DE3629924A1 - Immunologische messung von erythropoietin - Google Patents
Immunologische messung von erythropoietinInfo
- Publication number
- DE3629924A1 DE3629924A1 DE19863629924 DE3629924A DE3629924A1 DE 3629924 A1 DE3629924 A1 DE 3629924A1 DE 19863629924 DE19863629924 DE 19863629924 DE 3629924 A DE3629924 A DE 3629924A DE 3629924 A1 DE3629924 A1 DE 3629924A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- antibody
- epo
- bound
- labeled
- insoluble carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 74
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 title claims description 15
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 title claims description 15
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 title claims description 15
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 20
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 20
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 14
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 11
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 6
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 6
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 6
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 239000007769 metal material Substances 0.000 claims description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 2
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 59
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 208000008601 Polycythemia Diseases 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 3
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 3
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- 125000005342 perphosphate group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 4-carboxycyclohexylmethyl Chemical group 0.000 description 2
- XQXPVVBIMDBYFF-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XQXPVVBIMDBYFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- KSMVZQYAVGTKIV-UHFFFAOYSA-N decanal Chemical compound CCCCCCCCCC=O KSMVZQYAVGTKIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 2
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 2
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/746—Erythropoetin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine immunologische
Messung von Erythropoietin und insbesondere ein verbes
sertes Verfahren zur immunologischen Bestimmung von
Erythropoietin (im folgenden gelegentlich als "EPO"
bezeichnet) mittels einer sogenannten Sandwich-Methode
unter Verwendung eines ersten, eines zweiten und eines
dritten Antikörpers.
EPO wird hauptsächlich in den Nieren produziert und ist
ein Hormon, das ein Molekulargewicht von etwa 40 000
besitzt und die Bildung roter Blutkörperchen in Organis
men stimuliert. Es ist bekannt, daß die Menge EPO in den
Körperflüssigkeiten bei verschiedenen Fällen von Anämie
und von Erythrocytosen erhöht oder vermindert wird, und
aus diesem Grunde ist es sehr wichtig, für die Diagnose
dieser Blut-Krankheiten die Menge des EPO in Körperflüs
sigkeiten präzise zu messen.
Bekannt sind verschiedene Methoden zur Messung des EPO,
nämlich eine Bioassay-Methode mit Hilfe von Kleintieren
(z. B. Mäusen oder Ratten) [vgl. "Rinsho Kensa" (Clinical
Test) Vol. 22, Nr. 2, 1978], eine Methode der Messung
der 59Fe-Aufnahme durch die Knochenmark-Zellen von
Mäusen (vgl. J. Lab. Clin. Med., Vol. 97, Nr. 2, 158-169,
1981) und eine Methode unter Verwendung fötaler Mäuse-
Zellen (vgl. Acta Haematal JAPAN, Vol. 44, Nr. 6, 1981).
Von diesen ist die Bioassay-Methode die zuverlässigste,
aber sie hat ungünstigerweise eine geringere Nachweis
empfindlichkeit, benötigt eine lange Zeitdauer für die
Messung und ist außerdem kostspielig, da sie eine große
Zahl Versuchstiere braucht.
In neuerer Zeit wurde eine immunologische Methode, ins
besondere ein Enzymimmunoassay, für die Bestimmung von
Stoffen entwickelt, die in sehr kleinen Mengen in den
Körperflüssigkeiten anwesend sind. Jedoch ist der Enzym
immunoassay für den Nachweis von Stoffen im Vergleich
zum Radioimmunoassay weniger empfindlich, und infolge
dessen sind seine Anwendungsmöglichkeiten begrenzt.
Insbesondere ist EPO in einer sehr geringen Menge wie 10
bis 20 mU/ml (0,1 bis 0,3 ng/ml) in normalem Blut ent
halten, und deshalb wurde bisher angenommen, daß es
durch bekannte Enzymimmunoassays kaum zu bestimmen ist.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung stellten Unter
suchungen mit dem Ziel der Verbesserung des Immunoassays
zur EPO-Messung an und haben dabei eine verbesserte
Immunoassay-Methode für die Bestimmung von EPO gefunden,
die die Umsetzung eines antikörpergebundenen unlöslichen
Trägers, worin ein gegenüber EPO spezifisch reaktions
fähiger Antikörper an einen unlöslichen Träger gebunden
ist, einer EPO enthaltenden Test-Probe und eines enzym
markierten Antikörpers, worin der gegenüber EPO spezi
fisch reaktionsfähige Antikörper mittels eines Enzyms
markiert ist, wodurch ein antikörper-EPO-markierter
Antikörper-Komplex auf dem antikörpergebundenen unlösli
chen Träger gebildet wird, und anschließend die Messung
der Menge des markierten Produkts auf dem antikörper
gebundenen unlöslichen Träger umfaßt (vgl. die JP-
Patentanmeldung 39 687/1980). In diesem Verfahren hat
jedoch der gegenüber EPO spezifisch reaktionsfähige
Antikörper einen kleineren Titer, und infolgedessen kann
es nicht notwendigerweise auch für eine präzise Messung
der sehr kleinen Menge EPO in der normalen Blutprobe
geeignet sein. Es wird angenommen, daß der kleine Titer
des gegenüber EPO spezifisch reaktionsfähigen Anti
körpers auf den raschen Stoffwechsel von EPO in dem Fall
zurückzuführen ist, in dem Tiere statt des Menschen mit
EPO immunisiert werden, und weiterhin durch die Tatsache
bedingt wird, daß die Tiere, denen EPO verabreicht
wurde, physiologisch mit dem EPO reagieren und aufgrund
dessen bei ihnen eine schwere Anämie ausgelöst wird.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben weitere
Untersuchungen angestellt, die auf eine weiter verbes
serte Methode der immunologischen Bestimmung von EPO mit
hoher Empfindlichkeit zielen, die in einem gewöhnlichen
Testraum innerhalb eines sehr kurzen Zeitraums mit ge
ringen Kosten durchgeführt werden kann; dabei haben sie
gefunden, daß die gewünschte Bestimmung mittels der so
genannten Sandwich-Methode durchgeführt werden kann, bei
der ein enzymmarkierter dritter Antikörper eingesetzt
wird, der gegenüber dem Immunoglobulin desjenigen Tieres
spezifisch reaktionsfähig ist, das zur Herstellung des
zweiten Antikörpers dient.
Ein Ziel der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfah
ren zur immunologischen Messung von Erythropoietin ver
fügbar zu machen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist
es, einen verbesserten Enzymimmunoassay mittels einer
Sandwich-Methode zur Messung von Erythropoietin in den
Körperflüssigkeiten verfügbar zu machen. Ein weiteres
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine immuno
logische Erythropoietin-Bestimmung verfügbar zu machen,
die für die Diagnose verschiedener Blutkrankheiten wie
Anämie und Erythrocytose geeignet sind. Diese und andere
Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für
Fachleute aus der folgenden Beschreibung deutlich.
Fig. 1 zeigt eine in der vorliegenden Erfindung benutzte
Standard-Eichkurve für EPO.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur immunologi
schen Bestimmung von Erythropoietin umfaßt die Reaktion
eines antikörpergebundenen unlöslichen Trägers, worin
ein gegenüber Erythropoietin spezifisch reaktionsfähiger
erster Antikörper an einen unlöslichen Träger gebunden
ist, mit einer Erythropoietin enthaltenden Test-Probe
und einem zweiten Antikörper, der gegenüber Erythropoie
tin spezifisch reaktionsfähig ist und dadurch herge
stellt worden ist, daß eine Tier-Species, die von dem
für die Herstellung des ersten Antikörpers eingesetzten
Tier verschieden ist, immunisiert wird, anschließend die
Reaktion einer festgelegten Menge eines markierten drit
ten Antikörpers, der spezifisch gegenüber dem Immunglo
bulin der Tier-Species, die für die Herstellung des
zweiten Antikörpers eingesetzt wurde, reaktionsfähig
ist, mit dem vorhergehenden Reaktionssystem und danach
die Messung der Menge des markierten Antikörpers, der an
den antikörpergebundenen unlöslichen Träger gebunden
ist, oder der Menge des ungebundenen markierten Antikör
pers.
Selbst dann, wenn der spezifisch gegenüber EPO reak
tionsfähige zweite Antikörper einen kleineren Titer hat,
kann gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung der
Titer dadurch verstärkt werden, daß der markierte dritte
Antikörper eingesetzt wird, der speziell gegenüber dem
Immunoglobulin derjenigen Tier-Species reaktionsfähig
ist, die zur Herstellung des zweiten Antikörpers heran
gezogen wurde, und dadurch kann EPO in wirksamer Weise
immunologisch gemessen werden. Der dritte Antikörper
läßt sich in einfacher Weise dadurch herstellen, daß
eine Tier-Species, die von der für die Herstellung des
zweiten Antikörpers eingesetzten Tier-Species verschie
den ist, mit dem Immunoglobulin der letzteren Tier-
Species immunisiert wird, und der auf diese Weise ge
wonnene Antikörper hat einen weitaus höheren Titer als
der zweite Antikörper.
Der erste und der zweite Antikörper, die in der vorlie
genden Erfindung verwendet werden, werden dadurch herge
stellt, daß statt des Menschen verschiedene Tier-Species
wie Kaninchen, Rind, Ziege, Schaf, Meerschweinchen etc.
mit gereinigtem EPO immunisiert werden, das aus dem Harn
von Patienten gewonnen wird, die an Panmyelophthisis
(aplastischer Anämie) leiden und die eine vergleichswei
se große Menge EPO produzieren. Beide Antikörper, sowohl
der erste als auch der zweite, können monoklonale Anti
körper sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung ist der erste Antikörper ein
Antikörper, der durch Immunisieren einer Tier-Species
wie Kaninchen, Ziege oder Rind mit gereinigtem EPO her
gestellt wird, der zweite Antikörper ist ein von der
Maus stammender monoklonaler Antikörper, und der dritte
Antikörper ist ein Antikörper, der durch Immunisieren
eines anderen Tieres als der Maus mit einem Immunoglobu
lin der Maus hergestellt wurde.
Die Reinigung von EPO kann mittels einer Kombination
bekannter Reinigungsverfahren wie Affinitätschromatogra
phie, Gelfiltration und dergleichen durchgeführt werden.
Um einen Antikörper mit hoher Spezifität zu erhalten,
wird das EPO so hoch wie möglich gereinigt. Das gerei
nigte EPO wird subkutan Tieren wie Kaninchen oder Rin
dern, die dadurch immunisiert werden, verabreicht, um
den ersten und den zweiten Antikörper zu verabreichen.
Der dritte Antikörper, der spezifisch reaktionsfähig
gegenüber dem Immunoglobulin der für die Herstellung des
zweiten Antikörpers benutzten Tier-Species ist, wird
dadurch hergestellt, daß ein von dem für die Herstellung
des zweiten Antikörpers eingesetzten Tier verschiedenes
Tier mit einem gereinigten Immunoglobulin des letzteren
Tieres immunisiert wird. Der spezifisch gegenüber EPO
reaktionsfähige monoklonale Antikörper wird mittels
eines bekannten Verfahrens hergestellt, beispielsweise
durch Immunisieren von BALB/C-Mäusen mit gereinigtem
EPO, Isolieren der Milz-Zellen aus dem immunisierten
Mäusen, Fusionieren der Zellen mit Myelom-Zellen mit
Hilfe von Polyethylenglycol und Widerholen der Klonie
rung der fusionierten Zellen in HAT-Medium.
Der wie oben hergestellte erste Antikörper wird an einen
unlöslichen Träger gebunden. Zu den unlöslichen Trägern
gehören Polystyrol-Schlauch, Polystyrol-Perlen, Silicon-
Fragmente, Mikroplatten und dergleichen, vorzugsweise
Polystyrol-Schlauch und Polystyrol-Perlen. Das Binden
des ersten Antikörpers an den unlöslichen Träger erfolgt
durch Kombination bekannter chemischer oder physikali
scher Methoden. Beispielsweise umfaßt die physikalische
Methode das Auflösen des ersten Antikörpers in einer
geeigneten Puffer-Lösung, das Zusetzen des unlöslichen
Trägers zu derselben, das Stehenlassen der Mischung bei
0°C bis Raumtemperatur während mehrerer Stunden bis zu
einer Nacht, vorzugsweise 4 bis 16 h bei 4°C bis 20°C,
das Waschen des erhaltenen antikörpergebundenen unlösli
chen Trägers mit physikalischer Kochsalz-Lösung etc.,
wonach der gewünschte antikörpergebundene unlösliche
Träger (im folgenden einfach als "antikörpergebundener
Träger" bezeichnet) erhalten wird. Der antikörpergebun
dene Träger kann wenigstens für die Dauer eines Jahres
dadurch stabil aufbewahrt werden, daß man ihm einen Sta
bilisator wie Rinderserumalbumin zusetzt.
Der mit einem Markierungsmittel markierte dritte Anti
körper (im folgenden einfach als "markierter Antikörper"
bezeichnet) wird wie folgt hergestellt.
Der dritte Antikörper ist ein Antikörper gegen ein Immu
noglobulin einer Tier-Species, die für die Herstellung
des zweiten, spezifisch gegenüber EPO reaktionsfähigen
Antikörpers herangezogen wird. Wenn beispielsweise der
zweite Antikörper ein Mäusen entstammender monoklonaler
Antikörper ist, ist der dritte Antikörper ein Antikörper
gegen Mäuse-Immunoglobulin, und wenn der zweite Anti
körper ein unter Einsatz von Kaninchen hergestellter
Antikörper ist, ist der dritte Antikörper ein Antikörper
gegen das Kaninchen-Immunoglobulin. Zu den in der vor
liegenden Erfindung verwendeten Markierungsmitteln
zählen Enzyme, Isotope, Fluoreszenzmittel, metallische
Stoffe und dergleichen. Bevorzugte Markierungsmittel
sind Enzyme wie Peroxidase, alkalische Phosphatase,
β-Galactosidase, Glucose-Oxidase, Glucose-6-phosphor
säure-Dehydrogenase, Glucose-Dehydrogenase und derglei
chen, wovon Peroxidase, Glucose-Oxidase und Glucose-6-
phosphorsäure-Dehydrogenase die besonders bevorzugten
Markierungsmittel sind. Das Markieren des dritten Anti
körpers durch die Enzyme kann mittels bekannter Verfah
ren durchgeführt werden, beispielsweise durch Oxidieren
der Zucker-Kette des Enzyms mit Periodsäure und Binden
der erzeugten Aldehyd-Gruppe an die Amino-Gruppe des
dritten Antikörpers oder durch Einführen der Malein
imido-Gruppe in das Enzym und anschließendes Binden
dieser Gruppe an die Thiol-Gruppe des dritten Anti
körpers.
Unter Verwendung des wie vorstehend hergestellten anti
körpergebundenen Trägers und des markierten Antikörpers
kann die Messung des EPO in der folgenden Weise durchge
führt werden.
Zunächst wird der antikörpergebundene Träger mit einer
EPO enthaltenden Test-Probe und dem spezifisch gegenüber
EPO reaktionsfähigen zweiten Antikörper eine Stunde bis
eine Nacht bei 0°C bis 50°C, vorzugsweise 2 bis 4 h bei
15°C bis 37°C umgesetzt. Die EPO enthaltende Testprobe
umfaßt Serum, Blut-Plasma, Urin etc. Der an einen
unlöslichen Träger zu bindende erste Antikörper und der
zweite Antikörper sollten unter Einsatz von einander
verschiedener Tier-Species hergestellt sein. Wenn der
erste Antikörper und der zweite Antikörper unter
Einsatz der gleichen Tier-Species hergestellt werden,
wird der markierte dritte Antikörper gegen ein Immuno
globulin des vorgenannten Tieres unspezifisch und ohne
Bezug zu dem in der Testprobe vorhandenen EPO gebunden,
und aufgrunddessen ist es möglich, die Menge des EPO
zu messen.
Durch die obige Reaktion wird der antikörpergebundene
Träger mit dem zweiten Körper proportional zu der EPO-
Menge gebunden. Mit dem erhaltenen Reaktionsprodukt wird
der markierte Antikörper eine Stunde bis eine Nacht bei
0°C bis 50°C, vorzugsweise 2 bis 4 h bei 15°C bis 37°C
umgesetzt, wodurch der markierte dritte Antikörper an
den antikörpergebundenen Träger proportional zu der
Menge des EPO gebunden wird.
Schließlich wird die Menge des an den antikörpergebunde
nen Träger gebundenen Antikörpers gemessen, und die in
der Test-Probe enthaltene Menge EPO wird auf der Grund
lage der Eichkurve errechnet, die vorher mit Hilfe von
Standard-EPO-Proben aufgestellt wurde. Wenn das Markie
rungsmittel ein Enzym ist, wird die Enzym-Aktivität
gemessen, und wenn das Markierungsmittel ein Isotop ist,
wird die Radioaktivität gezählt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Titer des
Antikörpers durch den dritten Antikörper vervielfacht,
und aus diesem Grunde kann das Verfahren zur EPO-Messung
mit hoher Empfindlichkeit selbst bei so kleinen Mengen
wie 10 bis 20 mU/ml (0,1 bis 0,3 ng/ml) in normalem Blut
herangezogen werden, auf die sich die bekannten Methoden
nicht anwenden ließen. Somit ist das Verfahren der vor
liegenden Erfindung zur quantitativen Bestimmung von
Erythropoietin in Körperflüssigkeiten brauchbar und
eignet sich folglich für die Diagnose verschiedener
Blutkrankheiten wie Anämie und Erythrocytose, wobei
Erythropoietin in ungewöhnlicher Weise erhöht oder er
niedrigt ist.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Bei
spiele näher erläutert, ist jedoch nicht auf diese
beschränkt.
Herstellung des polyklonalen Antikörpers: Ein polyklona
ler Antikörper gegen Erythropoietin wird hergestellt
durch dreimaliges Immunisieren von Kaninchen mit einem
gereinigten EPO (das von einem an Anämie leidenden
Patienten stammte), und das resultierende Antiserum wird
in üblicher Weise behandelt, um gereinigtes IgG herzu
stellen.
Erste Immunisierung: Gereinigtes EPO (400 µg/ml) wird in
PBS (phosphat-gepufferter Kochsalz-Lösung) gelöst, und
die Lösung wird mit einer gleichen Menge des
Freund′schen Adjuvans vermischt, wodurch eine Emulsion
entsteht. Die Emulsion (1,5 ml) wird subkutan einem
Kaninchen (das etwa 2 kg wiegt) an 10 bis 15 Punkten
entlang der Wirbelsäule injiziert.
Zweite Immunisierung: Zwei Wochen nach der ersten Immu
nisierung wird die gleiche Emulsion wie oben (1 ml) an 10
bis 15 Punkten in der gleichen Weise wie bei der ersten
Immunisierung injiziert.
Dritte Immunisierung: Weitere zwei Wochen danach wird
eine Emulsion durch Einsetzen einer Lösung eines Anti
körpers (200 µg/ml) in PBS in der gleichen Weise, wie
sie bei der ersten Immunisierung beschrieben wurde,
hergestellt, und die Emulsion (1 ml) wird in gleicher
Weise an 10 Punkten injiziert.
Am Tag vor der dritten Immunisierung wird dem Tier eine
kleine Menge Blut abgenommen, und die Anti-EPO-Aktivität
des Blut-Serums wird getestet. Eine Woche nach der
dritten Immunisierung (der abschließenden Immunisierung)
wird die Blutentnahme vervollständigt, und das gesammel
te Blut wird der Serum-Abtrennung unterzogen, wodurch
ein Anti-EPO-Serum erhalten wird. Ein Anti-EPO-IgG wird
aus dem Anti-EPO-Serum mittels einer bekannten Methode
präpariert, d. h. durch Fällung mit 50-proz. Ammonium
sulfat und Fraktionierung mittels DEAE-Cellulose-Chroma
tographie, wobei nicht auf der DEAE-Cellulose absorbier
te Stoffe herausgenommen werden.
Dann wird zu Polystyrol-Perlen (Durchmesser: 6,4 mm; 100
Perlen) eine Lösung des ersten Antikörpers (20 ml) in
0,1 M NaHCO3 hinzugefügt, und die Mischung wird bei 4°C
16 h stehengelassen und mit physiologischer Kochsalz-
Lösung gewaschen, wodurch antikörpergebundene Poly
styrol-Perlen erhalten werden.
Zu Peroxidase (hergestellt von Toyo Boseki K.K.; 5 mg)
wird 0,06 M NaIO4 (0,2 ml) hinzugegeben, und die
Mischung wird 20 min bei Raumtemperatur umgesetzt und
dann über Nacht gegen Natriumacetat-Puffer (pH 4) dialy
siert. Nach der Dialyse wird die Mischung auf pH 9,5
einreguliert, und dazu wird Anti-Mäuse-IgG (gegen Kanin
chen immunisiert; hergestellt von DAKO Co., 5 mg) ge
geben, und die Mischung wird 2 h bei Raumtemperatur
umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird mit Natriumbor
hydrid reduziert. Die gesamte Reaktionsmischung wird der
Gelfiltration mit Sephadex G-200 unterworfen, und die
aktiven Fraktionen werden gesammelt, wodurch das ge
wünschte peroxidase-markierte Anti-Mäuse-IgG erhalten
wird.
Der verwendete zweite Antikörper ist ein monoklonaler
Anti-EPO-Antikörper (immunisiert gegen Mäuse, wie in der
JP-Patentveröffentlichung 1 55 395/1984 offenbart ist).
Die wie im vorstehenden unter (a) hergestellten anti
körpergebundenen Polystyrol-Perlen (eine Perle), eine
EPO enthaltende Testprobe (50 µl) und 0,01 M Phosphat-
Puffer (200 µl) werden in ein Polystyrol-Röhrchen
(12 mm × 75 mm) gegeben, und die Mischung wird 2 h bei
37°C umgesetzt und mit physiologischer Kochsalz-Lösung
gewaschen. Dazu wird der monoklonale Anti-EPO-Antikörper
(1000fache Verdünnung, 250 µl) hinzugefügt, und die
Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit
physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen.
Getrennt davon wird das wie im vorstehenden unter (b)
hergestellte Anti-Mäuse-IgG 700fach mit einen 0,5-proz.
Rinderserumalbumin-Perphosphat-Puffer verdünnt. Der auf
diese Weise erhaltene verdünnte markierte Antikörper
(250 µl) wird dem oben erwähnten Polystyrol-Röhrchen
zugesetzt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt
und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen.
Danach wird Citrat-Puffer (500 µl), der o-Phenylendiamin
(3 mg/ml) und H2O2 (0,02%) enthält, hinzugefügt, und
die Mischung wird 1 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Die
Reaktion wird durch Zusatz von 1 N H2SO4 (2 ml) abge
brochen. Die Extinktion der Reaktionsmischung wird bei
492 nm gemessen.
Die erhaltene Standard-Eichkurve für EPO ist in der
Fig. 1 dargestellt. Aus Fig. 1 berechnet
sich die Nachweisempfindlichkeit für EPO zu 10 mU/ml.
Zu Polystyrol-Perlen (Durchmesser: 6,4 mm; 100 Perlen)
wird eine Lösung (20 ml) eines monoklonalen Anti-EPO-
Antikörpers (immunisiert gegen Mäuse, wie in der JP-
Patentveröffentlichung 1 55 395/1984 offenbart ist) in
0,1 M NaHCO3 hinzugefügt, und die Mischung wird bei 4°C
16 h stehengelassen und dann mit physiologischer Koch
salz-Lösung gewaschen, wodurch die gewünschten antikör
pergebundene Polystyrol-Perlen erhalten werden.
Beispiel 1-(B) wird wiederholt mit der Abweichung, daß
Anti-Kaninchen-IgG (gegen Schafe immunisiert, herge
stellt von Cappel Co.) an Stelle des Anti-Mäuse-IgG
(hergestellt von DAKO Co.) zur Herstellung des gewünsch
ten peroxidase-markierten Anti-Kaninchen-IgG verwendet
wird.
Der verwendete zweite Antikörper ist ein wie in Beispiel
1-(a) hergestellter von Kaninchen stammender Antikörper.
Die wie im vorstehenden unter (a) hergestellten anti
körpergebundenen Polystyrol-Perlen (eine Perle), eine
EPO enthaltende Testprobe (50 µl) und 0,01 M Phosphat-
Puffer (200 µl) werden in ein Polystyrol-Röhrchen
(12 mm × 75 mm) gegeben, und die Mischung wird 2 h bei
37°C umgesetzt und mit physiologischer Kochsalz-Lösung
gewaschen. Dazu wird der zweite Antikörper (500fach
verdünnt mit einem 0,01 M Phosphat-Puffer, 250 µl) hin
zugefügt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt
und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen.
Das wie im vorstehenden unter (b) hergestellte peroxida
se-markierte Anti-Kaninchen-IgG wird 500fach mit einem
0,5-proz. Rinderserumalbumin-Perphosphat-Puffer ver
dünnt. Der auf diese Weise erhaltene verdünnte markierte
Antikörper (250 µl) wird dem oben erwähnten Polystyrol-
Röhrchen zugesetzt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C
umgesetzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung
gewaschen. Danach wird Citrat-Puffer (500 µl), der
o-Phenylendiamin (3 mg/ml) und H₂O₂ (0,02%) enthält,
hinzugefügt, und die Mischung wird 1 h bei Raumtempera
tur umgesetzt. Die Reaktion wird durch Zusatz von 1 N
H2SO4 (2 ml) abgebrochen. Die Extinktion der Reaktions
mischung wird bei 492 nm gemessen. Mittels dieses Ver
fahrens kann EPO auf einem Niveau von 25 mU/ml nachge
wiesen werden.
Zu Glucoseoxidase (hergestellt von Toyo Boseki K.K.;
10 mg) wird in Portionen N-(4-Carboxycyclohexylmethyl)-
maleinimid-N-hydroxysuccinimidylester (2 mg) in einem
Intervall von 5 min hinzugefügt, und die Reaktions
mischung wird der Gel-Filtration unter Verwendung von
Sephadex G-25 unterworfen, und die Enzym-Fraktionen
werden gesammelt und dann konzentriert. Dazu wird eine
IgG-Fraktion (10 mg) hinzugefügt, die durch Reduzieren
von Anti-Mäuse-IgG (gegen Kaninchen immunisiert; herge
stellt von DAKO Co.) erhalten wurde, und die Mischung
wird über Nacht bei 4°C umgesetzt. Die Reaktionsmischung
wird der Gelfiltration mit Sephadex G-200 unterworfen,
und die aktiven Fraktionen werden gesammelt, wodurch das
gewünschte glucoseoxidase-markierte Anti-Mäuse-IgG er
halten wird.
Die wie in Beispiel 1-(a) hergestellten antikörper
gebundenen Polystyrol-Perlen (eine Perle), eine EPO
enthaltende Testprobe (50 µl) und 0,01 M Phosphat-Puffer
(200 µl) werden in ein Polystyrol-Röhrchen (12 mm ×
75 mm) gegeben, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umge
setzt und mit physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen.
Dazu wird als zweiter Antikörper ein monoklonaler Anti-
EPO-Antikörper (wie er in der JP-Patentveröffentlichung
1 55 395/1984 offenbart ist) (1000fach verdünnt mit
0,01 M Phosphat-Puffer, 250 µl) hinzugefügt, und die
Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit
physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Getrennt wird
das wie im vorstehenden unter (a) hergestellte glucose
oxidase-markierte Anti-Mäuse-IgG 400fach mit einem
0,5-proz. Rinderserumalbumin-Perphosphat-Puffer ver
dünnt. Der auf diese Weise erhaltene verdünnte markierte
Antikörper (250 µl) wird dem oben erwähnten Polystyrol-
Röhrchen zugesetzt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C
umgesetzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung
gewaschen. Getrennt wird ein Substrat (250 µl), das
0,1% p-Hydroxyphenylessigsäure, 0,002% Peroxidase und
2% Glucose enthält, dazugegeben, und die Mischung wird
1 h bei 30°C umgesetzt. Die Reaktion wird durch Zusatz
von Glycin-NaOH-Puffer abgebrochen. Die Fluoreszenz der
Reaktionsmischung wird bei einer Erreger-Wellenlänge von
320 nm und einer Fluoreszenz-Wellenlänge von 450 nm
gemessen. Mittels dieses Verfahrens kann EPO bei
120 mU/ml nachgewiesen werden.
Zu G6PDH (hergestellt von Toyo Boseki K.K.; 5 mg) wird
N-(4-Carboxycyclohexylmethyl)-maleinimid-N-hydroxy
succinimidylester (2 mg) hinzugefügt, und die Reaktions
mischung wird 1 h bei 30°C umgesetzt. Die Reaktions
mischung wird der Gel-Filtration unter Verwendung von
Sephadex G-25 unterworfen, und die Enzym-Fraktionen
werden gesammelt und dann konzentriert. Dazu wird ein
IgG hinzugefügt, das durch Reduzieren von Anti-Mäuse-IgG
(gegen Kaninchen immunisiert; hergestellt von DAKO Co.,
5 mg) erhalten wurde, und die Mischung wird über Nacht
bei 4°C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird der Gel
filtration mit Ultrogel AcA44 (hergestellt von LKB,
Stockholm, Schweden) unterworfen, und die aktiven Frak
tionen werden gesammelt, wodurch das gewünschte G6PDH-
markierte Anti-Mäuse-IgG erhalten wird.
Der in Beispiel 1-(a) hergestellte erste Antikörper
(50 µl) wird in die Vertiefungen einer Polystyrol-Mikro
platte (hergestellt von Coaster Corp.) gegeben, und die
Mischung wird über Nacht bei 4°C umgesetzt und mit
physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. In jede
Vertiefung wird eine EPO enthaltende Testprobe (50 µl)
hinzugefügt, und die Mischung wird 2 h bei 37°C umge
setzt und dann mit physiologischer Kochsalz-Lösung ge
waschen. Als zweiter Antikörper wird ein monoklonaler Anti-
EPO-Antikörper (immunisiert gegen Mäuse, wie er in der
JP-Patentveröffentlichung 1 55 395/1984 offenbart ist)
verwendet und 1000fach verdünnt mit 0,01 M Phosphat-
Puffer. Der verdünnte Antikörper (50 µl) wird dem Inhalt
der obigen Vertiefungen hinzugefügt, und die Mischung
wird 2 h bei 37°C umgesetzt und dann mit physiologischer
Kochsalz-Lösung gewaschen. Getrennt wird das wie im
vorstehenden unter (a) hergestellte G6PDH-markierte
Anti-Mäuse-IgG 750fach mit einem 0,5-proz. Rinderserum
albumin-Phosphat-Puffer verdünnt. Der auf diese Weise
erhaltene verdünnte markierte Antikörper (50 µl) wird
den Vertiefungen zugesetzt, und die Mischung wird 2 h
bei 37°C umgesetzt und dann mit physiologischer Koch
salz-Lösung gewaschen.
Anschließend wird ein Substrat (200 µl), das 30 mM
Glucose-6-phosphorsäure und 2 mM Nicotinamid-adenin
dinucleotid (NAD) enthält, jeder Vertiefung zugesetzt,
und die Mischung wird 30 min bei 37°C umgesetzt. Die
Reaktionsmischung wird zu einem Substrat für die Spek
tralanalyse hinzugefügt, das Luciferase (hergestellt von
Toyo Boseki K.K.), Reduktions-Typ-NAD-Flavinmononucleo
tid (NADH-FMN)oxid-Reduktase (hergestellt von Toyo Boseki
K.K.), Flavinmononucleotid (FMN) und Decanal enthielt,
und das Reduktions-Typ-NAD (NADH) wird auf der Grundlage
der erzeugten Emission mittels eines Lumineszenz-Meters
TD-4000 (hergestellt von Laboneience Co.) gemessen. Als
Ergebnis können 5 mU/ml EPO gemessen werden.
Claims (4)
1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Erythro
poietin, umfassend die Reaktion eines antikörpergebunde
nen unlöslichen Trägers, worin ein spezifisch zur Reak
tion mit Erythropoietin befähigter erster Antikörper an
einen unlöslichen Träger gebunden ist, mit einer
Erythropoietin enthaltenden Test-Probe und einem zweiten
Antikörper, der spezifisch zur Reaktion mit Erythropoie
tin befähigt ist und dadurch hergestellt worden ist, daß
eine Tier-Species, die von dem für die Herstellung des
ersten Antikörpers eingesetzten Tier verschieden ist,
immunisiert wird, anschließend die Reaktion eines
markierten dritten Antikörpers, der spezifisch zur Reak
tion mit dem Immunglobulin der Tier-Species, die für die
Herstellung des zweiten Antikörpers eingesetzt wurde,
befähigt ist, mit dem vorhergehenden Reaktionssystem und
danach die Messung der Menge des markierten Antikörpers,
der an den antikörpergebundenen unlöslichen Träger ge
bunden ist, oder der Menge des ungebundenen markierten
Antikörpers.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der unlösliche Träger ein aus der aus Polystyrol-
Schlauch, Polystyrol-Perlen, Silicon-Fragmente und
Mikroplatten bestehenden Gruppe ausgewähltes Element
ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der markierte Antikörper ein dritter Antikörper ist, der
mit einem Markierungsstoff ausgewählt aus der aus Enzy
men, Isotopen, Fluoreszenzmitteln und metallischen
Stoffe bestehenden Gruppe markiert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der Markierungsstoff ein aus der aus Peroxidase, alkali
scher Phosphatase, β-Galactosidase, Glucose-Oxidase,
Glucose-6-phosphorsäure-Dehydrogenase und Glucose-
Dehydrogenase bestehenden Gruppe ausgewähltes Element
ist.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61079614A JPS62235564A (ja) | 1986-04-07 | 1986-04-07 | エリスロポエチンの免疫学的測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3629924A1 true DE3629924A1 (de) | 1987-10-08 |
Family
ID=13694923
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19863629924 Withdrawn DE3629924A1 (de) | 1986-04-07 | 1986-09-03 | Immunologische messung von erythropoietin |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62235564A (de) |
DE (1) | DE3629924A1 (de) |
FR (1) | FR2596867A1 (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1697750B1 (de) | 2003-12-01 | 2013-03-20 | Dako Denmark A/S | Verfahren und zusammensetzungen für den immunhistochemischen nachweis |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4002532A (en) * | 1974-10-21 | 1977-01-11 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates |
US4289748A (en) * | 1979-05-31 | 1981-09-15 | United States Of America | Ultrasensitive enzymatic radioimmunoassay method |
EP0125893A3 (de) * | 1983-05-12 | 1986-10-15 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Quantitative Bestimmung von Antigenen durch Enzym-Antikörper-Brückenverfahren |
-
1986
- 1986-04-07 JP JP61079614A patent/JPS62235564A/ja active Pending
- 1986-09-01 FR FR8612286A patent/FR2596867A1/fr active Pending
- 1986-09-03 DE DE19863629924 patent/DE3629924A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2596867A1 (fr) | 1987-10-09 |
JPS62235564A (ja) | 1987-10-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0397113B1 (de) | Verfahren zum Nachweis spezifisch bindefähiger Substanzen in Körperflüssigkeiten | |
EP0280211B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern | |
CH627281A5 (de) | ||
DE3854194T2 (de) | Monoklonale antikörper gegen glykosyliertes albumin, hybride zellinien, die diese antikörper produzieren, sowie deren verwendung. | |
EP0363942B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz | |
EP0407904B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Analyten | |
EP0174652B1 (de) | Immunchemisches Messverfahren für Haptene und Proteine | |
DE2951678A1 (de) | Immunologische bestimmung mit hilfe von lectin | |
EP0072902B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von carcinoembryonalem Antigen (CEA) und zur Bestimmung geeignete Antikörperlösung | |
DE2811228A1 (de) | Assay zur quantitativen bestimmung von immonogenen und antikoerpern | |
DE3136579A1 (de) | Analyse fuer thyroxin und 3, 5, 3'-trijodthyronin | |
DE69534294T2 (de) | Mess-system unter verwendung von vollblut | |
DE69730479T2 (de) | Marker und immunologisches Reagens für Dialyse verbundenen Amyloidosis, Diabetes Mellitus und Diabetes Mellitus-Komplikationen | |
DE69636013T2 (de) | Verfahren zum erlangen von rezeptor-freigabeligand (reland)-komplexen und testansätze | |
DE2952478A1 (de) | Verfahren und mittel zur immunologischen bestimmung von enzymen | |
DE3872575T2 (de) | Ckmb-bestimmung, monoclonale antikoerper zur verwendung darin und hybrid-zellinien. | |
DE69211805T2 (de) | Testsatz und Verfahren zum Nachweiss von Mikroorganismen assoziiert mit periodontalen Krankheiten unter Verwendung Surfactantmischung als Extraktionskomposition | |
DE3525911A1 (de) | Konjugat fuer die enzymimmunobestimmung | |
DE2804940A1 (de) | Verfahren zur herstellung antigener substanzen und nachweismaterial | |
DE69008178T2 (de) | Analyse von vitamin b12. | |
DE69211371T2 (de) | Bestimmung von Analyten mit hohem Molekulargewicht | |
DE3887727T2 (de) | Partikelstabilisierte Epitope zur Standardisierung und Kontrolle von Immuntests. | |
DE3883145T2 (de) | Verfahren zur Messung von humanen Insulin. | |
EP0809805B2 (de) | Verwendung von polyklonalen humanen anti-htg-autoantikörpern als reagenz für die klinische diagnostik von schilddrüsen-autoimmunerkrankungen sowie reagenziensatz für eine bestimmung von anti-htg-autoantikörpern in patientenseren | |
DE69822446T2 (de) | Cyclosporin derivate und deren verwendung |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8141 | Disposal/no request for examination |