KR100374308B1

KR100374308B1 - 재조합차이니스햄스터오바리세포로부터발현된수두바이러스의지피i당단백질의정제방법

Info

Publication number: KR100374308B1
Application number: KR1019950022599A
Authority: KR
Inventors: 박천길; 조중명
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 1995-07-27
Filing date: 1995-07-27
Publication date: 2003-12-18
Also published as: KR970006488A

Abstract

본 발명은 재조합 CHO 세포로부터 발현된 수두바이러스(VZV)의 gpI 당단백질의 정제 방법에 관한 것으로, 재조합 CHO 세포의 배양, 배지를 원심분리하고, 상등액을 투석하고, 투석물을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 방법에 의하면 고순도의 VZV의 gpI 당단백질을 대량으로 얻을 수 있다.

Description

재조합 CHO 세포(Chinese Hamster Ovary Cell)로부터 발현된 수두 바이러스(Varicella-Zoster Virus)의 gpI 당단백질의 정제 방법{PURIFICATION METHOD OF gpI GLYCOPROTEIN OF VZV FROM RECOMBINANT CHO CELL}

본 발명은 유전자 재조합 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 분비형태로 발현되는 수두 바이러스의 재조합 gpI 당단백질의 정제 방법에 관한 것이다.

수두 바이러스(Varicella-Zoster Virus: 이하 VZV)는 헤르페스 계통에 속하는 DNA 바이러스로서 수두(chicken pox)를 일으키는 바이러스이다. VZV에 의해 발생되는 수두는 어린이, 면역성이 약화된 노약자나 환자에게 발병하기 쉬운 전염성이 매우 강한 질환이다. VZV에 감염되면 감염후 약 14 일 경과후 감기 증상과 유사하게 열이 나며, 전신에 반점 형태의 발진이 생성되어 여드름 형태로 발전하는데 심한 경우 치명적인 흉터를 남기게 된다.

VZV는 1차 감염 부위인 호흡기에서 주로 증식을 시작하여 흘러나온 후 림프선으로 이동, 확산되어 1차 바이러스혈증(viremia)을 나타낸다. 세포성 면역 반응이 약화되거나 결핍되면 다음 단계로 세망내피계(reticuloendothelial system)로 이동하여 피부에서 본격적인 다중식이 이루어지고, 폐와 간으로까지 확대되어 2 차 바이러스혈증을 나타낸다. 일반적으로 2차 바이러스혈증은 정상인의 경우 세포성 또는 체액성 면역 방어기작에 의하여 3 일 내에 사라지는데, 이때 세포성 면역반응이 수두 바이러스의 억제에 보다 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

2차 바이러스혈증이 사라지더라도 감염후 2주일이 지나면 수두 바이러스는 면역 방어막을 피해 뇌의 신경절 세포속으로 침투하여 신경 세포 주위를 감싸고 있는 위성세포(satellite cell)에 잠복한다. 그런 다음에는 숙주의 세포성 면역반응에 의해 장기간 바이러스 증식이 억제되어 본격적인 잠복기에 들어가게 된다. 이와 같이 잠복상태에 있는 바이러스의 재활성은 체액성 면역 반응만으로는 막을 수 없으며, 세포성 면역반응에 의해서만 가능하다. 즉, 면역기작에 의해 생성되는 여러 종류의 사이토카인(cytokine)에 의해 바이러스의 증식이 억제될 수 있다.

그러나, 바이러스의 증식을 억제할 수 없을 정도로 면역성이 현저히 떨어진노년층이나 환자의 경우에는, VZV에 대한 특이 항체가 존재하더라도 이 바이러스가 재활성화되어 신경절 세포에서 증식하게 된다. 이렇게 되면 수두바이러스는 '잠복'의 역순으로 피부로 다시 이동, 확산하여 대상포진(Herpes zoster)을 일으키게 된다[H. John et al.,Virology, 5, 241(1994); D. G. Lawrence et al.,Virology,2,2011-2054(1990)]. 이렇게 신경절 세포에서 재활성화된 VZV는 1 차 수두성 폐렴과 같은 수두성 질병에 걸려 있는 환자의 경우에는, 보다 심각한 증상을 야기시킨다. 1 차적으르는 근육 떨림, 근육 저긴장증(마비), 급성 퇴행성과 같은 중앙 신경계에 이상이 시작되며 극히 일부의 경우는 뇌출혈, 말초혈관 원형세포 침윤 등으로 악화되어 신경염이나 외척수염으로 발전, 결국 사망에 이르게 되는 치명적인 질환이 되기도 한다.

미국의 경우, 1 년에 4백만 명 정도의 수두 환자와 백만 명 정도의 대상 포진 환자가 발생하여 100 명 이상이 수두성 복합 질환에 의해 사망하는데, 특히 백혈병 환자와 같이 면역억제제를 투여해야 하는 경우 더욱 치명적인 것으로 보고되어 있다[G. Fleisher et al.,Am. J. Dis. Child, 135. 896(1981); R. P. Stephen et al.,Pediatrics, 68, 14(1981); P. A. Patel et al.,Pediatrics, 64, 223(1979)].

VZV를 억제할 수 있는 치료제로는 비다라빈(Vidarabine; adenosine arabinoside), 아사이클로비르(Acyclovir)등이 개발되어 있으나, 이들은 신장이나 뇌의 중앙 신경계에 심한 부작용을 일으키기 때문에 치료가 매우 제한적이다[T. H. Weller et al.,New England J. Med. 309, 1434(1983)]. 따라서 예방 차원의 수두백신 개발은 필수적이라 할 수 있다.

지금까지 수두성 질환을 예방하기 위해 많은 연구가 이루어져 왔지만, 이는 고전적인 생수두 백신(live attenuate vaccine)을 이용한 것으로 고도의 유전공학 기술을 이용한 재조합 백신은 아니었다. 생수두 백신은 1975년 일본 오사카 대학의 다까하시(Takahashi) 그룹에 의해서 처음으로 개발된 후, 비켄(BIKEN)사(Oka strain)에서 제품으로 생산하고 있다. 이 백신은 VZV에 대한 예방효과가 우수하지만, 면역 후 예방 가능 기간에 대한 문제점이 일부 제기되어 있으며[Johnson, C., Rome, et al.,Pediatrcs 1989, 84, 418-421], 나아가 자연적인 감염의 경우와 마찬가지로 이 백신이 신경절 세포에 잠복되어 있다가 재활성화되어 수두를 일으킬 수 있다는 문제점이 보고되어 있다[Hardy, I., gershon, A. A., Steinberg, S. P., and LaRussa,N. Engl. J. Med. 1991, 325, 1545-1550; Plotkin, S. A., Starr, S., Connor, K and Morton, D.,J. Infect. Dis. 1989, 159, 1000]. 이에 따라, 서브유니트(subunit) 백신과 같이 바이러스 감염을 예방할 수는 있지만 잠복가능성은 없는 새로운 백신의 개발이 요구되고 있다.

헤르페스 바이러스과(Herpesvirus family)에 있어서는 이 과에 속한 여러 바이러스에 대한 서브유니트 백신이 개발되어 왔다[Collett, M. S.,Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 1989, 33, 109-172]. 이들 바이러스에 대한 백신 개발은 바이러스의 당단백질을 중심으로 이루어지고 있는데, 이는 이들 당단백질이 매우 유효한 면역 기작을 유발시킬 뿐 아니라 바이러스 감염시 발생되는 세포성 면역반응과 체액성 면역반응을 동일하게 일으키기 때문이다[Collett, M. S.,Adv. Vet. Sci. Comp. Med.1989, 33, 109-172].

한편, VZV는 1986년 에이. 제이. 데이비슨(A. J. Davison)에 의해 DNA 염기서열이 완전히 밝혀진 이후[A. J. Davison et al.,J. Gen. Virol. 67,1759(1986)] 본격적으로 연구가 진행되어 왔다. VZV 의 표면에는 gpI, gpII, gpIII, gpIV, gpV 로 명명된 5 가지의 당단백질이 존재하는 것으로 알려져 있다[A. J. Davison et al.,Journal of Virology 1986, 57,1195-1197]. 이 5 가지의 당단백질중에서 중화 항체를 만들 수 있는 gpI이 가장 중요한 연구목표중 하나가 되어 왔다[Stanley A. Plotkin,Science 1994, 265, 1383-1385; C. Sabella et al.,J. Virol. 67, 7673(1993)]. 특히, 일리노이대학의 바파이(Vafai) 그룹은 gpI 당단백질을 유전공학적인 방법으로 백시니아에서 발현시킨 후 정제하여 토끼에서 VZV에 대한 면역 중화실험을 수행한 결과, 이 당단백질이 사람에서도 백신으로 사용될 수 있음을 보여 주었다[Abbas Vafai,Vaccine, 11,1993, 937-940: Abbas Vafai,Vaccine, 12, 1994, 1265-1269]. 그러나, 이와 같은 gpI 당단백질을 백신으로 상업화하기 위해서는 경제적인 gpI 당단백질의 발현 및 정제방법이 요구된다. 따라서, 경제성에 매우 중요한 요인이 되는 정제공정상의 순도 및 수율, 재조합 gpI 당단백질의 후-전사 변형(post-translational modification), 면역발생능력(immunogenecity), 생체내 체류시간(clearance rate), 그리고 항구적인 생산측면을 고려할 때 CHO 세포를 숙주로 사용하는 것이 최적의 조건을 제공하게 된다[Charles F. Goochee, Michael J. Gramer, Dada C. andersen, Jennifer B. and James R. Rasmussen,Bio/Technology-1991, 9, 1347-1355; 본 출원인의 동일자로 출원한 대한민국 특허출원].

VZV의 당단백질을 정제하기 위한 기존의 방법은 단일 클론 항체를 이용한 면역 친화성 크로마토그래피를 이용한 방법들로 이루어져 있다[Pual M. Keller et al., US patent 5, 306, 635, 1994; Abbas Vafai,Vaccine, 12, 1994, 1265-1269]. 이 방법들은 정제에 사용될 면역 친화성 수지(affinity gel matrix)의 수율과 안전성, 그리고 과량의 단일 클론 항체를 준비하여야 하는 문제점 등으로 인해 경제성과 효율면에서 적합하지 않다.

이에 본 발명자들은 CHO 세포에서 분비형으로 발현되는 gpI 당단백질의 정제방법을 경제성과 효율측면을 중심으로 연구하기 시작하여, 안전성과 특성이 잘 알려져 있는 이온교환 수지를 사용한 정제방법을 개발하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 VZV의 감염을 예방하기 위한 서브유니트 백신으로 사용가능한 VZV의 gpI 당단백질을 고순도로 대량 정제할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 재조합 CHO 세포에서 발현된 VZV의 gpI 당단백질을 정제하는데 있어서, 재조합 CHO 세포의 배양, 배지를 원심분리하고, 상등액을 투석하고, 투석물을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 정제 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.

먼저, 동물세포 배양용 용기에 10 % FBS를 함유한 1 차 배양배지를 넣은 후 재조합 CHO 세포를 배양한다. 용기의 표면에 CHO 세포가 균일하게 자라면 2 차 배양 배지로 갈아준 다음 배양한다. gpI 당단백질이 분비되어 있는 배양 배지를 모아 원심분리하여 상등액을 취한다. 이 상등액을 투석막에 넣어 증류수로 투석한다. 10 시간 이상 투석한 후, 투석물을 회수하여 음이온 교환 수지에 흡착시킨다. 염세척으로 대부분의 오염 단백질을 제거한 다음, 선형 농도 구배의 염화나트륨 용액으로 용출시켜 순수한 gpI 당단백질을 회수한다.

본 발명의 정제 방법에 사용되는 음이온 교환수지로는 Q-세파로스 또는 DEAE-세파로스가 바람직하며, Q-세파로스를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 음이온 교환 크로마토그래피 수행시 완충액의 pH는 5.9 내지 9.5의 범위가 바람직하고, pH 6.5가 더욱 바람직하다. 완충액은 완충제로서 인산염(sodium phosphate), 비스-트리스(Bis-Tris), 트리스 또는 에탄올아민을 포함하는 것이 바람직하며, 염세척시에는 50 mM 이상 농도의 염화나트륨을 함유하는 완충용액을 사용하며 0.15 M 농도의 것이 바람직하다. 또한 용출액으로는 0.15 M 내지 0.6 M의 선형 농도구배의 염화나트륨 용액을 사용하는 것이 바람직하다.

이하 실시예를 통하여 본발명을 더욱 상세히 설명할 것이다. 단, 본발명의 범위가 하기 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

(참고예 1) gpI 당단백질의 이온 교환 수지에 대한 흡착 여부

완충액의 pH 및 사용 완충제의 종류에 따른 배지내 오염 단백질과 gpI 당단백질의 이온 교환 수지에 대한 상대적 흡착 여부를 조사함으로써 분리정제의 최적 조건을 확인하기 위하여, 양이온 교환 수지로는 S-, CM- 세파로스, 음이온 교환 수지로는 Q-, DEAE- 세파로스 수지를 사용하여, 하기의 pH 및 완충제에 따른 흡착 여부를 조사하였다.

상기 결과로부터 pH 5.9 내지 9.5에서, 에탄올아민, 트리스, 비스-트리스 또는 인산나트륨을 완충제로 사용하여 크로마토그래피하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

(참고예 2) gpI 당단백질의 웨스턴블로팅

본발명의 정제 방법중 이온 교환 크로마토그래피하여 얻은 분획들을 확인하는데 사용되는 웨스턴블로팅은 다음과 같이 시행하였다.

확인하고자 하는 용액 20 ㎕에 SDS-PAGE 완충액 20 ㎕를 램리의 방법(Laemmli, (1970)Nature 227, 680)에 따라 가한 뒤 3 분간 가열한 다음 10 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하였다. 겔상에서 분리된 단백질을 토빈의 방법(Towbin et al., (1979)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 4750)에 따라서 니트로셀룰로스 필터로 전달시컸다. 이 필터를 0.2 % 젤라틴이 함유된 PBS에 넣고 30 분간 흔들면서 여분의 단백질 흡착부위를 차단시켰다. 그 다음 0.25 % 젤라틴, 1 % 트리톤 X-100, 그리고 0.02 % 티메로살이 함유된 PBS로 500 배 희석한 토끼 항 VZV항체(Cytimmune^?Cat. No. 06361, Cortex Biochem Inc., U.S.A. )를 가하여 상온에서 1 시간 동안 약하게 흔들면서 반응시켰다.

상기 필터를 0.05 % 트윈 20이 함유된 PBS로 4 회 세척한 다음 0.25 % 젤라틴, 1 % 트리톤 X-100, 그리고 0.02 % 티메로살이 함유된 PBS로 500 배 희석한 서양고추냉이 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase)로 표지된 염소 항 토끼 IgG 항체(Goat anti-Rabbit IgG-HRP: American Qualex, Cat. No. A102 PS)를 가하여 상온에서 1 시간 동안 약하게 흔들면서 반응시켰다. 상기 필터를 0.05 % 트윈 20이 함유된 PBS로 4 회 세척한 다음 50 mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 2 회 세척하였다. 이 필터를 400 ㎍/㎖의 4-클로로-1-나프톨과 0.03 %의 과산화수소수가 함유된 50 mM 트리스 완충액(pH 8.0)을 가하여 발색시켰다.

실시예 1

(단계 1) CHO 세포 배양

액체질소에 보관한 수두바이러스의 gpI 당단백질을 발현하는 재조합 CHO 세포 스톡(KCTC 0176BP) 1 ㎖를 37 ℃ 수조에서 해동시킨 다음 여기에 10 % 투석 FBS(Gibco), 항생제(Antibiotic, Gibco) 및 1.6 μM MTX가 들어있는 α-MEM(20 % nucleoside, Gibco) 배지 10 ㎖를 넣어 잘 혼합하고 1,00 rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 침전된 세포를 동일 배지 10 ㎖에 현탁시켜 100 mm 배양 디쉬에 부어 잘 흔든후 5 % CO₂가 들어있는 인큐베이터에서 배양하였다. 3~4일 배양후 배지를 제거하고 PBS 완충액으로 세척한 후 0.2 % 트립신을 사용하여 세포를 배양용기로부터떼어내었다. 종배양을 하기 위해, 떼어낸 세포를 T-80 배양용기에 2 ×10⁴/㎠의 세포 밀도로 넣어주고 CO₂인큐베이터에서 4∼5 일간 배양하였다. 배양용기에 꽉 차게 자란 세포를 상기한 방법으로 다시 떼어내고 T-175 배양 시험관에 접종하였다. 이때 종배양 세포 밀도는 2 ×10⁴/㎠가 되도록 30 ㎖의 배지를 넣어 주었으며, 배지로는 α-MEM을 사용하였다. 1∼2 일후 세포가 배양용기에 완전히 붙었을 때 혈청이 없는 배지로 교체하였다. 이때 혈청이 없는 배지로는 CHO-S-SFM(Gibco)을 사용하였다. 발현된 단백질을 분리하기 위하여 2 일 간격으로 배지를 교체하였다. 각 용기의 배지를 모아 5000 rpm에서 10 분간 원심분리하여(Beckman J2-M1 원심분리기, Rotor: JA-10) 상등액을 취하였다.

(단계 2) 배양배지의 투석

상기 단계 1에서 원심분리하여 회수한 상등액을 투석막(Spectrum 사; Mwco; 12000)에 넣어준 후 20 ℓ의 증류수로 투석하였다. 이때 온도는 4 ℃를 유지하면서, 10 시간 이상 수행하였다.

(단계 3) 음이온 교환 크로마토그래피

완충용액(25 mM 인산염, 1 mM EDTA)으로 평형화시킨 10 ㎖의 Q-세파로스가 충진된 컬럼(Pharmacia, XK 26/20)에 분당 2.5 ㎖의 속도로 단계 2 에서 얻은 투석물을 통과시켰다. 이어서, 0.15 M의 염화나트륨이 들어 있는 완충용액 80 ㎖을 컬럼에 흘려주어 이온 교환수지에 흡착되어 있는 오염단백질을 제거하였다. 그런 다음, 0.15 M 내지 0.6 M의 선형 농도 구배의 염화나트륨을 포함하는 400 ㎖의 완충용액을 가하여 수지에 흡착되어 있는 단백질을 분당 2.5 ㎖의 속도로 용출시켜 각 10 ㎖의 분획들을 수집하였다. 수집된 분획들을 10 % SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 gpI 당단백질을 포함하는 분획들을 수집하였다. 전기 영동 결과를 제 1 도와 제 2 도에 나타내었다.

제 1 도는 10 % SDS-PAGE한 다음 은염색(silver staining)한 결과로, 제 1 열은 표준 분자량의 단백질, 제 2 열은 염세척시 수지에서 떨어져 나가는 단백질, 제 3 열들은 염농도 구배에 의해 용출되는 분획들을 나타낸다. 제 2 도는 10 % SDS-PAGE한 다음 참고예 2에 따라 웨스턴블로팅한 결과로, 제 1 열은 표준 분자량의 단백질, 제 2 열은 염세척시 수지에서 떨어져 나가는 단백질, 제 3 열들은 염농도 구배에 의해 용출되는 분획들을 나타낸다.

제 1 도 및 제 2 도에서 보듯이 본 발명의 정제 방법으로 정제한 목적 단백질의 순도는 은염색을 하여 공지의 희석 방법으로 계산한 결과 90 % 이상이였으며, 수율은 80 % 이상이었다.

(실시예 2) 염세척시 염 농도에 따른 세척 효과 비교

염세척시 50 mM의 염화나트륨이 든 완충용액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1의 단계 3에서와 같은 방법으로 음이온 교환 크로마토그래피를 시행하였다. 그 결과를 제 3 도 및 제 4 도에 나타내었다.

제 3 도는 전기영동후 은염색한 결과로서, 제 1 열은 표준 분자량의 단백질, 제 2 열은 컬럼에 투입되는 배양배지 투석물, 제 3 열은 수지에 흡착되지 않은 단백질, 제 4 열들은 용출되는 각 분획들, 제 5 열은 염세척시 제거되는 오염 단백질을 나타낸다.

제 4 도는 전기영동후 참고예 2에 따라 웨스턴블로팅한 결과로서, 제 1 열은 표준 분자량의 단백질, 제 2 열은 컬럼에 투입되는 배양배지 투석물, 제 3 열은 수지에 흡착되지 않은 단백질, 제 4 열들은 용출되는 각 분획들, 제 5 열은 염세척시 제거되는 오염 단백질을 나타낸다.

제 3 도 및 제 4 도에 나타낸 결과에서 보듯이 염세척시 염의 농도가 50 mM 이상이면 효과적으로 오염 단백질을 세척할 수 있음을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 정제 방법에 의하면 재조합 CHO 세포로부터 발현된 VZV의 gpI 당단백질을 안정적이며 경제적으로 분리정제할 수 있다.

제 1 도는 본발명의 정제 과정중 이온 교환 크로마토그래피한 용출액의 전기 영동후 은염색한 결과이고;

제 2 도는 본발명의 정제 과정중 이온 교환 크로마토그래피한 용출액의 전기 영동후 웨스턴블로팅한 결과이고;

제 3 도는 본발명의 정제 과정중 이온 교환 크로마토그래피 단계에서 저농도의 염세척을 행한 경우 용출액의 전기 영동후 은염색한 결과이고;

제 4 도는 본발명의 정제 과정중 이온 교환 크로마토그래피 단계에서 저농도의 염세척을 행한 경우 용출액의 전기 영동후 웨스턴블로팅한 결과이다.

Claims

재조합 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포로부터 발현된 수두 바이러스(VZV)의 gpI 당단백질을 정제하는 데 있어서, 재조합 CHO 세포의 배양, 배지를 원심분리하고, 상등액을 투석하고, 투석물을 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 정제 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 음이온 교환 크로마토그래피에서 수지로는 Q- 또는 DEAE-세파로스를 사용하고, 에탄올 아민, 트리스, 비스-트리스 또는 인산염을 포함하는 pH 5.9 내지 9.5의 완충용액중 0.15 M 내지 0.6 M의 선형 농도 구배의 염화나트륨으로 용출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

상기 음이온 교환 크로마토그래피에서, 용출전에 50 mM 이상의 염용액으로 염세척하는 것을 특징으로 하는 방법.