension von 0,03 OD bei 670 nm und durch Impfung von 0,5 ml in jeden Kolben ausgeführt. Die Kolben inkubierte man bei 30ºC ohne Schütteln.
Die Inkubation der Kolben wurde beendet und der gesamte Inhalt zur Probenentnahme geerntet. Von jedem Stamm entnahm man zu jedem Zeitpunkt eine Doppelprobe. Die Probenentnahme wurde bei deutlichem Wachstum begonnen, und man nahm normalerweise zwei Proben jeden Tag.
Zur Messung der Celluloseproduktion wurden die Kolbeninhalte jeder Probe in ein 100 ml Becherglas übertragen. Die Suspension wurde anschließend eine Minute lang mit einer großen Tekmarsonde bei 50 % Höchstleistung aufgeschlossen. Die Suspension zentrifugierte man bei 5000 Upm 10 Minuten lang. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 15 ml 1,0 N NaCl-Kochsalzlösung resuspendiert und verwirbelt. Die Suspension ließ man 15 Minuten lang mit gelegentlichem Verwirbeln ins Gleichgewicht kommen. Die Probe wurde nochmals zentrifugiert und der vorstehende Waschschritt wiederholt.
Das Pellet suspendierte man nach dem zweiten Waschen wieder in 15 ml 0,5 N KOH und inkubierte es unter sanftem Rühren 120 Minuten lang bei 60ºC. Die Suspension wurde zentrifugiert und der KOH-Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 15 ml entionisiertem Wasser resuspendiert und bei Raumtemperatur zur Gleichgewichtseinstellung 15 Minuten lang bei gelegentlichem Verwirbeln stehengelassen. Die Suspension wurde zentrifugiert und das vorstehende Waschverfahren bis zu einer Gesamtzahl von vier Waschungen wiederholt.
Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde das nasse Cellulosegeflecht gewogen und anschließend über Nacht bei 55ºC im Vakuum getrocknet. Tabelle 1 Cellulose (g/l) Zeit(Std) Stamm
Die Celluloseproduktion von Stamm 1306-3 und Stamm 1499-1 auf Y3-3 Medium erfolgte mit 2 % Fructose. Der pH- Anfangswert betrug 6,0, n.b. = nicht bestimmt

Beispiel II

Celluloseproduktion in Schüttelkulturen: Stabilitätsstudien
Die Stabilität der Cellulosesynthese der Stämme 1306- 3 und 1499-1 wurde während nacheinander erfolgender Übertragungen von Stämmen in geschüttelte Flüssigkulturen unter Verwendung einer einheitlichen Impfung bei jeder Übertragung untersucht. Zur Beurteilung der Stabilität der Cellulosesynthese wurde die Beobachtung der Celluloseproduktion in den Kolben und das Erscheinen ausgedehnter Kolonien (L-Kolonien) bei plattierten Proben herangezogen. Die Celluloseproduktion bei 1499-1 erwies sich in aeroben Schüttelkolben als instabil, wie es durch eine verminderte Menge an produzierter Cellulose und dem Erscheinen einer wachsenden Zahl ausgedehnter, diffuser Kolonien, die Cellulose nicht-produzierende Zellen darstellen, gezeigt wird. Die Celluloseproduktion bei 1306-3 erwies sich in Schüttelkolben über 30 Generationen als stabil.
Zuchtkulturen wurden in 50 ml Erlenmeyerkolben von Schrägagar der parentalen Kultur in 25 ml R20 Medium mit 2 % Fructose bei einem pH-Wert von 5,0 beimpft. Die Zuchtkulturen wurden vier Tage lang bei 30ºC als statische Kulturen gezüchtet. Die Kolben schüttelte man zur Freisetzung von Zellen heftig von Hand und 0,5 ml dieser Kultur (ohne Cellulosekahmhaut) impfte man in mehrere Kolben mit R20 Medium mit 2 % Fructose (25 ml in 50 ml Kolben). Diese Kolben wurden bei 30ºC ohne Schütteln inkubiert.
Nach mehreren Übertragungen in statische Kolben wurde die 36-Stunden-Kahmhaut heftig geschüttelt und der Überstand als Impfmaterial (1% Vol./Vol.) für die R20 mit 2 % Fructose, pH-Wert 5, enthaltenden Kolben verwendet. Die Kolben (25 ml Medium in 125 ml Kolben) inkubierte man bei 30ºC und 200 Upm in einem New Brunswick Rundschüttler. Nach 24 bis 48 Stunden wurde die Kultur steril vermischt und als Impfmaterial für die zweite Übertragung in frisches Medium und für das Ausstreichen auf Platten verwendet. Jeder Stamm wurde für vier Übertragungen untersucht, was etwa 30 Generationen entspricht. Das verwendete Medium der Plattierungsexperimente bestand aus R20 mit 2 % Fructose, 1,5 % Agar, pH-Wert 5,0.
Während des Wachstums in Schüttelkolben zeigte sich die Kultur des Stammes 1499-1 als eine feine Zellsuspension und als unregelmäßige Zusammenballungen unterschiedlicher Größe. Das Verhältnis von Klumpen zur Zellsuspension nahm von der ersten zur dritten Übertragung ab. Diese Beobachtung war mit einer bedeutenden Abnahme der produzierten Cellulosemenge von der ersten zur dritten Übertragung und einem Anwachsen des L-Kolonieanteils, der Cellulose nicht- produzierende Stämme darstellt, verbunden.
Die Häufigkeit der L-Kolonien bei Stamm 1499-1 ist in Tabelle 2 als Funktion des Wachstums gezeigt. Tabelle 2 Instabilität von Stamm 1499-1 in Schüttelkultur Phase % L-Formen Bestand Impfung für Schüttelkolben Ende der ersten Schüttelphase Ende der dritten Schüttelphase
Während des Wachstums in Schüttelkolben zeigte sich der Stamm 1306-3 in scharf em Gegensatz dazu in unregelmäßigen Zusammenballungen unterschiedlicher Größe mit klarem Medium dazwischen. Cellulose-negative Zellen zeigen sich in der Brühe als Einzelzellen und verursachen im Medium zwischen den Zusammenballungen eine Trübung. Es wurden nach vier Übertragungen keine Veränderungen im Aussehen der Kultur oder in der produzierten Cellulosemenge beobachtet. Während der Zeit erwiesen sich die plattierten Kolonien als einheitlich; es wurden keine ausgedehnten, nicht- produzierenden Kolonien beobachtet.

Beispiel III

Mutagenese des Stammes 1306-3

Stamm 1306-3 wurde mit 1 % oder 2 % des chemischen Mutagens Ethylmethansulfonat (EMS) mutagenisiert und die überlebenden Zellen auf den Verlust der Fähigkeit zur Gluconatsynthese (GlcA-) hin abgesucht. Man erhielt zwei vereinzelte GlcA- Zellkolonien. Die Mutagenese wurde wie folgt ausgeführt:
Eine zwei Tage alte Kultur von 1306-3 auf einem R20- 2-Medium wurde für die mutagene Behandlung eingesetzt. Die Bedingungen wurden so gewählt, daß etwa 99 % abgetötet wurden. Die gewählten Bedingungen waren 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 6,0, 2 % EMS und eine 60 minütige Inkubation bei 28ºC. Die Zellkonzentration betrug etwa 5 x 10&sup7; Zellen/ml. Nach dieser Behandlung wurde die Kultur bis zur nächsten Verwendung bei -80ºC im eingefrorenen Zustand aufbewahrt.

Beispiel IV

Das Absuchen auf 1306-3 Gluconat-negative Mutanten erfolgte mit dem Material aus der EMS-Mutagenese.
Das Absuchen erfolgte auf 1 % CaCO&sub3; enthaltenden R20- 2-Platten. Diese Platten wurden durch Zusatz von sterilem 20%igem CaCO&sub3; zu sterilem R20-2 bis zu einer Endkonzentration von 1 %, gutes Vermischen und Verteilung von 10 ml pro Platte hergestellt. Der pH-Endwert des Plattenmediums betrug 6,0.
Die Platten wurden bei 30ºC inkubiert und nach 7-10 Tagen ausgezählt. Kolonien ohne klare Zonen wählte man für eine bestätigende Prüfung aus. Die Kolonien wurden in sterilen Teströhrchen suspendiert, die 2 ml R20-2-Medium enthielten, und drei Tage lang zur Überprüfung der Kahmhautbildung und des pH-Abfalls der Brühe inkubiert. Von 8100 abgesuchten Kolonien stellten sich zwei Zellgruppen der mit 2 % EMS behandelten Probe als Gluconsäure-negativ heraus; die bessere von ihnen wurde als 1306-11 bezeichnet.
Die Gluconsäureproduktion von 1306-11 oder 1306-3 wurde in flüssiger R20-Glucose und Y1-Glucose bestimmt. Y1 mit 2 % Glucose wies einen anfänglichen pH-Wert von 4,21 auf.
Eine Impföse mit 1306-11 oder 1306-3 Kultur von einer R20-2 Platte suspendierte man in 2 ml Y1 ohne Kohlenstoffquelle. Zellzählungen in den Suspensionen ergaben etwa 1,6 x 108 Zellen/ml. Die 3 ml geeignetes Medium enthaltenden Röhrchen (16 x 125 mm) wurden mit 200 ul der Zellsuspension geimpft und durch Verwirbeln gut gemischt. Die Röhrchen wurden ohne Schütteln drei Tage lang bei 30ºC inkubiert.
Die Tabelle 3 zeigt den pH-Wert und die Gluconatmengen am dritten Tag für die Mutante 1306-11 und für 1306-3, den elterlichen Stamm. Es werden die Werte für jedes der Röhrchendoppelbestimmungen gezeigt. Tabelle 3 Gluconatproduktion der Stämme 1306-3 und 1306-11 pH-Wert

Beispiel V

Herstellung und Identifizierung von Stamm 1306-21

Stamm 1306-3 wurde wie in Beispiel III mutagenisiert. Die Organismen plattierte man zur Bildung von Einzelkolonien auf CSL-Platten (2 % Glucose, 3 % Maisquellwasser) aus. Die Kolonien wurden ausgewählt und in Mikrotiterplattenvertiefungen, die 0,25 ml CSL-Medium (4 % Glucose, 1 % Maisquellwasser) enthielten, gegeben. Man inkubierte die Platten 4-5 Tage lang, bis man durch Messung mit pH-Papier (Bereich 2,9 bis 5,2) einen deutlichen Abfall des pH-Werts im Medium beobachtete. Die Kolonien mit einem pH-Wert von etwa 5 (pH-Papier farblich grün oder grünlich) wurden ein zweites Mal abgesucht.
Beim zweiten Absuchen impfte man die selektierten Kolonien in Teströhrchen, die 2 ml des mit Glucose angereicherten Mediums enthielten, das wie vorstehend beschrieben in Mikrotiterplattenvertiefungen verwendet wurde. Die Röhrchen inkubierte man bei 30ºC. Die Kolonien wurden auf Kahmhautbildung und pH-Wert untersucht. Ein Gluconsäure-negativer Stamm mit der Bezeichnung 1306-21 wurde auf diese Weise selektiert.
Zu Vergleichszwecken wurden Proben der Stämme 1306-11 und 1306-21 unter Verwendung der allgemeinen in Beispiel I beschriebenen Verfahrensweisen in Zuchtflaschen, die CSL- Medium mit schwankenden Mengen an Glucose und Maisquellwasser enthielten, gezüchtet. Die Celluloseproduktion und den pH-Wert des Mediums bestimmte man nach einer fünftägigen Inkubation. Über diese Ergebnisse wird nachstehend in Tabelle 4 berichtet. Tabelle 4 Celluloseproduktion und pH-Wert der Stämme 1306-11 und 1306-21 pH-Wert Cellulose (g/l) Medium * Die Zahlen bezeichnen jeweils % Glucose, bzw. % Maisquellwasser.
Wie berichtet, zeigte der Stamm 1306-21 in diesen Tests eine geringere Säureproduktion (höherer pH-Wert) und eine größere Celluloseproduktion als Stamm 1306-11.

Beispiel VI

Herstellung eines netzartigen Celluloseproduktes

Stamm 1306-14 stellt eine spontane Mutante des Acetobacterstammes 1306-11 dar. Er wurde als eine ausgedehnte, weiße, schleimige Kolonie auf R20-2-Platten identifiziert, wohingegen die 1306-11 Kolonien kennzeichnenderweise glatt, konvex und dunkel-beige in der Farbe sind.
Eine Probe von 1306-14 aus einem Gefriervorrat wurde in 100 ml R20-2 Medium beimpft und unter statischen Bedingungen drei Tage lang bei 30ºC gezüchtet. Man übertrug den gesamten Inhalt der Kultur in einen sterilen Mixer. Unter Verwendung eines kleinen Mischkopfes wurde die Kultur mit kurzen, fünf Sekunden langen Stößen vermischt. Ein 5%iges (Vol./Vol.) Inoculum der aufgebrochenen Kultur wurde in 400 ml R20-2-Medium in einem 2000 ml Prallblechkolben (baffled flask) übertragen und unter Schütteln bei 125 Upm etwa 2,5 Tage lang bei 30ºC gezüchtet. Der Inhalt der Flasche wurde vermischt und zur Fermenterimpfung verwendet.
Ein 5%iges (Vol./Vol.) Inoculum der aufgebrochenen Kultur aus den Prallblechkolben wurde in 9 l eines R20-2 Mediums mit 2 % Glucose übertragen. Den Fermenter (Braun) stattete man mit einem Rührpropeller aus; intern angebrachte Heizspiralen und die Prallflächen (Baffles) wurden entfernt. Während des Betriebs bestanden die nachfolgenden Fermentationsbedingungen: Zu Beginn 600 Upm, die nach 44 Stunden zur verstärkten Vermischung des Kulturmediums, das viskos geworden war, auf 1000 Upm erhöht wurden. Eine Temperatur von 30ºC (-1ºC + 3ºC) wurde eingehalten. Der pH- Wert wurde auf 5,0 ± 0,1 einreguliert und die Sauerstoffkonzentration in der Brühe bei etwa 30 % Luftsättigung gehalten. Nach 48 Stunden entnahm man den Inhalt des Fermenters. Man ließ die Cellulose absitzen und dekantierte die überstehende Flüssigkeit. Der Celluloserückstand wurde wie vorstehend beschrieben vermischt, gewaschen und filtriert. Die Cellulose wurde mit entionisiertem (DI) Wasser gewaschen und dreimal über Nacht bei 60ºC mit 0,5 M NaOH extrahiert. Nach den letzten Extraktionen wurde die Cellulose mit DI gewaschen, bis der pH-Wert des Waschwassers unter 6,0 fiel. Die Präparation verwendete man, wie in Beispiel VIII beschrieben, für eine Untersuchung mit einem Rasterelektronenmikroskop.

Beispiel VII

Der Stamm 1306-8 stellt eine Acetobacterkolonie dar, die direkt aus einer Probe von NRRL B42 selektiert wurde. Kolonien von 1306-8 sind durch weiße, stark erhöhte Kolonien auf R20-2-Platten gekennzeichnet. Der Stamm 1306-8 produzierte Gluconsäure. Eine Probe von 1306-8 aus einem Gefriervorrat (2,5 ml) wurde in 100 ml R20-2-Medium beimpft und bei 30ºC unter statischen Bedingungen in einem 500 ml Weithals-Erlenmeyerkolben gezüchtet. Die Impfkultur inkubierte man etwa 2-4 Tage lang unter diesen Bedingungen bis zur Bildung einer sichtbaren Haut. Der gesamte Inhalt der Impfkultur wurde anschließend vermischt und zur Impfung nachfolgender Kulturen verwendet.
Die Fermentation führte man in Weithals- Fernbachkolben aus, die 1 Liter R20-2-Medium mit 0,025 ml einer 10 g/100 ml Suspension des Benlate-Fungizids (Dupont) in Dimethylformamid (DMF) enthielten. Diese Konzentration an DMF und Benlate verhinderte wirksam einen Pilzbefall, ohne das Wachstum des Acetobacterstammes 1306-8 meßbar zu beeinflussen.
Etwa 8-10 ml verwendete man zur Impfung eines Liters R20-2-Kulturmedium. Die Kulturen wurden in den Fernbachkolben 10-14 Tage lang bei 30ºC ohne Schütteln (d.h., statische Kulturen) gezüchtet. Bis zur Erntezeit hatten sich 0,3 bis 1,2 cm dicke Kahmhäute gebildet.
Die Kahmhäute wurden den Fernbachkolben entnommen, anschließend vermischt und zur Entfernung des Mediums und eines Teils der Zellen mit entionisiertem Wasser gewaschen. Das Waschen erfolgte durch Filtration mit einem weiten Büchner-Trichter unter Verwendung eines Siebfilters (Spectramesh #146382) mit einer Porenweite von 286 um als Filter.
Die Extraktion der vermischten und gewaschenen Kahmhaut wurde in 0,50 M NaOH etwa 14 Stunden lang bei etwa 60ºC ausgeführt. Nach Vermischung und Inkubation über die gewünschte Zeitspanne filtrierte man das Extraktionsgemisch unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen. Die Waschungen mit entionisiertem H&sub2;O wurden fortgesetzt, bis der pH-Wert des Waschwassers unter 6,0 fiel. Die Präparation verwendete man für eine Untersuchung mit dem Rasterelektronenmikroskop.

Beispiel VIII

Das in den vorstehenden Beispielen VI und VII erhaltene Celluloseprodukt wurde für die Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet. Die Proben wurden gefriergetrocknet und anschließend im Vakuum mit einem leitfähigen Film aus 60:40 Gold:Palladium besputtert. Die Mikroaufnahmen wurden mit einem im Nanometerbereich genauen, mit einer zunehmenden Spannung ab 16 Kv betriebenen Rasterelektronenmikroskop gemacht.
Die Figuren 2 und 4 stellen repräsentative elektronenmikrographische Aufzeichnungen des erhaltenen Celluloseproduktes dar. Die Figuren 2 und 4 zeigen das in statischen Kulturen nach Beispiel VII hergestellte Celluloseprodukt. Die Figuren machen deutlich, daß das Produkt hauptsächlich aus übereinanderliegenden, ausgedehnten Cellulosefasern besteht, die sich anscheinend überlappen und einander kreuzen, die sich aber anscheinend nicht miteinander verbinden. Die unter statischen Bedingungen produzierten Cellulosefäden wiesen Schwankungen in der Breite zwischen etwa 0,05 bis 0,2 Micron mit zahlreichen Strängen zwischen 0,05 bis 0,1 Micron auf.
Im Gegensatz dazu zeigen die Figuren 3 und 5, daß das in Beispiel VI in Schüttelkultur erzeugte Celluloseprodukt aus einem Netzwerk von Fäden besteht, die im Querschnitt im allgemeinen kräftiger sind - in einem Bereich zwischen 0,1 bis 0,2 Micron - als bei der in statischen Kulturen gewachsenen Cellulose. Zusätzlich bilden die Cellulosefasern ein Netzwerk von sich eher hauptsächlich verbindenden als sich überlappenden Fasern.

Beispiel IX

Dieses Beispiel zeigt einige der Kennzeichen des erfindungsgemäßen, netzartigen Celluloseproduktes.
Die Einzelblätter wurden aus Proben der von Acetobacter produzierten Cellulose bis zu einem Basisgewicht von etwa 60 g/m² nach dem in TAPPI, offizielles Testverfahren T205 om-81, beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Cellulose wurde von Stamm 1306-3 unter statischen Kulturbedingungen in einer Flaschenkultur unter Verwendung von R20-Medium mit 2 % Glucose produziert. Ein netzartiges Celluloseprodukt wurde mit Stamm 1306-11 in einem Fermenter mit einem Rührpropeller bei 600 Upm unter Verwendung desselben Mediums produziert. Die die Cellulose enthaltende Brühe wurde vor der Celluloseverarbeitung kalt gelagert. Man dispergierte die Cellulose (1,2 g in 2 Liter Wasser) in einem British-Disintegrator mit 150000 Umdrehungen. Die Suspension wurde anschließend in ein Schöpfsieb zur automatischen Blattbildung, enthaltend ein 200-mesh Drahtsieb, gegossen, und man ließ es wenigstens zwei Stunden lang abtropfen. Das feuchte Einzelblatt (15 cm im Durchmesser) wurde aus dem Schöpfsieb entnommen und zunächst zur Entfernung des überschüssigen Wassers vorsichtig zwischen Blättern von saugfähigem Papier gepreßt. Das Blatt preßte man anschließend unterschiedlich lange zwischen Blättern von saugfähigem Papier zur Herstellung von Blättern unterschiedlicher Dichte in einer TAPPI-Presse mit einem Preßdruck von 50 psi (345 kPa). Man trocknete die Blätter am Ende, indem man sie durch einen Noble und Wood- Trommeltrockner für Laboratorien passieren ließ.
Die Zugfestigkeit der Blätter wurde nach dem TAPPI- Verfahren T494 om-81 unter Verwendung eines Instron- Universal-Testinstruments gemessen.
Man fand, daß das netzartige Celluloseprodukt dieses Beispiels bei der Einzelblattbildung beträchtlichen Widerstand gegen Verdichtung zeigte. Mit unterschiedlichen Drücken bei der Naßpressung wurde eine Reihe von Blättern mit Dichten von etwa 300 bis etwa 500 kg/m³ hergestellt. Diese papierähnlichen Blätter weisen trotz der niedrigen Dichten eine sehr hohe Zugfestigkeit auf. Der Zugindex derartiger Blätter mit der vorstehenden Dichte liegt typischerweise zwischen 100 und 150 Newton-Meter/Gramm. Vergleichbare, aus Kraft-Zellstoff hergestellte Blätter mit Dichten unterhalb etwa 500 kg/m³ weisen praktisch keine Zugfestigkeit auf.
Einzelblätter von unter statischen Bedingungen produzierter Cellulose zeigen nicht den vorstehend erwähnten Widerstand gegen Verdichtung. Bezeichnenderweise weisen derartige Celluloseblätter von nicht-geschüttelten Kulturen in Abhängigkeit vom verwendeten Druck beim Naßpressen Dichten von etwa 500 bis etwa 750 kg/m³ auf.

Beispiel X

Dieses Beispiel vergleicht bei zwei Acetobacterstämmen den Widerstand gegen Verdichtung von der unter den Bedingungen einer Schüttelkultur produzierten netzartigen Cellulose und von der unter statischen Bedingungen produzierten nicht-netzartigen Cellulose. Die netzartige Cellulose wurde, wie in Beispiel VI beschrieben, unter Verwendung des Stammes 1306-14 unter Schüttelkulturbedingungen erhalten. Die nicht-netzartige Cellulose erhielt man unter Verwendung des Stammes 1306-3 in statischen Flaschenkulturen mit R20-2-Medium - 2 % Glucose unter den im wesentlichen gleichen, in Beispiel VII beschriebenen, statischen Bedingungen.
Man stellte Einzelblätter aus der netzartigen Cellulose und der statisch produzierten Cellulose bis zu einem Basisgewicht von annähernd 60 g/m² her, wie in Beispiel IX beschrieben, mit der Ausnahme, daß zur Herstellung der Blätter unterschiedliche Preßdrücke verwendet wurden. Die Dichte und weitere Kennzeichen der in diesem Beispiel aus netzartiger und nicht-netzartiger Cellulose produzierten Blätter werden in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Probe Nr. Basisgewicht g/m² Dicke mm Dichte kg/m³ Preßverefahren* Nicht-netzartige Cellulose *Verfahren B enthält einen höheren Preßdruck als Verfahren A

Beispiel XI

Sechs Stämme wurden getestet. 1306-3 und 1306-11 wurden wie hier vorstehend beschrieben untersucht. Man testete zwei hier als 23769A und 23769B bezeichnete Subkulturen von Acetobacter aceti sub sp. xylinum mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 23769. Zusätzlich wurden ebenso der Stamm 31174 der ATCC, der Stamm 8132 der National Collection of Industrial Bacteria (Aberdeen, U.K.) und der Stamm 1499-1 untersucht.
Das Nährmedium der Vor-Impfkultur, der Impfkultur und der Produktionsphasen war CSL Medium mit 4 % (Gew./Vol.) Fructose und 5 % (Gew./Vol.) CSL.
Die Vor-Impfkulturen wurden unter statischen Bedingungen in 100 ml des vorstehend beschriebenen Mediums in einer 750 ml Falcon #3028-Gewebekulturflasche mit 0,01 % des Dow-Corning Antischaummittels 24 bis 48 Stunden lang bei 30ºC gezüchtet. Der gesamte Inhalt der Vor-Impfkultur wurde wie vorher beschrieben vermischt und zur Herstellung einer 5%igen (Vol./Vol.) Impfflüssigkeit für die Impfkultur verwendet. Vor-Impfkulturen wurden zur Untersuchung auf Verunreinigungen auf R20-2-Platten ausgestrichen. Sämtliche Stämme wiesen eine homogene Koloniemorphologie auf, wobei der Stamm 1499, der zu etwa 50 % aus großen Kolonien bestand, eine Ausnahme bildete.
Die Impfkulturen züchtete man unter Schüttelbedingungen drei Tage lang bei 30ºC in 25 ml des vorstehend beschriebenen Mediums in 125 ml Prallblechkolben in einem Reziprokschüttler bei 125 Upm. Eine Probe sämtlicher vermischter Kulturen wurde zur Untersuchung auf Verunreinigungen auf R20-2 Platten ausgestrichen. Sämtliche Stämme wiesen eine homogene Koloniemorphologie auf, wobei der Stamm 1499-1, der zu etwa 50 % aus großen Kolonien bestand, eine Ausnahme bildete. Der gesamte Rückstand der Impfkultur wurde wie vorher beschrieben vermischt und zur Herstellung einer 5%igen Impfflüssigkeit für die Produktionsphase verwendet.
Fermentationskolben von jedem Stamm wurden in Doppelbestimmung bei 30ºC in 125 ml Prallblechkolben in einem Reziprokschüttler bei 125 Upm gezüchtet. Die doppelt vorhandenen Kolben von jedem Stamm wurden an den Tagen 1, 2, 3 und 4 geerntet, wobei der ATCC-Stamm 23769B, der wegen seines spärlichen Wachstums am Tag 7 geerntet wurde, eine Ausnahme bildete. Der Stamm 1499-1 und ATCC-Stamm 31174 produzierten beide unter diesen Bedingungen ein wasserlösliches Polysaccharid (WSP). Die Stämme 1306-3 oder 1306-11 produzierten kein WSP.
Die Celluloseproduktion wurde für jeden Stamm bestimmt und in Tabelle 6 wird darüber berichtet. Die Werte der Celluloseproduktion werden in g/l angegeben. Tabelle 6 Celluloseproduktion verschiedener Stämme 5 % CSL, 4 % Fructose* Stamm Tag 1 *Werte der Celluloseproduktion werden in g/l angegeben ** N.D. = nicht bestimmt

Beispiel XII

Celluloseproduktion in Fermentern:
Vor-Impf- und Impfkulturen wurden zwei Tage lang wie in Beispiel X gezüchtet, mit der Ausnahme des Mediums, das 4 % (Gew./Vol.) Glucose und 5 % (Gew./Vol.) CSL enthielt. Die Impfkulturen züchtete man zwei Tage lang in demselben Medium, mit der Ausnahme, daß das Kulturvolumen 400 ml in 2 l Prallblechkolben betrug.
Zwei Fermenterläufe in l4 l Chemap-Fermentern wurden mit einer 5 % (Vol./Vol.) Impfung in Anfangsvolumina von 12 l durchgeführt. Während des 72 Stunden dauernden Fermenterbetriebs hielt man die Kulturen bei etwa 30ºC (± 1ºC).
In Fermenter Nr. 1 betrug die Glucoseanfangskonzentration 32 g/l. In Fermenter Nr. 2 betrugen die Glucose- und Saccharoseanfangskonzentrationen 10 g/l bzw. 20 g/l. Während der Fermentation setzte man zusätzlich stoßweise 143 g/l Glucose zum Fermenter Nr. 1 zu.
Während der Fermentation setzte man dem Fermenter Nr. 2 stoßweise 50 g/l Glucose und 72 g/l Saccharose zu.
Die Anfangskonzentration von 2 % Vol./Vol. an CSL wurde nach 32 Stunden und 59 Stunden durch Zugabe einer Menge, die 2 Volumenprozenten des Anfangsvolumens entsprach, vergrößert.
Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wurde bei 30 % Luftsättigung gehalten. Sie fiel in der Stunde 69 in Fermenter Nr. 2 etwa 2 Stunden lang beim Fermenterbetrieb auf Null. Anfänglich wurde mit eingestellten 600 Upm gerührt. Mit wachsender Viskosität im Zuge der erhöhten Cellulosekonzentration vergrößerte man die Rührpropellergeschwindigkeit auf 1200 Upm. Die Cellulose-, Gluconsäure- und 2-Ketogluconsäurekonzentrationen werden für Fermenter 1 in Tabelle 7 gezeigt. Die Cellulosekonzentration für Fermenter 2 wird in Tabelle 8 gezeigt. Die maximale Cellulosekonzentration, die im nur Glucose enthaltenden Fermenter Nr. 1 erreicht wurde, betrug 12,7 g/l. Die maximale Cellulosekonzentration, die im Glucose/Saccharose enthaltenden Fermenter Nr. 2 erreicht wurde, betrug 18,3 g/l. Beide Maxima wurden nach 71,6 Stunden in der Fermentation erreicht. Die volumetrischen Produktivitäten in Fermenter Nr. 1 und Nr. 2 zu diesem Zeitpunkt betrugen 0,18 bzw. 0,26 g/l/Std. Tabelle 7 Fermenter Nr. 1:2 % (Vol./Vol.) CSL + 3,2 % (Gew./Vol.) Glucose (anfänglich) Stunden Cellulose g/l Gluconsäure g/l 2-Ketogluconsäure g/l Tabelle 8 Fermenter Nr. 2: 2 % (Vol./Vol.) CSL + 1 % (Gew./Vol.) Glucose + 2 % (Gew./Vol.) Saccharose (anfänglich) Stunden Cellulose g/l

Beispiel XIII

Die in Beispiel XII beschriebene Fermentation wurde unter Verwendung des Stammes 1306-21 an Stelle von 1306-11 und mit den nachfolgenden Veränderungen wiederholt:
1. Die Vor-Kultur und die Kultur wurden in CSL-Medium mit 2 % Glucose und 2 % Maisquellwasser hergestellt.
2. Die Rührgeschwindigkeit überschritt nicht 900 Upm.
3. Die anfängliche Glucosekonzentration betrug 20 g/l und weitere 109 g/l wurden während des Betriebs zugegeben.
4. Die anfängliche CSL-Konzentration betrug 2 % (Vol./Vol.) und weitere 2 % (Vol./Vol.) wurden während des Betriebs nach 27,8 Stunden zugegeben.
Über die bei diesem Lauf beobachteten Cellulose-, Gluconsäure-, 2-Ketogluconsäure- und 5- Ketogluconsäurekonzentrationen wird in Tabelle 9 berichtet. Tabelle 9 Fermentation: Stamm 1306-21 Stunden Cellulose g/l Gluconsäure g/l 2-Ketogluconsäure g/l 5-Ketogluconsäure g/l
Bei einem Vergleich der Ergebnisse von Tabelle 9 mit denen von Tabelle 7 erwies sich Stamm 1306-21 im Hinblick auf die Celluloseproduktion bei gleichzeitiger viel geringerer Säureproduktion als gleich oder besser als Stamm 1306-11. Die niedrigere Säureproduktion sollte theoretisch die Züchtung des Stammes 1306-21 bis zu vergleichbaren Konzentrationen mit einem geringeren Basenzusatz erlauben.

Beispiel XIV

Auswirkungen des Rührens auf die Eigenschaften der Cellulose
Zwei Testreihen wurden zur Beurteilung der Auswirkungen des Rührens im Hinblick auf die nachfolgenden vier Eigenschaften ausgeführt:
1. Einzelblattbildung (TAPPI-Test des Beispiels IX): die Fähigkeit der gereinigten, behandelten und resuspendierten Cellulosefasern aus der Fermentation, auf einem 150-mesh Sieb ein zusammenhängendes Blatt zu bilden. Die Ergebnisse werden nach dem Prozentsatz der resuspendierten, auf dem Sieb zurückgehaltenen Fasern und der qualitativen Bewertung der Integrität des gebildeten Blattes beurteilt.
2. Absetzgeschwindigkeit: die Geschwindigkeit, mit der sich eine verdünnte Probe von Cellulose aus einem Fermenter in einem graduierten Zylinder absetzt. Die abnehmende Höhe der Sediment/Überstand-Phasengrenze der sich absetzenden Suspension von Cellulose wird gegen die Zeit aufgetragen. Die momentane Absetzgeschwindigkeit kann aus der Neigung der Kurve zu einem gegebenen Zeitpunkt bestimmt werden. Die Fähigkeit dazu hängt von Größe und Dichte der Celluloseteilchen ab.
3. Viskosität der Suspension: die Viskosität der Fermenterbrühe der suspendierten Cellulose wurde mit einem mit Glycerinlösungen kalibrierten Thomas-Stormer-Viskometer gemessen. Diese Eigenschaft hängt von der Morphologie der Celluloseteilchen ab.
4. Größe und Morphologie der Teilchen: Diese Eigenschaft wird mit mikrophotographischen Aufnahmen der Fermentercellulose bestimmt.
Die erste Testreihe bestand unter Verwendung von Stamm 1306-11 aus vier Fermenterläufen, wobei zeitabhängig Proben aus 14 Liter fassenden Chemap-Fermentern entnommen wurden, die mit unterschiedlichen maximalen Rührgeschwindigkeiten betrieben wurden. Diese vier Fermenterläufe stellten typische Fermentationen bei der Züchtung von Kulturen dar, erstreckten sich aber zur Beurteilung der Wirkung länger andauernden Rührens über die normale Fermentationsdauer hinaus. Proben dieser Läufe wurden im Hinblick auf die Fähigkeit zur Einzelblattbildung analysiert.
In einer zweiten Serie von Experimenten wurden alte, nicht-wachsende, Cellulose produzierende Kulturen, die man aus einem Fermenterlauf von 250 Litern in vier 14 Liter fassenden Chemap-Fermentern erntete, gerührt. Die Rührgeschwindigkeit blieb in jedem Fermenter konstant, wurde aber unter den Fermentern variiert. Jedem Fermenter wurden zeitabhängig Proben entnommen. Es lag in sämtlichen Fermentern dieser Reihe von Experimenten eine einheitliche Cellulosekonzentration vor, die aber etwa die Hälfte der Konzentration der Endkonzentrationen der ersten Reihe von Experimenten aufwies. In dieser zweiten Reihe von Experimenten wurde Stickstoff mit etwa derselben Gaszufuhrgeschwindigkeit (Luft und Sauerstoff) der ersten Reihe von Experimenten zugesetzt. Proben der zweiten Reihe von Experimenten wurden im Hinblick auf die Einzelblattbildung, Absetzgeschwindigkeit, Viskosität, Größe der Teilchen und Morphologie analysiert.
Die auf Einzelblätter bezogenen Ergebnisse der ersten und zweiten Reihe von Experimenten werden jeweils in den Tabellen 10 und 11 zusammengefaßt. Tabelle 10 Rührgeschwindigkeit (Upm) Zeitpunkt bei dieser Rührgeschwindigkeit (Std.) Blattbildung % Cellulose Rückstand gut* wenig* keine *Diese Blätter aus einer Reihe von Fermenterläufen wiesen ein Sollgewicht von 0,65 bis 0,75 g Cellulose anstelle der gewöhnlichen 1,2 g auf, die das Sollgewicht für den Betrieb mit 1000 Upm darstellten. Tabelle 11 Rührgeschwindigkeit (Upm) Zeitpunkt bei dieser Rührgeschwindigkeit (Std.) Blattbildung* % Cellulose Rückstand gut wenig * Sämtliche Blätter wiesen ein Sollgewicht von 1,2 g auf.
Die Tabelle 10 zeigt, daß sich sowohl eine vergrößerte Rührgeschwindigkeit als auch eine zunehmende Rührdauer nachteilig auf die Einzelblattbildung auswirken.
Die Ergebnisse in Tabelle 11, bei denen stärker verdünnte und nicht wachsende, Cellulose produzierende Kulturen verwendet wurden, zeigten, daß die Einzellblattbildung nicht so empfindlich auf Rührgeschwindigkeit und -dauer wie in Tabelle 10 reagierte. Gute Einzelblätter konnten bis zu 86 Stunden bei 800 Upm oder bis zu 27 Stunden bei 1000 Upm Rührgeschwindigkeit hergestellt werden. Die besseren Ergebnisse in Tabelle 11 können auf die niedrigere Cellulosekonzentration im Fermenter oder auf die höheren Sollgewichte des Blattes zurückgeführt werden.
Weitere Testergebnisse zeigen jedoch während der zweiten Reihe von Experimenten eine Auswirkung von Rührgeschwindigkeit und -dauer auf die Celluloseeigenschaften. Zum Beispiel zeigen die Viskositätsanalysen eine mit der Rührdauer sich vergrößernde Viskosität der Cellulosesuspension im Fermenter bei 800 und 1000 Upm. Die erhöhte Viskosität spiegelt die Morphologieänderung der Cellulose von dichten Teilchen zu weniger dicht gepackten, faserähnlichen Formen. Derartige Veränderungen wurden in den zur Beurteilung von Größe und Morphologie der Teilchen verwendeten mikrophotographischen Aufnahmen beobachtet.
Die Studien zur Absetzgeschwindigkeit zeigten, daß sich die mit höherer Geschwindigkeit und über längere Zeit gerührte Cellulose langsamer absetzt. Diese Ergebnisse stimmten mit den photographischen Mikroaufnahmen überein, die zeigten, daß sich mit erhöhter Rührgeschwindigkeit und - dauer die Celluloseteilchen anscheinend zu kleineren, weniger dicht gepackten Fasern entwickeln. Die allgemeinen Analyseergebnisse der Absetzgeschwindigkeiten, Viskositäten, Teilchengröße und -form und Einzelblattbildung erweisen sich sämtlich als widerspruchsfrei und stimmen bis zu einem bestimmten Grad miteinander überein.
Der Mechanismus der Veränderung der Celluloseeigenschaften mit der Rührgeschwindigkeit und - dauer wird im Augenblick nicht vollständig verstanden. Es ist bekannt, daß erhöhte Rührgeschwindigkeiten die Scherkräfte auf die Celluloseteilchen vergrößern. Jedoch können weitere Kräfte ebenso zur Veränderung der Celluloseeigenschaften beitragen; beispielsweise heftige Torsionsdehnungen und Kavitationskräfte. Darüberhinaus werden die vorstehenden Kräfte und Dehnungen, sowie weitere, auch während der Gewinnung und Reinigung der Cellulose wirksam. Dementsprechend muß während sämtlicher Phasen der Celluloseverarbeitung zur Schadensverringerung an der Cellulose Vorsicht geübt werden.
Die Erfindung stellt auch die Herstellung eines netzartigen Celluloseproduktes mit mikrobiellen Verfahren bereit, bei dem die Cellulosestränge ein im wesentlichen zusammenhängendes Netzwerk von sich verzweigenden, verbundenen Cellulosesträngen bilden. Diese Herstellung kann mit einem als Acetobacter bezeichneten Mikroorganismus erfolgen, der die mit der Fähigkeit zur Produktion eines Celluloseproduktes unter Schüttelkulturbedingungen und einer Frequenz der Änderung zu Cellulose nicht-produzierenden Formen unter Schüttelkulturbedingungen, die bestimmt wird durch das Auftreten von Cellulose nicht-produzierenden Kolonien von weniger als 0,5 % im Verlauf von 42-45 Generationen auf festem Medium besitzt, wobei der Mikroorganismus vorzugsweise eine wesentlich verminderte Produktion von D-Gluconsäure bei der Züchtung auf D-Glucose enthaltendem Medium zeigt.
Man wird dem Vorstehenden entnommen haben, daß die bakterielle Cellulose unter Schüttelbedingungen mit hoher Effizienz für längere Zeiträume produziert werden kann. Vordem stellte sich die andauernde Herstellung von bakterieller Cellulose mit einer hohen Ergiebigkeit als mit Schwierigkeiten und extrem niedrigen Produktivitäten belastet dar. Die hier beschriebene und nachstehend beanspruchte Erfindung stellt eindeutig einen wichtigen Fortschritt in der fermentativen Herstellung von bakterieller Cellulose dar.
Proben der Stämme 1306-3, 1306-11 und 1306-21 wurden nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und der damit zusammenhängenden Bestimmungen (Budapester Vertrag) bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA 20832 hinterlegt. Die Daten der Hinterlegung und die Hinterlegungsnummern werden nachstehend angegeben: Stamm Hinterlegungsnr. Hinterlegungsdatum 13.September 1985 25.Juli 1986
Diese Hinterlegungen wurden in Folge eines Vertrages zwischen der ATCC und dem Anmelder dieser Patentanmeldung, Cetus Corporation, vorgenommen. Diese Vereinbahrung mit der ATCC sieht die ständige Zugänglichkeit dieser Stämme und deren Nachkommenschaft für die Öffentlichkeit vor, nach Erteilung eines U.S. Patentes entsprechend der vorliegenden Anmeldung mit einer Beschreibung und Identifizierung der Hinterlegung, oder nach Veröffentlichung oder Offenlegung einer jeden U.S.- oder ausländischen Patentanmeldung, welche auch immer zuerst erfolgt, und die Verfügbarkeit der Stämme und der Nachkommenschaft gegenüber dem, der durch Bestimmung des Präsidenten des US-Patentamtes dazu berechtigt ist, nach 35 USC Paragraph 122 und den dazu gehörigen Vorschriften des Präsidenten (einschließlich 37 CFR Paragraph 1.14 unter besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) gewährleistet. Der Inhaber der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, daß, falls die hinterlegten Kulturen absterben oder verloren gehen oder vernichtet werden, wenn sie unter geeigneten Bedingungen gezüchtet wurden, sie nach Kenntnisnahme sofort mit lebensfähigen Exemplaren derselben Kultur ersetzt werden.
Die Hinterlegungen nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages stellen die Erhaltung der hinterlegten Kulturen in einem lebensfähigen und unverseuchten Zustand für einen Zeitraum von wenigstens fünf Jahren nach der letzten Anfrage zur Beschaffung einer Probe des hinterlegten Mikroorganismus von der ATCC sicher und auf jeden Fall für einen Zeitraum von 30 Jahren vom Zeitpunkt der Hinterlegung an.
Die Verfügbarkeit der hinterlegten Stämme darf nicht so ausgelegt werden, daß sie eine Lizenz zur Durchführung der Erfindung entgegen den Rechten darstellt, die im Hoheitsbereich einer jeden Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentgesetzen garantiert wird.
Ebenso darf die Erfindung nicht als durch die hinterlegten Stämme in ihrem Schutzbereich begrenzt angesehen werden, da die hinterlegten Ausführungsformen nur besondere erfindungsgemäße Aspekte veranschaulichen sollen. Sämtliche Stämme von Mikroorganismen, die den hinterlegten funktionell äquivalent sind, werden als innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung liegend angesehen. Desweiteren werden verschiedene Modifikationen der Erfindung, die für einen Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung hervorgehen, zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen als im Schutzbereich der angehängten Ansprüche liegend angesehen.
Mit den hier enthaltenen Informationen werden für jeden Fachmann verschiedene Abweichungen von der genauen Beschreibung der Erfindung ohne weiteres ersichtlich sein, auf die sich die Erfindung, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen, bezieht.

Claims

1. Netzartige Cellulose, erhältlich von einem als Acetobacter bezeichneten Mikroorganismus mit der Fähigkeit von Mikroorganismen erhältlich von ATCC 53264, ATCC 53263 und ATCC 53524 zur Erzeugung eines Celluloseproduktes unter Schüttelkulturbedingungen, wobei das Produkt unter Bedingungen einer andauernden Schüttelkultur erhältlich ist, die, unter einem Rasterelektronenmikroskop betrachtet, zu einer netzartig angelegten Struktur mit häufig verdickten Strängen führen, welche Verbindungen unter Entstehung eines gitterartigen Musters erzeugen, das sich in drei Dimensionen erstreckt und bei der Verformung zu Blättern durch Einrichtungen zur Blattherstellung Widerstand gegen Verdichtung zeigt.

2. Blatt, umfassend netzartige Cellulose nach Anspruch 1.

3. Blatt nach Anspruch 2, wobei das Blatt in einem Basisgewicht von etwa 60 g/m² und einer Dicke zwischen etwa 0,15 und etwa 0,22 mm hergestellt wird und eine Dichte von etwa 250 kg/m² bis etwa 430 kg/m³ aufweist.

4. Blatt nach Anspruch 2, wobei das Blatt in einer Dichte im Bereich von etwa 300 bis etwa 500 kg/m³ hergestellt wird und einen Zugindex im Bereich zwischen etwa 100 und 150 Nm/g aufweist.

5. Verfahren zur Herstellung einer netzartigen Cellulose nach Anspruch 1, umfassend: a) Züchtung unter Schüttelbedingungen eines als Acetobacter bezeichneten Mikroorganismus mit der Fähigkeit von Mikroorganismen, erhältlich von ATCC 53264, ATCC 53263 und ATCC 53524 zur Erzeugung eines Celluloseproduktes unter Schüttelkulturbedingungen in einem für Celluloseproduktion geeigneten Flüssigmedium bei einer durchschnittlichen volumetrischen Produktivität von mindestens 0,1 g/l/Stunde über einen Zeitraum von mehr als 70 Stunden, wobei der Mikroorganismus unter Schüttelkulturbedingungen eine Frequenz der Änderung von Cellulose erzeugenden Formen zu Cellulose nicht erzeugenden Formen von weniger als 0,5 % im Verlauf von 42 bis 45 Generationen aufweist, bestimmt durch das Auftreten von Cellulose nicht erzeugenden Kolonien auf festem Medium, und b) Entnahme des erhaltenen netzartigen Celluloseproduktes.

6. Mikroorganismus mit der Bezeichnung Acetobacter mit der Fähigkeit von Mikroorganismen, erhältlich von ATCC 53264, ATCC 53263 und ATCC 53524 zur Erzeugung eines Celluloseproduktes unter Schüttelkulturbedingungen, der unter Schüttelkulturbedingungen eine Frequenz der Änderung von Cellulose erzeugenden Formen in Cellulose nicht erzeugende Formen, bestimmt durch das Auftreten von Cellulose nicht erzeugenden Kolonien auf festem Medium, von weniger als 0,5 % im Verlauf von 42 bis 45 Generationen aufweist.

7. Mikroorganismus mit der Bezeichnung Acetobacter mit der Fähigkeit von Mikroorganismen, erhältlich von ATCC 53264, ATCC 53263 und ATCC 53524 zur Erzeugung eines Celluloseproduktes unter Schüttelkulturbedingungen, der bei der Züchtung auf einem D-Glucose enthaltenden Medium verminderte Mengen an Gluconsäure und Ketogluconsäuren erzeugt.

8. Biologisch reine Kultur von Acetobacter xylinum, erhältlich von ATCC 53264, ATCC 53263 oder ATCC 53524.