NO300551B1 - Fremgangsmåte for bakteriell fremstilling av et polypeptid, preparat som omfatter et slikt, samt rekombinant DNA-vektor - Google Patents
Fremgangsmåte for bakteriell fremstilling av et polypeptid, preparat som omfatter et slikt, samt rekombinant DNA-vektor Download PDFInfo
- Publication number
- NO300551B1 NO300551B1 NO860658A NO860658A NO300551B1 NO 300551 B1 NO300551 B1 NO 300551B1 NO 860658 A NO860658 A NO 860658A NO 860658 A NO860658 A NO 860658A NO 300551 B1 NO300551 B1 NO 300551B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- bgh
- dna
- polypeptide
- sequence
- expression
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 95
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 94
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 56
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 14
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 109
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 108
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 63
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 60
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 60
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 52
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 47
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 41
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 33
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 32
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 84
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 43
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 35
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 30
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 35
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 abstract description 32
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 30
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 22
- 239000004474 valine Substances 0.000 abstract description 20
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 17
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 abstract description 14
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 abstract description 5
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 abstract description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 2
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 abstract 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 56
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 18
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 15
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 14
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 208000021017 Weight Gain Diseases 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 150000002614 leucines Chemical group 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- OJHZNMVJJKMFGX-BWCYBWMMSA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;(2r,3r)-2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)CC(=O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC OJHZNMVJJKMFGX-BWCYBWMMSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one Chemical compound S=C1NC(=O)CN1C1=CC=CC=C1 PQMRRAQXKWFYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N Ala-Phe-Pro Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)C(=O)N1[C@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- 241001298245 Lauria Species 0.000 description 1
- WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N Met-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- FMYLZGQFKPHXHI-GUBZILKMSA-N Met-Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FMYLZGQFKPHXHI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VWWGEKCAPBMIFE-SRVKXCTJSA-N Met-Met-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VWWGEKCAPBMIFE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N Met-Pro Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical group CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- -1 bGH(L) Natural products 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical group BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000001904 diabetogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000003715 nutritional status Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000135 prohibitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008684 selective degradation Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009645 skeletal growth Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002628 somatotropin effect Effects 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 108010036387 trimethionine Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/168—Steroids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/184—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/10—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for ruminants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Birds (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse er rettet på en fremgangs-
måte for bakteriell fremstilling av et polypeptid med et N-terminalt alanin, og som har somatotropinaktivitet og melkedannelsesøkende virkning. Videre er oppfinnelsen rettet på et preparat som omfatter pGH(A) fremstilt ved fremgangsmåten. Endelig er oppfinnelsen rettet på rekombinant DNA-vektor .
Selv om de samme grunntrinn for gentranskripsjon til budbringer-RNA (mRNA) og derpå følgende translasjon av denne mRNA til proteiner er felles ved ekspresjon av gener hos eukaryoter og prokaryoter, anvendes det forskjellige sett av intracellulære kontrollmidler for disse trinnene.
I eukaryoter translateres dertil mange fullt utviklede proteiner først som forløper-proteiner; dvs. polypeptider bestående av det fullt utviklede proteins sekvens bundet til en leder- eller signalsekvens. Eukaryot mRNA koder for hele forløper-proteinet som bearbeides etter translasjon for å fjerne ledersekvensen og tilveiebringe det fullt utviklede protein. Mens eukaryote celler er utstyrt for spesifikt å bearbeide slike forløperproteiner til fullt utviklede proteiner, er prokaryote celler vanligvis ikke i stand til å gjenkjenne bearbeidingssignalene som er tilstede i de eukaryote proteiner. Dersom fullstendige, komplementære DNA (cDNA) transkripter av eukaryot mRNA anvendes som DNA-sekvensene for ekspresjon i prokaryoter, får man derfor forløperproteinet og ikke det fullt utviklede protein. Det er mulig å omdanne forløperproteiner til fullt utviklede proteiner in vitro,
men ikke uten betydelig kostnad.
I det tilfelle at DNA-sekvensen som koder for det fullt utviklede protein, brukes for ekspresjon av fullt utviklet protein i prokaryoter, vil denne sekvens mangle bearbeidingssignalene for den eukaryote translasjon og post-translasjon som vanligvis finnes i DNA for ledersekvensen. For ekspre-
sjon av klonede eukaryote gener eller andre heterologe DNA-sekvenser i prokaryote systemer har det derfor vist seg ønskelig å anvende prokaryote kontrollsignaler av effektivitets-
grunner og fordi eukaryote signaler ikke behøver å bli gjen-kjent av en prokaryot vertcelle.
Uttrykket "heterolog DNA" er her definert som DNA hvor minst én del vanligvis ikke finnes i genomet til vertcellen. Eksempler på heterolog DNA omfatter, men er ikke begrenset til, virale og eukaryote gener, genfragmenter, alleler og syntetiske DNA-sekvenser. Uttrykket "heterologt protein" eller "heterologt polypeptid" er her definert som et protein eller polypeptid hvor minst én del vanligvis ikke er kodet for i genomet til vertcellen.
De prokaryote kontrollsignaler omfatter en promoter
som signaliserer oppstartingen av transkripsjon, og kontrollsignaler for translasjon omfattende et ribosombindende sete, et startsignal for translasjon og et stoppsignal for translasjon. Alle disse signaler bortsett fra stoppsignalet for translasjon må befinne seg foran det eukaryote gen eller annen DNA som skal uttrykkes.
Innen teknikken er det tatt i bruk flere fremgangsmåter for uttrykking av heterolog DNA (f.eks. eukaryote gener) i prokaryoter. Ved én fremgangsmåte ligeres DNA-segmentet som koder for det resulterende protein, til den DNA som koder for hele eller en del av et bakterieprotein under kontroll av dens bakterielle promoter. Den endogene prokaryote DNA inneholder også nødvendigvis ribosombindingssetet og startsignalet for translasjon. Ekspresjon av slik ligert DNA resulterer i det som kalles et fusjonsprotein bestående av det eukaryote polypeptid bundet til eller kondensert med et helt eller en del av et bakterieprotein. Isolering av det eukaryote protein kan så oppnåes ved hjelp av stedspesifikk enzymatisk eller kjemisk spalting i kondensasjonsstedet i det endogene eukaryote protein eller ved hjelp av selektiv nedbrytning av de prokaryote polypeptidsekvenser.
Eksempler på publiserte forskningsarbeider vedrørende produksjon i bakterier av eukaryote fusjonsproteiner omfatter EP patentsøknad nr. 47600 (publisert 17. mars, 1982) som vedrører fusjons- og ikke-fusjonsproteiner som omfatter bovint forløper-veksthormon eller bovint veksthormon ("bGH")
i carboxyl (C)-enden, med eller uten en del av et prokaryot protein i amino (N)-enden; GB patentsøknad nr. 2 073 245A
(publisert 14. oktober, 1981) som vedrører fusjonsproteiner av bGH og E. Coli 3-lactamase; E. Keshet et al., Nucleic Acid Research, 9:19-30 (1981) som vedrører et fusjonsprotein av bGH og E. coli 3-lactamase; EP patentsøknad nr. 95361 (publisert 30. november, 1983) som vedrører et fusjonsprotein omfattende i rekkefølge et endogent protein i N-enden, en startsignalaminosyre for translasjon, et entero-kinase-spaltingssete og et exogent protein (f.eks. vektshor-mon) i C-enden. Denne fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsprotein er imidlertid tungvint ettersom den krever in vitro bearbeiding etter rensing, og kostnaden forbundet med enzym(er) for bearbeiding av kommersielle mengder kan være uoverkommelig.
Fusjonsproteiner har imidlertid blitt et attraktivt system for uttrykking av noen eukaryote gener eller annen heterolog DNA i prokaryote celler ettersom fusjonsproduktet synes å beskytte noen av de resulterende heterologe proteiner mot intracellulær nedbrytning. Bakterieceller synes å gjenkjenne enkelte eukaryote proteiner, som produseres i disse, som fremmede og fortsetter med å nedbryte disse proteinene xså snart som proteinene lages eller like etterpå. Fusjonsproteiner bygget for beskyttelsesformål kan anvende endogene polypeptidsekvenser enten i amino- eller carboxyl-enden i det heterologe protein. Et eksempel på en nyere fremgangsmåte finne i EP patentsøknad nr. 111814 (publisert 27. juni, 1984) som beskriver fusjonproteiner omfattende en form for bGH med en syntetisk front-endé (amino-ende) og
E. coli 3-galactosidase i C-enden. Igjen er fordelene redusert., gjennom behovet for etterfølgende spalting av det heterologe protein fra det endogene polypeptid som omtalt ovenfor.
Ved en annen fremgangsmåte er startsignalet for translasjon, ATG, under kontroll av en bakteriepromoter lokalisert umiddelbart foran DNA-sekvensen som koder for et heterologt (f.eks. eukaryot) protein som er fritt for endogent protein både i N- og C-enden i det fremstilte protein. Selv om proteinene fremstilt ved hjelp av slike genkonstruksjoner ikke behøver etterfølgende spalting for å frembringe det ønskede protein, omfatter de vanligvis en methioninrest (i noen tilfeller en formyl-methioninrest) i N-enden ettersom ATG-startsignalet også er et methionin-kodon. Med mindre det ønskede fullt utviklede protein begynner med methionin, vil således proteinet nå ha en N-ende som er forandret ved innlemning av methioninresten.
Eksempler på slike genoppbygninger omfatter Guarente
et al., Cell (1980) 20:543-553 hvor (3-globin-genet fra kanin som har et N-terminalt valin, uttrykkes i E. coli under anvendelse av den genkonstruksjon som nylig er beskrevet. Forskerne fant at mens "det i 3-globin fra kanin ikke er noe aminoterminalt methionin, og leuciner er å finne i stillingene 3, 14, 28, 31, 32...., ble leuciner i det merkede protein funnet i stillingene 4, 15, 29, 32 og 33, og methionin ble funnet i stilling 1. Dette resultat viser at proteinet er kanin-3~globin pluss et aminoterminalt methionin som ikke fjernes i E. coli". Id på sider 546-547.
Et annet eksempel vedrører produksjon av veksthormoner i bakterier under anvendelse av den ovenfor beskrevne genkonstruksjon. Schoner et al., Proe. Nat' l. Acad. Sei. U. S. A. (1984) 81:5403-5407 beskriver et ekspresjonssystem på høyt nivå i bakterier for produksjon av bGH som resulterer i produksjon av et N-methionyl-bGH; dvs. en forbindelse med en aminosyresekvens svarende til aminosyresekvensen til en av de naturlig forekommende bGH-former pluss en methioninrest i dens N-ende. Addisjonen av et N-terminalt methionin til forskjellige former av veksthormon produsert i bakterier er videre omtalt i EP patentsøknad nr. 103 395 (publisert 21. mars 1984) og EP patentsøknad nr. 75444 (publisert 30. mars 1983) for bGH, og Seeburg et al., DNA (1983) 2:37-45,
for bGH og porcint veksthormon ("pGH").
Addisjon av et N-terminalt methionin til den naturlig forekommende N-ende kan være uønsket av flere grunner. For det første er det mulig (selv om det for tiden ansees for lite sannsynlig) at methioninet kan være tilbøyelig til å gjøre proteinet antigent i en organisme hvor proteinet uten N-methioninet er endogent. For det andre kan addisjonen av methionin til N-ende-delen i proteinet ha en uønsket virkning på dets bioaktivitet eller dets fysiske egenskaper. For det tredje kan denne endrede form av proteinet hemme vitenskape-lige forsøk på å bestemme forholdet mellom det naturlig forekommende proteins virkning og dets struktur. Videre kan det være fordelaktig å ha et biosyntetisk protein som struktu-
relt sett ligger så nært opp til et naturlig forekommende protein som mulig når det søkes offentlig godkjennelse for medi-sinske eller veterinærmedisinske anvendelser.
Evnen til slike prokaryoter som bakterier når det gjelder å fjerne det N-terminale methionin fra proteiner enten under produksjonen av disse eller etterpå, har vært et emne av betydelig interesse. F.eks. undersøkte Waller, J. Mol. Biol.
(1963) 7:483-496 den N-terminale aminosyresammensetning i "oppløselige" og ribosomale proteiner fra et cellefritt ekstrakt av E. coli, og EP patentsøknad nr. 1033 95 (publisert 21. mars, 1984) beskriver fjerningen av et N-terminalt methionin fra et eukaryot protein produsert i E. coli. Nærmere bestemt fjernes methionin fra én av to bakterielt produserte bGH-proteiner hvorav begge inneholder en serinrest umiddelbart foran det opprinnelig tilstedeværende N-terminale methionin. Den genoppbygning som ble anvendt ved disse undersøkelser, omfattet imidlertid en syntetisk startsekvens som kodet for 5'-methionin-serin-leucin-3<1> innskutt umiddelbart i nærheten av 5'-enden til en bGH-kodende sekvens hvor baser som kodet for de fire første eller 9 naturlig forekanmende.aminosyrer var blitt fjernet. Det resulterende protein fremstilt i E. coli var således et ikke-naturlig-forekommende protein. GB patent-søknad nr. 2 073 245A (publisert 14. oktober, 1981) beskriver at når met pro erstatter ala i det fullt utviklede bGH-protein, "kan met bearbeides av bakterier slik at det fåes modifisert bGH som starter med aminosyresekvensen Pro Phe Ala Pro".
Følgelig er det behov for å utvikle en økonomisk og for-utsigbar måte å fremstille heterologe (f.eks. eukaryote) proteiner som ikke har et N-terminalt methionin, i slike mikroorganismer som bakterier. Spesielt er det særlig ønskelig å utvikle en fremgangsmåte hvorved slike proteiner produseres i bakterier som ikke krever in vitro bearbeiding etter fermentering og ikke inneholder et ytterligere, ikke-naturlig forekommende N-terminalt methionin.
Veksthormoner (også kalt somatotropiner) er polypeptider fremstilt og utskilt av celler i hypofysen og er stort sett artsspesifikke i sine virkninger. I tillegg til deres rolle når det gjelder å fremme skjelettvekst, påvirker veksthormoner en rekke forskjellige metabolske prosesser, deri-blant stimuleringen av melkeproduksjon, økt insulinfri-givelse fra bukspyttkjertelen og glukagonutskillelse, og de utøver en lipid-mobiliserende virkning. Exogen administrering av bGH til kveg har f.eks. vist seg å øke melkeproduksjon, forutnyttelse og/eller veksthastighet, nedsette opp-fetningstid og øke forholdet mellom magert og fett kjøtt. Det er imidlertid fortsatt ikke fullstendig forstått hvordan hormonet utøver disse multiple virkninger.
Utstrakt forskning med humant veksthormon (hGH) har fastslått at hormonet, slik det utskilles fra bukspyttkjertelen hos menneske, ikke er en enkel molekylær enhet, men en blanding av polypeptider. Fraksjonering av forskjellige hGH-former har resultert i fremstillingen av visse hGH-frak-sjoner med hverken diabetogene eller lipolytiske virkninger.
På samme måte produseres bGH i kveg i flere former. Spesielt fremstilles det fire former bGH som adskiller seg
på to steder i proteinet. Den N-terminale aminosyre kan variere på grunn av en antatt flertydighet når det gjelder fjerning av signalpeptid (leder) sekvensen slik at det ferdig utviklede protein begynner med enten N^-phe-pro eller NH2~ ala-phe-pro. Dertil er det en uensartethet ved aminosyre 12 6 som er enten leucin eller valin. Dette skyldes åpenbart en allelvariasjon i den bovine populasjon. Wallis (1969)
FEBS Letters 3:118-120; Fellows and Rogol (1969) J. Biol Chem. 244:1567-1575; Fernadez et al (1971) FEBS Letters 18:53-54; Fellows (197 3) "Personal comments" i Recent Progress in Hor-mone Research 29:404; Santome (1973) Eur. J. Biochem. 37: 164-170; Graf and Li (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm. 56:168-176. De fire molekylære former (arter) av hypofyse-bGH er her betegnet og forkortet på følgende måte:
Formene bGH(A,V) og bGH(V) er her noen ganger henvist samlet til som "valinholdige allele bGH-former" eller "valin-holdige bGH-former". På samme måte er formene bGH (A,L) og bGH(L) noen ganger henvist samlet til som "leucinholdige allele bGH-former" eller "leucinholdige bGH-former". De tallene som er tildelt aminosyrene i bGH-proteinene som forkortet ovenfor, er kun for identifikasjons- og henvisnings-formål.
Mills et al. (1970), J. Biol. Chem. 245:3407-3415, konkluderte forsøksvis ut fra analyse av cyanbromidfragmenter at porcint veksthormon hadde N-endeheterogenitet, og kunne ha enten et N-terminalt fenylalanin, som tidligere rapportert, eller et N-terminalt alanin. Alaninresten som Mills et al. forsøksvis konkluderte med, var imidlertid en N-terminal rest som var delt av et ala-met-dipeptid som i virkeligheten opp-trer i porcint veksthormon i aminosyrestillingene 3 og 4.
De fullstendige, kodende DNA-sekvenser og tilsvarende aminosyresekvenser for bGH(L) og pGH(P), dvs. porcint veksthormon med et N-terminalt fenylalanin, er blitt publisert av Seeburg et al., DNA (1983) 2:37-45. Når fenylalanin i porcint veksthormon i overensstemmelse med et aspekt ved foreliggende oppfinnelse har et ytterligere alanin foran seg, se eksemplene nedenunder, henvises det her til som pGH(A).
Hypofyseceller fra enkeltstående kveg har generelt blitt funnet å inneholde en blanding av minst bGH(A,L) og bGH(L) eller bGH(A,V) og bGH(V). N-ende-analyse av bGH-proteiner produsert i dyrkede hypofyseceller viser en omtrentlig 50:50 blanding av molekyler som inneholder enten et N-terminalt fenylalanin (phe) eller et N-terminalt alanin (ala). Kommersielt tilgjengelige preparater laget av forente hypofyser fra mange kveg omfatter vanligvis alle fire molekylære former av hypofyse-bGH. Videre er det blitt rapportert at ca. 30% av molekylene i bGH-preparater erholdt fra forente kjertler har valin i stedet for leucin i stilling 126. Ferandez et al (1971)
FEBS Letters 18:53-54. Standard biokjemiske metoder for sepa-rering av de fire kjente bGH-former tillater ikke produksjon av hver eller noen av disse formene i en kommersiell skala. Forskjellige biologiske virkninger hos disse fire formene av bGH ville fordelaktig bli undersøkt og gjort kommersielt tilgjengelige ved å bruke hver av formene hovedsakelig fri for én eller flere av de øvrige tre formene, og/eller fri for andre proteiner av bovin opprinnelse. Uttrykket "i det vesentlige ren" slik det her er brukt for å beskrive et bestemt protein eller bestemte proteiner, betyr i det vesentlige fri for proteiner og/eller andre stoffer som proteinet eller proteinene er bundet til i en naturlig omgivelse eller kilde. Av denne og andre grunner omfatter formålet ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringelsen av en fremgangsmåte'hvorved i det minste noen av de individuelle formene av bGH lettvint kan fremstilles .
Følgelig er det et formål ved foreliggende oppfinnelse
å tilveiebringe en fremgangsmåte for bakteriell fremstilling av et polypeptid med et N-terminalt alanin, og som har somatotropinaktivitet og melkedannelsesøkende virkning.
Det er et annet formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe et preparat som omfatter porcint veksthormon fremstilt ved fremgangsmåten.
Nok et annet formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en rekombinant DNA-vektor med en kodende sekvens for et slikt pGH(A)-polypeptid.
Et ytterligere formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en rekombinant vektor som er i stand til å uttrykke bGH(A,L) og bGH(A,V).
De bGH-polypeptider som fremstilles ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, gir et middel for potensering av slike somatotropin-virkninger som økt melkeproduksjon, veksthastighet og/eller forutnyttelse.
Disse formål ved oppfinnelsen vil fremkomme mer fullstendig i den generelle og detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen nedenunder.
Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebrakt en fremgangsmåte for bakteriell fremstilling av et polypeptid med et N-terminalt alanin, og som har somatotropinaktivitet og melkedannelsesøkende virkning, hvor polypeptidet er valgt fra gruppen bestående av bovint veksthormon bGH(A,L) og bGH(A,V), og porcint veksthormon pGH(A), idet ekspresjonsplasmidet er illustrert ved pMON 3209, pMON 3215 eller
pMON 3213 i figurene 5, 6 og 10. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at ekspresjon av heterolog DNA i Escherichla coli forårsakes, idet den nevnte DNA inneholder kodonene for polypeptidet, inkludert et alaninkodon umiddelbart nedstrøms fra et metioninkodon som er translasjonsstartsignalet for polypeptidet, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, hvor ekspresjonen resulterer i fremstilling i de utvalgte bakterier av et fullt ferdig polypeptid med et N-terminalt alanin, og det resulterende polypeptid med et N-terminalt alanin fremstilt i bakteriene utvinnes.
Videre er det tilveiebrakt et preparat som er kjennetegnet ved at det omfatter pGH(A) fremstilt bakterielt ifølge kravene 1-6 som er i det vesentlige fritt for andre porcine molekylarter, i kombinasjon med fysiologisk akseptable bærere.
Det er ved foreliggende oppfinnelse også tilveiebrakt en rekombinant DNA-vektor som er kjennetegnet ved at den er illustrert ved pMON 3213 i figur 10 og valgt fra et bakterielt plasmid og en bakteriofag som hver har innføyd DNA som inneholder et metioninkodon, umiddelbart etterfulgt av en kodende sekvens for et pGH(A)-polypeptid, inkludert et alaninkodon umiddelbart nedstrøms for metioninkodonet, hvor metioninkodonet tjener som translasjonsstartsignalet for polypeptidet, og hvor vektoren inneholder transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som er i stand til å styre ekspresjon av den nevnte DNA i bakterier.
Endelig er det ved foreliggende oppfinnelse tilveiebrakt en rekombinant vektor som er i stand til å uttrykke bGH(A,L) og bGH(A,V). Denne vektoren er kjennetegnet ved at den er illustrert ved pMON 3209 og pMON 3215 i figurene 5 og 6, og at den videre separat inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte protein med et N-terminalt alaninkodon og et metioninkodon som tjener som translasjonsstartsignal, og hvor DNA-sekvensen er etterfulgt av et translasjonsstoppsignal, og er i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som muliggjør ekspresjon i E. coli.
I de skjematiske fremstillinger representerer den skraverte ramme den DNA-sekvens som koder for en bakteriepromoter, den svarte ramme representerer ytterligere DNA-sekvenser som koder som avmerket, og retningspilen viser ret-ningen fra 5' til 3' i DNA-kodingssekvensene. Relevante steder for restriksjonsendonuklease er også vist. De således avmerkede DNA-områder er kun for skjematiske fremstillingsformål og er ikke tegnet i skala. Fig. 1 viser konstruksjonen av Ml3mp8/xbal som omfatter en Ml3mp8-vektor hvor det ved restriksjonsendo-nukleasestedet for Smal er innskutt et restrik-
sjonsendonukleasested for Xbal. Fig. 2 viser konstruksjonen av Ml3mp8/BGH , som omfatter M13mp8/Xbal med en DNA-sekvens som koder for bGH(L). Fig. 3 viser frembringelsen av en DNA-sekvens som koder for bGH(A,L) ved hjelp av oligonukleotid-styrt sted-spesifikk mutagenese. Fig. 4 viser frembringelsen av en DNA-sekvens som koder for bGH(A,V) ved hjelp av oligonukleotid-styrt sted-spesifikk mutagenese. Fig. 5. viser konstruksjonen av en pMON3209 ekspresjonsvektor som omfatter pBGH , med en DNA-sekvens som koder for bGH(A,L) i stedet for en DNA-sekvens som koder for bGH(L). Fig. 6 viser konstruksjonen av en pMON3215 ekspresjonsvektor som omfatter pBGH , med en DNA-sekvens som koder for bGH(A,V) i stedet for en DNA-sekvens som koder for bGH(L). Fig. 7 viser konstruksjonen av Ml3mp9/PGH j, L som omfatter M13mp9 med en DNA-sekvens som koder for
pGH(P) . Fig. 8 viser frembringelsen av en DNA-sekvens som koder for pGH(A) ved hjelp av oligonukleotidstyrt stedspesifikk mutagenese. Fig. 9 viser konstruksjonen av pBGH _^ x som omfatter pBGH , hvor EcoRI restriksjonsendonuklease-stedet beliggende oppstrøms for 5<1->enden i DNA-sekvensen som koder for ptrp, er blitt fjernet. Fig.10 viser konstruksjonen av en pMON3213 ekspresjonsvektor som omfatter pBGH , 54 med en pPGH (A)-kodende DNA-Sekvens i stedet for en DNA-sekvens som koder for bGH(L).
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer som nevnt, en fremgangsmåte for bakteriell fremstilling av et polypeptid med et N-terminalt alanin. Polypeptidet fremstilles således uten et N-terminalt methionin, og behovet for in vitro bearbeiding for å fremstille et slikt polypeptid uten et N-terminalt methionin er eliminert. Den gjennomførte fremstilling av et slikt polypeptid som mangler et N-terminalt methionin i den sekvensen som genet koder for, er et nytt og helt uventet resultat.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en verdifull fremgangsmåte for produksjon av i det vesentlige rene proteiner som har et N-terminalt alanin. Slike proteiner omfatter de angitte arter av bovint og porcint veksthormon.
I eksemplene på foreliggende oppfinnelse hvor i det vesentlige rene arter av bGH eller pGH fremstilles ved hjelp av bakterieceller, mangler det helt klart tegn på og beskrivelse av fjerning av det N-terminale methionin. Faktisk rapporteres det i alle beskrivelser av bGH-ekspresjon ved hjelp av bakterieceller hvor N-enden omfatter en N-terminal aminosyresekvens som er homolog med naturlig forekommende bGH-arter, tilstedeværelsen av et N-terminalt methionin. I Seeburg et al., DNA (1983) 2:37-45 ble på side 44 gensekvensen for bGH-artene med N-terminalt fenylalanin, f.eks. bGH(L), bevisst valgt for ekspresjon i E. coli delvis for å unngå den forventede addisjon av en andre hydrofob aminosyre (methionin) til det hydrofobe N-terminale alanin i den andre bGH-art,dvs. bGH(A,L). Hittil tilgjengelige undersøkelser beskriver således en bibeholdelse av det N-terminale methionin i bakterie-produserte arter av bGH. Uansett disse rapporter ble det bestemt at det av de ovenfor omtalte grunner, foreligger et behov for å fremstille begge de to bGH-arter, bGH(A,L) og bGH(A,V), og pGH-arten pGH(A). Forsøk på å fremstille disse somatotropinarter i bakterier ble imidlertid gjennomført under den forventning at de fremstilte polypeptider ville inneholde et N-terminalt methionin.
Som nærmere beskrevet i eksemplene nedenunder, var fremgangsmåtene for fremstilling av bGH(A,L), bGH(A,V) og pGH(A) i bakterier i korte trekk som følger. De DNA-sekvenser som koder for de tidligere nevnte proteiner, ble konstruert ved hjelp av oligonukleotid-styrt stedspesifikk mutagenese av av de DNA-sekvenser som koder for bovine og porcine somatotropinarter som inneholder et N-terminalt fenylalanin som vist i figurene 3, 4 og 8. Deretter ble det innskutt sekvenser som koder for bGH(A,L), bGH(A,V) og pGH(A) i ekspresjonsvektorer slik at den endelige gensekvens omfattet i rekkefølge en promoter, et ribosombindende sted, et ATG start/methionin-kbdon i umiddelbar nærhet av den DNA-sekvens som koder for enten bGH(A,L), bGH(A,V) eller pGH(A), og et kodon for translasjonsstopp. Deretter ble E. coli transfektert med en bestemt ekspresjonsvektor som bar den ønskede gensekvens, og dyrket under betingelser som ville muliggjøre ekspresjon av den ønskede heterologe DNA og produksjon av det ønskede heterologe protein. De således fremstilte proteiner ble deretter sekvensbestemt og styrkebestemt med hensyn på vedkommende biologiske virkning.
Det er således oppdaget at når en DNA-sekvens som inneholder et startsignal/methionin-kodon umiddelbart etterfulgt av kodonene for et heterologt N-alanyl-holdig polypeptid uttrykkes, har det protein som utvinnes fra den prokaryote organisme faktisk alanin i N-enden, og ikke methionin. Det antas at et lignende resultat lar seg oppnå når det umiddelbart forut for alaninkodonet er opp til ca. 3 fortløpende methioninkodoner som omfatter startsignalet for translasjon av den mRNA som koder for det ønskede polypeptidprodukt. F.eks. kan den DNA som omfatter det translasjonsstartsignalet og kodonene for det ønskede polypeptidprodukt, omfatte enhver sekvens som passende koder for met ala, met met ala, met met met ala, eller en hvilken som helst funksjonell ekvivalent derav.
Et N-alanylholdig polypeptid er her definert som et polypeptid med alanin i aminoenden. Selv om man ikke ønsker å være bundet av den følgende mekanismeteori, antas det at det N-terminale methionin i polypeptidet etter translasjon fjernes enzymatisk av prokaryoten dersom den neste aminosyre er alanin eller en annen aminosyre med lignende egenskaper (f.eks. polaritet eller hydrofobisitet) som letter slik fjerning av N-methioninet. Det antas videre at mange prokaryoter er i stand til å fjerne N-terminale methioniner fra heterologe og/eller endogene polypeptider når de N-terminale methioniner umiddelbart etterfølges av alanin.
Disse prokaryoter (som er kjent og allment tilgjengelige fra anerkjente deponeringsinstitusjoner for mikroorganismer, som f.eks. ATCC, eller tilgjengelig på annen måte) omfatter E. coli og forskjellige stammer derav. Faktisk forventes det at enhver E. coli som er i stand til å produsere et polypeptid med et N-terminalt alanin fra en DNA-kodende sekvens som begynner med fra 1 til ca. 3 sammenhengende methioninkodoner umiddelbart etterfulgt av et alaninkodon, potensielt kan brukes ved utøvelsen av oppfinnelsen som her er beskrevet. Kommersielt og på andre måter tilgjengelige E. coli-organismer kan undersøkes med hensyn på evne til
å produsere slike N-alanyl-holdige polypeptider ved å inn-føre i genomet til organismene et gen som omfatter i rekke-følge en promoter som virker i organismen, DNA som koder for et ribosombindende sted, fra 1 til ca. 3 sammenhengende methi-
oninkodoner inkludert et startsignal for translasjon umiddelbart etterfulgt av kodonene for et heterologt N-alanyl-holdig polypeptid og et stoppsignal for translasjon, deretter frembringe ekspresjon av genet og så bestemme den N-terminale aminosyresekvens i det således fremstilte heterologe polypeptid. Når en slik e. coli-organisme er funnet å produsere et slikt heterologt N-alanyl-holdig polypeptid internt, tilhører organismen den gruppe som er definert som "utvalgt" for for-målene ved foreliggende beskrivelse og krav.
Ved en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse oppviser tre forskjellige isolater av E. coli stamme K12 som alle er blitt deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland og har fått deponeringsnumrene ATCC 39936, 53010 og 53009, en evne til å fjerne N-terminale methioniner når de N-terminale methioniner umiddelbart etter-følges av alanin.
Foreliggende oppfinnelse er viktig ettersom den tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling i prokaryoter av heterologe polypeptider med alanin i N-enden.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes som nevnt til å fremstille to bGH-arter, bGH(A,L)
og bGH(A,V), og en pGH-art, pGH(A), som er frie for andre bovine eller porcine proteiner og/eller henholdsvis andre bGH- eller pGH-arter. Nærmere bestemt sørger fremgangsmåten for fremstilling av bGH(A,L), bGH(A,V) eller pGH(A) som enkeltstående arter. Evnen til å fremstille en enkelt bGH-eller pGH-art med aminosyresekvenser som er homologe med naturlig forekommende somatotropiner, har veldig stor betyd-ning for bestemmelse av den nøyaktige biologiske reaktivitet til hver bGH- eller pGH-art når man kjenner de mange for-sterkende virkninger av bGH og pGH generelt som referert ovenfor. Det er faktisk funnet at administrering av en av de to N-alanyl-holdige bGH-arter gir en forsterkning av slike bGH-funksjoner som melkeproduksjon. Videre er det funnet at administrering av en melkedannelsesøkende mengde av bGH(A,V) fremstilt i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, øker melkeproduksjonen i melkekyr i en statistisk (f.eks. p<0,05) større utstrekning enn bGH(A,L) fremstilt på
lignende måte. Hittil har det ikke vært noen beskrivelse av den relative effektivitet mellom bestemte bGH-former (arter) når det gjelder økning av melkeproduksjon i melkedannende pattedyr. Videre har det ikke vært noen tidligere resultater in vivo eller in vitro som har antydet at en forskjell i biologisk aktivitet mellom bGH-arter ville kunne iakttas. Det funn at valinholdige allele bGH-arter resulterer i en større økning i melkeproduksjon enn de leucin-holdige allele bGH-arter, var således både overraskende og uventet. Dette funn antyder videre at forskjeller i de relative effektiviteter av bGH-arter når det gjelder forsterkning av slike andre vekst-hormonegenskaper som økt forutnyttelse og vekststimulering, kan bestemmes på lignende måte. Ved således å anvende fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse som muliggjør produksjonen i bakterier av minst to av de molekylære former av hypofyse-bGH i hovedsakelig ren form, og/eller ved å anvende andre tilgjengelige teknikker, kan det nå fremstilles de bGH-arter som er mest effektive når det gjelder å oppnå en bestemt veksthormonindusert respons. Slike andre tilgjengelige teknikker omfatter, men er ikke begrenset til, kjemisk syntese av hele bGH-proteiner eller fragmenter derav, og/eller produksjon i andre mikroorganismer som f.eks. gjær, eller patte-dyrceller ved å bruke kjente teknikker med rekombinant DNA.
Selv om man ikke ønsker å være bundet av den følgende mekanismeteori, synes det som om substitusjonen av leucin med valin i posisjon 126 øker den biologiske tilgjengelighet av og/eller biologiske reaktivitet til slikt somatotropin-protein eller slike somatotropinproteiner. Nærmere bestemt indikerer røntgenkrystallografi utført på somatotropinproteiner at området i proteinene fra ca. aminosyre 90 til ca. aminosyre 135 utgjør et forholdsvis fleksibelt område. Under-søkelse av andre proteiner har vist at fleksible områder ofte omfatter et biologisk reaktivt sted (f.eks. et sted som rea-gerer med biologiske reseptorer og/eller andre deler av det samme protein slik at det fåes en biologisk aktiv form). Det forventes derfor at ytterligere varianter av bGH(A,V) som omfatter aminosyresubstitusjoner, -fjerninger, -addisjoner og/eller -inversjoner innenfor dette beskrevne fleksible område og/eller utenfor området som likeledes resulterer i en målbar økning av melkedannelse (f.eks. melkeproduksjon) i en større utstrekning enn ellers identisk leucin-holdig bGH-art eller bGH(A,L), kan lages. Hindringer ved eller i nærheten av aminosyrestilling 126 kan f.eks. omfatte en substitusjon av andre mer hydrofile og/eller mindre aminosyrer (i forhold til leucin) forutsatt at den beskrevne økning i melkeproduksjon ikke reduseres i en utolererbar grad.
Videre forventes det at valin-holdig bGH-art som inneholder N-terminalt phe^, eller et N-terminalt ala_1#kan opp-
nå den beskrevne økning i melkeproduksjon når de administreres til kyr. Det forventes også "'"at endringer i aminosyreenden (f .eks. met_^) som ikke vesentlig skiller seg fra N-enden i naturlig forekommende bGH, ikke vil virke inn i en utolererbar grad på valin-holdige bGH-arters evne til å øke melkeproduksjon i en målbar større utstrekning enn ellers identiske leucin-holdige bGH-arter eller bGH(A,L). Det forventes videre at et bGH-preparat hvor konsentrasjonen av valin-holdige bGH-arter, basert på vekten av alt bGH i blandingen, er vesentlig større enn konsentrasjonen av valin-holdige bGH-arter i forent hypofyse-bG.H-preparat, på lignende måte ville nå det beskrevne resultat.
I et av sine videste aspekter er foreliggende
oppfinnelse en foredling i bruken av en teknikk med rekombinant DNA for direkte å fremstille i prokaryoter heterologe polypeptider. Beskrivelsen av oppfinnelsen forutsetter således kjennskap til de grunnleggende teknikker som anvendes innen rekombinant DNA teknologi for å isolere og klone DNA-sekven-
ser som koder for polypeptider, omordningen eller endringen av klonede DNA-sekvenser og ekspresjonen av klonede eller modifiserte DNA-sekvenser i transformerte mikroorganismer. Slike teknikker ligger innenfor fagmannens kunnskaper, (se f.eks. Molecular Cloning; A Laboratory Manual; Maniatis, Fritsch & Sambrook eds. 1982).
Den DNA-sekvens som koder for det ønskede, heterologe polypeptid som kan produseres i prokaryoten, velges og isoler-es, eller en DNA-sekvens som koder for det, konstrueres eller syntetiseres kjemisk. Ved mange viktige utførelsesformer er polypeptidet et eukaryot protein. Dersom polypeptidet er lite og den fullstendige aminosyresekvens er kjent, kan et syntetisk DNA-molekyl eller -sekvens som koder for polypeptidet, konstrueres. Dersom aminosyresekvensen til polypeptidet er ukjent, eller dets størrelse er for stor til at syntesen av en tilsvarende DNA-sekvens er praktisk gjennomførbar, kan det fremstilles en cDNA-sekvens ved hjelp av omvendt transkripsjon fra tilsvarende mRNA erholdt fra vev eller celler som ut-trykker polypeptidet. Ved en utførelsesform kan f.eks. bGH erholdes slik fra bovine hypofyser ved hjelp av fremgangsmåter som nå er rutine og som er beskrevet av Goodman et al.,
Methods in Enzymology 68:75-90 (1979). Alternativt kan en cDNA-sekvens fremstilles fra mRNA isolert fra celler transformert med genom-DNA isolert fra en samling av naturlig forekommende gener med en egnet probe. Genom-DNA kan også modifiseres i forskjellige vektorsystemer slik at DNA-en kan uttrykkes i prokaryoter. Disse teknikker ligger innenfor fagmannens kunnskaper.
Når først en heterolog DNA-sekvens som inneholder kodonene for det ønskede polypeptid, er erholdt, kan det være ønskelig å lage visse modifikasjoner i nukleotidsekvensen til molekylet. Dersom molekylet f.eks. er blitt produsert ved hjelp av omvendt transkripsjon fra et mRNA-templat, vil det ofte inneholde i det minste én del av den DNA som koder for ledersekvensen til forløper-proteinet. Det er følgelig nødvendig å fjerne all leder-sekvens-DNA foran det første kodon for det ønskede protein. I noen tilfeller kan det være nødvendig å tilføye eller bytte ut et alaninkodon ved be-gynnelsen av sekvensen som koder for det ønskede protein,dersom den ikke allerede har et N-terminalt alaninkodon. Deretter innføres et startsignal for translasjon (som også er et methioninkodon) oppstrøms for og umiddelbart grensende opp til alaninkodonet. Selv om startsignal/methioninkodonet vanligvis (og fortrinnsvis) vil være nukleotidsekvensen av ATG, kan også sekvensen GTG av og til tjene som et kodon for start-initierende signal/méthionin. Dertil er det ment at tilstedeværelsen av mer enn ett methioninkodon, f.eks. 2, 3 eller muligens flere sammenhengende kodoner for methionin,skal ut-gjøre ekvivalens innenfor fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Dersom det ikke allerede er tilstede, bør minst ett signal for translasjonsstopp innføres etter kodonet for den C-terminale aminosyre. Eksempler på signaler for translasjonsstopp omfatter deoxynukleotidtriplettene TAA, TGA og TAG. Derfor anvendes teknikker med rekombinant DNA egentlig til å konstruere en rekombinant DNA-sekvens som i rekkefølge inneholder et translasjonsstartsignal/methionin-kodon, kodonene for det ønskede polypeptid med kodonet for det N-terminale alanin like ved siden av startsignalet, og minst ett signal for translasjonsstopp like ved siden av kodonet for den C-terminale aminosyre.
Det er funnet at virksom ekspresjon av mRNA kan hemmes ved sekundære strukturer dannet ved hydrogenbindingen av to komplentære rekker av nukleotider i mRNA-en. Eliminering av disse komplementære sekvenser, særlig i den del av molekylet som koder for N-enden, letter bindingen av ribosomer til mRNA-en og gir derfor økte nivåer for ekspresjon. Det kan derfor være ønskelig å erstatte kodoner som deltar i dannelsen av slike sekundære strukturer, med kodoner for den samme aminosyre, men omfattende en annen nukleotid-triplett. Se EP patent-skrift nr. 75444 (publisert 30. mars, 1983), Seeburg et al.,
(1983) DNA 2:37-45 og Shoner et al. (1984) Proe. Nat' l. Acad. Sei. U. S. A. 81:5403-5407.
Andre måter å konstruere de heterologe DNA-sekvenser
på vil være åpenbare for fagfolk innen teknikken. Dersom et DNA-molekyl er tilgjengelig som koder for et polypeptid som uttrykkes med en N-terminal struktur som er NH2-met-x-y..., hvor x er en aminosyre som er forskjellig fra alanin, kan f.eks. et alaninkodon innføres mellom kodonet for translasjonsstartsignal/methionin og kodonet for x. Alternativt
kan kodoner for x fjernes og et alaninkodon innføres i stedet for dette. Således vil et protein med henholdsvis den N-terminale struktur NH^-ala-x-y... eller NH2-ala-y.... , produseres ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Likeledes kan det gjøres fjerninger, addisjoner og/eller substitusjoner i ethvert av aminosyrekodonene i en gitt gensekvens slik at et variantpolypeptid ville bli uttrykt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelsé. Et "variant"-polypeptid er her definert som et polypeptid med enkle eller multiple fjerninger, substitusjoner og/eller addisjoner i aminosyren sammenlignet med den naturlig forekommende aminosyresekvens til et bestemt polypeptid. Eksempler på slike varianter omfatter, men er ikke begrenset til, me.t-bGH(L) og met-bGH(V), hvor aminosyresekvensen til disse variant-bGH-arter er identiske med henholdsvis det bGH(L) og bGH(V) som fremstilles av bovine hypofyseceller, bortsett fra tilstedeværelsen av et ytterligere methionin i N-enden. Disse variantpolypeptider menes å ha en aminosyresekvens som i det vesentlige er den samme som sekvensen til et naturlig forekommende polypeptid så lenge som den biologiske aktivitet ikke er redusert i en utolererbar grad. Frembringelse og ekspresjon av variantpolypeptider kan være ønskelig for å oppnå økt akku-mulering, økt protéinstabilitet, for å lette polypeptid-rensing og/eller ved optimalisering av biologisk aktivititet.
De ovenfor nevnte modifikasjoner av DNA-molekylet som koder for det ønskede polypeptid, kan utføres ved å bruke restriksjonsenzymer, exonukleaser, endonukleaser, etc. ved kjente teknikker. Den generelle teknikk for oligonukleotid-styrt stedspesifikk mutagenese kan også anvendes for å be-virke de ovenfor nevnte modifikasjoner i strukturen eller sekvensen til DNA-molekylet, og er kjent for fagfolk innen teknikken. Se f.eks. Zoller & Smith (1982) Nuc. Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith, (1983) Meth. Enzymol. 100: 468-500; Norris et al., (1983) Nuc. Acids Res. 11:5103-5112.
I henhold til teknikker som omfatter rekombinant DNA innføres den ønskede heterologe DNA-sekvens så snart den er oppnådd i en passende kloningsvektor som gir et middel for replikering av DNA-sekvensen. Enhver passende kloningsvektor, fortrinnsvis : inneholdende en markørfunksjon, kan brukes, f.eks. E. coli plasmidvektorer som omfatter Col EI, Hersfield et al., Proe. Nat' l. Acad. Sei. U. S. A. (1974) 71:3455; pBR322, Bolivar et al., Gene (1977) 2:95; pBR 325, Soberon et al., Gene (1978) 4:121 og pkc7, Rao et al., Gene (1979) 7:79;
og E. coli bakteriofag-vektorer som omfatter CharonA L47.1, Loenen et al., Gene (1980) 10:249 og Ml3mp8 og Ml3mp9, Messing et al., Gene (1982) 19:269. De generelle teknikker for inn-føring av DNA-sekvensen i en kloningsvektor for å frembringe en rekombinant vektor, ligger innenfor kunnskaper innen teknikken. Se f.eks. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Maniatis, Fritsch & Sambrook, éds. (1982).
Når først multiple kopier av den ønskede heterologe DNA-sekvens er oppnådd, kan disse sekvenser fjernes fra de rekombinante vektorer og innføres i et ekspresjonssystem for produksjon og isolasjon av det ønskede heterologe protein slik det er fullstendig beskrevet nedenunder. Modifikasjoner av den heterologe DNA-sekvens ved hjelp av metoder som er vel-kjent for fagfolk innen teknikken, kan gjøres før innføring av disse DNA-sekvenser i en ekspresjonsvektor, eller etter innføringen.
I eksemplene ifølge foreliggende oppfinnelse ble M13mp8, beskrevet av Messing et al., Gene (1982) 10:269, modifisert slik at den inneholder et Xbal restriksjonssted som vist i fig. 1, valgt som kloningsvektor sammen med M13mp9, Id. Vek-torene Ml3mp8 og M13mp9, kollektivt betegnet "M13-vektorer", muliggjør isolering av rekombinante vektorer i både dobbelt-kjedet (ds) og replikativ form (RF), og av énkjedede (ss) DNA-former. Isolering av RF DNA rekombinante vektorer letter den derpå følgende innføring av de replikerte, ønskede DNA-sekvenser i ekspresjonsvektorer, somvist i figurene 5, 6 og 10. Alternativt letter isolering av den énkjedede form av disse rekombinante vektorer både isolering av rekombinante vektorer som inneholder den ønskede DNA-sekvens i korrekt 5' til 3'-orientering for ekspresjon og frembringelse av én eller annen DNA-sekvensmodifikasjon ved hjelp av slike teknikker som oligonukleotid-styrt stedspesifikk mutagenese, som vist i fig. 3,
4 og 8. Dertil kan disse M13-vektorer forsyne DNA-fragmenter
eller gener opp til 4kb i lengde, noe som sikrer kloningen av en typisk, helt, eukaryot gensekvens.
Markørfunksjonen som anvendes i Ml3-vektorer, som beskrevet av Messing et al., Gene (1982) 19:269, omfatter enzymet for 3-galactosidase. Nærmere bestemt innføres den ønskede heterologe DNA-sekvens i lacZ-genfragmentet i M13-vektoren som forstyrrer den normale komplementdannelse mellom lacZ-genfragmentet i Ml3-vektoren og del-lacZ-genfragmentet i den kromosomale DNA hos vertcellen (f.eks. E. coli JMlOl.) slik at verten ikke lengre er i stand til å metabolisere lactose som er tilstede i dyrkningsmediet for bakteriene. E. coli infisert med Ml3-vektorer som ikke har en fremmed gensekvens inn-ført i lacZ-genfragmentet båret av vektoren, er i stand til å metabolisere lactose som er tilstede i dyrkningsmediet for bakteriene og gi karakteristiske blå plaques når bakteriene dyrkes på agar som inneholder 1 x YT-medium omfattende 0,8%
(vekt/volum) trypton, 0,5% (vekt/volum) gjærekstrakt, 0,5%
(vekt/volum) NaCl og en fargeindikator for 3-galactosidase. Plaque-fargingen av E. coli infisert med rekombinante vektorer som bærer en innskutt heterolog DNA-sekvens i M13 lacZ-genfragmentet er klar eller fargeløs når bakteriene dyrkes i mediet. Positiv innføring av den heterologe DNA-sekvens i disse kloningsvektorer identifiseres derfor ved hjelp av fargeløs plague-dannelse etter infeksjon av E. coli vertcelle med den rekombinante vektor. Innføring av DNA-sekvensene som koder for bGH(L) og pGH(P) i Ml3-vektorer er vist i henholdsvis fig. 2 og 9.
Ved en foretrukket utførelsesform ble bGH(L)- og pGH(P)-kodende DNA-sekvenser båret på henholdsvis bakterieplasmidet pBGH , og pPGH^ ,, som i Seeburg et al., DNA (1983) 2(1): 37-45, isolert fra disse plasmider ved hjelp av stedspesifikk spalting med restriksjonsendonuklease. Det bør legges merke til at bakterier transfisert med henholdsvis bakterieplasmidet pBGH , eller pPGH ,, og deretter dyrket under betingelser som tillater ekspresjon av henholdsvis den bGH(L)- og pGH(P)-kodende sekvens, gir somatotropiner med et N-terminalt methionin (f.eks. henholdsvis met-bGH(L) eller met-pGH(P)). De respektive sekvenser ble deretter innført i RF-DNA i en modifisert Ml3mp8-vektor (M13mp8/Xbal) og i en Ml3mp9-vektor som vist i henholdsvis fig. 2 og 7. Innføring av de ønskede bGH(L)-og pGH(P)-DNA-sekvenser i RF-DNA i M13mp8/Xbal og M13mp9 ble bekreftet ved hjelp av stedspesifikk spalting med restriksjon-endonuklease igjen som vist i henholdsvis fig. 2 og 7. Deretter ble E. coli JM101 transfisert med én av disse rekombinante vektorer som beskrevet av Messing et., Methods in En zymology (1983) 101:20 og ssDNA i de rekombinante vektorer isolert som beskrevet av Messing et al., Gene (1982) 19:269. Det vises til relevante deler av disse litteraturhenvisninger.
Når de først var isolert, ble ssDNA fra disse rekombinante vektorer modifisert ved hjelp av oligonukleotidstyrt sted-spesifikk mutagenese for å frembringe de DNA-sekvenser som koder for bGH(A,V), bGH(A,L), bGH(V) og pGH(A). Nærmere bestemt ble bGH(L) modifisert slik at det ble tilføyd et kodon for alanin, f.eks. GCC, i 5'-enden til den sekvens som koder for bGH(L) som vist i fig. 3. Det forventes at hvilken som helst av dé 4 kodoner for alanin kan tilføyes på denne måte. Det foretrukkede alaninkodon for optimal somatotropinutbytte
i det ekspresjonssystem som her anvendes, er GCC. Bekreftelse av tilføyelsen av et alaninkodon for frembringelse av en sekvens som koder for bGH(A,L), ble oppnådd ved hjelp av DNA-sekvensanalyse av hele eller 5'-enden av DNA-sekvensen for bGH(A,L) ved hjelp av fremgangsmåten til Sanger et al., Proe. Nat' 1. Acad. Sei., U. S. A. (1977) 74:5463.
Den sekvens som koder for bGH(A,V) ble frembragt ved oligonukleotid-styrt stedspesifikk mutagenese av den sekvens som koder for bGH(A,L) som vist i fig. 4 ved å omdanne leucinkodonet i aminosyrestilling 127 (i bGH(A,L)) til et valinkodon, f.eks. GTG. Igjen forventes det at ethvert kodon for valin kan anvendes ved denne omdannelse. Frembringelsen av en sekvens som koder for bGH(A,V) ble igjen bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensanalyse av den resulterende sekvens som koder for bGH(A,V).
Den bGH(V)-kodende sekvens som gir produksjon av met-bGH(V)-proteiner i bakterier transfisert med en ekspresjonsvektor som omfatter den bGH(V)-kodende sekvens, ble frembragt på lignende måte ved hjelp av oligonukleotid-styrt sted-spesif ikk mutagenese av den bGH(L)-kodende sekvens ved om-danning av leucinkodonet i aminosyrestilling 126 (i bGH(L)) til et valinkodon, f.eks. GTG.
Frembringelsen av en sekvens som koder for pGH(A) ved hjelp av oligonukleotidstyrt stedspesifikk mutagenese av den pGH(P)-kodende sekvens ble utført på lignende måte vist i fig. 8 og beskrevet nærmere nedenunder, og bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensanalyse.
Når nå de ønskede heterologe DNA-sekvenser er isolert og konstruert, som eksempelifisert for bGH(A,L), bGH(A,V) og pGH(A), kan disse sekvenser replikeres og et stort antall kopier kan frembringes ved formering av de respektive rekombinante vektorer ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagfolk innen teknikken og som det er vist til ovenfor. Disse heterologe DNA-sekvenser. kan nå innføres i en hvilken som helst passende ekspresjonsvektor for produksjon i prokaryoter av de ønskede heterologe polypeptider.
FREMSTILLING AV POLYPEPTIDER MED N- TERMINALT ALANIN
Som tidligere nevnt, bør en egnet ekspresjonsvektor inneholde de nødvendige transkripsjons- og translasjons-signaler for produksjon av et heterologt protein i den utvalgte vertcelle sammen med en markørfunksjon for identifi-kasjon av de ekspresjonsvektorer hvori den ønskede heterologe DNA-sekvens er blitt innført. Ved bruk av en prokaryot ekspresjonsvektor kan de rekombinante DNA-sekvenser til-føyes det genetiske komplement hos en prokaryot organisme via transduksjon, transformasjon eller transfisjon (samlet referert til som "transfisjon") og organismen kan deretter dyrkes under betingelser (generelt bestemt av den promoter og den vert som anvendes) som forårsaker at det ønskede polypeptid produseres. Således inneholder den "genom"-DNA hos organismene som brukes ifølge oppfinnelsen, både kromosomal og episomal DNA.
Det er blitt beskrevet en rekke ekspresjonsvektorer for heterolog genekspresjon og heterolog proteinproduksjon i prokaryote vertceller, og disse er kjent for fagfolk innen teknikken.
Ved én foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse ble ekspresjonsvektorene pBGH _,, se Seeburg et al., DNA (1983) 2 (1):37-45, og'pBGH ,x , som utgjøres av en modifisert pBGH ,-vektor, anvendt.
^ ex-1
Ekspresjonsvektoren for bGH GX™* X, er et pBR322 bakterie-plasmid som bærer et gen for bGH(L). Genet omfatter i rekke-følge en tryptofanpromoter (ptrp), en Shine-Delgarno sekvens, et ATG translasjonsstart/methionin-kodon like ved siden av den sekvens som koder for N-terminalt fenylalanin, den første aminosyren i bGH(L)-polypeptidet, den sekvens som koder for bGH(L), og et kodon for translasjonsstopp. Markørfunksjonen på pGH CA ~~ X,-ekspresjonsvektoren er antibiotisk resistent. Nærmere bestemt bærer pBGH ex—± to gener for antibiotisk resistens, en for ampicillin-resistens (amp ) og den andre for tetracyklin-resistens (tet<r>) som gir spesifikk antibiotisk resistens til ellers mottagelige vertceller som er stabilt transformert med ekspresjonsvektoren. Således kan stabile transformanter velges ut ved hjelp av dyrkning i medier som inneholder enten tetracyklin, ampicillin eller begge anti-biotikaene . ;I eksemplene ifølge foreliggende oppfinnelse ble ekspresjonsvektorene pMON3209 og pMON3215 som omfatter pBGH 62£ ~ X, med henholdsvis bGH(A,L) - og bGH(A,V)-kodende sekvenser i stedet for den bGH(L)-kodende sekvens, frembragt som vist i henholdsvis fig. 5 og 6. Deretter ble en bakterie som f.eks. E. coli transformert med en av disse ekspresjonsvektorer og transformanter valgt ut ved dyrking på medier som inneholdt vedkommende antibiotikum. Deretter ble ekspresjonsplasmidene inneholdt i de transformerte bakterier undersøkt med hensyn på tilstedeværelsen av de bGH(A,L)- og bGH(A,V)-kodende sekvenser i den korrekte 5' til 3' orientering ved hjelp av spalting med restriksjonsenzym. ;I et eksempel ifølge foreliggende oppfinnelse ble ;pBGH , x bestående av pBGH ,-vektoren modifisert ved fjerning av det EcoRI-restriksjonssete som befinner seg opp-strøms for 5'-enden av den ptrp-kodende sekvens, anvendt for å frembringe ekspresjonsvektoren pMON3213 som bærer den pGH(A)-kodende sekvens i stedet for den bGH(L)-kodende sekvens. Den resulterende pBGH , -vektor inneholder ' ;bare ett enkelt Ecorl-sted som-vist i fig. 9. Utbyttingen av den bGH(L)-kodende sekvens i pBGH , x med de pGH(A)-kodende sekvenser for å frembringe ekspresjonsvektoren pMON3213 er vist i fig. 10. E. Coli ble så transformert med blandingen og transformanter utvalgt ved hjelp av dyrking i antibiotika-holdige medier. Ekspresjonsplasmidene i de transformerte bakterier ble så undersøkt med hensyn på tilstedeværelsen av de pGH(A)-kodende sekvenser ved hjelp av restriksjons-spalting. ;Produksjon av bGH(A,L), bGH(A,V) eller pGH(A) i E. ;coli ble oppnådd ved å transformere enten E. coli W3110, ;E. coli Le392 eller E. coli stamme 294 som er deponert og har fått henholdsvis ATCC deponeringsnummer 39936, 53010 og 53009, med en av ekspresjonsvektorene pMON3209, pMON3215 eller pMON3213 i overensstemmelse med fremgangsmåten som er mer fullstendig beskrevet nedenunder. Den transformerte E. coli W3110 ble så dyrket under betingelser som åpner mulighet for ekspresjon av somatotropingenene og produksjon av de ønskede heterologe polypeptider. ;Rensing av det fremstilte heterologe peptid vil av-henge både av proteinet og den vertcelle som er valgt. Det er f.eks. blitt iakttatt at de heterologe proteiner som fremstilles i slike bakterier som E. coli, ofte utfelles i cellen i form av "refraktile" legemer. Uttrykket "reflaktil" brukes fordi disse legemene faktisk kan sees ved å bruke et fasekontrastmikroskop. En brukbar fremgangsmåte ved utvinning av heterologe proteiner i biologisk aktiv form er beskrevet i EP patentsøknad nr. 114 506 (publisert 1. august, 1984). I korte trekk omfatter denne rensemetode oppkonsentrering av vertcellene, lysering av disse cellene for å frembringe et cellulært ekstrakt eller homogenat og deretter isolering av de refraktile legemer ved hjelp av differensialsentrifugering, hvor alle trinn er kjent for fagfolk innen teknikken. De isolerte refraktile legemer oppløses i et sterkt denaturerings-middel som f.eks. guanidinhydroklorid og det oppløseliggjorte protein byttes så ut i et egnet oppløsningsmiddel (f.eks. urea), renses ved hjelp av kromatografiske midler og aktive-res til slutt biologisk, dvs. tillates å innta sin aktive konfigurasjon og oxyderes deretter slik at denne konfigurasjon opprettholdes ved hjelp av disulfidbindinger mellom de passende cysteinrester, slik som beskrevet i EP patentsøknad nr. 114 506. En mer detaljert rensing av slike heterologe proteiner er beskrevet i to samtidig innleverte US patent-søknader, en av S.B. Storrs med tittel "Method of Somatotropin Solubilization", og den andre av L.A. Bentle, S.B. Storrs og J.W. Mitchell med tittel "Method of Somatotropin Naturation". Disse to samtidig innleverte US patentsøknader og foreliggende søknad er alle overdratt til Monsanto Company. Etter-følgende rensing av det heterologe polypeptid for å fjerne forurensende bakterieproteiner kan oppnåes ved hjelp av kon-vensjonelle kromatografiske midler som f.eks. gelfiltrering eller ionebytterkromatografi. Typisk vil de resulterende rensede blandinger inneholde fra ca. 90 til ca. 99,5 vekt% ;av N-alanyl-polypeptidet og fra ca. 0,5 til ca. 10 vekt% protein som er naturlig forekommende i bakteriene eller andre prokaryote verter hvor polypeptidet ble produsert. ;Det er funnet at vanligvis har minst ca. 80% av de heterologe peptider som uttrykkes ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, en N-terminal struktur som er Nf^-ala... Det gjenværende polypeptid foreligger typisk i methionylformen, med en N-terminal struktur som er NH2~met-ala.... Ved å variere dyrkingsbetingelser og/eller tidspunkt for induksjon av genekspresjon, er det imidlertid mulig å øke andelen av polypeptid med alanin i N-enden til minst ca. 95% eller ennå mer. ;De somatotropinpolypeptidartene som er produsert ;og isolert som beskrevet ovenfor, ble påvist å oppvise ;somatotropinlignende biologisk aktivitet målt i kaninlever-reseptor-prøven utført som beskrevet av Tsushima og Friesen, ;J. Clin. Endocrinol. Metab. (1973) 37:334-337 og en biologisk prøve på vektøkning hos rotter. I den sistnevnte prøve ble ;de biologiske virkningene av somatotropinene produsert i E. coli vurdert i forhold til en kjent mengde somatotropin (f.eks. bovin eller porcin hypofyse-somatotropin) ved å sammenligne størrelsen på vektøkningen hos hypofyseektomiserte rotter ;med varierende mengder av injisert forbindelse. Nærmere bestemt injiseres titrerte mengder (mellom 0 og 60 ug) av den ukjente eller standard somatotropinkilde i hypofyseektomiserte rotter (95 - 135 g) daglig i 7 eller flere dager. Ved å bruke mul-tippelkorrelasjon korreleres kroppsvektøkninger hos dyr. som mottar de kjente og ukjente hormonmengder, basert på log-transformerte mengder. Helningsvinkelen til kurvene undersøkes for å sikre ikke-parallellisme og hindre helhet. Bioaktivi-teten rapporteres som forholdet mellom helningsvinklene x aktiviteten til standarden. ;Bruk av N-alanin-bGH-produktene fremstilt ifølge oppfinnelsen, øker melkeproduksjon hos kyr og antas å øke mengden av for ;som kreves for en bestemt produksjon av melk hos kyrne. Ad-ministrasjon til melkekyr av en melkedannelsesøkende mengde av bGH-arter som inneholder valin i eller i nærheten av stilling 126 hos det ferdig utviklede bGH-protein, er særlig godt egnet for forsterkning av melkeproduksjon hos kyrne. ;Slike produkter fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan administreres til kyr ved injeksjon, infusjon eller implantasjon i polymerer eller andre medier som er kjent for å oppnå avleveringen av en påkrevd mengde i blodomløpet. Fysiologisk akseptable grunn-preparater som f.eks. oppløsninger, emulsjon eller geler, kan brukes, enten innkapslet eller ikke innkapslet. Disse preparater kan inneholde en enkel bGH-art eller varianter derav, eller hvilke som helst foreskrevet blanding av naturlig forekommende og/eller variantpolypeptider (f.eks. en blanding av bGH(A,V) og bGH(A,L) og/eller en blanding av bGH(A,V) og met-bGH(A)). Dosene kan variere fra minst ca. 0,005 mg til ;ca. 200 mg pr. dyr pr. dag, og fortrinnsvis fra ca. 5 mg til ;ca. 4 0 mg pr. dyr pr. dag. Den mengde som er mest effektiv for å øke melkeproduksjon og/eller f6r-til-melk-utbytte, kan bestemmes ved hjelp av rutineforsøk. Den aktuelle, foretrukkede mengde av bGH er avhengig av slike variable størrelser som det bestemte dyrets størrelse, generelle helsetilstand og næringsmessige status. Selv om melkeproduksjon kan brukes til å vurdere virkningen av bGH på -kyr, kan også andre produk-sjonsegenskaper hos kyrne brukes, som f.eks. total veksthastighet og kjøttproduksjon. Om ønsket kan bGH administreres til kyr sammen med andre gunstige midler som f.eks. andre biologiske aktive proteiner, antigener eller lignende, og derved gi økte virkninger. ;Som tidligere omtalt, omfatter oppfinnelsen også produksjonen av varianter av bGH som har et N-terminalt alanin, men som har utslettelser, addisjoner, inversjoner og/eller substitusjoner langs polypeptidkjeden. Slike modifikasjoner som har ønskede egenskaper når det gjelder å øke melkedannelse og/eller vekst, kan identifiseres ved hjelp av rutinetesting på kyr. ;Eksemplene nedenunder illustrerer foretrukkede utførel-sesformer av foreliggende oppfinnelse. ;Følgende mikroorganismer er tilgjengelige fra American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, U.S.A.: ;Eksempel 1 ;Alle oligonukleotider ble syntetisert i Department of Biological Sciences, Monsanto, under anvendelse av et Applied Biosystems DNA synteseapparat i overensstemmelse med den fremgangsmåte som er angitt av produsenten, Applied Biosystems, Inc., Foster City, California. Restriksjonsenzymer og DNA-modifiserende enzymer ble levert av New England Biolabs (Beverly, Mass achusetts) / New England Nuclear (Boston, Massachusetts) ;og Bethesda Research Laboratories (BRL) (Gaithersburg, Maryland) . En Xbal-linker ble erholdt fra Collaborative Research, Inc. (Lexington, Massachusetts). T4 DNA ligase ble levert av ;BRL (Gaithersburg, Maryland). T4 DNA kinase ble levert av ;32 ;New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) . P-merkede nukleotider ble levert av Amersham (Arlington Heights, Illinois) E. coli DNA polymerase I, Klenow fragment, ble levert av ;New England Nuclear (Boston, Massachusetts). E. coli JM101 ;ble erholdt fra Dr. Jo Messing, University of Minnesota ;(St. Paul, Minnesota). ;Restriksjonsenzymspaltinger, reaksjonene med T4 DNA ligase og reaksjonene med E. coli DNA polymerase I, Klenow-fragment kan utføres i henhold til fremgangsmåtene som er angitt av produsentene. Følgende buffere er foretrukket for de følgende restriksjonsenzymer: for Xbal, lOOmM NaCl, 50mM tris, pH 7,5, lOmM MgSC>4; for Ecorl, Hind III og Sma I: 50mM NaCl, lOmM Tris; pH 7,5, 10 mM MgS04. Reaksjoner med T4 DNA ligase ble kjørt i buffere som inneholdt 25mM Tris, pH 8,0, lOmM ;MgCl2, lOmM dithiothritol (DTT), 2mM spermidin og 0,2mM ATP. ;E. coli DNA polymerase I, K.lenow-fragment, ble brukt i en ;buffer som inneholdt 2 0mM Tris, pH 7,2, lOmM MaCl2, lOmM ;(DTT), lmM ATP og ImM av henholdsvis dATP, dGTP, dCTP, dTTP. a- 32P-dATP (400 ci/mmol) ble tilsatt under Klenow-reaksjonen dersom merking av den nysyntetiserte DNA-kjede var ønsket. ;32 Oligonukleotider ble merket ved å bruke y- P-ATP (sp. akt. større enn 5000 ci/mmol) og T4 DNA kinase i lOOmM Tris, ;pH 8,0, lOmM MgCl2, 5mM DTT. ;Plasmider med DNA-sekvenser som koder for bGH(L) og pGH(P) (pBGH og pPGH^ ,,), ble erholdt fra Genentech., ;Inc., So. San Francisco, California. Disse plasmidene kan fremstilles som beskrevet i EP patentsøknad nr. 75444 (publisert 30. mars, 1983); Seeburg et al., DNA (1983) 2(l):37-45; ;Goeddel et al. Nature (1979) 281:544-548; DeBoer et al., ;i P romoters: Structure and Function (1982); M.J. Chamberlin and R. Rodriguez eds., Chapter 293; Miozzari and Yanofsky, ;J. Bacteriol. (1978) 133:1457-1466; og Rosenberg and Court, Annual Review of Genetics 13:319-353. De 21 første transla-terte kodoner i DNA for bGH(L) er, som vist i EP patentsøknad nr. 75444, ATG TTC CCA GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT ;AAC GCT GTT CTT CGT GCT CAG CAT CTT eller funksjonelle ekvivalenter derav. (Funksjonelle ekvivalenter av disse kodonene kan selvfølgelig brukes i stedet). Det vises også til andre relevante deler av disse publikasjoner. ;M13mp8 og M13mp9 ble erholdt fra Dr. Jo Messing, University of Minnesota (St. Paul , Minnesota). ;Alle bestanddeler og antibiotika til bakteriedyrknings-medier ble erholdt enten fra Sigma (St. Louis, MO) eller fra Difco Laboratories (Detroit, Michigan). ;Eksempel 2 ;Det følgende eksempel demonstrerer konstruksjonen av ;tre DNA-kodende sekvenser som, når de uttrykkes, gir den direkte produksjon i bakterier av polypeptider som inneholder et N-terminalt alanin. Nærmere bestemt ble det konstruert DNA-kodende sekvenser slik at translasjonsinitiering start/methionin-kodonet (ATG) etterfølges umiddelbart av et alaninkodon (GCC). De tre DNA kodende sekvenser som omfatter bGH(A,L), bGH(A,V) ;og pGH(A), ble konstruert ved hjelp av oligonukleotidstyrt, stedspesifikk mutagenese av tidligere isolerte somatotropin DNA-sekvenser. Dette eksempel demonstrerer også konstruksjonen av en DNA-sekvens som koder for bGH(V), og som forårsaker produksjon av met-bGH(V) når den uttrykkes i bakterier. ;a. Konstruksjon av en DNA- sekvens som koder for bGH( A, L) ;Den DNA-sekvens som koder for somatotropin bGH(L), ble fjernet fra pGH , som et Xbal-fragment og klonet inn i Xbal-stedet i ^en modifisert M13mp8-vektor (Ml3mp8/Xbal). Konstruksjon av M13mp8/XbaI-vektoren som inneholder en Xbal- ;linker i det opprinnelige Xbal-sted, er vist i figur 1. Som vist i figur 2, spalter Xbal i begge ender av den DNA-sekvens som koder for bGH(L), og fjerner derved den fullstendige bGH(L)-kodende sekvens. Det pBGH _^-plasmid hvorfra Xbal var fjernet, ;ble blandet i nærvær av T4 DNA ligase med RF M13mp8/Xbal DNA som var gjort rettkjedet ved hjelp av Xbal restriksjonsenzymspalting og behandlet med alkalisk fosfatase fra kalvetarm. Blandingen ble deretter inkubert over natten ved 14°C. Be-handling med alkalisk fosfatase fra kalvetarm forhindrer ny ringdannelse av M13mp8/XbaI-vektoren. Innføring av den DNA-sekvens som koder for bGH(L), i~Ml3mp8/XbaI-vektoren for å frembringe rekombinant vektor Ml3mp8/BGH SX™" _, i_ ble først konstatert ved hjelp av fargeløs plaque-dannelse på et "teppe" av bakterier, E. coli JM101, dyrket på 1 x YT-medium under anvendelse av belegningsfremgangsmåten med bløt agar beskrevet i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch & Sambreok, eds. (1982), s. 64, som omfattet 10 ul lOOmM ;IPTG (isopropyl-B-D-thiogalaktopyranoside) og 50 ul 2% (vekt/ volum) X-GAL(5-brom-4-klor-3-indolyl-3-D-galaktopyranosid i 3 ml toppagar, og transfisert med den rekombinante vektor som tidligere beskrevet. Innføring av den bGH(L)-kodende sekvens ble bekreftet ved spalting av isolert RF-DNA, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch & Sambrook, eds. (1982), kapittel 3, fra den rekombinante vektor med Xbal som ga et fragment med 590 basepar som omfattet den innføyde sekvens. Fragmentet med 590 basepar ble identifisert ved hjelp av agarosegelelektroforese i 1% (vekt/volum) agarose som beskrevet i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch & Sambrook, eds. (1982). Alle senere restriksjonsfragmenter ;ble identifisert ved hjelp av denne fremgangsmåte. Orien-teringen til de innføyde bGH(L)-kodende sekvenser ble konstatert ved spalting av RF-rekombinantvektoren med Smal og Hindlll. Når de kodende sekvenser er i den korrekte 5<1> til 3' orientering, bør spalting med disse restriksjonsenzymer gi ;et fragment med 207 basepar. Isoleringen av ss fag-DNA ble utført i henhold til fremgangsmåten ifølge Messing et al., Gene (1982) 19:269. M13mp8/BGH ,-vektoren ble så anvendt ;som et templat i den oligonukleotidstyrte, stedspesifikke mutagenese hovedsakelig som beskrevet av Zoller and Smith, Nuc. Acids. Res. (1982) 10:6487-6500, Zoller and Smith Methods in Enzymol. (1983) 100:468-500. Norris et al., ;Nuc. Acid. Res. (1983) 11:5103-5112. ;Figur 3 skisserer mutagenesefremgangsmåten for frembringelse av en DNA-sekvens som koder for bGH(A,L) fra den bGH(L)-kodende sekvens. I korte trekk brukes en oligonukleotid-starter (se tabell 1 nedenunder) som inneholder sekvensen fra den ønskede mutasjon, til å starte opp syntese av en ringsluttet DNA-kopi av ssDNA M13mp8/BGH _,-templatet. De således frembragte, ringsluttende dsDNA-molekyler skilles fra ufullstendige og ssDNA-ringer ved hjelp av alkalisk sucrosegradient-sentrifugering som beskrevet av Zoller and Smith, Methods in Enzymol.(19 83) 100:468-500. De ringslut-tede dsDNA-molekyler brukes så til å transformere E. coli JM101 som beskrevet av Messing et al., Gene (1982) 19:269-276 og de resulterende fargeløse plagues løftes over på Pall-filtere erholdt fra Pall Ultrafine Filtration Corp. ;(Glen Cove, New York) og undersøkes med hensyn på hybridi- ;32 ;sering til en P-merket form av oligonukleotid-primeren som ble brukt til å frembringe den stedspesifikke mutagenese. Overflyttingen av plaquene ble utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet av produsenten av Pall-filteret. Hybridi-serings-screening ble utført ved å bruke nylon Biodyne ®-filtere som beskrevet av Pall Ultrafine Filtration Corpo-ration (Glen Cove, N.Y.) i "Protocol Guide for DNA Transfer to Pall Biodyne <®> A Nylon Filters" (1983). Filtere ble vasket ved forhøyede temperaturer inntil det radioaktivt merkede signal var fjernet fra et kontrollfilter som ble fremstilt med M13mp8/bGH ,-fag. Ved en typisk filtervaskingsfrem-gangsmåte ble det anvendt en vasking ved værelsetemperatur i 6xSSC (0,9M NaCl og 0,09M Na-citrat) i 10 minutter etterfulgt av en 50°C vask i 6xSSC i 5 minutter og derpå følgende vaskinger ved temperaturer som hver gang ble økt med 5°C. Plaques som hybridiserte til radioaktivt merket oligonukleotid-primer ved temperaturer over kontroll-fagenes, ble antatt å være den nyfrembragte bGH(A,L)-kodende sekvens og ble betegnet potensielt positive. Alternativt ble individuelle fargeløse plaques hentet fra E. coli JM101 transformasjonene og dyrket . i 5 ml 2 x YT-medium (1,6% (vekt/volum) trypton, ;1,0% (vekt/volum) gjærekstrakt, 0,5% (vekt/volum) NaCl) over natten ved 37°C med luftgjennomblåsning. Fag-DNA fremstilt ifølge Messing et al., Gene (1982) 19:269, ble deretter dryppet ut på nitrocellulose, hybridisert med radioaktivt merket primer og vasket ved økende temperaturer som beskrevet ovenfor. Fag-DNA som oppviste hybridiseringstemperaturer over temperaturene til Ml3mp8/bGH ,-kontroll-plaques ble likeledes betegnet potensielt positive. Potensielt positive plaques fra begge screening-fremgangsmåter ble dyrket som beskrevet ovenfor og brukt til å fremstille ss fag-DNA, som deretter ble sekvensert i henhold til fremgangsmåten til Sanger et al., Proe. Nat' l. Acad. Sei., U. S. A. (1977) 74: 5463 for å bekrefte at de bar den bGH(A,L)-kodende sekvens. RF-DNA-en fra Ml3mp8/BGH 6X"— J,_(ala) ble også undersøkt ved hjelp av restriksjonsenzymanalyse med HAE III for å bekrefte addisjonen av et alaninkodon etter startsignal/methionin-kodonet ATG ettersom alaninkodonet frembringer et ytterligere Hae III restriksjonssted. Addisjonsfrekvensen for alaninkodonet var ca. 2% til den DNA-sekvens som koder for bGH(L). ;b. Konstruksjon av en DNA- sekvens som koder for bGH( A, V) ;Konstruksjon av den DNA-sekvens som koder for bGH(A,V), screening og sekvensbekreftelse ble utført ved å bruke den samme fremgangsmåte som ovenfor bortsett fra at templatet var M12mp8/BGH , (ala) som vist i figur 4, og oligonukleotid-primeren var som vist i tabell 1 nedenunder. Omdannelsesfrekvensen for leucinkodonet til et valinkodon var ca. 10%. ;c. Konstruksjon av en DNA- sekvens som koder for bGH( V) ;Konstruksjon av den DNA-sekvens som koder for bGH(V), screening og sekvensbekreftelse ble utført ved å bruke den samme fremgangsmåte som ovenfor. Nærmere bestemt var templatet Ml3mp8/bGHex_1 og oligonukleotid-primeren var den samme som anvendt for å frembringe bGH(A,V). Omdannelsesfrekvensen for ;leucinkodonet til et valinkodon var igjen ca. 10%. ;d. Konstruksjon av en DNA- sekvens som koder for pGH( A) ;Oligonukleotid-stedspesifikk mutagenese ble anvendt ;på samme måte for å tilføye et alaninkodon til den DNA-sekvens som koder for pGH(P) beskrevet av Seeburg et al., ;DNA (1983) 2(l):37-45. Mutagenesefremgangsmåten skissert i figur 8 ble utført på følgende måte. ;Den 590 båsepar lange DNA-sek ens som koder for pGH(P) og som bæres på pPGH SX _-,L -plasmidet, m. ble fjernet fra plasmidet ved hjelp av restriksjonsenzymspalting med Ecorl og Hindlll som spalter plasmidet i henholdsvis 5'- og 3'enden av den pGH(P)-kodende sekvens, som vist i figur 7. Deretter ble det innskrenkede pPGH SX ™_— J,.-plasmid blandet med Ml3mp9 RF-DNA som på lignende måte var spaltet med Ecorl og Hindlll, men i tillegg forbehandlet med alkalisk fosfatase fra kalvetarm for å forhindre religering av Ml3mp9-restriksjonsfragmentene. ;T4 DNA ligase ble så tilsatt blandingen. På grunn av de varierende ender både på RF fag-DNA-en og på den DNA-sekvens som koder for pGH(P), frembragt ved bruken av to forskjellige restriksjonsenzymer, vil pGH(P)-DNA-en selektivt bli innføyd i RF fag-DNA-en og vil bli innføyd i den korrekte 5' til 3' orientering som vist i figur 7. E. coli JM101 ble deretter transformert som beskrevet ovenfor for M13mp8/BGH SX ~_™ j,_, med den rekombinante M13mp9/PGH SX ~™ J,L-vektor som bærer den DNA-sekvens som koder for pGH(P). Den transformerte E. coli JM101 ble så dyrket på 1 x YT-medium som inneholdt kolorometriske reagenser, og selektert ved hjelp av fargeløs plaque-dannelse som tidligere beskrevet. Innføyning av de DNA-sekvenser som koder for pGH(P), ble bekreftet på følgende måte. Fargeløse plaques ble plukket ut og RF M13mp9/PGH , DNA, isolert som tidligere beskrevet, ble så spaltet med Ecorl og Hindlll og underkastet agarosegelelektroforese, hvilket ga et fragment med 590 base-bar som omfattet den innføyde pGH(P)-DNA. Deretter ble Ml3mp9/ PGHex_1-fag formert i E. coli JM101 og ss fag-DNA-en isolert som beskrevet ovenfor. ;Ml3<mp9>/PGHex_1-DNA ble deretter anvendt som et templat for den oligonukleotid-sted-spesifikke mutagenese, vist i figur 8, i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet ovenfor for frembringelse av en bGH(A,L)-kodende sekvens, idet det ble anvendt en spesifikk primer (se tabell 1 nedenunder). Addisjonsfrekvensen for et alaninkodon, her:benevnt GCC, til den pGH(P)-kodende sekvens var omtrent 12%. Den resulterende pGH(A)-kodende sekvens ble på nytt bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensanalyse. ;Eksempel 3 ;Dette eksempel viser konstruksjon og ekspresjon av ;tre rekombinante ekspresjonsvektorer som sørger for den direkte produksjon av polypeptider som inneholder et N-terminalt alanin, i bakterier. De tre således fremstilte polypeptider er somatotropinartene bGH(A,L), bGH(A,V) og pGH(A). Dette eksempel viser også konstruksjon og ekspresjon av bGH(V) og ekspresjon av bGH(L). Polypeptidene som fremstilles på denne måte er henholdsvis met-bGH(V) og met-bGH(L). ;a. Ekspresjon av bGH( A/ L), bGH( A, V), bGH( L) og bGH( V) ;De bGH(A,L)-, bGH(A,V)- og bGH(V)-kodende DNA-sekvenser som bæres av henholdsvis rekombinant-vektor Ml3mp8/ ;BGH ,(ala), Ml3mp8/BGH ,(ala,val) og Ml3mp8/BGH ,(val) ;6X"*x 6X""1 6X X
ble brukt til å erstatte den bGH(L)-kodende DNA-sekvens som bæres av ekspresjonsplasmidet PBC=Hex_^ (se figurene 5 og 6) . Dette ble gjort ved spalting av de respektive M13 RF DNA-er
med Xbal. Ekspresjonsplasmid PBGHex_]_ kle °9S^ spaltet med Xbal og deretter behandlet med alkalisk fosfatase fra kalvetarm for å forhindre religering av restriksjonsfragmentene. Hver av de spaltede RF DNA-er ble så hver for seg blandet
med den spaltede og behandlede pBGH _,-DNA og ligert som beskrevet tidligere over natten ved 14 C. De således dannede rekombinante ekspresjonsvektorer ble merket pMON3209, pMON-3215 og pMON3214 som bar DNA-sekvenser som koder for henholdsvis bGH(A,L), bGH(A,V) og bGH(V). E. coli W3110 ble så transformert med ligeringsblandingen som inneholdt pMON3209 eller pMON3215 eller pMON3214 eller pBGH , og dyrket i Lauria
OX "™ x
dyrkingsvæske (LB) som omfattet 1% (vekt/volum) trypton,
0,5% (vekt/volum) gjærekstrakt og 0,5% (vekt/volum) NaCl og inneholdt 12,5 ug/ml tetracyklin og 200 ug/ml ampicillin.
E. coli W3110 som inneholder pMON3209 har ATCC deponeringsnummer 53024. E. coli W3110 som inneholder pMON3215 har ATCC deponeringsnummer 53022. Transformasjon ble i korte trekk ut-ført på følgende måte. Omtrent 50 ml E. coli W3110 ble dyrket i LB-medier inntil en OD60Q = 0,60. Cellene ble deretter pelletert og resuspendert i 10 ml buffer A ved 25mM Tris,
pH 7,6 og lOmM NaCl. Cellene ble så pelletert og resuspendert i 1 ml buffer A hvortil 14 ml buffer B med 25mM Tris, pH 7,6, lOmM NaCl, 50mM CaCl2 ble tilsatt og oppslemmingen inkubert
på is i 30 minutter. Cellene ble så pelletert og resuspendert i 3 ml buffer B. En aliquot av 0,2 ml resuspenderte celler ble så blandet med 0,1 ml buffer B og 0,1 - 0,5 ug av den ønskede rekombinante ekspresjonsvektor (pMON3209 eller pMON3215 eller pMON3214 eller BGH 6X ~™ X,) og inkubert på is i 60 minutter. Den inkuberte blanding ble deretter oppvarmet i 1 minutt ved 37°C hvoretter 3 ml LB-medier ble tilsatt og den resulterende blanding så inkubert i 60 minutter ved 37°C. Cellene ble deretter pelletert og resuspendert i 3 00 ml LB-medier og dyrket på LB-plater som inneholdt antibiotika som tidligere beskrevet. Resistente kolonier ble så valgt ut og ekspresjonsvektor-DNA-ene pMON3209, pMON3215, pBGH SX x, og pMON3214 isolert i henhold til fremgangsmåten beskrevet i Molecular Clonings: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch & Sambrook, eds. (1982) DNA-ene pMON3209, pMON3215, pBGH SX x, og pMON3214 ble undersøkt med hensyn på tilstedeværelse av et Xbal-fragment med 590 basepar og et HindIII/SmaI-fragment med 200 basepar som viser nærværet av de bGH(A,L)-, bGH(V)- og bGH(A,V)-kodende DNA-sekvenser i den korrekte orientering. Ekspresjonsplasmidene pMON3209 og pMON3215 ble undersøkt videre ved hjelp av restrik-sjonsanalyse med Haelll for å bekrefte tilstedeværelsen av et nytt Haelll-sted som skyldes addisjonen av et GCC(alanin)-kodon. Til slutt ble Xbal-fragmentet med 590 basepar fra pMON3209-, pMON3214- og pM0N3215-vektorene delvis sekvensbestemt som beskrevet tidligere for å bekrefte tilstedeværelsen av de bGH(A,L)-, bGH(V)- og bGH(A,V)-kodende DNA-sekvenser i disse ekspresjonsvektorer.
Enkeltstående kolonier av E. coli W3110 som bar pMON-3209, pMON3214, BGH SX ~" x, eller pMON3215, ble inokulert separat i 5 ml LB inneholdende 12,5 ug/ml tetracyklin og dyrket over natten ved 37°C med luftinnblåsing. 0,5 ml av kulturene som hadde stått over natten, ble så brukt til separat å inoku-lere 25 ml M9-medier omfattende (pr. liter medium) 100 ml 10X salter (70 gram (g) Na2HP04, 30 g KH2P04, 5 g NaCl, 10 g NH4C1 pr. 1000 ml totalt volum), 1,2 ml IM MgS04, 0,25 ml 0,1% Blf 12,5 ml 20% (vekt/volum) glykose, 0,025 ml IM CaCl2, supplert med 0,5% (vekt/volum) casaminosyrer og 6,25 jig/ml tetracyklin, inneholdt i 250 ml kolber. Hver av inokulasjonene ble så dyrket ved 37°C med luftinnblåsing inntil de nådde en 0D,„» (optisk densitet ved 600 nanometer) = 1,0. En aliquot
b U U
på 0,2 ml ble deretter fjernet fra hver av kolbene og hver for seg lysert i natriumdodecylsulfat(SDA)-polyacrylamid-gelelektrof orese (PAGE) -buf f er og målt ved hjelp av SDS-PAGE
i overensstemmelse med Laemmli, Nature (1970) 227:680-685. Proteiner med 22.000 dalton var.tilstede i høye nivåer i
E. coli W3110 fra begge de to genkonstruksjoner. Videre bandt begge de to 22.000 dalton store proteiner seg i "Western blot assays" (se Krivi and Rowold, Hybridoma (1984) 3:252-262 til et monoklonalt antistoff, F11-A1-B6, (Se Id.) produsert mot bovin hypofysesomtaotropin, og bekreftet derved at polypeptidene er beslektet med hypofysesomatotropin. E. coli W3110-celler som bar opphavsplasmidet pBR322 produserte ikke et protein med 22.000 dalton som bindes til anti-somatotropin-antistoffer.
Bakterier som bar ekspresjonsplasmidene pMON3209, pMON3214, pBGH ©X"™ x, og pMON3215 ble lagret på følgende måte.
En enkel koloni av E. coli W3110 transformert med et av plasmidene (pMON3209 eller pMON3215 eller pMON3214 eller pBGH 6X""X,), ble dyrket over natten ved 37 C i 5 ml LB pluss 12,5 ug/ml tetracyklin med luftinnblåsing. En 1 ml aliquot fra hver av kulturene som hadde stått over natten, ble tilsatt separat til individuelle kolber som inneholdt 25 ml LB pluss 12,5 ug/ ml tetracyklin, og dyrket til en OD.^ = 1,0. Cellene fra
6 U U
hver kolbe ble så innhøstet ved sentrifugering ved 6000 x g ved 4°C i 5 minutter. Pelletene ble hver for seg resuspendert i 12 ml LB pluss 7,5% (volum/volum) DMSO og umiddel-
bart nedfryst på tørris i 1 ml aliquoter. Cellene ble så lagret i en fryser med flytende nitrogen. I tillegg ble ca.
10.ug renset plasmid-DNA lagret ved -80°C.
b. Ekspresjon av pGH( A)- kodende DNA- sekvens
Som vist i fig. 10, ble den pGH(A)-kodende sekvens som bæres på den rekombinante vektor Ml3mp9/PGH SX ~_™ x,(ala) brukt til å erstatte den bGH(L)-kodende DNA-sekvens som bæres på en modifisert <p>BGHex_1~ekspresjonsvektor. Den modifiserte ekspresjonsvektor, pBGH " x ,x, omfatter en pBGH SX X.. ekspresjonsvektor hvor Ecorl-restriksjonsstedet beliggende oppstrøms for trypto-fanpromoteren (ptrp) er blitt fjernet (se figur 9). Den modifiserte pBGH 6X ™" X,x-ekspresjonsvektor ble frembragt ved partiell Ecorl-spalting av pBGH , x etterfulgt av SI-nukleasebehand-ling for å fjerne overhengene. Den innskrenkede pBGH cX™ X, - vektor ble så på nytt gjort ringformet ved bruk av T4 DNA-ligase og brukt til å transformere E. coli JM101, alt som tidligere beskrevet. Plasmid-DNA fra enkeltstående kolonier ble deretter undersøkt med hensyn på et EcorI/HindIII-fragment med 590 basepar som bærer den pGH(A)-kodende sekvens og et Ecorl/Pstl-fragment med 1050 basepar som bærer prtp-sekvensen (se figur 9). Fjerning av dette Ecorl-restriksjonssted letter den stedspesifikke innføyning av den pGH(A)-kodende sekvens i pBGH 6X ~_~ X,x,ekspresjonsvektoren i den korrekte orientering som vist i figur 10. Den således dannede rekombinante ekspresjonsvektor henvises heretter til som pMON3213. Blandingen som inneholder pMON3213 ble deretter brukt til å transformere E. coli W3110 og transformantene ble dyrket og valgt ut som beskrevet ovenfor. E. coli W3110 inneholdende pMON3213 har ATCC deponeringsnummer 53023. Erstatning av den pBGH(L)-kodende sekvens med en pGH(A)-kodende sekvens i pBGH GX ~_~ X.x-ekspresjonsvektoren ble bekreftet ved å isolere pMON3213-DNA og deretter spalte ekspresjonsvektoren med Ecorl og Hindlll for å frembringe et fragment med 590 basepar og spalte med Haelll for å påvise tilstedeværelsen av et ytterligere Haelll restriksjonsfragment frembragt gjennom tilstedeværelsen av et alaninkodon i den pGH(A)-kodende DNA-sekvens. Endelig bekreftelse på tilstedeværelsen av den pGH(A)-kodende DNA-sekvens i pMON3213 ekspresjonsvektoren ble utført ved delvis sekvensbestemmeIse av EcorI/HindIII-fragmentet med 590 basepar som tidligere beskrevet.
Ekspresjon av den pGH(A)-kodende DNA-sekvens og produksjon av pGH(A) i E. coli W3110 ble oppnådd på den måte som er angitt for bGH(A ,L)- og bGH(A,V)-produksjon som er beskrevet ovenfor. På samme måte ble det oppnådd høye nivåer av et protein med 22.000 dalton som lar seg påvise ved hjelp av SDS/PAGE som beskrevet ovenfor.
E. coli W3110 med pMON3213 ekspresjonsvektoren ble lagret
som tidligere beskrevet og anvendt ved produksjon av pGH(A)
i stor skala (10 - 100 liter fermentering), også som tidligere beskrevet. Innholdet av pGH(A)-protein i den 100 liter store satsvise fermentering var igjen omtrent 1 g/liter dyrkingsvæske målt ved hjelp av radioimmunkvantifisering ifølge Rosner et al., J. Immunol. Methods (1982) 52:175-181.
Eksempel 4
Dette eksempel ble utført for å bestemme den N-terminale aminosyresekvens i de heterologe proteiner bGH(A,L), bGH(A,V), met-bGH(V), met-bGH(L) og pGH(A) produsert i bakterier som eksempler på fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Somatotropinpolypeptidene produsert i E. coli ble renset fra rå, oppløseliggjorte refraktile legemer som inneholder enten bGH(A,L), bGH(A,V), met-bGH(V), met-bGH(L) eller pGH(A) ved hjelp av immunadsorbentkromatografi som beskrevet av Krivi & Rowold, Hybridoma (1984) 3:151-161. Alle tre somatotropinarter renset ved hjelp av immunadsorbentkromatografi syntes å være mer enn 95% rene målt ved SDS/PAGE-analyse av 1 g renset protein kjørt på en 7,5 - 15% (vekt/volum) gradient-gel utført i henhold til fremgangsmåten ifølge Laemmli, Nature
(1970) 227:680-685. Proteinkonsentrasjoner i de rensede bGH-arter ble bestemt ved hjelp av rutinemessig HPLC-analyse.
Proteiner renset ved hj>elp av immunaffinitetskromato-grafi for bruk i analyse av N-terminal sekvens ble grundig dialysert mot vann og deretter lyofilisert. Før N-terminal sekvensanalyse ble de rensede proteiner resuspendert i ammo-niumbicarbonatbuffer omfattende 50mM ammoniumbicarbonat pluss 0,1% (vekt/volum) SDS og dialysert mot den samme buffer for å fjerne resterende tris(hydroxymethyl)aminomethan(tris) og glycin. Deretter ble et apparat av type "Applied Biosystems Protein Sequencer Model 47OA" (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) anvendt til alle N-terminale sekvenseringsanalyser, som beskrevet av Hunkapiller et al. (1983), Methods in Enzymol. 91:399-413 og Hunkapiller et al. (1983), Methods in Enzymol. 91:486-493.
Tabell 2 nedenunder viser resultatene fra sekvensana-lysene for flere fremstillinger av bGH(A,L)bGH(A,V)-, met-bGH(L)- og pGH(A)-polypeptider. Mengden av protein med N-terminal methionin er vist i tabellen som en prosent av den totale mengde somatotropin i prøven. Fremgangsmåtene ble brukt til methioninkvantifisering. Med den indirekte metode ble mengden av NH^-met-ala-phe.•• i en i det alt vesentlige NH2~ala-phe....-populasjon beregnet ut fra forskjeller i forsinkelsessignaler. Ettersom denne fremgangsmåte avhenger av et anslag av "normal" sekvensforsinkelse, som varierer fra syklus til syklus, er den bare et grovt anslag av den tilstedeværende NH2~ala-phe...-sekvens. Ved den direkte fremgangsmåte som omfatter en Edman nedbrytningsreaksjon, ble signalstyrke fra PTH-met sammenlignet med PTH-ala etter fra-skilling av PTH-met fra kjemisk "bakgrunnsstøy" ved hjelp av HPLC "PTH" står for fenylthiohydantoin. Nærmere bestemt be-står Edman sekvenseringsreaksjon med nedbrytning i å omsette den N-terminale aminosyre med et reagens som forårsaker spalting av aminosyren, samt dens derpå følgende frigivelse som et PTH-derivat av aminosyren. Den sistnevnte fremgangsmåte vil gi gode anslag av prosent met-ala-phe.... så lenge forurensning med fri aminosyre er lav.
Som vist ved de N-terminale sekvenseringsresultater som er gjengitt i tabell 2 nedenunder, iakttas det ikke noe bevis for methioninbearbeiding når det N-terminale methionin etterfølges av fenylalanin. Imidlertid har 80% eller mer av molekylene fremstilt fra MBS(A,L)- og MBS(A,V)-genkonstruk-sjonene alanin i stedet for methionin i N-enden. Utstrekningen av methioninbearbeiding i N-enden er variabel i celler fra forskjellige fermenteringer, men oppstår alltid i minst 80%
av somatotropinmolekylene. Dertil ble det oppnådd produksjons-nivåer på omtrent 10 til 15% av det totale bakterieprotein for somatotropinene produsert i de transformerte mikroorganismer.
Eksempel 5
Dette eksempel ble utført for å bestemme evnen til bGH-artene produsert i bakterier når det gjelder å stimulere melkeproduksjon i melkekyr. Som vist i tabell 3 nedenunder, stimulerte både bGH(A,V) og met-bGH(V) uventet melkeproduksjon i en større utstrekning enn deres respektive leucin-holdige analoger, bGH(A,L) og met-bGH(L). Dertil oppviste de valinholdige bGH-arter som ble testet, når de ble sammenlignet kollektivt mot de leucinholdige bGH-arter testet, en statistisk (p = 0,02). større økning i melkeproduksjon.
Undersøkelsen ble i korte trekk utført på følgende måte. Holstein kyr i det andre og tredje trimester av melkedannelse ble gitt 5 ml natriumbicatbonatoppløsning, pH 9,8 - 0,5, alene (her henvist til som "kontrollprøve) eller inneholdende ca.
25 mg bGH(A,V), bGH(A,L), met-bGH(V) eller met-bGH(L) (her henvist samlet til som "test-somatotropiner"), daglig. Alle test-somatotropiner og kontrollprøver ble administrert paren-teralt ved intramuskulær injeksjon i semitendinosus-muskelen daglig i 21 på hverandre følgende dager. Den individuelle melkeproduksjon hos hver ku ble målt ved hver formiddags-
og ettermiddagsmelking idet man begynte 6 dager før den første daglige injeksjon og sluttet på dag 21 med injeksjon. Melke-fett/ protein og somatiske celler ble analysert ukentlig av DHIA Test Laboratory ved DHIA Testing Center, Springfield, Missouri, 65803. Resultatene som er gjengitt i tabell 3 nedenunder, indikerer at økningen i melkeproduksjon som skyldtes administrering av bGH(A,V) til kyr, var ca. 50% større enn den som ble oppnådd ved å bruke bGH(A,L), og ca. 17% større for met-bGH(V) sammenlignet med met-bGH(L). Slike uventede produktivitetsfordeler tilveiebragt ved hjelp av de valinholdige bGH-arter ifølge oppfinnelsen, utgjør klart en svært stor potensiell økonomisk fordel for melkeprodu-senter.
Claims (11)
1. Fremgangsmåte for bakteriell fremstilling av et polypeptid med et N-terminalt alanin, og som har somatotropinaktivitet og melkedannelsesøkende virkning, hvor polypeptidet er valgt fra gruppen bestående av. bovint veksthormon bGH(A,L) og bGH(A,V), og porcint veksthormon pGH(A), idet ekspresjonsplasmidet er illustrert ved pMON 3209, pMON 3215 eller pMON 3213 i figurene 5, 6 og 10,
karakterisert ved at ekspresjon av heterolog DNA i Escherichia coli forårsakes, idet den nevnte DNA inneholder kodonene for polypeptidet, inkludert et alaninkodon umiddelbart nedstrøms fra et metioninkodon som er translasjonsstartsignalet for polypeptidet, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, hvor ekspresjonen resulterer i fremstilling i de utvalgte bakterier av et fullt ferdig polypeptid med et N-terminalt alanin, og det resulterende polypeptid med et N-terminalt alanin fremstilt i bakteriene utvinnes.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den nevnte kodende DNA-sekvens inneholder en modifisert nukleotidsekvens innført i polypeptidets N-terminale, kodende del som gir et forøkt ekspresjonsnivå for polypeptid i forhold til cDNA fremstilt fra det naturlig forekommende gen, hvor den modifiserte nukleotidsekvens koder for den samme aminosyresekvens som den nevnte cDNA fremstilt fra det naturlig forekommende gen.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at minst 80 vekt% av det fullt ferdige bovine veksthormonpolypeptid fremstilt i bakteriene fra ekspresjon av den nevnte DNA inneholder det N-terminale alanin.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at minst 95 vekt% av det
fullt ferdige bovine veksthormonpolypeptid fremstilt i bakteriene fra ekspresjon av den nevnte DNA inneholder det N-terminale alanin.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekspresjonen resulterer i lysbrytende partikler i bakteriene, som er synlige ved bruk av et fasekontrastmikroskop, og som omfatter det fullt ferdige bovine veksthormonpolypeptid med et N-terminalt alanin.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at Escherichia coli-bakteriene er valgt fra gruppen med ATCC-deponeringsnumrene 39936, 53009, 53010, 53022, 53023 og 53024, som intracellulært fjerner metioninet og etterlater det resulterende polypeptid med et N-terminalt alanin.
7. Preparat,
karakterisert ved at det omfatter pGH(A) fremstilt bakterielt ifølge kravene 1-6 som er i det vesentlige fritt for andre porcine molekylarter, i kombinasjon med fysiologisk akseptable bærere.
8. Rekombinant DNA-vektor,
karakterisert ved at den er illustrert ved pMON 3213 i figur 10 og valgt fra et bakterielt plasmid og en bakteriofag som hver har innføyd DNA som inneholder et metioninkodon, umiddelbart etterfulgt av en kodende sekvens for et pGH(A)-polypeptid, inkludert et alaninkodon umiddelbart ned-strøms for metioninkodonet, hvor metioninkodonet tjener som translasjonsstartsignalet for polypeptidet, og hvor vektoren inneholder transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som er i stand til å styre ekspresjon av den nevnte DNA i bakterier.
9. Rekombinant DNA-vektor ifølge krav 8, karakterisert ved at den nevnte kodende DNA-sekvens inneholder en modifisert nukleotidsekvens innført i polypeptidets N-terminale, kodende del som gir et forøkt ekspresjonsnivå for polypeptid i forhold til cDNA fremstilt fra det naturlig forekommende gen, hvor den modifiserte nukleotidsekvens koder for den samme aminosyresekvens som den nevnte cDNA fremstilt fra det naturlig forekommende gen.
10. Rekombinant vektor som er i stand til å uttrykke bGH(A,L) og bGH(A,V),
karakterisert ved at den er illustrert ved pMON 3209 og pMON 3215 i figurene 5 og 6, og at den videre separat inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte protein med et N-terminalt alaninkodon og et metioninkodon som tjener som translasjonsstartsignal, og hvor DNA-sekvensen er etterfulgt av et translasjonsstoppsignal, og er i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som muliggjør ekspresjon i E. coil.
11. Vektor ifølge krav 10,
karakterisert ved at de første 21 kodonene for bGH(A,V) eller bGH(A,L) er GCC TTC CCA GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT CGT GCT CAG CAT CTT.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/704,362 US4861868A (en) | 1985-02-22 | 1985-02-22 | Production of proteins in procaryotes |
| US06/824,202 US5037806A (en) | 1985-02-22 | 1986-02-04 | Biologically active method using somatotropins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO860658L NO860658L (no) | 1986-08-25 |
| NO300551B1 true NO300551B1 (no) | 1997-06-16 |
Family
ID=27107310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO860658A NO300551B1 (no) | 1985-02-22 | 1986-02-21 | Fremgangsmåte for bakteriell fremstilling av et polypeptid, preparat som omfatter et slikt, samt rekombinant DNA-vektor |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5037806A (no) |
| EP (1) | EP0193515B1 (no) |
| JP (3) | JP2583214B2 (no) |
| KR (1) | KR920000849B1 (no) |
| CN (3) | CN1021973C (no) |
| AT (1) | ATE141327T1 (no) |
| AU (2) | AU596575B2 (no) |
| CA (1) | CA1338981C (no) |
| DE (1) | DE3650553T2 (no) |
| DK (1) | DK80886A (no) |
| ES (1) | ES8801851A1 (no) |
| GR (1) | GR860509B (no) |
| HU (1) | HU210671B (no) |
| IE (1) | IE80663B1 (no) |
| IL (4) | IL112403A (no) |
| LT (1) | LT3916B (no) |
| MX (1) | MX9203728A (no) |
| NO (1) | NO300551B1 (no) |
| NZ (1) | NZ215260A (no) |
| PT (1) | PT82070B (no) |
| RO (1) | RO106956B1 (no) |
| RU (2) | RU2072393C1 (no) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7101981B1 (en) | 1980-08-26 | 2006-09-05 | Regents Of The University Of California | Bovine growth hormone recombinantly produced in E. coli |
| US6692941B1 (en) | 1980-08-26 | 2004-02-17 | The Regents Of The University Of California | Bovine growth hormone |
| US5141922A (en) * | 1985-02-22 | 1992-08-25 | Monsanto Company | Biologically active proteins and a method for their use |
| US4861868A (en) | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
| JPH06104070B2 (ja) * | 1985-06-26 | 1994-12-21 | ジ・アップジョン・カンパニ− | 形質転換した微生物からのソマトトロピンの精製 |
| AU599922B2 (en) * | 1985-09-10 | 1990-08-02 | Natinco Nv | Improving carcass quality |
| HUT43625A (en) | 1986-03-27 | 1987-11-30 | Monsanto Co | Process for increasing yield of proteins with applying new ribosomal binding positions in bacteria |
| GB8701848D0 (en) * | 1987-01-28 | 1987-03-04 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US5104806A (en) * | 1987-03-12 | 1992-04-14 | Amgen, Inc. | Porcine growth hormone analogs encoding dna |
| US5244882A (en) * | 1987-03-12 | 1993-09-14 | Amgen, Inc. | Porcine growth hormone analogs, and compositions |
| US4863736A (en) | 1987-03-16 | 1989-09-05 | Monsanto Company | Somatotropin prolonged release |
| ATE152176T1 (de) * | 1988-02-17 | 1997-05-15 | Upjohn Co | Verfahren zum regeln des norleucingehalts in polypeptiden |
| US5130422A (en) * | 1988-08-29 | 1992-07-14 | Monsanto Company | Variant somatotropin-encoding DNA |
| US5089473A (en) | 1988-08-29 | 1992-02-18 | Monsanto Company | Somatotropin variants and their use |
| DK0482124T3 (da) * | 1989-07-10 | 1994-04-25 | Upjohn Co | Somatotropinanaloger |
| US5663305A (en) * | 1989-07-10 | 1997-09-02 | The Upjohn Company | Somatotropin analogs |
| DE3930522A1 (de) * | 1989-09-13 | 1991-03-21 | Bayer Ag | Rekombinante aprotinin-varianten - gentechnisches verfahren zur mikrobiellen herstellung von homogen prozessierten aprotinin-varianten sowie die therapeutische anwendung derselben |
| US6583115B1 (en) | 1989-10-12 | 2003-06-24 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Methods for treating acromegaly and giantism with growth hormone antagonists |
| US5958879A (en) * | 1989-10-12 | 1999-09-28 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Growth hormone receptor antagonists and methods of reducing growth hormone activity in a mammal |
| US6787336B1 (en) | 1989-10-12 | 2004-09-07 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | DNA encoding growth hormone antagonists |
| US5350836A (en) * | 1989-10-12 | 1994-09-27 | Ohio University | Growth hormone antagonists |
| US5951972A (en) * | 1990-05-04 | 1999-09-14 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues |
| US5767080A (en) * | 1996-05-01 | 1998-06-16 | Cargill, Incorporated | Enhanced milk production in dairy cattle |
| GB9803424D0 (en) * | 1998-02-18 | 1998-04-15 | Pfizer Ltd | Performance enhancement |
| CN1322211A (zh) | 1998-10-05 | 2001-11-14 | 武田药品工业株式会社 | 除去n－末端蛋氨酸的方法 |
| US6890731B1 (en) * | 2000-03-27 | 2005-05-10 | Applera Corporation | Isolated human G-protein coupled receptors that are members of the aminergic subfamily, nucleic acid molecules encoding human GPCR proteins, and uses thereof |
| CN101665788B (zh) * | 2009-09-21 | 2011-11-09 | 山西大学 | 人工合成猪生长激素基因及其表达纯化方法 |
| CN101907626A (zh) * | 2010-07-20 | 2010-12-08 | 广东省农业科学院兽医研究所 | 一种猪饲料中猪源蛋白的检测方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4443539A (en) * | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
| IL59690A (en) | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
| IE52755B1 (en) | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
| JPS58996A (ja) * | 1981-06-01 | 1983-01-06 | ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・ミシガンステ−トユニバ−シテイ− | 細菌中での牛成長ホルモン遺伝子のクロ−ン化 |
| US4436824A (en) * | 1981-06-09 | 1984-03-13 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Leukocyte migration through antigen containing agaroses for immunocompetence testing |
| EP0085036A1 (en) * | 1982-01-18 | 1983-08-03 | Monsanto Company | Method for improved bovine milk production |
| DE3380262D1 (en) | 1982-05-25 | 1989-08-31 | Lilly Co Eli | Cloning vectors for expression of exogenous protein |
| CA1224432A (en) * | 1982-08-17 | 1987-07-21 | Gary N. Buell | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| AU2092983A (en) * | 1982-11-08 | 1984-05-17 | Genentech Inc. | Porcine growth hormone produced by recombinant dna technology |
| EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
| US4661454A (en) * | 1983-02-28 | 1987-04-28 | Collaborative Research, Inc. | GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene |
| CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
| ES8702440A1 (es) * | 1984-10-04 | 1986-12-16 | Monsanto Co | Un procedimiento para la preparacion de una composicion de polipeptido inyectable sustancialmente no acuosa. |
| US4861868A (en) * | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
-
1986
- 1986-02-04 US US06/824,202 patent/US5037806A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-20 ES ES552234A patent/ES8801851A1/es not_active Expired
- 1986-02-21 RO RO133757A patent/RO106956B1/ro unknown
- 1986-02-21 NZ NZ215260A patent/NZ215260A/xx unknown
- 1986-02-21 GR GR860509A patent/GR860509B/el unknown
- 1986-02-21 KR KR1019860001221A patent/KR920000849B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 NO NO860658A patent/NO300551B1/no not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 CA CA000502495A patent/CA1338981C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-21 EP EP86870024A patent/EP0193515B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-21 DE DE3650553T patent/DE3650553T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-21 IL IL11240386A patent/IL112403A/en not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 IL IL7795086A patent/IL77950A/en not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 CN CN86101830A patent/CN1021973C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-21 CN CN90108714A patent/CN1051302A/zh active Pending
- 1986-02-21 IL IL11240286A patent/IL112402A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 AT AT86870024T patent/ATE141327T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 HU HU86742A patent/HU210671B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 JP JP61037158A patent/JP2583214B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-21 PT PT82070A patent/PT82070B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-02-21 AU AU53854/86A patent/AU596575B2/en not_active Ceased
- 1986-02-21 DK DK80886A patent/DK80886A/da unknown
- 1986-02-24 IE IE46786A patent/IE80663B1/en not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-10-13 AU AU42825/89A patent/AU632293B2/en not_active Ceased
-
1990
- 1990-08-20 RU SU4830848/13A patent/RU2072393C1/ru not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-29 MX MX9203728A patent/MX9203728A/es active IP Right Grant
- 1992-08-03 RU SU5052718/13A patent/RU2094439C1/ru not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-01-28 LT LTIP1819A patent/LT3916B/lt not_active IP Right Cessation
- 1994-05-10 CN CN94105667A patent/CN1100272A/zh active Pending
-
1995
- 1995-01-20 IL IL11240395A patent/IL112403A0/xx unknown
- 1995-05-26 JP JP7128637A patent/JP2634390B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-05-26 JP JP7128636A patent/JP2863113B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO300551B1 (no) | Fremgangsmåte for bakteriell fremstilling av et polypeptid, preparat som omfatter et slikt, samt rekombinant DNA-vektor | |
| US5028530A (en) | AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques | |
| AU634517B2 (en) | Somatotropin analogs | |
| US5206154A (en) | Method of producing cecropins by microbiological techniques | |
| US4861868A (en) | Production of proteins in procaryotes | |
| EP0460709B1 (en) | AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques | |
| EP0456642A1 (en) | Somatotropin analogs | |
| CA1340122C (en) | Modifications of somatotropins for enhanced stability | |
| US5141922A (en) | Biologically active proteins and a method for their use | |
| AU5945290A (en) | Somatotropin analogs | |
| US5130422A (en) | Variant somatotropin-encoding DNA | |
| US5663305A (en) | Somatotropin analogs | |
| JPH05504063A (ja) | 小蛋白およびペプチドの産生に有用なｒａｌ―４ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |