DE3650276T2 - Proteinreinigung. - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Erythropoietin- Reinigung unter Einsatz chromatographischer Techniken.
- Zahlreiche Techniken sind in der Vergangenheit bei der präparativen Trennung biochemisch bedeutsamer Materialien angewendet worden. Üblicherweise eingesetzte präparative Trenntechniken schließen ein: Ultrafiltrationl Säulenelektrofokussierung, Flachbettelektrofokussierung, Gelfiltration, Elektrophorese, Isotachophorese und verschiedene Formen von Chromatographie. Unter den üblicherweise eingesetzten chromatographischen Techniken sind Ionenaustauschchromatographie und Adsorptionschromatographie. Das erstere Verfahren ist eine Trennmethode, bei der fluide Komponenten mit unterschiedlichen Nettoladungen unterschieden und mittels Elution (schrittweise oder mit einem kontinuierlich angewendeten Gradienten) mit Elutionsmitteln unterschiedlicher Ionenstärke isoliert werden. Eine Gelmatrix (Harz), die entweder eine positive oder negative Ladung trägt, wird eingesetzt, um Komponenten entgegengesetzter Nettoladung zu adsorbieren (zu binden). Während der Desorption (Elution) werden eingebrachte Probenkomponenten durch Salz-Ionen im ausgewählten Elutionsmittel ausgetauscht, wobei spezifische Probenkomponenten bei spezifischen Ionenstärken eluieren. Umkehrphasenadsorptionschromatographie umfaßt die Trennung von Komponenten einer fluiden Probe auf der Grundlage unterschiedlicher Polarität. Probenkomponenten werden an eine granulierte Gelmatrix (Harz) durch nicht-kovalente Bindungen adsorbiert. Danach führt schrittweise Elution oder Elution mit kontinuierlichem Gradienten zu selektiver Desorption von Komponenten bei Austausch mit einem nicht-polaren Lösungsmittel im Elutionsmittel.
- Während zahlreiche Trenntechniken, die oben erwähnt sind, routinemäßig bei der Trennung von relativ kleinen hydrophoben und hydrophilen Molekülen eingesetzt werden, besitzen sie ziemlich eingeschränkte Anwendbarkeit bei präparativen Trennungen von relativ großen Molekülen, wie etwa Proteinen, insbesondere komplexen Proteinen, wie etwa Lipoproteinen, Nucleoproteinen und Glykoproteinen. Veranschaulichend für den Stand der Technik bei Proteintrennungen sind Übersichten von Brown et al., Analytical Biochemistry, 99, 1-21 (1979) und Rubinstein, Analytical Biochemistry, 99, 1-7 (1979). Siehe auch "VYDAC Comprehensive Guide to Reverse Phase Materials for HPLC", The Sep/A/Ra/Tions Groups, Hesperia, CA. und die Veröffentlichung der gemeinsamen Anmelder Strickland und Mitarbeiter in Parsons et al., Endocrinology, 114, (6), 2223-2227 (1984). Außerdem haben in dem Umfang, in dem zum Beispiel Umkehrphasen-HPLC- Prozesse bei Isolationen von Proteinen oder Polypeptiden vorgeschlagen oder eingesetzt worden sind, nicht-polare Lösungsmittel, die allgemein empfohlen worden sind, Reagenzien eingeschlossen, die schwierig zu handhaben oder vom gewünschten Protein zu trennen sind, wie etwa Acetonitril. Siehe Parsons et al., aaO.. Es ist nur eine einzige existierende Literaturstelle bekannt, die Elutionen mit Ethanol offenbart, genauer gesagt wäßrigen Ethanol/Ameisensäure-Mischungen. Siehe Takagaki et al., Journal of Biological Chemistrv, 5, (4), 1536-1541 (1980).
- Lange et al., Blood Cells, 10:305-314 (1984) berichten über Reinigung von Urin-EPO, indem es einer C&sub8;-RP-HPLC-Chromatographie mit einem Trifluoressigsäure-Elutionsgradienten im Anschluß an eine anfängliche Behandlung durch Ausschlußchromatographie unterzogen wird. Dasselbe Ausschlußchromatographie- Produkt wurde auch einer Hochleistungs-Ionenaustauschchromatographie unterzogen, aber keine Kombination von Ionenaustauschund Umkehrphasenreinigunssystemen wurde vorgeschlagen.
- Die offensichtliche beschränkte Brauchbarkeit der oben angegebenen Techniken bei präparativen Trennungen von komplexen Proteinen mit hohem Molekulargewicht ist problematisch im Hinblick auf jüngste intensive Bemühungen, die auf die Isolation, Reinigung und Anwendung therapeutischer, immunprophylaktischer und diagnostischer Verfahren einer breiten Vielfalt von komplexen viralen und eukaryontischen Proteinen gerichtet gewesen ist, die in nur sehr geringen Mengen aus natürlichen Quellen verfügbar sind, in denen sie in Assoziation mit Myriaden von anderen komplexen Proteinen angetroffen werden. Als ein Beispiel sind biochemisch bedeutsame Säugetier-Blutbildungsfaktoren, wie etwa Erythropoietin, Thrombopoietin, Granulopoietin und Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, in extrem kleinen Mengen aus Urin von Patienten mit aplastischer Anämie verfügbar. Gewinnungsverfahren aus Urinflüssigkeitsquellen sind im allgemeinen sehr komplex, kostspielig und arbeitsintensiv gewesen und haben relativ niedrige Ausbeuten an aktiven Produkt geliefert. Eine im breiten Maße praktizierte Methode zur Gewinnung biologisch aktiver Zubereitungen von Urin-Erythropoietin (einem Glykoprotein mit hohem Molekulargewicht und hohem Sialinsäuregehalt) ist zu finden bei Miyake et al., Journal of Biological Chemistrv, 252, (15), 5558-5564 (1977). Das siebenstufige Verfahren schließt Ionenaustauschchromatographie, Ethanolausfällung, Gelfiltration und Adsorptionschromatographie ein und es wird berichtet, daß es Erythropoietin mit einer spezifischen Aktivität von 128.620 IU/AU liefert.
- Die umfassende Anwendung rekombinanter Methodiken zur Herstellung von eukaryontischen Proteinen im Großmaßstab haben die Aussichten beträchtlich erhöht, daß die gewünschten Moleküle in größeren Mengen erhältlich sind und in einigen Fällen sogar vereinfachte Reinigungsverfahren benötigt werden, um biologisch aktive Materialien zu erhalten. Beispielhaft können, wo die gewünschten rekombinanten Proteine nicht glykosyliert sein müssen, um biologische Aktivität zu besitzen, große Mengen an Protein produziert werden in E.coli-Rekombinationswirten in der Form unlöslicher "Einschlußkörperchen", die wenige proteinhaltige Verunreinigungen, Proteasen und dergleichen enthalten. Wo Glykosylierung und/oder Wirtsmembranverarbeitung, um die richtige Sekundär- und Tertiär-Konformation zu entwikkeln, für biologische Aktivität erforderlich sind, liefern eukaryontische Wirte, wie etwa Hefe und Säugetierzellen in Kultur (z.B. COS-1- und CHO-Zellen) jedoch geeignetere Rekombinationswirte. Die Verwendung solcher Wirte führt jedoch im allgemeinen zu erhöhten Schwierigkeiten bei der Gewinnung von biologisch aktiven Formen von Proteinen in guter Ausbeute. Wirtszellysate schließen häufig proteinhaltige Bestandteile mit hinreichend ähnlichen Eigenschaften von Molekulargewicht, Ladung, Polarität und Löslichkeit (gegenüber dem rekombinanten Protein) ein, so daß eine einfache Trennung erschwert wird. Außerdem liefern proteolytische Enzyme, die für den Wirt endogen sind, eine relativ chronische Quelle von Verlust an biologischer Aktivität für das gewünschte Protein. Wo rekombinante Produkte von den Wirtszellen in Medienuberstände sekretiert werden, begleiten ähnliche Probleme die Isolation aus z.B. Kulturmedien aus dem Wachstum von transformierten Säugetierzellkulturen, hauptsächlich aufgrund der Komplexität der eingesetzten Medien.
- Es besteht somit weiterhin ein Bedürfnis in der Technik nach schnellen und effizienten präparativen Trennverfahren, die zur Gewinnung von biologisch aktiven rekonbinanten Erythropoietin aus verschiedenen "verunreinigten" Flüssigkeiten, wie etwa Säugetierzellkulturüberständen, geeignet sind.
- WO 85/02610, veröffentlicht am 20. Juni 1985, betrifft den Hintergrund der vorliegenden Erfindung, insbesondere in Bezug auf den Stand der Technik im Hinblick auf rekombinante Methodiken, die zur Produktion von Säugetier-Erythropoietin im Großmaßstab angewendet werden.
- Die vorliegende Erfindung stellt neuartige chromatographische Trennverfahren zur Verfügung, die einzeln oder zusammen zur Verwendung bei der Isolation von Erythropoietin, insbesondere rekoiabinantem Erythropoietin, in biologisch aktiver Form aus Flüssigkeiten, insbesondere Säugetierwirtszellkulturüberständen, geeignet sind.
- Gemäß einem ihrer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung die effiziente Gewinnung von Erythropoietin aus einer Flüssigkeit mittels Ionenaustauschchromatographie zur Verfügung, die selektive Bindung von Erythropoietin an ein ausgewähltes kationisches Harz, Stabilisierung gebundener Materialien, um gegen Säureaktivierung von vorhandenen Proteasen zu schützen, selektive Elution gebundener Materialien mit pKa's, die größer sind als derjenige von Erythropoietin, mit wäßriger Säure bei einem pH von 4,0 bis 6,0 und anschließende Elution mit wäßrigem Salz bei etwa pH 7,0 umfaßt. Erythropoietin enthaltende Elutionsmittelfraktionen sind angereichert mit biologisch aktiven Material, können fakultativ aber einer Weiterverarbeitung unterzogen werden, z.B. durch Gelfiltration bei Entfernung von Ethanol. In einer gegenwärtig hoch bevorzugten Art und Weise der praktischen Umsetzung dieses Aspekts der Erfindung werden hohe Ausbeuten an biologisch aktiven rekombinanten Erythropoietin aus Säugetierwirtszellkulturüberständen durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Agaroseharz gewonnen. Im Anschluß an die Beladung der DEAE-Säule wird Harnstoff zugegeben, um gegen anschließende Säureaktivierung von vorhandenen Proteasen zu schützen, und gebundene fluide Komponenten mit größeren pKa's als Erythropoietin werden mit wäßriger Säure bei etwa pH 4,3 eluiert. Danach wird der pH auf etwa 7,0 eingestellt und wäßriges Salz wird schrittweise oder in einem kontinuierlichen Gradienten angewendet, um biologisch aktives Erythropoietin selektiv zu eluieren.
- In einem anderen ihrer Aspekte stellt die Erfindung ein Erythropoietin-Gewinnungsverfahren zur Verfügung, das serielle Anwendung der zuvor beschriebenen Ionenaustausch- und Umkehrphasenflüssigchromatographieverfahren umfaßt. Genauer gesagt wird Erythropoietin (insbesondere rekombinantes Erythropoietin) aus einer Flüssigkeit (wie etwa Säugetierwirtszellkulturüberstand) in der folgenden stufenweisen Art und Weise gewonnen. Kulturüberstandpools (vorzugsweise vorher diafiltriert und konzentriert) werden auf eine Ionenaustauschsäule bei etwa pH 7,0 geladen und Erythropoietin bindet sich selektiv an das kationische Harz (vorzugsweise DEAE-Agarose). Gebundene Materialien werden gegen Abbau durch säureaktivierte Protease (vorzugsweise durch Zugabe von Harnstoff) stabilisiert und gebundene Materialien mit größeren pKa's als Erythropoietin werden eluiert, indem mit einer oder mehreren wäßrigen Säuren bei von etwa pH 4,0 bis pH 6,0 (vorzugsweise etwa pH 4,3) gewaschen wird. Danach wird biologisch aktives Erythropoietin mit wäßrigem Salz bei etwa pH 7,0 eluiert. Die Erythropoietin enthaltenden Elutionsmittelfraktionen werden dann einer Umkehrphasenflüssigchromatographie auf einem C&sub6;- oder vorzugsweise C&sub4;-Harz unterzogen, um Erythropoietin selektiv zu binden. Gebundenes, biologisch aktives Erythropoietin wird dann bei von etwa pH 4,5 bis etwa pH 8,0 (vorzugsweise etwa pH 7,0) mit einer wäßrigen Ethanollösung mit von etwa 50 bis 80 (vorzugsweise etwa 60) Prozent eluiert. Das gewünschte Erythropoietin wird in Erythropoietin enthaltenden Elutionsmittelfraktionen isoliert (wie bestimmt durch Extinktion bei 280 nm). Ethanol kann dann entfernt werden und das Produkt kann einer Gelfiltration unterzogen werden (z.B. unter Verwendung einer Sephacryl-S-200-Säule), mit einer Entwicklung unter Verwendung von z.B. einen pharmazeutischen Formulierungspuffer, wie etwa 20 mM Natriumcitrat/100 mM Natriumchlorid, pH 6,8 bis 7,0. Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung der Praxis der bevorzugten Ausführungsformen derselben deutlich werden.
- Wir sind der Auffassung, daß die Praxis der vorliegenden Erfindung in geeigneter Weise durch die folgenden Beispiele veranschaulicht wird, die an gepoolten CHO-Zellüberständen durchgeführt wurden. die hergestellt worden sind in der Art und Weise, die in Beispiel 10 der vorgenannten WO 85/02610 beschrieben ist. Genauer gesagt wurden die behandelten überstände aus Zellstainm CHO pDSVL-gHuEPO gewonnen, der mittels MTX "amplifiziert" und in Rollflaschen in serumfreien Medium, wie beschrieben auf Seite 62 der Anmeldung, gezüchtet worden ist. Beispiel 1 betrifft allgemein die Gewinnung von biologisch aktivem, rekombinanten Human-Erythropoietin mittels einer Umkehrphasenflüssigchromatographie. Beispiel 2 betrifft ein zusammengesetztes Gewinnungsverfahren, das an demselben Überstandsmaterial durchgeführt wurde. Beispiel 3 betrifft RIA und in-vivo-Tests, die an den resultierenden gereinigten Materialien durchgeführt wurden.
- Nicht-konzentrierter Kulturüberstand, erhalten durch Poolen von ersten und zweiten (7 Tage) Zyklusüberständen, wurden auf eine geschlossene (Hochdruckkonfiguration) Säule geladen, die im Labor mit C&sub4;-Matrix (VYDAC 214TP-B) gepackt ist. Eine 0,45 x 10 mm-Säule wurde mit einem Durchfluß von 1 ml/min eingesetzt. Im Anschluß an das Aufbringen der Probe wurde biologisch aktives, rekombinantes Erythropoietin mit einem linearen Gradienten von 10 mM Tris, pH 7,0 bis 80% EtOH/10 mM Tris, pH 7,0 eluiert. Proteinkonzentration wurde Uv-überwacht bei 230 nm und die Elutionsmittelfraktionen wurden bei etwa 60% EtOH gepoolt.
- Das zusammengesetzte Gewinnungsverfahren dieses Beispiels bestand aus der seriellen Anweendung von Ionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographieverfahren, die an einer größeren Überstandsfraktion als in Beispiel 1 durchgeführt wurden. Den Chromatographieverfahren gingen Konzentrations- und Diafiltrationsschritte voran, und ihnen folgte ein Gelfiltrationsverarbeitungsschritt.
- Erste und zweite (7 Tage) Wachstumszyklusüberstände wurden getrennt dreißigfach unter Verwendung einer Pellicon-Ultrafiltrationseinheit (Millipore, Bedford, Mass.) mit einem Schnitt von MG 10.000 konzentriert. Konzentrierte erste und zweite Zyklusmedien wurden gepoolt und auf der Pellicon-Einheit gegen 10 mM Tris bei etwa pH 7,0 diafiltriert. (Die diafiltrierten Medien können fakultativ vor der Ionenaustauschchromatographie 20 uM in CuSO&sub4; gemacht werden.) Es kann angemerkt werden, daß jede Ultrafiltrationseinheit mit einem Schnitt von MG 10.000 oder 30.000 verwendet werden kann und der Diafiltrationsschritt gegen jeden Puffer mit geeigneter niedriger Ionenstärke bei einem pH von etwa 6,0 bis 8,5 durchgeführt werden kann.
- Das konzentrierte, diafiltrierte Medium aus Schritt 1 wurde auf eine Säule aus DEAE-Agarose mit relativ niedriger Dichte (Bio-Rad, Richmond, CA.) gepumpt. Die Säule wurde dann mit etwa vier Volumenteilen 5 mM Essigsäure/1 mM Glycin/6 M Harnstoff bei etwa pH 4,5 gewaschen. Fakultativ kann die Waschung 20 um CuSO&sub4; einschließen, um die Oxidation von Sulfhydrylgruppen auf dem unerwünschten Protein zu unterstützen. Glycin wurde einbezogen. um mit irgendwelchem vorhandenen Cyanat zu reagieren. Harnstoff dient dazu, gegen Säureaktivierung von Proteasen bei niedrigen pH zu stabilisieren und die Löslichmachung von Proteinen zu unterstützen. Im Anschluß an die Waschungen, die dazu dienen, gebundene Materialien mit größeren pKa's als Erythropoietin herauszueluieren, wurde die Säule mit 25 mM NaCl/10 mM Tris bei etwa pH 7,0 gewaschen, um zu neutralem pH zurückzukehren und Harnstoff zu entfernen. Biologisch aktives Erythropoietin wurde mit 75 mM NaCl/10 mM Tris bei etwa pH 7,0 eluiert. CuSO&sub4; (20 uM) kann fakultativ sowohl in die Neutralisierungswaschung und/oder den Elutionsschritt einbezogen werden.
- Das angewendete Verfahren war im wesentlichen wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß eine offene Säule, Niederdruckbetrieb eingesetzt wurde. Wenn Kupfersulfat in den Puffern in Schritt 2 oben eingesetzt wurde, wurde die Erythropoietin-Fraktion 1 mM in EDTA gemacht, bevor sie auf die Umkehrphasensäule geladen wurde, um die Entfernung von Kupfer zu erleichtern. Im Anschluß an die Identifizierung des Erythropoietin-"Peaks" in Gradientenfraktionen bei etwa 60% Ethanol, ist es bevorzugt, die gesammelte(n) Fraktion(en) fünffach mit z.B. 10 mM Tris bei pH 7,0 zu verdünnen, um die Ethanolkonzentration zu verringern und die Entfernung von Ethanol zu erleichtern. Ethanol wurde entfernt, indem das Erythropoietin an die DEAE-Säule gebunden und mit einer geringen Menge Puffer (20 mM Natriumcitrat/100 mM Natriumchlorid) eluiert wurde.
- Produkte von Schritt 3, aus denen Ethanol entfernt worden war, wurden auf eine Säule aus Sephacryl 5-200 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) geladen. Die Säule wurde unter Verwendung eines geplanten pharmazeutischen Formulierungspuffers aus 20 mM Natriumcitrat/100 mM Natriumchlorid bei pH 6,8 bis 7,0 entwickelt.
- Radioimmuntest- und in-vivo-Biotest-Verfahren wie beschrieben in der oben erwähnten WO 85/02610, wurden unter Verwendung des rekombinanten Erythropoietins durchgeführt, das durch die Verfahren von Beispiel 1 und 2 gewonnen worden war. Die experimentellen Daten zeigt Ausbeuten von 52 bzw. 16 Prozent für die Produkte von Beispiel 1 und 2, mit Verhältnissen von in-vivo- zu RIA-Aktivität von 1,02 und 1,3. Anschließende Wiederholungen des Verfahrens von Beispiel 2 an unterschiedlichen Überständen haben Ausbeuten in der Größenordnung von 30-50 Prozent geliefert.
- Die Reinheit des Erythropoietins nach den Reinigungsschritten von Beispiel 1 und Beispiel 2 beträgt wenigstens etwa 95% und im allgemeinen mehr als etwa 98%. Die Reinheit des rekombinanten Erythropoietins wurde durch nicht-reduzierende SDS-PAGE- Analyse, reduzierende SDS-PAGE-Analyse und Hochdruckflüssigchromatographie-Gelfiltration bestimmt. Die hochreinen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten weniger als 0,5% Chinahamster-Ovarzellen (CHO) und Rinderserumproteine, wie bestimmt mit einem ELISA-Test. Das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigte rekombinante Erythropoietin besitzt eine beträchtlich größere spezifische Aktivität als Erythropoietin, das zuvor unter Verwendung anderer Reinigungstechniken erhalten wurde. Zusätzlich enthalten die gereinigten rekombinanten Erythropoietinzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung weniger als 2,5 EU/ml Pyrogene, wie bestimmt durch Limulusamebocytentest. Außerdem enthalten die gereinigten Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung weniger als 10 pg DNA/10.000 Einheiten DNA-Verunreinigung, wie gemessen mit Dot-Blot-Analyse.
- Die hoch gereinigten rekombinanten Erythropoietinzusammensetzungen stellen eine pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung zur Verfügung, wobei unerwünschte Proteine entfernt sind. Die Entfernung unerwünschter Proteine aus rekombinantem Erythropoietin gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt eine gereinigte Zusammensetzung zur Verfügung, die im Ergebnis verringerte immunologische Reaktionen, d.h. Anaphylaxe, zeigt, wenn sie verwendet wird, um Menschen zu behandeln. Zusätzlich kann die Entfernung der unerwünschten Proteine die Stabilität der rekombinanten Erythropoietinzusainmensetzung durch Verhinderung des Abbaus des rekombinanten Erythropoietins durch verunreinigende hydrolytische Enzyme erhöhen.
- Obgleich die vorstehenden veranschaulichenden Beispiele Verfahren der Erfindung beschrieben haben, wie sie für die Gewinnung von Erythropoietin aus Säugetierzellkulturquellen praktiziert werden, sind wir der Auffassung, daß die Verfahren für Gewinnungen geeignet sind, die an anderen Kulturflüssigkeiten durchgeführt werden, wie etwa Säugetier-Lysat/Überstand-Kombination und ähnlichen Flüssigkeiten, die aus Hefezellkulturen gewonnen sind. In ähnlicher Weise wird erwartet, daß die einzelnen und zusammengesetzten Verfahren (und insbesondere die Ionenaustauschchromatographieverfahren) nützlich sind bei der Gewinnung von Erythropoietin aus natürlichen Quellen, wie etwa Urin.
Claims (11)
1. Ein Verfahren zur effizienten Gewinnung von
Erythropoietin aus einer Flüssigkeit, wobei besagtes Verfahren die
folgenden Schritte in Reihenfolge umfaßt:
Unterziehen der Flüssigkeit unter
Ionenaustauschchromatographietrennung bei etwa pH 7,0, wodurch Erythropoietin
in besagter Probe an ein kationisches Harz selektiv
gebunden wird;
Stabilisieren von an besagtes Harz gebundenen Materialien
gegen Abbau durch säureaktivierte Proteasen;
Selektives Eluieren gebundener verunreinigender
Materialien mit einem pKa, der größer ist als derjenige von
Erythropoietin, durch Behandlung mit wäßriger Säure bei
einem pH von etwa 4,0 bis 6,0; und
Selektives Eluieren von Erythropoietin durch Behandlung
mit einem wäßrigen Salz bei einem pH von etwa 7,0; und
Isolieren von Erythropoietin enthaltenden
Elutionsmittelfraktionen.
2. Das Verfahren von Anspruch 1, angewendet auf die
Gewinnung von rekombinantem Erythropoietin aus einer aus einer
Zellkultur gewonnenen Flüssigkeit.
3. Das Verfahren von Anspruch 2, angewendet auf die
Gewinnung von Erythropoietin aus einer aus einer
Säugetierzellkutur gewonnenen Flüssigkeit.
4. Das Verfahren von Anspruch 3, angewendet auf die
Gewinnung von Erythropoietin aus einem
Säugetierzellkulturüberstand.
5. Das Verfahren von Anspruch 1, angewendet auf die
Gewinnung von Erythropoietin aus Urinflüssigkeiten.
6. Das Verfahren von Anspruch 1, wobei das kationische Harz
ein DEAE-Agaroseharz ist.
7. Das Verfahren von Anspruch 1, wobei besagter
Stabilisierungsschritt Behandlung mit Harnstoff umfaßt.
8. Ein Verfahren zur effizienten Gewinnung von
Erythropoietin aus einer Flüssigkeit, wobei besagtes Verfahren die
folgenden Schritte in Reihenfolge umfaßt
(1) Unterziehen der Flüssigkeit unter
Ionenaustauschchromatographietrennung bei etwa pH 7,0, wodurch
Erythropoietin in besagter Probe an ein kationisches
Harz selektiv gebunden wird;
(2) Stabilisierung von an besagtes Harz gebundenen
Materialien gegen Abbau durch säureaktivierte Proteasen;
(3) Selektives Eluieren gebundener verunreinigender
Materialien mit einem pKa, der größer ist als
derjenige von Erythropoietin, durch Behandlung mit wäßriger
Säure bei einem pH von etwa 4,0 bis 6,0;
(4) Selektives Eluieren von Erythropoietin durch
Behandlung mit einem wäßrigen Salz bei einem pH von etwa
7,0;
(5) Unterziehen der eluierten, Erythropoietin
enthaltenden Flüssigkeiten unter
Umkehrphasenflüssigchromatographietrennung, die ein immobilisiertes C&sub4;- oder C&sub6;-
Harz umfaßt, wodurch Erythropoietin in besagter
Flüssigkeit an besagtes Harz selektiv gebunden wird;
(6) Selektives Eluieren von gebundenen Erythropoietin
aus besagtem Harz mit einer wäßrigen Ethanollösung
mit von 50 bis 80 Prozent bei einem pH von etwa 4,5
bis etwa 8,0; und
(7) Isolieren von Erythropoietin enthaltenden Fraktionen
des Elutionsmittels.
9. Das Verfahren von Anspruch 8, angewendet auf die
Gewinnung von rekombinantem Erythropoietin aus einer aus einer
Zellkultur gewonnenen Flüssigkeit.
10. Ein Verfahren zur effizienten Gewinnung von rekombinantem
Erythropoietin aus einer
Säugetierzellkulturüberstandsflüssigkeit, wobei besagtes Verfahren die folgenden
Schritte in Reihenfolge umfaßt:
(1) Unterziehen der Flüssigkeit unter
Ionenaustauschchromatographietrennung bei etwa pH 7,0, wodurch
Erythropoietin in besagter Probe an ein kationisches
DEAE-Agaroseharz selektiv gebunden wird;
(2) Stabilisieren von an besagtes Harz gebundenen
Materialien gegen Abbau durch säureaktivierte Proteasen
durch Behandlung mit Harnstoff;
(3) Selektives Eluieren gebundener Materialien mit einem
pKa, der größer ist als derjenige von
Erythropoietinl durch Behandlung mit wäßriger Säure bei einem
pH von etwa 4,3;
(4) Selektives Eluieren von Erythropoietin durch
Behandlung mit einem wäßrigen Salz bei einem pH von etwa
7,0;
(5) Unterziehen von Erythropoietin enthaltenden
Elutionsmittelfraktionen unter
Umkehrphasenflüssigchromatographietrennung, die ein immobilisiertes C&sub4;-Harz
umfaßt, wodurch Erythropoietin in besagter
Flüssigkeit an besagtes Harz selektiv gebunden wird;
(6) Selektives Eluieren von gebundenem Erythropoietin
aus besagten Harz mit einer wäßrigen Ethanollösung
mit etwa 60 Prozent bei einem pH von etwa 7,0; und
(7) Isolieren von Erythropoietin enthaltenden Fraktionen
des Elutionsmittels.
11. Das Verfahren von Anspruch 10, welches außerdem den
Schritt des Entfernens von Ethanol aus isolierten,
Erythropoietin enthaltenden Fraktionen einschließt.
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