JP2688180B2 - スーパーオキシドジスムターゼアナログの産生方法 - Google Patents
スーパーオキシドジスムターゼアナログの産生方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】発明の背景
遺伝子工学の1つの特徴は、真核生物起源に由来する外
来DNA配列を大腸菌(Escherichia co
li)又はその他の微生物に挿入することにある。遺伝
子工学で得られる別の優れた特徴は、外来DNAがコー
ドしているポリペプチドの産生をこれら微生物中で誘導
することにある。ポリペプチドの産生は2段階プロセス
で生じ、各段階が多数のサブステップを含むと考えられ
ている。2つの段階は転写段階と翻訳段階である。ポリ
ペプチドを効率的に量産するためにはプロセスの2つの
段階が共に効率的に行なわれる必要がある。転写によっ
て遺伝子(DNA)からmRNAが生成し、翻訳によっ
てmRNAからポリペプチドが生成する。転写プロセス
の重要なサブステップは開始、即ちプロモーター−オペ
レーター領域へのRNAポリメラーゼの結合である。プ
ロモーター領域を構成するデオキシリボヌクレオチド塩
基の配列を変更し、これによってプロモーターの相対的
効率を加減し得る。この効率はRNAポリメラーゼのプ
ロモーターに対する親和性に左右される。翻訳効率はm
RNAの安定性に影響される。mRNA安定性が増すと
翻訳効率が上がる。mRNA安定性の正確な決定因子は
正確にはわかっていないが、その塩基の配列によって決
定されるmRNAの二次構造が安定性に寄与することが
判明している。翻訳の最初のサブステップでは、シャイ
ン−ダルガルノ(Shine−Dalgarno)配列
又はリボソーム結合部位(RBS)として知られるmR
NA上の塩基配列にリボソームが結合する。リボソーム
がmRNAに沿ってAUG翻訳開始コドンまで移動する
とポリペプチド合成が開始される。これらのコドンは通
常、シャイン−ダルガルノ(Shine−Dalgar
no)部位から約10塩基“下流に”存在する。翻訳効
率を高める要因の1つに、シャイン−ダルガルノ(Sh
ine−Dalgarno)部位へのリボソームの結合
を増強することが含まれる。シャイン−ダルガルノ(S
hine−Dalgarno)配列及びAUGコドンの
領域でのmRNAの構造とシャイン−ダルガルノ(Sh
ine−Dalgarno)配列からAUGコドンまで
の間隔とは、夫々、翻訳効率の決定に関して重要な役割
を果たすことが判明している。翻訳効率に影響を与える
別の要因は、早期終結(premature term
ination)及び転写減衰(attenuatio
n)である。減衰部位を除去することによって翻訳効率
を向上させることが可能である。細菌細胞中で真核生物
ポリペプチドを多量に産生する計画の障害となるのは、
多量のmRNAを生成する細胞が効率良く増殖できない
ことである。このような障害は、抑制というプロセスに
より転写を阻害することによって除去することができ
る。抑制に於いては、オペレーター領域に結合して転写
を阻害するタンパク阻害剤(リプレッサータンパク)の
作用によって遺伝子がスイッチオフされている。微生物
が所望の細胞密度まで増殖した後に、リプレッサーを破
壊するか又はリプレッサーの効果を凌駕し得る誘導物質
として知られる分子を添加することによって抑制されて
いる遺伝子を活性化する。λバクテリオファージ由来の
PLプロモーターを含むプラスミド中での真核生物遺伝
子のクローニングに関しては文献中に多くの報告が見ら
れる[エッチ.ブイ.バーナード(H.V.Berna
rd)らジーン(Gene)(1979)5,59;シ
ー.デロム(C.Derom)ら、ジーン(Gene)
(1982)17,45;ディー.ゲイセン(D.Gh
eysen)ら、ジーン(Gene)(1982)1
7,55;ジェー.ヘジペス(J.Hedgpeth)
ら、モル.ジエン.ジエネット.(Mol.Gen.G
enet.)(1978)163,197;イー.レマ
ート(E.Remaut)ら、ジーン(Gene)(1
981)15,81;アール.デリンク(R.Dery
nck)ら、ネーチャー(Nature)(1980)
287,193)]。更に、1981年12月16日公
開の欧州特許出願第041,767号は、λバクテリオ
ファージ由来のPLプロモーターを含む発現ベクターを
記載している。しかしながら、これらの文献はいずれも
CIIリボソーム結合部位の使用については記載してい
ない。λバクテリオファージ由来のPLプロモーターと
CIIリボソーム結合部位とを含むベクターの使用につ
いては、エー.ビー.オッペンハイム(A.B.Opp
enheim)ら、ジェー.モル.バイオロ.(J.M
ol.Biol.)(1982)158,327並びに
エッチ.シマタケ(H.Shimatake)及びエ
ム.ローゼンベルグ(M.Rosenberg),ネー
チャー(Nature)(1981)292,128に
記載されている。これらの刊行物は、高レベルのCII
タンパクの産生について記載しているが、真核生物タン
パクの産生を包含又は記載していない。PLプロモータ
ーとCIIリボソーム結合部位を含む他のベクターも以
下の文献に記載されている。カーンティ・エム等(Co
urntey,M.,et al.),PNAS(19
84)81,669−673;ラウテンベルガー・ジェ
イ・エー等(Lautenberger,J.A.,e
t al.),遺伝子(Gene),1983,23,
75−84及びラウテンベルガー・ジェイ・エー等,サ
イエンス(1983),221,858−860。しか
しながら、これらに記載されたベクターではいずれもC
IIプロテインのアミノ末端部分を含む融合タンパク質
が産生する。1982年にシャッマン(Shatzma
n)及びローゼンバーグ(Rosenberg)は第1
4回マイアミ.ウインター.シンポジウム(Miami
Winter Symposium)にポスターを提
出した[エー.アール.シャッマン(A.R.Shat
zman)及びエム.ローゼンバーグ(M.Rosen
berg),第14回マイアミウインターシンポジウム
(Miami Winter Symposium)抄
録98頁[1982]]。この抄録には、λバクテリオ
ファージ由来のPLとNutとCIIリボソーム結合部
位とを含むベクターを使用して“真核生物”ポリペプチ
ドを細菌宿主中で細胞タンパクの5%より高い量で合成
することが開示されているが、(SV40小T(sma
ll T)抗原は実際には真核生物ポリペプチドでなく
ウイルスタンパクであるし)、細菌宿主名が示されてい
ない、使用したオペレーターが定義されていない、複製
起点(開始点)も選択可能な表現型の遺伝子も同定され
ていない等の理由によって上記の開示は実施不能であ
る。このようなベクターを使用するこの系は、このベク
ターを安定に形質転換し得るような或る種の宿主溶原菌
(host lysogen)を含むと記載されてい
る。本出願人は、国立保健協会(National I
nstitutes ofHealth),ヘルス及び
ヒューマンサービス部門(Dept.of Healt
h and Human Services),米国,
によるエム.ローゼンベルグ(M.Rosenber
g)名義で係属中の米国特許出願第457,352号の
存在を知っている。この出願の一部は国立技術情報サー
ビス(National Technical Inf
ormation Service),米国通常部門
(U.S.Dept.of Commerce)から入
手できたが、特許請求の範囲はまだ機密であり入手不能
である。本出願人は該出願の入手し得た部分について検
討し、この開示も実施不能であるとの結論を得た。即
ち、この開示によれば宿主が重要であるのに(8頁17
行)いかなる適当な宿主も同定されていない。更に該出
願はλ突然変異体の使用を基盤とするのにこの突然変異
体が特定されていない(4頁20行)。更に該出願では
宿主が溶原(lysogen)を含む(8頁18行)
が、本発明では宿主が溶原菌でない。該出願は真核生物
遺伝子、すなわちサルメタロチオネイン遺伝子のクロー
ニング及び発現に言及しているが(7頁18行)、これ
らについて詳細に説明していない。該出願ではCIIリ
ボソーム結合領域のいかなるヌクレオチドの配列も位置
も変更していないと述べられている(3頁27行)。1
983年7月15日出願の、本発明と同様に譲渡されて
いる係属中の米国特許出願第514,188号中に細菌
中に於けるポリペプチドの発現に有用な新規なベクター
について記載がある。これらのベクターは、PLOL,
抗転写終結因子Nタンパクを結合するN利用部位(Nu
tilization site),リボソーム結合部
位,ATG コドン,所望のポリペプチドをコードして
いる遺伝子を挿入する為の制限酵素部位,複製起点及び
選択可能なマーカーを含んでいる。これらのベクターに
於いて、N利用部位とリボソーム結合部位間の距離は約
300塩基対より大きい。更に、それぞれのベクターに
は、容易に置換され得ない特異的リボソーム結合部位が
含まれている。これらのベクターは様々なポリペプチド
の発現にどれも同様に用い得るということはできない。
T1T2rRNA転写終結配列が、ブロシウス・ジェイ
等(Brosius,J.,et al.)ジェイ・モ
ル・バイオル(J.Mol.Biol.)148,10
7,(1981)に記載されている。このT1T2rR
NA終結配列を原核生物遺伝子の3′末端につなぎ、該
遺伝子をプロモーターによるコントロール下で発現させ
ることが記載されている(アマン・イー等(Aman
n,E.,et al.)遺伝子(Gene)198
3,25,167;ザビュー・エム等(Zabeau,
M.,et al.)エムボ・ジャーナル(The E
MBOJournal)1982,1,1217)。欧
州特許出願第81304573.9号で1982年4月
14日に公開された欧州特許公開第049,619号に
は、安定化因子として熱誘導性リプレッサー(ther
moinducible repressor)λcI
857の使用が記載されている。このリプレッサーをプ
ラスミド上にクローニングする。リプレッサー合成を欠
陥しているプロファージλcI90に感染によって導入
する。このプロファージは32℃より低い温度ではクロ
ーン化リプレッサーによって維持される。前記プラスミ
ドを失った細胞はいずれも溶菌する。温度を38℃より
も高くすると、該リプレッサーが破壊されあるいは不活
化されて細胞が溶菌する。この安定化システムはλPL
プロモーターを含み38℃より高温でポリペプチドを発
現する本発明のベクターには用いることはできない。コ
ピー数の多い構成プラスミド(constitutiv
e high copy number plasmi
ds)に由来する複製起点は公知である。例えば、Co
l E1由来の。pOP 1Δ6複製起点は、ゲルファ
ンド・デー・エイチ等(Gelfand,D.H.,e
t al.)PNAS(1978)75,(12),5
869及びミューシング・エム等(Muesing,
M.,et al.)Cell(1981)45,23
5に記載されている。更に、コピー数の多い脱落性(r
un−away)複製プラスミド(これはコピー数の多
い構成プラスミドとは区別される)も公知である(レマ
ント・イー等(Remant,E.,et al.)遺
伝子(Gene)1983,22,103)。本発明は
様々なポリペプチドの発現を予期せぬ程高める発現ベク
ターに係わる。本発明のベクター中に異なるリボソーム
結合部位を採用することで、従来のベクターを用いて達
成されるレベルと比較して高い発現レベルの様々なポリ
ペプチドを生産することが可能になる。加えて、従来の
ベクターと全く同じリボソーム結合部位を用いても同じ
ポリペプチドを高い発現レベルで生産することが可能で
ある。更に、T1T2rRNA終結配列を発現させたい
ポリペプチドがコードされている遺伝子の3′末端に結
げることによって、細菌宿主によって生産される総ポリ
ペプチドに比べてその所望のポリペプチドの量を増やす
ことが可能である。重要なことに、T1T2rRNA転
写終結配列が存在すると、コピー数の多い構成プラスミ
ド由来の複製起点を、数多くのコピーを構成的(con
stitutive)に複製する能力を失なうことなく
発現ベクター中に組み込むことが可能になる。pBR
322又はコピー数の多い脱落性(runaway)プ
ラスミド以外のコピー数の多い非構成プラスミド(no
n constitutive high copy
number plasmids)由来の複製起点はこ
れをベクター中に組み込んだとき細胞当りほんの限られ
た数の、代表的には細胞当り40コピーより少ない数を
生産することができる。コピー数の多い構成プラスミド
由来の複製起点に代えることによって、ポリペプチドの
発現レベルが予期せぬ程高くなることが判明した。本発
明の好適なベクターは細菌宿主内で安定化されており、
ベクター及びポリペプチドをコードした遺伝子を含むプ
ラスミドを含有する細菌が増殖する際にそのプラスミド
は失なわれることがない。こうして、プラスミドの不安
定性に帰因するところの収率低下が克服される。更に、
このような好適ベクターを用いることで選択マーカーと
して抗生物質抵抗性を用いる必要がなく、従ってポリペ
プチドを低コストで生産することが可能になる。本発明
の新規な発現ベクターを用いて生産され得る幾つかのポ
リペプチドのうちのあるものはスーパーオキシドジスム
ターゼ(SOD)及びそのアナログ(類似体)である。
本発明は特に、従来のベクターと全く同じリボソーム結
合部位を用いても、また本明細書中に記載されている前
記RBSと異なるリボソーム結合部位を用いても、スー
パーオキシドジスムターゼ及びそのアナログの予期せぬ
程の高められた発現を催す発現プラスミドに係わる。本
発明はまた、前記プラスミドを利用して細菌内でSOD
及びそのアナログの高効率に産生する方法に係わる。ス
ーパーオキシドジスムターゼ(SOD)及び酸素フリー
ラジカル(O2・−)の現象は1968年にマッコード
及びフリードヴィッヒによって発見された(マッコード
・ジェイ・エム(McCord,J.M.)及びフリー
ドヴィッヒ・アイ(Fridovich,I.)ジェイ
・バイオル・ケミ(J.Biol.Chem.)24
4,6049−6055(1969))。スーパーオキ
シドラジカル及び他の高反応性酸素種は全ての呼吸細胞
に於いて酸化的代謝の副生成物として産生し、広範囲の
細胞成分及び高分子に多大の損傷を与えることが判った
(フリードヴィッヒ・アイ(Fridovich,
I.),アドバンス・イン・イン・オーガニック・バイ
オケミストリー,アイクホーン・ジー・エル(Eich
horn,G.L.)版及びマルチリ・エル・ジー(M
arzilli,L.G.),エルセヴィア/北オラン
ダ,ニューヨーク,67−90頁(1970)並びにフ
リーマン・ビー・エー(Freeman,B.A.)及
びクラポ・ジェイ・デー(Crapo,J,D,)ラボ
ラトリー・インベスティゲーション,47,412−4
26(1982)参照)。スーパーオキシドジスムター
ゼとして知られる金属プロテイン類は酸化−還元反応2
O2 −+2H+→H2O2+O2を触媒し、酸素毒性に
対する防御機構を形成する。タンパク分子中に異なる金
属を含有する3種類のSODが知られている。即ち、
鉄,マンガン及び銅と亜鉛の両者を含有するものであ
る。これらの酵素は全て同じ反応を究極的な効率で触媒
し、金属が活性部位の触媒因子であるような類似の機構
で作用する。これらの酵素は幾つかの進化論上の群に分
類される。Mn−SOD及びFe−SODは主に原核細
胞中に見られ、一方CuZn−SODは事実上全ての真
核生物中に認められる(シュタインマン・エイチ・エム
(Steinman,H.M)スーパーオキシドジスム
ターゼ,オバーレイ・エル・エム(Oberley,
L.M.)版,シーアールシープレス,フロリダ,11
−68頁(1982))。ヒトCu/Zn SOD−1
は同一の非共有結合サブユニットからなる金属−蛋白質
二量体であり、各サブユニットは銅1原子と亜鉛1原子
とを含有し、16000ダルトンの分子量を持つ(ハー
ツ,ジェー,ダブリュ(Hartz,J.W.)及びド
イッチェ,エイチ.エフ.(Deutsch,H.
F.)、ジェー.バイオール.ケム.(J.Biol.
Chem.)247,7043−7050(197
2))。各サブユニットは配列が確定された153個の
アミノ酸からなる(ジャブッシュ,ジェー.アール.
(Jabusch,J.R.)、ファーブ,ディー.エ
ル.(Farb,D.L.)、ケルシェンスタイナー,
ディー.エー.(Kerschensteiner,
D.A.)及びドイッチェ,エイチ.エフ.(Deut
sch,H.F.)、バイオケミストリー(Bioch
emistry)19:2310〜2316(198
0)及びバーラ,ディ.(Barra,D.),マルチ
ニ,エフ.(Martini,F.)、バニスター,ジ
ェー.ブイ.(Bannister,J.V.)、シニ
ーナ,エム.ダブリュ.(Schinina,M.
W.)、ロチリオ,ダブリュー.エイチ.(Rotil
io,W.H.)、バニスター,ダブリュー.エイチ.
(Bannister,W.H.)及びボッサ,エフ.
(Bossa,F)、FEBSレターズ(FEBS L
etters)120,53−56(1980))。更
に、近年、ヒトSOD−1の全コード領域を含有するc
DNAクローンが単離されその配列が決定された(リー
マン−フルウィッツ,ジェー.(Lieman−Hur
witz,J.)、ダフニ,エヌ.(Dafni,
N.)、ラヴィエ,ブイ.(Lavie,V.)及びグ
ローナー,ワイ.(Groner,Y.)、プロク.ナ
ットル.アカデ.サイ.USA(Proc.Natl.
Acad.Sci.USA)79,2808−2811
(1982)及びシャーマン,エル.(Sherma
n,L.),ダフニ,エヌ.(Dafni,N.)、ラ
イマン−フルヴィッツ,ジェー.(Leiman−Hu
rwitz,J.)及びグローナー,ワイ.(Gron
er,Y.)、プロク.ナットル.アカデ.サイ.US
A(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)
80,5465−5469(1983))。産生したヒ
トCu−Zn SODアナログはそのアミノ末端アラニ
ンがアセチル化されていない点で天然のヒトCu−Zn
SODと異なる。天然のヒトSODはアミノ末端アラ
ニンがアセチル化されている(ハーツ,ジェー,ダブリ
ュー.(Hartz,J.W.)及びドイッチェ,エイ
チ.エフ.(Deutsch,H.F.)、ジェー.バ
イオール.ケム.(J.Biol.Chem.)(19
72)247,7043−7050;ジャブッシュ,ジ
ェー.アール.(Jabusch,J.R.)ら、バイ
オケミストリー(Biochemistry)(198
0)19,2310−2316;バーラ(Barra)
ら、FEBSレターズ(FEBS Letters)
(1980)120,53及びオバーリー,エル.ダブ
リュ.(Oberly,L.W.)、スーパーオキシド
ジスムターゼ(Superoxide Dismuta
se)、第1巻、CRCプレス(CRC Pres
s)、フロリダ(Florida)、(1982)、
(32頁−33頁)。ウシSODと同様に天然のヒトS
ODはグリコシル化されていると思われる(ヒューバ
ー,ダブリュ.(Huber,W.)、米国特許第3,
579,495号明細書、1971年5月18日発
行)。大腸菌(Escherichia coli)が
自分で産生した蛋白質をグリコシル化しないように、細
菌が産生したヒトSODはほとんどグリコシル化されな
い。細菌が産生したSODアナログのアミノ酸配列は成
熟ヒトSODと同じであるが、N−末端にメチオニン残
基を持たない。本発明はヒトCu/Zn SODの酵素
学的に活性なアナログを細菌内で産生し精製する方法を
提供する。スーパーオキシドジスムターゼはその薬理学
的特性から非常に興味深い。ウシ由来の天然にみられる
スーパーオキシドジスムターゼ(オルゴテイン,org
otein)は抗炎症作用を持つことが知られており、
欧州、例えば***で炎症の治療用に最近市販されてい
る。米国を含む多くの国でも炎症治療用特に馬の腱の炎
症の治療用に動物薬として販売されている。又、科学論
文はSODが広範囲に亘り臨床的に使用できるであろう
ことを示唆している。これには腫瘍形成や腫瘍増大を防
止することや抗癌剤の細胞毒作用や心臓毒作用を軽減す
ること(オバーレイ,エル.ダブリュ.(Oberle
y,L.W.)及びビューエトナー,ジー.アール.
(Buettner,G.R.)、キャンサー リサー
チ(Cancer Research)39,1141
−1149(1979);虚血組織の保護(マクコー
ド,ジェー.エム.(McCord,J.M.)及びロ
イ,アール.エス.(Roy,R.S.)、カン.ジェ
ー.フィジオール.ファーム.(Can.J.Phys
iol.Pharm.)60,1346−1352(1
982));及び***の保護(アルバーレッツ,ジェ
ー.ジー.(Alvarez,J.G.)及びストーレ
イ,ビー.ティー.(Storey,B.T.)、バイ
オール.リプロダ.(Biol.Reprod.)2
8,1129−1136(1983))が包含される。
更に、加令過程に対するSODの作用の研究も非常に興
味深い(タルマソッフ,ジェー.エム.(Talmas
off,J.M.)、オノ,ディー.(Ono,T.)
及びカトラー,アール.ジー.(Cutler,R.
G.)、プロク.ナットル.アカデ.サイ.USA(P
roc.Natl.Acad.Sci.USA)77,
2777−2782(1980))。本発明は、H+の
存在下でのスーパーオキシドラジカルの過酸化水素と分
子状酸素への還元を触媒するために組換えヒトスーパー
オキシドジスムターゼ(hSOD)またはそのアナログ
を使用することにも係る。特に、本発明は虚血(isc
hemia)に伴う再灌流(reperfusion)
時の損傷を減少させ、切除した摘出臓器の生存期間(s
urvival period)を延長するためのhS
ODアナログの使用に関する。本発明は臓器移植に伴う
再灌流時の損傷や脊髄虚血(spinal cord
ischemia)を減少させるためにhSOD又はそ
のアナログを使用することにも係る。発明の要約 本発明は、非耐熱性(thermolabile)リプ
レッサーC1を含有する適切な細菌宿主細胞例えば大腸
菌(Escherichia coli)に導入する
と、この宿主細胞が、宿主細胞の温度がリプレッサー不
活化温度まで上昇した際、前記ベクターに挿入されてい
る所望遺伝子を発現し得かつ前記遺伝子がコードしてい
るポリペプチドを産生し得るようになる改良発現ベクタ
ーに係り、このベクターは、5′から3′に向かって、
λバクテリオファージ由来のプロモーター−オペレータ
ーPLOLを含有するDNA配列と、抗転写終結因子N
タンパク質を結合するためのN利用部位と、この後に続
くリボソーム結合部位を含有するDNA配列の置換(r
eplacement)を可能にする第1の制限酵素部
位と、所望遺伝子のmRNAが宿主細胞内のリボソーム
に結合し得るようにするためのリボソーム結合部位を含
有するDNA配列と、ATG開始コドン、または所望遺
伝子をベクター内に挿入するとATG開始コドンに変換
されるDNA配列と、ATG開始コドンと位相を合わせ
て(in phase)所望遺伝子をベクター内に挿入
するための第2の制限酵素部位と、をこの順に含む二本
鎖DNA分子を含んでおり、さらに、宿主細胞中で自律
複製し得る細菌プラスミド由来複製起点を含有するDN
A配列と、このベクターが宿主細胞中に存在するときに
現れる選択可能または同定可能な表現形質に関連する遺
伝子を含有するDNA配列ならびにcI434という断
片(このような断片はcI434リプレッサータンパク
質に対する遺伝子とこれに関連したプロモーター−オペ
レーター配列とを含む)を含有するDNA配列から成る
群から選択される選択手段と、を含んでおり、PLOL
プロモーターオペレーター配列の3′末端とN利用部位
の5′末端との間の距離が約80塩基対未満であり、N
利用部位の3′末端とリボソーム結合部位の5′末端と
の間の距離が約300塩基対未満である。選択手段がp
JH200及びpRO211の如き表現形質に関連する
遺伝子であるベクターが好ましい。本発明ベクターは第
2の制限酵素部位の3′にT1T2rRNA配列を含有
するDNAを更に含んでいてもよい。T1T2rRNA
転写終結配列は第2の制限酵素部位の3′末端から約1
00塩基対未満であることが望ましく、約20塩基対未
満であることがより望ましい。T1T2rRNA転写終
結配列を含んでいる現状の好ましいベクターはその選択
手段が表現形質に関連する遺伝子であるp579であ
る。cI434フラグメント(断片)を含有する本発明
ベクター中で、cI434フラグメントはT1T2rR
NA終結配列の3′にあることが望ましい。ベクターが
表現形質に関連する遺伝子とcI434フラグメントと
の両者を含有していることが望ましい。両方の遺伝子を
含有している現状で好ましいベクターはCla I部位
にcI434フラグメントをクローニングしたp579
である。本発明ベクターは、宿主細胞中で自律複製し
得、少なくとも400個のベクターの構成コピーを生成
し得る細菌のプラスミド由来の複製起点をも含有してい
てもよい。現状で好ましい複製起点はcol E1プラ
スミド由来のpOP 1Δ6である。T1T2rRNA
終結配列、宿主細胞内でベクターの構成コピーを少なく
とも400個生成し得る複製起点を含み且つ表現形質遺
伝子とcI434フラグメントの遺伝子との両者を含有
しているベクターが好ましい。所望のポリペプチド例え
ばウシ、ブタ、ニワトリ又はヒトの成長ホルモンの如き
成長ホルモン、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、ヒ
トアポリポプロテインE又はこれらのアナログをコード
するcDNAのような遺伝子をベクターの第2の制限酵
素部位に挿入してプラスミドを作ってもよい。このプラ
スミドはその後、遺伝子が発現され所望のポリペプチド
を生成することのできる適切な宿主に導入することがで
きる。現状で好ましいプラスミドは、bGH用には、p
RO 12,pSAL5200−6,pHG44,pS
AL5600−1,p7200−22,pHG50,p
8300−10A,pSAL−170/10 pSAL
−210/4及びp9200;ヒトスーパーオキシドジ
スムターゼ用には、pSODα2,pSODβ1,pS
ODβ1T11,pSODβ1−BA2及びpSODβ
1TT−1;pGH用には、p3008及びp300
9;cGH用には、p5002及びp5003;hGH
用には、pTV300;ヒトアポリポプロテインE用に
は、pTV−188,pSAL160−5,pTV−1
70,pTV−190,pTV−194,pTV−21
4及びpTVR279−8である。好ましい宿主は大腸
菌(Escherichia coli)A1637,
A1645,A2602,A2097及びA1563並
びにプラスミドがcI434フラグメントを含有してい
るときには、A1645(λi434cI−mini
Tn 10)を包含する。好ましい原栄養性宿主(pr
ototrophic hosts)は大腸菌(E.
coli)A4200,A4255及びA4346を包
含する。好ましい溶解性宿主(lytic host
s)は大腸菌(E. coli)A4048を包含す
る。得られた宿主ベクター系はポリペプチドの製造に用
いることができる。プラスミドを含有する宿主細胞をポ
リペプチドを生成しうる適切な条件下で増殖させ、得ら
れたポリペプチドを回収する。宿主ベクター系を用い
て、ヒトアポリポプロテインE、ウシ成長ホルモン、ブ
タ成長ホルモン、ニワトリ成長ホルモン、ヒト成長ホル
モン及びヒトスーパーオキシドジスムターゼのアナログ
が製造される。このように得られたSODアナログはS
ODアナログと適当なキャリアー(担体,carrie
r)とを含有する動物薬及び医薬組成物に配合される。
これらのスーパーオキシドジスムターゼアナログは次の
反応:2O2 −+2H+→H2O2+O2を触媒するの
に用いられる。より特定的には、このようなアナログは
虚血又は臓器移植に伴う再灌流による損傷を減少させ、
心筋梗塞の大きさを減少させ、切除した摘出臓器の生存
時間(有効保存期間)を増加させるために用いられた。
これらのアナログは脊髄損傷を減少させるために又気管
支肺異形成(bronchial pulmonary
dysplasia)に用いることもできる。酵素学的
に活性な真核生物のスーパーオキシドジスムターゼ又は
そのアナログを細菌細胞中で生成する方法も発見され
た。細菌細胞はスーパーオキシドジスムターゼ又はアナ
ログをコードするDNA配列を含有しており、このDN
A配列を発現させることができる。この方法は、適切な
条件下で、培地中の細胞が利用しうるCu++濃度が約
2ppm以上となるような量のCu++を添加した生成
(産生)培地中に細菌細胞を維持することからなる。こ
の方法の好ましい具体例では、細菌細胞はヒトスーパー
オキシドジスムターゼのアナログをコードするDNA配
列を含有するプラスミドを持つ大腸菌(Escheri
chia coli)細胞である。本発明は又、本発明
方法により細菌細胞内で生成された、精製された酵素学
的に活性な真核生物のスーパーオキシドジスムターゼ又
はそのアナログを回収する方法にも係る。この方法は、
成長(増殖)培地から細菌細胞を単離し、pHが約7.
0〜約8.0の適切な溶液中に細菌細胞を懸濁すること
からなる。懸濁した細菌細胞の細胞壁を破砕し、次に、
得られた均質な溶液を適切な条件下で音波処理する。音
波処理した溶液を適切な条件下で遠心する。上清部を移
して、約2時間約65℃に加熱する。次に、上清部を冷
却し、適切な条件下で遠心して上清部に清澄な蛋白質溶
液を得る。得られた上清部を適切な容量まで濃縮し、p
H約7.0〜約8.0で平衡化した適切なアニオン交換
体でのイオン交換クロマトグラフィーにかける。スーパ
ーオキシドジスムターゼ又はアナログを含有する得られ
た溶液を集めて適切な容量まで濃縮し、pH約7.0〜
約8.0の緩衝溶液に対して透析する。この濃縮した緩
衝溶液をpH約7.0〜約8.0で平衡化した適切なア
ニオン交換体でのイオン交換クロマトグラフィーにかけ
る。アニオン交換体−蛋白質複合体を適切な塩勾配にか
ける。スーパーオキシドジスムターゼまたはアナログを
含有する画分を集めて濃縮し、蒸留水に対して透析す
る。適当なバッファーでこの溶液のpHを約4.0〜約
5.0に調整する。次に、緩衝化した溶液をpH約4.
0〜約5.0で平衡化した適切なカチオン交換体でのイ
オン交換クロマトグラフィーにかける。蛋白質−カチオ
ン交換体複合体を適切な塩勾配にかけ、精製されたスー
パーオキシドジスムターゼ又はアナログを含有する得ら
れた画分を集める。本発明はこれらの方法で生成され
た、精製された酵素学的に活性な組換え体の真核性スー
パーオキシドジスムターゼ又はそのアナログにも係る。図面の説明 第1図乃至第31図に示した各プラスミドの制限地図は
各プラスミドに存在する全ての制限部位を同定するもの
ではない。制限部位が1つの図には示されているが、も
う1つの図には示されていない場合もある。しかしなが
ら、本発明を完全に理解するために必要な制限部位は全
て示している。第1図:pAL 500の構築 bGH cDNAを含むプラスミドD4(ATCC N
o.31826)をHae IIで消化した。得られた
1600塩基対の大フラグメントを精製し、S1エキソ
ヌクレアーゼで37℃で5分間消化した。得られたフラ
グメントの末端に配列: の合成Eco RIリンカーを連結した。連結混合物を
Eco RIで開裂し、Eco RIで開裂してあるp
BR 322(ATCC No.37017)中に挿入
した。Eco RIで開裂すると5′端に配列: を有する1200塩基対フラグメントを遊離するクロー
ンpALRIが得られた。この配列が生成するというこ
とは、pALRIが天然bGHの1番目の残基(フェニ
ルアラニン)をコードするTTCコドンを含むEco
RI制限部位を含有することを示している。pALRI
をPst Iで部分開裂した。消化物をDNAポリメラ
ーゼIの大フラグメント(クレノウ)で処理し、配列: のHind IIIリンカーを連結した。連結混合物を
Eco RIとHindIIIとで開裂した。bGH
cDNAを含むフラグメントを単離し、EcoRI及び
Hind IIIの制限部位間でpBR 322にサブ
クローニングしてpAL 500(ATCC No.3
9782)を得た。第2図:pRO 211及びpRO 12の構築 プラスミドpJH 200(ATCC No.3978
3)をNde Iで部分消化し、末端を充填(fill
in)するためにDNAポリメラーゼI(クレノウ)
で処理した。得られた末端を再び連結させて発現ベクタ
ーpRO 211を形成した。発現ベクターpRO 2
11をNde I及びHind IIIで消化した。大
フラグメントを単離し、pAL 500(ATCC N
o.39782)から単離したNde I−Hind
III bGHフラグメントと連結してpRO 12を
得た。(Nde I−Hind IIIフラグメントは
pAL500をEco RIで消化し、消化産物の末端
に配列: の合成リンカーを連結させて生成した。連結混合物をN
de I及びHindIIIで消化し、得られたNde
I−Hind III bGHフラグメントを単離し
た。)第3図:pSAL5200−6の構築 pRO 12(第2図)をPvu IIで部分消化し、
次いでNde Iで消化することにより72塩基対フラ
グメントを除去した。消化したpRO 12に真正(a
uthentic)bGHのN−末端の最初の24個の
アミノ酸をコードする合成DNAフラグメントを連結し
た。合成DNAフラグメントは配列:
来DNA配列を大腸菌(Escherichia co
li)又はその他の微生物に挿入することにある。遺伝
子工学で得られる別の優れた特徴は、外来DNAがコー
ドしているポリペプチドの産生をこれら微生物中で誘導
することにある。ポリペプチドの産生は2段階プロセス
で生じ、各段階が多数のサブステップを含むと考えられ
ている。2つの段階は転写段階と翻訳段階である。ポリ
ペプチドを効率的に量産するためにはプロセスの2つの
段階が共に効率的に行なわれる必要がある。転写によっ
て遺伝子(DNA)からmRNAが生成し、翻訳によっ
てmRNAからポリペプチドが生成する。転写プロセス
の重要なサブステップは開始、即ちプロモーター−オペ
レーター領域へのRNAポリメラーゼの結合である。プ
ロモーター領域を構成するデオキシリボヌクレオチド塩
基の配列を変更し、これによってプロモーターの相対的
効率を加減し得る。この効率はRNAポリメラーゼのプ
ロモーターに対する親和性に左右される。翻訳効率はm
RNAの安定性に影響される。mRNA安定性が増すと
翻訳効率が上がる。mRNA安定性の正確な決定因子は
正確にはわかっていないが、その塩基の配列によって決
定されるmRNAの二次構造が安定性に寄与することが
判明している。翻訳の最初のサブステップでは、シャイ
ン−ダルガルノ(Shine−Dalgarno)配列
又はリボソーム結合部位(RBS)として知られるmR
NA上の塩基配列にリボソームが結合する。リボソーム
がmRNAに沿ってAUG翻訳開始コドンまで移動する
とポリペプチド合成が開始される。これらのコドンは通
常、シャイン−ダルガルノ(Shine−Dalgar
no)部位から約10塩基“下流に”存在する。翻訳効
率を高める要因の1つに、シャイン−ダルガルノ(Sh
ine−Dalgarno)部位へのリボソームの結合
を増強することが含まれる。シャイン−ダルガルノ(S
hine−Dalgarno)配列及びAUGコドンの
領域でのmRNAの構造とシャイン−ダルガルノ(Sh
ine−Dalgarno)配列からAUGコドンまで
の間隔とは、夫々、翻訳効率の決定に関して重要な役割
を果たすことが判明している。翻訳効率に影響を与える
別の要因は、早期終結(premature term
ination)及び転写減衰(attenuatio
n)である。減衰部位を除去することによって翻訳効率
を向上させることが可能である。細菌細胞中で真核生物
ポリペプチドを多量に産生する計画の障害となるのは、
多量のmRNAを生成する細胞が効率良く増殖できない
ことである。このような障害は、抑制というプロセスに
より転写を阻害することによって除去することができ
る。抑制に於いては、オペレーター領域に結合して転写
を阻害するタンパク阻害剤(リプレッサータンパク)の
作用によって遺伝子がスイッチオフされている。微生物
が所望の細胞密度まで増殖した後に、リプレッサーを破
壊するか又はリプレッサーの効果を凌駕し得る誘導物質
として知られる分子を添加することによって抑制されて
いる遺伝子を活性化する。λバクテリオファージ由来の
PLプロモーターを含むプラスミド中での真核生物遺伝
子のクローニングに関しては文献中に多くの報告が見ら
れる[エッチ.ブイ.バーナード(H.V.Berna
rd)らジーン(Gene)(1979)5,59;シ
ー.デロム(C.Derom)ら、ジーン(Gene)
(1982)17,45;ディー.ゲイセン(D.Gh
eysen)ら、ジーン(Gene)(1982)1
7,55;ジェー.ヘジペス(J.Hedgpeth)
ら、モル.ジエン.ジエネット.(Mol.Gen.G
enet.)(1978)163,197;イー.レマ
ート(E.Remaut)ら、ジーン(Gene)(1
981)15,81;アール.デリンク(R.Dery
nck)ら、ネーチャー(Nature)(1980)
287,193)]。更に、1981年12月16日公
開の欧州特許出願第041,767号は、λバクテリオ
ファージ由来のPLプロモーターを含む発現ベクターを
記載している。しかしながら、これらの文献はいずれも
CIIリボソーム結合部位の使用については記載してい
ない。λバクテリオファージ由来のPLプロモーターと
CIIリボソーム結合部位とを含むベクターの使用につ
いては、エー.ビー.オッペンハイム(A.B.Opp
enheim)ら、ジェー.モル.バイオロ.(J.M
ol.Biol.)(1982)158,327並びに
エッチ.シマタケ(H.Shimatake)及びエ
ム.ローゼンベルグ(M.Rosenberg),ネー
チャー(Nature)(1981)292,128に
記載されている。これらの刊行物は、高レベルのCII
タンパクの産生について記載しているが、真核生物タン
パクの産生を包含又は記載していない。PLプロモータ
ーとCIIリボソーム結合部位を含む他のベクターも以
下の文献に記載されている。カーンティ・エム等(Co
urntey,M.,et al.),PNAS(19
84)81,669−673;ラウテンベルガー・ジェ
イ・エー等(Lautenberger,J.A.,e
t al.),遺伝子(Gene),1983,23,
75−84及びラウテンベルガー・ジェイ・エー等,サ
イエンス(1983),221,858−860。しか
しながら、これらに記載されたベクターではいずれもC
IIプロテインのアミノ末端部分を含む融合タンパク質
が産生する。1982年にシャッマン(Shatzma
n)及びローゼンバーグ(Rosenberg)は第1
4回マイアミ.ウインター.シンポジウム(Miami
Winter Symposium)にポスターを提
出した[エー.アール.シャッマン(A.R.Shat
zman)及びエム.ローゼンバーグ(M.Rosen
berg),第14回マイアミウインターシンポジウム
(Miami Winter Symposium)抄
録98頁[1982]]。この抄録には、λバクテリオ
ファージ由来のPLとNutとCIIリボソーム結合部
位とを含むベクターを使用して“真核生物”ポリペプチ
ドを細菌宿主中で細胞タンパクの5%より高い量で合成
することが開示されているが、(SV40小T(sma
ll T)抗原は実際には真核生物ポリペプチドでなく
ウイルスタンパクであるし)、細菌宿主名が示されてい
ない、使用したオペレーターが定義されていない、複製
起点(開始点)も選択可能な表現型の遺伝子も同定され
ていない等の理由によって上記の開示は実施不能であ
る。このようなベクターを使用するこの系は、このベク
ターを安定に形質転換し得るような或る種の宿主溶原菌
(host lysogen)を含むと記載されてい
る。本出願人は、国立保健協会(National I
nstitutes ofHealth),ヘルス及び
ヒューマンサービス部門(Dept.of Healt
h and Human Services),米国,
によるエム.ローゼンベルグ(M.Rosenber
g)名義で係属中の米国特許出願第457,352号の
存在を知っている。この出願の一部は国立技術情報サー
ビス(National Technical Inf
ormation Service),米国通常部門
(U.S.Dept.of Commerce)から入
手できたが、特許請求の範囲はまだ機密であり入手不能
である。本出願人は該出願の入手し得た部分について検
討し、この開示も実施不能であるとの結論を得た。即
ち、この開示によれば宿主が重要であるのに(8頁17
行)いかなる適当な宿主も同定されていない。更に該出
願はλ突然変異体の使用を基盤とするのにこの突然変異
体が特定されていない(4頁20行)。更に該出願では
宿主が溶原(lysogen)を含む(8頁18行)
が、本発明では宿主が溶原菌でない。該出願は真核生物
遺伝子、すなわちサルメタロチオネイン遺伝子のクロー
ニング及び発現に言及しているが(7頁18行)、これ
らについて詳細に説明していない。該出願ではCIIリ
ボソーム結合領域のいかなるヌクレオチドの配列も位置
も変更していないと述べられている(3頁27行)。1
983年7月15日出願の、本発明と同様に譲渡されて
いる係属中の米国特許出願第514,188号中に細菌
中に於けるポリペプチドの発現に有用な新規なベクター
について記載がある。これらのベクターは、PLOL,
抗転写終結因子Nタンパクを結合するN利用部位(Nu
tilization site),リボソーム結合部
位,ATG コドン,所望のポリペプチドをコードして
いる遺伝子を挿入する為の制限酵素部位,複製起点及び
選択可能なマーカーを含んでいる。これらのベクターに
於いて、N利用部位とリボソーム結合部位間の距離は約
300塩基対より大きい。更に、それぞれのベクターに
は、容易に置換され得ない特異的リボソーム結合部位が
含まれている。これらのベクターは様々なポリペプチド
の発現にどれも同様に用い得るということはできない。
T1T2rRNA転写終結配列が、ブロシウス・ジェイ
等(Brosius,J.,et al.)ジェイ・モ
ル・バイオル(J.Mol.Biol.)148,10
7,(1981)に記載されている。このT1T2rR
NA終結配列を原核生物遺伝子の3′末端につなぎ、該
遺伝子をプロモーターによるコントロール下で発現させ
ることが記載されている(アマン・イー等(Aman
n,E.,et al.)遺伝子(Gene)198
3,25,167;ザビュー・エム等(Zabeau,
M.,et al.)エムボ・ジャーナル(The E
MBOJournal)1982,1,1217)。欧
州特許出願第81304573.9号で1982年4月
14日に公開された欧州特許公開第049,619号に
は、安定化因子として熱誘導性リプレッサー(ther
moinducible repressor)λcI
857の使用が記載されている。このリプレッサーをプ
ラスミド上にクローニングする。リプレッサー合成を欠
陥しているプロファージλcI90に感染によって導入
する。このプロファージは32℃より低い温度ではクロ
ーン化リプレッサーによって維持される。前記プラスミ
ドを失った細胞はいずれも溶菌する。温度を38℃より
も高くすると、該リプレッサーが破壊されあるいは不活
化されて細胞が溶菌する。この安定化システムはλPL
プロモーターを含み38℃より高温でポリペプチドを発
現する本発明のベクターには用いることはできない。コ
ピー数の多い構成プラスミド(constitutiv
e high copy number plasmi
ds)に由来する複製起点は公知である。例えば、Co
l E1由来の。pOP 1Δ6複製起点は、ゲルファ
ンド・デー・エイチ等(Gelfand,D.H.,e
t al.)PNAS(1978)75,(12),5
869及びミューシング・エム等(Muesing,
M.,et al.)Cell(1981)45,23
5に記載されている。更に、コピー数の多い脱落性(r
un−away)複製プラスミド(これはコピー数の多
い構成プラスミドとは区別される)も公知である(レマ
ント・イー等(Remant,E.,et al.)遺
伝子(Gene)1983,22,103)。本発明は
様々なポリペプチドの発現を予期せぬ程高める発現ベク
ターに係わる。本発明のベクター中に異なるリボソーム
結合部位を採用することで、従来のベクターを用いて達
成されるレベルと比較して高い発現レベルの様々なポリ
ペプチドを生産することが可能になる。加えて、従来の
ベクターと全く同じリボソーム結合部位を用いても同じ
ポリペプチドを高い発現レベルで生産することが可能で
ある。更に、T1T2rRNA終結配列を発現させたい
ポリペプチドがコードされている遺伝子の3′末端に結
げることによって、細菌宿主によって生産される総ポリ
ペプチドに比べてその所望のポリペプチドの量を増やす
ことが可能である。重要なことに、T1T2rRNA転
写終結配列が存在すると、コピー数の多い構成プラスミ
ド由来の複製起点を、数多くのコピーを構成的(con
stitutive)に複製する能力を失なうことなく
発現ベクター中に組み込むことが可能になる。pBR
322又はコピー数の多い脱落性(runaway)プ
ラスミド以外のコピー数の多い非構成プラスミド(no
n constitutive high copy
number plasmids)由来の複製起点はこ
れをベクター中に組み込んだとき細胞当りほんの限られ
た数の、代表的には細胞当り40コピーより少ない数を
生産することができる。コピー数の多い構成プラスミド
由来の複製起点に代えることによって、ポリペプチドの
発現レベルが予期せぬ程高くなることが判明した。本発
明の好適なベクターは細菌宿主内で安定化されており、
ベクター及びポリペプチドをコードした遺伝子を含むプ
ラスミドを含有する細菌が増殖する際にそのプラスミド
は失なわれることがない。こうして、プラスミドの不安
定性に帰因するところの収率低下が克服される。更に、
このような好適ベクターを用いることで選択マーカーと
して抗生物質抵抗性を用いる必要がなく、従ってポリペ
プチドを低コストで生産することが可能になる。本発明
の新規な発現ベクターを用いて生産され得る幾つかのポ
リペプチドのうちのあるものはスーパーオキシドジスム
ターゼ(SOD)及びそのアナログ(類似体)である。
本発明は特に、従来のベクターと全く同じリボソーム結
合部位を用いても、また本明細書中に記載されている前
記RBSと異なるリボソーム結合部位を用いても、スー
パーオキシドジスムターゼ及びそのアナログの予期せぬ
程の高められた発現を催す発現プラスミドに係わる。本
発明はまた、前記プラスミドを利用して細菌内でSOD
及びそのアナログの高効率に産生する方法に係わる。ス
ーパーオキシドジスムターゼ(SOD)及び酸素フリー
ラジカル(O2・−)の現象は1968年にマッコード
及びフリードヴィッヒによって発見された(マッコード
・ジェイ・エム(McCord,J.M.)及びフリー
ドヴィッヒ・アイ(Fridovich,I.)ジェイ
・バイオル・ケミ(J.Biol.Chem.)24
4,6049−6055(1969))。スーパーオキ
シドラジカル及び他の高反応性酸素種は全ての呼吸細胞
に於いて酸化的代謝の副生成物として産生し、広範囲の
細胞成分及び高分子に多大の損傷を与えることが判った
(フリードヴィッヒ・アイ(Fridovich,
I.),アドバンス・イン・イン・オーガニック・バイ
オケミストリー,アイクホーン・ジー・エル(Eich
horn,G.L.)版及びマルチリ・エル・ジー(M
arzilli,L.G.),エルセヴィア/北オラン
ダ,ニューヨーク,67−90頁(1970)並びにフ
リーマン・ビー・エー(Freeman,B.A.)及
びクラポ・ジェイ・デー(Crapo,J,D,)ラボ
ラトリー・インベスティゲーション,47,412−4
26(1982)参照)。スーパーオキシドジスムター
ゼとして知られる金属プロテイン類は酸化−還元反応2
O2 −+2H+→H2O2+O2を触媒し、酸素毒性に
対する防御機構を形成する。タンパク分子中に異なる金
属を含有する3種類のSODが知られている。即ち、
鉄,マンガン及び銅と亜鉛の両者を含有するものであ
る。これらの酵素は全て同じ反応を究極的な効率で触媒
し、金属が活性部位の触媒因子であるような類似の機構
で作用する。これらの酵素は幾つかの進化論上の群に分
類される。Mn−SOD及びFe−SODは主に原核細
胞中に見られ、一方CuZn−SODは事実上全ての真
核生物中に認められる(シュタインマン・エイチ・エム
(Steinman,H.M)スーパーオキシドジスム
ターゼ,オバーレイ・エル・エム(Oberley,
L.M.)版,シーアールシープレス,フロリダ,11
−68頁(1982))。ヒトCu/Zn SOD−1
は同一の非共有結合サブユニットからなる金属−蛋白質
二量体であり、各サブユニットは銅1原子と亜鉛1原子
とを含有し、16000ダルトンの分子量を持つ(ハー
ツ,ジェー,ダブリュ(Hartz,J.W.)及びド
イッチェ,エイチ.エフ.(Deutsch,H.
F.)、ジェー.バイオール.ケム.(J.Biol.
Chem.)247,7043−7050(197
2))。各サブユニットは配列が確定された153個の
アミノ酸からなる(ジャブッシュ,ジェー.アール.
(Jabusch,J.R.)、ファーブ,ディー.エ
ル.(Farb,D.L.)、ケルシェンスタイナー,
ディー.エー.(Kerschensteiner,
D.A.)及びドイッチェ,エイチ.エフ.(Deut
sch,H.F.)、バイオケミストリー(Bioch
emistry)19:2310〜2316(198
0)及びバーラ,ディ.(Barra,D.),マルチ
ニ,エフ.(Martini,F.)、バニスター,ジ
ェー.ブイ.(Bannister,J.V.)、シニ
ーナ,エム.ダブリュ.(Schinina,M.
W.)、ロチリオ,ダブリュー.エイチ.(Rotil
io,W.H.)、バニスター,ダブリュー.エイチ.
(Bannister,W.H.)及びボッサ,エフ.
(Bossa,F)、FEBSレターズ(FEBS L
etters)120,53−56(1980))。更
に、近年、ヒトSOD−1の全コード領域を含有するc
DNAクローンが単離されその配列が決定された(リー
マン−フルウィッツ,ジェー.(Lieman−Hur
witz,J.)、ダフニ,エヌ.(Dafni,
N.)、ラヴィエ,ブイ.(Lavie,V.)及びグ
ローナー,ワイ.(Groner,Y.)、プロク.ナ
ットル.アカデ.サイ.USA(Proc.Natl.
Acad.Sci.USA)79,2808−2811
(1982)及びシャーマン,エル.(Sherma
n,L.),ダフニ,エヌ.(Dafni,N.)、ラ
イマン−フルヴィッツ,ジェー.(Leiman−Hu
rwitz,J.)及びグローナー,ワイ.(Gron
er,Y.)、プロク.ナットル.アカデ.サイ.US
A(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)
80,5465−5469(1983))。産生したヒ
トCu−Zn SODアナログはそのアミノ末端アラニ
ンがアセチル化されていない点で天然のヒトCu−Zn
SODと異なる。天然のヒトSODはアミノ末端アラ
ニンがアセチル化されている(ハーツ,ジェー,ダブリ
ュー.(Hartz,J.W.)及びドイッチェ,エイ
チ.エフ.(Deutsch,H.F.)、ジェー.バ
イオール.ケム.(J.Biol.Chem.)(19
72)247,7043−7050;ジャブッシュ,ジ
ェー.アール.(Jabusch,J.R.)ら、バイ
オケミストリー(Biochemistry)(198
0)19,2310−2316;バーラ(Barra)
ら、FEBSレターズ(FEBS Letters)
(1980)120,53及びオバーリー,エル.ダブ
リュ.(Oberly,L.W.)、スーパーオキシド
ジスムターゼ(Superoxide Dismuta
se)、第1巻、CRCプレス(CRC Pres
s)、フロリダ(Florida)、(1982)、
(32頁−33頁)。ウシSODと同様に天然のヒトS
ODはグリコシル化されていると思われる(ヒューバ
ー,ダブリュ.(Huber,W.)、米国特許第3,
579,495号明細書、1971年5月18日発
行)。大腸菌(Escherichia coli)が
自分で産生した蛋白質をグリコシル化しないように、細
菌が産生したヒトSODはほとんどグリコシル化されな
い。細菌が産生したSODアナログのアミノ酸配列は成
熟ヒトSODと同じであるが、N−末端にメチオニン残
基を持たない。本発明はヒトCu/Zn SODの酵素
学的に活性なアナログを細菌内で産生し精製する方法を
提供する。スーパーオキシドジスムターゼはその薬理学
的特性から非常に興味深い。ウシ由来の天然にみられる
スーパーオキシドジスムターゼ(オルゴテイン,org
otein)は抗炎症作用を持つことが知られており、
欧州、例えば***で炎症の治療用に最近市販されてい
る。米国を含む多くの国でも炎症治療用特に馬の腱の炎
症の治療用に動物薬として販売されている。又、科学論
文はSODが広範囲に亘り臨床的に使用できるであろう
ことを示唆している。これには腫瘍形成や腫瘍増大を防
止することや抗癌剤の細胞毒作用や心臓毒作用を軽減す
ること(オバーレイ,エル.ダブリュ.(Oberle
y,L.W.)及びビューエトナー,ジー.アール.
(Buettner,G.R.)、キャンサー リサー
チ(Cancer Research)39,1141
−1149(1979);虚血組織の保護(マクコー
ド,ジェー.エム.(McCord,J.M.)及びロ
イ,アール.エス.(Roy,R.S.)、カン.ジェ
ー.フィジオール.ファーム.(Can.J.Phys
iol.Pharm.)60,1346−1352(1
982));及び***の保護(アルバーレッツ,ジェ
ー.ジー.(Alvarez,J.G.)及びストーレ
イ,ビー.ティー.(Storey,B.T.)、バイ
オール.リプロダ.(Biol.Reprod.)2
8,1129−1136(1983))が包含される。
更に、加令過程に対するSODの作用の研究も非常に興
味深い(タルマソッフ,ジェー.エム.(Talmas
off,J.M.)、オノ,ディー.(Ono,T.)
及びカトラー,アール.ジー.(Cutler,R.
G.)、プロク.ナットル.アカデ.サイ.USA(P
roc.Natl.Acad.Sci.USA)77,
2777−2782(1980))。本発明は、H+の
存在下でのスーパーオキシドラジカルの過酸化水素と分
子状酸素への還元を触媒するために組換えヒトスーパー
オキシドジスムターゼ(hSOD)またはそのアナログ
を使用することにも係る。特に、本発明は虚血(isc
hemia)に伴う再灌流(reperfusion)
時の損傷を減少させ、切除した摘出臓器の生存期間(s
urvival period)を延長するためのhS
ODアナログの使用に関する。本発明は臓器移植に伴う
再灌流時の損傷や脊髄虚血(spinal cord
ischemia)を減少させるためにhSOD又はそ
のアナログを使用することにも係る。発明の要約 本発明は、非耐熱性(thermolabile)リプ
レッサーC1を含有する適切な細菌宿主細胞例えば大腸
菌(Escherichia coli)に導入する
と、この宿主細胞が、宿主細胞の温度がリプレッサー不
活化温度まで上昇した際、前記ベクターに挿入されてい
る所望遺伝子を発現し得かつ前記遺伝子がコードしてい
るポリペプチドを産生し得るようになる改良発現ベクタ
ーに係り、このベクターは、5′から3′に向かって、
λバクテリオファージ由来のプロモーター−オペレータ
ーPLOLを含有するDNA配列と、抗転写終結因子N
タンパク質を結合するためのN利用部位と、この後に続
くリボソーム結合部位を含有するDNA配列の置換(r
eplacement)を可能にする第1の制限酵素部
位と、所望遺伝子のmRNAが宿主細胞内のリボソーム
に結合し得るようにするためのリボソーム結合部位を含
有するDNA配列と、ATG開始コドン、または所望遺
伝子をベクター内に挿入するとATG開始コドンに変換
されるDNA配列と、ATG開始コドンと位相を合わせ
て(in phase)所望遺伝子をベクター内に挿入
するための第2の制限酵素部位と、をこの順に含む二本
鎖DNA分子を含んでおり、さらに、宿主細胞中で自律
複製し得る細菌プラスミド由来複製起点を含有するDN
A配列と、このベクターが宿主細胞中に存在するときに
現れる選択可能または同定可能な表現形質に関連する遺
伝子を含有するDNA配列ならびにcI434という断
片(このような断片はcI434リプレッサータンパク
質に対する遺伝子とこれに関連したプロモーター−オペ
レーター配列とを含む)を含有するDNA配列から成る
群から選択される選択手段と、を含んでおり、PLOL
プロモーターオペレーター配列の3′末端とN利用部位
の5′末端との間の距離が約80塩基対未満であり、N
利用部位の3′末端とリボソーム結合部位の5′末端と
の間の距離が約300塩基対未満である。選択手段がp
JH200及びpRO211の如き表現形質に関連する
遺伝子であるベクターが好ましい。本発明ベクターは第
2の制限酵素部位の3′にT1T2rRNA配列を含有
するDNAを更に含んでいてもよい。T1T2rRNA
転写終結配列は第2の制限酵素部位の3′末端から約1
00塩基対未満であることが望ましく、約20塩基対未
満であることがより望ましい。T1T2rRNA転写終
結配列を含んでいる現状の好ましいベクターはその選択
手段が表現形質に関連する遺伝子であるp579であ
る。cI434フラグメント(断片)を含有する本発明
ベクター中で、cI434フラグメントはT1T2rR
NA終結配列の3′にあることが望ましい。ベクターが
表現形質に関連する遺伝子とcI434フラグメントと
の両者を含有していることが望ましい。両方の遺伝子を
含有している現状で好ましいベクターはCla I部位
にcI434フラグメントをクローニングしたp579
である。本発明ベクターは、宿主細胞中で自律複製し
得、少なくとも400個のベクターの構成コピーを生成
し得る細菌のプラスミド由来の複製起点をも含有してい
てもよい。現状で好ましい複製起点はcol E1プラ
スミド由来のpOP 1Δ6である。T1T2rRNA
終結配列、宿主細胞内でベクターの構成コピーを少なく
とも400個生成し得る複製起点を含み且つ表現形質遺
伝子とcI434フラグメントの遺伝子との両者を含有
しているベクターが好ましい。所望のポリペプチド例え
ばウシ、ブタ、ニワトリ又はヒトの成長ホルモンの如き
成長ホルモン、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、ヒ
トアポリポプロテインE又はこれらのアナログをコード
するcDNAのような遺伝子をベクターの第2の制限酵
素部位に挿入してプラスミドを作ってもよい。このプラ
スミドはその後、遺伝子が発現され所望のポリペプチド
を生成することのできる適切な宿主に導入することがで
きる。現状で好ましいプラスミドは、bGH用には、p
RO 12,pSAL5200−6,pHG44,pS
AL5600−1,p7200−22,pHG50,p
8300−10A,pSAL−170/10 pSAL
−210/4及びp9200;ヒトスーパーオキシドジ
スムターゼ用には、pSODα2,pSODβ1,pS
ODβ1T11,pSODβ1−BA2及びpSODβ
1TT−1;pGH用には、p3008及びp300
9;cGH用には、p5002及びp5003;hGH
用には、pTV300;ヒトアポリポプロテインE用に
は、pTV−188,pSAL160−5,pTV−1
70,pTV−190,pTV−194,pTV−21
4及びpTVR279−8である。好ましい宿主は大腸
菌(Escherichia coli)A1637,
A1645,A2602,A2097及びA1563並
びにプラスミドがcI434フラグメントを含有してい
るときには、A1645(λi434cI−mini
Tn 10)を包含する。好ましい原栄養性宿主(pr
ototrophic hosts)は大腸菌(E.
coli)A4200,A4255及びA4346を包
含する。好ましい溶解性宿主(lytic host
s)は大腸菌(E. coli)A4048を包含す
る。得られた宿主ベクター系はポリペプチドの製造に用
いることができる。プラスミドを含有する宿主細胞をポ
リペプチドを生成しうる適切な条件下で増殖させ、得ら
れたポリペプチドを回収する。宿主ベクター系を用い
て、ヒトアポリポプロテインE、ウシ成長ホルモン、ブ
タ成長ホルモン、ニワトリ成長ホルモン、ヒト成長ホル
モン及びヒトスーパーオキシドジスムターゼのアナログ
が製造される。このように得られたSODアナログはS
ODアナログと適当なキャリアー(担体,carrie
r)とを含有する動物薬及び医薬組成物に配合される。
これらのスーパーオキシドジスムターゼアナログは次の
反応:2O2 −+2H+→H2O2+O2を触媒するの
に用いられる。より特定的には、このようなアナログは
虚血又は臓器移植に伴う再灌流による損傷を減少させ、
心筋梗塞の大きさを減少させ、切除した摘出臓器の生存
時間(有効保存期間)を増加させるために用いられた。
これらのアナログは脊髄損傷を減少させるために又気管
支肺異形成(bronchial pulmonary
dysplasia)に用いることもできる。酵素学的
に活性な真核生物のスーパーオキシドジスムターゼ又は
そのアナログを細菌細胞中で生成する方法も発見され
た。細菌細胞はスーパーオキシドジスムターゼ又はアナ
ログをコードするDNA配列を含有しており、このDN
A配列を発現させることができる。この方法は、適切な
条件下で、培地中の細胞が利用しうるCu++濃度が約
2ppm以上となるような量のCu++を添加した生成
(産生)培地中に細菌細胞を維持することからなる。こ
の方法の好ましい具体例では、細菌細胞はヒトスーパー
オキシドジスムターゼのアナログをコードするDNA配
列を含有するプラスミドを持つ大腸菌(Escheri
chia coli)細胞である。本発明は又、本発明
方法により細菌細胞内で生成された、精製された酵素学
的に活性な真核生物のスーパーオキシドジスムターゼ又
はそのアナログを回収する方法にも係る。この方法は、
成長(増殖)培地から細菌細胞を単離し、pHが約7.
0〜約8.0の適切な溶液中に細菌細胞を懸濁すること
からなる。懸濁した細菌細胞の細胞壁を破砕し、次に、
得られた均質な溶液を適切な条件下で音波処理する。音
波処理した溶液を適切な条件下で遠心する。上清部を移
して、約2時間約65℃に加熱する。次に、上清部を冷
却し、適切な条件下で遠心して上清部に清澄な蛋白質溶
液を得る。得られた上清部を適切な容量まで濃縮し、p
H約7.0〜約8.0で平衡化した適切なアニオン交換
体でのイオン交換クロマトグラフィーにかける。スーパ
ーオキシドジスムターゼ又はアナログを含有する得られ
た溶液を集めて適切な容量まで濃縮し、pH約7.0〜
約8.0の緩衝溶液に対して透析する。この濃縮した緩
衝溶液をpH約7.0〜約8.0で平衡化した適切なア
ニオン交換体でのイオン交換クロマトグラフィーにかけ
る。アニオン交換体−蛋白質複合体を適切な塩勾配にか
ける。スーパーオキシドジスムターゼまたはアナログを
含有する画分を集めて濃縮し、蒸留水に対して透析す
る。適当なバッファーでこの溶液のpHを約4.0〜約
5.0に調整する。次に、緩衝化した溶液をpH約4.
0〜約5.0で平衡化した適切なカチオン交換体でのイ
オン交換クロマトグラフィーにかける。蛋白質−カチオ
ン交換体複合体を適切な塩勾配にかけ、精製されたスー
パーオキシドジスムターゼ又はアナログを含有する得ら
れた画分を集める。本発明はこれらの方法で生成され
た、精製された酵素学的に活性な組換え体の真核性スー
パーオキシドジスムターゼ又はそのアナログにも係る。図面の説明 第1図乃至第31図に示した各プラスミドの制限地図は
各プラスミドに存在する全ての制限部位を同定するもの
ではない。制限部位が1つの図には示されているが、も
う1つの図には示されていない場合もある。しかしなが
ら、本発明を完全に理解するために必要な制限部位は全
て示している。第1図:pAL 500の構築 bGH cDNAを含むプラスミドD4(ATCC N
o.31826)をHae IIで消化した。得られた
1600塩基対の大フラグメントを精製し、S1エキソ
ヌクレアーゼで37℃で5分間消化した。得られたフラ
グメントの末端に配列: の合成Eco RIリンカーを連結した。連結混合物を
Eco RIで開裂し、Eco RIで開裂してあるp
BR 322(ATCC No.37017)中に挿入
した。Eco RIで開裂すると5′端に配列: を有する1200塩基対フラグメントを遊離するクロー
ンpALRIが得られた。この配列が生成するというこ
とは、pALRIが天然bGHの1番目の残基(フェニ
ルアラニン)をコードするTTCコドンを含むEco
RI制限部位を含有することを示している。pALRI
をPst Iで部分開裂した。消化物をDNAポリメラ
ーゼIの大フラグメント(クレノウ)で処理し、配列: のHind IIIリンカーを連結した。連結混合物を
Eco RIとHindIIIとで開裂した。bGH
cDNAを含むフラグメントを単離し、EcoRI及び
Hind IIIの制限部位間でpBR 322にサブ
クローニングしてpAL 500(ATCC No.3
9782)を得た。第2図:pRO 211及びpRO 12の構築 プラスミドpJH 200(ATCC No.3978
3)をNde Iで部分消化し、末端を充填(fill
in)するためにDNAポリメラーゼI(クレノウ)
で処理した。得られた末端を再び連結させて発現ベクタ
ーpRO 211を形成した。発現ベクターpRO 2
11をNde I及びHind IIIで消化した。大
フラグメントを単離し、pAL 500(ATCC N
o.39782)から単離したNde I−Hind
III bGHフラグメントと連結してpRO 12を
得た。(Nde I−Hind IIIフラグメントは
pAL500をEco RIで消化し、消化産物の末端
に配列: の合成リンカーを連結させて生成した。連結混合物をN
de I及びHindIIIで消化し、得られたNde
I−Hind III bGHフラグメントを単離し
た。)第3図:pSAL5200−6の構築 pRO 12(第2図)をPvu IIで部分消化し、
次いでNde Iで消化することにより72塩基対フラ
グメントを除去した。消化したpRO 12に真正(a
uthentic)bGHのN−末端の最初の24個の
アミノ酸をコードする合成DNAフラグメントを連結し
た。合成DNAフラグメントは配列:
【化1】
の2つのリン酸化した合成一本鎖DNAをアニールして
構築した。アニールしたフラグメントを4つのデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸全ての存在下にDNAポリメ
ラーゼI(クレノウ)で処理して、完全長(full
length)の二本鎖DNAを形成した。フラグメン
トをPvu IIとNde Iとで消化した後にpRO
12と連結させてpSAL5200−6を形成した。第4図:p3008の構築 p3008(ATCC No.39804)は、プラス
ミドppGH−NdeI/RIのNde I消化物から
単離したpGHフラグメントとNde Iで消化したp
RO 211(第2図)とを連結して構築した。ppG
H−Nde I/RIは完全長のpGH cDNAを含
有しており、この両末端には合成リンカーによってNd
e I部位が付加されている。第5図:p5002の構築 二量体化した合成リンカーと、プラスミドpcGH−N
de I/RIのNde I及びBan II消化物か
ら単離した2つのcGHフラグメントとを3点連結(t
ripartite Ligation)してp500
2を構築した。連結混合物をNde Iで消化し、次い
で、予めNde Iで制限してある発現ベクターpRO
211(第2図)と連結した。プラスミドp5002
を含むコロニーを単離した。 合成リンカーは配列:
構築した。アニールしたフラグメントを4つのデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸全ての存在下にDNAポリメ
ラーゼI(クレノウ)で処理して、完全長(full
length)の二本鎖DNAを形成した。フラグメン
トをPvu IIとNde Iとで消化した後にpRO
12と連結させてpSAL5200−6を形成した。第4図:p3008の構築 p3008(ATCC No.39804)は、プラス
ミドppGH−NdeI/RIのNde I消化物から
単離したpGHフラグメントとNde Iで消化したp
RO 211(第2図)とを連結して構築した。ppG
H−Nde I/RIは完全長のpGH cDNAを含
有しており、この両末端には合成リンカーによってNd
e I部位が付加されている。第5図:p5002の構築 二量体化した合成リンカーと、プラスミドpcGH−N
de I/RIのNde I及びBan II消化物か
ら単離した2つのcGHフラグメントとを3点連結(t
ripartite Ligation)してp500
2を構築した。連結混合物をNde Iで消化し、次い
で、予めNde Iで制限してある発現ベクターpRO
211(第2図)と連結した。プラスミドp5002
を含むコロニーを単離した。 合成リンカーは配列:
【化2】
を有する2つの一本鎖合成DNAから構築した。連結前
にリンカーをリン酸化した。このリンカーは真正cGH
のN−末端の初めの18個のアミノ酸をコードする。プ
ラスミドpcGH−Nde I/RIは完全長cGH
cDNAを含有し、その5′端はEco RI制限部位
であり、3′端はNde I制限部位である。これら制
限部位は合成リンカーを用いて付加した。第6図:pHG 44及びpHG 50の構築 pRO 12(第2図)をHind IIIで消化し
た。アガロースゲルで線状DNA(III型)を精製
し、rRNAオペロン転写終結配列T1T2を含有する
約1200塩基対のHind III−Hind II
Iフラグメントに連結した。T1T 2Hind III
−Hind IIIフラグメントは、Hind III
で消化してあるプラスミドpPS 1(ATCC N
o.39807)から単離した。得られたプラスミドp
HG 44(ATCC No.39806)は組換え体
(rec)bGH配列の3′端にT1T2配列を含有し
ている。λcI434リプレッサー配列を含有するプラ
スミドpSK 434(ATCC No.39784)
をHpa IIで消化した。λcI 434Hpa II
−Hpa IIフラグメントを単離し、Cla Iで消
化してあるpHG 44と連結した。得られたプラスミ
ドpHG 50(ATCC No.39805)はT1
T2転写終結配列とλcI434リプレッサー配列とを
含有する。第7図:p8300−10Aの構築 N−末端にメチオニンを有する天然のフェニルアラニン
型bGH(met−phe bGH)のアナログを発現
するプラスミドp8300−10A(ATCCNo.3
9785)を次のように製造した。プラスミドp720
0−22はpJH200(ATCC No.3978
3)由来のλPLプロモーターとリボソーム結合部位
と、met−phe bGHをコードするDNAと、T
1T2rRNA終結配列とを含有している。λPLプロ
モーター、CIIリボソーム結合部位、met−phe
bGH遺伝子及びT1T2転写終結配列を有するCl
aI−Cla IフラグメントをプラスミドpOP 1
Δ6の唯一(単一)のCla I部位に挿入してp83
00−10Aを形成した。このプラスミドpOP1Δ6
は高いコピー数を有する構成プラスミド(consti
tutive high copy number p
lasmid)である。第8図:pSAL−130/5及びpSAL−170/
10の構築 met−asp−gln bGH蛋白質を発現するプラ
スミドpHG 44(ATCC No.39806)を
Nde I及びHind IIIで消化した。得られた
Nde I及びHind III bGHフラグメント
を単離し、p8300−10A(ATCC No.39
785)をNde IとHind IIIの両者で部分
消化して調製したフラグメントに連結した。このような
連結により、met−phe bGH遺伝子フラグメン
トをmet−asp−gln bGH遺伝子フラグメン
トに置換する。このようにして得たプラスミドpSAL
−130/5はrec bGHを発現する。pBR 3
22プラスミド(ATCCNo.37017)のTet
R遺伝子を含有するEco RI−Ava Iフラグメ
ントをDNAポリメラーゼI(クレノウ)で処理し、予
めBam HIで消化しDNAポリメラーゼI(クレノ
ウ)で充填したpSAL−130/5に挿入することに
よりpSAL−170/10を得た。第9図:pSAL−210/4の構築 pSAL−170/10をCla Iで部分消化するこ
とにより線状DNA(III型)を調製した。これをア
ガロースゲルで精製し、プラスミドpSK 434(A
TCC No.39784)のHpa II消化物から
単離したHpaII−Hpa II cI434遺伝子
フラグメントに連結した。第10図:pSAL5600−1の構築 pSAL5200−6(第3図)をHind IIIで
消化した。アガロースゲルで線状DNA(III型)を
精製し、rRNAオペロン転写終結配列T1T2を含有
する約1200塩基対のHind III−Hind
IIIフラグメントに連結した。このT1T 2Hind
III−Hind IIIフラグメントはHind
IIIで消化してあるプラスミドpPS 1(ATCC
No.39807)から単離した。得られたプラスミ
ドpSAL5600−1はmet−asp−glnbG
H配列の3′端にT1T2配列を含有する。第11図:p3009の構築 プラスミドp3008(ATCC No.39804)
(第5図)からNdeI−Nde I pGHフラグメ
ントを単離した。予めNde Iで消化した発現ベクタ
ーp579(第19図)の唯一のNde I部位にこの
フラグメントを挿入した。得られたプラスミドp300
9はN−末端に付加したメチオニン残基を有する天然の
ブタ成長ホルモン蛋白質のアナログを発現する。第12図:p5003の構築 プラスミドp5002からNde I−Nde I c
GHフラグメントを単離した。予めNde Iで消化し
た発現ベクターp579(第19図)の唯一のNde
I部位にこのフラグメントを挿入した。得られたプラス
ミドp5003(ATCC No.39792)はN−
末端にメチオニン残基を付加した天然のニワトリ成長ホ
ルモン蛋白質のアナログを発現する。第13図:pSODα2の構築 pJH 200(ATCC No.39783)発現ベ
クターをNde Iで消化した。λPLプロモーターと
CIIリボソーム結合部位とを含有する550塩基対N
de Iフラグメントを単離し、予めNde Iで消化
したプラスミドpSOD NH−10の唯一のNde
I部位に挿入した。(プラスミドpSOD NH−10
はヒトSODのcDNAクローン由来のものである[リ
ーマン−フルヴィッツ,ジェー.(Lieman−Hu
rwitz,J.)ら、PNAS(1982)79:2
808]。得られたプラスミドpSOD NH−550
をAlu Iで消化した。(関連Alu I部位のみを
図示する。)λPLプロモーター及びSOD遺伝子を含
有する大Alu Iフラグメントを単離した。Bam
HIリンカーを結合し、得られたフラグメントをBam
HIで消化した。Bam HIで消化産物をpBRM
(ATCC No.37283)の唯一のBam HI
部位に挿入してpSODα2(ATCC No.397
86)を形成した。第14図:pSODα13及びpSODβ1の構築 プラスミドpSODα2(ATCC No.3978
6)をEco RIで部分消化し、得られた線状DNA
をアガロースゲルにより単離した。精製DNAをDNA
ポリメラーゼI(クレノウ)で充填し、再び連結した。
得られたクローンpSODα13はリボソーム結合部位
の5′端にEco RI部位を1個有する。Eco R
I及びAle Iで消化してあるプラスミドpBLA1
1(ATCC No.39788)からβ−ラクタマー
ゼプロモーター及びリボソーム結合部位を含有するフラ
グメントを単離した。200塩基対(bp)フラグメン
トをpSODα13から単離した大きなフラグメントに
連結した。このpSODα13はNde Iで消化し、
DNAポリメラーゼI(Klenow)で充填し、次い
でEco RIで消化してあった。得られたプラスミド
pSODβ1はβ−ラクタマーゼ遺伝子のリボソーム結
合部位とλPLプロモーターとを含有している。第15図:pSODβ1T11の構築 プラスミドpBR 322(ATCC No.3701
7)をEco RIとAva Iで消化した。得られた
DNAをDNAポリメラーゼI(クレノウ)で充填し
た。その後、TetR遺伝子フラグメントを単離し、p
SODβ1(第14図)プラスミドから単離した大フラ
グメントに連結した。このpSODβ1プラスミドは予
め、Pst Iで消化した後Bam HIで部分消化
し、次いでDNAポリメラーゼI(クレノウ)て充填し
ておいた。得られたプラスミドpSODβ1T11はT
etR遣伝子を含有している。第16図:pSODβ1TT−1の構築 Hind IIIで消化し、DNAポリメラーゼI(ク
レノウ)で充填してあるプラスミドpPSI(ATCC
No.39807)からrRNAT1T2転写終結フ
ラグメントを単離した。このフラグメントを、Bam
HIで部分消化しDNAポリメラーゼI(クレノウ)で
充填してあるプラスミドpSODβ1T11(第15
図)に連結した。第17図:pSODβ1−BA2の構築 天然のβ−ラクタマーゼリボソーム結合部位の配列に類
似の配列:
にリンカーをリン酸化した。このリンカーは真正cGH
のN−末端の初めの18個のアミノ酸をコードする。プ
ラスミドpcGH−Nde I/RIは完全長cGH
cDNAを含有し、その5′端はEco RI制限部位
であり、3′端はNde I制限部位である。これら制
限部位は合成リンカーを用いて付加した。第6図:pHG 44及びpHG 50の構築 pRO 12(第2図)をHind IIIで消化し
た。アガロースゲルで線状DNA(III型)を精製
し、rRNAオペロン転写終結配列T1T2を含有する
約1200塩基対のHind III−Hind II
Iフラグメントに連結した。T1T 2Hind III
−Hind IIIフラグメントは、Hind III
で消化してあるプラスミドpPS 1(ATCC N
o.39807)から単離した。得られたプラスミドp
HG 44(ATCC No.39806)は組換え体
(rec)bGH配列の3′端にT1T2配列を含有し
ている。λcI434リプレッサー配列を含有するプラ
スミドpSK 434(ATCC No.39784)
をHpa IIで消化した。λcI 434Hpa II
−Hpa IIフラグメントを単離し、Cla Iで消
化してあるpHG 44と連結した。得られたプラスミ
ドpHG 50(ATCC No.39805)はT1
T2転写終結配列とλcI434リプレッサー配列とを
含有する。第7図:p8300−10Aの構築 N−末端にメチオニンを有する天然のフェニルアラニン
型bGH(met−phe bGH)のアナログを発現
するプラスミドp8300−10A(ATCCNo.3
9785)を次のように製造した。プラスミドp720
0−22はpJH200(ATCC No.3978
3)由来のλPLプロモーターとリボソーム結合部位
と、met−phe bGHをコードするDNAと、T
1T2rRNA終結配列とを含有している。λPLプロ
モーター、CIIリボソーム結合部位、met−phe
bGH遺伝子及びT1T2転写終結配列を有するCl
aI−Cla IフラグメントをプラスミドpOP 1
Δ6の唯一(単一)のCla I部位に挿入してp83
00−10Aを形成した。このプラスミドpOP1Δ6
は高いコピー数を有する構成プラスミド(consti
tutive high copy number p
lasmid)である。第8図:pSAL−130/5及びpSAL−170/
10の構築 met−asp−gln bGH蛋白質を発現するプラ
スミドpHG 44(ATCC No.39806)を
Nde I及びHind IIIで消化した。得られた
Nde I及びHind III bGHフラグメント
を単離し、p8300−10A(ATCC No.39
785)をNde IとHind IIIの両者で部分
消化して調製したフラグメントに連結した。このような
連結により、met−phe bGH遺伝子フラグメン
トをmet−asp−gln bGH遺伝子フラグメン
トに置換する。このようにして得たプラスミドpSAL
−130/5はrec bGHを発現する。pBR 3
22プラスミド(ATCCNo.37017)のTet
R遺伝子を含有するEco RI−Ava Iフラグメ
ントをDNAポリメラーゼI(クレノウ)で処理し、予
めBam HIで消化しDNAポリメラーゼI(クレノ
ウ)で充填したpSAL−130/5に挿入することに
よりpSAL−170/10を得た。第9図:pSAL−210/4の構築 pSAL−170/10をCla Iで部分消化するこ
とにより線状DNA(III型)を調製した。これをア
ガロースゲルで精製し、プラスミドpSK 434(A
TCC No.39784)のHpa II消化物から
単離したHpaII−Hpa II cI434遺伝子
フラグメントに連結した。第10図:pSAL5600−1の構築 pSAL5200−6(第3図)をHind IIIで
消化した。アガロースゲルで線状DNA(III型)を
精製し、rRNAオペロン転写終結配列T1T2を含有
する約1200塩基対のHind III−Hind
IIIフラグメントに連結した。このT1T 2Hind
III−Hind IIIフラグメントはHind
IIIで消化してあるプラスミドpPS 1(ATCC
No.39807)から単離した。得られたプラスミ
ドpSAL5600−1はmet−asp−glnbG
H配列の3′端にT1T2配列を含有する。第11図:p3009の構築 プラスミドp3008(ATCC No.39804)
(第5図)からNdeI−Nde I pGHフラグメ
ントを単離した。予めNde Iで消化した発現ベクタ
ーp579(第19図)の唯一のNde I部位にこの
フラグメントを挿入した。得られたプラスミドp300
9はN−末端に付加したメチオニン残基を有する天然の
ブタ成長ホルモン蛋白質のアナログを発現する。第12図:p5003の構築 プラスミドp5002からNde I−Nde I c
GHフラグメントを単離した。予めNde Iで消化し
た発現ベクターp579(第19図)の唯一のNde
I部位にこのフラグメントを挿入した。得られたプラス
ミドp5003(ATCC No.39792)はN−
末端にメチオニン残基を付加した天然のニワトリ成長ホ
ルモン蛋白質のアナログを発現する。第13図:pSODα2の構築 pJH 200(ATCC No.39783)発現ベ
クターをNde Iで消化した。λPLプロモーターと
CIIリボソーム結合部位とを含有する550塩基対N
de Iフラグメントを単離し、予めNde Iで消化
したプラスミドpSOD NH−10の唯一のNde
I部位に挿入した。(プラスミドpSOD NH−10
はヒトSODのcDNAクローン由来のものである[リ
ーマン−フルヴィッツ,ジェー.(Lieman−Hu
rwitz,J.)ら、PNAS(1982)79:2
808]。得られたプラスミドpSOD NH−550
をAlu Iで消化した。(関連Alu I部位のみを
図示する。)λPLプロモーター及びSOD遺伝子を含
有する大Alu Iフラグメントを単離した。Bam
HIリンカーを結合し、得られたフラグメントをBam
HIで消化した。Bam HIで消化産物をpBRM
(ATCC No.37283)の唯一のBam HI
部位に挿入してpSODα2(ATCC No.397
86)を形成した。第14図:pSODα13及びpSODβ1の構築 プラスミドpSODα2(ATCC No.3978
6)をEco RIで部分消化し、得られた線状DNA
をアガロースゲルにより単離した。精製DNAをDNA
ポリメラーゼI(クレノウ)で充填し、再び連結した。
得られたクローンpSODα13はリボソーム結合部位
の5′端にEco RI部位を1個有する。Eco R
I及びAle Iで消化してあるプラスミドpBLA1
1(ATCC No.39788)からβ−ラクタマー
ゼプロモーター及びリボソーム結合部位を含有するフラ
グメントを単離した。200塩基対(bp)フラグメン
トをpSODα13から単離した大きなフラグメントに
連結した。このpSODα13はNde Iで消化し、
DNAポリメラーゼI(Klenow)で充填し、次い
でEco RIで消化してあった。得られたプラスミド
pSODβ1はβ−ラクタマーゼ遺伝子のリボソーム結
合部位とλPLプロモーターとを含有している。第15図:pSODβ1T11の構築 プラスミドpBR 322(ATCC No.3701
7)をEco RIとAva Iで消化した。得られた
DNAをDNAポリメラーゼI(クレノウ)で充填し
た。その後、TetR遺伝子フラグメントを単離し、p
SODβ1(第14図)プラスミドから単離した大フラ
グメントに連結した。このpSODβ1プラスミドは予
め、Pst Iで消化した後Bam HIで部分消化
し、次いでDNAポリメラーゼI(クレノウ)て充填し
ておいた。得られたプラスミドpSODβ1T11はT
etR遣伝子を含有している。第16図:pSODβ1TT−1の構築 Hind IIIで消化し、DNAポリメラーゼI(ク
レノウ)で充填してあるプラスミドpPSI(ATCC
No.39807)からrRNAT1T2転写終結フ
ラグメントを単離した。このフラグメントを、Bam
HIで部分消化しDNAポリメラーゼI(クレノウ)で
充填してあるプラスミドpSODβ1T11(第15
図)に連結した。第17図:pSODβ1−BA2の構築 天然のβ−ラクタマーゼリボソーム結合部位の配列に類
似の配列:
【化3】
を有する合成DNAフラグメントをリン酸化し、Nde
I及びEco RIで消化してあるpSODα13プ
ラスミド(第14図)の大フラグメントに連結した。第18図:pTV−188の構築 プラスミドpApo E−EX2(ATCC No.3
9787)をNdeIで消化し、次いでフラグメントを
DNAポリメラーゼI(クレノウ)で充填した。得られ
たApo E遺伝子フラグメントを単離し、pSODβ
1T11プラスミド(第15図)の唯一のブラントエン
ド(平滑端)Stu I部位に挿入した。得られたプラ
スミドpTV−188はApo E融合蛋白質を発現す
る。第19図:p579の構築 Hind IIIで消化してあるプラスミドpPS 1
(ATCC No.39807)からrRNAオペロン
T1T2転写終結フラグメントを単離した。T1T2フ
ラグメントを、Hind IIIで消化してあるpRO
211(第2図)の唯一のHind III部位に挿
入した。得られた発現ベクターp579はλPLプロモ
ーター、CIIリボソーム結合部位そしてT1T2転写
終結信号を有している。第20図:pTV−170の構築 Nde I−Nde I Apo Eフラグメントをプ
ラスミドpApoE−EX2(ATCC No.397
87)から単離し、Nde Iで消化してある発現ベク
ターp579(第19図)の唯一のNde I部位に挿
入した。得られたプラスミドpTV−170はN末端に
メチオニン残基を付加した天然のヒトApo E蛋白質
のアナログを発現する。第21図:pTV−190の構築 プラスミドpTV−170(第20図)をNde Iで
部分消化し、DNAポリメラーゼI(クレノウ)で充填
した。単離した線状DNAを再連結してプラスミドpT
V−190を得た。プラスミドpTV−190を分析し
たところApoE遺伝子の5′端に唯一のNde I部
位を持つことが判った。第22図:pTV−194の構築 Eco RIとAlu Iで消化した後プラスミドpB
LA11(ATCCNo.39788)からβ−ラクタ
マーゼプロモーターとリボソーム結合部位のフラグメン
トを単離した。このフラグメントを、Nde Iで消化
し、DNAポリメラーゼI(クレノウ)で充填した後E
co RIで消化してあるpTV−170(第20図)
プラスミドの大フラグメトに連結した。第23図:pSAL160−5の構築 Apo E DNA配列を有するAva I−Ava
Iフラグメントを、Ava Iで消化したpTV−17
0(第21図)から単離した。このフラグメントをDN
AポリメラーゼI(クレノウ)で充填し、アガロースゲ
ルで単離した。精製Apo Eフラグメントを、Pst
Iで部分消化しDNAポリメラーゼI(クレノウ)で
充填してあるpTV104(2)プラスミド(ATCC
No.39384)のPst I部位に挿入した。得
られたプラスミドをpSAL160−5と表わす。第24図:pTV−214の構築 配列:
I及びEco RIで消化してあるpSODα13プ
ラスミド(第14図)の大フラグメントに連結した。第18図:pTV−188の構築 プラスミドpApo E−EX2(ATCC No.3
9787)をNdeIで消化し、次いでフラグメントを
DNAポリメラーゼI(クレノウ)で充填した。得られ
たApo E遺伝子フラグメントを単離し、pSODβ
1T11プラスミド(第15図)の唯一のブラントエン
ド(平滑端)Stu I部位に挿入した。得られたプラ
スミドpTV−188はApo E融合蛋白質を発現す
る。第19図:p579の構築 Hind IIIで消化してあるプラスミドpPS 1
(ATCC No.39807)からrRNAオペロン
T1T2転写終結フラグメントを単離した。T1T2フ
ラグメントを、Hind IIIで消化してあるpRO
211(第2図)の唯一のHind III部位に挿
入した。得られた発現ベクターp579はλPLプロモ
ーター、CIIリボソーム結合部位そしてT1T2転写
終結信号を有している。第20図:pTV−170の構築 Nde I−Nde I Apo Eフラグメントをプ
ラスミドpApoE−EX2(ATCC No.397
87)から単離し、Nde Iで消化してある発現ベク
ターp579(第19図)の唯一のNde I部位に挿
入した。得られたプラスミドpTV−170はN末端に
メチオニン残基を付加した天然のヒトApo E蛋白質
のアナログを発現する。第21図:pTV−190の構築 プラスミドpTV−170(第20図)をNde Iで
部分消化し、DNAポリメラーゼI(クレノウ)で充填
した。単離した線状DNAを再連結してプラスミドpT
V−190を得た。プラスミドpTV−190を分析し
たところApoE遺伝子の5′端に唯一のNde I部
位を持つことが判った。第22図:pTV−194の構築 Eco RIとAlu Iで消化した後プラスミドpB
LA11(ATCCNo.39788)からβ−ラクタ
マーゼプロモーターとリボソーム結合部位のフラグメン
トを単離した。このフラグメントを、Nde Iで消化
し、DNAポリメラーゼI(クレノウ)で充填した後E
co RIで消化してあるpTV−170(第20図)
プラスミドの大フラグメトに連結した。第23図:pSAL160−5の構築 Apo E DNA配列を有するAva I−Ava
Iフラグメントを、Ava Iで消化したpTV−17
0(第21図)から単離した。このフラグメントをDN
AポリメラーゼI(クレノウ)で充填し、アガロースゲ
ルで単離した。精製Apo Eフラグメントを、Pst
Iで部分消化しDNAポリメラーゼI(クレノウ)で
充填してあるpTV104(2)プラスミド(ATCC
No.39384)のPst I部位に挿入した。得
られたプラスミドをpSAL160−5と表わす。第24図:pTV−214の構築 配列:
【化4】
のヒト成長ホルモンの最初の14個のアミノ酸を含む合
成フラグメントをγ−32P−ATPとポリヌクレオチ
ドキナーゼでリン酸化した。リン酸化したリンカーを、
Nde Iで消化してあるpTV190プラスミドの唯
一のNde I部位に挿入した。第25図:pTVR279−8の構築 pTVR279−8はpTV190から構築したpTV
264−45から構築した。Met−Apo E3アナ
ログの発現を支配するプラスミドpTV190をAva
Iで部分開裂し、DNAポリメラーゼIのクレノウフ
ラグメントを用いて「充填」し、再連結した。得られた
プラスミドpTV264−45には遺伝子の3′端のA
va I部位がない。プラスミドpTV264−45を
Nde Iで完全に消化し、配列: のリン酸化した合成リンカーに連結した。pTVR27
9−8と表わされる得られたプラスミドはmet−le
u−leu−leu−met−Apo E3アナログの
発現を支配する。第26図:p9200の構築 pHG44からアンピシリン耐性遺伝子のほとんどを除
去しpHG44のテトラサイクリン耐性遺伝子で置き換
えることによりプラスミドp9200を構築した。pH
G44をGla IとPst Iで開裂し、DNAポリ
メラーゼIのクレノウフラグメントで処理し、DNA大
フラグメントを単離した。このフラグメントを、Eco
RIとAva IでpBR322を開裂し、クレノウ
フラグメントで処理した後に単離したpBR322のD
NA小フラグメントに連結した。連結で得たプラスミド
をp9200と表わした。プラスミドp9200はme
t−asp−gln−bGHアナログの発現を支配し、
宿主細胞をテトラサイクリン耐性とする。第27図:pTV300の構築 pTV300はmet14−hGHアナログの発現を支
配する。pTV18(1)をNde Iで開裂し、me
t14−hGH DNAを単離し、Nde Iで開裂し
たp579(第19図)に連結することによりpTV3
00を構築した。pTV18(1)は1985年1月2
3日に公開された欧州特許出願公開第0131843A
l明細書又は対応の1983年7月15日出願の米国特
許出願番号第514,188号明細書(援用して本明細
書に包含する)に記載されたようにして得ることができ
る。第28図:Apo Eアナログの細胞内蓄積に伴う細胞
毒性 pTV194を含有するc600細胞(5ml)又はト
ランスフェクションしていない対照(コントロール)細
胞を培養し、インキュベーション温度を30℃から42
℃に上昇させることにより誘導した。図に示した時間
に、培養物の1mlアリコートを取り、氷で急冷し、成
長培地で段階的に希釈し、適当な抗生物質の存在下に寒
天上に置き、30℃で一晩インキュベートした。コロニ
ー数は2つのプレートの平均から決定した。pTV19
4をトランスフェクトしたc600細胞とトランスフェ
クトしていないc600細胞とを30℃に維持した対応
培養物(parallel culture)を非誘導
対照とした。第29図:線維芽細胞のApo−B,E(LDL)レセ
プターへのApo EDMPC複合体の結合 生物工学処理したApo E(met−Apo E 3
アナログ)と真正Apo Eのリン脂質複合体は、蛋白
質とDMPCとを22℃でインキュベートすることによ
って調製した。(実施例38の後の参考文献30に)記
載したように、密度勾配超遠心で非複合物質から複合体
を分離した。左:4℃において、培養した線維芽細胞レ
セプターとの結合について125I標識ヒトLDLと競
合する生物工学処理Apo E及び真正Apo E・D
MPC複合体の能力。右:125I−標識Apo Eア
ナログ及び真正Apo E・DMPC複合体の培養線維
芽細胞と直接結合する能力。第30図:肝臓の膜のApo Eレセプターに対する
125I−Apo E・DMPC複合体の結合 第29図に記載の通りにリン脂質(DMPC)複合体を
調製した。コレステロールを与えた成犬の肝臓の膜をA
po Eレセプター源として用い、(実施例38の後の
参考文献32に)記載の如く調製した。125I−標識
した生物工学処理した及び真正Apo E DMPC複
合体を、(実施例38の後の参考文献32)に記載の如
く4℃で膜に結合させた。第31図:ウサギ血漿からのヨウ素化Apo Eのクリ
アランス 生物工学処理した及び真正Apo Eをウサギ血漿1m
lと共に37℃で30分間インキュベートした後、この
混合物をウサギの静脈に注射した。図に示す時間に約2
mlの血液をEDTAを含有するバイアル中に採取し、
計数測定用血漿を調製した。(実施例38の後の参考文
献33に)記載されているように、測定値(カウント)
はTCA可溶分解産物に対して補正する。発明の詳細な説明 遺伝子の発現とポリペプチドの産生を増強しうるベクタ
ーが開発された。このプラスミドは2本鎖DNA分子で
ある。このプラスミドを非耐熱性リプレッサーCIを含
有する適切な細菌の宿主細胞に導入すると、この細胞
は、宿主細胞の温度がリプレッサー不活性化温度まで上
昇したときに、プラスミドに挿入された所望の遺伝子を
発現して、遺伝子がコードするポリペプチドを産生させ
ることができる。前記ベクターは5′から3′に向って
次のものを順に含んでいる。 ・ラムダバクテリオファージ由来のプロモーターとオペ
レーターPLOLを含有するDNA配列; ・抗転写終結因子N蛋白質を結合するためのN利用部
位; ・その後に続くリボソーム結合部位を含有するDNA配
列を置換できる第1の制限酵素部位; ・所望遺伝子のmRNAが宿主細胞内のリボソームと結
合しうるようにするためのリボソーム結合部位を含有す
るDNA配列; ・ATG開始コドン、又はベクターに所望遺伝子を挿入
するときにATG開始コドンに変換されるDNA配列;
及び ・ATG開始コドンと位相を合わせてベクター内に所望
遺伝子を挿入するための第2の制限酵素部位。 前記ベクターは、又、宿主細胞内で自律複製できる細菌
プラスミド由来の複製起点を含有するDNA配列と、ベ
クターが宿主細胞中に存在するときに現われる選択可能
な又は同定可能な表現形質に関連する遺伝子を含有する
DNA配列とcI434と表わされるフラグメントを含
有するDNA配列とからなる群から選択される選択手段
とを含んでいる。このようなcI434フラグメントは
cI434リプレッサー蛋白質の遺伝子とそれに関連す
るプロモーター及びオペレーター配列とを含んでいる。
cI434はcI434−溶原素(lysogen)を
抑制するので、このプラスミドを損失すると細胞融解
(lysis)が起こるであろう。PLOLプロモータ
ー及びオペレーター配列の3′末端とN利用部位の5′
末端との間の距離は約80塩基対未満であり、N利用部
位の3′末端とリボソーム結合部位の5′末端との間の
距離は約300塩基対未満である。ベクターの適宜付加
成分は第2の制限酵素部位の3′末端に位置するT1T
2rRNA転写終結配列である。T1T2rRNA転写
終結配列が第2の制限酵素部位の3′末端から約100
塩基対未満であると好ましい。より好ましくは、T1T
2rRNA転写終結配列が第2の制限酵素部分の3′末
端から約20塩基対未満である。ベクターは、このベク
ターが宿主細胞内に存在するときに現われる選択可能な
又は同定可能な表現形質に関連している遺伝子を含有し
ているDNA配列か、λimm434cI−溶原素を抑
制するcI434リプレッサー遺伝子を含有しているD
NA配列のいずれか、又は両者を含んでいる。選択可能
な又は同定可能な表現形質に関連する適切な遺伝子は温
度感受性又は薬剤耐性例えばアンピシリン、クロラムフ
ェニコール又はテトラサイクリンに対する耐性に関連す
るものを包含する。宿主がcI434リプレッサー遺伝
子を含有しているときには、この宿主内でλimm43
4cI−プロファージが誘発されない。従って、cI
434が存在するときには高価な抗生物質選択用生理食
塩水を使う必要はない。ベクターは、選択可能な又は同
定可能な表現形質に関連する遺伝子を含有しているDN
A配列と、cI434と表わされるフラグメントを含有
するDNA配列との両方を含んでいるのが好ましい。c
I434遺伝子がベクターに含まれているときにはT1
T2rRNA配列の3′末端の後に位置していることが
望ましい。ベクターは、宿主細胞内で自律複製しうる細
菌プラスミド由来の複製起点をも含んでいる。このよう
な複製起点の適切なものは多くの源、例えばpBR32
2又はpRIから得ることができる。好ましくは、ベク
ターは、宿主細胞内でベクターの構成コピーを少なくと
も400個自律複製しうる高い構成コピー数の細菌プラ
スミド由来の複製起点を有している。より好ましくは、
この複製起点がCol E1である。最も好ましくは、
起点は第7図に示す制限地図を有するプラスミドpOP
1Δ6である。ベクターのもう1つの成分は、その後
に続くリボソーム結合部位を含有するDNA配列を置換
させうる第1の制限酵素部位である。多数のこのような
部位が使用できる。Eco RIが適切である。ベクタ
ーのもう1つの成分は、ATG開始コドンと位相を合わ
せてプラスミドに所望遺伝子を挿入するための第2の制
限酵素部位である。多数のこのような部位を使用しう
る。適切部位はNde I,Cla I,Hind I
II,Sma I,Bgl II,Xba I,Sac
I及びAlu Iを包含する。一般的に、第2の制限
酵素部位がリボソーム結合部位を含有するDNA配列を
置換させうるに必要な第2の制限部位としても機能する
ことが好ましい。第2の制限酵素部位をこの目的にも用
いることができないときには、本発明ベクターはリボソ
ーム結合部位の後且つ第2の制限部位の前に第3の制限
酵素部位をも含んでいなければならない。好ましくは、
ベクターは2つの非反復(unique)制限酵素部位
を含有している。第1の部位はリボソーム結合部位を含
有するDNA配列を置換させることができる。第2の部
位はATG開始コドンと位相を合せてプラスミドに所望
遺伝子を挿入させることができる。本明細書中で用いら
れている「非反復(唯一の,単一の)制限酵素」という
用語はプラスミド中に1つだけある制限酵素部位を意味
している。現状での好ましい具体例においては、Eco
RIが第1の制限酵素部位であり、Nde Iが第2
の制限酵素部位である。好ましくは、ベクターは共有結
合で閉じた環状二本鎖の分子である。しかしながら、プ
ラスミドが共有結合で閉じていることは必須ではない。
宿主細胞をCIリプレッサー蛋白質の不活化温度まで加
熱した後に、プラスミドの発現レベルが上昇する。この
目的のためには約38℃以上の温度が有効である。又、
宿主細胞に対する不必要な熱損傷を最小限にすることが
望ましいので、温度は42℃を数度以上超えないことが
一般的に好ましい。ベクターの1つの重要な成分はリボ
ソーム結合部位である。適切な部位は、配列:
成フラグメントをγ−32P−ATPとポリヌクレオチ
ドキナーゼでリン酸化した。リン酸化したリンカーを、
Nde Iで消化してあるpTV190プラスミドの唯
一のNde I部位に挿入した。第25図:pTVR279−8の構築 pTVR279−8はpTV190から構築したpTV
264−45から構築した。Met−Apo E3アナ
ログの発現を支配するプラスミドpTV190をAva
Iで部分開裂し、DNAポリメラーゼIのクレノウフ
ラグメントを用いて「充填」し、再連結した。得られた
プラスミドpTV264−45には遺伝子の3′端のA
va I部位がない。プラスミドpTV264−45を
Nde Iで完全に消化し、配列: のリン酸化した合成リンカーに連結した。pTVR27
9−8と表わされる得られたプラスミドはmet−le
u−leu−leu−met−Apo E3アナログの
発現を支配する。第26図:p9200の構築 pHG44からアンピシリン耐性遺伝子のほとんどを除
去しpHG44のテトラサイクリン耐性遺伝子で置き換
えることによりプラスミドp9200を構築した。pH
G44をGla IとPst Iで開裂し、DNAポリ
メラーゼIのクレノウフラグメントで処理し、DNA大
フラグメントを単離した。このフラグメントを、Eco
RIとAva IでpBR322を開裂し、クレノウ
フラグメントで処理した後に単離したpBR322のD
NA小フラグメントに連結した。連結で得たプラスミド
をp9200と表わした。プラスミドp9200はme
t−asp−gln−bGHアナログの発現を支配し、
宿主細胞をテトラサイクリン耐性とする。第27図:pTV300の構築 pTV300はmet14−hGHアナログの発現を支
配する。pTV18(1)をNde Iで開裂し、me
t14−hGH DNAを単離し、Nde Iで開裂し
たp579(第19図)に連結することによりpTV3
00を構築した。pTV18(1)は1985年1月2
3日に公開された欧州特許出願公開第0131843A
l明細書又は対応の1983年7月15日出願の米国特
許出願番号第514,188号明細書(援用して本明細
書に包含する)に記載されたようにして得ることができ
る。第28図:Apo Eアナログの細胞内蓄積に伴う細胞
毒性 pTV194を含有するc600細胞(5ml)又はト
ランスフェクションしていない対照(コントロール)細
胞を培養し、インキュベーション温度を30℃から42
℃に上昇させることにより誘導した。図に示した時間
に、培養物の1mlアリコートを取り、氷で急冷し、成
長培地で段階的に希釈し、適当な抗生物質の存在下に寒
天上に置き、30℃で一晩インキュベートした。コロニ
ー数は2つのプレートの平均から決定した。pTV19
4をトランスフェクトしたc600細胞とトランスフェ
クトしていないc600細胞とを30℃に維持した対応
培養物(parallel culture)を非誘導
対照とした。第29図:線維芽細胞のApo−B,E(LDL)レセ
プターへのApo EDMPC複合体の結合 生物工学処理したApo E(met−Apo E 3
アナログ)と真正Apo Eのリン脂質複合体は、蛋白
質とDMPCとを22℃でインキュベートすることによ
って調製した。(実施例38の後の参考文献30に)記
載したように、密度勾配超遠心で非複合物質から複合体
を分離した。左:4℃において、培養した線維芽細胞レ
セプターとの結合について125I標識ヒトLDLと競
合する生物工学処理Apo E及び真正Apo E・D
MPC複合体の能力。右:125I−標識Apo Eア
ナログ及び真正Apo E・DMPC複合体の培養線維
芽細胞と直接結合する能力。第30図:肝臓の膜のApo Eレセプターに対する
125I−Apo E・DMPC複合体の結合 第29図に記載の通りにリン脂質(DMPC)複合体を
調製した。コレステロールを与えた成犬の肝臓の膜をA
po Eレセプター源として用い、(実施例38の後の
参考文献32に)記載の如く調製した。125I−標識
した生物工学処理した及び真正Apo E DMPC複
合体を、(実施例38の後の参考文献32)に記載の如
く4℃で膜に結合させた。第31図:ウサギ血漿からのヨウ素化Apo Eのクリ
アランス 生物工学処理した及び真正Apo Eをウサギ血漿1m
lと共に37℃で30分間インキュベートした後、この
混合物をウサギの静脈に注射した。図に示す時間に約2
mlの血液をEDTAを含有するバイアル中に採取し、
計数測定用血漿を調製した。(実施例38の後の参考文
献33に)記載されているように、測定値(カウント)
はTCA可溶分解産物に対して補正する。発明の詳細な説明 遺伝子の発現とポリペプチドの産生を増強しうるベクタ
ーが開発された。このプラスミドは2本鎖DNA分子で
ある。このプラスミドを非耐熱性リプレッサーCIを含
有する適切な細菌の宿主細胞に導入すると、この細胞
は、宿主細胞の温度がリプレッサー不活性化温度まで上
昇したときに、プラスミドに挿入された所望の遺伝子を
発現して、遺伝子がコードするポリペプチドを産生させ
ることができる。前記ベクターは5′から3′に向って
次のものを順に含んでいる。 ・ラムダバクテリオファージ由来のプロモーターとオペ
レーターPLOLを含有するDNA配列; ・抗転写終結因子N蛋白質を結合するためのN利用部
位; ・その後に続くリボソーム結合部位を含有するDNA配
列を置換できる第1の制限酵素部位; ・所望遺伝子のmRNAが宿主細胞内のリボソームと結
合しうるようにするためのリボソーム結合部位を含有す
るDNA配列; ・ATG開始コドン、又はベクターに所望遺伝子を挿入
するときにATG開始コドンに変換されるDNA配列;
及び ・ATG開始コドンと位相を合わせてベクター内に所望
遺伝子を挿入するための第2の制限酵素部位。 前記ベクターは、又、宿主細胞内で自律複製できる細菌
プラスミド由来の複製起点を含有するDNA配列と、ベ
クターが宿主細胞中に存在するときに現われる選択可能
な又は同定可能な表現形質に関連する遺伝子を含有する
DNA配列とcI434と表わされるフラグメントを含
有するDNA配列とからなる群から選択される選択手段
とを含んでいる。このようなcI434フラグメントは
cI434リプレッサー蛋白質の遺伝子とそれに関連す
るプロモーター及びオペレーター配列とを含んでいる。
cI434はcI434−溶原素(lysogen)を
抑制するので、このプラスミドを損失すると細胞融解
(lysis)が起こるであろう。PLOLプロモータ
ー及びオペレーター配列の3′末端とN利用部位の5′
末端との間の距離は約80塩基対未満であり、N利用部
位の3′末端とリボソーム結合部位の5′末端との間の
距離は約300塩基対未満である。ベクターの適宜付加
成分は第2の制限酵素部位の3′末端に位置するT1T
2rRNA転写終結配列である。T1T2rRNA転写
終結配列が第2の制限酵素部位の3′末端から約100
塩基対未満であると好ましい。より好ましくは、T1T
2rRNA転写終結配列が第2の制限酵素部分の3′末
端から約20塩基対未満である。ベクターは、このベク
ターが宿主細胞内に存在するときに現われる選択可能な
又は同定可能な表現形質に関連している遺伝子を含有し
ているDNA配列か、λimm434cI−溶原素を抑
制するcI434リプレッサー遺伝子を含有しているD
NA配列のいずれか、又は両者を含んでいる。選択可能
な又は同定可能な表現形質に関連する適切な遺伝子は温
度感受性又は薬剤耐性例えばアンピシリン、クロラムフ
ェニコール又はテトラサイクリンに対する耐性に関連す
るものを包含する。宿主がcI434リプレッサー遺伝
子を含有しているときには、この宿主内でλimm43
4cI−プロファージが誘発されない。従って、cI
434が存在するときには高価な抗生物質選択用生理食
塩水を使う必要はない。ベクターは、選択可能な又は同
定可能な表現形質に関連する遺伝子を含有しているDN
A配列と、cI434と表わされるフラグメントを含有
するDNA配列との両方を含んでいるのが好ましい。c
I434遺伝子がベクターに含まれているときにはT1
T2rRNA配列の3′末端の後に位置していることが
望ましい。ベクターは、宿主細胞内で自律複製しうる細
菌プラスミド由来の複製起点をも含んでいる。このよう
な複製起点の適切なものは多くの源、例えばpBR32
2又はpRIから得ることができる。好ましくは、ベク
ターは、宿主細胞内でベクターの構成コピーを少なくと
も400個自律複製しうる高い構成コピー数の細菌プラ
スミド由来の複製起点を有している。より好ましくは、
この複製起点がCol E1である。最も好ましくは、
起点は第7図に示す制限地図を有するプラスミドpOP
1Δ6である。ベクターのもう1つの成分は、その後
に続くリボソーム結合部位を含有するDNA配列を置換
させうる第1の制限酵素部位である。多数のこのような
部位が使用できる。Eco RIが適切である。ベクタ
ーのもう1つの成分は、ATG開始コドンと位相を合わ
せてプラスミドに所望遺伝子を挿入するための第2の制
限酵素部位である。多数のこのような部位を使用しう
る。適切部位はNde I,Cla I,Hind I
II,Sma I,Bgl II,Xba I,Sac
I及びAlu Iを包含する。一般的に、第2の制限
酵素部位がリボソーム結合部位を含有するDNA配列を
置換させうるに必要な第2の制限部位としても機能する
ことが好ましい。第2の制限酵素部位をこの目的にも用
いることができないときには、本発明ベクターはリボソ
ーム結合部位の後且つ第2の制限部位の前に第3の制限
酵素部位をも含んでいなければならない。好ましくは、
ベクターは2つの非反復(unique)制限酵素部位
を含有している。第1の部位はリボソーム結合部位を含
有するDNA配列を置換させることができる。第2の部
位はATG開始コドンと位相を合せてプラスミドに所望
遺伝子を挿入させることができる。本明細書中で用いら
れている「非反復(唯一の,単一の)制限酵素」という
用語はプラスミド中に1つだけある制限酵素部位を意味
している。現状での好ましい具体例においては、Eco
RIが第1の制限酵素部位であり、Nde Iが第2
の制限酵素部位である。好ましくは、ベクターは共有結
合で閉じた環状二本鎖の分子である。しかしながら、プ
ラスミドが共有結合で閉じていることは必須ではない。
宿主細胞をCIリプレッサー蛋白質の不活化温度まで加
熱した後に、プラスミドの発現レベルが上昇する。この
目的のためには約38℃以上の温度が有効である。又、
宿主細胞に対する不必要な熱損傷を最小限にすることが
望ましいので、温度は42℃を数度以上超えないことが
一般的に好ましい。ベクターの1つの重要な成分はリボ
ソーム結合部位である。適切な部位は、配列:
【化5】
を有するラムダバクテリオファージ由来のCII;配
列:
列:
【化6】
を有するラムダバクテリオファージ由来のCIIの変異
体;配列:
体;配列:
【化7】
を有するバクテリオファージラムダの主要頭部蛋白質遺
伝子;pBR322由来の天然のβ−ラクタマーゼリボ
ソーム結合部位;配列:
伝子;pBR322由来の天然のβ−ラクタマーゼリボ
ソーム結合部位;配列:
【化8】
を有する合成オリゴヌクレオチド;配列:
【化9】
を有する合成オリゴヌクレオチド;及びバシラスツレン
ゲンシス(Bacillus thurengensi
s)由来の天然のリボソーム結合部位である。以前に記
載されたベクターと比較して、本発明ベクターは所望の
ポリペプチド生成物をコードする広範囲の遺伝子の発現
を増強するために使用することができる。成長ホルモン
例えばウシ、ブタ、ニワトリ又はヒトの成長ホルモン
や、スーパーオキシドジスムターゼやアポリポプロテイ
ンE又はそれらいずれかのアナログをコードする遺伝子
が適切な遺伝子に含まれる。アナログ(アナログ、類似
体)とは天然のポリペプチドと同じ活性を有している
が、ポリペプチドのN末端で1つ以上の異なるアミノ酸
が付加されているか、欠失しているか又はその両者であ
るポリペプチドを意味している。本発明のプラスミドと
共に用いる好ましい宿主は大腸菌(Escherich
ia coli)である。現状で好ましい株はA163
7,A1645,A2602,A2097,A1563
及びA1645(λi434cI−mini Tn 1
0)である。スーパーオキシドジスムターゼ又はそのア
ナログの発現のために現状で最も好ましい株はA164
5である。A1645及びA1645(λi434cI
−mini Tn 10)が動物の成長ホルモン遺伝子
を発現するための現状でより好ましい株である。 (1)フェニルアラニン型真正bGHのアミノ末端にア
ミノ酸配列met−asp−glnがついているbGH
アナログ、又は (2)フェニルアラニン型天然cGHのアミノ末端にア
ミノ酸、メチオニンがついているcGHのアナログ を産生する遺伝子の発現のための現状で最も好ましい株
はA2097である。テトラサイクリン耐性遺伝子を含
有するトランスポゾンをガラクトースオペロン内に挿入
し、ガラクトースオペロンに近い所で発現用のラムダ系
を挿入することによってc600からA1637を得
た。c600はアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ンからATCC受託番号23724号として入手でき
る。Gal+(ガラクトース発酵能)に関して選択し、
テトラサイクリン耐性を失わせることにより、A163
7からA1645を得た。A1645はラムダ発現系を
含有しているが選択によってトランスポゾンの一部は取
り除かれている。この表現型はC600r− m+ g
al+ thr− leu− lac Z−bl(λc
I857ΔHIΔBam HI N+)である。以下に
より詳細に記載した種々のプラスミドも含み、A164
5は米国(U.S.A.)、マリーランド(Maryl
and)、ロックビル(Rockville)のアメリ
カンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。
A1645(λi434cI−mini Tn 10)
は30℃でimm434cI3008mini Tn
10Δ16Δ17をプラスミド含有大腸菌(Esche
richia coli)株A1645に感染させるこ
とにより得た。テトラサイクリン耐性コロニーを単離精
製した。プラスミドpHG50を含有するこの株はAT
CC受託番号39805としてアメリカンタイプカルチ
ャーコレクションに寄託してある。A2602及びA1
563はSA500由来である。これらの表現型は各々
SA500his− ile− gal+ Δ8(λc
I857ΔHIΔBamN+)及びSA500his−
ile− gal+ Δ8 lac Z− A21
(λcI857 int2 xis1 nutL3 Δ
HI)である。A2097はA1645由来である。こ
の表現型はA1645lacΔx A21prc
C::Tn10である。最少必須培地中で増殖させたと
きでさえ高いレベルでポリペプチドを発現すことができ
る大腸菌(Escherichia coli)の原栄
養株も又、本発明ベクターの宿主として使用できる。好
ましい原栄養株はA4200とA4255とを包含す
る。プラスミドp9200を含有する株A4255は受
託番号53215号としてATCCに寄託してある。プ
ラスミドpGH44を含有するA4346のようなビオ
チン非要求(依存)性原栄養株が更に好ましい。A43
46は受託番号53218号としてATCCに寄託して
ある。大腸菌(Escherichia coli)の
溶原株も本発明のベクターの宿主として使用できる。ポ
リペプチドが産生する温度において、ポリペプチドが産
生する速度よりゆっくりと、例えば細胞を融解させるエ
ンドリシンのような物質を産生する溶原株が適切な溶原
株に含まれる。これにより、産生された溶解物質の量が
細胞融解を起こすレベルに達する前に、細胞が比較的大
量の所望ポリペプチドを産生することができる。適切な
溶原菌の例には、pGH44を含有する株A4048の
ようなPlc Itsプラスミドを含有するものが含ま
れる。A4048は受託番号53217号でATCCに
寄託してある。pBR322とpBRMは各々ATCC
受託番号37017号及び37283号としてアメリカ
ンタイプカルチャーコレクションから入手でき、D4は
米国特許出願と関連してATCC受託番号31826号
として寄託した以外、全ての寄託は微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約に従った。ベクターは本
発明が関連する分野の当業者には公知の方法で形成でき
る。これらの方法については本明細書中に記載した種々
の文献中により詳細に記載されており、従来技術に関す
る完全な情報を提供するために本明細書中に参考として
それらの内容を包含する。現状の好ましいベクターの1
つは第2図に示す制限地図を有するpJH200であ
る。A1645株を用い、従来の形質転換法により大腸
菌(Escherichia coli)にこのベクタ
ーを導入した。得られた宿主ベクター系はATCC受託
番号第39783号として寄託してある。所望のポリペ
プチド例えばウシ成長ホルモンをコートする遺伝子をp
JH200に挿入できる。2番目の好ましいベクターp
RO211はpJH200のNde I部分消化物から
構築した。pRO211は第2図に示す制限地図を有す
る。このベクターをNde I及びHind IIIで
消化し、大フラグメントを単離し、これをpAL500
(ATCC受託番号39782号)から得たbGH c
DNAに連結することによりウシ成長ホルモンcDNA
をpRO211に挿入した。得られたプラスミドはpR
O12と表わす。これの制限地図も第2図に示す。プラ
スミドpRO12をPvu IIで部分消化し、続いて
Nde Iにより消化する。真正bGHのN末端の最初
の24個のアミノ酸をコードする合成DNAフラグメン
トを消化したpRO12に連結する。得られたプラスミ
ドはpSAL5200−6と称し、その制限地図を第3
図に示す。本発明のベクターはまた、ヒトスーパーオキ
シドジスムターゼ(SOD)あるいはその類似物(アナ
ログ)を生産するプラスミドを生成するように工学処理
し得る。λPLプロモーター及びCIIリボソーム結合
部位を有するpJH200(ATCC受託番号3978
3)のフラグメントを、第13図に示すように、単離し
た後ヒトSOD遺伝子を含むプラスミドpSOD NH
−10に挿入して、pSOD NH−550と称するプ
ラスミドを形成した。λPLプロモーター及びSOD遺
伝子を含むフラグメントをpSOD NH−550のA
lu Iによる消化後単離した。Bam HIリンカー
の添加及びその後のBam HIによる制限の後、フラ
グメントをpBRMの唯一のBam HI部位に挿入し
た。pBRMはATCC受託番号37283で寄託され
ている高コピー数プラスミドである。得られたプラスミ
ドをpSODα2と称する。その制限地図を第13図に
示した。このプラスミドは E.coli株A2097
中に入れてATCC受託番号39786で寄託されてい
る。プラスミドpSODα2(ATCC受託番号397
86)はCIIリボソーム結合部位を含んでいる。この
リボソーム結合部位を、pBLA11のEco RI−
Alu Iダイジェスト(消化物)から単離したβ−ラ
クタマーゼプロモーター及びシャイン−ダルガーノ(S
hine−Dalgarno)リボソーム結合部位を含
有するフラグメントにより置き換える。(プラスミドp
BLA11は第14図に示す制限地図を有するものであ
り、Escherichia coli株A1645中
に入れてATCC受託番号39788により寄託されて
いる。)CIIリボソーム結合部位を第14図に示すよ
うにプラスミドpSODα2から除去する。pSODα
2をEco RIにより部分的に制限しDNAポリメラ
ーゼI(Klenow)で充填し再連結すると、該プラ
スミド中に残る唯一のEco RI部位がCIIRBS
の5′末端となる。得られたpSODα13と称するプ
ラスミドをNde Iで消化し、DNAポリメラーゼI
(Klenow)で充填し、次にEco RIにより消
化する。大フラグメントを単離し、pBLA11より単
離されたβ−ラクタマーゼプロモーター及びリボソーム
結合部位を含むフラグメントに連結してプラスミドpS
OD β1を構築する。pSOD β1はアンピシリン
抵抗性遺伝子フラグメント(AmpR)の替りにテトラ
サイクリン抵抗性遺伝子フラグメント(TetR)を含
むように改変し得る。AmpRフラグメントをPst
I引き続きBam HI(部分的)による消化によりp
SODβ1から除去した。得られたプラスミドをDNA
ポリメラーゼI(Klenow)で充填した。別にTe
tR遺伝子フラグメントをpBR322のEco RI
−Ava Iダイジェストから単離し、充填し、上で充
填したプラスミドに連結した。(プラスミドpBR32
2は広く入手可能で、例えばアメリカンタイプカルチュ
アコレクションからATCC受託番号37017として
入手可能である。)得られたプラスミドをpSODβ1
T11と称する。その制限地図を第15図に示す。ヒト
スーパーオキシドジスムターゼを生産するのに使用し得
るもう1つのプラスミドをpSODβ1−BA2と称す
る。そのpSODα13からの構築を第17図に示す。
本発明のベクター、例えばpRO211はまたブタある
いはニワトリ成長ホルモンを生産するように処理するこ
ともできる。即ち第4図に示すように、ブタ成長ホルモ
ンcDNAをppGH−Nde I/RIのNde I
ダイジェストから単離した。得られたpGH遺伝子を含
むフラグメントをpRO211のNdeIダイジェスト
に連結した。得られたプラスミドはP3008と称し、
E.Coli株A2097中に入れてATCC受託番
号39804で寄託されている。本発明の他の実施態様
においては、第5図に示すようにpcGH−Nde I
/RIのNde I−Ban IIダイジェストから2
つのニワトリ成長ホルモンフラグメントを単離した。2
つのcGHフラグメントを、真正cGHのN末端の最初
の18個のアミノ酸をコードするリン酸化合成リンカー
に連結した。リンカーの配列は下記の通りである。
ゲンシス(Bacillus thurengensi
s)由来の天然のリボソーム結合部位である。以前に記
載されたベクターと比較して、本発明ベクターは所望の
ポリペプチド生成物をコードする広範囲の遺伝子の発現
を増強するために使用することができる。成長ホルモン
例えばウシ、ブタ、ニワトリ又はヒトの成長ホルモン
や、スーパーオキシドジスムターゼやアポリポプロテイ
ンE又はそれらいずれかのアナログをコードする遺伝子
が適切な遺伝子に含まれる。アナログ(アナログ、類似
体)とは天然のポリペプチドと同じ活性を有している
が、ポリペプチドのN末端で1つ以上の異なるアミノ酸
が付加されているか、欠失しているか又はその両者であ
るポリペプチドを意味している。本発明のプラスミドと
共に用いる好ましい宿主は大腸菌(Escherich
ia coli)である。現状で好ましい株はA163
7,A1645,A2602,A2097,A1563
及びA1645(λi434cI−mini Tn 1
0)である。スーパーオキシドジスムターゼ又はそのア
ナログの発現のために現状で最も好ましい株はA164
5である。A1645及びA1645(λi434cI
−mini Tn 10)が動物の成長ホルモン遺伝子
を発現するための現状でより好ましい株である。 (1)フェニルアラニン型真正bGHのアミノ末端にア
ミノ酸配列met−asp−glnがついているbGH
アナログ、又は (2)フェニルアラニン型天然cGHのアミノ末端にア
ミノ酸、メチオニンがついているcGHのアナログ を産生する遺伝子の発現のための現状で最も好ましい株
はA2097である。テトラサイクリン耐性遺伝子を含
有するトランスポゾンをガラクトースオペロン内に挿入
し、ガラクトースオペロンに近い所で発現用のラムダ系
を挿入することによってc600からA1637を得
た。c600はアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ンからATCC受託番号23724号として入手でき
る。Gal+(ガラクトース発酵能)に関して選択し、
テトラサイクリン耐性を失わせることにより、A163
7からA1645を得た。A1645はラムダ発現系を
含有しているが選択によってトランスポゾンの一部は取
り除かれている。この表現型はC600r− m+ g
al+ thr− leu− lac Z−bl(λc
I857ΔHIΔBam HI N+)である。以下に
より詳細に記載した種々のプラスミドも含み、A164
5は米国(U.S.A.)、マリーランド(Maryl
and)、ロックビル(Rockville)のアメリ
カンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。
A1645(λi434cI−mini Tn 10)
は30℃でimm434cI3008mini Tn
10Δ16Δ17をプラスミド含有大腸菌(Esche
richia coli)株A1645に感染させるこ
とにより得た。テトラサイクリン耐性コロニーを単離精
製した。プラスミドpHG50を含有するこの株はAT
CC受託番号39805としてアメリカンタイプカルチ
ャーコレクションに寄託してある。A2602及びA1
563はSA500由来である。これらの表現型は各々
SA500his− ile− gal+ Δ8(λc
I857ΔHIΔBamN+)及びSA500his−
ile− gal+ Δ8 lac Z− A21
(λcI857 int2 xis1 nutL3 Δ
HI)である。A2097はA1645由来である。こ
の表現型はA1645lacΔx A21prc
C::Tn10である。最少必須培地中で増殖させたと
きでさえ高いレベルでポリペプチドを発現すことができ
る大腸菌(Escherichia coli)の原栄
養株も又、本発明ベクターの宿主として使用できる。好
ましい原栄養株はA4200とA4255とを包含す
る。プラスミドp9200を含有する株A4255は受
託番号53215号としてATCCに寄託してある。プ
ラスミドpGH44を含有するA4346のようなビオ
チン非要求(依存)性原栄養株が更に好ましい。A43
46は受託番号53218号としてATCCに寄託して
ある。大腸菌(Escherichia coli)の
溶原株も本発明のベクターの宿主として使用できる。ポ
リペプチドが産生する温度において、ポリペプチドが産
生する速度よりゆっくりと、例えば細胞を融解させるエ
ンドリシンのような物質を産生する溶原株が適切な溶原
株に含まれる。これにより、産生された溶解物質の量が
細胞融解を起こすレベルに達する前に、細胞が比較的大
量の所望ポリペプチドを産生することができる。適切な
溶原菌の例には、pGH44を含有する株A4048の
ようなPlc Itsプラスミドを含有するものが含ま
れる。A4048は受託番号53217号でATCCに
寄託してある。pBR322とpBRMは各々ATCC
受託番号37017号及び37283号としてアメリカ
ンタイプカルチャーコレクションから入手でき、D4は
米国特許出願と関連してATCC受託番号31826号
として寄託した以外、全ての寄託は微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約に従った。ベクターは本
発明が関連する分野の当業者には公知の方法で形成でき
る。これらの方法については本明細書中に記載した種々
の文献中により詳細に記載されており、従来技術に関す
る完全な情報を提供するために本明細書中に参考として
それらの内容を包含する。現状の好ましいベクターの1
つは第2図に示す制限地図を有するpJH200であ
る。A1645株を用い、従来の形質転換法により大腸
菌(Escherichia coli)にこのベクタ
ーを導入した。得られた宿主ベクター系はATCC受託
番号第39783号として寄託してある。所望のポリペ
プチド例えばウシ成長ホルモンをコートする遺伝子をp
JH200に挿入できる。2番目の好ましいベクターp
RO211はpJH200のNde I部分消化物から
構築した。pRO211は第2図に示す制限地図を有す
る。このベクターをNde I及びHind IIIで
消化し、大フラグメントを単離し、これをpAL500
(ATCC受託番号39782号)から得たbGH c
DNAに連結することによりウシ成長ホルモンcDNA
をpRO211に挿入した。得られたプラスミドはpR
O12と表わす。これの制限地図も第2図に示す。プラ
スミドpRO12をPvu IIで部分消化し、続いて
Nde Iにより消化する。真正bGHのN末端の最初
の24個のアミノ酸をコードする合成DNAフラグメン
トを消化したpRO12に連結する。得られたプラスミ
ドはpSAL5200−6と称し、その制限地図を第3
図に示す。本発明のベクターはまた、ヒトスーパーオキ
シドジスムターゼ(SOD)あるいはその類似物(アナ
ログ)を生産するプラスミドを生成するように工学処理
し得る。λPLプロモーター及びCIIリボソーム結合
部位を有するpJH200(ATCC受託番号3978
3)のフラグメントを、第13図に示すように、単離し
た後ヒトSOD遺伝子を含むプラスミドpSOD NH
−10に挿入して、pSOD NH−550と称するプ
ラスミドを形成した。λPLプロモーター及びSOD遺
伝子を含むフラグメントをpSOD NH−550のA
lu Iによる消化後単離した。Bam HIリンカー
の添加及びその後のBam HIによる制限の後、フラ
グメントをpBRMの唯一のBam HI部位に挿入し
た。pBRMはATCC受託番号37283で寄託され
ている高コピー数プラスミドである。得られたプラスミ
ドをpSODα2と称する。その制限地図を第13図に
示した。このプラスミドは E.coli株A2097
中に入れてATCC受託番号39786で寄託されてい
る。プラスミドpSODα2(ATCC受託番号397
86)はCIIリボソーム結合部位を含んでいる。この
リボソーム結合部位を、pBLA11のEco RI−
Alu Iダイジェスト(消化物)から単離したβ−ラ
クタマーゼプロモーター及びシャイン−ダルガーノ(S
hine−Dalgarno)リボソーム結合部位を含
有するフラグメントにより置き換える。(プラスミドp
BLA11は第14図に示す制限地図を有するものであ
り、Escherichia coli株A1645中
に入れてATCC受託番号39788により寄託されて
いる。)CIIリボソーム結合部位を第14図に示すよ
うにプラスミドpSODα2から除去する。pSODα
2をEco RIにより部分的に制限しDNAポリメラ
ーゼI(Klenow)で充填し再連結すると、該プラ
スミド中に残る唯一のEco RI部位がCIIRBS
の5′末端となる。得られたpSODα13と称するプ
ラスミドをNde Iで消化し、DNAポリメラーゼI
(Klenow)で充填し、次にEco RIにより消
化する。大フラグメントを単離し、pBLA11より単
離されたβ−ラクタマーゼプロモーター及びリボソーム
結合部位を含むフラグメントに連結してプラスミドpS
OD β1を構築する。pSOD β1はアンピシリン
抵抗性遺伝子フラグメント(AmpR)の替りにテトラ
サイクリン抵抗性遺伝子フラグメント(TetR)を含
むように改変し得る。AmpRフラグメントをPst
I引き続きBam HI(部分的)による消化によりp
SODβ1から除去した。得られたプラスミドをDNA
ポリメラーゼI(Klenow)で充填した。別にTe
tR遺伝子フラグメントをpBR322のEco RI
−Ava Iダイジェストから単離し、充填し、上で充
填したプラスミドに連結した。(プラスミドpBR32
2は広く入手可能で、例えばアメリカンタイプカルチュ
アコレクションからATCC受託番号37017として
入手可能である。)得られたプラスミドをpSODβ1
T11と称する。その制限地図を第15図に示す。ヒト
スーパーオキシドジスムターゼを生産するのに使用し得
るもう1つのプラスミドをpSODβ1−BA2と称す
る。そのpSODα13からの構築を第17図に示す。
本発明のベクター、例えばpRO211はまたブタある
いはニワトリ成長ホルモンを生産するように処理するこ
ともできる。即ち第4図に示すように、ブタ成長ホルモ
ンcDNAをppGH−Nde I/RIのNde I
ダイジェストから単離した。得られたpGH遺伝子を含
むフラグメントをpRO211のNdeIダイジェスト
に連結した。得られたプラスミドはP3008と称し、
E.Coli株A2097中に入れてATCC受託番
号39804で寄託されている。本発明の他の実施態様
においては、第5図に示すようにpcGH−Nde I
/RIのNde I−Ban IIダイジェストから2
つのニワトリ成長ホルモンフラグメントを単離した。2
つのcGHフラグメントを、真正cGHのN末端の最初
の18個のアミノ酸をコードするリン酸化合成リンカー
に連結した。リンカーの配列は下記の通りである。
【化10】
得られたフラグメントを次にpRO211のNde I
ダイジェストに連結し、p5002と称するプラスミド
を形成した。その制限地図を第5図に示す。本発明のベ
クターはまた、ヒトアポリポプロテインEを生産するよ
うに工学処理することもできる。ヒトアポリポプロテイ
ンE(Apo E)遺伝子はプラスミドpApo E−
EX2からNde I消化により単離される。pApo
E−EX2は第18図に示す制限地図を有し、 E.
coli株A1645中に入れてATCC受託番号39
787で寄託されている。Apo E遺伝子(cDN
A)は種々のプラスミド中に配置し得る。好ましい具体
例はプラスミドpTV−188であり、その制限地図を
第18図に示す。pTV−188は、pApo E−E
X2から単離されたApo E遺伝子をプラスミドpS
ODβ1T11のStu Iダイジェストに連結するこ
とにより構築した。pTV−188はTetRフラグメ
ント、PLプロモータ配列、β−ラクタマーゼプロモー
ター及びシャイン−ダルガーノ配列を含む。このプラス
ミドはApo E融合プロテインを発現する。Apo
E遺伝子を含むプラスミドのもう1つの好ましい具体例
は第23図に示した制限地図を有するpSAL160−
5である。pSAL160−5はpTV104(2)
(ATCC受託番号39384)及びプラスミドpTV
−170(第20図参照)から構築した。Apo E遺
伝子はpTV−170から単離し、pTV104(2)
のPst I部位のヒト成長ホルモン遺伝子配列内に挿
入した。得られたプラスミドpSAL160−5はAm
pRフラグメント及びPLプロモーター配列を含む。現
状での好ましいベクターの一つは、第19図に示す制限
地図を有するp579である。このベクターは適当な
Escherichia coli株、例えばA163
7,A2602,A1563,A1645あるいはA2
097に、当業者にとっては公知の慣用の形質転換法に
より導入し得る。所望のポリペクチド、例えばブタ成長
ホルモンあるいはニワトリ成長ホルモンをコードした遺
伝子をp579に挿入し得る。ブタ成長ホルモンcDN
Aを、ベクターp579をNde Iにより消化し、こ
のオープンストランドをp3008(ATCC受託番号
39804)より得たpGH cDNAに連結すること
によって、p579に挿入した。得られたプラスミドを
p3009と称し、その制限地図を第11図に示す。ベ
クターp579をNde Iで消化し、このオープンス
トランドをp5002から得たcGH cDNAに連結
することによって、ニワトリ成長ホルモンcDNAをp
579に挿入した。得られたプラスミドをp5003と
称し、その制限地図を第12図に示す。p5003はE
scherichia coliA2097株中に入れ
てATCC受託番号39792で寄託されている。ヒト
アポリポプロテインE(Apo E3)産生遺伝子はお
そらくその最終産物のアミノ末端にアミノ酸メチオニン
が付加しているであろうが、これもp579に挿入し得
る。得られたpTV−170と称するプラスミドの構築
を第20図に示す。このプラスミドはpJH200(A
TCC受託番号39783)由来のCIIリボソーム結
合部位を有する。プラスミドpTV−170はApo
E遺伝子の両端を区切っているNdeI部位の一つを除
去することによって改変し得る。得られたプラスミドは
pTV−190と称し、第21図に示す。pTV−17
0はまた、CIIリボソーム結合部位をpBLA11
(ATCC受託番号No.39788)から単離された
β−ラクタマーゼプロモーター及びシャイン−ダルガー
ノリボソーム結合部位配列と置き替えることにより改変
し得る。得られたプラスミドはpTV−194と称し、
第22図に示した制限地図を有する。pTV−190
(第21図)はまた、ヒトApo E3のアナログを生
産するように改変することもでき、このアナログはその
アミノ末端において、成熟ヒトApo E3の配列に結
合した、ヒト成長ホルモンの14個のアミノ酸のアミノ
末端配列及びそれに続くメチオニンを有する。このプラ
スミドをpTV−214と称し、第24図に示した制限
地図を有する。Apo E3遺伝子を含むプラスミドの
もう一つの好ましい具体例は第25図に示した制限地図
を有するpTVR279−8である。pTVR279−
8はpTV190から構築されたpTV264−45か
ら構築される。プラスミドpTV190(第21図)を
Ava Iにより部分的に開裂し、DNAポリメラーゼ
Iのクレノウフラグメントを使用して“充填”し、再連
結する。得られたプラスミドはpTV264−45と称
し、遺伝子の3′末端においAva I部位を欠除して
いる。プラスミドpTV264−45をNde Iによ
り完全に消化し、下記の配列を有するリン酸化合成リン
カーに連結する。 得られたプラスミドはpTVR279−8と称しATC
Cに受託番号53216で寄託されている。本発明のベ
クターはまた、ヒト成長ホルモンを産生することができ
るプラスミドを形成するように工学処理することもでき
る。このようなプラスミドの1つの例はpTV300で
あり、第27図に示した制限地図を有している。pTV
300は、pTV18(1)をNde Iにより開裂
し、met14−hGH DNAを単離し、それをNd
e Iで開裂したp579(第19図)に連結すること
によって構築した。pTV18(1)は、1985年1
月23日公開のヨーロッパ特許出願公開No.0131
843A1号あるいは対応する1983年7月15日出
願のアメリカ特許出願514,188号(援用して本明
細書に包含する)に記載されているようにして得られ
る。本発明のベクターはまた、アミノ末端がアセチル化
されていないという点において天然のヒトSODと異な
っているヒトCu−Znスーパーオキシドジスムターゼ
(SOD)のアナログを産生するプラスミドを生成する
ように工学処理することもできる。このようなプラスミ
ドは第16図に従って構築され、pSODβ1TT−1
と称する。本発明のベクターは組換えウシ成長ホルモン
を産生するプラスミドを生成するように処理し得る。1
つの例として、真正pGHのフェニルアラニン形のアミ
ノ末端に付加されたアミノ酸配列met−asp−gl
nを有するbGHアナログの生産があり、このアナログ
はrec bGHとも称される。そのようなホルモンを
産生するプラスミドpGH44は第6図の図式に従って
構築されるものであり、A2097株に入れてATCC
受託番号39806で寄託されている。met−asp
−glnウシ成長ホルモンを生産するもう一つのプラス
ミドはp9200である。このプラスミドp9200は
pHG44(第6図)に似ているが、アンピシリン抵抗
性の替りにテトラサイクリン抵抗性を与える。p920
0の構築は第26図に示した。pHG44をCla I
及びPst Iにより開裂し、DNAポリメラーゼIの
クレノウフラグメントを使用して“充填”し、次いで大
DNAフラグメントを単離した。このフラグメントを、
pBR322をEcoRI及びAva Iにより開裂し
DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを使用し
て“充填”することにより単離したpBR322のテト
ラサイクリン抵抗性遺伝子を含むDNAフラグメントに
連結した。得られたプラスミドp9200はATCCに
受託番号53215で寄託されている。もう一つの例
は、天然bGHのフェニルアラニン形のアミノ末端につ
け加えられたアミノ酸メチオニンを有するbGHアナロ
グの生産である。このようなホルモンを産生するプラス
ミドpSAL5600−1は第10図に示したように構
築した。プラスミドp7200−22もこのようなホル
モンを産生する。このプラスミドは第7図に示した制限
地図を有する。現状で好ましいベクターの一つは、Cl
a I部位にクローニングされたcI434フラグメン
トを含有するDNA配列を持ったベクターp579であ
る。p579は第19図に示した制限地図を有する。天
然のウシ成長ホルモンのフェニルアラニン形のアミノ末
端につけ加えられたmet−asp−glnのアミノ酸
配列を有するウシ成長ホルモンのアナログ(rec−ウ
シ成長ホルモンとも称する)を発現するプラスミドを構
築した。このようなプラスミドの1つはpHG50であ
り、第6図に示した制限地図を有する。このプラスミド
はA1645株(λi434cI−mini Tn 1
0)中に入れてATCC受託番号37805でアメリカ
ンタイプカルチュアコレクションに寄託されている。も
う一つのこのようなプラスミドはpSAL−210/4
であり、第9図に示した制限地図を有する。現状での好
ましいベクターの1つはプラスミドp8300−10A
からmet−phe bGHを除去することによって得
られる。このプラスミドp8300−10Aは第7図に
示した制限地図を有し、A2097株中に入れてATC
C受託番号39785でアメリカンタイプカルチュアコ
レクションに寄託されている。現状でのもう一つの好ま
しいベクターは、プラスミドpSAL−170/10か
らrec bGH遺伝子を除去して得られる。このプラ
スミドpSAL−170/10の制限地図を第8図に示
した。現状での好ましい第3のベクターはプラスミドp
SAL−210/4からrec bGH遺伝子を除去し
て得られる。このプラスミドpSAL−210/4の制
限地図を第9図に示した。本発明のベクターは、宿主に
導入することによりウシ成長ホルモンのアナログを産生
するプラスミドを生成するようにも工学処理し得る。p
8300−10A(ATCC受託番号39785)はこ
のようなプラスミドの1例であるが、第7図に示したよ
うにして構築した。それにより生産されたこのアナログ
は、天然bGHのフェニルアラニン形のアミノ末端につ
け加えられたメチオニン残基を有する。他のプラスミド
も、天然bGHのフェニルアラニン形のN末端につけ加
えられたmet−asp−glnのアミノ酸配列を有す
るアナログを産生する。それ等のプラスミドにはpSA
L−130/4(第8図)、pSAL−170/10
(第8図)及びpSAL−210/4(第9図)が包含
される。同じ方法により、プラスミドの第2制限酵素部
位において所望のポリペプチドをコードした遺伝子に置
きかえることにより他のプラスミドを調製し得る。種々
の宿主ベクター系としては、 E.coliA163
7,A1645,A2606,A2097あるいはプラ
スミドがcI434フラグメントを含んでいない場合は
A1563及びプラスミドがcI434フラグメントを
含む場合はA1645株(i434cI−mini T
n 10)が包含される。本発明の宿主ベクター系とし
ては、例えばA4200,A4255のような原栄養体
E.coli及び例えばA4346のようなビオチン
非依存宿主ベクター系が包含される。本発明の溶解性宿
主ベクター系としては宿主がA4048、特にA311
1であるものが包含される。本明細書に記載する宿主ベ
クター系及びプラスミドは、例えばウシ,ブタ,ニワト
リ及びヒトの成長ホルモン、ヒトスーパーオキシドジス
ムターゼ及びヒトアポリポプロテインEのような異なる
ポリペプチドを生産するのに使用できる。そうするため
には宿主ベクター系をポリペプチドを生産し得る適当条
件下で成長させ、次いでポリペプチドを回収する。宿主
ベクター系の至適生育条件は約42℃に適当な時間を保
つことである。望ましくは、ヒトアポリポプロテインE
を生産しようとするもの以外の全ての宿主ベクター系に
対しては42℃で生育させる時間は約1〜5時間であ
る。ヒトアポリポプロテインEを生産しようとする宿主
ベクター系の場合の生育時間は望ましくは約15分であ
る。至適培地は加水分解物を含む。上記の方法により多
数のbGH,pGH,cGH,hGH,Apo E及び
SODアナログを調製した。N末端における変化以外は
天然Apo Eのものと同一のアミノ酸配列を有するA
po Eアナログを調製した。例としては下記のものが
ある。 1)天然ヒトアポリポプロテインEのN末端に付け加え
られたアミノ酸メチオニン、 2)ヒトスーパーオキシドジスムターゼのN末端の42
のアミノ酸配列、次いでメチオニンをN末端に付加され
た天然ヒトアポリポプロテインE、 3)N末端の11個のアミノ酸を取り除き、成熟ヒト成
長ホルモンのN末端の45個のアミノ酸配列とそれに続
くメチオニンに置き換えた天然ヒトアポリポプロテイ
ン、 4)ヒト成長ホルモンのN末端の14個のアミノ酸、続
いてメチオニンをN末端に結合した天然ヒトアポリポプ
テインEのアミノ酸配列、及び 5)N末端にmet−leu−leu−metのアミノ
酸配列を結合した天然ヒトアポリポプロテインE3。 調製したpGHアナログでは天然ブタ成長ホルモンのN
末端にアミノ酸メチオニンが結合していた。天然ニワト
リ成長ホルモンのN末端にアミノ酸メチオニンが結合し
たcGHアナログを調製した。天然ヒト成長ホルモンの
最初の13個のアミノ酸が欠失されているhGHアナロ
グ、即ちmet14hGHを調製した。N末端における
変化以外は天然SODと同一のアミノ酸配列を有するS
ODアナログを調製した。例としては下記のものがあ
る。 1)アセチル化されていない天然ヒトSOD及び 2)アセチル化及びグリコシル化されていない天然ヒト
SOD。これ等のSODアナログは陽子(プロトン)の
存在下で超酸化物(スーパーオキシド)アニオンの不均
化(dismutation)あるいは等価(univ
alent)還元を触媒して下記式に従い過酸化水素を
生成する。
ダイジェストに連結し、p5002と称するプラスミド
を形成した。その制限地図を第5図に示す。本発明のベ
クターはまた、ヒトアポリポプロテインEを生産するよ
うに工学処理することもできる。ヒトアポリポプロテイ
ンE(Apo E)遺伝子はプラスミドpApo E−
EX2からNde I消化により単離される。pApo
E−EX2は第18図に示す制限地図を有し、 E.
coli株A1645中に入れてATCC受託番号39
787で寄託されている。Apo E遺伝子(cDN
A)は種々のプラスミド中に配置し得る。好ましい具体
例はプラスミドpTV−188であり、その制限地図を
第18図に示す。pTV−188は、pApo E−E
X2から単離されたApo E遺伝子をプラスミドpS
ODβ1T11のStu Iダイジェストに連結するこ
とにより構築した。pTV−188はTetRフラグメ
ント、PLプロモータ配列、β−ラクタマーゼプロモー
ター及びシャイン−ダルガーノ配列を含む。このプラス
ミドはApo E融合プロテインを発現する。Apo
E遺伝子を含むプラスミドのもう1つの好ましい具体例
は第23図に示した制限地図を有するpSAL160−
5である。pSAL160−5はpTV104(2)
(ATCC受託番号39384)及びプラスミドpTV
−170(第20図参照)から構築した。Apo E遺
伝子はpTV−170から単離し、pTV104(2)
のPst I部位のヒト成長ホルモン遺伝子配列内に挿
入した。得られたプラスミドpSAL160−5はAm
pRフラグメント及びPLプロモーター配列を含む。現
状での好ましいベクターの一つは、第19図に示す制限
地図を有するp579である。このベクターは適当な
Escherichia coli株、例えばA163
7,A2602,A1563,A1645あるいはA2
097に、当業者にとっては公知の慣用の形質転換法に
より導入し得る。所望のポリペクチド、例えばブタ成長
ホルモンあるいはニワトリ成長ホルモンをコードした遺
伝子をp579に挿入し得る。ブタ成長ホルモンcDN
Aを、ベクターp579をNde Iにより消化し、こ
のオープンストランドをp3008(ATCC受託番号
39804)より得たpGH cDNAに連結すること
によって、p579に挿入した。得られたプラスミドを
p3009と称し、その制限地図を第11図に示す。ベ
クターp579をNde Iで消化し、このオープンス
トランドをp5002から得たcGH cDNAに連結
することによって、ニワトリ成長ホルモンcDNAをp
579に挿入した。得られたプラスミドをp5003と
称し、その制限地図を第12図に示す。p5003はE
scherichia coliA2097株中に入れ
てATCC受託番号39792で寄託されている。ヒト
アポリポプロテインE(Apo E3)産生遺伝子はお
そらくその最終産物のアミノ末端にアミノ酸メチオニン
が付加しているであろうが、これもp579に挿入し得
る。得られたpTV−170と称するプラスミドの構築
を第20図に示す。このプラスミドはpJH200(A
TCC受託番号39783)由来のCIIリボソーム結
合部位を有する。プラスミドpTV−170はApo
E遺伝子の両端を区切っているNdeI部位の一つを除
去することによって改変し得る。得られたプラスミドは
pTV−190と称し、第21図に示す。pTV−17
0はまた、CIIリボソーム結合部位をpBLA11
(ATCC受託番号No.39788)から単離された
β−ラクタマーゼプロモーター及びシャイン−ダルガー
ノリボソーム結合部位配列と置き替えることにより改変
し得る。得られたプラスミドはpTV−194と称し、
第22図に示した制限地図を有する。pTV−190
(第21図)はまた、ヒトApo E3のアナログを生
産するように改変することもでき、このアナログはその
アミノ末端において、成熟ヒトApo E3の配列に結
合した、ヒト成長ホルモンの14個のアミノ酸のアミノ
末端配列及びそれに続くメチオニンを有する。このプラ
スミドをpTV−214と称し、第24図に示した制限
地図を有する。Apo E3遺伝子を含むプラスミドの
もう一つの好ましい具体例は第25図に示した制限地図
を有するpTVR279−8である。pTVR279−
8はpTV190から構築されたpTV264−45か
ら構築される。プラスミドpTV190(第21図)を
Ava Iにより部分的に開裂し、DNAポリメラーゼ
Iのクレノウフラグメントを使用して“充填”し、再連
結する。得られたプラスミドはpTV264−45と称
し、遺伝子の3′末端においAva I部位を欠除して
いる。プラスミドpTV264−45をNde Iによ
り完全に消化し、下記の配列を有するリン酸化合成リン
カーに連結する。 得られたプラスミドはpTVR279−8と称しATC
Cに受託番号53216で寄託されている。本発明のベ
クターはまた、ヒト成長ホルモンを産生することができ
るプラスミドを形成するように工学処理することもでき
る。このようなプラスミドの1つの例はpTV300で
あり、第27図に示した制限地図を有している。pTV
300は、pTV18(1)をNde Iにより開裂
し、met14−hGH DNAを単離し、それをNd
e Iで開裂したp579(第19図)に連結すること
によって構築した。pTV18(1)は、1985年1
月23日公開のヨーロッパ特許出願公開No.0131
843A1号あるいは対応する1983年7月15日出
願のアメリカ特許出願514,188号(援用して本明
細書に包含する)に記載されているようにして得られ
る。本発明のベクターはまた、アミノ末端がアセチル化
されていないという点において天然のヒトSODと異な
っているヒトCu−Znスーパーオキシドジスムターゼ
(SOD)のアナログを産生するプラスミドを生成する
ように工学処理することもできる。このようなプラスミ
ドは第16図に従って構築され、pSODβ1TT−1
と称する。本発明のベクターは組換えウシ成長ホルモン
を産生するプラスミドを生成するように処理し得る。1
つの例として、真正pGHのフェニルアラニン形のアミ
ノ末端に付加されたアミノ酸配列met−asp−gl
nを有するbGHアナログの生産があり、このアナログ
はrec bGHとも称される。そのようなホルモンを
産生するプラスミドpGH44は第6図の図式に従って
構築されるものであり、A2097株に入れてATCC
受託番号39806で寄託されている。met−asp
−glnウシ成長ホルモンを生産するもう一つのプラス
ミドはp9200である。このプラスミドp9200は
pHG44(第6図)に似ているが、アンピシリン抵抗
性の替りにテトラサイクリン抵抗性を与える。p920
0の構築は第26図に示した。pHG44をCla I
及びPst Iにより開裂し、DNAポリメラーゼIの
クレノウフラグメントを使用して“充填”し、次いで大
DNAフラグメントを単離した。このフラグメントを、
pBR322をEcoRI及びAva Iにより開裂し
DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを使用し
て“充填”することにより単離したpBR322のテト
ラサイクリン抵抗性遺伝子を含むDNAフラグメントに
連結した。得られたプラスミドp9200はATCCに
受託番号53215で寄託されている。もう一つの例
は、天然bGHのフェニルアラニン形のアミノ末端につ
け加えられたアミノ酸メチオニンを有するbGHアナロ
グの生産である。このようなホルモンを産生するプラス
ミドpSAL5600−1は第10図に示したように構
築した。プラスミドp7200−22もこのようなホル
モンを産生する。このプラスミドは第7図に示した制限
地図を有する。現状で好ましいベクターの一つは、Cl
a I部位にクローニングされたcI434フラグメン
トを含有するDNA配列を持ったベクターp579であ
る。p579は第19図に示した制限地図を有する。天
然のウシ成長ホルモンのフェニルアラニン形のアミノ末
端につけ加えられたmet−asp−glnのアミノ酸
配列を有するウシ成長ホルモンのアナログ(rec−ウ
シ成長ホルモンとも称する)を発現するプラスミドを構
築した。このようなプラスミドの1つはpHG50であ
り、第6図に示した制限地図を有する。このプラスミド
はA1645株(λi434cI−mini Tn 1
0)中に入れてATCC受託番号37805でアメリカ
ンタイプカルチュアコレクションに寄託されている。も
う一つのこのようなプラスミドはpSAL−210/4
であり、第9図に示した制限地図を有する。現状での好
ましいベクターの1つはプラスミドp8300−10A
からmet−phe bGHを除去することによって得
られる。このプラスミドp8300−10Aは第7図に
示した制限地図を有し、A2097株中に入れてATC
C受託番号39785でアメリカンタイプカルチュアコ
レクションに寄託されている。現状でのもう一つの好ま
しいベクターは、プラスミドpSAL−170/10か
らrec bGH遺伝子を除去して得られる。このプラ
スミドpSAL−170/10の制限地図を第8図に示
した。現状での好ましい第3のベクターはプラスミドp
SAL−210/4からrec bGH遺伝子を除去し
て得られる。このプラスミドpSAL−210/4の制
限地図を第9図に示した。本発明のベクターは、宿主に
導入することによりウシ成長ホルモンのアナログを産生
するプラスミドを生成するようにも工学処理し得る。p
8300−10A(ATCC受託番号39785)はこ
のようなプラスミドの1例であるが、第7図に示したよ
うにして構築した。それにより生産されたこのアナログ
は、天然bGHのフェニルアラニン形のアミノ末端につ
け加えられたメチオニン残基を有する。他のプラスミド
も、天然bGHのフェニルアラニン形のN末端につけ加
えられたmet−asp−glnのアミノ酸配列を有す
るアナログを産生する。それ等のプラスミドにはpSA
L−130/4(第8図)、pSAL−170/10
(第8図)及びpSAL−210/4(第9図)が包含
される。同じ方法により、プラスミドの第2制限酵素部
位において所望のポリペプチドをコードした遺伝子に置
きかえることにより他のプラスミドを調製し得る。種々
の宿主ベクター系としては、 E.coliA163
7,A1645,A2606,A2097あるいはプラ
スミドがcI434フラグメントを含んでいない場合は
A1563及びプラスミドがcI434フラグメントを
含む場合はA1645株(i434cI−mini T
n 10)が包含される。本発明の宿主ベクター系とし
ては、例えばA4200,A4255のような原栄養体
E.coli及び例えばA4346のようなビオチン
非依存宿主ベクター系が包含される。本発明の溶解性宿
主ベクター系としては宿主がA4048、特にA311
1であるものが包含される。本明細書に記載する宿主ベ
クター系及びプラスミドは、例えばウシ,ブタ,ニワト
リ及びヒトの成長ホルモン、ヒトスーパーオキシドジス
ムターゼ及びヒトアポリポプロテインEのような異なる
ポリペプチドを生産するのに使用できる。そうするため
には宿主ベクター系をポリペプチドを生産し得る適当条
件下で成長させ、次いでポリペプチドを回収する。宿主
ベクター系の至適生育条件は約42℃に適当な時間を保
つことである。望ましくは、ヒトアポリポプロテインE
を生産しようとするもの以外の全ての宿主ベクター系に
対しては42℃で生育させる時間は約1〜5時間であ
る。ヒトアポリポプロテインEを生産しようとする宿主
ベクター系の場合の生育時間は望ましくは約15分であ
る。至適培地は加水分解物を含む。上記の方法により多
数のbGH,pGH,cGH,hGH,Apo E及び
SODアナログを調製した。N末端における変化以外は
天然Apo Eのものと同一のアミノ酸配列を有するA
po Eアナログを調製した。例としては下記のものが
ある。 1)天然ヒトアポリポプロテインEのN末端に付け加え
られたアミノ酸メチオニン、 2)ヒトスーパーオキシドジスムターゼのN末端の42
のアミノ酸配列、次いでメチオニンをN末端に付加され
た天然ヒトアポリポプロテインE、 3)N末端の11個のアミノ酸を取り除き、成熟ヒト成
長ホルモンのN末端の45個のアミノ酸配列とそれに続
くメチオニンに置き換えた天然ヒトアポリポプロテイ
ン、 4)ヒト成長ホルモンのN末端の14個のアミノ酸、続
いてメチオニンをN末端に結合した天然ヒトアポリポプ
テインEのアミノ酸配列、及び 5)N末端にmet−leu−leu−metのアミノ
酸配列を結合した天然ヒトアポリポプロテインE3。 調製したpGHアナログでは天然ブタ成長ホルモンのN
末端にアミノ酸メチオニンが結合していた。天然ニワト
リ成長ホルモンのN末端にアミノ酸メチオニンが結合し
たcGHアナログを調製した。天然ヒト成長ホルモンの
最初の13個のアミノ酸が欠失されているhGHアナロ
グ、即ちmet14hGHを調製した。N末端における
変化以外は天然SODと同一のアミノ酸配列を有するS
ODアナログを調製した。例としては下記のものがあ
る。 1)アセチル化されていない天然ヒトSOD及び 2)アセチル化及びグリコシル化されていない天然ヒト
SOD。これ等のSODアナログは陽子(プロトン)の
存在下で超酸化物(スーパーオキシド)アニオンの不均
化(dismutation)あるいは等価(univ
alent)還元を触媒して下記式に従い過酸化水素を
生成する。
【化11】
bGH,cGHあるいはpGHアナログの一つ以上の有
効量及び適当なキャリアーを含有する獣医学的組成物を
調製し得る。キャリアーは当業者にとって公知のもので
ある。アナログは直接、あるいは組成物の形状で、ミル
クや肉の生産を増加させるためにウシあるいはブタに投
与したり、肉の生産を増加させるためにニワトリに投与
し得る。Apo EあるいはhGHのアナログの一つ以
上の有効量及び適当なキャリアーを含有する薬剤(医
薬)組成物を調製し得る。キャリアーは当業者にとって
公知のものである。アナログは直接あるいは組成物の形
状で、例えばApo Eの場合はApoE生産不全ある
いは動脈硬化(atherioscelerosis)
の患者の治療のために、hGHの場合はhGH生産不全
の患者の治療のためにヒトに投与し得る。SODあるい
は一種以上のSODアナログの有効量及び適当なキャリ
アーを含有する獣医学的及び薬剤組成物も調製し得る。
キャリアーは当業者にとって公知のものである。SOD
あるいはアナログは直接あるいは組成物の形状で、例え
ば炎症羅患々者の治療や、全体的虚血症(globol
ischemia)あるいは腎移植のような臓器移植
の後の再灌注における酸素−フリーラジカルによる損傷
の軽減のために、動物あるいはヒトに投与できる。SO
Dあるいはアナログはまた、直接あるいは組成物の形状
で、例えば切除の後の灌注におけるフリーラジカル酸素
による単離臓器の損傷を軽減し、角膜のような臓器の生
存時間(survival time)を延長するため
に、単離臓器灌注媒体に加えることもできる。さらには
SODあるいはアナログは神経学的損傷の軽減にも使用
できる。酵素的活性真核生物スーパーオキシドジスムタ
ーゼ(SOD)またはそのアナログを細菌細胞中で産生
する方法を発見した。このバクテリア(細菌)細胞がス
ーパーオキシドジスムターゼあるいはアナログをコード
したDNA配列を含有しておりかつ発現し得る。該方法
はそのバクテリア細胞を適当な条件下、適当な生産培地
中に生育維持することから成る。生産培地中には、濃度
が約2ppm以上となるようなCu++量を添加する。
バクテリア細胞は、組換えDNA技術により真核細胞ス
ーパーオキシドジスムターゼをコードしたDNA配列を
導入できるものならば何でもよい。該バクテリアはこの
DNA配列を発現し、タンパク生成物を生産できなけれ
ばならない。バクテリアの種及び株により、至適条件及
び生産培地は異なる。バクテリア細胞は例えばプラスミ
ドのようなベクターDNA分子中に、スーパーオキシド
ジスムターゼあるいはアナログをコードするDNA配列
を含有してもよい。ベクターあるいはプラスミドは、組
換えDNA技術によりSODをコードする配列を分子内
の適当な位置に取り組み込むように構築される。本発明
の好ましい具体例においてはバクテリア細胞はEsch
erichiacoli細胞である。 E.coliの
好ましい株はA1645株である。本発明の E.co
li細胞はSODあるいはそのアナログをコードするプ
ラスミドを含有する。本発明の好ましい具体例において
はSODはヒトスーパーオキシドジスムターゼあるいは
そのアナログである。本発明の好ましい具体例は、プラ
スミドpSODβ1,pSODα2,pSODβT1
1,pSODβ1−BA2あるいはpSODβ1TT1
を含有するE.coli株に関する。これ等のプラスミ
ドの構築方法は前記図面の説明において記載し、プラス
ミド自体は後記実施例3に記載した。これ等のプラスミ
ドは通常の当業者であれば利用可能な出発物質から構築
し得る。真核細胞スーパーオキシドジスムターゼをコー
ドするプラスミドを構築するのに有用な種々のプラスミ
ドを含有するE.coli株は、特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従
い、アメリカンタイプカルチュアコレクション(ロック
ビル、メリーランド20852)に寄託してある。これ
等のプラスミドのATCC受託番号は、pBRMがAT
CC37283、pSODα2がATCC39786、
pBR322がATCC37017、pBLA11がA
TCC39788、pJH200がATCC3978
3、pPSIがATCC39807である。本発明の1
つの特定具体例においては、プラスミドpSODα2を
含有するE.coliA2097株により酵素的活性ヒ
トスーパーオキシドジスムターゼアナログを産生する。
この細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクションに
寄託番号39786で寄託されている。バクテリア細胞
の適当な産生培地は、例えばカゼイン加水分解物あるい
はLB(Luria Broth)培地のような許容可
能成長培地であればどのようなものでもよい。適当な生
育条件はE.coli株及びそれに含まれるプラスミド
により変化し、例えばプラスミドpSODβ1T11を
含有するE.coliA1645は42℃で誘導し、そ
の温度で約1〜5時間維持する。接種物の生育、生産段
階前での培養の所望密度までの生育及び生産期間中の培
養の維持に対する温度、時間、撹拌及び通気の至適条件
は後記実施例26に記載した。酵素的活性SODの生成
に必要なCu++イオンの培地中の濃度は、使用培地の
タイプにより変化する。カゼイン加水分解物培地の場
合、200ppmのCu++イオン濃度が有効であるこ
とが判明した。LB培地の場合、Cu++濃度は75p
pmが有効であることが判明した。全ての複合型の成長
培地においては、培地中のCu++濃度が約50〜25
0ppmであることが好ましい。ほとんどの真核細胞ス
ーパーオキシドジスムターゼはCu/Zn金属タンパク
質である。本発明の一つの特定具体例においては、培地
中のZn++濃度が約2ppm以上となるように添加物
(supplement)としてZn++を加える。本
発明の好ましい具体例においては、Cu++及びZn
++の濃度は0.8g/lのCuSO4・5H2O及び
10mg/lのZnSO4・7H2Oを加えることによ
り補給する。適切な保存、培養、接種及び生産培地の特
定成分は変化し得るが、当業者にとっては公知のもので
ある。至適培地の特定例は実施例26に記載した。本発
明は、本発明の方法に従って生成したバクテリア細胞中
の生成された酵素的活性真核細胞SODあるいはそのア
ナログの回収方法にも係る。培養物を急冷した後、バク
テリア細胞を先ず生産培地から単離する。細胞の単離
は、遠心分離や濾過のように細胞を破壊しない方法であ
れば何によっても行なえる。次に細胞をpH約7.0〜
約8.0の適当な溶液に懸濁する。pHが約7.8の5
0mMリン酸ナトリウム溶液を使用することが好まし
い。ブレンダーあるいは細胞破砕機のような適当な手段
により細胞壁を破棄し、得られた均一懸濁液を至適条件
下で超音波処理する。超音波処理は連続流型セルを用い
て行なう。得られた超音波処理溶液を適当な条件下で遠
心分離し、細胞破片と上清タンパク質溶液を分離する。
次に上清液を約2時間、約65℃に加熱し、冷却して先
の遠心分離ステップと同じ条件において遠心分離して上
清液として清澄タンパク質溶液を得る。次に上清液を適
当な容量に濃縮する。例えば分子量10.000カット
オフの限外濾過装置を用いて11に濃縮する。次に濃縮
タンパク質溶液を、pHを約7.0〜約8.0に平衡さ
せた適当なアニオン交換物質上のイオン交換クロマトグ
ラフィーにかける。pH約7.8の150mMリン酸ナ
トリウムバッファーにより平衡化したDEAE−セファ
セル(Sephacel)カラム上でクロマトグラフィ
ーを行なうことが好ましい。得られたスーパーオキシド
ジスムターゼあるいはアナログを含有する通過溶液を収
集し、適当な容量に濃縮してpH約7.0〜約8.0の
バッファー溶液に対して透析する。この操作は限外濾過
装置中でpH約7.8の20mMトリスーHCl溶液に
対して行うことができる。この濃縮溶液を次に、pH約
7.0〜約8.0に平衡化した適当なアニオン交換物質
上のイオン交換クロマトグラフィーにかける。pH約
7.8の20mMトリス−HClにより平衡化したQA
E−セファロースカラムが適当である。アニオン交換物
質に結合したタンパク質を、例えばpH7.8の20m
Mトリス−HCl中の0〜200mM NaClのよう
な適当な塩勾配にかける。得られたSODあるいはアナ
ログを含有するフラクション(画分)を回収し、例えば
限外濾過装置により濃縮し、蒸留水に対して透析し、適
当なバッファーによりpHを約4.0〜約5.0に調整
する。好ましい具体例においては、対象溶液はpH約
4.8の1M酢酸ナトリウムを加えて100mM酢酸ナ
トリウム溶液とした。この緩衝した溶液を今度はカチオ
ン交換物質のイオン交換クロマトグラフィーにかける。
pH約4.7の100mM酢酸ナトリウムバッファーに
より平衡化したCM−セファロースカラムが適当であ
る。カチオン交換物質に結合したタンパク質を、例えば
pH4.7の100mM酢酸ナトリウム中の100〜5
00mMNaClのような適当な塩勾配にかけ、得られ
る精製SODあるいはアナログを含有するフラクション
を回収する。精製SODを含有するフラクションは例え
ば限外濾過によって濃縮しかつ貯蔵のために凍結乾燥を
行なってもよい。本発明はまた、本発明の方法により生
産及び精製された精製酵素的活性真核細胞スーパーオキ
シドジスムターゼあるいはそのアナログにも係る。本発
明の好ましい具体例は、本発明の方法により調製及び精
製された精製酵素的活性ヒトスーパーオキシドジスムタ
ーゼに係る。
効量及び適当なキャリアーを含有する獣医学的組成物を
調製し得る。キャリアーは当業者にとって公知のもので
ある。アナログは直接、あるいは組成物の形状で、ミル
クや肉の生産を増加させるためにウシあるいはブタに投
与したり、肉の生産を増加させるためにニワトリに投与
し得る。Apo EあるいはhGHのアナログの一つ以
上の有効量及び適当なキャリアーを含有する薬剤(医
薬)組成物を調製し得る。キャリアーは当業者にとって
公知のものである。アナログは直接あるいは組成物の形
状で、例えばApo Eの場合はApoE生産不全ある
いは動脈硬化(atherioscelerosis)
の患者の治療のために、hGHの場合はhGH生産不全
の患者の治療のためにヒトに投与し得る。SODあるい
は一種以上のSODアナログの有効量及び適当なキャリ
アーを含有する獣医学的及び薬剤組成物も調製し得る。
キャリアーは当業者にとって公知のものである。SOD
あるいはアナログは直接あるいは組成物の形状で、例え
ば炎症羅患々者の治療や、全体的虚血症(globol
ischemia)あるいは腎移植のような臓器移植
の後の再灌注における酸素−フリーラジカルによる損傷
の軽減のために、動物あるいはヒトに投与できる。SO
Dあるいはアナログはまた、直接あるいは組成物の形状
で、例えば切除の後の灌注におけるフリーラジカル酸素
による単離臓器の損傷を軽減し、角膜のような臓器の生
存時間(survival time)を延長するため
に、単離臓器灌注媒体に加えることもできる。さらには
SODあるいはアナログは神経学的損傷の軽減にも使用
できる。酵素的活性真核生物スーパーオキシドジスムタ
ーゼ(SOD)またはそのアナログを細菌細胞中で産生
する方法を発見した。このバクテリア(細菌)細胞がス
ーパーオキシドジスムターゼあるいはアナログをコード
したDNA配列を含有しておりかつ発現し得る。該方法
はそのバクテリア細胞を適当な条件下、適当な生産培地
中に生育維持することから成る。生産培地中には、濃度
が約2ppm以上となるようなCu++量を添加する。
バクテリア細胞は、組換えDNA技術により真核細胞ス
ーパーオキシドジスムターゼをコードしたDNA配列を
導入できるものならば何でもよい。該バクテリアはこの
DNA配列を発現し、タンパク生成物を生産できなけれ
ばならない。バクテリアの種及び株により、至適条件及
び生産培地は異なる。バクテリア細胞は例えばプラスミ
ドのようなベクターDNA分子中に、スーパーオキシド
ジスムターゼあるいはアナログをコードするDNA配列
を含有してもよい。ベクターあるいはプラスミドは、組
換えDNA技術によりSODをコードする配列を分子内
の適当な位置に取り組み込むように構築される。本発明
の好ましい具体例においてはバクテリア細胞はEsch
erichiacoli細胞である。 E.coliの
好ましい株はA1645株である。本発明の E.co
li細胞はSODあるいはそのアナログをコードするプ
ラスミドを含有する。本発明の好ましい具体例において
はSODはヒトスーパーオキシドジスムターゼあるいは
そのアナログである。本発明の好ましい具体例は、プラ
スミドpSODβ1,pSODα2,pSODβT1
1,pSODβ1−BA2あるいはpSODβ1TT1
を含有するE.coli株に関する。これ等のプラスミ
ドの構築方法は前記図面の説明において記載し、プラス
ミド自体は後記実施例3に記載した。これ等のプラスミ
ドは通常の当業者であれば利用可能な出発物質から構築
し得る。真核細胞スーパーオキシドジスムターゼをコー
ドするプラスミドを構築するのに有用な種々のプラスミ
ドを含有するE.coli株は、特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従
い、アメリカンタイプカルチュアコレクション(ロック
ビル、メリーランド20852)に寄託してある。これ
等のプラスミドのATCC受託番号は、pBRMがAT
CC37283、pSODα2がATCC39786、
pBR322がATCC37017、pBLA11がA
TCC39788、pJH200がATCC3978
3、pPSIがATCC39807である。本発明の1
つの特定具体例においては、プラスミドpSODα2を
含有するE.coliA2097株により酵素的活性ヒ
トスーパーオキシドジスムターゼアナログを産生する。
この細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクションに
寄託番号39786で寄託されている。バクテリア細胞
の適当な産生培地は、例えばカゼイン加水分解物あるい
はLB(Luria Broth)培地のような許容可
能成長培地であればどのようなものでもよい。適当な生
育条件はE.coli株及びそれに含まれるプラスミド
により変化し、例えばプラスミドpSODβ1T11を
含有するE.coliA1645は42℃で誘導し、そ
の温度で約1〜5時間維持する。接種物の生育、生産段
階前での培養の所望密度までの生育及び生産期間中の培
養の維持に対する温度、時間、撹拌及び通気の至適条件
は後記実施例26に記載した。酵素的活性SODの生成
に必要なCu++イオンの培地中の濃度は、使用培地の
タイプにより変化する。カゼイン加水分解物培地の場
合、200ppmのCu++イオン濃度が有効であるこ
とが判明した。LB培地の場合、Cu++濃度は75p
pmが有効であることが判明した。全ての複合型の成長
培地においては、培地中のCu++濃度が約50〜25
0ppmであることが好ましい。ほとんどの真核細胞ス
ーパーオキシドジスムターゼはCu/Zn金属タンパク
質である。本発明の一つの特定具体例においては、培地
中のZn++濃度が約2ppm以上となるように添加物
(supplement)としてZn++を加える。本
発明の好ましい具体例においては、Cu++及びZn
++の濃度は0.8g/lのCuSO4・5H2O及び
10mg/lのZnSO4・7H2Oを加えることによ
り補給する。適切な保存、培養、接種及び生産培地の特
定成分は変化し得るが、当業者にとっては公知のもので
ある。至適培地の特定例は実施例26に記載した。本発
明は、本発明の方法に従って生成したバクテリア細胞中
の生成された酵素的活性真核細胞SODあるいはそのア
ナログの回収方法にも係る。培養物を急冷した後、バク
テリア細胞を先ず生産培地から単離する。細胞の単離
は、遠心分離や濾過のように細胞を破壊しない方法であ
れば何によっても行なえる。次に細胞をpH約7.0〜
約8.0の適当な溶液に懸濁する。pHが約7.8の5
0mMリン酸ナトリウム溶液を使用することが好まし
い。ブレンダーあるいは細胞破砕機のような適当な手段
により細胞壁を破棄し、得られた均一懸濁液を至適条件
下で超音波処理する。超音波処理は連続流型セルを用い
て行なう。得られた超音波処理溶液を適当な条件下で遠
心分離し、細胞破片と上清タンパク質溶液を分離する。
次に上清液を約2時間、約65℃に加熱し、冷却して先
の遠心分離ステップと同じ条件において遠心分離して上
清液として清澄タンパク質溶液を得る。次に上清液を適
当な容量に濃縮する。例えば分子量10.000カット
オフの限外濾過装置を用いて11に濃縮する。次に濃縮
タンパク質溶液を、pHを約7.0〜約8.0に平衡さ
せた適当なアニオン交換物質上のイオン交換クロマトグ
ラフィーにかける。pH約7.8の150mMリン酸ナ
トリウムバッファーにより平衡化したDEAE−セファ
セル(Sephacel)カラム上でクロマトグラフィ
ーを行なうことが好ましい。得られたスーパーオキシド
ジスムターゼあるいはアナログを含有する通過溶液を収
集し、適当な容量に濃縮してpH約7.0〜約8.0の
バッファー溶液に対して透析する。この操作は限外濾過
装置中でpH約7.8の20mMトリスーHCl溶液に
対して行うことができる。この濃縮溶液を次に、pH約
7.0〜約8.0に平衡化した適当なアニオン交換物質
上のイオン交換クロマトグラフィーにかける。pH約
7.8の20mMトリス−HClにより平衡化したQA
E−セファロースカラムが適当である。アニオン交換物
質に結合したタンパク質を、例えばpH7.8の20m
Mトリス−HCl中の0〜200mM NaClのよう
な適当な塩勾配にかける。得られたSODあるいはアナ
ログを含有するフラクション(画分)を回収し、例えば
限外濾過装置により濃縮し、蒸留水に対して透析し、適
当なバッファーによりpHを約4.0〜約5.0に調整
する。好ましい具体例においては、対象溶液はpH約
4.8の1M酢酸ナトリウムを加えて100mM酢酸ナ
トリウム溶液とした。この緩衝した溶液を今度はカチオ
ン交換物質のイオン交換クロマトグラフィーにかける。
pH約4.7の100mM酢酸ナトリウムバッファーに
より平衡化したCM−セファロースカラムが適当であ
る。カチオン交換物質に結合したタンパク質を、例えば
pH4.7の100mM酢酸ナトリウム中の100〜5
00mMNaClのような適当な塩勾配にかけ、得られ
る精製SODあるいはアナログを含有するフラクション
を回収する。精製SODを含有するフラクションは例え
ば限外濾過によって濃縮しかつ貯蔵のために凍結乾燥を
行なってもよい。本発明はまた、本発明の方法により生
産及び精製された精製酵素的活性真核細胞スーパーオキ
シドジスムターゼあるいはそのアナログにも係る。本発
明の好ましい具体例は、本発明の方法により調製及び精
製された精製酵素的活性ヒトスーパーオキシドジスムタ
ーゼに係る。
【実施例】以下の実施例は本発明の理解を助けるために
提示されたものであり、本発明の範囲を限定する意図は
なく、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきもので
はない。実施例においては、ベクターの構築、該当ポリ
ペプチドをコードする遺伝子のベクター内挿入、得られ
たプラスミドの細菌宿主内導入等のために使用された従
来方法について詳細に説明していないが、これらの方法
は当業者に公知であり、以下の如き多数の刊行物に記載
されている。T.マニアティス(T.Maniati
s)、E.F.フリッチ(E.F.Fritsch)及
びJ.サンブルーク(J.Sambrook)、モレキ
ュラークローニング;アラボラトリーマニュアル(Mo
lecular Cloning;A Laborat
ory Manual)、コールドスプリングハーバー
ラボラトリー(Cold Spring Harbor
Laboratory)、ニューヨーク(198
2)。メソッドインエンザイモロジー(Methods
in Enzymology)、65巻、“ニューク
レイックアシード(パート1)(Nucleic Ac
ids)”、ローレンスグロスマン(Lawrence
Grossman)及びキビーモルダブ(Kivie
Moldave)編、アカデミックプレス(Acad
emic Press)、ニューヨーク(1980)。
メソッドインエンザイモロジー、68巻、“リコンビナ
ントDNA(Recombinant DNA)”、レ
イウー(Ray Wu)編、アカデミックプレス、ニュ
ーヨーク(1981)。メソッドインエンザイモロジ
ー、100巻、“リコンビナントDNA(パート
B)”、レイウー、ローレンスグロスマン及びキビーモ
ルダブ編、アカデミックプレス、ニューヨーク(198
3)。メソッドインエンザイモロジー、101巻、“リ
コンビナントDNA(パートC)”、レイウー、ローレ
ンスグロスマン及びキビーモルダブ編、アカデミックプ
レス、ニューヨーク(1983)。プリンシプルズオブ
ジーンマニピュレーション、マンイントロダクションツ
ージェネティックエンジニアリング(Principl
es of Gene Manipulation、A
n Introduction to Genetic
Engineering)、第2版、R.W.オール
ド(R.W.Old)及びS.B.プリムローズ(S.
B.Primrose)編、ユニバーシティーオブカル
フォルニアプレス(University of Ca
lifornia Press)(1981)。H.
V.バーナード(H.V.Bernard)他、ジーン
(Gene)(1979)5,59。A.B.オッペン
ハイム(A.B.Oppenheim)他、J.モル.
バイオル(J.Mol.Biol)(1982)15
8,327。E.ルモー(E.Remaut)他、ジー
ン(1981)15,81。実施例1 発現ベクター 本明細書中で使用される「発現ベクター」という用語
は、細菌、特に大腸菌(E.coli)中で所望の遺伝
子を発現させるのに有用な1群のプラスミドを意味す
る。所望遺伝子を発現ベクター内に挿入してもよく、又
は発現ベクターのプロモーターを切除して所望遺伝子の
手前に入れてもよい。pJH200 第2図に示したpJH200は、マルチコピー プラス
ミドpBR322に挿入されたDNAから成る。λDN
Aの顕著な特徴は、λDNAがλPLプロモーター,左
側のN利用部位(nutL),EcoRI制限部位,t
RI終結部位,それに続くCIIリボソーム結合部位お
よびNde I制限部位の一部であるATG開始コドン
を含むことである。第2図に示すように、Nde I制
限部位の下流の116塩基対は4個の単一(非反復、u
nique)制限部位である。これらの制限部位により
所望遺伝子が容易に挿入されうる。CIIリボソーム結
合部位は天然のリボソーム結合部位とただ1個の点変異
で異なる。pJH200はpOG11[エー.オッペン
ハイム(A.oppen heim)ら、ジェー.モ
ル.バイオル.(J.Mol.Biol)、(198
2)158;327]から構築され、pOG11中に認
められたCIIリボソーム結合部位とλPLプロモータ
ーとを含む。しかしながら、λPLプロモーターとC
IIリボソーム結合部位の間に位置するλDNAの34
6bpは欠失しており、EcoRI制限部位がこれら2
つの要素間の接合点に導入されている。また、マルチ制
限部位リンカーをリボソーム結合部位の“下流に(do
wnstream)”挿入した。pJH200はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCC
No.39783で寄託されている。pRO211 第2図に示し、前記図面の説明中で詳細に記載したよう
にpRO211は、pJH200から2個のNde I
制限部位の1個を脱離させて誘導された。pJH20
0,pRO211および真核遺伝子を含有するそれらの
誘導体を適当な大腸菌(E.coli)宿主中に維持さ
せてもよい。適当な宿主の最も重要な特徴は、この宿主
が熱感受性リプレッサーcI857および抗転写終結N
タンパクを与えることである。[エム.イー.ゴッテス
マン(M.E.Gottesman)ら、ジェー.モ
ル.バイオロ.(J.Mol.Biol.)、(198
0)140;57−75]。pRO211は従来の発現
ベクターに比して下記する多くの利点を有する。 1.発現レベルが極めて高いこと このベクターは、総細胞タンパクの35%という高レベ
ルで大腸菌(E.coli)中に外来タンパクを発現さ
せることができる。 2.リボソーム結合部位を置換しうること pRO211は、リボソーム結合部位の“上流に”位置
する非反復Eco RI部位とリボソーム結合部位の
“下流”に位置する1個のNde I部位とを含む。従
って、リボソーム結合部位の境界は2個の非反復制限部
位である。こうして、プラスミドの他の特徴を変えるこ
となく、現在のリボソーム結合部位(λCIIリボソー
ム結合部位)を簡単に切除して他の天然あるいは合成リ
ボソーム結合部位のほとんどいずれとも置換することが
できる。これは所望のポリペプチドの至適発現を大きく
助長する。 3.発現を熱感応的に調節し得ること λPLプロモーターは、CIリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。cI857リプレッサーは熱感
受性である。即ち、このリプレッサーは30℃ではプロ
モーターに結合するが、42℃で失活する。従って、発
酵温度を42℃に上げることにより宿主細菌で所望タン
パクの産生が誘発(誘導)される。そのような系は以下
の利点を有する。 (a)大腸菌(Escherichia coli)に
毒性の外来タンパクを発酵過程の遅くに産生させること
ができるので、早期の細胞死が避けられる。 (b)タンパクの産生亢進(Overproducti
on)は、プロテインを安定にしかつタンパク分解を回
避しうる。[チエン,ワイ.イー(Cheng,Y.
E.)ら、ジーン(Gene)(1981)14,12
1]。従って、λPLの如き厳密に調節されたプロモー
ターを使用する“瞬間的”産生亢進は、連続的な低レベ
ル産生より好ましいであろう。 4.単純化された誘発プロトコール 本願並びに係属中の米国特許出願第514,188号に
記載されているプラスミドによるタンパク産生は、熱感
受性cI857リプレッサーにより調節される。上記係
属中の出願に記載されているプラスミドで必要とされる
誘発プロトコールは、42℃における誘発とそれに続く
38℃における増殖を含んでいた。対照的に、ベクター
pJH200,pRO211あるいはそれらのプラスミ
ド誘導体を使用するときには、タンパク合成の至適誘発
は42℃における誘発と同温度(42℃)における増殖
とを含んでいた。これにより、発酵器を冷却する必要が
なくなる。 5.コピー数 pJH200およびpRO211中のλPLプロモータ
ーは、大腸菌(E.coli)中に存在するλ形質導入
ファージベクターよりも高いコピー数をプラスミド上で
示した。これにより発現レベルが高くなる。 6.リボソーム結合部位と開始コドン この発現ベクターは、強力な原核生物リボソーム結合部
位(RBS)と翻訳開始コドン(ATG)とを含む。従
って、いずれの真核遺伝子も開始コドンを付加せずにク
ローン化されうる。また、有効なRBSは発現レベルを
増加させる。リボソーム結合部位はλCIIリボソーム
結合部位である。リボソーム結合部位の配列は次の通り
である。
提示されたものであり、本発明の範囲を限定する意図は
なく、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきもので
はない。実施例においては、ベクターの構築、該当ポリ
ペプチドをコードする遺伝子のベクター内挿入、得られ
たプラスミドの細菌宿主内導入等のために使用された従
来方法について詳細に説明していないが、これらの方法
は当業者に公知であり、以下の如き多数の刊行物に記載
されている。T.マニアティス(T.Maniati
s)、E.F.フリッチ(E.F.Fritsch)及
びJ.サンブルーク(J.Sambrook)、モレキ
ュラークローニング;アラボラトリーマニュアル(Mo
lecular Cloning;A Laborat
ory Manual)、コールドスプリングハーバー
ラボラトリー(Cold Spring Harbor
Laboratory)、ニューヨーク(198
2)。メソッドインエンザイモロジー(Methods
in Enzymology)、65巻、“ニューク
レイックアシード(パート1)(Nucleic Ac
ids)”、ローレンスグロスマン(Lawrence
Grossman)及びキビーモルダブ(Kivie
Moldave)編、アカデミックプレス(Acad
emic Press)、ニューヨーク(1980)。
メソッドインエンザイモロジー、68巻、“リコンビナ
ントDNA(Recombinant DNA)”、レ
イウー(Ray Wu)編、アカデミックプレス、ニュ
ーヨーク(1981)。メソッドインエンザイモロジ
ー、100巻、“リコンビナントDNA(パート
B)”、レイウー、ローレンスグロスマン及びキビーモ
ルダブ編、アカデミックプレス、ニューヨーク(198
3)。メソッドインエンザイモロジー、101巻、“リ
コンビナントDNA(パートC)”、レイウー、ローレ
ンスグロスマン及びキビーモルダブ編、アカデミックプ
レス、ニューヨーク(1983)。プリンシプルズオブ
ジーンマニピュレーション、マンイントロダクションツ
ージェネティックエンジニアリング(Principl
es of Gene Manipulation、A
n Introduction to Genetic
Engineering)、第2版、R.W.オール
ド(R.W.Old)及びS.B.プリムローズ(S.
B.Primrose)編、ユニバーシティーオブカル
フォルニアプレス(University of Ca
lifornia Press)(1981)。H.
V.バーナード(H.V.Bernard)他、ジーン
(Gene)(1979)5,59。A.B.オッペン
ハイム(A.B.Oppenheim)他、J.モル.
バイオル(J.Mol.Biol)(1982)15
8,327。E.ルモー(E.Remaut)他、ジー
ン(1981)15,81。実施例1 発現ベクター 本明細書中で使用される「発現ベクター」という用語
は、細菌、特に大腸菌(E.coli)中で所望の遺伝
子を発現させるのに有用な1群のプラスミドを意味す
る。所望遺伝子を発現ベクター内に挿入してもよく、又
は発現ベクターのプロモーターを切除して所望遺伝子の
手前に入れてもよい。pJH200 第2図に示したpJH200は、マルチコピー プラス
ミドpBR322に挿入されたDNAから成る。λDN
Aの顕著な特徴は、λDNAがλPLプロモーター,左
側のN利用部位(nutL),EcoRI制限部位,t
RI終結部位,それに続くCIIリボソーム結合部位お
よびNde I制限部位の一部であるATG開始コドン
を含むことである。第2図に示すように、Nde I制
限部位の下流の116塩基対は4個の単一(非反復、u
nique)制限部位である。これらの制限部位により
所望遺伝子が容易に挿入されうる。CIIリボソーム結
合部位は天然のリボソーム結合部位とただ1個の点変異
で異なる。pJH200はpOG11[エー.オッペン
ハイム(A.oppen heim)ら、ジェー.モ
ル.バイオル.(J.Mol.Biol)、(198
2)158;327]から構築され、pOG11中に認
められたCIIリボソーム結合部位とλPLプロモータ
ーとを含む。しかしながら、λPLプロモーターとC
IIリボソーム結合部位の間に位置するλDNAの34
6bpは欠失しており、EcoRI制限部位がこれら2
つの要素間の接合点に導入されている。また、マルチ制
限部位リンカーをリボソーム結合部位の“下流に(do
wnstream)”挿入した。pJH200はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCC
No.39783で寄託されている。pRO211 第2図に示し、前記図面の説明中で詳細に記載したよう
にpRO211は、pJH200から2個のNde I
制限部位の1個を脱離させて誘導された。pJH20
0,pRO211および真核遺伝子を含有するそれらの
誘導体を適当な大腸菌(E.coli)宿主中に維持さ
せてもよい。適当な宿主の最も重要な特徴は、この宿主
が熱感受性リプレッサーcI857および抗転写終結N
タンパクを与えることである。[エム.イー.ゴッテス
マン(M.E.Gottesman)ら、ジェー.モ
ル.バイオロ.(J.Mol.Biol.)、(198
0)140;57−75]。pRO211は従来の発現
ベクターに比して下記する多くの利点を有する。 1.発現レベルが極めて高いこと このベクターは、総細胞タンパクの35%という高レベ
ルで大腸菌(E.coli)中に外来タンパクを発現さ
せることができる。 2.リボソーム結合部位を置換しうること pRO211は、リボソーム結合部位の“上流に”位置
する非反復Eco RI部位とリボソーム結合部位の
“下流”に位置する1個のNde I部位とを含む。従
って、リボソーム結合部位の境界は2個の非反復制限部
位である。こうして、プラスミドの他の特徴を変えるこ
となく、現在のリボソーム結合部位(λCIIリボソー
ム結合部位)を簡単に切除して他の天然あるいは合成リ
ボソーム結合部位のほとんどいずれとも置換することが
できる。これは所望のポリペプチドの至適発現を大きく
助長する。 3.発現を熱感応的に調節し得ること λPLプロモーターは、CIリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。cI857リプレッサーは熱感
受性である。即ち、このリプレッサーは30℃ではプロ
モーターに結合するが、42℃で失活する。従って、発
酵温度を42℃に上げることにより宿主細菌で所望タン
パクの産生が誘発(誘導)される。そのような系は以下
の利点を有する。 (a)大腸菌(Escherichia coli)に
毒性の外来タンパクを発酵過程の遅くに産生させること
ができるので、早期の細胞死が避けられる。 (b)タンパクの産生亢進(Overproducti
on)は、プロテインを安定にしかつタンパク分解を回
避しうる。[チエン,ワイ.イー(Cheng,Y.
E.)ら、ジーン(Gene)(1981)14,12
1]。従って、λPLの如き厳密に調節されたプロモー
ターを使用する“瞬間的”産生亢進は、連続的な低レベ
ル産生より好ましいであろう。 4.単純化された誘発プロトコール 本願並びに係属中の米国特許出願第514,188号に
記載されているプラスミドによるタンパク産生は、熱感
受性cI857リプレッサーにより調節される。上記係
属中の出願に記載されているプラスミドで必要とされる
誘発プロトコールは、42℃における誘発とそれに続く
38℃における増殖を含んでいた。対照的に、ベクター
pJH200,pRO211あるいはそれらのプラスミ
ド誘導体を使用するときには、タンパク合成の至適誘発
は42℃における誘発と同温度(42℃)における増殖
とを含んでいた。これにより、発酵器を冷却する必要が
なくなる。 5.コピー数 pJH200およびpRO211中のλPLプロモータ
ーは、大腸菌(E.coli)中に存在するλ形質導入
ファージベクターよりも高いコピー数をプラスミド上で
示した。これにより発現レベルが高くなる。 6.リボソーム結合部位と開始コドン この発現ベクターは、強力な原核生物リボソーム結合部
位(RBS)と翻訳開始コドン(ATG)とを含む。従
って、いずれの真核遺伝子も開始コドンを付加せずにク
ローン化されうる。また、有効なRBSは発現レベルを
増加させる。リボソーム結合部位はλCIIリボソーム
結合部位である。リボソーム結合部位の配列は次の通り
である。
【化12】
1個の塩基対が野生型λにみられるリボソーム結合部位
と異なる。 7.適当な制限部位 発現ベクターは唯一のNde I制限部位を有し、前記
部位内にATG開始コドンを含む。これにより、所望の
遺伝子を適正に位置付けることができる。唯一のNde
I部位がリボソーム結合部位の直後にみとめられる。 8.遺伝子挿入のための適当な制限部位 Nde I制限部位の下流に配置された116塩基対
は、次の順番で4個の他の非反復制限部位である。Bg
l II,Sma I,Hind IIIおよびCla
I。非反復制限部位が複数個あるため、所望の遺伝子
が容易に挿入されうる。 9.Nut部位 宿主から与えられるNタンパクは発現ベクター上のNu
t部位に結合し、それによってtRI部位での転写終結
あるいはクローン化された遺伝子内での早期転写終結が
阻止される。菌株 所望のベクターおよびプラスミドに対する適切な宿主
は、形質転換に適した大腸菌(E.coli)の菌株で
あり、前記菌株はA1637,A2602,A156
3,A1645(c600r−m+ gal+ thr
− leu− lac−bl(λcI857ΔHIΔB
am HI N+))およびA2097(A1645
lac Δx A21 pro C::Tn 10)を
含む。実施例2 動物成長ホルモン I pRO 12 pRO12の構築は、第2図に示されかつ図面の説明に
記載されている。第1図に示した構築手順を有するpA
L500からのbGH cDNAをpRO211に挿入
する前に処理して、適切な解読枠とNde I制限部位
を作成した。pRO 12を、当業者に公知の方法を用
いる形質転換によって大腸菌(Escherichia
coli)A1645株に導入した。この菌株は増殖
および誘発されるとウシ成長ホルモン(bGH)のアナ
ログを産生する。前記bGHアナログは、フェニルアラ
ニン型天然bGHのN−末端に付加されたアミノ酸配列
のmet−asp−glnを有する。pRO 12によ
り産生されるbGHアナログの量は、クーマシーブルー
染色SDSポリアクリルアミドゲルを走査して計算する
と、細菌により産生される総タンパクの約30〜36%
であった(表I)。 II pSAL5200−6 pSAL5200−6の構築は第3図に示されかつ図面
の説明に記載されている。met−phe bGHをコ
ードするDNA配列を、pRO 12をPvuIIおよ
びNde Iで制限し、10塩基対が重複したセグメン
トを有する2個の一重鎖合成オリゴヌクレオチドから形
成された合成DNAフラグメント(断片)を挿入して得
た。pSAL5200−6を、公知の方法を使用する形
質転換によって大腸菌(Escherichia co
li)A1645株に導入した。この菌株は、増殖およ
び誘発で、phe bGHのアミノ末端に付加されたメ
チオニンを有するbGHアナログを産生する。pSAL
5200−6により産生されるmet−phe bGH
アナログの量は、クーマシー染色SDSポリアクリルア
ミドゲルを走査して計算すると、細菌により産生される
総タンパクの約18−20%であった。菌株を増殖さ
せ、産生されたbGHを回収しそしてbGHを精製する
ために使用した方法は、pRO12からのbGH産生の
ための実施例5に後記する方法と同じである。 III p3008 p3008の構築は、第4図に示されかつ図面の説明に
記載されている。p3008は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにATCC No.3980
4で寄託されている。met−phe pGH(豚成長
ホルモン)をコードするDNA配列を、pGH cDN
AをpRO211に挿入して得た。p3008を、当業
者に公知の方法を用いる形質転換により大腸菌(Esc
herichia coli)菌株A1645株に導入
した。この菌株は増殖および誘発により、phe pG
Hのアミノ末端に付加されたメチオニンを有するpGH
を産生する。p3008により産生されるmet−ph
e pGHアナログの量は、クーマシー染色SDSポリ
アクリルアミドゲルを走査して計算すると、細菌により
産生される総タンパクの約18−20%であった。菌株
を増殖させ、産生されたpGHを回収しかつpGHを精
製するために使用した方法は、pRO12からのbGH
産生のための実施例5に後記する方法と同じであった。 IV p5002 p5002の構築は第5図に示されかつ図面の説明に記
載されている。met−phe cGH(ニワトリ成長
ホルモン)をコードするDNA配列を、cGHcDNA
をpRO 211に挿入し、次いで遺伝子の5′末端を
合成オリゴヌクレオチドリンカーで完成させることによ
り得た。p5002を、公知の方法を用いる形質転換に
より大腸菌(Escherichia coli)A1
645株に挿入した。この菌株は増殖および誘発によ
り、phe cGHのアミノ末端に付加されたメチオニ
ンを有するcGHを産生する。p5002により産生さ
れたmet−phe cGHの量は、クーマシー染色S
DSポリアクリルアミドゲルを走査して計算すると、細
菌により産生された総タンパクの約18−20%であっ
た。菌株を増殖させ、産生されたcGHを回収し、cG
Hを精製するために使用された方法は、pRO 12か
らのbGH産生のための実施例5に後記する方法と同じ
である。
と異なる。 7.適当な制限部位 発現ベクターは唯一のNde I制限部位を有し、前記
部位内にATG開始コドンを含む。これにより、所望の
遺伝子を適正に位置付けることができる。唯一のNde
I部位がリボソーム結合部位の直後にみとめられる。 8.遺伝子挿入のための適当な制限部位 Nde I制限部位の下流に配置された116塩基対
は、次の順番で4個の他の非反復制限部位である。Bg
l II,Sma I,Hind IIIおよびCla
I。非反復制限部位が複数個あるため、所望の遺伝子
が容易に挿入されうる。 9.Nut部位 宿主から与えられるNタンパクは発現ベクター上のNu
t部位に結合し、それによってtRI部位での転写終結
あるいはクローン化された遺伝子内での早期転写終結が
阻止される。菌株 所望のベクターおよびプラスミドに対する適切な宿主
は、形質転換に適した大腸菌(E.coli)の菌株で
あり、前記菌株はA1637,A2602,A156
3,A1645(c600r−m+ gal+ thr
− leu− lac−bl(λcI857ΔHIΔB
am HI N+))およびA2097(A1645
lac Δx A21 pro C::Tn 10)を
含む。実施例2 動物成長ホルモン I pRO 12 pRO12の構築は、第2図に示されかつ図面の説明に
記載されている。第1図に示した構築手順を有するpA
L500からのbGH cDNAをpRO211に挿入
する前に処理して、適切な解読枠とNde I制限部位
を作成した。pRO 12を、当業者に公知の方法を用
いる形質転換によって大腸菌(Escherichia
coli)A1645株に導入した。この菌株は増殖
および誘発されるとウシ成長ホルモン(bGH)のアナ
ログを産生する。前記bGHアナログは、フェニルアラ
ニン型天然bGHのN−末端に付加されたアミノ酸配列
のmet−asp−glnを有する。pRO 12によ
り産生されるbGHアナログの量は、クーマシーブルー
染色SDSポリアクリルアミドゲルを走査して計算する
と、細菌により産生される総タンパクの約30〜36%
であった(表I)。 II pSAL5200−6 pSAL5200−6の構築は第3図に示されかつ図面
の説明に記載されている。met−phe bGHをコ
ードするDNA配列を、pRO 12をPvuIIおよ
びNde Iで制限し、10塩基対が重複したセグメン
トを有する2個の一重鎖合成オリゴヌクレオチドから形
成された合成DNAフラグメント(断片)を挿入して得
た。pSAL5200−6を、公知の方法を使用する形
質転換によって大腸菌(Escherichia co
li)A1645株に導入した。この菌株は、増殖およ
び誘発で、phe bGHのアミノ末端に付加されたメ
チオニンを有するbGHアナログを産生する。pSAL
5200−6により産生されるmet−phe bGH
アナログの量は、クーマシー染色SDSポリアクリルア
ミドゲルを走査して計算すると、細菌により産生される
総タンパクの約18−20%であった。菌株を増殖さ
せ、産生されたbGHを回収しそしてbGHを精製する
ために使用した方法は、pRO12からのbGH産生の
ための実施例5に後記する方法と同じである。 III p3008 p3008の構築は、第4図に示されかつ図面の説明に
記載されている。p3008は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにATCC No.3980
4で寄託されている。met−phe pGH(豚成長
ホルモン)をコードするDNA配列を、pGH cDN
AをpRO211に挿入して得た。p3008を、当業
者に公知の方法を用いる形質転換により大腸菌(Esc
herichia coli)菌株A1645株に導入
した。この菌株は増殖および誘発により、phe pG
Hのアミノ末端に付加されたメチオニンを有するpGH
を産生する。p3008により産生されるmet−ph
e pGHアナログの量は、クーマシー染色SDSポリ
アクリルアミドゲルを走査して計算すると、細菌により
産生される総タンパクの約18−20%であった。菌株
を増殖させ、産生されたpGHを回収しかつpGHを精
製するために使用した方法は、pRO12からのbGH
産生のための実施例5に後記する方法と同じであった。 IV p5002 p5002の構築は第5図に示されかつ図面の説明に記
載されている。met−phe cGH(ニワトリ成長
ホルモン)をコードするDNA配列を、cGHcDNA
をpRO 211に挿入し、次いで遺伝子の5′末端を
合成オリゴヌクレオチドリンカーで完成させることによ
り得た。p5002を、公知の方法を用いる形質転換に
より大腸菌(Escherichia coli)A1
645株に挿入した。この菌株は増殖および誘発によ
り、phe cGHのアミノ末端に付加されたメチオニ
ンを有するcGHを産生する。p5002により産生さ
れたmet−phe cGHの量は、クーマシー染色S
DSポリアクリルアミドゲルを走査して計算すると、細
菌により産生された総タンパクの約18−20%であっ
た。菌株を増殖させ、産生されたcGHを回収し、cG
Hを精製するために使用された方法は、pRO 12か
らのbGH産生のための実施例5に後記する方法と同じ
である。
【表1】
1.表は、pRO 211由来の各種プラスミドのbG
H発現レベルを示す。プラスミドpRec2/3および
pRO 11は、1983年7月15日出願の係属中の
米国特許出願第514,188号に記載されている。 2.産生されたbGHの量は総バクテリアプロテインに
対するパーセンテージで表示した。略 号 CHCN=構成高コピー数(constitutive
high copynumber) AmpR=アンピシリン耐性 TetR=テトラサイクリン耐性 T1T2=転写終結配列 cI434=プラスミド安定化cI434系。実施例3 ヒトCu−Znスーパーオキシドジスムターゼ(SO
D) Cu−Zn SOD cDNA修飾の出発点は、リーマ
ン−ハービッツ,ジェー.(Lieman−Hurwi
tz,J.)ら、PNAS(1982),79:280
8に記載されているプラスミドpS61−10である。
SOD cDNAは、1983年4月29日に出願され
た係属中の米国特許出願第489,786号明細書にも
記載されている。SOD cDNAを修飾すると、遺伝
子の5′末端にNde I制限部位が、遺伝子の3′末
端にHind III制限部位が導入された。得られた
プラスミドpSOD NH−10は両端が非反復制限部
位になっているSOD cDNAを含んでいる。 I.pSODα2 pSODα2の構築は第13図に示されかつ前記図面の
説明中に記載されている。pSODα2はアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションにATCCNo.3
9786で寄託されている。pSODα2を構築するた
めに、λPLプロモーターとNutLとCIIリボソー
ム結合部位とを発現ベクターpJH200から切り取
り、プラスミドpSOD NH−10のSOD遺伝子の
手前に配置した。次いでプロモーターとRBSとSOD
遺伝子とを含有するフラグメントをベクターpBRMに
挿入した[ハートマン,ジェー・アール.(Hartm
an,J.R.)ら,PN AS79:233−237
(1982)]。pBRMはアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションにATCCNo.37283で寄
託されている。pSODα2を、公知の方法を用いる形
質転換で大腸菌(Escherichia coli)
A2097株に導入した。得られたクローンを増殖およ
び誘発させるとSODアナログタンパクが産生した。p
SODα2により産生されたSODアナログの量は、ク
ーマシー染色SDSポリアクリルアミドゲルの走査によ
って計算すると、細菌により産生された総タンパクの約
0.1−0.3%であった(表2)。産生されたSOD
アナログは、下記のpSODβ1により産生されたアナ
ログと多分同一であろう。 II.pSODβ1 pSODβ1の構築は、第14図に示しかつ前記図面の
説明中に記載されている。pSODβ1を構築するため
に、pSODα2のCIIRBSを、pBLA11由来
のRBSおよびβ−ラクタマーゼプロモーター(β−l
ac−prom)で置換した。pBLA11はアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCCN
o.39788で寄託されている。pBLA11はpB
R322中の座標(coordinates)4157
と4353との間にあるβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロ
モーターと、リボソーム結合部位とを含む。EcoRI
リンカーをプロモーターの上流に付加し、マルチ制限部
位リンカーを開始コドンATGの直後に付加した。従っ
て、開始コドンで始まるコード鎖の配列はATGAGC
TCTAGAATTCである。pSODβ1を、公知の
方法を用いる形質転換によって大腸菌(Escheri
chia coli)菌株A1645に導入した。得ら
れたクローンを増殖および誘発させるとSODアナログ
を産生する。産生されるヒトCu−Zn SODアナロ
グは、天然ヒトSODがアミノ末端アラニンでアセチル
化されているのに対して[ハーツ,ジェー.ダブリュ
ー.(Hartz,J.W.)及びドイッチン,エッ
チ.エフ.(Deutsch,H.F.)、ジェー.バ
イオロ.ケム.(J.Biol.Chem)(197
2)234:7043−7050;ヤーブッシュ,ジェ
ー.アール.(Jabusch,J.R.)らバイロケ
ミストリー(Biochemistry)(1980)
19:2310−2316;バラ(Barra)ら、F
EBS]レターズ(Letters)(1980)12
0:53及びオバーレイ,エル.ダブリュ.(Ober
ley,L.W.)スーパーオキシドジスムターゼ(S
uperoxide Dismutase),vol.
I,(1982),CRCプレス,フロリダ,pp.3
2−33]、アミノ酸配列解析化学量論で示されるよう
にアミノ末端アラニンがアセチル化されていない点で天
然ヒトCu−Zn SODと異なる。更に、天然ヒトS
ODはグリコシル化されている[ヒューバー,ダブリュ
ー.(Huber,W.)、1971年5月18日付発
行USP No.3,579,495〕のに対して、細
菌産生ヒトSODはほとんど全くグリコシル化されてい
ない。なぜなら、大腸菌(Escherichia c
oli)は自身が産生するタンパクをグリコシル化しな
いからである。細菌産生SODアナログのアミノ酸配列
は成熟ヒトSODの配列と同一であり、そのN−末端に
メチオニン残基を含まない。pSODβ1により産生さ
れるSODの量は、クーマシー染色SDSポリアクリル
アミドゲルの走査により計算すると、細菌により産生さ
れた総タンパクの約3−8%であった(表II)。菌株
の増殖、産生されたSODの回収およびSODの精製の
ために用いた方法は、pSODβ1T11のための後記
実施例7の方法と同じである。 III.pSODβ1T11 pSODβ1T11構築は第15図に示されかつ前記図
面の説明中に記載されている。pSODβ1のβ−ラク
タマーゼ遺伝子を、pBR322由来のテトラサイクリ
ン耐性をコードする遺伝子で置換した。pSODβ1T
11より産生されるSODアナログの量は、クーマシー
染色SDSポリアクリルアミドゲルの走査により計算す
ると、細菌により産生された総タンパクの約8−13%
であった(表II)。産生されたSODアナログは、p
SODβ1により産生されるアナログと同一である。 IV.pSODβ1−BA2 pSODβ1−BA2の構築は第17図に示されかつ前
記図面の説明中に記載されている。pSODα13のC
IIリボソーム結合部位を、配列
H発現レベルを示す。プラスミドpRec2/3および
pRO 11は、1983年7月15日出願の係属中の
米国特許出願第514,188号に記載されている。 2.産生されたbGHの量は総バクテリアプロテインに
対するパーセンテージで表示した。略 号 CHCN=構成高コピー数(constitutive
high copynumber) AmpR=アンピシリン耐性 TetR=テトラサイクリン耐性 T1T2=転写終結配列 cI434=プラスミド安定化cI434系。実施例3 ヒトCu−Znスーパーオキシドジスムターゼ(SO
D) Cu−Zn SOD cDNA修飾の出発点は、リーマ
ン−ハービッツ,ジェー.(Lieman−Hurwi
tz,J.)ら、PNAS(1982),79:280
8に記載されているプラスミドpS61−10である。
SOD cDNAは、1983年4月29日に出願され
た係属中の米国特許出願第489,786号明細書にも
記載されている。SOD cDNAを修飾すると、遺伝
子の5′末端にNde I制限部位が、遺伝子の3′末
端にHind III制限部位が導入された。得られた
プラスミドpSOD NH−10は両端が非反復制限部
位になっているSOD cDNAを含んでいる。 I.pSODα2 pSODα2の構築は第13図に示されかつ前記図面の
説明中に記載されている。pSODα2はアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションにATCCNo.3
9786で寄託されている。pSODα2を構築するた
めに、λPLプロモーターとNutLとCIIリボソー
ム結合部位とを発現ベクターpJH200から切り取
り、プラスミドpSOD NH−10のSOD遺伝子の
手前に配置した。次いでプロモーターとRBSとSOD
遺伝子とを含有するフラグメントをベクターpBRMに
挿入した[ハートマン,ジェー・アール.(Hartm
an,J.R.)ら,PN AS79:233−237
(1982)]。pBRMはアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションにATCCNo.37283で寄
託されている。pSODα2を、公知の方法を用いる形
質転換で大腸菌(Escherichia coli)
A2097株に導入した。得られたクローンを増殖およ
び誘発させるとSODアナログタンパクが産生した。p
SODα2により産生されたSODアナログの量は、ク
ーマシー染色SDSポリアクリルアミドゲルの走査によ
って計算すると、細菌により産生された総タンパクの約
0.1−0.3%であった(表2)。産生されたSOD
アナログは、下記のpSODβ1により産生されたアナ
ログと多分同一であろう。 II.pSODβ1 pSODβ1の構築は、第14図に示しかつ前記図面の
説明中に記載されている。pSODβ1を構築するため
に、pSODα2のCIIRBSを、pBLA11由来
のRBSおよびβ−ラクタマーゼプロモーター(β−l
ac−prom)で置換した。pBLA11はアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCCN
o.39788で寄託されている。pBLA11はpB
R322中の座標(coordinates)4157
と4353との間にあるβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロ
モーターと、リボソーム結合部位とを含む。EcoRI
リンカーをプロモーターの上流に付加し、マルチ制限部
位リンカーを開始コドンATGの直後に付加した。従っ
て、開始コドンで始まるコード鎖の配列はATGAGC
TCTAGAATTCである。pSODβ1を、公知の
方法を用いる形質転換によって大腸菌(Escheri
chia coli)菌株A1645に導入した。得ら
れたクローンを増殖および誘発させるとSODアナログ
を産生する。産生されるヒトCu−Zn SODアナロ
グは、天然ヒトSODがアミノ末端アラニンでアセチル
化されているのに対して[ハーツ,ジェー.ダブリュ
ー.(Hartz,J.W.)及びドイッチン,エッ
チ.エフ.(Deutsch,H.F.)、ジェー.バ
イオロ.ケム.(J.Biol.Chem)(197
2)234:7043−7050;ヤーブッシュ,ジェ
ー.アール.(Jabusch,J.R.)らバイロケ
ミストリー(Biochemistry)(1980)
19:2310−2316;バラ(Barra)ら、F
EBS]レターズ(Letters)(1980)12
0:53及びオバーレイ,エル.ダブリュ.(Ober
ley,L.W.)スーパーオキシドジスムターゼ(S
uperoxide Dismutase),vol.
I,(1982),CRCプレス,フロリダ,pp.3
2−33]、アミノ酸配列解析化学量論で示されるよう
にアミノ末端アラニンがアセチル化されていない点で天
然ヒトCu−Zn SODと異なる。更に、天然ヒトS
ODはグリコシル化されている[ヒューバー,ダブリュ
ー.(Huber,W.)、1971年5月18日付発
行USP No.3,579,495〕のに対して、細
菌産生ヒトSODはほとんど全くグリコシル化されてい
ない。なぜなら、大腸菌(Escherichia c
oli)は自身が産生するタンパクをグリコシル化しな
いからである。細菌産生SODアナログのアミノ酸配列
は成熟ヒトSODの配列と同一であり、そのN−末端に
メチオニン残基を含まない。pSODβ1により産生さ
れるSODの量は、クーマシー染色SDSポリアクリル
アミドゲルの走査により計算すると、細菌により産生さ
れた総タンパクの約3−8%であった(表II)。菌株
の増殖、産生されたSODの回収およびSODの精製の
ために用いた方法は、pSODβ1T11のための後記
実施例7の方法と同じである。 III.pSODβ1T11 pSODβ1T11構築は第15図に示されかつ前記図
面の説明中に記載されている。pSODβ1のβ−ラク
タマーゼ遺伝子を、pBR322由来のテトラサイクリ
ン耐性をコードする遺伝子で置換した。pSODβ1T
11より産生されるSODアナログの量は、クーマシー
染色SDSポリアクリルアミドゲルの走査により計算す
ると、細菌により産生された総タンパクの約8−13%
であった(表II)。産生されたSODアナログは、p
SODβ1により産生されるアナログと同一である。 IV.pSODβ1−BA2 pSODβ1−BA2の構築は第17図に示されかつ前
記図面の説明中に記載されている。pSODα13のC
IIリボソーム結合部位を、配列
【化13】
を有する合成DNAフラグメントで置換した。前記配列
は天然β−ラクタマーゼRBSの配列と類似している。
pSODβ1−BA2を当業者に公知の方法を用いる形
質転換によって、大腸菌(Escherichia c
oli)菌株A1645に導入した。得られたクローン
を増殖および誘発させると、ヒトSODアナログを産生
する。pSODβ1−BA2により産生されるSODの
量は、クーマシー染色SDSポリアクリルアミドゲルの
走査により計算すると、細菌により産生された総タンパ
クの約2−4%であった(表II)。産生されたSOD
アナログは、pSODβ1により産生されたアナログと
同一である。
は天然β−ラクタマーゼRBSの配列と類似している。
pSODβ1−BA2を当業者に公知の方法を用いる形
質転換によって、大腸菌(Escherichia c
oli)菌株A1645に導入した。得られたクローン
を増殖および誘発させると、ヒトSODアナログを産生
する。pSODβ1−BA2により産生されるSODの
量は、クーマシー染色SDSポリアクリルアミドゲルの
走査により計算すると、細菌により産生された総タンパ
クの約2−4%であった(表II)。産生されたSOD
アナログは、pSODβ1により産生されたアナログと
同一である。
【表2】
1.β−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーター及びリボソ
ーム結合部位 2.β−ラクタマーゼ遺伝子のリボソーム結合部位に相
当する合成リボソーム結合部位 3.総細菌性タンパクのパーセンテージとして表示した
産生SODアナログの量略 号 AmpR=アンピシリン耐性 TetR=テトラサイクリン耐性 T1T2=転写終結配列。実施例4 ヒトアポリポプロテインE(Apo E3) Apo E3 cDNA修飾の出発点は、カリホルニ
ア,サンフランシスコのグラッドストン財団(Glad
stone Foundation)のジョーンテイラ
ー(John Taylor)博士により提供されたプ
ラスミドpNB178であった。このプラスミドは、ヒ
トApo E3遺伝子の完全長cDNAコピーを含む。
pNB178中のcDNAを修飾して、遺伝子の5′末
端の非コード化DNAを除去しかつ遺伝子の両末端にN
de I制限部位を付加した。このApo E3 cD
NAフラグメントを(1983年7月15日に出願され
た係属中の米国特許出願第514,188号に記載され
ている)ベクターpND5中に挿入した。得られたプラ
スミドpApoE−Ex2を第18図に示す。これはア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにATC
C No.39787で寄託されている。 I.pTV−188 pTV−188の構築は第18図に示されかつ前記図面
の説明に記載されている。プラスミドpTV−188
は、pApoE−Ex2のNde I−NdeIフラグ
メントを充填(filled−in)して得たApo
E3フラグメントを(第14図に示しかつ図面の説明中
に記載されている)pSODβ1T11の唯一のブラン
ト末端Stu I部位に挿入して得た。pTV−188
を当業者に公知の方法を用いる形質転換により、大腸菌
(Escherichia coli)菌株A1645
に導入した。得られたクローンを増殖及び誘発させる
と、ヒトApo E3のアナログを産生する。前記アナ
ログは、真正ヒトApo E3のN−末端に結合したヒ
トスーパーオキシドジスムターゼのN−末端配列の42
個のアミノ酸を有し、かつそのN−末端にはメチオニン
を有する。産生されたApo E3アナログは、クーマ
シー染色SDSポリアクリルアミドゲルの走査によって
計算すると、細菌により産生される総タンパクの約10
%であった。菌株の増殖のために使用した方法は、1
2.5mg/lのテトラサイクリンをアンピシリンの代
わりに使用する以外はpRO 12からのbGH産生の
ための実施例5に記載の方法と同じである。 II.pSAL160−5 pSAL160−5の構築は第23図に示されかつ前記
図面の説明中に記載されている。プラスミドpSAL1
60−5を、pTV−170(第20図参照)のAva
I−Ava I Apo E3遺伝子フラグメントに
挿入して得た。pSAL160−5を、当業者に公知の
方法を用いる形質転換によって大腸菌(Escheri
chia coli)菌株A1645に導入した。得ら
れたクローンを増殖および誘発させると、アミノ末端に
メチオニンと11個のN−末端アミノ酸が欠失している
Apo E3に融合したヒト成長ホルモンのN−末端由
来の45個のアミノ酸とを含むApo E3のアナログ
が産生される。pSAL160−5により産生されるA
po E3アナログの量は、クーマシー染色SDSポリ
アクリルアミドゲルの走査により計算すると、細菌によ
り産生される総タンパクの約5%であった。菌株の増殖
するために使用した方法は、pRO 12からのbGH
産生のための実施例5に記載されている方法と同じであ
る。実施例5 pRO 12の増殖 I.保存培養物 pRO 12の保存培養物(stock cultur
e)をカゼイン培地で増殖し(接種物参照)、次に凍結
培地で2倍に希釈し、−80℃で保存する。凍結培地は
500mlあたり以下の物質を含む。 II.接種物 接種物を20g/lカゼイン水解物,10g/l酵母抽
出物および2g/lNaCl中で増殖させた。振盪フラ
スコ中の無菌培地に保存培養物を接種し、30℃,約2
00r.p.mのシェーカー上で15時間インキュベー
トした。必要に応じ、以後の接種物増殖段階は撹拌通気
した発酵槽で行なった。無菌培地に2−10%接種物を
接種し、30℃,pH7±0.5で撹拌通気して溶存酸
素レベルを空気飽和の20%より高く維持しながら15
時間インキュベートした。 III.産生 産生培地は以下の物質を含む。 培地は100mg/lのアンピシリンも含む。アンピシ
リンは産生のためには任意成分であるが、通常接種物の
増殖用培地には添加されている。濃縮溶液中のビオチ
ン,チアミン及びアンピシリンを別々にフィルター滅菌
し、接種以前に無菌産生培地に加えた。無菌ブドウ糖溶
液を最初に10g/lになるように添加した。誘発の過
程ではブドウ糖を更に10g/l添加した。微量元素溶
液は以下の物質を含む。 培地に0.5−10%の接種培養物を接種し、30℃で
インキュベートする。撹拌−通気速度は、空気飽和の2
0%より高い溶存酸素レベルが維持されるように設定さ
れる。NH3でpHを7±0.2に維持する。細胞濃度
が約3.5g/l(OD660=10)に到達したら誘
発を始める。温度を42℃に上げ、42℃で1−5時間
維持する。次いで培養物を急冷し、ホルモン精製のため
に遠心分離によって細胞を回収する。bGHの回収 ポリトロン(Kinematica)配合装置を用い、
50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)と50
mM EDTA と100mM NaClとを含む5倍
容の溶液に13kgの細菌細胞(湿潤ケーキ)を再懸濁
させる。配合装置の速度は泡立ちを最小に抑えるように
調整する。均質懸濁液をダイノミル細胞破砕装置KD5
(Willy A.Bachofen,バーゼル)に8
0l/時の速度で連続的に通し、破砕細胞の均質懸濁液
をCEPA101遠心機で45l/時の流速で遠心して
清澄化する。遠心ステップで得られた沈殿物を回収し、
50mM EDTA含有50mMリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.4)15.5lに再懸濁させる。終濃度
0.05mg/mlまでリゾチームを加え、懸濁液を3
7℃で16時間インキュベートした。トリトン(Tri
ton)X−100を終濃度1%まで加える。次に、懸
濁液を室温で30分間インキュベートし、連続流式細胞
超音波処理装置(加熱システム)内で18l/時の速度
で超音波処理し、CEPA101遠心機で遠心する。沈
殿物を収集し、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.4)に再懸濁し、前記同様に超音波処理し、CEP
A101遠心機で遠心した。細胞を50mM BDTA
および100mM NaClを含む50mMリン酸ナト
リウム緩衝液(pH7.4)15.5lに再懸濁し、2
回沈殿させ、蒸留水15.5lに再懸濁させる。沈殿物
を遠心によって収集し、−20℃で保存する。bGHの精製 沈殿物を30−40lの蒸留水に再懸濁させ、0.5
NのNaOHでpH11.8に滴定して可溶化する。次
に溶液を連続的に超音波処理し、所要によりCEPA1
01遠心機で遠心して清澄化するか、またはワットマン
No.1濾紙を通して濾過する。清澄化プロテイン溶液
(32.61、297,000のOD280nmを含
む)を各部分が50,000−60,000ODを含む
ように分ける(6×5.4l)。各部分を夫々、5ft
2面積の100,000分子量カットオフカセット(タ
イプPTHK)を3個備えたミリポア(Millipo
re)ペリコン(Pellicon)限外濾過装置を通
して限外濾過する。5.4 l部分を1l保留分(re
tentate)容量に濃縮する。限外濾液を収集し保
存する。保留分を再び新鮮な10mMホウ酸塩緩衝液,
pH11.8でもとの容量にまで希釈し、十分に混合す
る。バッチを再び1l保留分容量に濃縮する。限外濾液
を集め、はじめの限外濾液と合わせる。限外濾液中のO
D分の流出総量が限外濾過装置に最初に充填されたOD
分の20%に等しくなるとき、次の濃縮ステップでの保
留分を1lではなく0.5lにする。濃縮および10m
Mホウ酸塩緩衝液による希釈のサイクルを、0.5lの
保留分からの限外濾液の280nm(1cmセル)での
吸光度が0.1未満になるまで継続する。これは通常9
−12回の濃縮・希釈サイクルを要する。最終保留分は
捨てる。全ての限外濾液を合せ、6N HClでpH
9.0に調節した。他の5.4l部分を同様に限外濾過
し、pH調節した限外濾液を全て一緒にする。典型的な
流出物は0.26の吸光度を有する限外濾液を総量38
0l(100,000ODに等しい)生じ、完結するに
は24−40時間を要する。100K限外濾過工程から
の合した限外濾液(280nmで100,000ODを
含む380l)を、23cm/時(25l/時)の線流
速でセファロースCL−6BDEAEイオン交換カラム
に充填する。直径37cm、高さ15cmのカラムをp
H9.0で10mMホウ酸塩緩衝液の2ベット容量(3
2L)で洗浄する。充填および洗浄ステップからの溶出
物は捨てる。10mMホウ酸塩、100mM塩化ナトリ
ウム,pH9に溶離液を変えると、カラムからbGHが
排出される。溶離流速は23cm/時である。流出の進
行を280nmでの溶出物の吸光度を追跡してモニター
する。bGHピークを4乃至5ベット容量(280nm
で43,000ODを含む84l)で収集し、10,0
00分子量カットオフカセットを備えたミリポアペリコ
ン限外濾過装置を用いて約10mg/mlに濃縮する。
次いで、溶液を凍結乾燥する。収量は純bGH約70g
である。実施例6 pRO12により産生されるbGHアナログの活性 1.bGHアナログと天然bGHとのラジオイムノアツ
セイ比較 リン酸塩緩衝生理食塩水(1%BSA)中に100ng
/mlのbGHアナログを含む溶液を調製した。この溶
液を濃度50,25,12.5,6.25,3.12,
1.56及び0.78ng/lまで順序希釈した。これ
らの溶液について各0.1mlのサンプル群2組を、二
抗体法を用いるRIAにかけた。希釈曲線は天然bGH
で得られる曲線と同等であった。 2.ラジオレセプター結合アッセイ ウサギ肝膜に対するラジオレセプター結合アッセイを、
ツシマティー(TushimaT.)及びフライセンエ
ッチ.ジー.(Freisen H.G.)[ワイ.チ
ン(Y.Chin.),エンドクル.メタボ.(End
ocr,Metab9)(1973),37,3]に記
載の方法で、125I−bGHをトレーサーとし、真正
bGH溶液を校正曲線用に用いて実施した。3組のサン
プルを0.3mlのアッセイバッファ(50mM Tr
is,15mM CaCl2及び5mg/mlウシ血清
アルブミン,pH7.6)中、室温で2時間インキュベ
ートした。試験管は、125I−bGH(30−60μ
Ci/μgの調製物20,000cpmと、150−2
50μgの肝膜タンパクと、天然bGH(1−100n
g)又は細菌bGHの抽出物のいずれかとを収容してい
た。結果は、bGHアナログのbGH活性が天然bGH
の同じ活性に匹敵することを示した。 3.脛骨テスト 実施例5の細菌細胞から回収されたpRO 12産生b
GHアナログの生物活性を脛骨テストで測定した。[パ
ルロー,エー.エフ.(Parlow A.F.)ら、
エンドクリノロジー(Endocrinology)
(1965)77,1126]。生後28〜30日のラ
ットを下垂体切除し、次に処理しないで10−14日間
維持した。ウシ下垂体又は組換体大腸菌(Escher
ichiacoli)から誘導したウシ成長ホルモンを
0.15M NaCl+0.01Mホウ酸塩,pH1
0.0に溶解した。ラット(1群4−7匹ずつ)を正常
食[プリナラット餌(Purina Rat−Cho
w)及び任意量の水]で維持し、bGH溶液の皮下注射
(0.2cc中、5−125μg/日)を5日間毎日続
けた。6日目に動物を殺し、前肢膝骨を取り出して長手
方向に切開し、アセトンで固定して2%AgNO3で染
色した。解剖双眼顕微鏡(ニコン)で観察して骨端プレ
ートの幅を測定した。(ラットあたり40回の読み取り
を行なった)平均値を用いて長期投与−応答曲線を抽い
た。結果は、pRO 12産生bGHアナログのbGH
活性が天然bGHの同じ活性に匹敵することを示した。 実施例7SODβ1T11の増殖 I.保存培養物 pSODβ1T11の保存培養物をカゼイン培地で増殖
し(接種物参照)、凍結培地で2倍に希釈し、−80℃
で保存した。凍結培地は500mlあたり次の物質を含
む。 II.接種物 接種物を20g/lカゼイン水解物,10g/l酵母抽
出物及び2g/l NaClの中で増殖させた。振盪フ
ラスコ中の無菌培地に保存培養物を接種し、30℃、約
200r.p.m.のシェーカー上で15時間インキュ
ベートした。必要に応じ、以後の接種物増殖段階は撹拌
通気した発酵槽で行なった。無菌培地に2〜10%接種
物を接種し、30℃,pH7±0.5で撹拌通気して溶
存酸素レベルを空気飽和の20%より高く維持しながら
15時間インキュベートした。 III.産生 産生培地は次の物質を含む。 培地には、12.5mg/lのテトラサイクリンも含ま
れる。テトラサイクリンは産生のためには任意成分であ
るが、通常接種物を増殖させるために使用される培地に
は添加されている。濃縮溶液中のビオチン,チアミン及
びテトラサイクリンを別々にフイルター滅菌し、接種以
前に無菌産生培地に加えた。無菌ブドウ糖溶液を最初に
10g/lになるように添加した。誘発の段階で更に1
0g/lのブドウ糖を添加した。微量元素溶液は次の物
質を含む。 培地に0.5〜10%の接種培養物を接種し、30℃で
インキュベートした。撹拌−通気速度は、空気飽和の2
0%より高い溶存酸素レベルが維持されるように設定さ
れる。NH3でpHを7±0.2に維持する。細胞濃度
が約3.5g/l(OD660=10)に達すると誘発
が始まる。温度を42℃に上げ、42℃で1〜5時間維
持する。次いで培養物を急冷し、酵素精製のために遠心
分離によって細胞を回収する。SODの回収 ポリトロン(Kinematica)配合装置を用い、
50mMリン酸ナトリウム(pH7.8)12l中に
1.5kgの細菌細胞(ウェットケーキ)を懸濁させ
る。配合装置の速度は泡立ちを最小に抑えるように調整
した。均質懸濁液をダイノミル(Dynomill)細
胞破砕装置KD5(Willy,A.Bachofe
n,バーゼル)に連続的に通す。破砕細胞の均質懸濁液
を連続流細胞を用いて超音波処理し、CEPA101遠
心機で遠心した。上清を65℃で2時間加熱し、冷却
し、前記処理と同様にして遠心した、清澄な上清を1
0,000分子量カットオフカセット(PTGC型)を
備えたミリポアペリコン限外濾過装置で1lに濃縮す
る。濃縮されたタンパク溶液を、150mMリン酸ナト
リウム緩衝液(pH7.8)で平衡したDEAE−セフ
ァロースカラム(2kgDEAEセファロース)に流
す。流出液を収集し、濃縮し、20mMトリス−HC
l,pH7.8に対してペリコン限外濾過装置で透析
し、次いで20mMトリス−HCl緩衝液で平衡したQ
AE−セファロースカラムに通す。20mMトリス−H
Cl緩衝液,pH7.8と塩勾配(0〜200mM N
aCl)でカラムを展開する。SOD含有画分を収集
し、ペリコン限外濾過装置を用いて濃縮し、蒸留水に対
して透析し、1M酢酸ナトリウム緩衝液,pH4.8を
添加して100mM酢酸ナトリウムとする。タンパク溶
液を更に100mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.7
で平衡したCM−セファロースカラムで分離する。カラ
ムを同じ緩衝液および塩勾配(100〜500mM N
aCl)で展開する。SOD含有画分を収集し、ペリコ
ン限外濾過装置を用いて濃縮し、凍結乾燥する。実施例8 pSODβ1T11により産生されるSODの活性 実施例7で調製したpSODβ1T11より産生される
SODアナログの酵素活性を、マックコード(McCo
rd)及びフライドビッチ(Fridovich),ジ
ェー・バイオロ・ケム(J.Biol.Chem.)
(1969),244:6049−6055に記載され
た如く、フエリシトクロム−cの還元抑制をモニターし
てアッセイした。得られた結果は、pSODβ1T11
生SODアナログの活性は天然ヒトSOD[シグマ(S
igma)]の活性に匹敵し、ウシSOD[オルゴテイ
ン(Orgotein):グリューネンタールGMB
H]の活性にも匹敵していることを示した。実施例9 発現ベクター I.p579 第19図に示し前記図面の説明中で詳細に説明したベク
ターp579は、PLプロモーターとN利用部位(Nu
tL)及び非反復ECo RIおよびNdeI制限部位
で境界付けられるCIIリボソーム結合部位とATG開
始コドンと大腸菌(Escherichia col
i)のrrn BリボソームRNA遺伝子オペロンの末
端に由来するT1T2転写終結シグナルとから成る。こ
れらの要素は、アンピシリン耐性遺伝子を有するpBR
322上でクローンされる。他の特徴は第19図に示さ
れている。p579は、プラスミドpPS 1上に含ま
れるT1T2転写終結シグナルをベクターpRO 21
1のHind III部位に挿入して調製される。pR
O211は第2図に示されている。pPS 1はサルミ
エントス(Sarmientos)ら、セル(Cel
l)(1983)32,1337−1346に記載さ
れ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
ATCC No.39807で寄託されている。p57
9および真核生物遺伝子を含むその誘導体を適当な大腸
菌(Escherichia coli)宿主中に維持
することもできる。宿主の最も重要な特徴は、この宿主
が熱感受性リプレッサーcI857と抗転写終結Nタン
パクを与えることである。[ゴーテスマン,エム.(G
ottesman,M.)ら、ジェー.モル.バイオ
ロ.(J.Mol.Biol.)(1980)140,
57−75]。p579は、従来の発現ベクターに比較
して以下の如き多くの利点を有する。 1.発現レベルが極めて高いこと このベクターは、大腸菌(E.coli)中の外来タン
パクの発現を総細胞タンパクの42%という高レベルで
誘発しうる。この発現レベルは、T1T2転写終結配列
を欠く他の類似のλPLプラスミドの発現レベルよりも
高い。 2.転写終結シグナル ベクターP579はλPLプロモータとCIIリボソー
ム結合部位の下流に位置するT1T2転写終結シグナル
を含む。このベクターを用いて得られる高発現レベルは
挿入された遺伝子の末端にT1T2転写終結因子が存在
していることに部分的に起因している。すなわち、この
T1T2転写終結因子はN修飾RNAポリメラーゼの転
写を集結しうるからである。このように、転写終結因子
はプラスミドの非所望タンパクのλPL制御転写を阻止
し、これにより所望のタンパクの相対収量を高める。 3.リボソーム結合部位が交換しうること p579は、リボソーム結合部位の上流に位置する唯一
のEco RI部位とATG開始コドンの所に位置する
唯一のNde I部位とを含む。従って、リボソーム結
合部位の両境界は2個の非反復制限部位である。これに
より、現在のリボソーム結合部位(λCIIリボソーム
結合部位)の切除とプラスミドの他の特徴を変えること
なく他の天然または合成リボソーム結合部位の実質的な
置換を容易に行ない得る。こうして所望ポリペプチドの
至適発現が大いに促進される。 4.発現を熱誘導的に調節し得ること λPLプロモーターは、CIリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。c1857リプレッサーは熱感
受性である。即ち、30℃ではプロモーターに結合する
が、42℃で失活する。従って、発酵温度を42℃に上
げることにより宿主細菌で所望タンパクの産生が誘発さ
れる。そのような系は以下の利点を含む。 (a)大腸菌(Escherichia coli)に
毒性の外来タンパクを発酵プロセスの後期に産生するこ
とができ、これにより早期の細胞死を回避しうる。 (b)タンパクの産生先進がこのタンパクを安定させ、
タンパク分解を阻止する[チエン,ワイ.イー(Che
ng,Y.E.)ら、ジーン(Gene)(1981)
14,121]。従って厳密に調節されたプロモーター
例えばλPLを使用する“瞬間的”産生冗進は連続的な
低レベル産生よりも好ましいであろう。 5.誘発プロトコールを簡略化しうること p579由来のプラスミドを約42℃で誘発し、タンパ
ク合成中42℃に保持する。係属中の米国特許出願第5
14,188号に記載のpMG 100およびpND5
から誘導したプラスミドの誘発プロトコールでは、42
℃への温度変化が必要であり、その後の増殖は38℃で
長時間要する。p579の至適誘発プロトコールは38
℃への冷却ステップが不要であり、簡略化される。 6.コピー数が多いこと p579のλPLプロモーターは、大腸菌(Esche
richia coli)中に使用されるλ導入ファー
ジベクターに比較してプラスミド上に多いコピー数を示
す。これにより発現レベルが増加する。 7.リボソーム結合部位及び開始コドンを有すること この発現ベクターは強力な原核生物リボソーム結合部位
(RBS)と翻訳開始コドン(ATG)とを含む。従っ
て、開始コドンの付加を要せずにいかなる真核生物遺伝
子のクローニングも可能である。さらに効率の良いRB
Sによって発現レベルが増大する。リボソーム結合部位
は我々がすでにベクターpND5にクローン化したλC
IIリボソーム結合部位である。リボソーム結合部位の
配列は次の通りである。
ーム結合部位 2.β−ラクタマーゼ遺伝子のリボソーム結合部位に相
当する合成リボソーム結合部位 3.総細菌性タンパクのパーセンテージとして表示した
産生SODアナログの量略 号 AmpR=アンピシリン耐性 TetR=テトラサイクリン耐性 T1T2=転写終結配列。実施例4 ヒトアポリポプロテインE(Apo E3) Apo E3 cDNA修飾の出発点は、カリホルニ
ア,サンフランシスコのグラッドストン財団(Glad
stone Foundation)のジョーンテイラ
ー(John Taylor)博士により提供されたプ
ラスミドpNB178であった。このプラスミドは、ヒ
トApo E3遺伝子の完全長cDNAコピーを含む。
pNB178中のcDNAを修飾して、遺伝子の5′末
端の非コード化DNAを除去しかつ遺伝子の両末端にN
de I制限部位を付加した。このApo E3 cD
NAフラグメントを(1983年7月15日に出願され
た係属中の米国特許出願第514,188号に記載され
ている)ベクターpND5中に挿入した。得られたプラ
スミドpApoE−Ex2を第18図に示す。これはア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにATC
C No.39787で寄託されている。 I.pTV−188 pTV−188の構築は第18図に示されかつ前記図面
の説明に記載されている。プラスミドpTV−188
は、pApoE−Ex2のNde I−NdeIフラグ
メントを充填(filled−in)して得たApo
E3フラグメントを(第14図に示しかつ図面の説明中
に記載されている)pSODβ1T11の唯一のブラン
ト末端Stu I部位に挿入して得た。pTV−188
を当業者に公知の方法を用いる形質転換により、大腸菌
(Escherichia coli)菌株A1645
に導入した。得られたクローンを増殖及び誘発させる
と、ヒトApo E3のアナログを産生する。前記アナ
ログは、真正ヒトApo E3のN−末端に結合したヒ
トスーパーオキシドジスムターゼのN−末端配列の42
個のアミノ酸を有し、かつそのN−末端にはメチオニン
を有する。産生されたApo E3アナログは、クーマ
シー染色SDSポリアクリルアミドゲルの走査によって
計算すると、細菌により産生される総タンパクの約10
%であった。菌株の増殖のために使用した方法は、1
2.5mg/lのテトラサイクリンをアンピシリンの代
わりに使用する以外はpRO 12からのbGH産生の
ための実施例5に記載の方法と同じである。 II.pSAL160−5 pSAL160−5の構築は第23図に示されかつ前記
図面の説明中に記載されている。プラスミドpSAL1
60−5を、pTV−170(第20図参照)のAva
I−Ava I Apo E3遺伝子フラグメントに
挿入して得た。pSAL160−5を、当業者に公知の
方法を用いる形質転換によって大腸菌(Escheri
chia coli)菌株A1645に導入した。得ら
れたクローンを増殖および誘発させると、アミノ末端に
メチオニンと11個のN−末端アミノ酸が欠失している
Apo E3に融合したヒト成長ホルモンのN−末端由
来の45個のアミノ酸とを含むApo E3のアナログ
が産生される。pSAL160−5により産生されるA
po E3アナログの量は、クーマシー染色SDSポリ
アクリルアミドゲルの走査により計算すると、細菌によ
り産生される総タンパクの約5%であった。菌株の増殖
するために使用した方法は、pRO 12からのbGH
産生のための実施例5に記載されている方法と同じであ
る。実施例5 pRO 12の増殖 I.保存培養物 pRO 12の保存培養物(stock cultur
e)をカゼイン培地で増殖し(接種物参照)、次に凍結
培地で2倍に希釈し、−80℃で保存する。凍結培地は
500mlあたり以下の物質を含む。 II.接種物 接種物を20g/lカゼイン水解物,10g/l酵母抽
出物および2g/lNaCl中で増殖させた。振盪フラ
スコ中の無菌培地に保存培養物を接種し、30℃,約2
00r.p.mのシェーカー上で15時間インキュベー
トした。必要に応じ、以後の接種物増殖段階は撹拌通気
した発酵槽で行なった。無菌培地に2−10%接種物を
接種し、30℃,pH7±0.5で撹拌通気して溶存酸
素レベルを空気飽和の20%より高く維持しながら15
時間インキュベートした。 III.産生 産生培地は以下の物質を含む。 培地は100mg/lのアンピシリンも含む。アンピシ
リンは産生のためには任意成分であるが、通常接種物の
増殖用培地には添加されている。濃縮溶液中のビオチ
ン,チアミン及びアンピシリンを別々にフィルター滅菌
し、接種以前に無菌産生培地に加えた。無菌ブドウ糖溶
液を最初に10g/lになるように添加した。誘発の過
程ではブドウ糖を更に10g/l添加した。微量元素溶
液は以下の物質を含む。 培地に0.5−10%の接種培養物を接種し、30℃で
インキュベートする。撹拌−通気速度は、空気飽和の2
0%より高い溶存酸素レベルが維持されるように設定さ
れる。NH3でpHを7±0.2に維持する。細胞濃度
が約3.5g/l(OD660=10)に到達したら誘
発を始める。温度を42℃に上げ、42℃で1−5時間
維持する。次いで培養物を急冷し、ホルモン精製のため
に遠心分離によって細胞を回収する。bGHの回収 ポリトロン(Kinematica)配合装置を用い、
50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)と50
mM EDTA と100mM NaClとを含む5倍
容の溶液に13kgの細菌細胞(湿潤ケーキ)を再懸濁
させる。配合装置の速度は泡立ちを最小に抑えるように
調整する。均質懸濁液をダイノミル細胞破砕装置KD5
(Willy A.Bachofen,バーゼル)に8
0l/時の速度で連続的に通し、破砕細胞の均質懸濁液
をCEPA101遠心機で45l/時の流速で遠心して
清澄化する。遠心ステップで得られた沈殿物を回収し、
50mM EDTA含有50mMリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.4)15.5lに再懸濁させる。終濃度
0.05mg/mlまでリゾチームを加え、懸濁液を3
7℃で16時間インキュベートした。トリトン(Tri
ton)X−100を終濃度1%まで加える。次に、懸
濁液を室温で30分間インキュベートし、連続流式細胞
超音波処理装置(加熱システム)内で18l/時の速度
で超音波処理し、CEPA101遠心機で遠心する。沈
殿物を収集し、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.4)に再懸濁し、前記同様に超音波処理し、CEP
A101遠心機で遠心した。細胞を50mM BDTA
および100mM NaClを含む50mMリン酸ナト
リウム緩衝液(pH7.4)15.5lに再懸濁し、2
回沈殿させ、蒸留水15.5lに再懸濁させる。沈殿物
を遠心によって収集し、−20℃で保存する。bGHの精製 沈殿物を30−40lの蒸留水に再懸濁させ、0.5
NのNaOHでpH11.8に滴定して可溶化する。次
に溶液を連続的に超音波処理し、所要によりCEPA1
01遠心機で遠心して清澄化するか、またはワットマン
No.1濾紙を通して濾過する。清澄化プロテイン溶液
(32.61、297,000のOD280nmを含
む)を各部分が50,000−60,000ODを含む
ように分ける(6×5.4l)。各部分を夫々、5ft
2面積の100,000分子量カットオフカセット(タ
イプPTHK)を3個備えたミリポア(Millipo
re)ペリコン(Pellicon)限外濾過装置を通
して限外濾過する。5.4 l部分を1l保留分(re
tentate)容量に濃縮する。限外濾液を収集し保
存する。保留分を再び新鮮な10mMホウ酸塩緩衝液,
pH11.8でもとの容量にまで希釈し、十分に混合す
る。バッチを再び1l保留分容量に濃縮する。限外濾液
を集め、はじめの限外濾液と合わせる。限外濾液中のO
D分の流出総量が限外濾過装置に最初に充填されたOD
分の20%に等しくなるとき、次の濃縮ステップでの保
留分を1lではなく0.5lにする。濃縮および10m
Mホウ酸塩緩衝液による希釈のサイクルを、0.5lの
保留分からの限外濾液の280nm(1cmセル)での
吸光度が0.1未満になるまで継続する。これは通常9
−12回の濃縮・希釈サイクルを要する。最終保留分は
捨てる。全ての限外濾液を合せ、6N HClでpH
9.0に調節した。他の5.4l部分を同様に限外濾過
し、pH調節した限外濾液を全て一緒にする。典型的な
流出物は0.26の吸光度を有する限外濾液を総量38
0l(100,000ODに等しい)生じ、完結するに
は24−40時間を要する。100K限外濾過工程から
の合した限外濾液(280nmで100,000ODを
含む380l)を、23cm/時(25l/時)の線流
速でセファロースCL−6BDEAEイオン交換カラム
に充填する。直径37cm、高さ15cmのカラムをp
H9.0で10mMホウ酸塩緩衝液の2ベット容量(3
2L)で洗浄する。充填および洗浄ステップからの溶出
物は捨てる。10mMホウ酸塩、100mM塩化ナトリ
ウム,pH9に溶離液を変えると、カラムからbGHが
排出される。溶離流速は23cm/時である。流出の進
行を280nmでの溶出物の吸光度を追跡してモニター
する。bGHピークを4乃至5ベット容量(280nm
で43,000ODを含む84l)で収集し、10,0
00分子量カットオフカセットを備えたミリポアペリコ
ン限外濾過装置を用いて約10mg/mlに濃縮する。
次いで、溶液を凍結乾燥する。収量は純bGH約70g
である。実施例6 pRO12により産生されるbGHアナログの活性 1.bGHアナログと天然bGHとのラジオイムノアツ
セイ比較 リン酸塩緩衝生理食塩水(1%BSA)中に100ng
/mlのbGHアナログを含む溶液を調製した。この溶
液を濃度50,25,12.5,6.25,3.12,
1.56及び0.78ng/lまで順序希釈した。これ
らの溶液について各0.1mlのサンプル群2組を、二
抗体法を用いるRIAにかけた。希釈曲線は天然bGH
で得られる曲線と同等であった。 2.ラジオレセプター結合アッセイ ウサギ肝膜に対するラジオレセプター結合アッセイを、
ツシマティー(TushimaT.)及びフライセンエ
ッチ.ジー.(Freisen H.G.)[ワイ.チ
ン(Y.Chin.),エンドクル.メタボ.(End
ocr,Metab9)(1973),37,3]に記
載の方法で、125I−bGHをトレーサーとし、真正
bGH溶液を校正曲線用に用いて実施した。3組のサン
プルを0.3mlのアッセイバッファ(50mM Tr
is,15mM CaCl2及び5mg/mlウシ血清
アルブミン,pH7.6)中、室温で2時間インキュベ
ートした。試験管は、125I−bGH(30−60μ
Ci/μgの調製物20,000cpmと、150−2
50μgの肝膜タンパクと、天然bGH(1−100n
g)又は細菌bGHの抽出物のいずれかとを収容してい
た。結果は、bGHアナログのbGH活性が天然bGH
の同じ活性に匹敵することを示した。 3.脛骨テスト 実施例5の細菌細胞から回収されたpRO 12産生b
GHアナログの生物活性を脛骨テストで測定した。[パ
ルロー,エー.エフ.(Parlow A.F.)ら、
エンドクリノロジー(Endocrinology)
(1965)77,1126]。生後28〜30日のラ
ットを下垂体切除し、次に処理しないで10−14日間
維持した。ウシ下垂体又は組換体大腸菌(Escher
ichiacoli)から誘導したウシ成長ホルモンを
0.15M NaCl+0.01Mホウ酸塩,pH1
0.0に溶解した。ラット(1群4−7匹ずつ)を正常
食[プリナラット餌(Purina Rat−Cho
w)及び任意量の水]で維持し、bGH溶液の皮下注射
(0.2cc中、5−125μg/日)を5日間毎日続
けた。6日目に動物を殺し、前肢膝骨を取り出して長手
方向に切開し、アセトンで固定して2%AgNO3で染
色した。解剖双眼顕微鏡(ニコン)で観察して骨端プレ
ートの幅を測定した。(ラットあたり40回の読み取り
を行なった)平均値を用いて長期投与−応答曲線を抽い
た。結果は、pRO 12産生bGHアナログのbGH
活性が天然bGHの同じ活性に匹敵することを示した。 実施例7SODβ1T11の増殖 I.保存培養物 pSODβ1T11の保存培養物をカゼイン培地で増殖
し(接種物参照)、凍結培地で2倍に希釈し、−80℃
で保存した。凍結培地は500mlあたり次の物質を含
む。 II.接種物 接種物を20g/lカゼイン水解物,10g/l酵母抽
出物及び2g/l NaClの中で増殖させた。振盪フ
ラスコ中の無菌培地に保存培養物を接種し、30℃、約
200r.p.m.のシェーカー上で15時間インキュ
ベートした。必要に応じ、以後の接種物増殖段階は撹拌
通気した発酵槽で行なった。無菌培地に2〜10%接種
物を接種し、30℃,pH7±0.5で撹拌通気して溶
存酸素レベルを空気飽和の20%より高く維持しながら
15時間インキュベートした。 III.産生 産生培地は次の物質を含む。 培地には、12.5mg/lのテトラサイクリンも含ま
れる。テトラサイクリンは産生のためには任意成分であ
るが、通常接種物を増殖させるために使用される培地に
は添加されている。濃縮溶液中のビオチン,チアミン及
びテトラサイクリンを別々にフイルター滅菌し、接種以
前に無菌産生培地に加えた。無菌ブドウ糖溶液を最初に
10g/lになるように添加した。誘発の段階で更に1
0g/lのブドウ糖を添加した。微量元素溶液は次の物
質を含む。 培地に0.5〜10%の接種培養物を接種し、30℃で
インキュベートした。撹拌−通気速度は、空気飽和の2
0%より高い溶存酸素レベルが維持されるように設定さ
れる。NH3でpHを7±0.2に維持する。細胞濃度
が約3.5g/l(OD660=10)に達すると誘発
が始まる。温度を42℃に上げ、42℃で1〜5時間維
持する。次いで培養物を急冷し、酵素精製のために遠心
分離によって細胞を回収する。SODの回収 ポリトロン(Kinematica)配合装置を用い、
50mMリン酸ナトリウム(pH7.8)12l中に
1.5kgの細菌細胞(ウェットケーキ)を懸濁させ
る。配合装置の速度は泡立ちを最小に抑えるように調整
した。均質懸濁液をダイノミル(Dynomill)細
胞破砕装置KD5(Willy,A.Bachofe
n,バーゼル)に連続的に通す。破砕細胞の均質懸濁液
を連続流細胞を用いて超音波処理し、CEPA101遠
心機で遠心した。上清を65℃で2時間加熱し、冷却
し、前記処理と同様にして遠心した、清澄な上清を1
0,000分子量カットオフカセット(PTGC型)を
備えたミリポアペリコン限外濾過装置で1lに濃縮す
る。濃縮されたタンパク溶液を、150mMリン酸ナト
リウム緩衝液(pH7.8)で平衡したDEAE−セフ
ァロースカラム(2kgDEAEセファロース)に流
す。流出液を収集し、濃縮し、20mMトリス−HC
l,pH7.8に対してペリコン限外濾過装置で透析
し、次いで20mMトリス−HCl緩衝液で平衡したQ
AE−セファロースカラムに通す。20mMトリス−H
Cl緩衝液,pH7.8と塩勾配(0〜200mM N
aCl)でカラムを展開する。SOD含有画分を収集
し、ペリコン限外濾過装置を用いて濃縮し、蒸留水に対
して透析し、1M酢酸ナトリウム緩衝液,pH4.8を
添加して100mM酢酸ナトリウムとする。タンパク溶
液を更に100mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.7
で平衡したCM−セファロースカラムで分離する。カラ
ムを同じ緩衝液および塩勾配(100〜500mM N
aCl)で展開する。SOD含有画分を収集し、ペリコ
ン限外濾過装置を用いて濃縮し、凍結乾燥する。実施例8 pSODβ1T11により産生されるSODの活性 実施例7で調製したpSODβ1T11より産生される
SODアナログの酵素活性を、マックコード(McCo
rd)及びフライドビッチ(Fridovich),ジ
ェー・バイオロ・ケム(J.Biol.Chem.)
(1969),244:6049−6055に記載され
た如く、フエリシトクロム−cの還元抑制をモニターし
てアッセイした。得られた結果は、pSODβ1T11
生SODアナログの活性は天然ヒトSOD[シグマ(S
igma)]の活性に匹敵し、ウシSOD[オルゴテイ
ン(Orgotein):グリューネンタールGMB
H]の活性にも匹敵していることを示した。実施例9 発現ベクター I.p579 第19図に示し前記図面の説明中で詳細に説明したベク
ターp579は、PLプロモーターとN利用部位(Nu
tL)及び非反復ECo RIおよびNdeI制限部位
で境界付けられるCIIリボソーム結合部位とATG開
始コドンと大腸菌(Escherichia col
i)のrrn BリボソームRNA遺伝子オペロンの末
端に由来するT1T2転写終結シグナルとから成る。こ
れらの要素は、アンピシリン耐性遺伝子を有するpBR
322上でクローンされる。他の特徴は第19図に示さ
れている。p579は、プラスミドpPS 1上に含ま
れるT1T2転写終結シグナルをベクターpRO 21
1のHind III部位に挿入して調製される。pR
O211は第2図に示されている。pPS 1はサルミ
エントス(Sarmientos)ら、セル(Cel
l)(1983)32,1337−1346に記載さ
れ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
ATCC No.39807で寄託されている。p57
9および真核生物遺伝子を含むその誘導体を適当な大腸
菌(Escherichia coli)宿主中に維持
することもできる。宿主の最も重要な特徴は、この宿主
が熱感受性リプレッサーcI857と抗転写終結Nタン
パクを与えることである。[ゴーテスマン,エム.(G
ottesman,M.)ら、ジェー.モル.バイオ
ロ.(J.Mol.Biol.)(1980)140,
57−75]。p579は、従来の発現ベクターに比較
して以下の如き多くの利点を有する。 1.発現レベルが極めて高いこと このベクターは、大腸菌(E.coli)中の外来タン
パクの発現を総細胞タンパクの42%という高レベルで
誘発しうる。この発現レベルは、T1T2転写終結配列
を欠く他の類似のλPLプラスミドの発現レベルよりも
高い。 2.転写終結シグナル ベクターP579はλPLプロモータとCIIリボソー
ム結合部位の下流に位置するT1T2転写終結シグナル
を含む。このベクターを用いて得られる高発現レベルは
挿入された遺伝子の末端にT1T2転写終結因子が存在
していることに部分的に起因している。すなわち、この
T1T2転写終結因子はN修飾RNAポリメラーゼの転
写を集結しうるからである。このように、転写終結因子
はプラスミドの非所望タンパクのλPL制御転写を阻止
し、これにより所望のタンパクの相対収量を高める。 3.リボソーム結合部位が交換しうること p579は、リボソーム結合部位の上流に位置する唯一
のEco RI部位とATG開始コドンの所に位置する
唯一のNde I部位とを含む。従って、リボソーム結
合部位の両境界は2個の非反復制限部位である。これに
より、現在のリボソーム結合部位(λCIIリボソーム
結合部位)の切除とプラスミドの他の特徴を変えること
なく他の天然または合成リボソーム結合部位の実質的な
置換を容易に行ない得る。こうして所望ポリペプチドの
至適発現が大いに促進される。 4.発現を熱誘導的に調節し得ること λPLプロモーターは、CIリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。c1857リプレッサーは熱感
受性である。即ち、30℃ではプロモーターに結合する
が、42℃で失活する。従って、発酵温度を42℃に上
げることにより宿主細菌で所望タンパクの産生が誘発さ
れる。そのような系は以下の利点を含む。 (a)大腸菌(Escherichia coli)に
毒性の外来タンパクを発酵プロセスの後期に産生するこ
とができ、これにより早期の細胞死を回避しうる。 (b)タンパクの産生先進がこのタンパクを安定させ、
タンパク分解を阻止する[チエン,ワイ.イー(Che
ng,Y.E.)ら、ジーン(Gene)(1981)
14,121]。従って厳密に調節されたプロモーター
例えばλPLを使用する“瞬間的”産生冗進は連続的な
低レベル産生よりも好ましいであろう。 5.誘発プロトコールを簡略化しうること p579由来のプラスミドを約42℃で誘発し、タンパ
ク合成中42℃に保持する。係属中の米国特許出願第5
14,188号に記載のpMG 100およびpND5
から誘導したプラスミドの誘発プロトコールでは、42
℃への温度変化が必要であり、その後の増殖は38℃で
長時間要する。p579の至適誘発プロトコールは38
℃への冷却ステップが不要であり、簡略化される。 6.コピー数が多いこと p579のλPLプロモーターは、大腸菌(Esche
richia coli)中に使用されるλ導入ファー
ジベクターに比較してプラスミド上に多いコピー数を示
す。これにより発現レベルが増加する。 7.リボソーム結合部位及び開始コドンを有すること この発現ベクターは強力な原核生物リボソーム結合部位
(RBS)と翻訳開始コドン(ATG)とを含む。従っ
て、開始コドンの付加を要せずにいかなる真核生物遺伝
子のクローニングも可能である。さらに効率の良いRB
Sによって発現レベルが増大する。リボソーム結合部位
は我々がすでにベクターpND5にクローン化したλC
IIリボソーム結合部位である。リボソーム結合部位の
配列は次の通りである。
【化14】
1塩基対が野生型λで認められるリボソーム結合部位と
異なる。 8.適当な制限部位が存在すること 発現ベクターは、ATG開始コドンを含む唯一のNde
I制限部位を有する。これにより、所望の遺伝子を適
正に配置し得る。この唯一のNde I部位がリボソー
ム結合部位の直後にある。 9.遺伝子挿入のための適当な制限部位が存在すること Nde I制限部位の下流に位置する116塩基対に
は、順次Bgl II、Sma Iという非反復制限部
位がある。これら非反復制限部位により、所望遺伝子の
挿入が容易に行ない得る。 10.Nut 部位を有すること 宿主によって与えられるNタンパクは発現ベクター上の
Nut部位に結合し、これによりtRI部位での転写終
結またはクローン化された遺伝子内の早期転写終結が阻
止する。菌株 記載されたベクター及びプラスミドに対する適当な宿主
は、A1637,A2602,A1563,A1645
(c600r−m+gal+thr−leu−lac−
bl(λcI857ΔHIΔBamHI N+))及び
A2097(A1645 lac Δx A21 pr
oC::Tn10)を含む形質転換用に適当な大腸菌
(Escherichiacoli)の菌株である。実施例10 動物成長ホルモン I pHG44 pHG44の構築は、第6図に示されかつ前記図面の説
明中に記載され、ATCC No.39806で寄託さ
れている。このプラスミドは第2図に示すpRO 12
プラスミドに、第6図に示されサーミエントス(sar
mientos)ら、セル(cell)(1983)3
2,337−1346に記載され、ATCC No.3
9807で寄託されているプラスミドpPS 1のT1
T2転写終結配列を挿入して得られた。T1T2転写終
結配列の存在により、mRNA転写の長期間継続(lo
ng run−on)が阻止され、よってλPLプロモ
ーターのコントロール下でのβ−ラクタマーゼ遺伝子と
多分他の非所望タンパクの高レベル発現が阻止される。
プラスミドpHG 44を、当業者に公知の方法を用い
る形質転換によって大腸菌(Escherichia
coli)A2097株中に導入した。この菌株を増殖
及び誘発すると、フェニルアラニン形真正ウシ成長ホル
モン(bGH)のアミノ末端に付加されたアミノ酸配列
met−asp−glnを有するbGHのアナログが産
生する。pHG 44により産生されるbGHアナログ
の量は、クーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲ
ルの走査により計算すると、細菌により産生される総タ
ンパクの約37−42%であった。菌株の増殖、産生さ
れたbGH アナログの回収及びbGH アナログの精
製に使用した方法は実施例13に記載されている。bG
H 遺伝子の3′末端にT1T2転写終結配列を導入す
ることによりβ−ラクタマーゼ発現が顕著に抑えられて
いるため、発現レベルはpRO 12から得られる発現
レベル(表I)より高い。 II pSAL5600−1 pSAL5600−1の構築は第10図に示されかつ前
記図面の説明中に記載されている。プラスミドpSAL
5600−1は(第3図に示されている)pSAL52
00−6からプラスミドpPS 1(ATCC No.
39807)のT1T2転写終結配列を挿入して得られ
た。プラスミドpSAL5600−1を、当業者に公知
の方法を用いる形質転換により大腸菌(Escheri
chia coli)菌株A1645に導入した。この
菌株を増殖及び誘発すると、フェニルアラニン型天然b
GHのアミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニンを有
するbGHのアナログが産生された。pSAL5600
−1菌株により産生されたbGH アナログの量は、ク
ーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査に
より計算すると、細菌により産生される総タンパクの約
22−28%であった。菌株の増殖、産生されたbGH
アナログの回収及びbGH アナログの精製に使用し
た方法は、実施例13に記載のpHG 44に対する方
法と同じである。bGH 遺伝子の3′末端にT1T2
転写終結配列を導入することによりβ−ラクタマーゼ発
現が大きく抑えられているため、発現レベルはpSAL
5200−6菌株から得られるレベルよりも高かった。 III p3009 p3009の構築は、第11図に示されかつ前記図面の
説明に記載されている。P579発現ベクター(第19
図)の唯一のNde I部位にNde I−Nde I
ブタ成長ホルモンcDNAフラグメントを挿入して、プ
ラスミドp3009を得た。ブタ成長ホルモン(pG
H)フラグメントはNde I消化によりp3008
(ATCC No.39804)から単離した。プラス
ミドp3009を、当業者に公知の方法を用いる形質転
換により大腸菌(Escherichia coli)
菌株A1645に導入した。この菌株は増殖及び誘発す
ると、フェニルアラニン形天然 pGHのアミノ末端に
付加されたアミノ酸メチオニンを有するpGHのアナロ
グが産生された。産生されたpGH アナログの量は、
クーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査
により計算すると、細菌により産生される総タンパクの
約30−35%であった。菌株を増殖、産生されたpG
H アナログの回収及びpGH アナログの精製に使用
した方法は、実施例13に記載されているpHG 44
に対する方法と同じである。pHG 遺伝子の3′末端
にT1T2転写終結配列が導入されてβ−ラクタマーゼ
発現が大きく抑えられているために、p3009の発現
レベルはp3008菌株から得られるレベルに比して高
かった。 IV p5003 p5003の構築は第12図に示されかつ前記図面の説
明中に記載されている。p5003はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションにATCC No.39
792で寄託されている。p579発現ベクターの非反
復Nde I部位にNde I−Nde Iニワトリ成
長ホルモンcDNAフラグメントを挿入して、プラスミ
ドp5003を得た。プラスミドp5003を、当業者
に公知の方法を用いる形質転換により大腸菌(Esch
erichia coli)菌株A2097に導入し
た。この菌株は増殖及び誘発すると、フェニルアラニン
形天然ニワトリ成長ホルモン(cGH)のアミノ末端に
付加されたアミノ酸メチオニンを有するcGHのアナロ
グが産生された。産生されたcGHアナログの量は、ク
ーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査に
より計算すると、細菌により産生される総タンパクの約
30−35%であった。菌株を増殖、産生されるcGH
アナログの回収及びcGH アナログを精製するため
に使用した方法は、実施例13に記載したpHG44に
対する方法と同じである。ある。cGH遺伝子の3′末
端にT1T2転写終結配列が導入することによりβ−ラ
クタマーゼの発現が大きく抑えられているため、p50
03の発現レベルはp5002菌株から得られるレベル
よりも高かった。実施例11 ヒトCu−Znスーパーオキシドジスムターゼ(SO
D) I pSODβ1TT−1 pSODβ1TT−1構築は第16図に示されかつ図面
の説明中に記載されている。プラスミドpSODβ1T
T−1は、pSODβ1T11(第15図)のSOD遺
伝子の3′末端にT1T2終結配列を挿入した得た。プ
ラスミドpSODβ1TT−1を、当業者に公知の方法
を用いる形質転換で大腸菌(Escherichia
coli)菌株A1645に導入した。この菌株を増殖
するとSODアナログを産生した。産生したSOD ア
ナログの量は、クーマシー染色SDS ポリアクリルア
ミドゲルの走査により計算すると、細菌により産生され
る総タンパクの約10−15%であった。菌株の増殖、
産生されるSOD アナログの回収及びSOD アナロ
グの精製に使用した方法は実施例15に記載されてい
る。非所望DNA 配列の転写及び翻訳がT1T2誘発
で抑えられているために、pSODβ1TT−1の発現
レベルはpSODβ1T11(表II)から得られるレ
ベルより高かった。アミノ酸配列解析化学量論により示
される如くアミノ末端アラニンがアセチル化されていな
い点で、産生されたヒトCu−ZnSODアナログは天
然ヒトCu−ZnSODとは異なる。天然ヒトSODは
アミノ末端アラニンでアセチル化されている[ハーツ,
ジェー.ダブリュー.(Hartz,J.W.)及びド
イッチェ,エィチ.エフ.(Deutsch,H.
F.)、ジェー.バイオロ.ケム.(J.Biol.C
hem)(1972)247:7043−7050、ヤ
ーブッシュ,ジェー.アール.(Jabusch,J.
R.)ら、バイオケミストリー(Biochemist
ry)(1980)19:2310−2316;バーラ
(Barra)ら、FEBSレターズ(Letter
s)(1980)120,53及びオバーレイ,エル.
ダブリュ.(Oberley,L.W.),スーパーオ
キシドジスムターゼ(Superoxide Dism
utase)VoL.I,CRCプレス,フロリダ,
(1982),pp.32−33]。天然ヒトSODは
グリコシル化されている[ヒューバー,ダブリュ.(H
uber,W.)、1971年5月18日付発刊米国特
許第3,579,495号]。大腸菌(Escheri
chia coli)は自身が産生するタンパクをグリ
コシル化しないので、細菌産生ヒトSODは殆んど全く
グリコシル化されていない。細菌産生SODアナログの
アミノ酸配列は成熟ヒトSODのアミノ酸配列と同一で
あり、N−末端にメチオニン残基を含まない。実施例12 ヒトアポリポプロテインE3(Apo−E3) I pTV−170 pTV−170の構築は第20図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。pApoE−EX2(AT
CC No.39787)由来のNde I−Nde
I Apo−E3フラグメントを発現ベクターp579
の非反復NdeI部位に挿入して、プラスミドpTV−
170を得た。pTV−170を当業者に公知の方法を
使用する形質転換により大腸菌(Escherichi
a coli)菌株A1645に導入した。得られたク
ローンを増殖させると、多分天然ヒトApo E3のア
ミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニンを有するヒト
Apo E3が産生された。産生されたヒトApo E
3アナログの量は、クーマシー染色SDSポリアクリル
アミドゲルの走査により計算すると、細菌により産生さ
れる総タンパクの約1%であった。菌株を増殖するのに
使用した方法は実施例17に記載されている。 II pTV−194 pTV−194の構築は第22図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。pTV−170(第20
図)から、CIIリボソーム結合部位をpBLA11由
来のβ−ラクタマーゼプロモーターとリボソーム結合部
位で置換すると、pTV−194が誘導された。pBL
A11は、pBR322中の座標4157と4353の
間にあるβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーターとリボ
ソーム結合部位とを含む。Eco RIリンカーをプロ
モーターの上流に付加し、マルチ制限部位リンカーを開
始コドンATGの直後に付加した。従って、開始コドン
を始めとするコード鎖の配列は、ATGAGCTCTA
GAATTCである。pBLA11はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションにATCC No.39
788として寄託された。pTV−194を、当業者に
公知の方法を用いる形質転換によって大腸菌(Esch
erichia coli)菌株A1645に導入し
た。得られたクローンを増殖すると、多分天然ヒトAp
o E3のアミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニン
を有するヒトApo E3のアナログが産生された。産
生されたヒトApo−Eアナログの量は、クーマシー染
色SDSポリアクリルアミドゲルの走査により計算する
と、細菌により産生される総タンパクの約3%であっ
た。菌株を増殖するのに使用された方法は実施例17に
記載されているpTV−170に対する方法と同じであ
る。 III pTV−214 pTV−214の構築は第24図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。ヒト成長ホルモンの14個
のアミノ酸アミノ末端配列をコードする合成DNAフラ
グメントをpTV−190の非反復Nde I部位に挿
入することにより、(第21図に示されかつ前記図面の
説明中に記載されている)pTV−190からpTV−
214を誘導した。pTV−214を、当業者に公知の
方法を用いる形質転換により大腸菌(Escheric
hia coli)菌株A1645に導入した。得られ
たクローンを増殖及び誘発すると、ヒトApo E3の
アナログが産生された。前記アナログは、アミノ末端に
ヒト成長ホルモンの14個のアミノ酸アミノ末端配列と
それに続く成熟ヒトApo E3の配列に付随したメチ
オニンとを有する。産生されたヒトApo Eアナログ
の量は、クーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲ
ルの走査により計算すると、細菌により産生された総タ
ンパクの約2%であった。菌株を増殖するために使用し
た方法は実施例17に記載されているpTV−170に
対する方法と同じである。実施例13 pHG 44の増殖 I.保存培養株 pHG 44の保存株をカゼイン培地(接種材料の項参
照)上で増殖させた後、凍結培地で2倍に希釈し、−8
0℃で保存した。凍結培地は500ml中の含有成分を
以下に示す。 II.接種材料 接種材料を、カゼイン水解物20g/l、酵母エキス1
0g/l及びNaCl2g/l中で増殖させた。振盪フ
ラスコ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で30
℃及び約200r.p.mで15時間培養した。必要に
応じ、撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実
施した。滅菌培地に2−10%の接種材料培養株を接種
し、空気飽和の20%を越えるような溶存酸素濃度を保
つように撹拌及び通気しながら30℃、pH7±0.5
で15時間培養した。 III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には更にアンピシリン100mg/lを含有させ
た。アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材
料の増殖用に使用される培地中で常に見出されるもので
ある。ビオチン、チアミン及びアンピシリンの濃縮溶液
をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添
加した。まず10g/lまで滅菌グルコース溶液を添加
した。誘導段階で更に10g/lのグルコースを添加し
た。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に0.5−10%の接種材料培養株を接種し、30
℃で培養した。空気飽和の20%を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHはNH
3で7±0.2に維持した。細胞濃度が約3.5g/l
(OD660=10)に達してから誘導を開始した。温
度を42℃まで上昇させ、42℃を1−5時間維持し
た。次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に遠心分離法
により細胞を回収した。bGHの回収 ポリトロン(キネマテイカ)(Polytron(Ki
nematica))混合機を使用し、発泡を最小化す
るように該混合機の速度を調節しながら、50mMリン
酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、50mM EDT
A及び100mMNaClを含有する溶液5容量中に、
細菌細胞13kg(湿潤ケーキ)を再懸濁させた。均質
な懸濁液を80l/時でダイノミル細胞破砕器ケー.デ
ィー・5(ウイリー・エイ・バシヨフエン、バーゼル)
(Dynomill celldisruptor K
D5(Willy A.Bachofen,Base
l))に連続的に通し、破砕した細胞の均質懸濁液を、
流量45l/時でシー・イー・ピー・エイ(CEPA)
101遠心機で遠心分離により清澄化させた。遠心分離
段階で分離された沈殿物を収集し、50mM EDTA
を含有する50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.
4)15.5l中に再懸濁させた。最終濃度が0.05
mg/mlになるまでリゾチームを添加し、懸濁液を3
7℃で16時間インキュベートした。最終濃度が1%に
なるまでトリトン・エックス(Triton X)−1
00を添加した。次に懸濁液を室温で30分間インキュ
ベートし、連続フローセル音波処理装置(熱システム)
内で18l/時で音波処理し、シー・イー・ピー・エイ
・101遠心機内で遠心分離した。沈殿物を収集し、5
0mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中に再懸
濁させ、前記と同様に音波処理し、シー・イー・ピー・
エイ・101遠心機内で遠心分離した。50mMEDT
A及び100mMNaClを含有する50mMリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH7.4)15.5l中に細胞を再
懸濁させ、2度沈殿させ、蒸留水15.5l中に再懸濁
させた。遠心分離により沈殿物を収集し、−20℃で保
存した。bGHの精製 沈殿物を蒸留水30−40l中に再懸濁させ、0.5N
NaOHでpH11.8に滴定して可溶化させた。次に
溶液を連続的に音波処理し、必要に応じてシー・イー・
ピー・エイ・101遠心機内で遠心分離により清澄化さ
せ、又はワットマン(Whatman)No.1濾紙で
濾過した。清澄化させた蛋白質溶液(280nm OD
=297000の溶液32.6l)を、それぞれ500
00−60000ODの各部分(6×5.4l)に分割
した。各面積5ft2の3個の100000分子量カッ
トオフカセット(ピー・ティー・エイチ・ケーPTHK
型)を備えるミリポア・ペリコン(Millipore
Pellicon)限外濾過器で各部分をそれぞれ限
外濾過した。5.4l部分を保持物(retentat
e)容量1lまで濃縮した。限外濾過物を収集し、保存
した。保持物をpH11.8の別の10mMホウ酸塩緩
衝液で当初の容量まで希釈し、十分混合した。バッチを
保持物容量1lまで再び濃縮した。限外濾過物を収集
し、先の限界濾過物と混合した。両者の限外濾過物中の
ODの合計値が、限外濾過器に初期にチャージされたO
Dの20%になったら、次の濃縮段階の保持物容量を1
lでなく0.5lとした。0.5lの保持物容量からの
限外濾過物の吸光度が280nm(1cmセル)で0.
1より小さくなるまで、濃縮及び10mMホウ酸塩緩衝
液による希釈のサイクルを継続した。一般に、濃縮及び
希釈サイクル数は9から12の範囲とした。最終保持物
を排出した。全限外濾過物を合し、6NHClでpH
9.0に調整した。別の5.4 1部分を同様に限外濾
過し、pH調整済みの全限外濾過物を合した。代表的な
一工程から、OD=100000に相当する吸光度0.
26の限外濾過物総量380lが産生され、所要時間は
24から40時間であった。100K限外濾過段階で合
した限外濾過物(280nmでOD=100000の濾
過物380l)を、線流速23cm/時(25l/時)
でセファロース・シー・エル・6・ビー、ディー・イー
・エー・イー(Sepharose CL−6B DE
AE)イオン交換カラムに通した。直径37cm、高さ
15cmのカラムを、pH9.0の10mMホウ酸塩緩
衝液2床容量(32L)で洗浄した。充填及び洗浄段階
からの溶出液を排出した。溶離液を段階的に10mMホ
ウ酸塩、10mM塩化ナトリウム、pH9に変化させ、
bGHをカラムから排出した。溶出流速は23cm/時
とした。280nmにおける溶出液の吸光度を追跡する
ことにより、工程の進行を監視した。bGHピークを4
から5床容量(280nmでOD=43000の容量8
41)収集した後、10000分子量カットオフカセッ
トを有するミリポア・ペリコン限外慮過器を使用して約
10mg/mlに濃縮した。次に溶液を凍結乾燥した。
収量は、純粋bGH約70gであった。実施例14 pHG 44により産生されるbGHアナログの活性 1.天然bGHに対するbGH アナログのラジオイム
ノアッセイ比較 リン酸塩でpHを調節した食塩水(1%BSA)中にb
GH アナログ100ng/mlを含有する溶液を調製
した。該溶液を逐次、濃度50,25,12.5,6.
25,3.12,1.56及び0.78ng/lに希釈
した。これらの溶液の0.1ml アリコート1対に対
して、二抗体法によりRIAを行った。希釈曲線は、天
然bGHで得られる場合と同等であった。 2.ラジオレセプタ結合アッセイ トレーサとして125I−bGH及び較正曲線用として
真正bGH溶液を使用し、ツシマ・ティーTushim
a,T及びフレイセン・エイチ・ジーFreisen,
H.G.(ワイ・チン「内分泌代謝」Y.Chin.,
EndocrMetab.(1973),37,3)に
より記載されているように、ウサギ肝臓膜でラジオレセ
プタ結合アッセイを行った。アッセイ用緩衝液0.3m
l(50mMトリス、15mMCaCl2及びウシ血清
アルブミン5mg/ml、pH7.6)中で室温で3組
の試料を2時間インキュベートした。管には、125I
−bGH(30−60μCi/μgの調製に20000
cpm)、肝臓膜蛋白質150−250μg、及び天然
bGH(1−100ng)又は細菌bGHエキスのいず
れかを充填した。その結果、bGH アナログのbGH
活性は天然bGHのbGH活性と同等であることが認め
られた。 3.脛骨試験 実施例13に従い細菌細胞から回収したpRO 12か
ら産生したbGH アナログの生物活性を脛骨試験によ
り評価した。(パーロウ・エイ・エフ他「分泌学」Pa
rlow,A.F.,et al.,Endocrin
ology(1965)77,1126参照。)ラット
の下垂体を28−30日齢で切除した後、無処置で10
−14日間置いた。ウシ下垂体又は組換体大腸菌(Es
cherichia coli)から誘導されたウシ成
長ホルモンをpH10.0の0.01Mホウ酸塩と共に
0.15MNaClに溶解させた。ラット(1群4−7
匹)に毎日bGH溶液(0.2cc中に5−125μg
/日)を5日間皮下注射し、この間常用飼料(プリナラ
ットチャウ及び任意に水)を与え続けた。動物を6日目
に殺し、前脚膝骨を取出し、長手方向に切断し、アセト
ンで固定し、2%AgNO3で染色した。解剖双眼鏡
(ニコン)で観察することにより骨端板の幅を測定し
た。平均値(ラット1匹当たりの読み40回)を使用し
て長い投与−応答曲線を形成した。この結果、bHG
44から産生したbGH アナログのbGH 活性が天
然bGHのbGH 活性と同等であることが認められ
た。実施例15 pSODβ1TT−1の増殖 I.保存培養株 pSODβ1T11の保存株をカゼイン培地(接種材料
の項参照)上で増殖させた後、凍結培地で2倍に希釈
し、−80℃で保存した。凍結培地500ml中の含有
成分を以下に示す。 II.接種材料 カゼイン水解物20g/l、酵母エキス10g/l及び
NaCl2g/l中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存株を接種し、30℃及び約20
0r.p.mで振盪器上で15時間培養した。必要に応
じて撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実施
した。滅菌培地に2−10%の接種材料を接種し、空気
飽和の20%を越えるような溶存酸素濃度を維持するよ
うに撹拌及び通気しながら30℃、pH7±0.5で1
5時間培養した。 III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には更にテトラサイクリン12.5mg/lを含有
させた。テトラサイクリンは産生に任意の成分である
が、接種材料の増殖用に使用される培地中には常に含有
されている。ビオチン、チアミン及びテトラサイクリン
の濃度溶液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生
用培地に添加した。滅菌グルコース溶液をまず10g/
lまで添加した。誘導段階で更に10g/lのグルコー
スを添加した。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に0.5−10%の接種材料培養株を接種し、30
℃で培養した。空気飽和の20%を越えるような溶存酸
素濃度を維持するように撹拌通気率を設定した。pHを
NH3で7±0.2に保った。細胞濃度が約3.5g/
l(OD660=10)に達してから誘導を開始した。
温度を42℃まで上昇させ、1−5時間42℃を保っ
た。次に培養株を冷却し、酵素精製用に遠心分離法によ
り細胞を回収した。SODの回収 発泡を最小化するように速度を調節しながらポリトロン
(キネマテイカ)混合機内で50mMリン酸ナトリウム
(pH7.8)12l中に細菌細胞1.5kg(湿潤ケ
ーキ)を懸濁させた。均質懸濁液をダイノミル細胞破砕
器ケー・ディー・5(ウイリー・エイ・バシヨフエン、
バーゼル)に連続的に通過させた。連続フローセルを使
用して破砕細胞の均質懸濁液を音波処理し、シー・イー
・ピー・エイ・101遠心機内で遠心分離した。上清を
65℃で2時間加熱し、冷却して前記と同様に遠心分離
した、10000分子量カットオフカセット(ピー・テ
ィー・ジー・シー型)を使用するミリポアペリコン限外
濾過装置内で清澄な上清を1lまで濃縮した。濃縮され
た蛋白質溶液を、150mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.8)で平衡化されたディー・イー・エイ・イ
ー・セファロースカラム(2kgディー・イー・エイ・
イー・セファロース)に通した。溶液中の流れを収集
し、濃縮し、ペリコン限外濾過装置内でpH7.8の2
0mMトリスHClで透析してから、20mMトリスH
Cl緩衝液で平衡化されたキュー・エイ・イー・セファ
ロースカラム上に置いた。pH7.8の20mMトリス
HCl緩衝液及び塩勾配(0−200mMNaCl)で
カラムを展開させた。SOD含有フラクションを収集
し、ペリコン限外濾過装置で濃縮し、蒸留水で透析した
後、pH4.8の1M酢酸ナトリウム緩衝液を添加する
ことにより100mM酢酸ナトリウムとした。pH4.
7の100mM酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化されたシ
ー・エム・セファロースカラム上で蛋白質溶液を更に分
離した。同一緩衝液及び塩勾配(100−500mMN
aCl)を使用してカラムを展開させた。SOD含有フ
ラクションを収集し、ペリコン限外濾過装置で濃縮し、
凍結乾燥した。実施例16 pSODβ1TT−1により産生されるSODの活性 マックコード及びフリドヴィチ、生化学誌(McCor
d and Fridovich,J.Biol.Ch
em)(1969),244,6049−6055に記
載されているようにフエリシトクロム・シーの還元抑制
を監視することにより、実施例15のpSODβ1TT
−1により産生されたSOD アナログの酵素活性を分
析した。その結果、pSODβ1TT−1から産生され
たSODアナログの活性は、天然のヒトSOD の活性
及びウシSOD (オルゴテイン:グルネンタール・ゲ
ー・エム・ベー・ハーorgotein:Grunen
thal GMBH)の活性と同等であると認められ
た。実施例17 pTV−170の増殖 I.保存培養株 pTV−170の保存株をカゼイン培地(接種材料の項
参照)上で増殖させ、凍結培地で2倍に希釈し、−80
℃で保存した。凍結培地500ml中の含有成分を以下
に示す。 II.接種材料 カゼイン水解物20g/l、酵母エキス10g/l及び
NaCl2g/l中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で30℃
及び約200r.p.mで15時間培養した。必要に応
じて、撹拌通気発酵器内で接種材料増殖の後続段階を実
施した。滅菌培地に2−10%の接種材料を接種し、空
気飽和の20%を越えるような溶存酸素濃度を保つよう
に撹拌及び通気しながら30℃、pH7±0.5で15
時間培養した。 III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には更にアンピシリン100mg/lを含有させ
た。アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材
料の増殖用として使用される培地中には常に見出され
る。ビオチン、チアミン及びアンピシリンの濃度溶液を
それぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添加
した。滅菌グルコース溶液をまず10g/lまで添加し
た。誘導段階で更に10g/lのグルコースを添加し
た。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に0.5−10%の接種材料培養株を接種し、30
℃で培養した。空気飽和の20%を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHをNH
3で7±0.2に維持した。細胞濃度が約3.5g/l
(OD660=10)に達してから誘導を開始した。温
度を42℃まで上昇させ、15時間42℃を保った。次
に培養株を冷却し、蛋白質精製用に遠心分離法により細
胞を回収した。実施例18 ウシ成長ホルモン pHG 50 pHG 50の構築は第6図に示され図面の説明中に説
明してある。pHG44(エイ・ティー・シー・シー・
ATCC番号39806)の単一Cla I部位にpS
K 434(ATCC番号39784)のHpa II
−Hpa IIλcI434フラグメントを挿入するこ
とによりプラスミドpHG 50を得た。同様にしてプ
ラスミドpHG 51を構築した。しかし乍ら、プラス
ミドpHG 50と比較してλimm434cI+フラ
グメントはプラスミド内で逆配向(opposite
orientation)に見出された。λimm43
4をBam HIで消化し、Bam HIで消化された
pBR322に混合物を連結させることによりpSK
434(ATCC番号39784)を構築した。連結さ
れた混合物で大腸菌A2097を形質転換し、λimm
434cI3003ファージに免疫性のコロニーを単離
した。これらのコロニーの1個から単離したプラスミド
pSK 434は6kb Bam HIフラグメントを
含んでおり、該フラグメントはλcI434遺伝子を含
んでおりかつN遺伝子外からP遺伝子外に伸びていた。
pSK434は第6図の制限地図を有する。当業者に公
知の方法を使用する形質転換により、pHG 50及び
pHG 51を大腸菌菌株A1645に導入した。得ら
れたクローン、それぞれA3108及びA3112は、
増殖及び誘導後、フェニルアラニン形天然bGH のア
ミノ末端に付加されたアミノ酸配列met−asp−g
ln を有するbGH アナログを産生した。産生され
たbGHアナログの量を、クーマシーで染色したエス・
ディー・エス・ポリアクリルアミドゲルを走査すること
により計算した処、細菌により産生される総蛋白質量の
37−42%の範囲であった(第1表)。プロファージ導入 λcI434選択系を使用するためには、pHG 50
を含有する細胞がプロファージλimm434cI−を
も含有していなければならない。本発明者はプロファー
ジとしてλimm434cI3003mini Tn
10Δ16Δ17を使用した。まれに起こる安定的なプ
ロファージ挿入現象の単離を容易にするために、min
i Tn 10Δ16Δ17テトラサイクリン耐性マー
カ(フォスター他、細胞(Foster,et a
l.,cell)(1981)23,201−213)
をファージ中に導入した。他方、この結果、テトラサイ
クリン耐性を監視することにより、プロファージの存在
を簡単に試験することも可能になった。アンピシリンの
存在下で増殖したプラスミドpHG 50を含有する大
腸菌菌株A1645に、30℃で低感染多重度でλim
m434cI3003miniTn 10Δ16Δ17
を感染させた。テトラサイクリン耐性コロニーを単離
し、精製した。前記菌株はアメリカ菌寄託センター(A
merican Type Collection C
enter)にATCC番号39805で寄託されてい
る。別の方法として、大腸菌1645をpHG 50及
びλimm434cI3003mini Tn 10Δ
16Δ17で同時に形質転換し、アンピシリン及びテト
ラサイクリンの双方に耐性のコロニーを選択することに
より、プロファージを導入した。ベクター及びプラスミ
ドに好適な宿主は、A1637,A2602,A156
3,A1645(C600ΔHΔBam HIr−m+
gal+thr−leu−Bl)又はA2097(A1
645 lacΔx A21,proC::Tn10)
を包含する形質転換に好適な大腸菌の菌株である。上記
と同様にして所望のプロファージを全菌株に導入するこ
とができる。pHG 及びbGH 遺伝子の切除により
該pHG から誘導され得るベクターは、従来開示され
ている発現ベクターに対して、以下の点を含む多くの利
点を有する。 1.プラスミド安定性の改良 プラスミドは、λimm434cI−溶原素を抑制する
cI434リプレッサ遺伝子を含んでいる。プラスミド
が損失すると、λimm434cI−プロファージ誘導
により細菌細胞溶菌が生じる。従って、高価な抗生物質
選択系を使用しなくてもプラスミドは安定的に保たれ
る。第III表は、cI434安定化系を有するプラス
ミドの高安定性を示している。λPLプロモーターの不
耐熱性リプレッサーがCIであるにも拘らず、cI
434プラスミド安定化系は、熱誘導性λPLプロモー
タ発現系と同時に利用することができる。λimm43
4cI−プロファージはいずれもλimm434cI3
003プロファージと置換できることに留意すべきであ
る。又、任意の抗生物質耐性マーカを先にmini T
n 10Δ16Δ17に導入したテトラサイクリン耐性
マーカと置換することができる。λimm21及びλi
mm22のリプレッサーマイナス突然変異体が入手でき
るので、λ434系の代わりにファージ21又はファー
ジ22の同等の系を使用することができる。 2.非常に高い発現レベル このプラスミドは、総細胞蛋白質の42%という高レベ
ルで大腸菌中に外来蛋白質を発現させることが可能であ
る。この発現レベルは、T1T2転写終結配列を含まな
い他の同様のλPLプラスミドについて記載されている
発現レベルよりも高い。 3.転写終結暗号 プラスミドは、λPLプロモーター及びCIIリボソー
ム結合部位の「下流」に配置されたT1T2転写終結暗
号を含んでいる。T1T2転写ターミネータはN修飾R
NAポリメラーゼの転写を終結させ得るので、このプラ
スミドを使用する場合に得られる高発現レベルは部分的
に、挿入遺伝子の端部にあるT1T2転写ターミネータ
の存在に起因し得る。従って、この転写ターミネータは
好ましくないプラスミド蛋白質のλPL制御転写を阻止
し、その結果、所望の蛋白質の相対収量を向上させる。 4.置換可能なリボソーム結合部位 pHG 50は、リボソーム結合部位の「上流」に位置
する1個のEco RI部位と、ATG開始コドンに位
置するNde I部位1個とを含んでいる。従って、リ
ボソーム結合部位は2個の別々の制限部位によりその両
端が定められている。このため、プラスミドの他の特徴
を変えることなく、容易に現在のリボソーム結合部位
(λCIIリボソーム結合部位)を切除して別のほとん
どあらゆる天然又は合成リボソーム結合部位に置換する
ことができる。こうして、所望のポリペチドの最適発現
が著しく容易になる。 5.発現の熱誘導調節 λPLプロモーターは、CIリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。cI857リプレッサーは熱感
受性である。即ち該リプレッサーは30℃ではプロモー
ターに結合するが、42℃では不活性化する。従って、
発酵温度を42℃に上昇させることにより、宿主細菌は
所望の蛋白質を産生するように誘導される。このような
系の利点を以下に述べる。 (a)大腸菌に対して毒性の外来蛋白質が後期に産生さ
れ得るので、発酵プロセス中における初期細胞死が避け
られる。 (b)蛋白質の過剰産生により蛋白質が安定化し、蛋白
質分解が阻止され得る。(チエン、ワイ・イー他、遺伝
子(Cheng,Y.E.,etal.,Gene)
(1981)14,121)。従って、λPLのような
厳密に調整されたプロモーターを使用する「一時的」過
剰産生の方が、連続的低レベル産生よりも好適である。 6.誘導プロトコールの単純化 pHG 50は約42℃で誘導され、蛋白質合成期間を
通して42℃に保たれる。本願出願人名義の米国特許出
願第514188号に記載されているpMG100及び
pND 5から誘導されたプラスミドの誘導プロトコー
ルは、42℃で誘導後、38℃の増殖期間を設けること
を定めている。pHG 50の最適誘導プロトコールは
38℃まで冷却する段階を必要としないので単純であ
る。 7.高コピー数 プラスミド上に見出されるpHG 50中のλPLプロ
モーターは、大腸菌中のλ形質導入ファージベクターよ
りもコピー数が多い。従って、発現レベルが向上する。 8.リボソーム結合部位及び開始コドン この発現ベクターは、強力な原核性リボソーム結合部位
(RBS)及び翻訳開始コドン(ATG)を含んでい
る。従って、開始コドンを添加することなくあらゆる真
核性遺伝子がクローン化され得る。更に、高効率のRB
S は発現レベルを向上させる。リボソーム結合部位は
λCIIリボソーム結合部位である。リボソーム結合部
位の配列を以下に示す。
異なる。 8.適当な制限部位が存在すること 発現ベクターは、ATG開始コドンを含む唯一のNde
I制限部位を有する。これにより、所望の遺伝子を適
正に配置し得る。この唯一のNde I部位がリボソー
ム結合部位の直後にある。 9.遺伝子挿入のための適当な制限部位が存在すること Nde I制限部位の下流に位置する116塩基対に
は、順次Bgl II、Sma Iという非反復制限部
位がある。これら非反復制限部位により、所望遺伝子の
挿入が容易に行ない得る。 10.Nut 部位を有すること 宿主によって与えられるNタンパクは発現ベクター上の
Nut部位に結合し、これによりtRI部位での転写終
結またはクローン化された遺伝子内の早期転写終結が阻
止する。菌株 記載されたベクター及びプラスミドに対する適当な宿主
は、A1637,A2602,A1563,A1645
(c600r−m+gal+thr−leu−lac−
bl(λcI857ΔHIΔBamHI N+))及び
A2097(A1645 lac Δx A21 pr
oC::Tn10)を含む形質転換用に適当な大腸菌
(Escherichiacoli)の菌株である。実施例10 動物成長ホルモン I pHG44 pHG44の構築は、第6図に示されかつ前記図面の説
明中に記載され、ATCC No.39806で寄託さ
れている。このプラスミドは第2図に示すpRO 12
プラスミドに、第6図に示されサーミエントス(sar
mientos)ら、セル(cell)(1983)3
2,337−1346に記載され、ATCC No.3
9807で寄託されているプラスミドpPS 1のT1
T2転写終結配列を挿入して得られた。T1T2転写終
結配列の存在により、mRNA転写の長期間継続(lo
ng run−on)が阻止され、よってλPLプロモ
ーターのコントロール下でのβ−ラクタマーゼ遺伝子と
多分他の非所望タンパクの高レベル発現が阻止される。
プラスミドpHG 44を、当業者に公知の方法を用い
る形質転換によって大腸菌(Escherichia
coli)A2097株中に導入した。この菌株を増殖
及び誘発すると、フェニルアラニン形真正ウシ成長ホル
モン(bGH)のアミノ末端に付加されたアミノ酸配列
met−asp−glnを有するbGHのアナログが産
生する。pHG 44により産生されるbGHアナログ
の量は、クーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲ
ルの走査により計算すると、細菌により産生される総タ
ンパクの約37−42%であった。菌株の増殖、産生さ
れたbGH アナログの回収及びbGH アナログの精
製に使用した方法は実施例13に記載されている。bG
H 遺伝子の3′末端にT1T2転写終結配列を導入す
ることによりβ−ラクタマーゼ発現が顕著に抑えられて
いるため、発現レベルはpRO 12から得られる発現
レベル(表I)より高い。 II pSAL5600−1 pSAL5600−1の構築は第10図に示されかつ前
記図面の説明中に記載されている。プラスミドpSAL
5600−1は(第3図に示されている)pSAL52
00−6からプラスミドpPS 1(ATCC No.
39807)のT1T2転写終結配列を挿入して得られ
た。プラスミドpSAL5600−1を、当業者に公知
の方法を用いる形質転換により大腸菌(Escheri
chia coli)菌株A1645に導入した。この
菌株を増殖及び誘発すると、フェニルアラニン型天然b
GHのアミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニンを有
するbGHのアナログが産生された。pSAL5600
−1菌株により産生されたbGH アナログの量は、ク
ーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査に
より計算すると、細菌により産生される総タンパクの約
22−28%であった。菌株の増殖、産生されたbGH
アナログの回収及びbGH アナログの精製に使用し
た方法は、実施例13に記載のpHG 44に対する方
法と同じである。bGH 遺伝子の3′末端にT1T2
転写終結配列を導入することによりβ−ラクタマーゼ発
現が大きく抑えられているため、発現レベルはpSAL
5200−6菌株から得られるレベルよりも高かった。 III p3009 p3009の構築は、第11図に示されかつ前記図面の
説明に記載されている。P579発現ベクター(第19
図)の唯一のNde I部位にNde I−Nde I
ブタ成長ホルモンcDNAフラグメントを挿入して、プ
ラスミドp3009を得た。ブタ成長ホルモン(pG
H)フラグメントはNde I消化によりp3008
(ATCC No.39804)から単離した。プラス
ミドp3009を、当業者に公知の方法を用いる形質転
換により大腸菌(Escherichia coli)
菌株A1645に導入した。この菌株は増殖及び誘発す
ると、フェニルアラニン形天然 pGHのアミノ末端に
付加されたアミノ酸メチオニンを有するpGHのアナロ
グが産生された。産生されたpGH アナログの量は、
クーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査
により計算すると、細菌により産生される総タンパクの
約30−35%であった。菌株を増殖、産生されたpG
H アナログの回収及びpGH アナログの精製に使用
した方法は、実施例13に記載されているpHG 44
に対する方法と同じである。pHG 遺伝子の3′末端
にT1T2転写終結配列が導入されてβ−ラクタマーゼ
発現が大きく抑えられているために、p3009の発現
レベルはp3008菌株から得られるレベルに比して高
かった。 IV p5003 p5003の構築は第12図に示されかつ前記図面の説
明中に記載されている。p5003はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションにATCC No.39
792で寄託されている。p579発現ベクターの非反
復Nde I部位にNde I−Nde Iニワトリ成
長ホルモンcDNAフラグメントを挿入して、プラスミ
ドp5003を得た。プラスミドp5003を、当業者
に公知の方法を用いる形質転換により大腸菌(Esch
erichia coli)菌株A2097に導入し
た。この菌株は増殖及び誘発すると、フェニルアラニン
形天然ニワトリ成長ホルモン(cGH)のアミノ末端に
付加されたアミノ酸メチオニンを有するcGHのアナロ
グが産生された。産生されたcGHアナログの量は、ク
ーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査に
より計算すると、細菌により産生される総タンパクの約
30−35%であった。菌株を増殖、産生されるcGH
アナログの回収及びcGH アナログを精製するため
に使用した方法は、実施例13に記載したpHG44に
対する方法と同じである。ある。cGH遺伝子の3′末
端にT1T2転写終結配列が導入することによりβ−ラ
クタマーゼの発現が大きく抑えられているため、p50
03の発現レベルはp5002菌株から得られるレベル
よりも高かった。実施例11 ヒトCu−Znスーパーオキシドジスムターゼ(SO
D) I pSODβ1TT−1 pSODβ1TT−1構築は第16図に示されかつ図面
の説明中に記載されている。プラスミドpSODβ1T
T−1は、pSODβ1T11(第15図)のSOD遺
伝子の3′末端にT1T2終結配列を挿入した得た。プ
ラスミドpSODβ1TT−1を、当業者に公知の方法
を用いる形質転換で大腸菌(Escherichia
coli)菌株A1645に導入した。この菌株を増殖
するとSODアナログを産生した。産生したSOD ア
ナログの量は、クーマシー染色SDS ポリアクリルア
ミドゲルの走査により計算すると、細菌により産生され
る総タンパクの約10−15%であった。菌株の増殖、
産生されるSOD アナログの回収及びSOD アナロ
グの精製に使用した方法は実施例15に記載されてい
る。非所望DNA 配列の転写及び翻訳がT1T2誘発
で抑えられているために、pSODβ1TT−1の発現
レベルはpSODβ1T11(表II)から得られるレ
ベルより高かった。アミノ酸配列解析化学量論により示
される如くアミノ末端アラニンがアセチル化されていな
い点で、産生されたヒトCu−ZnSODアナログは天
然ヒトCu−ZnSODとは異なる。天然ヒトSODは
アミノ末端アラニンでアセチル化されている[ハーツ,
ジェー.ダブリュー.(Hartz,J.W.)及びド
イッチェ,エィチ.エフ.(Deutsch,H.
F.)、ジェー.バイオロ.ケム.(J.Biol.C
hem)(1972)247:7043−7050、ヤ
ーブッシュ,ジェー.アール.(Jabusch,J.
R.)ら、バイオケミストリー(Biochemist
ry)(1980)19:2310−2316;バーラ
(Barra)ら、FEBSレターズ(Letter
s)(1980)120,53及びオバーレイ,エル.
ダブリュ.(Oberley,L.W.),スーパーオ
キシドジスムターゼ(Superoxide Dism
utase)VoL.I,CRCプレス,フロリダ,
(1982),pp.32−33]。天然ヒトSODは
グリコシル化されている[ヒューバー,ダブリュ.(H
uber,W.)、1971年5月18日付発刊米国特
許第3,579,495号]。大腸菌(Escheri
chia coli)は自身が産生するタンパクをグリ
コシル化しないので、細菌産生ヒトSODは殆んど全く
グリコシル化されていない。細菌産生SODアナログの
アミノ酸配列は成熟ヒトSODのアミノ酸配列と同一で
あり、N−末端にメチオニン残基を含まない。実施例12 ヒトアポリポプロテインE3(Apo−E3) I pTV−170 pTV−170の構築は第20図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。pApoE−EX2(AT
CC No.39787)由来のNde I−Nde
I Apo−E3フラグメントを発現ベクターp579
の非反復NdeI部位に挿入して、プラスミドpTV−
170を得た。pTV−170を当業者に公知の方法を
使用する形質転換により大腸菌(Escherichi
a coli)菌株A1645に導入した。得られたク
ローンを増殖させると、多分天然ヒトApo E3のア
ミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニンを有するヒト
Apo E3が産生された。産生されたヒトApo E
3アナログの量は、クーマシー染色SDSポリアクリル
アミドゲルの走査により計算すると、細菌により産生さ
れる総タンパクの約1%であった。菌株を増殖するのに
使用した方法は実施例17に記載されている。 II pTV−194 pTV−194の構築は第22図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。pTV−170(第20
図)から、CIIリボソーム結合部位をpBLA11由
来のβ−ラクタマーゼプロモーターとリボソーム結合部
位で置換すると、pTV−194が誘導された。pBL
A11は、pBR322中の座標4157と4353の
間にあるβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーターとリボ
ソーム結合部位とを含む。Eco RIリンカーをプロ
モーターの上流に付加し、マルチ制限部位リンカーを開
始コドンATGの直後に付加した。従って、開始コドン
を始めとするコード鎖の配列は、ATGAGCTCTA
GAATTCである。pBLA11はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションにATCC No.39
788として寄託された。pTV−194を、当業者に
公知の方法を用いる形質転換によって大腸菌(Esch
erichia coli)菌株A1645に導入し
た。得られたクローンを増殖すると、多分天然ヒトAp
o E3のアミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニン
を有するヒトApo E3のアナログが産生された。産
生されたヒトApo−Eアナログの量は、クーマシー染
色SDSポリアクリルアミドゲルの走査により計算する
と、細菌により産生される総タンパクの約3%であっ
た。菌株を増殖するのに使用された方法は実施例17に
記載されているpTV−170に対する方法と同じであ
る。 III pTV−214 pTV−214の構築は第24図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。ヒト成長ホルモンの14個
のアミノ酸アミノ末端配列をコードする合成DNAフラ
グメントをpTV−190の非反復Nde I部位に挿
入することにより、(第21図に示されかつ前記図面の
説明中に記載されている)pTV−190からpTV−
214を誘導した。pTV−214を、当業者に公知の
方法を用いる形質転換により大腸菌(Escheric
hia coli)菌株A1645に導入した。得られ
たクローンを増殖及び誘発すると、ヒトApo E3の
アナログが産生された。前記アナログは、アミノ末端に
ヒト成長ホルモンの14個のアミノ酸アミノ末端配列と
それに続く成熟ヒトApo E3の配列に付随したメチ
オニンとを有する。産生されたヒトApo Eアナログ
の量は、クーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲ
ルの走査により計算すると、細菌により産生された総タ
ンパクの約2%であった。菌株を増殖するために使用し
た方法は実施例17に記載されているpTV−170に
対する方法と同じである。実施例13 pHG 44の増殖 I.保存培養株 pHG 44の保存株をカゼイン培地(接種材料の項参
照)上で増殖させた後、凍結培地で2倍に希釈し、−8
0℃で保存した。凍結培地は500ml中の含有成分を
以下に示す。 II.接種材料 接種材料を、カゼイン水解物20g/l、酵母エキス1
0g/l及びNaCl2g/l中で増殖させた。振盪フ
ラスコ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で30
℃及び約200r.p.mで15時間培養した。必要に
応じ、撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実
施した。滅菌培地に2−10%の接種材料培養株を接種
し、空気飽和の20%を越えるような溶存酸素濃度を保
つように撹拌及び通気しながら30℃、pH7±0.5
で15時間培養した。 III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には更にアンピシリン100mg/lを含有させ
た。アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材
料の増殖用に使用される培地中で常に見出されるもので
ある。ビオチン、チアミン及びアンピシリンの濃縮溶液
をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添
加した。まず10g/lまで滅菌グルコース溶液を添加
した。誘導段階で更に10g/lのグルコースを添加し
た。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に0.5−10%の接種材料培養株を接種し、30
℃で培養した。空気飽和の20%を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHはNH
3で7±0.2に維持した。細胞濃度が約3.5g/l
(OD660=10)に達してから誘導を開始した。温
度を42℃まで上昇させ、42℃を1−5時間維持し
た。次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に遠心分離法
により細胞を回収した。bGHの回収 ポリトロン(キネマテイカ)(Polytron(Ki
nematica))混合機を使用し、発泡を最小化す
るように該混合機の速度を調節しながら、50mMリン
酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、50mM EDT
A及び100mMNaClを含有する溶液5容量中に、
細菌細胞13kg(湿潤ケーキ)を再懸濁させた。均質
な懸濁液を80l/時でダイノミル細胞破砕器ケー.デ
ィー・5(ウイリー・エイ・バシヨフエン、バーゼル)
(Dynomill celldisruptor K
D5(Willy A.Bachofen,Base
l))に連続的に通し、破砕した細胞の均質懸濁液を、
流量45l/時でシー・イー・ピー・エイ(CEPA)
101遠心機で遠心分離により清澄化させた。遠心分離
段階で分離された沈殿物を収集し、50mM EDTA
を含有する50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.
4)15.5l中に再懸濁させた。最終濃度が0.05
mg/mlになるまでリゾチームを添加し、懸濁液を3
7℃で16時間インキュベートした。最終濃度が1%に
なるまでトリトン・エックス(Triton X)−1
00を添加した。次に懸濁液を室温で30分間インキュ
ベートし、連続フローセル音波処理装置(熱システム)
内で18l/時で音波処理し、シー・イー・ピー・エイ
・101遠心機内で遠心分離した。沈殿物を収集し、5
0mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中に再懸
濁させ、前記と同様に音波処理し、シー・イー・ピー・
エイ・101遠心機内で遠心分離した。50mMEDT
A及び100mMNaClを含有する50mMリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH7.4)15.5l中に細胞を再
懸濁させ、2度沈殿させ、蒸留水15.5l中に再懸濁
させた。遠心分離により沈殿物を収集し、−20℃で保
存した。bGHの精製 沈殿物を蒸留水30−40l中に再懸濁させ、0.5N
NaOHでpH11.8に滴定して可溶化させた。次に
溶液を連続的に音波処理し、必要に応じてシー・イー・
ピー・エイ・101遠心機内で遠心分離により清澄化さ
せ、又はワットマン(Whatman)No.1濾紙で
濾過した。清澄化させた蛋白質溶液(280nm OD
=297000の溶液32.6l)を、それぞれ500
00−60000ODの各部分(6×5.4l)に分割
した。各面積5ft2の3個の100000分子量カッ
トオフカセット(ピー・ティー・エイチ・ケーPTHK
型)を備えるミリポア・ペリコン(Millipore
Pellicon)限外濾過器で各部分をそれぞれ限
外濾過した。5.4l部分を保持物(retentat
e)容量1lまで濃縮した。限外濾過物を収集し、保存
した。保持物をpH11.8の別の10mMホウ酸塩緩
衝液で当初の容量まで希釈し、十分混合した。バッチを
保持物容量1lまで再び濃縮した。限外濾過物を収集
し、先の限界濾過物と混合した。両者の限外濾過物中の
ODの合計値が、限外濾過器に初期にチャージされたO
Dの20%になったら、次の濃縮段階の保持物容量を1
lでなく0.5lとした。0.5lの保持物容量からの
限外濾過物の吸光度が280nm(1cmセル)で0.
1より小さくなるまで、濃縮及び10mMホウ酸塩緩衝
液による希釈のサイクルを継続した。一般に、濃縮及び
希釈サイクル数は9から12の範囲とした。最終保持物
を排出した。全限外濾過物を合し、6NHClでpH
9.0に調整した。別の5.4 1部分を同様に限外濾
過し、pH調整済みの全限外濾過物を合した。代表的な
一工程から、OD=100000に相当する吸光度0.
26の限外濾過物総量380lが産生され、所要時間は
24から40時間であった。100K限外濾過段階で合
した限外濾過物(280nmでOD=100000の濾
過物380l)を、線流速23cm/時(25l/時)
でセファロース・シー・エル・6・ビー、ディー・イー
・エー・イー(Sepharose CL−6B DE
AE)イオン交換カラムに通した。直径37cm、高さ
15cmのカラムを、pH9.0の10mMホウ酸塩緩
衝液2床容量(32L)で洗浄した。充填及び洗浄段階
からの溶出液を排出した。溶離液を段階的に10mMホ
ウ酸塩、10mM塩化ナトリウム、pH9に変化させ、
bGHをカラムから排出した。溶出流速は23cm/時
とした。280nmにおける溶出液の吸光度を追跡する
ことにより、工程の進行を監視した。bGHピークを4
から5床容量(280nmでOD=43000の容量8
41)収集した後、10000分子量カットオフカセッ
トを有するミリポア・ペリコン限外慮過器を使用して約
10mg/mlに濃縮した。次に溶液を凍結乾燥した。
収量は、純粋bGH約70gであった。実施例14 pHG 44により産生されるbGHアナログの活性 1.天然bGHに対するbGH アナログのラジオイム
ノアッセイ比較 リン酸塩でpHを調節した食塩水(1%BSA)中にb
GH アナログ100ng/mlを含有する溶液を調製
した。該溶液を逐次、濃度50,25,12.5,6.
25,3.12,1.56及び0.78ng/lに希釈
した。これらの溶液の0.1ml アリコート1対に対
して、二抗体法によりRIAを行った。希釈曲線は、天
然bGHで得られる場合と同等であった。 2.ラジオレセプタ結合アッセイ トレーサとして125I−bGH及び較正曲線用として
真正bGH溶液を使用し、ツシマ・ティーTushim
a,T及びフレイセン・エイチ・ジーFreisen,
H.G.(ワイ・チン「内分泌代謝」Y.Chin.,
EndocrMetab.(1973),37,3)に
より記載されているように、ウサギ肝臓膜でラジオレセ
プタ結合アッセイを行った。アッセイ用緩衝液0.3m
l(50mMトリス、15mMCaCl2及びウシ血清
アルブミン5mg/ml、pH7.6)中で室温で3組
の試料を2時間インキュベートした。管には、125I
−bGH(30−60μCi/μgの調製に20000
cpm)、肝臓膜蛋白質150−250μg、及び天然
bGH(1−100ng)又は細菌bGHエキスのいず
れかを充填した。その結果、bGH アナログのbGH
活性は天然bGHのbGH活性と同等であることが認め
られた。 3.脛骨試験 実施例13に従い細菌細胞から回収したpRO 12か
ら産生したbGH アナログの生物活性を脛骨試験によ
り評価した。(パーロウ・エイ・エフ他「分泌学」Pa
rlow,A.F.,et al.,Endocrin
ology(1965)77,1126参照。)ラット
の下垂体を28−30日齢で切除した後、無処置で10
−14日間置いた。ウシ下垂体又は組換体大腸菌(Es
cherichia coli)から誘導されたウシ成
長ホルモンをpH10.0の0.01Mホウ酸塩と共に
0.15MNaClに溶解させた。ラット(1群4−7
匹)に毎日bGH溶液(0.2cc中に5−125μg
/日)を5日間皮下注射し、この間常用飼料(プリナラ
ットチャウ及び任意に水)を与え続けた。動物を6日目
に殺し、前脚膝骨を取出し、長手方向に切断し、アセト
ンで固定し、2%AgNO3で染色した。解剖双眼鏡
(ニコン)で観察することにより骨端板の幅を測定し
た。平均値(ラット1匹当たりの読み40回)を使用し
て長い投与−応答曲線を形成した。この結果、bHG
44から産生したbGH アナログのbGH 活性が天
然bGHのbGH 活性と同等であることが認められ
た。実施例15 pSODβ1TT−1の増殖 I.保存培養株 pSODβ1T11の保存株をカゼイン培地(接種材料
の項参照)上で増殖させた後、凍結培地で2倍に希釈
し、−80℃で保存した。凍結培地500ml中の含有
成分を以下に示す。 II.接種材料 カゼイン水解物20g/l、酵母エキス10g/l及び
NaCl2g/l中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存株を接種し、30℃及び約20
0r.p.mで振盪器上で15時間培養した。必要に応
じて撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実施
した。滅菌培地に2−10%の接種材料を接種し、空気
飽和の20%を越えるような溶存酸素濃度を維持するよ
うに撹拌及び通気しながら30℃、pH7±0.5で1
5時間培養した。 III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には更にテトラサイクリン12.5mg/lを含有
させた。テトラサイクリンは産生に任意の成分である
が、接種材料の増殖用に使用される培地中には常に含有
されている。ビオチン、チアミン及びテトラサイクリン
の濃度溶液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生
用培地に添加した。滅菌グルコース溶液をまず10g/
lまで添加した。誘導段階で更に10g/lのグルコー
スを添加した。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に0.5−10%の接種材料培養株を接種し、30
℃で培養した。空気飽和の20%を越えるような溶存酸
素濃度を維持するように撹拌通気率を設定した。pHを
NH3で7±0.2に保った。細胞濃度が約3.5g/
l(OD660=10)に達してから誘導を開始した。
温度を42℃まで上昇させ、1−5時間42℃を保っ
た。次に培養株を冷却し、酵素精製用に遠心分離法によ
り細胞を回収した。SODの回収 発泡を最小化するように速度を調節しながらポリトロン
(キネマテイカ)混合機内で50mMリン酸ナトリウム
(pH7.8)12l中に細菌細胞1.5kg(湿潤ケ
ーキ)を懸濁させた。均質懸濁液をダイノミル細胞破砕
器ケー・ディー・5(ウイリー・エイ・バシヨフエン、
バーゼル)に連続的に通過させた。連続フローセルを使
用して破砕細胞の均質懸濁液を音波処理し、シー・イー
・ピー・エイ・101遠心機内で遠心分離した。上清を
65℃で2時間加熱し、冷却して前記と同様に遠心分離
した、10000分子量カットオフカセット(ピー・テ
ィー・ジー・シー型)を使用するミリポアペリコン限外
濾過装置内で清澄な上清を1lまで濃縮した。濃縮され
た蛋白質溶液を、150mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.8)で平衡化されたディー・イー・エイ・イ
ー・セファロースカラム(2kgディー・イー・エイ・
イー・セファロース)に通した。溶液中の流れを収集
し、濃縮し、ペリコン限外濾過装置内でpH7.8の2
0mMトリスHClで透析してから、20mMトリスH
Cl緩衝液で平衡化されたキュー・エイ・イー・セファ
ロースカラム上に置いた。pH7.8の20mMトリス
HCl緩衝液及び塩勾配(0−200mMNaCl)で
カラムを展開させた。SOD含有フラクションを収集
し、ペリコン限外濾過装置で濃縮し、蒸留水で透析した
後、pH4.8の1M酢酸ナトリウム緩衝液を添加する
ことにより100mM酢酸ナトリウムとした。pH4.
7の100mM酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化されたシ
ー・エム・セファロースカラム上で蛋白質溶液を更に分
離した。同一緩衝液及び塩勾配(100−500mMN
aCl)を使用してカラムを展開させた。SOD含有フ
ラクションを収集し、ペリコン限外濾過装置で濃縮し、
凍結乾燥した。実施例16 pSODβ1TT−1により産生されるSODの活性 マックコード及びフリドヴィチ、生化学誌(McCor
d and Fridovich,J.Biol.Ch
em)(1969),244,6049−6055に記
載されているようにフエリシトクロム・シーの還元抑制
を監視することにより、実施例15のpSODβ1TT
−1により産生されたSOD アナログの酵素活性を分
析した。その結果、pSODβ1TT−1から産生され
たSODアナログの活性は、天然のヒトSOD の活性
及びウシSOD (オルゴテイン:グルネンタール・ゲ
ー・エム・ベー・ハーorgotein:Grunen
thal GMBH)の活性と同等であると認められ
た。実施例17 pTV−170の増殖 I.保存培養株 pTV−170の保存株をカゼイン培地(接種材料の項
参照)上で増殖させ、凍結培地で2倍に希釈し、−80
℃で保存した。凍結培地500ml中の含有成分を以下
に示す。 II.接種材料 カゼイン水解物20g/l、酵母エキス10g/l及び
NaCl2g/l中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で30℃
及び約200r.p.mで15時間培養した。必要に応
じて、撹拌通気発酵器内で接種材料増殖の後続段階を実
施した。滅菌培地に2−10%の接種材料を接種し、空
気飽和の20%を越えるような溶存酸素濃度を保つよう
に撹拌及び通気しながら30℃、pH7±0.5で15
時間培養した。 III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には更にアンピシリン100mg/lを含有させ
た。アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材
料の増殖用として使用される培地中には常に見出され
る。ビオチン、チアミン及びアンピシリンの濃度溶液を
それぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添加
した。滅菌グルコース溶液をまず10g/lまで添加し
た。誘導段階で更に10g/lのグルコースを添加し
た。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に0.5−10%の接種材料培養株を接種し、30
℃で培養した。空気飽和の20%を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHをNH
3で7±0.2に維持した。細胞濃度が約3.5g/l
(OD660=10)に達してから誘導を開始した。温
度を42℃まで上昇させ、15時間42℃を保った。次
に培養株を冷却し、蛋白質精製用に遠心分離法により細
胞を回収した。実施例18 ウシ成長ホルモン pHG 50 pHG 50の構築は第6図に示され図面の説明中に説
明してある。pHG44(エイ・ティー・シー・シー・
ATCC番号39806)の単一Cla I部位にpS
K 434(ATCC番号39784)のHpa II
−Hpa IIλcI434フラグメントを挿入するこ
とによりプラスミドpHG 50を得た。同様にしてプ
ラスミドpHG 51を構築した。しかし乍ら、プラス
ミドpHG 50と比較してλimm434cI+フラ
グメントはプラスミド内で逆配向(opposite
orientation)に見出された。λimm43
4をBam HIで消化し、Bam HIで消化された
pBR322に混合物を連結させることによりpSK
434(ATCC番号39784)を構築した。連結さ
れた混合物で大腸菌A2097を形質転換し、λimm
434cI3003ファージに免疫性のコロニーを単離
した。これらのコロニーの1個から単離したプラスミド
pSK 434は6kb Bam HIフラグメントを
含んでおり、該フラグメントはλcI434遺伝子を含
んでおりかつN遺伝子外からP遺伝子外に伸びていた。
pSK434は第6図の制限地図を有する。当業者に公
知の方法を使用する形質転換により、pHG 50及び
pHG 51を大腸菌菌株A1645に導入した。得ら
れたクローン、それぞれA3108及びA3112は、
増殖及び誘導後、フェニルアラニン形天然bGH のア
ミノ末端に付加されたアミノ酸配列met−asp−g
ln を有するbGH アナログを産生した。産生され
たbGHアナログの量を、クーマシーで染色したエス・
ディー・エス・ポリアクリルアミドゲルを走査すること
により計算した処、細菌により産生される総蛋白質量の
37−42%の範囲であった(第1表)。プロファージ導入 λcI434選択系を使用するためには、pHG 50
を含有する細胞がプロファージλimm434cI−を
も含有していなければならない。本発明者はプロファー
ジとしてλimm434cI3003mini Tn
10Δ16Δ17を使用した。まれに起こる安定的なプ
ロファージ挿入現象の単離を容易にするために、min
i Tn 10Δ16Δ17テトラサイクリン耐性マー
カ(フォスター他、細胞(Foster,et a
l.,cell)(1981)23,201−213)
をファージ中に導入した。他方、この結果、テトラサイ
クリン耐性を監視することにより、プロファージの存在
を簡単に試験することも可能になった。アンピシリンの
存在下で増殖したプラスミドpHG 50を含有する大
腸菌菌株A1645に、30℃で低感染多重度でλim
m434cI3003miniTn 10Δ16Δ17
を感染させた。テトラサイクリン耐性コロニーを単離
し、精製した。前記菌株はアメリカ菌寄託センター(A
merican Type Collection C
enter)にATCC番号39805で寄託されてい
る。別の方法として、大腸菌1645をpHG 50及
びλimm434cI3003mini Tn 10Δ
16Δ17で同時に形質転換し、アンピシリン及びテト
ラサイクリンの双方に耐性のコロニーを選択することに
より、プロファージを導入した。ベクター及びプラスミ
ドに好適な宿主は、A1637,A2602,A156
3,A1645(C600ΔHΔBam HIr−m+
gal+thr−leu−Bl)又はA2097(A1
645 lacΔx A21,proC::Tn10)
を包含する形質転換に好適な大腸菌の菌株である。上記
と同様にして所望のプロファージを全菌株に導入するこ
とができる。pHG 及びbGH 遺伝子の切除により
該pHG から誘導され得るベクターは、従来開示され
ている発現ベクターに対して、以下の点を含む多くの利
点を有する。 1.プラスミド安定性の改良 プラスミドは、λimm434cI−溶原素を抑制する
cI434リプレッサ遺伝子を含んでいる。プラスミド
が損失すると、λimm434cI−プロファージ誘導
により細菌細胞溶菌が生じる。従って、高価な抗生物質
選択系を使用しなくてもプラスミドは安定的に保たれ
る。第III表は、cI434安定化系を有するプラス
ミドの高安定性を示している。λPLプロモーターの不
耐熱性リプレッサーがCIであるにも拘らず、cI
434プラスミド安定化系は、熱誘導性λPLプロモー
タ発現系と同時に利用することができる。λimm43
4cI−プロファージはいずれもλimm434cI3
003プロファージと置換できることに留意すべきであ
る。又、任意の抗生物質耐性マーカを先にmini T
n 10Δ16Δ17に導入したテトラサイクリン耐性
マーカと置換することができる。λimm21及びλi
mm22のリプレッサーマイナス突然変異体が入手でき
るので、λ434系の代わりにファージ21又はファー
ジ22の同等の系を使用することができる。 2.非常に高い発現レベル このプラスミドは、総細胞蛋白質の42%という高レベ
ルで大腸菌中に外来蛋白質を発現させることが可能であ
る。この発現レベルは、T1T2転写終結配列を含まな
い他の同様のλPLプラスミドについて記載されている
発現レベルよりも高い。 3.転写終結暗号 プラスミドは、λPLプロモーター及びCIIリボソー
ム結合部位の「下流」に配置されたT1T2転写終結暗
号を含んでいる。T1T2転写ターミネータはN修飾R
NAポリメラーゼの転写を終結させ得るので、このプラ
スミドを使用する場合に得られる高発現レベルは部分的
に、挿入遺伝子の端部にあるT1T2転写ターミネータ
の存在に起因し得る。従って、この転写ターミネータは
好ましくないプラスミド蛋白質のλPL制御転写を阻止
し、その結果、所望の蛋白質の相対収量を向上させる。 4.置換可能なリボソーム結合部位 pHG 50は、リボソーム結合部位の「上流」に位置
する1個のEco RI部位と、ATG開始コドンに位
置するNde I部位1個とを含んでいる。従って、リ
ボソーム結合部位は2個の別々の制限部位によりその両
端が定められている。このため、プラスミドの他の特徴
を変えることなく、容易に現在のリボソーム結合部位
(λCIIリボソーム結合部位)を切除して別のほとん
どあらゆる天然又は合成リボソーム結合部位に置換する
ことができる。こうして、所望のポリペチドの最適発現
が著しく容易になる。 5.発現の熱誘導調節 λPLプロモーターは、CIリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。cI857リプレッサーは熱感
受性である。即ち該リプレッサーは30℃ではプロモー
ターに結合するが、42℃では不活性化する。従って、
発酵温度を42℃に上昇させることにより、宿主細菌は
所望の蛋白質を産生するように誘導される。このような
系の利点を以下に述べる。 (a)大腸菌に対して毒性の外来蛋白質が後期に産生さ
れ得るので、発酵プロセス中における初期細胞死が避け
られる。 (b)蛋白質の過剰産生により蛋白質が安定化し、蛋白
質分解が阻止され得る。(チエン、ワイ・イー他、遺伝
子(Cheng,Y.E.,etal.,Gene)
(1981)14,121)。従って、λPLのような
厳密に調整されたプロモーターを使用する「一時的」過
剰産生の方が、連続的低レベル産生よりも好適である。 6.誘導プロトコールの単純化 pHG 50は約42℃で誘導され、蛋白質合成期間を
通して42℃に保たれる。本願出願人名義の米国特許出
願第514188号に記載されているpMG100及び
pND 5から誘導されたプラスミドの誘導プロトコー
ルは、42℃で誘導後、38℃の増殖期間を設けること
を定めている。pHG 50の最適誘導プロトコールは
38℃まで冷却する段階を必要としないので単純であ
る。 7.高コピー数 プラスミド上に見出されるpHG 50中のλPLプロ
モーターは、大腸菌中のλ形質導入ファージベクターよ
りもコピー数が多い。従って、発現レベルが向上する。 8.リボソーム結合部位及び開始コドン この発現ベクターは、強力な原核性リボソーム結合部位
(RBS)及び翻訳開始コドン(ATG)を含んでい
る。従って、開始コドンを添加することなくあらゆる真
核性遺伝子がクローン化され得る。更に、高効率のRB
S は発現レベルを向上させる。リボソーム結合部位は
λCIIリボソーム結合部位である。リボソーム結合部
位の配列を以下に示す。
【化15】
1個の塩基対が、野性型λに見出されるリボソーム結合
部位と異なっている。 9.好適な制限部位 プラスミドから誘導される発現ベクターは、部位内にA
TG 開始コドンを含む1個のNde I制限部位を有
している。従って、所望の遺伝子の適正な配置が可能に
なる。該1個のNde I部位は、リボソーム結合部位
のすぐ後に見出される。 10.Nut部位 宿主により供給されるN蛋白質は発現ベクター上のNu
t 部位に結合し、従って、tRI部位における転写終
結又はクローン化遺伝子内の早期転写終結を阻止する。
部位と異なっている。 9.好適な制限部位 プラスミドから誘導される発現ベクターは、部位内にA
TG 開始コドンを含む1個のNde I制限部位を有
している。従って、所望の遺伝子の適正な配置が可能に
なる。該1個のNde I部位は、リボソーム結合部位
のすぐ後に見出される。 10.Nut部位 宿主により供給されるN蛋白質は発現ベクター上のNu
t 部位に結合し、従って、tRI部位における転写終
結又はクローン化遺伝子内の早期転写終結を阻止する。
【表3】
菌株A3108及びA3112に30℃でλimm43
4I−mini Tn10を感染させ、テトラサイクリ
ン耐性コロニーを分離した。コロニーを精製し、アンピ
シリン耐性を試験した。単一のコロニーを選択し、アン
ピリン50μg/mlを含有するLB培地中で30℃で
一晩増殖させた。培養株をLB培地で1/1000に希
釈し、約5×108株/mlに増殖させ、更に別のLB
で1/100000に希釈し、一晩増殖させた。LBプ
レート上及びアンピシリン50μg/mlを含有するL
Bプレート上に試料を展開させた。各LBプレートから
約50コロニーを抽出し、アンピシリンを含有するLB
プレート上の増殖について調査した。その結果、選択さ
れたクローンのプラスミド安定性が確認された。実施例19 pHG 50の増殖 I.保存培養株 pHG 50の保存株をカゼイン培地(接種材料の項参
照)上で増殖させた後、凍結培地で2倍に希釈し、−8
0℃で保存した。凍結培地500ml中の含有成分を以
下に示す。 II.接種材料 カゼイン水解物20g/l、酵母エキス10/l及びN
aCl2g/l中で接種材料を増殖させた。振盪フラス
コ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で30℃及
び約200r.p.m.で15時間培養した。必要に応
じて撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実施
した。滅菌培地に2−10%の接種材料を接種し、空気
飽和の20%を越えるような溶存酸素濃度を保つように
撹拌及び通気しながら30℃、pH7±0.5で15時
間培養した。 III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地にはアンピシリン100mg/lを更に含有させ
た。アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材
料の増殖用として使用される培地中に常に見出される。
ピチオン、チアミン及びアンピシリンの濃縮溶液をそれ
ぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添加し
た。滅菌グルコース溶液をまず10g/lまで添加し
た。誘導段階で更に10g/lのグルコースを添加し
た。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に0.5−10%の接種材料培養株を接種し、30
℃で培養した。空気飽和の20%を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHをNH
3で7±0.2に維持した。細胞濃度が約3.5g/l
(OD660=10)に達してから誘導を開始した。温
度を42℃に上昇させ、42℃を1−5時間維持した。
次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に遠心分離法によ
り細胞を回収した。実施例20 p8300−10A p8300−10A(ATCC番号39785)の構築
は第7図に示され図面の説明中に説明されている。構成
多コピー数プラスミドpOPlΔ6(ゲルファンド、デ
ィー・エイチ他、ピー・エヌ・エイ・エス(Gelfa
nd,D.H.,et al.,PNAS(1978)
75,5869);ミュージング他、細胞(Meusi
ng,et al,,Cell)(1981)24,2
35−242)からプラスミドp8300−10Aを誘
導した。同じく第7図に示すp7200−22をCla
Iで消化し、λPLプロモーター、bGH遺伝子及び
T1T2配列を含むCla I−Cla Iフラグメン
トを単離した。Cla I−Cla Iフラグメントを
pOP1Δ6の単一Cla I部位に挿入した。(プラ
スミドp7200−22は、λPLプロモーターの「上
流」のBgl II部位に合成Cla Iリンカーを導
入させたpSAL5600−1(第10図)の誘導体で
ある。)プラスミドp8300−10Aは、約42℃に
おけるλPLプロモーターの誘導後も構成高コピー数表
現型を維持することが認められた。これは、bGH配列
の3′末満にT1T2終結配列が存在することに起因す
ると思われ、この存在により、pOPlΔ6の複製起点
で他のmRNA転写体に干渉し得るλPLプロモーター
からの長鎖mRNA転写体が形成されるのを阻止する。
当業者に公知の方法を使用する形質転換により、p83
00−10Aを大腸菌株A2097に導入した。増殖及
び誘導後にこの菌株から、フェニルアラニン形の天然b
GHのアミノ末端に付加されたメチオニン残基を有する
ウシ成長ホルモンのアナログが産生された。bGHアナ
ログの産生量は、クーマシー染色エス・ディー・エス・
ポリアクリルアミドゲルの走査により計算した処、細菌
により産生される総蛋白質の約37−43%であった。
菌株の増殖、産生されたbGHアナログの回収、及びb
GHアナログの精製に使用した方法は、実施例24でp
SAL−170/10について記載する方法と同様であ
る。実施例21 一般用発現ベクターは、bGH遺伝子の切除によりプラ
スミドp8300−10A(第7図、ATCC番号39
785)から誘導され得る。こうして誘導されたベクタ
ーは、従来開示の発現ベクターに較べて以下に示すよう
な多くの利点を有する。 1.著しく高い発現レベル ベクターは、総細胞蛋白質の44%程度の高レベルで大
腸菌中に外来蛋白質を発現させることが可能である。 2.構成高コピー数 ベクターは、細胞1個当たり約200−300コピーの
構成高コピー数を維持する。この点は、低コピー数の他
のλPL発現ベクターと区別される。高コピー数は発現
レベルの向上をもたらす。 3.転写終結暗号 p8300−10AからbGH配列の切除により得られ
るベクターは、λPLプロモーター及びCIIリボソー
ム結合部位から「下流」に配置されたT1T2転写終結
暗号を含んでいる。高発現レベルの一因は、挿入遺伝子
の端部にT1T2転写ターミネータが存在するという点
にある。というのは、T1T2暗号はN修飾RNAポリ
メラーゼの転写を終結させるからである。従って、転写
ターミネータは、好ましくないプラスミド蛋白質のλP
L制御転写を阻止し、その結果、所望の蛋白質の相対収
量を増加させる。更に、T1T2転写終結暗号の存在
は、プラスミドの複製起点を通って続く長鎖mRNA転
写体を阻止する。従って、高コピー表現型の安定性が向
上する。λPLプロモーターを含んでいながら転写終結
配列を含まない同様の高コピー数プラスミドは不安定で
あり、高コピー数表現型を失い易い。 4.置換可能なリボソーム結合部位 p8300−10Aは、リボソーム結合部位の「上流」
に配置された単一EcoRI部位と、リボソーム結合部
位の「下流」に配置されたNde I部位とを含んでい
る。従って、リボソーム結合部位は2個の単一制限部位
によりその境界が定められている。従って、プラスミド
の他の特徴を変えることなく、容易に現在のリボソーム
結合部位(λCIIリボソーム結合部位)を切除、かつ
ほとんどの他のあらゆる天然又は合成リボソーム結合部
位と置換することができる。その結果、所望のポリペプ
チドの最適発現が著しく促進される。 5.発現の熱誘導調節 λPLプロモーターは、cIリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。cI857リプレッサーは熱感
受性である。即ち該リプレッサーは30℃でプロモータ
ーと結合するが、42℃では不活性化される。従って、
発酵温度を42℃まで増加させることにより、宿主細菌
は所望の蛋白質を産生するように誘導される。このよう
な系の利点を以下に述べる。 (a)大腸菌に対して毒性の外来蛋白質が発酵プロセス
の後期に産生され得るので、早期の細菌死が避けられ
る。 (b)蛋白質の過剰産生により蛋白質が安定化され、蛋
白質分解が阻止される。(チエン、ワイ・イー他、遺伝
子(1981)14,121)。従って、λPLのよう
な厳密に調整されたプロモーターを使用する「一時的」
過剰産生の方が、連続的低レベル産生よりも好適であ
る。 6.誘導プロトコールの単純化 本願明細書及び本出願人名義の米国特許出願第5141
88号中に記載のプラスミドによる蛋白質産生は、熱感
受性cI857リプレッサーにより調節される。前記米
国特許出願中に記載のプラスミドに必要な誘導プロトコ
ールは、42℃の誘導後に38℃で増殖させることを定
めている。一方、プラスミドp8300−10A又はp
SAL−130/15又はそれらのプラスミド誘導体を
使用する場合の蛋白質合成の最適誘導では、42℃で誘
導後、同一温度、即ち42℃で増殖を行った。従って、
発酵器を冷却する必要がなくなる。 7.リボソーム結合部位及び開始コドン この発現ベクターは、強力な原核性リボソーム結合部位
(RBS)と翻訳開始コドン(ATG)とを含んでい
る。従って、開始コドンを添加しなくてもあらゆる真核
性遺伝子をクローン化できる。更に、高効率のRBSに
より発現レベルが向上する。リボソーム結合部位はλC
IIリボソーム結合部位である。リボソーム結合部位の
配列を以下に示す。
4I−mini Tn10を感染させ、テトラサイクリ
ン耐性コロニーを分離した。コロニーを精製し、アンピ
シリン耐性を試験した。単一のコロニーを選択し、アン
ピリン50μg/mlを含有するLB培地中で30℃で
一晩増殖させた。培養株をLB培地で1/1000に希
釈し、約5×108株/mlに増殖させ、更に別のLB
で1/100000に希釈し、一晩増殖させた。LBプ
レート上及びアンピシリン50μg/mlを含有するL
Bプレート上に試料を展開させた。各LBプレートから
約50コロニーを抽出し、アンピシリンを含有するLB
プレート上の増殖について調査した。その結果、選択さ
れたクローンのプラスミド安定性が確認された。実施例19 pHG 50の増殖 I.保存培養株 pHG 50の保存株をカゼイン培地(接種材料の項参
照)上で増殖させた後、凍結培地で2倍に希釈し、−8
0℃で保存した。凍結培地500ml中の含有成分を以
下に示す。 II.接種材料 カゼイン水解物20g/l、酵母エキス10/l及びN
aCl2g/l中で接種材料を増殖させた。振盪フラス
コ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で30℃及
び約200r.p.m.で15時間培養した。必要に応
じて撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実施
した。滅菌培地に2−10%の接種材料を接種し、空気
飽和の20%を越えるような溶存酸素濃度を保つように
撹拌及び通気しながら30℃、pH7±0.5で15時
間培養した。 III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地にはアンピシリン100mg/lを更に含有させ
た。アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材
料の増殖用として使用される培地中に常に見出される。
ピチオン、チアミン及びアンピシリンの濃縮溶液をそれ
ぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添加し
た。滅菌グルコース溶液をまず10g/lまで添加し
た。誘導段階で更に10g/lのグルコースを添加し
た。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に0.5−10%の接種材料培養株を接種し、30
℃で培養した。空気飽和の20%を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHをNH
3で7±0.2に維持した。細胞濃度が約3.5g/l
(OD660=10)に達してから誘導を開始した。温
度を42℃に上昇させ、42℃を1−5時間維持した。
次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に遠心分離法によ
り細胞を回収した。実施例20 p8300−10A p8300−10A(ATCC番号39785)の構築
は第7図に示され図面の説明中に説明されている。構成
多コピー数プラスミドpOPlΔ6(ゲルファンド、デ
ィー・エイチ他、ピー・エヌ・エイ・エス(Gelfa
nd,D.H.,et al.,PNAS(1978)
75,5869);ミュージング他、細胞(Meusi
ng,et al,,Cell)(1981)24,2
35−242)からプラスミドp8300−10Aを誘
導した。同じく第7図に示すp7200−22をCla
Iで消化し、λPLプロモーター、bGH遺伝子及び
T1T2配列を含むCla I−Cla Iフラグメン
トを単離した。Cla I−Cla Iフラグメントを
pOP1Δ6の単一Cla I部位に挿入した。(プラ
スミドp7200−22は、λPLプロモーターの「上
流」のBgl II部位に合成Cla Iリンカーを導
入させたpSAL5600−1(第10図)の誘導体で
ある。)プラスミドp8300−10Aは、約42℃に
おけるλPLプロモーターの誘導後も構成高コピー数表
現型を維持することが認められた。これは、bGH配列
の3′末満にT1T2終結配列が存在することに起因す
ると思われ、この存在により、pOPlΔ6の複製起点
で他のmRNA転写体に干渉し得るλPLプロモーター
からの長鎖mRNA転写体が形成されるのを阻止する。
当業者に公知の方法を使用する形質転換により、p83
00−10Aを大腸菌株A2097に導入した。増殖及
び誘導後にこの菌株から、フェニルアラニン形の天然b
GHのアミノ末端に付加されたメチオニン残基を有する
ウシ成長ホルモンのアナログが産生された。bGHアナ
ログの産生量は、クーマシー染色エス・ディー・エス・
ポリアクリルアミドゲルの走査により計算した処、細菌
により産生される総蛋白質の約37−43%であった。
菌株の増殖、産生されたbGHアナログの回収、及びb
GHアナログの精製に使用した方法は、実施例24でp
SAL−170/10について記載する方法と同様であ
る。実施例21 一般用発現ベクターは、bGH遺伝子の切除によりプラ
スミドp8300−10A(第7図、ATCC番号39
785)から誘導され得る。こうして誘導されたベクタ
ーは、従来開示の発現ベクターに較べて以下に示すよう
な多くの利点を有する。 1.著しく高い発現レベル ベクターは、総細胞蛋白質の44%程度の高レベルで大
腸菌中に外来蛋白質を発現させることが可能である。 2.構成高コピー数 ベクターは、細胞1個当たり約200−300コピーの
構成高コピー数を維持する。この点は、低コピー数の他
のλPL発現ベクターと区別される。高コピー数は発現
レベルの向上をもたらす。 3.転写終結暗号 p8300−10AからbGH配列の切除により得られ
るベクターは、λPLプロモーター及びCIIリボソー
ム結合部位から「下流」に配置されたT1T2転写終結
暗号を含んでいる。高発現レベルの一因は、挿入遺伝子
の端部にT1T2転写ターミネータが存在するという点
にある。というのは、T1T2暗号はN修飾RNAポリ
メラーゼの転写を終結させるからである。従って、転写
ターミネータは、好ましくないプラスミド蛋白質のλP
L制御転写を阻止し、その結果、所望の蛋白質の相対収
量を増加させる。更に、T1T2転写終結暗号の存在
は、プラスミドの複製起点を通って続く長鎖mRNA転
写体を阻止する。従って、高コピー表現型の安定性が向
上する。λPLプロモーターを含んでいながら転写終結
配列を含まない同様の高コピー数プラスミドは不安定で
あり、高コピー数表現型を失い易い。 4.置換可能なリボソーム結合部位 p8300−10Aは、リボソーム結合部位の「上流」
に配置された単一EcoRI部位と、リボソーム結合部
位の「下流」に配置されたNde I部位とを含んでい
る。従って、リボソーム結合部位は2個の単一制限部位
によりその境界が定められている。従って、プラスミド
の他の特徴を変えることなく、容易に現在のリボソーム
結合部位(λCIIリボソーム結合部位)を切除、かつ
ほとんどの他のあらゆる天然又は合成リボソーム結合部
位と置換することができる。その結果、所望のポリペプ
チドの最適発現が著しく促進される。 5.発現の熱誘導調節 λPLプロモーターは、cIリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。cI857リプレッサーは熱感
受性である。即ち該リプレッサーは30℃でプロモータ
ーと結合するが、42℃では不活性化される。従って、
発酵温度を42℃まで増加させることにより、宿主細菌
は所望の蛋白質を産生するように誘導される。このよう
な系の利点を以下に述べる。 (a)大腸菌に対して毒性の外来蛋白質が発酵プロセス
の後期に産生され得るので、早期の細菌死が避けられ
る。 (b)蛋白質の過剰産生により蛋白質が安定化され、蛋
白質分解が阻止される。(チエン、ワイ・イー他、遺伝
子(1981)14,121)。従って、λPLのよう
な厳密に調整されたプロモーターを使用する「一時的」
過剰産生の方が、連続的低レベル産生よりも好適であ
る。 6.誘導プロトコールの単純化 本願明細書及び本出願人名義の米国特許出願第5141
88号中に記載のプラスミドによる蛋白質産生は、熱感
受性cI857リプレッサーにより調節される。前記米
国特許出願中に記載のプラスミドに必要な誘導プロトコ
ールは、42℃の誘導後に38℃で増殖させることを定
めている。一方、プラスミドp8300−10A又はp
SAL−130/15又はそれらのプラスミド誘導体を
使用する場合の蛋白質合成の最適誘導では、42℃で誘
導後、同一温度、即ち42℃で増殖を行った。従って、
発酵器を冷却する必要がなくなる。 7.リボソーム結合部位及び開始コドン この発現ベクターは、強力な原核性リボソーム結合部位
(RBS)と翻訳開始コドン(ATG)とを含んでい
る。従って、開始コドンを添加しなくてもあらゆる真核
性遺伝子をクローン化できる。更に、高効率のRBSに
より発現レベルが向上する。リボソーム結合部位はλC
IIリボソーム結合部位である。リボソーム結合部位の
配列を以下に示す。
【化16】
野性型λに見出されるリボソーム結合部位とは塩基対1
個が異なっている。 8.好適な制限部位 発現ベクターは、部位内にATG開始コドンを含む単一
のNde I制限部位を有している。このため、所望の
遺伝子の適正な配置が可能になる。単一NdeI部位
は、リボソーム結合部位のすぐ後に見出される。 9.Nut部位 宿主により供給されるN蛋白質は、発現のベクター上の
Nut部位に結合し、その結果、tRI部位における転
写の終結又はクローン化遺伝子内における早期転写終結
を阻止する。菌株 ベクター及びプラスミドに好適な宿主は、A1637,
A2602,A1563,A1645(c600r−m
+gal+thr−leu−lac−bl(λcI85
7ΔHIΔBam HI N+))及びA2097(A
1645lacΔx A21pro C::Tn10)
を包含する形質転換に好適な大腸菌の菌株である。実施例22 pSAL−130/5 pSAL−130/5の構築は第8図に示され図面の説
明中に説明してある。met−phe bGH遺伝子を
met−asp−gln bGH遺伝子に置換すること
により、p8300−10A(ATCC番号3978
5)からpSAL−130/5を得た。met−asp
−gln bGH遺伝子は、Ned I及びHind
III消化によりプラスミドpHG44(第6図)(A
TCC番号39806)から得た。当業者に公知の方法
を使用する形質転換により、pSAL−130/5を大
腸菌菌株A1645に導入した。この菌株は、増殖及び
誘導後、フェニルアラニン形の天然bGHのN末端に付
加されたアミノ酸配列met−asp−glnを有する
ウシ成長ホルモン(bGH)のアナログを産生した。p
SAL−130/5により産生されたbGHアナログの
量は、クーマシー・ブルー染色エス・ディ・エスポリア
クリルアミドゲルの走査により計算した処、細菌により
産生される総蛋白質の約39−44%であった(第I
表)。菌株の増殖、産生されたbGHアナログの回収、
及びbGHアナログの精製に使用した方法は、実施例2
4でpSAL−170/10について記載する方法と同
様である。実施例23 pSAL−170/10 pSAL−170/10の構築は第8図に示され図面の
説明中に説明されている。公知方法を使用する形質転換
によりpSAL−170/10を大腸菌菌株A1645
に導入した。この菌株は、増殖及び誘導後、フェニルア
ラニン形の天然bGHのアミノ末端に加えられたアミノ
酸配列met−asp−glnを有するbGHのアナロ
グを産生する。pSAL−170/10により産生され
たbGHアナログの量を、クーマシー染色エス・ディー
・エス・ポリアクリルアミドゲルの走査により計算した
処、細菌により産生される総蛋白質の約40−46%で
あった(第I表)。実施例24 pSAL−170/10の増殖 I.保存培養株 pSAL一170/10の保存株をカゼイン培地(接種
材料の項参照)上で増殖させた後、凍結培地で2倍に希
釈し、−80℃で保存した。凍結培地500ml中の含
有成分を以下に示す。 II.接種材料 カゼイン水解物20g/l、酵母エキス10g/l及び
NaCl2g/l中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存培養株を接種し、振盪器上で3
0℃及び約200r.p.m.で15時間培養した。必
要に応じて撹拌通気発酵器内で接種材料増殖の後続段階
を実施した。滅菌培地に2−10%の接種材料を接種
し、空気飽和の20%を越えるような溶存酸素濃度を保
つように撹拌及び通気しながら30℃、pH7±0.5
で15時間培養した。 III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には、更にテトラサイクリン12.5mg/lを含
有させた。テトラサイクリンは産生に任意の成分である
が、接種材料の増殖用に使用される培地中に常に見出さ
れるものである。ピオチン、チアミン及び抗生物質の濃
縮溶液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培
地に添加した。滅菌グルコース溶液をまず10g/lま
で添加した。誘導段階で更に10g/lのグルコースを
添加した。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に0.5−10%の接種材料培養株を接種し、30
℃で培養した。空気飽和の20%を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHはNH
3で7±0.2に保った。細胞濃度が約3.5g/l
(OD660=10)に達してから誘導を開始した。温
度を42℃に上昇させ、42℃を1−5時間維持した。
次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に遠心分離法によ
り細胞を回収した。bGHの回収 ポリトロン(キネマテイカ)混合機を使用し、発砲を最
小にするように混合機の速度を調節しながら、50mM
リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、50mM E
DTA及び100mM NaClを含有する溶液5容量
中に細菌細胞13kg(湿潤ケーキ)を懸濁させた。均
質懸濁液を80l/時で連続的にダイノミル細胞破砕器
ケー・ディー・5(ウイリー・エイ・バシヨフエン、バ
ーゼル)中に通過させ、破砕細胞の均質懸濁液をシー・
イー・ピー・エイ・101遠心機内で45l/時の流量
で遠心分離により清澄化させた。遠心分離段階から得ら
れた沈殿物を収集し、50mM EDTAを含有する5
0mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)15.5
l中に再懸濁させた。最終濃度が0.05mg/mlに
なるまでリゾチームを添加し、懸濁液を37℃で16時
間インキュベートした。最終濃度が1%になるまでトリ
トン・エックス・100を添加した。次に懸濁液を室温
で30分間インキュベートし、連続フローセル音波処理
器(熱システム)内で18l/時で音波処理し、シー・
イー・ピー・エイ・101遠心機内で遠心分離した。沈
殿物を収集し、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.4)に再懸濁させ、上記同様に音波処理し、シー・
イー・ピー・エイ・101遠心機内で遠心分離した。5
0mM EDTA及び100mM NaClを含有する
50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)15.
5l中に細胞を再懸濁させ、2度沈殿させ、蒸溜水1
5.5l中に再懸濁させた。遠心分離により沈殿物を収
集し、−20℃で保存した。bGHの精製 沈殿物を蒸溜水30−40l中に再懸濁させ、0.5N
NaOHの滴定によりpH11.8として可溶化させ
た。次に溶液を連続的に音波処理し、必要に応じてシー
・イー・ピー・エイ・101遠心機内で遠心分離により
清澄化させるか又はワットマンNo.1濾紙で濾過し
た。清澄化蛋白質溶液(280nmでOD=29700
0の溶液32.6l)を、それぞれ50000−600
00ODの各部分(6×5.4 l)に分割した。各面
積5ft2の3個の100000分子量カットオフカセ
ット(ビー・ティー・エイチ・ケー型)を備えるミリポ
ア・ペリコン限外濾過器で各部分をそれぞれ限外濾過し
た。5.4 l部分を1lの保持物容量まで濃縮した。
限外濾過物を収集し、保存した。保持物をpH11.8
の別の10mMホウ酸塩緩衝液で当初の容量まで希釈
し、十分混合した。保持物容量が1lになるまでバッチ
を更に濃縮した。限外濾過物を収集し、最初の限外濾過
物と混合した。限外濾過物中のODの経常合計値が、限
外濾過器に最初にチャージしたODの20%になった
ら、次の濃縮段階の保持物容量を1lでなく0.5 l
とした。0.5 lの保持物容量からの限界濾過物の2
80nm(1cmセル)における吸光度が0.1より小
さくなるまで濃縮及び10mMホウ酸塩緩衝液による希
釈サイクルを継続した。一般に濃縮及び希釈サイクルは
9から12サイクルとした。最終保持物を排出した。全
限界濾過物を混合し、6N HClでpH9.0に調整
した。別の5.4l部分を同様に限界濾過し、pHを調
整された全限界濾過物を混合した。代表的な一工程か
ら、OD=100000に相当する吸光度0.26の限
界濾過物総量380lが産生され、所要時間は24から
40時間であった。100K限界濾過段階からの混合さ
れた限界濾過物(280nmでOD=100000の濾
過物380l)を、線流速23cm/時(25l/時)
でセファロース・シー・エル・6・ビー・ディー・イー
・エイ・イー・イオン交換カラムに通した。直径37c
m、高さ15cmのカラムを、pH9.0の10mMホ
ウ酸塩緩衝液2床容量(32L)で洗浄した。充填及び
洗浄段階から得た溶出液を廃棄した。溶離液を段階的に
10mMホウ酸塩、100mM塩化ナトリウム、pH9
に変化させ、bGHをカラムから排出させた。溶出流速
は23cm/時であった。280nmにおける溶出液の
吸光度を追跡することにより工程の進行を監視した。b
GHピークを4から5床容量(280nmでOD=43
000の容量84l)収集した後、10000分子量切
断カセットを備えるミリポア・ペリコン限界濾過装置を
使用して約10mg/mlに濃縮した。次に溶液を凍結
乾燥した。収量は純粋bGH約70gであった。実施例25 pSAL−170/10により産生されるbGHアナロ
グの活性 1.bGHアナログ及び天然bGH間のラジオイムノア
ッセイ比較 リン酸塩で緩衝した食塩水(1%BSA)を用いて10
0ng/mlのbGHアナログを含む溶液を調製した。
この溶液を50,25,12.5,6.25,3.1
2,1.56及び0.78ng/lの濃度に逐次希釈し
た。これら溶液の0.1mlアリコートを夫々一対ずつ
用意し、二抗体法を用いるRIAにかけた。希釈曲線は
天然bGHの場合とほぼ同じであった。 2.放射線受容体結合アッセイ トレーサとしての125I−BGHとカリブレーション
曲線を形成するための真正bGH溶液とを使用し、ツシ
マ,ティー(Tushima,T.)及びフライセン,
エッチ・ジー(Freisen,H.G,)の方法(ワ
イ.シン(Y.Chin.),内分泌物代謝(Endo
cr.Metab.)(1973年),37;3)に従
ってウサギ肝臓膜での放射線受容体結合アッセイ(ra
dioreceptor binding assa
y)を行なった。試料を各3部ずつ0.3mlのアッセ
イ緩衝液(50mMのトリス,15mMのCaCl2及
び5mg/mlのウシ血清アルブミン,pH7.6)中
で室温で2時間インキュベートした。管には125I−
bGH(20,000cpmの30〜60μCi/μg
試料)、150〜250μgの肝臓膜タンパク質及び天
然bGH(1〜100ng)又はバクテリアbGH抽出
物のいずれかを入れた。アッセイの結果このbGHアナ
ログのbGH活性は天然bGHに比肩することが判明し
た。 3.脛骨テスト 実施例5に従いバクテリア細胞から回収したpRO12
産生bGHアナログの生物学的活性を脛骨テストにより
測定した(パーロー,エー・エフ(Parlow,A.
F.)他,内分泌学(Endocrinology)
(1965年)77:1126参照)。ラットを生後2
8〜30日で下垂体切除し、その後無処理で10〜14
日間放置した。ウシ下垂体又は組換え体大腸菌(Esc
herichia Coli)から得たウシ成長ホルモ
ンをpH10.0の0.15M NaCl+0.01M
ホウ酸塩に溶解した。ラット(4〜7匹/グループ)に
bGH溶液(0.2ccで5〜125μg/日)を5日
間毎日皮下注射し、その間食餌は普通に与えた(プリナ
ラット チャウ(Purina Rat−Chow)
及び任意に水)。6日目にラットを殺して前脚膝骨を取
り出し、長手方向に切断し、アセトンで固定し且つ2%
AgNO3で染色した。解剖用双眼顕微鏡(ニコン)で
の観察により骨端板の幅を測定した。平均値(40記録
/ラット)を用いて長い用量−応答曲線を形成した。テ
ストの結果pSAL−170/10産生bGHアナログ
のbGH活性は天然bGHと比肩することが判明した。実施例26 実施例3のSOD宿主−ベクター系により産生されるヒ
ト超酸化物ジスムターゼの収率及び活性は前記宿主−ベ
クター系の成長条件の改変により向上し得る。下記のデ
ータが示すように、前記宿主−ベクター系の成長培地に
Cu及び/又はZnを補足すると活性ダイマー形状の前
記酵素の収率が増大する。バクテリア含有pSODβ1T11の成長 I.保存培養株 保存培養pSODβ1T11をカゼイン培地(接種材料
の項参照)で成長させ、次いで凍結用培地(freez
ing medium)で2倍に希釈し−80℃で保存
した。前記凍結用培地の組成は次の通りである。 II.接種材料 接種材料を20g/lのカゼイン水解物、10g/lの
イースト抽出物及び2g/lのNaCl中で増殖させ
た。シェークフラスコ内の無菌培地に保存培養物を接種
し、シェーカー内30℃で且つ約200r.p.m.で
15時間インキュベートした。必要に応じ、接種材料増
殖過程におけるその後のステップは撹拌曝気発酵槽中で
実施した。無菌培地に2−10%のフラスコ培養物を接
種し、溶存酸素レベルを20%空気飽和以上に保持すべ
く撹拌及びアエレーションを行ないながらpH7±0.
5,30℃で15時間インキュベートする。 III.産生 産生培地は下記の物質を含む。 濃縮溶液状のビオチン、チアミン及びテトラサイクリン
は別個にフイルタ滅菌処理し、接種前の無菌産生培地に
加えた。無菌グルコース溶液を最初に10g/lとなる
ように加えた。誘導(induction)ステップで
更に10g/lのグルコースを加えた。トレース微量元
素溶液は下記の成分を含む。 この培地に0.3−10%の接種材料培養物を接種し、
30℃でインキュベートする。撹拌−通気は溶存酸素レ
ベルを20%空気飽和以上に維持すべく調整する。pH
はNH3で7±0.2に維持する。細胞濃度が約3.5
g/l(OD660=10)に達すると誘導が開始され
る。温度を42℃に上げ、1−5時間42℃に維持す
る。次いで培養物を冷却し、細胞を遠心分離により回収
することによって酵素精製用とする。SODの回収 ポリトロン(Polytron)ブレンダー(キネマチ
カ)を用い、起泡を最小限に抑えるべく速度調整しなが
ら1.5kgのバクテリア細胞(ウェットケーキ)を1
21の50mMリン酸ナトリウム(pH7.8)に懸濁
させる。この均質懸濁液をダイノミル細胞破砕器(Dy
nomill cell disrupter)KD5
(ウイリー,エー。バシヨフエン,バーゼル(Will
y,A.Bachofen,Basel)に連続的に通
す。連続フローセル(エン,バーゼル(Willy,
A.Bachofen,Basel)に連続的に通す。
連続フローセル(continuous flow c
ell)を使用して該破砕細胞均質懸濁液を超音波処理
し、CEPA101遠心分離器で分離処理する。上澄み
を2時間65℃に加熱し、冷却後前述の如く遠心分離に
かける。10,000分子量カットオフカセット(PT
GCタイプ)を用いるミリポア ペリコン(Milli
pore Pellicon)限外濾過装置で前記の透
明な上澄みを1lまで濃縮する。この濃縮されたタンパ
ク質溶液を150mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.8)で平衝化したDEAE−セファセル(Seph
acel)カラム(2kgのDEAEセファセル)に通
す。通過溶液を回収し濃縮してペリコン限外慮過器によ
りpH7.8の20mMトリス−HClに対して透析
し、その後20mMトリス−HCl緩衝液で平衝化した
QAE−セファローズ(Sepharose)カラムに
通す。このカラムをpH7.8の20mMトリス−HC
l緩衝液と塩グラジエント(0〜200mM NaC
l)とで展開する。SOD含有分画を集め、ペリコン限
外濾過装置を用いて濃縮し、蒸留水に対して透析し、そ
の後pH4.8の1M酢酸ナトリウム緩衝液を加えて1
00mM酢酸ナトリウムにする。このタンパク質溶液を
pH4.7の100mM酢酸ナトリウムで平衝化したC
M−セファローズカラムで更に分離処理する。同一の緩
衝液と塩グラジエント(100〜500mM NaC
l)とを用いて前記カラムを展開する。SOD含有分画
を集め、ペリコン限外濾過装置を用いて濃縮し、凍結乾
燥する。 実施例27バクテリアにより産生されるSODの酵素活性 標準的成長条件(即ちCuSO4を補足しない)では実
施例26のバクテリアにより産生される精製ヒトSOD
(hSOD)はウシCu/ZnSODと比べて5%の酵
素活性しか示さなかった。金属含量分析の結果、該酵素
はCuを予定値の8%に過ぎない極めて少量しか含まな
いことが判明した。更に、該タンパク質はZnを必要量
のほぼ2倍も含んでいることから、大部分のCu++部
位がZnイオンにより置換されているものと考えられ
る。これに対し、バクテリア産生hSODから製造され
る金属を全く含まないアポプロテインは溶液中で再構成
(reconstitute)すると本質的に完全な酵
素活性を回復する。この溶液はCu++及びZn++を
双方共モル活性部位当り1.2モルの濃度で含む(表I
V参照)。前述のデータは細胞内Cu++濃度が限定さ
れており、産生されたhSODを飽和するには不十分で
あることを示唆している。一連の実験から、成長培地の
Cu++濃度を増加するとhSODの比活性が増加する
ことが判明した。実際、200ppmCu++を補足し
たカゼイン水解物(実施例26)中で増殖した大腸菌は
誘導後天然金属組成と十分な酵素活性とをもつ極めて活
性の高いhSODを産生した(表IV参照)。更に実験
を続けた結果、添加される外因性Cu++が50〜25
0ppmであると同様の効果が得られることが判明し
た。75ppmのCu++を補足したLB(ルリアブロ
ス(Luria Broth))培地でも同様の効果が
観察された。
個が異なっている。 8.好適な制限部位 発現ベクターは、部位内にATG開始コドンを含む単一
のNde I制限部位を有している。このため、所望の
遺伝子の適正な配置が可能になる。単一NdeI部位
は、リボソーム結合部位のすぐ後に見出される。 9.Nut部位 宿主により供給されるN蛋白質は、発現のベクター上の
Nut部位に結合し、その結果、tRI部位における転
写の終結又はクローン化遺伝子内における早期転写終結
を阻止する。菌株 ベクター及びプラスミドに好適な宿主は、A1637,
A2602,A1563,A1645(c600r−m
+gal+thr−leu−lac−bl(λcI85
7ΔHIΔBam HI N+))及びA2097(A
1645lacΔx A21pro C::Tn10)
を包含する形質転換に好適な大腸菌の菌株である。実施例22 pSAL−130/5 pSAL−130/5の構築は第8図に示され図面の説
明中に説明してある。met−phe bGH遺伝子を
met−asp−gln bGH遺伝子に置換すること
により、p8300−10A(ATCC番号3978
5)からpSAL−130/5を得た。met−asp
−gln bGH遺伝子は、Ned I及びHind
III消化によりプラスミドpHG44(第6図)(A
TCC番号39806)から得た。当業者に公知の方法
を使用する形質転換により、pSAL−130/5を大
腸菌菌株A1645に導入した。この菌株は、増殖及び
誘導後、フェニルアラニン形の天然bGHのN末端に付
加されたアミノ酸配列met−asp−glnを有する
ウシ成長ホルモン(bGH)のアナログを産生した。p
SAL−130/5により産生されたbGHアナログの
量は、クーマシー・ブルー染色エス・ディ・エスポリア
クリルアミドゲルの走査により計算した処、細菌により
産生される総蛋白質の約39−44%であった(第I
表)。菌株の増殖、産生されたbGHアナログの回収、
及びbGHアナログの精製に使用した方法は、実施例2
4でpSAL−170/10について記載する方法と同
様である。実施例23 pSAL−170/10 pSAL−170/10の構築は第8図に示され図面の
説明中に説明されている。公知方法を使用する形質転換
によりpSAL−170/10を大腸菌菌株A1645
に導入した。この菌株は、増殖及び誘導後、フェニルア
ラニン形の天然bGHのアミノ末端に加えられたアミノ
酸配列met−asp−glnを有するbGHのアナロ
グを産生する。pSAL−170/10により産生され
たbGHアナログの量を、クーマシー染色エス・ディー
・エス・ポリアクリルアミドゲルの走査により計算した
処、細菌により産生される総蛋白質の約40−46%で
あった(第I表)。実施例24 pSAL−170/10の増殖 I.保存培養株 pSAL一170/10の保存株をカゼイン培地(接種
材料の項参照)上で増殖させた後、凍結培地で2倍に希
釈し、−80℃で保存した。凍結培地500ml中の含
有成分を以下に示す。 II.接種材料 カゼイン水解物20g/l、酵母エキス10g/l及び
NaCl2g/l中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存培養株を接種し、振盪器上で3
0℃及び約200r.p.m.で15時間培養した。必
要に応じて撹拌通気発酵器内で接種材料増殖の後続段階
を実施した。滅菌培地に2−10%の接種材料を接種
し、空気飽和の20%を越えるような溶存酸素濃度を保
つように撹拌及び通気しながら30℃、pH7±0.5
で15時間培養した。 III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には、更にテトラサイクリン12.5mg/lを含
有させた。テトラサイクリンは産生に任意の成分である
が、接種材料の増殖用に使用される培地中に常に見出さ
れるものである。ピオチン、チアミン及び抗生物質の濃
縮溶液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培
地に添加した。滅菌グルコース溶液をまず10g/lま
で添加した。誘導段階で更に10g/lのグルコースを
添加した。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に0.5−10%の接種材料培養株を接種し、30
℃で培養した。空気飽和の20%を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHはNH
3で7±0.2に保った。細胞濃度が約3.5g/l
(OD660=10)に達してから誘導を開始した。温
度を42℃に上昇させ、42℃を1−5時間維持した。
次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に遠心分離法によ
り細胞を回収した。bGHの回収 ポリトロン(キネマテイカ)混合機を使用し、発砲を最
小にするように混合機の速度を調節しながら、50mM
リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、50mM E
DTA及び100mM NaClを含有する溶液5容量
中に細菌細胞13kg(湿潤ケーキ)を懸濁させた。均
質懸濁液を80l/時で連続的にダイノミル細胞破砕器
ケー・ディー・5(ウイリー・エイ・バシヨフエン、バ
ーゼル)中に通過させ、破砕細胞の均質懸濁液をシー・
イー・ピー・エイ・101遠心機内で45l/時の流量
で遠心分離により清澄化させた。遠心分離段階から得ら
れた沈殿物を収集し、50mM EDTAを含有する5
0mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)15.5
l中に再懸濁させた。最終濃度が0.05mg/mlに
なるまでリゾチームを添加し、懸濁液を37℃で16時
間インキュベートした。最終濃度が1%になるまでトリ
トン・エックス・100を添加した。次に懸濁液を室温
で30分間インキュベートし、連続フローセル音波処理
器(熱システム)内で18l/時で音波処理し、シー・
イー・ピー・エイ・101遠心機内で遠心分離した。沈
殿物を収集し、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.4)に再懸濁させ、上記同様に音波処理し、シー・
イー・ピー・エイ・101遠心機内で遠心分離した。5
0mM EDTA及び100mM NaClを含有する
50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)15.
5l中に細胞を再懸濁させ、2度沈殿させ、蒸溜水1
5.5l中に再懸濁させた。遠心分離により沈殿物を収
集し、−20℃で保存した。bGHの精製 沈殿物を蒸溜水30−40l中に再懸濁させ、0.5N
NaOHの滴定によりpH11.8として可溶化させ
た。次に溶液を連続的に音波処理し、必要に応じてシー
・イー・ピー・エイ・101遠心機内で遠心分離により
清澄化させるか又はワットマンNo.1濾紙で濾過し
た。清澄化蛋白質溶液(280nmでOD=29700
0の溶液32.6l)を、それぞれ50000−600
00ODの各部分(6×5.4 l)に分割した。各面
積5ft2の3個の100000分子量カットオフカセ
ット(ビー・ティー・エイチ・ケー型)を備えるミリポ
ア・ペリコン限外濾過器で各部分をそれぞれ限外濾過し
た。5.4 l部分を1lの保持物容量まで濃縮した。
限外濾過物を収集し、保存した。保持物をpH11.8
の別の10mMホウ酸塩緩衝液で当初の容量まで希釈
し、十分混合した。保持物容量が1lになるまでバッチ
を更に濃縮した。限外濾過物を収集し、最初の限外濾過
物と混合した。限外濾過物中のODの経常合計値が、限
外濾過器に最初にチャージしたODの20%になった
ら、次の濃縮段階の保持物容量を1lでなく0.5 l
とした。0.5 lの保持物容量からの限界濾過物の2
80nm(1cmセル)における吸光度が0.1より小
さくなるまで濃縮及び10mMホウ酸塩緩衝液による希
釈サイクルを継続した。一般に濃縮及び希釈サイクルは
9から12サイクルとした。最終保持物を排出した。全
限界濾過物を混合し、6N HClでpH9.0に調整
した。別の5.4l部分を同様に限界濾過し、pHを調
整された全限界濾過物を混合した。代表的な一工程か
ら、OD=100000に相当する吸光度0.26の限
界濾過物総量380lが産生され、所要時間は24から
40時間であった。100K限界濾過段階からの混合さ
れた限界濾過物(280nmでOD=100000の濾
過物380l)を、線流速23cm/時(25l/時)
でセファロース・シー・エル・6・ビー・ディー・イー
・エイ・イー・イオン交換カラムに通した。直径37c
m、高さ15cmのカラムを、pH9.0の10mMホ
ウ酸塩緩衝液2床容量(32L)で洗浄した。充填及び
洗浄段階から得た溶出液を廃棄した。溶離液を段階的に
10mMホウ酸塩、100mM塩化ナトリウム、pH9
に変化させ、bGHをカラムから排出させた。溶出流速
は23cm/時であった。280nmにおける溶出液の
吸光度を追跡することにより工程の進行を監視した。b
GHピークを4から5床容量(280nmでOD=43
000の容量84l)収集した後、10000分子量切
断カセットを備えるミリポア・ペリコン限界濾過装置を
使用して約10mg/mlに濃縮した。次に溶液を凍結
乾燥した。収量は純粋bGH約70gであった。実施例25 pSAL−170/10により産生されるbGHアナロ
グの活性 1.bGHアナログ及び天然bGH間のラジオイムノア
ッセイ比較 リン酸塩で緩衝した食塩水(1%BSA)を用いて10
0ng/mlのbGHアナログを含む溶液を調製した。
この溶液を50,25,12.5,6.25,3.1
2,1.56及び0.78ng/lの濃度に逐次希釈し
た。これら溶液の0.1mlアリコートを夫々一対ずつ
用意し、二抗体法を用いるRIAにかけた。希釈曲線は
天然bGHの場合とほぼ同じであった。 2.放射線受容体結合アッセイ トレーサとしての125I−BGHとカリブレーション
曲線を形成するための真正bGH溶液とを使用し、ツシ
マ,ティー(Tushima,T.)及びフライセン,
エッチ・ジー(Freisen,H.G,)の方法(ワ
イ.シン(Y.Chin.),内分泌物代謝(Endo
cr.Metab.)(1973年),37;3)に従
ってウサギ肝臓膜での放射線受容体結合アッセイ(ra
dioreceptor binding assa
y)を行なった。試料を各3部ずつ0.3mlのアッセ
イ緩衝液(50mMのトリス,15mMのCaCl2及
び5mg/mlのウシ血清アルブミン,pH7.6)中
で室温で2時間インキュベートした。管には125I−
bGH(20,000cpmの30〜60μCi/μg
試料)、150〜250μgの肝臓膜タンパク質及び天
然bGH(1〜100ng)又はバクテリアbGH抽出
物のいずれかを入れた。アッセイの結果このbGHアナ
ログのbGH活性は天然bGHに比肩することが判明し
た。 3.脛骨テスト 実施例5に従いバクテリア細胞から回収したpRO12
産生bGHアナログの生物学的活性を脛骨テストにより
測定した(パーロー,エー・エフ(Parlow,A.
F.)他,内分泌学(Endocrinology)
(1965年)77:1126参照)。ラットを生後2
8〜30日で下垂体切除し、その後無処理で10〜14
日間放置した。ウシ下垂体又は組換え体大腸菌(Esc
herichia Coli)から得たウシ成長ホルモ
ンをpH10.0の0.15M NaCl+0.01M
ホウ酸塩に溶解した。ラット(4〜7匹/グループ)に
bGH溶液(0.2ccで5〜125μg/日)を5日
間毎日皮下注射し、その間食餌は普通に与えた(プリナ
ラット チャウ(Purina Rat−Chow)
及び任意に水)。6日目にラットを殺して前脚膝骨を取
り出し、長手方向に切断し、アセトンで固定し且つ2%
AgNO3で染色した。解剖用双眼顕微鏡(ニコン)で
の観察により骨端板の幅を測定した。平均値(40記録
/ラット)を用いて長い用量−応答曲線を形成した。テ
ストの結果pSAL−170/10産生bGHアナログ
のbGH活性は天然bGHと比肩することが判明した。実施例26 実施例3のSOD宿主−ベクター系により産生されるヒ
ト超酸化物ジスムターゼの収率及び活性は前記宿主−ベ
クター系の成長条件の改変により向上し得る。下記のデ
ータが示すように、前記宿主−ベクター系の成長培地に
Cu及び/又はZnを補足すると活性ダイマー形状の前
記酵素の収率が増大する。バクテリア含有pSODβ1T11の成長 I.保存培養株 保存培養pSODβ1T11をカゼイン培地(接種材料
の項参照)で成長させ、次いで凍結用培地(freez
ing medium)で2倍に希釈し−80℃で保存
した。前記凍結用培地の組成は次の通りである。 II.接種材料 接種材料を20g/lのカゼイン水解物、10g/lの
イースト抽出物及び2g/lのNaCl中で増殖させ
た。シェークフラスコ内の無菌培地に保存培養物を接種
し、シェーカー内30℃で且つ約200r.p.m.で
15時間インキュベートした。必要に応じ、接種材料増
殖過程におけるその後のステップは撹拌曝気発酵槽中で
実施した。無菌培地に2−10%のフラスコ培養物を接
種し、溶存酸素レベルを20%空気飽和以上に保持すべ
く撹拌及びアエレーションを行ないながらpH7±0.
5,30℃で15時間インキュベートする。 III.産生 産生培地は下記の物質を含む。 濃縮溶液状のビオチン、チアミン及びテトラサイクリン
は別個にフイルタ滅菌処理し、接種前の無菌産生培地に
加えた。無菌グルコース溶液を最初に10g/lとなる
ように加えた。誘導(induction)ステップで
更に10g/lのグルコースを加えた。トレース微量元
素溶液は下記の成分を含む。 この培地に0.3−10%の接種材料培養物を接種し、
30℃でインキュベートする。撹拌−通気は溶存酸素レ
ベルを20%空気飽和以上に維持すべく調整する。pH
はNH3で7±0.2に維持する。細胞濃度が約3.5
g/l(OD660=10)に達すると誘導が開始され
る。温度を42℃に上げ、1−5時間42℃に維持す
る。次いで培養物を冷却し、細胞を遠心分離により回収
することによって酵素精製用とする。SODの回収 ポリトロン(Polytron)ブレンダー(キネマチ
カ)を用い、起泡を最小限に抑えるべく速度調整しなが
ら1.5kgのバクテリア細胞(ウェットケーキ)を1
21の50mMリン酸ナトリウム(pH7.8)に懸濁
させる。この均質懸濁液をダイノミル細胞破砕器(Dy
nomill cell disrupter)KD5
(ウイリー,エー。バシヨフエン,バーゼル(Will
y,A.Bachofen,Basel)に連続的に通
す。連続フローセル(エン,バーゼル(Willy,
A.Bachofen,Basel)に連続的に通す。
連続フローセル(continuous flow c
ell)を使用して該破砕細胞均質懸濁液を超音波処理
し、CEPA101遠心分離器で分離処理する。上澄み
を2時間65℃に加熱し、冷却後前述の如く遠心分離に
かける。10,000分子量カットオフカセット(PT
GCタイプ)を用いるミリポア ペリコン(Milli
pore Pellicon)限外濾過装置で前記の透
明な上澄みを1lまで濃縮する。この濃縮されたタンパ
ク質溶液を150mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.8)で平衝化したDEAE−セファセル(Seph
acel)カラム(2kgのDEAEセファセル)に通
す。通過溶液を回収し濃縮してペリコン限外慮過器によ
りpH7.8の20mMトリス−HClに対して透析
し、その後20mMトリス−HCl緩衝液で平衝化した
QAE−セファローズ(Sepharose)カラムに
通す。このカラムをpH7.8の20mMトリス−HC
l緩衝液と塩グラジエント(0〜200mM NaC
l)とで展開する。SOD含有分画を集め、ペリコン限
外濾過装置を用いて濃縮し、蒸留水に対して透析し、そ
の後pH4.8の1M酢酸ナトリウム緩衝液を加えて1
00mM酢酸ナトリウムにする。このタンパク質溶液を
pH4.7の100mM酢酸ナトリウムで平衝化したC
M−セファローズカラムで更に分離処理する。同一の緩
衝液と塩グラジエント(100〜500mM NaC
l)とを用いて前記カラムを展開する。SOD含有分画
を集め、ペリコン限外濾過装置を用いて濃縮し、凍結乾
燥する。 実施例27バクテリアにより産生されるSODの酵素活性 標準的成長条件(即ちCuSO4を補足しない)では実
施例26のバクテリアにより産生される精製ヒトSOD
(hSOD)はウシCu/ZnSODと比べて5%の酵
素活性しか示さなかった。金属含量分析の結果、該酵素
はCuを予定値の8%に過ぎない極めて少量しか含まな
いことが判明した。更に、該タンパク質はZnを必要量
のほぼ2倍も含んでいることから、大部分のCu++部
位がZnイオンにより置換されているものと考えられ
る。これに対し、バクテリア産生hSODから製造され
る金属を全く含まないアポプロテインは溶液中で再構成
(reconstitute)すると本質的に完全な酵
素活性を回復する。この溶液はCu++及びZn++を
双方共モル活性部位当り1.2モルの濃度で含む(表I
V参照)。前述のデータは細胞内Cu++濃度が限定さ
れており、産生されたhSODを飽和するには不十分で
あることを示唆している。一連の実験から、成長培地の
Cu++濃度を増加するとhSODの比活性が増加する
ことが判明した。実際、200ppmCu++を補足し
たカゼイン水解物(実施例26)中で増殖した大腸菌は
誘導後天然金属組成と十分な酵素活性とをもつ極めて活
性の高いhSODを産生した(表IV参照)。更に実験
を続けた結果、添加される外因性Cu++が50〜25
0ppmであると同様の効果が得られることが判明し
た。75ppmのCu++を補足したLB(ルリアブロ
ス(Luria Broth))培地でも同様の効果が
観察された。
【表4】
Cu++及びZn++を補足しない培地を使用した。h
SOD2は実施例26に従い製造。Cu++及びZn
++を補足した培地を使用した。基準としてウシ血清ア
ルブミンを使用し、ロウリー(Lowry)の方法によ
ってSOD濃度を測定した(ローリー,オー・エッチ
(Lowry,O.H.),ローズブロー,エヌ・ジェ
ー(Rosebrough N.J.),ファー,エー
・エル(Farr,A.L.)及びランドール,アール
・ジェー(Randall R.J.),生物学化学誌
(J.Biol.Chem.),193,265〜27
5(1951年)参照)。フエリシトクロム−cの還元
阻止を検査すべく、マッコード(McCord)及びフ
リドビッチ(Fridovich)の方法で活性測定を
行なった(マッコード,J.M.及びフリドビッチ,
I.,Biol.Chem誌,244,6049−60
55(1969年)参照)。原子吸収により精製SOD
試料のCu及びZn含量を測定した。ウィーザー(We
ser)及びハートマン(Hartman)に従ってS
ODアポ酵素を製造し(ウィーザー,U.及びハートマ
ン,H.j.,FEBSレター(FEBS Let
t.),17,78−80(1971年)参照)、Cu
及びZnの同時添加によって再構成した(ジュウェッ
ト,エス・エル(Jewett,S.L.),ラトレン
タ,ジー・エス(Latrenta,G.S.)及びベ
ック,シー・エム(Beck,C.M.),生化学生物
物理学誌(Arc.Biochem.Biophy
s.)215,116−128(1982年)参照)。実施例28 バクテリア産生hSODのアミノ末端配列 実施例26に従い製造した精製SODのアミノ末端の5
つのアミノ酸の配列をエドマンデグラデーション(Ed
mann degradation)により検査した。
このアミノ酸配列はヒトCu/ZnSODのN末端と同
一、即ちAla−Thr−Lys−Ala−Valであ
る。これは該バクテリア産生物の真正を立証するもので
ある。従って可溶性hSODはN末端メチオニンを除去
する大腸菌処理酵素を受入れ易いと考えられる。論 考 我々は、LB又はカゼイン水解物培地で成長すると多量
のhSODを産生すべく誘導されるバクテリアが酵素活
性をもたないタンパク質を産生することを確認した。こ
のようにして産生されたタンパク質は再構成と消失Cu
++,Zn++イオンの補足とによって活性化すること
ができる。意外なことに、このバクテリアはCu++を
補足した培地で成長させると酵素活性をもつhSODを
産生すべく誘導され得る。理論として決めつけるつもり
はないが、我々は肥沃培地(例えばLB及びカゼイン水
解物)の或る種の成分が有効銅の大部分と結合してキレ
ートを形成し、そのためバクテリアが高レベルで産生さ
れるSOD分子の全ての部位を満たす程十分な遊離銅を
持たないのだと考える。培地に50〜250ppmのC
u++イオンを加えると、バクテリア内部のCu++イ
オン濃度は明らかに増加し、過剰産生されるヒトCu/
ZnSODに必要な全てのCu++を提供するに十分な
レベルに到達する。実施例29 組換型ヒト超酸化物ジスムターゼによる全体的虚血後の
再灌流傷害の減少 実施例3の如く大腸菌A1645内の宿主−ベクター系
pSODβ1T11により産生し、実施例26の条件下
で成長させ且つ精製したヒト超酸化物ジスムターゼは全
体的虚血後の再灌流傷害(損傷)を減少させることが判
明した。摘出し灌流したウサギ心臓 1.2〜2.0kgの雌ニュージーランド白ウサギをヘ
パリン化し、麻酔をかけて心臓を取出し、低温(4℃)
灌流液中に即刻配置した。上行大動脈にカニューレを挿
入し、117mM塩化ナトリウム、6mM塩化カリウ
ム、3.0mM塩化カルシウム、1.0mM硫酸マグネ
シウム、0.5mM EDTA及び16.7mMグルコ
ースを含み最終pHが約24mMの炭酸水素ナトリウム
の添加により7.40に調整された改質クレブス−リン
ガーズ(Krebs−Ringers)緩衝溶液により
一定圧力(水110cm)下でこれら心臓の灌流を行な
った。前記灌流液には95%の酸素及び5%の二酸化炭
素で連続的に気泡を与えた。真空吸引によりNMR試料
管から冠状流(coronary flow)を除去し
た。飽和塩化カリウムに浸漬しポリエチレン管に入れて
グラス(Grass)SD−9ステイミュレータに接続
したガーゼ(wick)を用い、右心室ペーシングによ
ってこれらの心臓に175指動/分のペースを与えた。
左心室収縮機能を定量すべく、空気泡を入念に除去し3
路ストップコックを介してステイサム(Statha
m)P23Db変換器に接続した長さ100cmのPE
190管の先端にラテックスラバーバルーンを取付け
た。等容量圧(isovolumicpressur
e)をブラッシュ(Brush)2チャネル直接書込み
レコーダにより記録した。前記バルーンは注入器により
10mmHgの末端拡張期圧を得るに足る十分な量の食
塩水を注入して膨満させた。発生圧力の以後の測定はこ
の末端拡張期圧で行った。全ての心臓を30分間全体的
虚血状態におき、その間温灌流液を周囲に流すことによ
り37℃に保持した。灌流線のクロスクランピングによ
り大動脈流入を完全に遮断した。前記虚血時間終了後4
5分間の正常温度再灌流(37±2℃)を行なった。左
心室に発生する圧力の回復を虚血前対照のパーセンテー
ジとして計算した。虚血開始時にはバルーンを収縮させ
ペーサーを切断した。再流(reflow)開始15分
後、第1回目の機能測定直前にバルーンを虚血時に除去
した量と同量だけ再膨満させた。虚血の前と、再流後5
分の時点と、再灌流開始後15分,30分及び45分の
時点とにおいて真空吸引により冠状血液流の体積測定を
行なった。核磁気共鳴法 内径の大きい超伝導磁石内で4.23テルサ(Tels
a)でブラッカー(Brucher)WH180スペク
トロメータによりリン−31NMRスペクトルを得た。
この磁界強さでは前記リンは72.89MHzで共鳴す
る。リンプローブの直径は25mmである。この道具は
パルス状フーリエ変換モードで作動させ、ノコレット
(Nocolet)1280コンピュータとインタフェ
ース接続させた。データは高密度磁気ディスクに記録し
た。超伝導磁石の磁界は安定しているため磁界/周波数
ロックは不要である。2秒間隔で送出される45°パル
スに続く過渡電流から5分間プロトン減結合スペクトル
(five minuteproton decoup
led spectra)を集めた。これらはスペクト
ル飽和を最小にするための既に立証された条件である。
データは3,000Hzのスペクトル幅で2Kテーブル
を用いて保持した。NMRスペクトルに基づく組織細胞内pHの測定 細胞内pHの測定値は次の方程式 pH1=pK−log(δO−δB/δA−δO) により無機リン酸塩ピークの化学シフト(δO)から求
められる。組織異種効果(tissue inhomo
geneity effects)を最小限に抑えるべ
く、化学シフト値はこれらの研究で見られるpH範囲内
では比較的低いpH依存度を示すホスホクレアチンの共
鳴に関して測定した(pKA=4.6)。この方程式で
使用する定数は既に知られているようにpK=6.9
0,δA=3.290PPM及びδB=5.805PP
Mである。NMRスペクトルに基づく代謝産物の定量 コンピュータで決定される標準化定数又は規準化ファク
タを考慮に入れて個々のピーク下の面積をプラニメータ
測定することにより組織のホスホクレアチン(PC
r)、アデノシン三リン酸(ATP)及び無機リン酸塩
(Pi)を測定した。面積積分の実施にはヒューレット
−パッカード(Hewlett−Packard)デジ
タル化装置を使用した。このようにして得られるPc
r、ATP及びPiの定量データは虚血前対照含量のパ
ーセントテージとして表わされる。 実験プロトコール 17個の心臓を次の2グループに分割した。 グループI (n=8)このグループの心臓は60,0
00単位のヒト組換型超酸化物ジスムターゼ(hSO
D,比活性3,200IU/mg)を10mlの濃縮塊
(bolus)として再流の直前に投与し、次いで再流
の最初の15分間の間60,000単位を連続注入する
ことにより処理した。hSODは37℃のクレブス−リ
ンガーズ重炭酸塩灌流液に溶解した。 グループII (n=9)このグループの心臓には再流
の直前に10mlの灌流液濃縮塊を投与し、次いで正常
温度再漕流を行なった。 結 果左心室機能の回復 この研究で使用した虚血実験モデルは中程度のひどさの
回復不能傷害を受け且つ治療によって改善する可能性を
保持するような心臓を得るべく一連の予備研究に基づい
て特別に選択したものである。45分間の再流終了後の
左心室機能回復は(対照発生圧力のパーセンテージとし
て測定)対照グループの場合47±5%であり、末端拡
張期圧は48±7mmHgであった(10mmHgの虚
血前対照値と比較)。これらのパラメータは30分間及
び45分間の再灌流の間に余り変化しなかった。これは
比較的安定した回復状態が得られたことを意味する。再
流直前と最初の15分間の再灌流の間とにhSODを投
与した結果、心臓機能保存状態が著しく改善され、対照
心臓と比較して末端拡張期圧の増加が減少した。hSO
Dで処理した心臓は対照発生圧力の71±6%を回復
し、末端拡張期圧は僅か27±4mmHgであった(い
ずれも対照に対し、P<0.01)。虚血の間及びこれに続く再灌流の間の心筋代謝 心筋の高エネルギーリン酸塩含量を対照心臓及びhSO
D処理心臓に関して虚血の間及びその後の再灌流の間に
順次測定した。30分間の虚血期間では心筋クレアチン
ホスフエート及びATP含量の漸減が観察された。ホス
ホクレアチン含量は虚血期間終了までに対照心臓では虚
血前基線量値の8±3%に減少し、hSOD処理心臓で
は対照の10±5%に減少した。ATP含量は対照心臓
では基線量の36±6%に達し、hSOD処理心臓では
33±6%に達した。これらのデータは2つのグループ
の心臓がいずれも同程度の虚血を受けたことを明示して
いる。これらのデータはまた、メカニズム制御されない
ものによって細胞代謝が虚血期間の間より良く保存され
るがために、hSOD受容心臓がより良い機能回復を示
したという可能性を否定する。45分間の再流後にhS
OD処理心臓がほぼ正常なホスホクレアチン含量(対照
の93±9%)を示したのに対し、対照心臓は元の値の
69±7%しか回復しなかった(P<0.05)。この
再流期間終了時のATP含量はどちらのグループの心臓
でも同等であった(対照心臓では41±4%、hSOD
処理心臓では42±5%)。このATP含量に関する結
果は、高エネルギーリン酸塩産生率を増加させる能力が
制限されている場合に心臓がより良い左心室機能回復を
得るにはより多くのエネルギーを必要とすることを示唆
していると考えられる。これに対し対照心臓のより低い
機能回復は高エネルギーリン酸塩代謝産物のより低い使
用度につながり、場合によってはエネルギー生産のより
厳しい制限さえ遮蔽し得る。結論としてこれらのデータ
は、中程度の虚血傷害を受け次いで再灌流処理される心
臓では、再灌流の前と初期とにhSODを投与すると収
縮機能及び拡張機能がより良く回復し且つ心筋のホスホ
クレアチン含量が増加することを示している。これらの
データはまた、虚血心筋の再灌流の結果構造的及び/又
は機能的損傷成分が生じるが、この成分は再灌流時にh
SODの如き酸素遊離基スカベンジャーを投与すれば除
去又は減少し得ることも示唆している。従って虚血心筋
の再酸素付加に起因する前記再流傷害成分を抑制するこ
とにより、hSODは急性心筋梗塞後早期に治療を受け
る患者の血栓融解療法及び/又は冠状血管形成に加えて
更に別の利益をもたらし得る。実施例30 再灌流中の組換型ヒト超酸化物ジスムターゼ投与による
実験的梗塞サイズの縮小 実施例3に記載の大腸菌A1645中のpSODβ1T
11宿主−ベクター系により産生され、実施例26の条
件で成長及び精製したヒト超酸化物ジスムターゼは心臓
の梗塞サイズを縮小させることが判明した。虚血性心筋
の時を得た再灌流は梗塞サイズ(IS)を縮小せしめ
る。しかしながらこの有益な効果は、有害酸素遊離基の
発生により媒介される再流傷害の同時発生によって低減
し得る。組換型ヒト超酸化物ジスムターゼ(hSOD)
による遊離基の除去が再灌流のみの場合と比較してIS
を縮小させる結果をもたらし得るか否かをテストすべ
く、16匹のイヌに麻酔をかけ、どの辺縁枝よりも手前
で回旋冠動脈を90分間閉塞した。再灌流時にこれら動
物にhSOD(400,000単位を濃縮塊として左心
房投与し、次いで300,000単位を1時間静脈内注
入;n=8)又は同量の食塩水(対照,n=8)を投与
した。胸部を閉鎖して動物を回復させた。48時間後に
これら犬を殺し、一般病理学によるISの測定と死後血
管造影法による危険領域の測定とを行なうべく心臓を盲
検法(blinded fashion)で処理した。
回旋動脈を中心に近い方で閉塞した結果、対照グループ
では左心室(LV)の40.8+2.3%、処理グルー
プでは41.8+2.0%が虚血状態になった。対照グ
ループのイヌでは再灌流に伴い危険領域52.2+7%
の梗塞が生じた。これに対しhSOD処理は壊死を著し
く減少させ、ISは危険領域が33.6+2.1%であ
った(P<0.05)。対照動物では危険領域の大部分
に亘って広がる壁を越えない(non−transmu
ral)融合性梗塞が発生したのに対し、処理動物では
より不統一(patchy)な非融合性梗塞が現われ
た。結論すれば、再灌流時に投与されるhSODによる
遊離基除去は、恐らくは再流傷害の回避によって、壊死
の規模を著しく縮小させた。実施例31 低温保存虚血腎臓の再灌流傷害の媒介における酸素遊離
基の役割 1 最近の指摘によれば、ヒト超酸化物ジスムターゼは臓器
移植後の再灌流傷害を減少させ得る。次の実施例は腎臓
移植後の再灌流に伴う障害が前記超酸化物ジスムターゼ
により改善されることを示す。この実施例で使用したヒ
ト超酸化物ジスムターゼは実施例3の大腸菌A1645
中のpSODβ1T11宿主−ベクター系により産生さ
れ、実施例26の条件で成長させ且つ精製したものであ
る。この実施例で括弧内に記されているアラビア数字は
該実施例の後の参考文献表に列挙されている文献を示
す。ブタにおける腎臓の保存及び移植虚血のモデル 体重15〜18kgの異系交配雌ブタをアセプロマジン
及びアトロピンで薬剤前処理し、ケタミン及びハロタン
で麻酔した。1500ccのリンガー乳酸塩(Ring
ers′lactate)、フロセミド(20mg)及
びマンニトール(12.5g)の静脈内投与により、採
取30分前にドナーのブタに利尿作用を与えた。ブタに
しばしば見られる腎臓血管痙攣を回避すべくフエノキシ
ベンザミン(50mg)を静脈内投与した。正中線に沿
って腹部を切開し、末端大動脈及び大静脈を分岐の直ぐ
近傍まで可動化した。尿管を剥離し膀胱レベルで分割し
た。分岐の直ぐ上の大動脈に導入用カテーテルを配置
し、下方大静脈に導出カテーテルを配置した。ヘパリン
(5,000単位)を静脈内投与し、腎臓動脈の直ぐ上
の大動脈のクロスクランピングと合致する末端大動脈を
介して4℃のユーロ−コリンズ(Euro−Colli
ns)溶液での連続的フラッシュ(flush)を開始
した。腎臓をその場で冷却した後一括して取出した。次
いで腎臓を分離し、一方を対照他方をテスト腎臓として
使用した。これは対による実験法を容易にするためであ
る。各腎臓を4℃のユーロ−コリンズ液で再度フラッシ
ュした。プロトコールにより必要とされる場合にはテス
ト物質をこの時点で第2腎臓の保存液に加えた。これら
腎臓は双方共無菌状態で包装し4℃で一晩保存した。2
4時間の低温虚血の後、新たなレシピエント動物に麻酔
をかけ、保存腎臓を腸骨管に移植した。各吻合に要した
時間は25〜30分であった。対照(未処理)腎臓を必
ず最初に移植し、テスト腎臓を次に移植した。従ってテ
スト腎臓の再灌流は常に対照腎臓の再灌流より合計1時
間遅れた。これは対照腎臓が低温虚血状態に23時間お
かれたのに対し、テスト腎臓は24時間おかれたことを
意味する。SODアナログの動脈内投与を対照腎臓の再
灌流の1時間後に当たるテスト腎臓の再灌流時に開始し
た。従って対照腎臓はテスト腎臓に与えられる全ての物
質効果に曝される1時間前に再加熱及び再灌流の有害効
果に曝されたことになる。第2腎臓の再灌流に次いでレ
シピエントたるブタ自体の腎臓を除去した。臨床操作を
模倣して更に10gのマンニトールを先ず対照腎臓の再
灌流前に投与し、次いでテスト腎臓の再灌流前に再び投
与した。これによって従来の最適保存/移植技術に加え
られる遊離基改変物質の効果を測定し得た。各腎臓から
の尿管は皮膚尿管瘻造設術として別個に取出した。移植
後2日間レシピエントを軽く麻酔して各腎臓(尿管造瘻
術)から別個に尿を1時間収集し、量とクレアチニン濃
度とを測定した。血清クレアチニンも測定した。これは
各腎臓毎にクレアアチニンクリアランスを計算するため
である。全ての結果は平均値±SEMで表わされる。ス
チューデントt−テスト(両側検定)の間にデータを分
析した。実験が対で行なわれるため、殆んどの場合に対
テストを適用し得た。 1 この実施例で使用した略号: CCR クレスチニンクリアランス ATP アデノシン三リン酸 ADP アデノシンニリン酸 AMP アデノシン一リン酸 実験プロトコール超酸化物ジスムターゼ(SOD)及びカタラーゼ 4匹のブタのテスト腎臓にシグマウシ血液超酸化物ジス
ムターゼ、酸素遊離基スカベンジャーを投与した。再灌
流の直前に腎臓動脈に5mgの濃縮塊を投与し、再灌流
開始後15分間1mg/分で一定の動脈内注入を続け
た。その結果合計20mgのSODが与えられたことに
なる。4匹のブタからなる第2グループではSODに加
えてカタラーゼ(シグマ社)を同一投与量でテスト腎臓
に与えた。これら各ブタの他方の腎臓は処理せずに対照
として使用した。SODに対する用量応答 最大の保護を得るための最小限の用量を決定すべく用量
応答関係(doseresponse relatio
nship)を調べた。血管再分布(revascul
arization)時に一方の腎臓には2種類の用量
のうち少ない方のSODを注入し他方には多い方のSO
Dを注入した。実施例9に従い製造したヒト組換型SO
Dを前述の如く投与した。各用量範囲内で2つの比較を
行なった。最初の比較では0.2mgのSODを対照た
る食塩水と比較した。段階的に0.2mgを2mgと比
較し、2mgを20mgと比較し、20mgを100m
gと比較した。いずれの場合も少ない方の用量を受容す
る腎臓を最初に移植した。これは第2移植時にSODの
循環が滞留し得るという問題を回避するためである。 結 果ウシSOD及びカタラーゼの効果 我々が使用した大きさのブタの単一正常腎臓のクレアチ
ニンクリアランスは、前述の麻酔及び水分補給(hyd
ration)条件下では25.5+6.3ml/分で
あった(n=8)。20mgのSODを再灌流の最初の
15分間に亘って腎臓動脈内に投与すると低温虚血後の
腎機能減損が実質的に改善された。SODのみで処理し
た4つの腎臓は平均クレアチニンクリアランスが23.
2±4.5ml/分であった。これは対照腎臓(8.4
±1.7ml/分,p<0.05)のほぼ3倍に当た
る。SOD及びカタラーゼを組合わせて使用した場合に
も同程度の保護が得られ、それ以上の効果は見られなか
った(CCR=19.0±4.5ml/分)。先に行な
った予備実験では4匹のブタからなる別のグループを4
0分を越える吻合時間をかけて移植処理した。SOD及
びカタラーゼにより腎機能は著しく向上したが、これら
の動物では処理腎臓も対照腎臓も極めて低い機能を示し
た(CCR=4.8±0.8対1.6±0.4ml/
分)。それ自体再灌流に先立つ虚血に起因してより重大
な傷害を受けたと思われるこれらの腎臓では、遊離基の
危害を改変しても正常腎機能を回復することはできなか
った。ヒトSODアナログ用量応答関係 ヒトSODアナログ(0.2mg及び2mg)を注入し
ても対照と比較して腎機能には何らの改善も見られなか
った。しかしながら20mgのSODアナログを投与し
た腎臓の平均クレアチニンクリアランスは14.2±
1.1ml/分であり、2mg注入した腎臓(7.7±
1.0ml/分,p<0.05)を遥かに上回ってい
た。100mgのSODアナログを投与してもそれ以上
の効果は得られなかった(CCR=16.1±1.2m
l/分)。従ってSODアナログの最小有効量はこのよ
うな方法で投与する場合には2mgより多く20mgよ
り少ない量であることが判明した。ヒトSODアナログ
はウシSODと同程度の効力を示した。 論 考 使用処理法に起因する差異を最大限にし且つ特定ドナー
又はレシピエント動物に係る種々の変数に関する制御を
行なうべく対で実験する方式を用いた。この対方式では
結果の統計分析を対で行なうこともでき、従って少数の
比較的高価な実験動物の最適利用を可能にするものであ
った。これらの研究における重要な発見は遊離基媒介再
灌流傷害の除去によって得られる利益の大きさであっ
た。対照腎臓は健康なドナー腎臓及びレシピエント動
物、水分補給、αアドレナリン作用阻害、抗凝血並びに
利尿を含む従来の最適臓器保存法の利益を受けたにも拘
らず重大な機能障害を示し、クレアチニンクリアランス
のレベルが正常レベルの1/3以下に低下した。この2
4時間の虚血状態保持は、同様の臨床的状況下でしばし
ば見られるように従来の職器保存能力を越えるものであ
る。有効量のウシSOD又はヒトSODアナログで処理
するとこの障害が驚く程効果的に回避され、腎機能がほ
ぼ正常レベルに維持される。実際、このように処理した
腎臓で、移植後48時間目に測定した時に、対をなすも
う一方の未処理対照腎臓の少なくとも2倍のクレアチニ
ンクリアランスを示さなかったものは1つもない。この
利益の大きさは従って45〜60分の温暖虚血後に見ら
れるものより量的に大きかった。これは、従来の最適保
存技術を用いると虚血自体に起因する障害は最小化さ
れ、再灌流時に発生する障害が優勢になることを示唆す
る。この解釈は更に、再灌流に先立ち18時間保存して
おいた腎臓についての研究によっても裏付けられる。こ
れらの腎臓では対照グループ及び処理グループの双方共
優れた機能を示した。これは、再灌流時の遊離基発生に
適した条件を設定するだけの十分な代謝産物の蓄積に必
要な時間が未だ十分に経過していなかったことを意味す
る。一方、腎臓を吻合時間のより長い(即ち温暖虚血)
前記予備実験の場合のようにより重大な虚血状態におく
と、SODを投与しても明らかな改善は見られたものの
機能を正常レベルまで回復させることはできなかった。
従ってこれらの腎臓はより短時間の温暖虚血(7,8,
9)後に調べたものにより類似していると言えよう。他
の器官と同様に、遊離基傷害除去の利益は主として、再
灌流に起因する傷害と比較した虚血自体に起因する傷害
の相対比に関連する。更にこの利益増加の達成は悉無律
的であると考えられる。SODに関する用量応答検査
は、最大限の保護が得られるか又は保護が全く得られな
いかのいずれかを示した。カタラーゼはSODのみに加
えてもそれ以上の利益はもたらさなかった。この研究を
定量的に分析した限りでは、再灌流傷害防止は悉無律的
現象であったと思われる。しかしながら、この研究にお
ける諸発見事項は臨床的用途に特に適していると考えら
れる。ここで選択した24時間の低温虚血は臨床状況で
必要とされる死体移植組織保存期間に十分該当する。更
にこれらの研究では、従来の最適保存及び移植法に対し
て遊離基による再灌流時傷害の除去の効果が立証され
た。これにはそれ自体効果的なヒドロキシル基スカベン
ジャーであるマンニトールの使用が含まれる。従ってこ
れらの研究は、遊離基除去を現在使用されている臨床的
方法に加えて用いれば同程度の効果が得られることを示
唆する。SODは無毒化合物であるため、この方法は有
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A.),グレンジャー,ディー・エヌ(Granger
D.N.),バルクレー,ジー・ビー(Bulkle
y G.B.),超酸化物ラジカルと虚血小腸の粘膜損
傷(概要)(Superoxide Radicals
and Mucosal Lesionsof th
e Ischemic Small Intestin
e(Abstract))。フェドプロク(Fed P
roc)41:1742(1982年)。 18.カゼイル,エー・エス(Casale A.
S.),バルクレー,ジー・ビー(Bulkley
G.B.),バルクレー,ビー・エッチ(Bulkle
y B.H.),フラハーティ,ジェー・ティー(Fl
aherty J.T.),ゴット,ブイ・エル(Go
tt V.L.),ガードナー,ティー・ジェー(Ga
rdner T.J.),酸素遊離基スカベンジャーは
進行阻止された全体的虚血心臓を再灌流時に保護する
(Oxygen Free−RadicalScave
ngers Protect the Arreste
d,Globally Ischemic Heart
Upon Reperfusion)。サージュリー
フォーラム(Surg Forum)34:313(1
983年)。実施例32 摘出ウサギ角膜の生存と遊離基スカベンジャー 実施例3の大腸菌A1645中pSODβ1T11宿主
ベクター系により産生し、実施例26の条件下で成長さ
せ且つ精製したヒト超酸化物ジスムターゼは切除した摘
出(単離)角膜の生存期間を長くすることが判明した。
この実施例で括弧内に記されたアラビア数字は該実施例
の説明の後に列挙された参考文献を示す。in vit
roのウサギ角膜内皮ポンプに対する低濃度アデノシン
の有益な効果は種々の研究で既に立証されている
(1)。前記流体ポンプの作動は単離角膜に平衡食塩水
中生理濃度グルコース(5mM)及びアデノシン(10
−6M)を灌流させることによって実現された。生存時
間は約7時間であった。我々の次の目標は生存時間の延
長であった。超酸化物ジスムターゼ(SOD)(2)は
反応O2・−+O2・−+2H+→H2O2+O2を促
進することにより超酸化物遊離基を除去する。SOD投
与は部分的酸素欠乏後の虚血組織の生存を著しく高める
ことが知られている(3)。虚血に起因するかなりの程
度の組織破壊は単離組織の再灌流及び再酸素付加の間に
生じる。この危害の大部分は超酸化物ラジカルとその一
族とによって媒介される。本研究の目的は超酸化物ジス
ムターゼ(SOD)又はカタラーゼが単離角膜の生存期
間を延長させ得るか否かを調べることにある。体重2.
0〜3.0kgのシロウサギから角膜を単離した。その
技術としては既に詳述されているものを使用した
(1)。要約すれば、眼を切除して角膜上皮を剥離し、
次いで角膜を記載の如く単離し、灌流処理した。 結 果 5mMグルコース及び1μアデノシンを含む基礎食塩水
にSODアナログを2μ/mlで加えると単離角膜の生
存時間が7時間から14時間まで延びた。アデノシンを
除外すると生存時間は12時間までしか延長されなかっ
た。結論としては、SODアナログは単離角膜の生存時
間の延長に有効であることが判明した。SODアナログ
は他の単離(摘出)臓器の生存時間延長でも重要な役割
を果たし得る。ウシSODを用いて得た同様のデータが
エクスペリメンタルアイリサーチ(Experimen
tal Eye Research)4:153−15
4(1985年)に発表されている。 参考文献 1.ニューワース,オー(Neuwirth,O.)及
びディクスタイン,エス(Dikstein,S.)
(1983年)ウサギ角膜内皮流体ポンプに対する環状
AMPの効果(The effect of cycl
ic AMP onthe rabbit corne
al endothelial fluid pum
p)。カレントアイリサーチ(Current Eye
Res.)2(8),565−567。 2.フリドビッチ,アイ(Fidovich,I.)
(1975年)超酸化物ジスムターゼ(Superox
ide dismutase)。生化学年刊誌(An
n.Rev.Biochem.)44,147−15
9。 3.マンソン,ピー・エヌ(Manson,P.
N.),ロパート,エム(Robert M.),アン
テネリ,エム・エム(Anthenelli,M.
M.),マイケル,ジェー(Michael J.),
バルクレー,ジー・ビー(Bulkley G.B.)
及びフープス,ジェー・イー(Hoopes,J.
E.)(1983年)アイランド皮弁の虚血組織損傷に
おける酸素遊離基の役割(The role of o
xygen−free radicals inisc
hemic tissue injury in Is
land skin flaps)。年刊サージュリー
(Ann.Surg.)198,87−90。 4.マイケルソン,エー・エム(Michaelso
n,A.M.)及びピュゲット,ケー(Puget,
K.)(1980年)外因性超酸化物ジスムターゼによ
る細胞侵入(Cell penetration by
exogenoussuperoxide dism
utase)。アクタフイジオロジースカンジナビアサ
プルメント(Acta Physiol.Scand.
Suppl.)492,67−80。 5.パールマン,エム(Perlman,M.)及びボ
ーム,ジェー・エル(Baum,J.L.)(1974
年)ウサギ角膜内皮細胞の大量培養(The mass
culture of rabbit cornea
l endothelial cells)。眼科学会
誌(Arch.Ophthalmol.)92,235
−237。 6.クライス,エス(Klyce,S.)及びモーリ
ス,デイー・エム(Maurice,D.M.)(19
76年)in vitroでの角膜厚さの自動記録(A
utomatic recording of cor
neal thickness in vitro)。
眼科学研究(Invest.Opthalmol.)1
5,550−553。 7.ニューワースリュクス,オー(Neuwirth
Lux,O.)(1984年)ウサギ角膜内皮ポンプの
生存(Survival of rabbitcorn
eal endothelial pump)。エルサ
レムヘブライ大学理事会(the Senate of
the Hebrew University of
Jerusalem)に提出された博士論文。実施例33 p9200の構築とp9200を用いる大腸菌A164
5及びA4255内でのbGHの産生 p9200の構築は第26図に示されており図面の説明
の項で説明されている。pHG 44をCla I及び
PstIで分割し、DNAポリメラーゼIのクレノー
(Klenow)断片を用いて「フィル イン(fil
l in)」し、次いで大きなDNA断片を単離した。
Eco RI及びAva IでpBR322を開裂し次
いでDNAポリメラーゼIのクレノー断片を用いて「フ
ィルイン」することにより単離したpBR 322のテ
トラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA断片に前記断片
を結びつけた。その結果得られたプラスミドp9200
を受託番号(Accession Number)AT
CC53215としてATCCに寄託した。プラスミド
p9200はpHG 44(第6図)に類似している
が、このプラスミドはアンピシリン耐性ではなくテトラ
サイクリン耐性を付与する。プラスミドp9200を普
通の知識をもつ当業者に公知の方法を用いる形質転換に
より大腸菌株A1645及びA4255内に導入した。
これらの株は成長及び誘導時に、真正bGHのフェニル
アラニン形状のアミノ末端に加えられたアミノ酸配列m
et−asp−glnを有するウシ成長ホルモン(bG
H)のアナログを産生した。これらの株によって産生さ
れたbGHアナログの量はpHG 44により産生され
たものとほぼ同等であった。菌株A1645/p920
0(p9200で形質転換した宿主株A1645)の成
長(増殖)、bGHアナログの回収及びbGHアナログ
の精製に使用した方法は100mg/lのアンピシリン
に代えて12.5mg/lのテトラサイクリンを加えた
以外はpHG 44に関する実施例13と同一である。
A4320と称されてきた株A4255/P9200の
成長及び誘導に使用した方法は実施例36に記載の方法
である。bGHアナログの精製に使用した方法は実施例
13のpHG 44の場合と同じである。菌株A432
0(プラスミドp9200で形質転換した宿主株A42
55)を受託番号ATCC53215としてATCCに
寄託した。アンピシリン遺伝子をテトラサイクリン遺伝
子で代換すると、アンピシリンを産生プロセスから除外
し得、そのため重大なアレルギー反応の原因となり得る
最終産生物のアンピシリン汚染の可能性が回避されると
いう利点が得られる。実施例34 met−leu−leu−leu−met ヒトApo
Eアナログの産生 プラスミドpTVRは新規なアポリポタンパク質E3ア
ナログの発現を支配する。このアナログのN−末端配列
はmet−leu−leu−leu−met であり、
この直後に成熟アポリポタンパク質E3の配列が存在す
る。pTVR279−8の組立(構築) pTVR279−8の組立は第25図及び図面説明に示
されている。プラスミドpTVR279−8は受託番号
53216号でATCCに寄託済である。プラスミドp
TV 190(第21図)をAva Iで部分消化し、
DNAポリメラーゼIのKlenow断片で「埋め戻し
(till in)」,連結してE.coliを形質転
換させた。得られたプラスミドは3′Ava I部位が
除去されておりこれをpTV 264−45と命名し
た。pTV 264−45をNde Iで完全に消化し
以下の合成オリゴヌクレオチドに結合(連結)した。
SOD2は実施例26に従い製造。Cu++及びZn
++を補足した培地を使用した。基準としてウシ血清ア
ルブミンを使用し、ロウリー(Lowry)の方法によ
ってSOD濃度を測定した(ローリー,オー・エッチ
(Lowry,O.H.),ローズブロー,エヌ・ジェ
ー(Rosebrough N.J.),ファー,エー
・エル(Farr,A.L.)及びランドール,アール
・ジェー(Randall R.J.),生物学化学誌
(J.Biol.Chem.),193,265〜27
5(1951年)参照)。フエリシトクロム−cの還元
阻止を検査すべく、マッコード(McCord)及びフ
リドビッチ(Fridovich)の方法で活性測定を
行なった(マッコード,J.M.及びフリドビッチ,
I.,Biol.Chem誌,244,6049−60
55(1969年)参照)。原子吸収により精製SOD
試料のCu及びZn含量を測定した。ウィーザー(We
ser)及びハートマン(Hartman)に従ってS
ODアポ酵素を製造し(ウィーザー,U.及びハートマ
ン,H.j.,FEBSレター(FEBS Let
t.),17,78−80(1971年)参照)、Cu
及びZnの同時添加によって再構成した(ジュウェッ
ト,エス・エル(Jewett,S.L.),ラトレン
タ,ジー・エス(Latrenta,G.S.)及びベ
ック,シー・エム(Beck,C.M.),生化学生物
物理学誌(Arc.Biochem.Biophy
s.)215,116−128(1982年)参照)。実施例28 バクテリア産生hSODのアミノ末端配列 実施例26に従い製造した精製SODのアミノ末端の5
つのアミノ酸の配列をエドマンデグラデーション(Ed
mann degradation)により検査した。
このアミノ酸配列はヒトCu/ZnSODのN末端と同
一、即ちAla−Thr−Lys−Ala−Valであ
る。これは該バクテリア産生物の真正を立証するもので
ある。従って可溶性hSODはN末端メチオニンを除去
する大腸菌処理酵素を受入れ易いと考えられる。論 考 我々は、LB又はカゼイン水解物培地で成長すると多量
のhSODを産生すべく誘導されるバクテリアが酵素活
性をもたないタンパク質を産生することを確認した。こ
のようにして産生されたタンパク質は再構成と消失Cu
++,Zn++イオンの補足とによって活性化すること
ができる。意外なことに、このバクテリアはCu++を
補足した培地で成長させると酵素活性をもつhSODを
産生すべく誘導され得る。理論として決めつけるつもり
はないが、我々は肥沃培地(例えばLB及びカゼイン水
解物)の或る種の成分が有効銅の大部分と結合してキレ
ートを形成し、そのためバクテリアが高レベルで産生さ
れるSOD分子の全ての部位を満たす程十分な遊離銅を
持たないのだと考える。培地に50〜250ppmのC
u++イオンを加えると、バクテリア内部のCu++イ
オン濃度は明らかに増加し、過剰産生されるヒトCu/
ZnSODに必要な全てのCu++を提供するに十分な
レベルに到達する。実施例29 組換型ヒト超酸化物ジスムターゼによる全体的虚血後の
再灌流傷害の減少 実施例3の如く大腸菌A1645内の宿主−ベクター系
pSODβ1T11により産生し、実施例26の条件下
で成長させ且つ精製したヒト超酸化物ジスムターゼは全
体的虚血後の再灌流傷害(損傷)を減少させることが判
明した。摘出し灌流したウサギ心臓 1.2〜2.0kgの雌ニュージーランド白ウサギをヘ
パリン化し、麻酔をかけて心臓を取出し、低温(4℃)
灌流液中に即刻配置した。上行大動脈にカニューレを挿
入し、117mM塩化ナトリウム、6mM塩化カリウ
ム、3.0mM塩化カルシウム、1.0mM硫酸マグネ
シウム、0.5mM EDTA及び16.7mMグルコ
ースを含み最終pHが約24mMの炭酸水素ナトリウム
の添加により7.40に調整された改質クレブス−リン
ガーズ(Krebs−Ringers)緩衝溶液により
一定圧力(水110cm)下でこれら心臓の灌流を行な
った。前記灌流液には95%の酸素及び5%の二酸化炭
素で連続的に気泡を与えた。真空吸引によりNMR試料
管から冠状流(coronary flow)を除去し
た。飽和塩化カリウムに浸漬しポリエチレン管に入れて
グラス(Grass)SD−9ステイミュレータに接続
したガーゼ(wick)を用い、右心室ペーシングによ
ってこれらの心臓に175指動/分のペースを与えた。
左心室収縮機能を定量すべく、空気泡を入念に除去し3
路ストップコックを介してステイサム(Statha
m)P23Db変換器に接続した長さ100cmのPE
190管の先端にラテックスラバーバルーンを取付け
た。等容量圧(isovolumicpressur
e)をブラッシュ(Brush)2チャネル直接書込み
レコーダにより記録した。前記バルーンは注入器により
10mmHgの末端拡張期圧を得るに足る十分な量の食
塩水を注入して膨満させた。発生圧力の以後の測定はこ
の末端拡張期圧で行った。全ての心臓を30分間全体的
虚血状態におき、その間温灌流液を周囲に流すことによ
り37℃に保持した。灌流線のクロスクランピングによ
り大動脈流入を完全に遮断した。前記虚血時間終了後4
5分間の正常温度再灌流(37±2℃)を行なった。左
心室に発生する圧力の回復を虚血前対照のパーセンテー
ジとして計算した。虚血開始時にはバルーンを収縮させ
ペーサーを切断した。再流(reflow)開始15分
後、第1回目の機能測定直前にバルーンを虚血時に除去
した量と同量だけ再膨満させた。虚血の前と、再流後5
分の時点と、再灌流開始後15分,30分及び45分の
時点とにおいて真空吸引により冠状血液流の体積測定を
行なった。核磁気共鳴法 内径の大きい超伝導磁石内で4.23テルサ(Tels
a)でブラッカー(Brucher)WH180スペク
トロメータによりリン−31NMRスペクトルを得た。
この磁界強さでは前記リンは72.89MHzで共鳴す
る。リンプローブの直径は25mmである。この道具は
パルス状フーリエ変換モードで作動させ、ノコレット
(Nocolet)1280コンピュータとインタフェ
ース接続させた。データは高密度磁気ディスクに記録し
た。超伝導磁石の磁界は安定しているため磁界/周波数
ロックは不要である。2秒間隔で送出される45°パル
スに続く過渡電流から5分間プロトン減結合スペクトル
(five minuteproton decoup
led spectra)を集めた。これらはスペクト
ル飽和を最小にするための既に立証された条件である。
データは3,000Hzのスペクトル幅で2Kテーブル
を用いて保持した。NMRスペクトルに基づく組織細胞内pHの測定 細胞内pHの測定値は次の方程式 pH1=pK−log(δO−δB/δA−δO) により無機リン酸塩ピークの化学シフト(δO)から求
められる。組織異種効果(tissue inhomo
geneity effects)を最小限に抑えるべ
く、化学シフト値はこれらの研究で見られるpH範囲内
では比較的低いpH依存度を示すホスホクレアチンの共
鳴に関して測定した(pKA=4.6)。この方程式で
使用する定数は既に知られているようにpK=6.9
0,δA=3.290PPM及びδB=5.805PP
Mである。NMRスペクトルに基づく代謝産物の定量 コンピュータで決定される標準化定数又は規準化ファク
タを考慮に入れて個々のピーク下の面積をプラニメータ
測定することにより組織のホスホクレアチン(PC
r)、アデノシン三リン酸(ATP)及び無機リン酸塩
(Pi)を測定した。面積積分の実施にはヒューレット
−パッカード(Hewlett−Packard)デジ
タル化装置を使用した。このようにして得られるPc
r、ATP及びPiの定量データは虚血前対照含量のパ
ーセントテージとして表わされる。 実験プロトコール 17個の心臓を次の2グループに分割した。 グループI (n=8)このグループの心臓は60,0
00単位のヒト組換型超酸化物ジスムターゼ(hSO
D,比活性3,200IU/mg)を10mlの濃縮塊
(bolus)として再流の直前に投与し、次いで再流
の最初の15分間の間60,000単位を連続注入する
ことにより処理した。hSODは37℃のクレブス−リ
ンガーズ重炭酸塩灌流液に溶解した。 グループII (n=9)このグループの心臓には再流
の直前に10mlの灌流液濃縮塊を投与し、次いで正常
温度再漕流を行なった。 結 果左心室機能の回復 この研究で使用した虚血実験モデルは中程度のひどさの
回復不能傷害を受け且つ治療によって改善する可能性を
保持するような心臓を得るべく一連の予備研究に基づい
て特別に選択したものである。45分間の再流終了後の
左心室機能回復は(対照発生圧力のパーセンテージとし
て測定)対照グループの場合47±5%であり、末端拡
張期圧は48±7mmHgであった(10mmHgの虚
血前対照値と比較)。これらのパラメータは30分間及
び45分間の再灌流の間に余り変化しなかった。これは
比較的安定した回復状態が得られたことを意味する。再
流直前と最初の15分間の再灌流の間とにhSODを投
与した結果、心臓機能保存状態が著しく改善され、対照
心臓と比較して末端拡張期圧の増加が減少した。hSO
Dで処理した心臓は対照発生圧力の71±6%を回復
し、末端拡張期圧は僅か27±4mmHgであった(い
ずれも対照に対し、P<0.01)。虚血の間及びこれに続く再灌流の間の心筋代謝 心筋の高エネルギーリン酸塩含量を対照心臓及びhSO
D処理心臓に関して虚血の間及びその後の再灌流の間に
順次測定した。30分間の虚血期間では心筋クレアチン
ホスフエート及びATP含量の漸減が観察された。ホス
ホクレアチン含量は虚血期間終了までに対照心臓では虚
血前基線量値の8±3%に減少し、hSOD処理心臓で
は対照の10±5%に減少した。ATP含量は対照心臓
では基線量の36±6%に達し、hSOD処理心臓では
33±6%に達した。これらのデータは2つのグループ
の心臓がいずれも同程度の虚血を受けたことを明示して
いる。これらのデータはまた、メカニズム制御されない
ものによって細胞代謝が虚血期間の間より良く保存され
るがために、hSOD受容心臓がより良い機能回復を示
したという可能性を否定する。45分間の再流後にhS
OD処理心臓がほぼ正常なホスホクレアチン含量(対照
の93±9%)を示したのに対し、対照心臓は元の値の
69±7%しか回復しなかった(P<0.05)。この
再流期間終了時のATP含量はどちらのグループの心臓
でも同等であった(対照心臓では41±4%、hSOD
処理心臓では42±5%)。このATP含量に関する結
果は、高エネルギーリン酸塩産生率を増加させる能力が
制限されている場合に心臓がより良い左心室機能回復を
得るにはより多くのエネルギーを必要とすることを示唆
していると考えられる。これに対し対照心臓のより低い
機能回復は高エネルギーリン酸塩代謝産物のより低い使
用度につながり、場合によってはエネルギー生産のより
厳しい制限さえ遮蔽し得る。結論としてこれらのデータ
は、中程度の虚血傷害を受け次いで再灌流処理される心
臓では、再灌流の前と初期とにhSODを投与すると収
縮機能及び拡張機能がより良く回復し且つ心筋のホスホ
クレアチン含量が増加することを示している。これらの
データはまた、虚血心筋の再灌流の結果構造的及び/又
は機能的損傷成分が生じるが、この成分は再灌流時にh
SODの如き酸素遊離基スカベンジャーを投与すれば除
去又は減少し得ることも示唆している。従って虚血心筋
の再酸素付加に起因する前記再流傷害成分を抑制するこ
とにより、hSODは急性心筋梗塞後早期に治療を受け
る患者の血栓融解療法及び/又は冠状血管形成に加えて
更に別の利益をもたらし得る。実施例30 再灌流中の組換型ヒト超酸化物ジスムターゼ投与による
実験的梗塞サイズの縮小 実施例3に記載の大腸菌A1645中のpSODβ1T
11宿主−ベクター系により産生され、実施例26の条
件で成長及び精製したヒト超酸化物ジスムターゼは心臓
の梗塞サイズを縮小させることが判明した。虚血性心筋
の時を得た再灌流は梗塞サイズ(IS)を縮小せしめ
る。しかしながらこの有益な効果は、有害酸素遊離基の
発生により媒介される再流傷害の同時発生によって低減
し得る。組換型ヒト超酸化物ジスムターゼ(hSOD)
による遊離基の除去が再灌流のみの場合と比較してIS
を縮小させる結果をもたらし得るか否かをテストすべ
く、16匹のイヌに麻酔をかけ、どの辺縁枝よりも手前
で回旋冠動脈を90分間閉塞した。再灌流時にこれら動
物にhSOD(400,000単位を濃縮塊として左心
房投与し、次いで300,000単位を1時間静脈内注
入;n=8)又は同量の食塩水(対照,n=8)を投与
した。胸部を閉鎖して動物を回復させた。48時間後に
これら犬を殺し、一般病理学によるISの測定と死後血
管造影法による危険領域の測定とを行なうべく心臓を盲
検法(blinded fashion)で処理した。
回旋動脈を中心に近い方で閉塞した結果、対照グループ
では左心室(LV)の40.8+2.3%、処理グルー
プでは41.8+2.0%が虚血状態になった。対照グ
ループのイヌでは再灌流に伴い危険領域52.2+7%
の梗塞が生じた。これに対しhSOD処理は壊死を著し
く減少させ、ISは危険領域が33.6+2.1%であ
った(P<0.05)。対照動物では危険領域の大部分
に亘って広がる壁を越えない(non−transmu
ral)融合性梗塞が発生したのに対し、処理動物では
より不統一(patchy)な非融合性梗塞が現われ
た。結論すれば、再灌流時に投与されるhSODによる
遊離基除去は、恐らくは再流傷害の回避によって、壊死
の規模を著しく縮小させた。実施例31 低温保存虚血腎臓の再灌流傷害の媒介における酸素遊離
基の役割 1 最近の指摘によれば、ヒト超酸化物ジスムターゼは臓器
移植後の再灌流傷害を減少させ得る。次の実施例は腎臓
移植後の再灌流に伴う障害が前記超酸化物ジスムターゼ
により改善されることを示す。この実施例で使用したヒ
ト超酸化物ジスムターゼは実施例3の大腸菌A1645
中のpSODβ1T11宿主−ベクター系により産生さ
れ、実施例26の条件で成長させ且つ精製したものであ
る。この実施例で括弧内に記されているアラビア数字は
該実施例の後の参考文献表に列挙されている文献を示
す。ブタにおける腎臓の保存及び移植虚血のモデル 体重15〜18kgの異系交配雌ブタをアセプロマジン
及びアトロピンで薬剤前処理し、ケタミン及びハロタン
で麻酔した。1500ccのリンガー乳酸塩(Ring
ers′lactate)、フロセミド(20mg)及
びマンニトール(12.5g)の静脈内投与により、採
取30分前にドナーのブタに利尿作用を与えた。ブタに
しばしば見られる腎臓血管痙攣を回避すべくフエノキシ
ベンザミン(50mg)を静脈内投与した。正中線に沿
って腹部を切開し、末端大動脈及び大静脈を分岐の直ぐ
近傍まで可動化した。尿管を剥離し膀胱レベルで分割し
た。分岐の直ぐ上の大動脈に導入用カテーテルを配置
し、下方大静脈に導出カテーテルを配置した。ヘパリン
(5,000単位)を静脈内投与し、腎臓動脈の直ぐ上
の大動脈のクロスクランピングと合致する末端大動脈を
介して4℃のユーロ−コリンズ(Euro−Colli
ns)溶液での連続的フラッシュ(flush)を開始
した。腎臓をその場で冷却した後一括して取出した。次
いで腎臓を分離し、一方を対照他方をテスト腎臓として
使用した。これは対による実験法を容易にするためであ
る。各腎臓を4℃のユーロ−コリンズ液で再度フラッシ
ュした。プロトコールにより必要とされる場合にはテス
ト物質をこの時点で第2腎臓の保存液に加えた。これら
腎臓は双方共無菌状態で包装し4℃で一晩保存した。2
4時間の低温虚血の後、新たなレシピエント動物に麻酔
をかけ、保存腎臓を腸骨管に移植した。各吻合に要した
時間は25〜30分であった。対照(未処理)腎臓を必
ず最初に移植し、テスト腎臓を次に移植した。従ってテ
スト腎臓の再灌流は常に対照腎臓の再灌流より合計1時
間遅れた。これは対照腎臓が低温虚血状態に23時間お
かれたのに対し、テスト腎臓は24時間おかれたことを
意味する。SODアナログの動脈内投与を対照腎臓の再
灌流の1時間後に当たるテスト腎臓の再灌流時に開始し
た。従って対照腎臓はテスト腎臓に与えられる全ての物
質効果に曝される1時間前に再加熱及び再灌流の有害効
果に曝されたことになる。第2腎臓の再灌流に次いでレ
シピエントたるブタ自体の腎臓を除去した。臨床操作を
模倣して更に10gのマンニトールを先ず対照腎臓の再
灌流前に投与し、次いでテスト腎臓の再灌流前に再び投
与した。これによって従来の最適保存/移植技術に加え
られる遊離基改変物質の効果を測定し得た。各腎臓から
の尿管は皮膚尿管瘻造設術として別個に取出した。移植
後2日間レシピエントを軽く麻酔して各腎臓(尿管造瘻
術)から別個に尿を1時間収集し、量とクレアチニン濃
度とを測定した。血清クレアチニンも測定した。これは
各腎臓毎にクレアアチニンクリアランスを計算するため
である。全ての結果は平均値±SEMで表わされる。ス
チューデントt−テスト(両側検定)の間にデータを分
析した。実験が対で行なわれるため、殆んどの場合に対
テストを適用し得た。 1 この実施例で使用した略号: CCR クレスチニンクリアランス ATP アデノシン三リン酸 ADP アデノシンニリン酸 AMP アデノシン一リン酸 実験プロトコール超酸化物ジスムターゼ(SOD)及びカタラーゼ 4匹のブタのテスト腎臓にシグマウシ血液超酸化物ジス
ムターゼ、酸素遊離基スカベンジャーを投与した。再灌
流の直前に腎臓動脈に5mgの濃縮塊を投与し、再灌流
開始後15分間1mg/分で一定の動脈内注入を続け
た。その結果合計20mgのSODが与えられたことに
なる。4匹のブタからなる第2グループではSODに加
えてカタラーゼ(シグマ社)を同一投与量でテスト腎臓
に与えた。これら各ブタの他方の腎臓は処理せずに対照
として使用した。SODに対する用量応答 最大の保護を得るための最小限の用量を決定すべく用量
応答関係(doseresponse relatio
nship)を調べた。血管再分布(revascul
arization)時に一方の腎臓には2種類の用量
のうち少ない方のSODを注入し他方には多い方のSO
Dを注入した。実施例9に従い製造したヒト組換型SO
Dを前述の如く投与した。各用量範囲内で2つの比較を
行なった。最初の比較では0.2mgのSODを対照た
る食塩水と比較した。段階的に0.2mgを2mgと比
較し、2mgを20mgと比較し、20mgを100m
gと比較した。いずれの場合も少ない方の用量を受容す
る腎臓を最初に移植した。これは第2移植時にSODの
循環が滞留し得るという問題を回避するためである。 結 果ウシSOD及びカタラーゼの効果 我々が使用した大きさのブタの単一正常腎臓のクレアチ
ニンクリアランスは、前述の麻酔及び水分補給(hyd
ration)条件下では25.5+6.3ml/分で
あった(n=8)。20mgのSODを再灌流の最初の
15分間に亘って腎臓動脈内に投与すると低温虚血後の
腎機能減損が実質的に改善された。SODのみで処理し
た4つの腎臓は平均クレアチニンクリアランスが23.
2±4.5ml/分であった。これは対照腎臓(8.4
±1.7ml/分,p<0.05)のほぼ3倍に当た
る。SOD及びカタラーゼを組合わせて使用した場合に
も同程度の保護が得られ、それ以上の効果は見られなか
った(CCR=19.0±4.5ml/分)。先に行な
った予備実験では4匹のブタからなる別のグループを4
0分を越える吻合時間をかけて移植処理した。SOD及
びカタラーゼにより腎機能は著しく向上したが、これら
の動物では処理腎臓も対照腎臓も極めて低い機能を示し
た(CCR=4.8±0.8対1.6±0.4ml/
分)。それ自体再灌流に先立つ虚血に起因してより重大
な傷害を受けたと思われるこれらの腎臓では、遊離基の
危害を改変しても正常腎機能を回復することはできなか
った。ヒトSODアナログ用量応答関係 ヒトSODアナログ(0.2mg及び2mg)を注入し
ても対照と比較して腎機能には何らの改善も見られなか
った。しかしながら20mgのSODアナログを投与し
た腎臓の平均クレアチニンクリアランスは14.2±
1.1ml/分であり、2mg注入した腎臓(7.7±
1.0ml/分,p<0.05)を遥かに上回ってい
た。100mgのSODアナログを投与してもそれ以上
の効果は得られなかった(CCR=16.1±1.2m
l/分)。従ってSODアナログの最小有効量はこのよ
うな方法で投与する場合には2mgより多く20mgよ
り少ない量であることが判明した。ヒトSODアナログ
はウシSODと同程度の効力を示した。 論 考 使用処理法に起因する差異を最大限にし且つ特定ドナー
又はレシピエント動物に係る種々の変数に関する制御を
行なうべく対で実験する方式を用いた。この対方式では
結果の統計分析を対で行なうこともでき、従って少数の
比較的高価な実験動物の最適利用を可能にするものであ
った。これらの研究における重要な発見は遊離基媒介再
灌流傷害の除去によって得られる利益の大きさであっ
た。対照腎臓は健康なドナー腎臓及びレシピエント動
物、水分補給、αアドレナリン作用阻害、抗凝血並びに
利尿を含む従来の最適臓器保存法の利益を受けたにも拘
らず重大な機能障害を示し、クレアチニンクリアランス
のレベルが正常レベルの1/3以下に低下した。この2
4時間の虚血状態保持は、同様の臨床的状況下でしばし
ば見られるように従来の職器保存能力を越えるものであ
る。有効量のウシSOD又はヒトSODアナログで処理
するとこの障害が驚く程効果的に回避され、腎機能がほ
ぼ正常レベルに維持される。実際、このように処理した
腎臓で、移植後48時間目に測定した時に、対をなすも
う一方の未処理対照腎臓の少なくとも2倍のクレアチニ
ンクリアランスを示さなかったものは1つもない。この
利益の大きさは従って45〜60分の温暖虚血後に見ら
れるものより量的に大きかった。これは、従来の最適保
存技術を用いると虚血自体に起因する障害は最小化さ
れ、再灌流時に発生する障害が優勢になることを示唆す
る。この解釈は更に、再灌流に先立ち18時間保存して
おいた腎臓についての研究によっても裏付けられる。こ
れらの腎臓では対照グループ及び処理グループの双方共
優れた機能を示した。これは、再灌流時の遊離基発生に
適した条件を設定するだけの十分な代謝産物の蓄積に必
要な時間が未だ十分に経過していなかったことを意味す
る。一方、腎臓を吻合時間のより長い(即ち温暖虚血)
前記予備実験の場合のようにより重大な虚血状態におく
と、SODを投与しても明らかな改善は見られたものの
機能を正常レベルまで回復させることはできなかった。
従ってこれらの腎臓はより短時間の温暖虚血(7,8,
9)後に調べたものにより類似していると言えよう。他
の器官と同様に、遊離基傷害除去の利益は主として、再
灌流に起因する傷害と比較した虚血自体に起因する傷害
の相対比に関連する。更にこの利益増加の達成は悉無律
的であると考えられる。SODに関する用量応答検査
は、最大限の保護が得られるか又は保護が全く得られな
いかのいずれかを示した。カタラーゼはSODのみに加
えてもそれ以上の利益はもたらさなかった。この研究を
定量的に分析した限りでは、再灌流傷害防止は悉無律的
現象であったと思われる。しかしながら、この研究にお
ける諸発見事項は臨床的用途に特に適していると考えら
れる。ここで選択した24時間の低温虚血は臨床状況で
必要とされる死体移植組織保存期間に十分該当する。更
にこれらの研究では、従来の最適保存及び移植法に対し
て遊離基による再灌流時傷害の除去の効果が立証され
た。これにはそれ自体効果的なヒドロキシル基スカベン
ジャーであるマンニトールの使用が含まれる。従ってこ
れらの研究は、遊離基除去を現在使用されている臨床的
方法に加えて用いれば同程度の効果が得られることを示
唆する。SODは無毒化合物であるため、この方法は有
望と思われる。 参考文献 1.パークス,ディー・エー(Parks D.
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983年)。実施例32 摘出ウサギ角膜の生存と遊離基スカベンジャー 実施例3の大腸菌A1645中pSODβ1T11宿主
ベクター系により産生し、実施例26の条件下で成長さ
せ且つ精製したヒト超酸化物ジスムターゼは切除した摘
出(単離)角膜の生存期間を長くすることが判明した。
この実施例で括弧内に記されたアラビア数字は該実施例
の説明の後に列挙された参考文献を示す。in vit
roのウサギ角膜内皮ポンプに対する低濃度アデノシン
の有益な効果は種々の研究で既に立証されている
(1)。前記流体ポンプの作動は単離角膜に平衡食塩水
中生理濃度グルコース(5mM)及びアデノシン(10
−6M)を灌流させることによって実現された。生存時
間は約7時間であった。我々の次の目標は生存時間の延
長であった。超酸化物ジスムターゼ(SOD)(2)は
反応O2・−+O2・−+2H+→H2O2+O2を促
進することにより超酸化物遊離基を除去する。SOD投
与は部分的酸素欠乏後の虚血組織の生存を著しく高める
ことが知られている(3)。虚血に起因するかなりの程
度の組織破壊は単離組織の再灌流及び再酸素付加の間に
生じる。この危害の大部分は超酸化物ラジカルとその一
族とによって媒介される。本研究の目的は超酸化物ジス
ムターゼ(SOD)又はカタラーゼが単離角膜の生存期
間を延長させ得るか否かを調べることにある。体重2.
0〜3.0kgのシロウサギから角膜を単離した。その
技術としては既に詳述されているものを使用した
(1)。要約すれば、眼を切除して角膜上皮を剥離し、
次いで角膜を記載の如く単離し、灌流処理した。 結 果 5mMグルコース及び1μアデノシンを含む基礎食塩水
にSODアナログを2μ/mlで加えると単離角膜の生
存時間が7時間から14時間まで延びた。アデノシンを
除外すると生存時間は12時間までしか延長されなかっ
た。結論としては、SODアナログは単離角膜の生存時
間の延長に有効であることが判明した。SODアナログ
は他の単離(摘出)臓器の生存時間延長でも重要な役割
を果たし得る。ウシSODを用いて得た同様のデータが
エクスペリメンタルアイリサーチ(Experimen
tal Eye Research)4:153−15
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eal endothelial pump)。エルサ
レムヘブライ大学理事会(the Senate of
the Hebrew University of
Jerusalem)に提出された博士論文。実施例33 p9200の構築とp9200を用いる大腸菌A164
5及びA4255内でのbGHの産生 p9200の構築は第26図に示されており図面の説明
の項で説明されている。pHG 44をCla I及び
PstIで分割し、DNAポリメラーゼIのクレノー
(Klenow)断片を用いて「フィル イン(fil
l in)」し、次いで大きなDNA断片を単離した。
Eco RI及びAva IでpBR322を開裂し次
いでDNAポリメラーゼIのクレノー断片を用いて「フ
ィルイン」することにより単離したpBR 322のテ
トラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA断片に前記断片
を結びつけた。その結果得られたプラスミドp9200
を受託番号(Accession Number)AT
CC53215としてATCCに寄託した。プラスミド
p9200はpHG 44(第6図)に類似している
が、このプラスミドはアンピシリン耐性ではなくテトラ
サイクリン耐性を付与する。プラスミドp9200を普
通の知識をもつ当業者に公知の方法を用いる形質転換に
より大腸菌株A1645及びA4255内に導入した。
これらの株は成長及び誘導時に、真正bGHのフェニル
アラニン形状のアミノ末端に加えられたアミノ酸配列m
et−asp−glnを有するウシ成長ホルモン(bG
H)のアナログを産生した。これらの株によって産生さ
れたbGHアナログの量はpHG 44により産生され
たものとほぼ同等であった。菌株A1645/p920
0(p9200で形質転換した宿主株A1645)の成
長(増殖)、bGHアナログの回収及びbGHアナログ
の精製に使用した方法は100mg/lのアンピシリン
に代えて12.5mg/lのテトラサイクリンを加えた
以外はpHG 44に関する実施例13と同一である。
A4320と称されてきた株A4255/P9200の
成長及び誘導に使用した方法は実施例36に記載の方法
である。bGHアナログの精製に使用した方法は実施例
13のpHG 44の場合と同じである。菌株A432
0(プラスミドp9200で形質転換した宿主株A42
55)を受託番号ATCC53215としてATCCに
寄託した。アンピシリン遺伝子をテトラサイクリン遺伝
子で代換すると、アンピシリンを産生プロセスから除外
し得、そのため重大なアレルギー反応の原因となり得る
最終産生物のアンピシリン汚染の可能性が回避されると
いう利点が得られる。実施例34 met−leu−leu−leu−met ヒトApo
Eアナログの産生 プラスミドpTVRは新規なアポリポタンパク質E3ア
ナログの発現を支配する。このアナログのN−末端配列
はmet−leu−leu−leu−met であり、
この直後に成熟アポリポタンパク質E3の配列が存在す
る。pTVR279−8の組立(構築) pTVR279−8の組立は第25図及び図面説明に示
されている。プラスミドpTVR279−8は受託番号
53216号でATCCに寄託済である。プラスミドp
TV 190(第21図)をAva Iで部分消化し、
DNAポリメラーゼIのKlenow断片で「埋め戻し
(till in)」,連結してE.coliを形質転
換させた。得られたプラスミドは3′Ava I部位が
除去されておりこれをpTV 264−45と命名し
た。pTV 264−45をNde Iで完全に消化し
以下の合成オリゴヌクレオチドに結合(連結)した。
【化17】
得られたプラスミドをpTVR279−8と命名し、当
業者に公知の方法でE.coli.A1645を形質転
換した。このプラスミドを含む細胞を、32P−標識オ
リゴヌクレオチドNo.1218をプローブとしてコロ
ニーハイブリダイゼーションによって同定した。DNA
配列決定によって間違いなくこのプラスミドであること
が確認された。pApoEE2を含むA1645株は受
託番号39787号でATCCに寄託済である。pTV
R279−8は増殖及び誘発によって天然アポリポタン
パク質E3のN−末端に付加アミノ酸配列met−le
u−leu−leu−metをもつヒトアポリポタンパ
ク質E3のアナログを産生する。菌株の増殖に使用され
る方法は、実施例17に記載のpTV−170の増殖方
法に等しいが、但し42℃での誘発期間が15分でなく
1〜5時間である。pTVR279−8が産生するAp
o E3アナログはpTV 170及びpTV 190
によって産生されたmet−Apo E3アナログより
も細菌に対する毒性が小さい。met−leu−leu
−leu−met−Apo E3アナログは42℃での
誘発後60分を経過したときも細胞内に蓄積し続けて、
培養物1l当り400〜600mgのレベルに到達す
る。実施例35 ヒト成長ホルモンアナログの産生pTV 300の組立 pTV 300の組立については第27図及び図面説明
に示した。プラスミドpTV 18(1)に由来のhG
H遺伝子をp579(第19図)のNde I部位に挿
入してプラスミドpTV 300を構築した。pTV
18(1)の組立は、1985年1月23日付の欧州特
許公開第0131843A1号及び対応する1983年
7月15日付の米国特許出願第514188号に開示さ
れている。引用した特許出願は本明細書に含まれるもの
とする。hGHアナログの合成 当業者に公知の方法を用いpTV 300をE.col
iA1645菌株に形質転換によって導入した。この菌
株は増殖及び誘発によって天然成長ホルモンの最初の1
3個のアミノ酸が欠失したヒト成長ホルモンアナログを
産生した。菌株の増殖とhGHアナログの精製とのため
に実施例13と等しい方法を使用した。実施例36 原栄養菌株の組立及び原栄養宿主を用いたbGHの産生 最小培地で増殖させた場合であっても多くの前記プラス
ミドによって高レベルにタンパク質を発現し得るE.c
oliの原栄養株を構築した。最小培地を使用する細菌
増殖プロトコールの利点は、(a)細菌を高い細胞密度
に増殖できること、(b)培地成分が「より簡単であ
り」従って高品質なので増殖条件を再現し易いこと、及
び、(c)培地がより安価なことである。本発明の好ま
しい原栄養株はA4200,A4255及びA4346
と命名されている。プラスミドp9200を含む菌株A
4255は受託番号53215号でATCCに寄託済で
ある。これをA4320と指称する。原栄養株の選択及び組立 最小培地での増殖率とファージλ,λ434及びファー
ジP1に対する感受性とに基いて以下の菌株をスクリー
ニングした。 テストの結果より、上記ファージに感受性で増殖率が最
も高い菌株ATCC12435とATCC25404と
に基いた原栄養株を主として開発することに決定した。
これらの2種の菌株を使用し、λcI857ΔHIΔB
am HI:Tn10を含むP1を形質導入してλcI
857リプレッサーを含有する新しい菌株を構築した。
テトラサイクリン耐性コロニーを精製し、必要な場合は
P1を除去した。得られた菌株とその遺伝子型とを以下
に示す。 A4200=ATCC12439(λcI852ΔHI
ΔBam HI):Tn10 A4206=ATCC25404(λcI857ΔHI
ΔBam HI):Tn10 双方の菌株をpHG 44で形質転換して菌株A420
2及びA4207を夫々得た。増殖及び誘発 以下の条件で菌株A4202とA4207とを増殖及び
誘発させ、ウシ成長ホルモンアナログの産生をアッセイ
した。 A4202とA4207との双方共が最小培地で十分に
増殖する。しかし乍らA4202だけが有意レベルのb
GHアナログを発現する。A4202は、実施例13に
記載の濃厚培地(rich medium)で増殖した
pHG 44とほぼ同じレベルでbGH アナログを発
現する。A4200からのテトラサイクリン耐性の除去 テトラサイクリン耐性マーカーのみを含むプラスミドで
原栄養株A4200を利用するために、Tn10マーカ
ーを除去した菌株を構築した。A4200株をマッコン
キー(MacConky)ガラクトースプレートに画線
し、gal+復帰細胞を選択しテトラサイクリン感受性
とλファージに対する免疫性とをテストした。この菌株
をA4255と命名した。ビオチン独立性(非依存性)原栄養株の組立 前記原栄養株は全てλcI857ΔHIΔBam HI
欠損プロファージを含む。ΔHI欠失はbio uvr
B領域に及び、ビチオン生合成オペロンが除去されて
いる。従って、菌株の増殖培地にビオチンを加える必要
がある。A4200及びA4255由来の菌株のビオチ
ン要求を除去するために、これら菌株にA89株のF′
エピソームを導入した。A89株はF′gal プラス
ミドを含んでいる。このF′プラスミドがビオチンの内
因合成に必要な全ての遺伝子を含むことが判明した。こ
のプラスミドはbio オペロンの好適ソースとなり得
る特性をいくつか備えている。 1.F′gal はユニットコピー(unit cop
y)プラスミドである; 2.このプラスミドはE. coli中で極めて安定で
ある; 3.F′プラスミドは、出願人等の発現ベクターのベー
スとなるcol E1プラスミドと適合性である; 4.F′galは接合性プラスミドである。従って細胞
間を容易に移動し得る; 5.ビオチン独立性菌株のスクリーニングが容易であ
る。 A4202株をA89と30分間接合し、ビオチン独立
性コロニーを選択した。得られたA4346株を、ビオ
チンを含まない最小グルコース培地で誘発させると高レ
ベルのウシ成長ホルモンアナログが産生した。他の増殖
因子は不要である。当業者に公知の標準方法でA434
6からpHG 44を除去し得る。得られた原栄養宿主
菌株は、本出願に記載の全てのプラスミドによって形質
転換され得る。最小培地 原栄養株による産生のために以下の最小培地を標準的に
使用した。 菌株がアンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性のい
ずれであるかに従ってアンピシリン(100mg/l)
又はテトラサイクリン(12.5mg/l)を培地に添
加し得る。別に50%グルコースをオートクレーブ処理
し20gm/lまで加えた。発酵中に50%グルコース
を、F′エピソームを含まない菌株に対してはO.D.
単位当りグルコース1.08gmの割合で加え、A43
46株に対してはO.D.単位当りグルコース1.8g
mの割合で加えた。25%NH4を送ってpHを調節し
た。必要に応じて消泡剤を加えた。A4200,A42
55及びA4206をベースとする菌株にビオチンを1
5mg/lの割合で添加した。溶液は以下の微量元素を
含有するバイオテクノロジカル・バイオエンジニアリン
グ(Biotechnol.Bioeng.)16:9
33−941(1974): かっこ内の化合物は、かっこの前の化合物の代りに使用
し得る代替化合物である。かっこ内の数値はこの代替化
合物の量である。前出のプラスミドの多くを、原栄養株
A4200とA4255とに導入した。これら菌株の一
部のリストを次表に示す。 実施例37 溶菌宿主の組立及びこれら溶菌宿主を使用するbGH
の産生 1.菌株A4048及びA3111の組立 λファージの増殖には多くの場合W3350株が使用さ
れている(例えばオッペンハイム(Oppenhei
m)及びサロモン(Salomon)(1970),4
1ヴィロロジイ(Virology),151−159
参照)。W3350の原栄養誘導体たるA2509株に
A1637で増殖したPlcItsを形質導入し、ま
た、Tn10マーカーを含むλcI857ΔHIΔBa
m HI欠損プロファージを形質導入した。得られたA
4048菌株を、欠損プロファージλcI857ΔHI
ΔBam HIを含むテトラサイクリン耐性クローンと
して選択した。この菌株はまたPlcItsプラスミド
を含んでいた。この菌株をpHG 44で形質転換して
A3111株を作成した。同様にして、同じくA250
9株を用いこの菌株にλcI857ΔHIΔBam H
を挿入しpHG 44で形質転換する前にTn10トラ
ンスポゾンを除去し且つPlcItsプラスミドを除去
してA4085株を構築した。A4085株は欠損プロ
ファージλcI857ΔHIΔBam Hを含んでお
り、PIプラスミドを存在させずに行なわれるbGH産
生と自己溶菌とを測定するためのコントロールとして作
用する。A3111株は受託番号53217号でATC
Cに寄託されている。 2.ウシ成長ホルモン(bGH)の合成 保存培養物 50μg/mlのアンピシリン(Amp)
を含むLB培地でA3111株(A4048細胞中のp
HG 44)の保存培養物を30℃で一晩増殖した。培
養物を50%グリセロールで2倍に希釈し−20℃で保
存した。接種物 接種物は100μg/mlのAmp を含むL
B寒天プレートで増殖したA3111の単一コロニーか
ら得られた。次に、保存培養物から採取した材料をLB
プレートに塗抹した。50μg/mlのAmPを含む3
mlの無菌LB培地にA3111の単一コロニーを接種
し30℃の振盪浴で18時間増殖させた。産生 50μg/mlのAmp を含むBHI 培地
(脳心インフュージョン培地(Difco),37μg
/l)でbGH を産生した。新鮮BHI+50μg/
mlのAmp を収容したフラスコで接種物を100倍
に希釈し、細胞濃度が約4×108細胞/ml(OD
600=0.5)になるまで30℃の振盪浴で増殖させ
た。bGH 産生を誘発するために、フラスコを42℃
に調温した振盪浴に移した。誘発開始後0分と90分と
の時点で細胞サンプルを採取した。bGH産生の分析 10〜26%の濃度勾配のアクリル
アミドゲルでbGH産生を分析した。細胞サンプルをマ
イクロ遠心機で回転させ上清を除去してペレットをサン
プルバッファ(2%SDS,50mMトリスpH7.
0,3%ショ糖、5%β−メルカプトエタノール)に溶
解し、ゲルにロードした。200ボルトで2−1/2時
間電気泳動にかけ、ゲルをクーマシーブルー(Coom
asseiblue)で染色し、ゲルスキャナーで走査
してbGH の量を測定した。420℃での誘発の90
分後にbGH はA3111の総タンパクの約20%を
含む。 3.自己溶菌 A3111株は、pHG 44と欠損プロファージλc
I857ΔHIΔBam HIと安定なPlcItsプ
ラスミドとを含む。42℃で長時間誘発すると、P1に
よって支配されるエンドリシンの産生によって細胞の溶
解が始まる。2.5〜3時間後に培養物が完全に溶解す
る。調節自己溶解テスト 42℃で(90分間)の誘発の以
前及び以後に5mlのA3111培養物を採取し、ソー
バル(Sorvall)遠心機に入れ7000rpmで
7分間回転させた。上清を除去しペレットを−20℃で
一晩冷凍した。次にペレットを0.5mlのT.E.バ
ッファ(10mMのトリス、pH8.0,1mMのED
TA)に再懸濁させ、0.1mlをT.E.で10倍に
希釈し、OD600を測定した。この実験のコントロー
ルとして、A3111と同様にpHG 44と欠損プロ
ファージλcI857ΔHIΔBam HIを含むがP
lcItsプラスミドを含まないA4085株を使用し
た。この実験の結果を表Vに示す。この表の結果より、
PlcItsプラスミドを含む細胞(A3111)が解
凍直後に溶解することが判明した。解凍混合物の検査に
より、この処理後に細胞の95%以上が溶解することも
判明した。
業者に公知の方法でE.coli.A1645を形質転
換した。このプラスミドを含む細胞を、32P−標識オ
リゴヌクレオチドNo.1218をプローブとしてコロ
ニーハイブリダイゼーションによって同定した。DNA
配列決定によって間違いなくこのプラスミドであること
が確認された。pApoEE2を含むA1645株は受
託番号39787号でATCCに寄託済である。pTV
R279−8は増殖及び誘発によって天然アポリポタン
パク質E3のN−末端に付加アミノ酸配列met−le
u−leu−leu−metをもつヒトアポリポタンパ
ク質E3のアナログを産生する。菌株の増殖に使用され
る方法は、実施例17に記載のpTV−170の増殖方
法に等しいが、但し42℃での誘発期間が15分でなく
1〜5時間である。pTVR279−8が産生するAp
o E3アナログはpTV 170及びpTV 190
によって産生されたmet−Apo E3アナログより
も細菌に対する毒性が小さい。met−leu−leu
−leu−met−Apo E3アナログは42℃での
誘発後60分を経過したときも細胞内に蓄積し続けて、
培養物1l当り400〜600mgのレベルに到達す
る。実施例35 ヒト成長ホルモンアナログの産生pTV 300の組立 pTV 300の組立については第27図及び図面説明
に示した。プラスミドpTV 18(1)に由来のhG
H遺伝子をp579(第19図)のNde I部位に挿
入してプラスミドpTV 300を構築した。pTV
18(1)の組立は、1985年1月23日付の欧州特
許公開第0131843A1号及び対応する1983年
7月15日付の米国特許出願第514188号に開示さ
れている。引用した特許出願は本明細書に含まれるもの
とする。hGHアナログの合成 当業者に公知の方法を用いpTV 300をE.col
iA1645菌株に形質転換によって導入した。この菌
株は増殖及び誘発によって天然成長ホルモンの最初の1
3個のアミノ酸が欠失したヒト成長ホルモンアナログを
産生した。菌株の増殖とhGHアナログの精製とのため
に実施例13と等しい方法を使用した。実施例36 原栄養菌株の組立及び原栄養宿主を用いたbGHの産生 最小培地で増殖させた場合であっても多くの前記プラス
ミドによって高レベルにタンパク質を発現し得るE.c
oliの原栄養株を構築した。最小培地を使用する細菌
増殖プロトコールの利点は、(a)細菌を高い細胞密度
に増殖できること、(b)培地成分が「より簡単であ
り」従って高品質なので増殖条件を再現し易いこと、及
び、(c)培地がより安価なことである。本発明の好ま
しい原栄養株はA4200,A4255及びA4346
と命名されている。プラスミドp9200を含む菌株A
4255は受託番号53215号でATCCに寄託済で
ある。これをA4320と指称する。原栄養株の選択及び組立 最小培地での増殖率とファージλ,λ434及びファー
ジP1に対する感受性とに基いて以下の菌株をスクリー
ニングした。 テストの結果より、上記ファージに感受性で増殖率が最
も高い菌株ATCC12435とATCC25404と
に基いた原栄養株を主として開発することに決定した。
これらの2種の菌株を使用し、λcI857ΔHIΔB
am HI:Tn10を含むP1を形質導入してλcI
857リプレッサーを含有する新しい菌株を構築した。
テトラサイクリン耐性コロニーを精製し、必要な場合は
P1を除去した。得られた菌株とその遺伝子型とを以下
に示す。 A4200=ATCC12439(λcI852ΔHI
ΔBam HI):Tn10 A4206=ATCC25404(λcI857ΔHI
ΔBam HI):Tn10 双方の菌株をpHG 44で形質転換して菌株A420
2及びA4207を夫々得た。増殖及び誘発 以下の条件で菌株A4202とA4207とを増殖及び
誘発させ、ウシ成長ホルモンアナログの産生をアッセイ
した。 A4202とA4207との双方共が最小培地で十分に
増殖する。しかし乍らA4202だけが有意レベルのb
GHアナログを発現する。A4202は、実施例13に
記載の濃厚培地(rich medium)で増殖した
pHG 44とほぼ同じレベルでbGH アナログを発
現する。A4200からのテトラサイクリン耐性の除去 テトラサイクリン耐性マーカーのみを含むプラスミドで
原栄養株A4200を利用するために、Tn10マーカ
ーを除去した菌株を構築した。A4200株をマッコン
キー(MacConky)ガラクトースプレートに画線
し、gal+復帰細胞を選択しテトラサイクリン感受性
とλファージに対する免疫性とをテストした。この菌株
をA4255と命名した。ビオチン独立性(非依存性)原栄養株の組立 前記原栄養株は全てλcI857ΔHIΔBam HI
欠損プロファージを含む。ΔHI欠失はbio uvr
B領域に及び、ビチオン生合成オペロンが除去されて
いる。従って、菌株の増殖培地にビオチンを加える必要
がある。A4200及びA4255由来の菌株のビオチ
ン要求を除去するために、これら菌株にA89株のF′
エピソームを導入した。A89株はF′gal プラス
ミドを含んでいる。このF′プラスミドがビオチンの内
因合成に必要な全ての遺伝子を含むことが判明した。こ
のプラスミドはbio オペロンの好適ソースとなり得
る特性をいくつか備えている。 1.F′gal はユニットコピー(unit cop
y)プラスミドである; 2.このプラスミドはE. coli中で極めて安定で
ある; 3.F′プラスミドは、出願人等の発現ベクターのベー
スとなるcol E1プラスミドと適合性である; 4.F′galは接合性プラスミドである。従って細胞
間を容易に移動し得る; 5.ビオチン独立性菌株のスクリーニングが容易であ
る。 A4202株をA89と30分間接合し、ビオチン独立
性コロニーを選択した。得られたA4346株を、ビオ
チンを含まない最小グルコース培地で誘発させると高レ
ベルのウシ成長ホルモンアナログが産生した。他の増殖
因子は不要である。当業者に公知の標準方法でA434
6からpHG 44を除去し得る。得られた原栄養宿主
菌株は、本出願に記載の全てのプラスミドによって形質
転換され得る。最小培地 原栄養株による産生のために以下の最小培地を標準的に
使用した。 菌株がアンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性のい
ずれであるかに従ってアンピシリン(100mg/l)
又はテトラサイクリン(12.5mg/l)を培地に添
加し得る。別に50%グルコースをオートクレーブ処理
し20gm/lまで加えた。発酵中に50%グルコース
を、F′エピソームを含まない菌株に対してはO.D.
単位当りグルコース1.08gmの割合で加え、A43
46株に対してはO.D.単位当りグルコース1.8g
mの割合で加えた。25%NH4を送ってpHを調節し
た。必要に応じて消泡剤を加えた。A4200,A42
55及びA4206をベースとする菌株にビオチンを1
5mg/lの割合で添加した。溶液は以下の微量元素を
含有するバイオテクノロジカル・バイオエンジニアリン
グ(Biotechnol.Bioeng.)16:9
33−941(1974): かっこ内の化合物は、かっこの前の化合物の代りに使用
し得る代替化合物である。かっこ内の数値はこの代替化
合物の量である。前出のプラスミドの多くを、原栄養株
A4200とA4255とに導入した。これら菌株の一
部のリストを次表に示す。 実施例37 溶菌宿主の組立及びこれら溶菌宿主を使用するbGH
の産生 1.菌株A4048及びA3111の組立 λファージの増殖には多くの場合W3350株が使用さ
れている(例えばオッペンハイム(Oppenhei
m)及びサロモン(Salomon)(1970),4
1ヴィロロジイ(Virology),151−159
参照)。W3350の原栄養誘導体たるA2509株に
A1637で増殖したPlcItsを形質導入し、ま
た、Tn10マーカーを含むλcI857ΔHIΔBa
m HI欠損プロファージを形質導入した。得られたA
4048菌株を、欠損プロファージλcI857ΔHI
ΔBam HIを含むテトラサイクリン耐性クローンと
して選択した。この菌株はまたPlcItsプラスミド
を含んでいた。この菌株をpHG 44で形質転換して
A3111株を作成した。同様にして、同じくA250
9株を用いこの菌株にλcI857ΔHIΔBam H
を挿入しpHG 44で形質転換する前にTn10トラ
ンスポゾンを除去し且つPlcItsプラスミドを除去
してA4085株を構築した。A4085株は欠損プロ
ファージλcI857ΔHIΔBam Hを含んでお
り、PIプラスミドを存在させずに行なわれるbGH産
生と自己溶菌とを測定するためのコントロールとして作
用する。A3111株は受託番号53217号でATC
Cに寄託されている。 2.ウシ成長ホルモン(bGH)の合成 保存培養物 50μg/mlのアンピシリン(Amp)
を含むLB培地でA3111株(A4048細胞中のp
HG 44)の保存培養物を30℃で一晩増殖した。培
養物を50%グリセロールで2倍に希釈し−20℃で保
存した。接種物 接種物は100μg/mlのAmp を含むL
B寒天プレートで増殖したA3111の単一コロニーか
ら得られた。次に、保存培養物から採取した材料をLB
プレートに塗抹した。50μg/mlのAmPを含む3
mlの無菌LB培地にA3111の単一コロニーを接種
し30℃の振盪浴で18時間増殖させた。産生 50μg/mlのAmp を含むBHI 培地
(脳心インフュージョン培地(Difco),37μg
/l)でbGH を産生した。新鮮BHI+50μg/
mlのAmp を収容したフラスコで接種物を100倍
に希釈し、細胞濃度が約4×108細胞/ml(OD
600=0.5)になるまで30℃の振盪浴で増殖させ
た。bGH 産生を誘発するために、フラスコを42℃
に調温した振盪浴に移した。誘発開始後0分と90分と
の時点で細胞サンプルを採取した。bGH産生の分析 10〜26%の濃度勾配のアクリル
アミドゲルでbGH産生を分析した。細胞サンプルをマ
イクロ遠心機で回転させ上清を除去してペレットをサン
プルバッファ(2%SDS,50mMトリスpH7.
0,3%ショ糖、5%β−メルカプトエタノール)に溶
解し、ゲルにロードした。200ボルトで2−1/2時
間電気泳動にかけ、ゲルをクーマシーブルー(Coom
asseiblue)で染色し、ゲルスキャナーで走査
してbGH の量を測定した。420℃での誘発の90
分後にbGH はA3111の総タンパクの約20%を
含む。 3.自己溶菌 A3111株は、pHG 44と欠損プロファージλc
I857ΔHIΔBam HIと安定なPlcItsプ
ラスミドとを含む。42℃で長時間誘発すると、P1に
よって支配されるエンドリシンの産生によって細胞の溶
解が始まる。2.5〜3時間後に培養物が完全に溶解す
る。調節自己溶解テスト 42℃で(90分間)の誘発の以
前及び以後に5mlのA3111培養物を採取し、ソー
バル(Sorvall)遠心機に入れ7000rpmで
7分間回転させた。上清を除去しペレットを−20℃で
一晩冷凍した。次にペレットを0.5mlのT.E.バ
ッファ(10mMのトリス、pH8.0,1mMのED
TA)に再懸濁させ、0.1mlをT.E.で10倍に
希釈し、OD600を測定した。この実験のコントロー
ルとして、A3111と同様にpHG 44と欠損プロ
ファージλcI857ΔHIΔBam HIを含むがP
lcItsプラスミドを含まないA4085株を使用し
た。この実験の結果を表Vに示す。この表の結果より、
PlcItsプラスミドを含む細胞(A3111)が解
凍直後に溶解することが判明した。解凍混合物の検査に
より、この処理後に細胞の95%以上が溶解することも
判明した。
【表5】
この溶菌手順を用いると、bGH産生を妨害すること無
く誘発細胞からbGHを簡単に抽出できる。実施例38 Met−Apo E3アナログの生物学的活性 実施例17の方法で細菌pTV 194を増殖させた。
かっこ内の数字は実施例末尾に列記した参考文献の参照
番号を示す。細菌抽出物の分析 細菌細胞を遠心採取し、5mMのEDTAと2mMのフ
ェニルメチルスルホニルフルオリドとを含む50mMの
リン酸カリウムバッファ、pH7.5に懸濁させた。分
取サンプルを1.5倍量のバッファ(15%グリセロー
ル、4.5%NaDodSO4,1mMのβ−メルカプ
トエタノール、93.5mMのトリス、HCl,0.2
5%のブロモフェノールブルー、pH6.8)に溶解
し、100℃で10分間加熱し、10%NaDodSO
4ポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分析した(2
6)。ポリアクリルアミドゲルで分離したタンパク質を
クーマシー・ブリリアント・ブルーで染色するか、又
は、ニトロセルロールシートに電気泳動させ(27)
125I標識抗ヒトApoEモノクローナル又はポリク
ローナルIgG と反応させた。免疫ブロットを洗い、
風乾しX線フイルムに露光した。Apo Eの単離 従来技術のセフアクリル(Sephacryl)S−3
00カラムクロマトグラフィー(14)を用い、高トリ
グリセライド血症患者のd<1.02血漿リポタンパク
質(E3/3表現型)から真正Apo Eを単離した。
プレパラティブインモビリン等電点電気泳動法(pre
parative Immobiline isoel
ectric focusing)(エル・ケー・ビー
・インストルメンツLKB Intruments,ブ
ロンマ(Bromma),スエーデン,pH4.9〜
5.9)(28)を用いE3のアイソフォーム(iso
form)を得た。Apo Eアナログを33gの凍結
乾燥細胞から単離した。後者は51発酵で得られる細胞
量である。(4℃に)冷した乳鉢と乳棒とを用い22g
のアルミナ(ベーラー・リミテッド(Buehler
Ltd.),エバンストン市、イリノイ州)によって細
胞を微粉に粉砕した。0.1MのNH4HCO3と2m
MのPMSFと0.1%トラシロール(モベー・ケミカ
ル・コーポレーション(Mobay Chemical
Corp.),ニューヨーク市、ニューヨーク州)と
を含む(脱イオン直後の)6Mの尿素(pH7.8)3
00mlで粉砕細胞を抽出した。不溶細胞残渣をベック
マン(Beckman)SW28ロータ内で(25,0
00rpmで50分間)4℃で超遠心して沈降させ、2
00mlの6M尿素バッファで再抽出した。上清画分を
合せて透析した。透析には、25mMのNH4HCO3
と2mMのPMSFと2mMのEDTAと0.1%のト
ラシロールと0.1%のβ−メルカプトエタノールとを
含む2M尿素(pH7.4)を3回交換して用いた。透
析後、抽出上清に〜200mlのヘパリン−セファロー
スを加えた。後者は従来通りに(29)調製し、2M尿
素バッファで平衡させておく。ゲルと上清との混合物を
回転台に載せ4℃で一晩インキュベートし、次にガラス
カラム(4.0×3.5cm、コンテス・ガラス(Ko
ntes Glass)、ヴアインランド(Vine
land)、ニュー・ジャーシ(NJ))に充填した。
〜300mlの2M尿素バッファを25ml/時の速度
でカラムに流してヘパリン−セファロースに結合しなか
った物質をカラムから洗い流した。次に、2M尿素に入
れた50mlの1.0M NH4HCO3で結合した物
質をカラムから溶出し、5mMのNH4HCO3に透析
して凍結乾燥した。この半精製Apo Eを0.1Mの
トリスHClと1mMのEDTAと1.0%のβ−メル
カプトエタノールとを含む15mlの6Mグアニジン
(pH7.4)に可溶化し、セファクリルS−300
(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ(Pharma
cia Fine Chemicals,ウプサラ(U
ppsala),スエーデン(Sweden))カラム
(2.5×300cm)にかけ、4Mのグアニジンと
0.1Mのトリス.HClと1mMのEDTAと0.1
%のβ−メルカプトエタノールと(pH7.4)によっ
て平衡させた。Apo Eを含む画分をプールし、5m
MのNH4HCO3に完全に透析して凍結乾燥した。固
定ゲル上の分取形等電点電気泳動法(28)を用いて最
終精製を終了した。Apo Eアナログの構造的特性決定 アミノ酸解析用のタンパク質又はペプチドサンプルを密
封減圧管内で110℃の6N HCl中で20時間加水
分解した。標準的126データシステムを備えたベック
マン(Beckman)121MBアナライザーで分析
を実施した。セフアクリルS−300カラムで精製した
3mgのApo Eを600μlの70%HCOOHに
入れた90mgのCNBrにより室温で30時間消化し
てアミノ酸及びその配列を解析するためのペプチドを得
た。得られたペプチドを前述の真正ApoEと同様に
(4)セフアデックスG−50カラムで分離した。最新
型ベックマン890Cシーケンサ(Beckman89
0C Sequencer)を用い標準0.1Mカドロ
ール(Quadrol)プログラムで配列解析を実施し
た。3mgのポリブレンと0.5%のNaDodSO4
との存在中で完全形タンパク質を分解し、ポリブレンの
みを存在させてペプチドを分解した。従来の高性能液体
クロマトグラフィー(14)を用いてフェニルチオヒダ
ントインアミノ酸の同定及び定量を実施した。 分析用
等電点電気泳動法とNaDodSO4ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法(14)とを実施した。システアミン
(β−メルカプトエタノールアミン)による電荷修正を
行なった(14)。Apo Eアナログの生物学的特性決定 Apo Eアナログとジミリストイルホスファチジルコ
リン(DMPC)とのリン脂質複合体を従来通りに調製
し単離した(14)。従来の線維芽細胞(31)及び肝
膜(32)の場合に準じてリポタンパク質レセプター結
合アッセイを実施した。ヨード−ビーズ(Iode−B
eads)(ピアス(Pierce))を製造業者の指
示通りに用い0.10MのNH4HCO3中でApoE
をヨウ素化した。ウサギ及びラットのインビボテストの
ためにヨウ素化した真正ApoEとApoEアナログ
(各90μg)とを1mlのウサギ又はラットの血漿と
共に室温で30分間インキュベートし、ニュージーラン
ド白ウサギの雄に注射した。従来の沈殿(33)を使用
し血漿放射能によってTCA沈殿可能タンパク質を測定
する。血漿量を体重の4.5%と仮定し、種々の経過時
間での注射物質の血漿中残存パーセントを計算する。結果及びその考察 ヒトApo Eの発現 pTV 194でトランスフエクトした細胞の誘発によ
り、ApoEに等しい見掛け分子量をもつタンパク質が
特異的に誘発された。この誘発タンパク質は抗ヒトAp
oE抗体と反応した(図示せず)。誘発期間が30分以
上の場合細胞溶解が観察された(第28図)。この細胞
溶解はApoEの細胞内蓄積と関係がある。30℃に維
持された非誘発細胞は安定であった(第28図)。この
ような崩壊性(toxicity)細胞溶解はこの発現
ベクターの一般的特徴ではない。何故ならヒト成長ホル
モンcDNAを含むとき同じ発現系が同じ結果を生じな
いからである。細胞溶解後のタンパク分解によってAp
oEは破壊された。ApoE蓄積によって生じる毒性の
問題を解決するために、細胞の誘発を短時間にし(〜2
0分)次に発酵槽に氷を加えて細胞を冷却した。固相ラ
ジオイムノアッセイで定量すると短時間誘発細胞中のA
po Eレベルは可溶細胞タンパクの約1%であった。
Apo Eを単離し、ヘパリンセファロースとセファク
リルS−300クロマトグラフィーとによって細胞抽出
物から精製した。この2段階プロセスで90%より高純
度のApo E調製物が細胞抽出物中のApo E存在
量の約20%に相当する収率で得られた。特性決定する
ための最終精製には分取型インモビリン等電点電気泳動
を用いた。これらのテストで用いた精製手順は総回収率
を最も良くするように設計されたものでなく特性決定の
ための純粋物質が得られるように設計されたものであ
る。Apo Eアナログの構造的特性決定 インモビリン精製Apo EアナログはSDSゲル上で
真正Apo Eに等しい見掛けMrをもつ単一バンドと
して泳動した。生物工学的(bio−engineer
ed)Apo Eは等電点電気泳動にかけるとインモビ
リン精製ApoE3と等しいpIをもつ1つの主要バン
ドとして集束した。1つのシステイン残基の存在に対応
してApo Eアナログはシステアミン修飾後にアノー
ド側に1電荷ユニットだけシフトした。イモビリン精製
産物のアミノ酸解析を同じ方法で精製した真正ヒトAp
o E3に比較した。表VIに示す如くApo Eアナ
ログと真正Apo Eとの分析結果は互いにほぼ等しく
ヒトApo Eの従来の配列解析から得られた理論組成
にもほぼ等しい。しかし乍らこの分析結果は、Apo
Eアナログが真正Apo Eに比較して付加的なメチオ
ニン残基を含むことを示唆している。更に、システアミ
ン処理によって示唆された1つのシステイン残基の存在
も確認された。完全形Apo Eアナログ(約6ナノモ
ル)の配列解析の結果、付加メチオニン残基がタンパク
質のNH2末端に存在し、単鎖配列
く誘発細胞からbGHを簡単に抽出できる。実施例38 Met−Apo E3アナログの生物学的活性 実施例17の方法で細菌pTV 194を増殖させた。
かっこ内の数字は実施例末尾に列記した参考文献の参照
番号を示す。細菌抽出物の分析 細菌細胞を遠心採取し、5mMのEDTAと2mMのフ
ェニルメチルスルホニルフルオリドとを含む50mMの
リン酸カリウムバッファ、pH7.5に懸濁させた。分
取サンプルを1.5倍量のバッファ(15%グリセロー
ル、4.5%NaDodSO4,1mMのβ−メルカプ
トエタノール、93.5mMのトリス、HCl,0.2
5%のブロモフェノールブルー、pH6.8)に溶解
し、100℃で10分間加熱し、10%NaDodSO
4ポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分析した(2
6)。ポリアクリルアミドゲルで分離したタンパク質を
クーマシー・ブリリアント・ブルーで染色するか、又
は、ニトロセルロールシートに電気泳動させ(27)
125I標識抗ヒトApoEモノクローナル又はポリク
ローナルIgG と反応させた。免疫ブロットを洗い、
風乾しX線フイルムに露光した。Apo Eの単離 従来技術のセフアクリル(Sephacryl)S−3
00カラムクロマトグラフィー(14)を用い、高トリ
グリセライド血症患者のd<1.02血漿リポタンパク
質(E3/3表現型)から真正Apo Eを単離した。
プレパラティブインモビリン等電点電気泳動法(pre
parative Immobiline isoel
ectric focusing)(エル・ケー・ビー
・インストルメンツLKB Intruments,ブ
ロンマ(Bromma),スエーデン,pH4.9〜
5.9)(28)を用いE3のアイソフォーム(iso
form)を得た。Apo Eアナログを33gの凍結
乾燥細胞から単離した。後者は51発酵で得られる細胞
量である。(4℃に)冷した乳鉢と乳棒とを用い22g
のアルミナ(ベーラー・リミテッド(Buehler
Ltd.),エバンストン市、イリノイ州)によって細
胞を微粉に粉砕した。0.1MのNH4HCO3と2m
MのPMSFと0.1%トラシロール(モベー・ケミカ
ル・コーポレーション(Mobay Chemical
Corp.),ニューヨーク市、ニューヨーク州)と
を含む(脱イオン直後の)6Mの尿素(pH7.8)3
00mlで粉砕細胞を抽出した。不溶細胞残渣をベック
マン(Beckman)SW28ロータ内で(25,0
00rpmで50分間)4℃で超遠心して沈降させ、2
00mlの6M尿素バッファで再抽出した。上清画分を
合せて透析した。透析には、25mMのNH4HCO3
と2mMのPMSFと2mMのEDTAと0.1%のト
ラシロールと0.1%のβ−メルカプトエタノールとを
含む2M尿素(pH7.4)を3回交換して用いた。透
析後、抽出上清に〜200mlのヘパリン−セファロー
スを加えた。後者は従来通りに(29)調製し、2M尿
素バッファで平衡させておく。ゲルと上清との混合物を
回転台に載せ4℃で一晩インキュベートし、次にガラス
カラム(4.0×3.5cm、コンテス・ガラス(Ko
ntes Glass)、ヴアインランド(Vine
land)、ニュー・ジャーシ(NJ))に充填した。
〜300mlの2M尿素バッファを25ml/時の速度
でカラムに流してヘパリン−セファロースに結合しなか
った物質をカラムから洗い流した。次に、2M尿素に入
れた50mlの1.0M NH4HCO3で結合した物
質をカラムから溶出し、5mMのNH4HCO3に透析
して凍結乾燥した。この半精製Apo Eを0.1Mの
トリスHClと1mMのEDTAと1.0%のβ−メル
カプトエタノールとを含む15mlの6Mグアニジン
(pH7.4)に可溶化し、セファクリルS−300
(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ(Pharma
cia Fine Chemicals,ウプサラ(U
ppsala),スエーデン(Sweden))カラム
(2.5×300cm)にかけ、4Mのグアニジンと
0.1Mのトリス.HClと1mMのEDTAと0.1
%のβ−メルカプトエタノールと(pH7.4)によっ
て平衡させた。Apo Eを含む画分をプールし、5m
MのNH4HCO3に完全に透析して凍結乾燥した。固
定ゲル上の分取形等電点電気泳動法(28)を用いて最
終精製を終了した。Apo Eアナログの構造的特性決定 アミノ酸解析用のタンパク質又はペプチドサンプルを密
封減圧管内で110℃の6N HCl中で20時間加水
分解した。標準的126データシステムを備えたベック
マン(Beckman)121MBアナライザーで分析
を実施した。セフアクリルS−300カラムで精製した
3mgのApo Eを600μlの70%HCOOHに
入れた90mgのCNBrにより室温で30時間消化し
てアミノ酸及びその配列を解析するためのペプチドを得
た。得られたペプチドを前述の真正ApoEと同様に
(4)セフアデックスG−50カラムで分離した。最新
型ベックマン890Cシーケンサ(Beckman89
0C Sequencer)を用い標準0.1Mカドロ
ール(Quadrol)プログラムで配列解析を実施し
た。3mgのポリブレンと0.5%のNaDodSO4
との存在中で完全形タンパク質を分解し、ポリブレンの
みを存在させてペプチドを分解した。従来の高性能液体
クロマトグラフィー(14)を用いてフェニルチオヒダ
ントインアミノ酸の同定及び定量を実施した。 分析用
等電点電気泳動法とNaDodSO4ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法(14)とを実施した。システアミン
(β−メルカプトエタノールアミン)による電荷修正を
行なった(14)。Apo Eアナログの生物学的特性決定 Apo Eアナログとジミリストイルホスファチジルコ
リン(DMPC)とのリン脂質複合体を従来通りに調製
し単離した(14)。従来の線維芽細胞(31)及び肝
膜(32)の場合に準じてリポタンパク質レセプター結
合アッセイを実施した。ヨード−ビーズ(Iode−B
eads)(ピアス(Pierce))を製造業者の指
示通りに用い0.10MのNH4HCO3中でApoE
をヨウ素化した。ウサギ及びラットのインビボテストの
ためにヨウ素化した真正ApoEとApoEアナログ
(各90μg)とを1mlのウサギ又はラットの血漿と
共に室温で30分間インキュベートし、ニュージーラン
ド白ウサギの雄に注射した。従来の沈殿(33)を使用
し血漿放射能によってTCA沈殿可能タンパク質を測定
する。血漿量を体重の4.5%と仮定し、種々の経過時
間での注射物質の血漿中残存パーセントを計算する。結果及びその考察 ヒトApo Eの発現 pTV 194でトランスフエクトした細胞の誘発によ
り、ApoEに等しい見掛け分子量をもつタンパク質が
特異的に誘発された。この誘発タンパク質は抗ヒトAp
oE抗体と反応した(図示せず)。誘発期間が30分以
上の場合細胞溶解が観察された(第28図)。この細胞
溶解はApoEの細胞内蓄積と関係がある。30℃に維
持された非誘発細胞は安定であった(第28図)。この
ような崩壊性(toxicity)細胞溶解はこの発現
ベクターの一般的特徴ではない。何故ならヒト成長ホル
モンcDNAを含むとき同じ発現系が同じ結果を生じな
いからである。細胞溶解後のタンパク分解によってAp
oEは破壊された。ApoE蓄積によって生じる毒性の
問題を解決するために、細胞の誘発を短時間にし(〜2
0分)次に発酵槽に氷を加えて細胞を冷却した。固相ラ
ジオイムノアッセイで定量すると短時間誘発細胞中のA
po Eレベルは可溶細胞タンパクの約1%であった。
Apo Eを単離し、ヘパリンセファロースとセファク
リルS−300クロマトグラフィーとによって細胞抽出
物から精製した。この2段階プロセスで90%より高純
度のApo E調製物が細胞抽出物中のApo E存在
量の約20%に相当する収率で得られた。特性決定する
ための最終精製には分取型インモビリン等電点電気泳動
を用いた。これらのテストで用いた精製手順は総回収率
を最も良くするように設計されたものでなく特性決定の
ための純粋物質が得られるように設計されたものであ
る。Apo Eアナログの構造的特性決定 インモビリン精製Apo EアナログはSDSゲル上で
真正Apo Eに等しい見掛けMrをもつ単一バンドと
して泳動した。生物工学的(bio−engineer
ed)Apo Eは等電点電気泳動にかけるとインモビ
リン精製ApoE3と等しいpIをもつ1つの主要バン
ドとして集束した。1つのシステイン残基の存在に対応
してApo Eアナログはシステアミン修飾後にアノー
ド側に1電荷ユニットだけシフトした。イモビリン精製
産物のアミノ酸解析を同じ方法で精製した真正ヒトAp
o E3に比較した。表VIに示す如くApo Eアナ
ログと真正Apo Eとの分析結果は互いにほぼ等しく
ヒトApo Eの従来の配列解析から得られた理論組成
にもほぼ等しい。しかし乍らこの分析結果は、Apo
Eアナログが真正Apo Eに比較して付加的なメチオ
ニン残基を含むことを示唆している。更に、システアミ
ン処理によって示唆された1つのシステイン残基の存在
も確認された。完全形Apo Eアナログ(約6ナノモ
ル)の配列解析の結果、付加メチオニン残基がタンパク
質のNH2末端に存在し、単鎖配列
【化18】
を形成することが判明した。メチオニン以後の配列はヒ
トApo Eの残基1−17に対応する。これらの結果
より、Apo EのNH2末端をコードする部分を再構
築する合成オリゴヌクレオチドが正しく翻訳されたこと
及び(細菌による翻訳開始コドンとして付加された)付
加的メチオニンがプロセシングメカニズムによって除去
されなかったことが判明した。配列解析に於いて初期収
率は予想外に低かったが(約20%)、その理由は恐ら
く、NH2−末端メチオニンの一部分がホルミル化され
たためでなく、ホルミル化タンパク質が非ホルミル化ポ
リペプチド(及び真正Apo E)とは明らかに異なる
pIを有しこれが観察されなかったためであろう。いく
つかのCNBrペプチドをそれらのアミノ酸組成に関し
て特性決定し、(図示しないが)真正Apo Eとの間
に違いはないことを知見した。更にCB4(真正Apo
Eの残基109−125)の配列解析とCB5の(A
po Eの164位に対応する残基までの)部分配列解
析とによって、Apo Eアナログが重要なレセプター
結合領域に於いては真正Apo E3と等しい配列を有
することを確認した。これらのデータは全て、NH2末
端の付加メチオニンを除くとApo EアナログがAp
o E3と等しい構造を有することを示す。Apo Eアナログのインビトロ及びインビボ代謝の特
性決定 Apo E.DMPC複合体のレセプター結合の比較に
より、Apo Eアナログが真正Apo Eと本質的に
等しい結合特性を有することが判明した。培養線維芽細
胞上でのApoB,E(LDL)レセプターの結合を測
定をするために125I−LDLを用いた競合テストを
行なうと、50%置換濃度はApo Eアナログで0.
019μg/ml、真正Apo Eで0.024μg/
mlであった(第29図)。線維芽細胞への直接結合テ
ストでは、双方のApo E調製物が同様に結合した
(第29図)。直接結合データのスキャッチャード(S
catchard)分析によれば、生物工学Apo E
と真正Apo Eとの夫々に対するKds及び最大結合
量は各々0.93及び0.96×10−10M、並び
に、29.4及び34.2μg/mg細胞タンパク質で
あった。更に、双方のApo E調製物はイヌ肝膜上の
Apo Eレセプターにも同様に効率良く結合した(第
30図)。Apo Eアナログと真正Apo Eとのイ
ンビボ代謝特性とを比較すると、双方の調製物が同様の
挙動を示すことが判明した。131I標識Apo Eア
ナログと125I標識真正Apo Eとを混合し正常ウ
サギ血漿と共にインキュベートし次に混合物を正常ウサ
ギに注射すると双方のラベルは等しい反応速度論に従っ
て血液から除去された(第31図)。注射後約20分で
双方のラベルの注射量の50%が除去された。ラベルを
互いに交換して標識したタンパク質に関しても等しい結
果が得られた。またラットを用いたターンオーバーテス
トでも等しい結果が得られた(図示せず)。従って、イ
ンビトロ及びインビボのテストの双方に於いて生物工学
Apo Eと真正Apo Eとは同様の特性を示し、本
質的に同様に作用する。要約すれば、単離Apo Eア
ナログの構造的特性決定の結果、Apo Eアナログは
アミノ末端の付加メチオニン残基を除いて真正Apo
Eに等しい構造を有することが判明した。更にインビト
ロ及びインビボの双方に於いてApoEアナログと真正
Apo Eとは等しい代謝特性を有していた。
トApo Eの残基1−17に対応する。これらの結果
より、Apo EのNH2末端をコードする部分を再構
築する合成オリゴヌクレオチドが正しく翻訳されたこと
及び(細菌による翻訳開始コドンとして付加された)付
加的メチオニンがプロセシングメカニズムによって除去
されなかったことが判明した。配列解析に於いて初期収
率は予想外に低かったが(約20%)、その理由は恐ら
く、NH2−末端メチオニンの一部分がホルミル化され
たためでなく、ホルミル化タンパク質が非ホルミル化ポ
リペプチド(及び真正Apo E)とは明らかに異なる
pIを有しこれが観察されなかったためであろう。いく
つかのCNBrペプチドをそれらのアミノ酸組成に関し
て特性決定し、(図示しないが)真正Apo Eとの間
に違いはないことを知見した。更にCB4(真正Apo
Eの残基109−125)の配列解析とCB5の(A
po Eの164位に対応する残基までの)部分配列解
析とによって、Apo Eアナログが重要なレセプター
結合領域に於いては真正Apo E3と等しい配列を有
することを確認した。これらのデータは全て、NH2末
端の付加メチオニンを除くとApo EアナログがAp
o E3と等しい構造を有することを示す。Apo Eアナログのインビトロ及びインビボ代謝の特
性決定 Apo E.DMPC複合体のレセプター結合の比較に
より、Apo Eアナログが真正Apo Eと本質的に
等しい結合特性を有することが判明した。培養線維芽細
胞上でのApoB,E(LDL)レセプターの結合を測
定をするために125I−LDLを用いた競合テストを
行なうと、50%置換濃度はApo Eアナログで0.
019μg/ml、真正Apo Eで0.024μg/
mlであった(第29図)。線維芽細胞への直接結合テ
ストでは、双方のApo E調製物が同様に結合した
(第29図)。直接結合データのスキャッチャード(S
catchard)分析によれば、生物工学Apo E
と真正Apo Eとの夫々に対するKds及び最大結合
量は各々0.93及び0.96×10−10M、並び
に、29.4及び34.2μg/mg細胞タンパク質で
あった。更に、双方のApo E調製物はイヌ肝膜上の
Apo Eレセプターにも同様に効率良く結合した(第
30図)。Apo Eアナログと真正Apo Eとのイ
ンビボ代謝特性とを比較すると、双方の調製物が同様の
挙動を示すことが判明した。131I標識Apo Eア
ナログと125I標識真正Apo Eとを混合し正常ウ
サギ血漿と共にインキュベートし次に混合物を正常ウサ
ギに注射すると双方のラベルは等しい反応速度論に従っ
て血液から除去された(第31図)。注射後約20分で
双方のラベルの注射量の50%が除去された。ラベルを
互いに交換して標識したタンパク質に関しても等しい結
果が得られた。またラットを用いたターンオーバーテス
トでも等しい結果が得られた(図示せず)。従って、イ
ンビトロ及びインビボのテストの双方に於いて生物工学
Apo Eと真正Apo Eとは同様の特性を示し、本
質的に同様に作用する。要約すれば、単離Apo Eア
ナログの構造的特性決定の結果、Apo Eアナログは
アミノ末端の付加メチオニン残基を除いて真正Apo
Eに等しい構造を有することが判明した。更にインビト
ロ及びインビボの双方に於いてApoEアナログと真正
Apo Eとは等しい代謝特性を有していた。
【表6】
(注)結果は重複定量(duplicate dete
rmiuationg)から得られるものでありモル当
りの残基として示される。システインは過ギ酸酸化後別
個に定量された。スレオニンとセリンとの値は加水分解
損を補正していない。トリプトファンは測定されなかっ
た。Apo E3配列は参考文献4による。 参考文献目録 1.アール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahle
y)(1978)脂質及びリポタンパク質の代謝障害
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y),エー・エム・ゴットー・ジュニア(A.M.Go
tto Jr.)及びジェー・エー・オント(J.A.
Ontko)(米国生理学協会(Americal P
hysiological Society),ベセズ
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1〜197ページ。 2.アール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahle
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y)及びティー・エル・イネラリティ(T.L.Inn
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テイスバーグ(P.Teisherg)及びティー・ゲ
ッドーダールジュニア(T.Gedde−Dahl J
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ジェー・エル・ブレスロウ(J.L.Bresle
w),ジー・ユターマン(G.Uterman),アー
ル・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahley),ケ
ー・エッチ・ワイスグレーバー(K.H.Weisgr
aber),アール・ジェー・ハーヴェル(R.J.H
avei),ジェー・エル・ゴールドシュタイン(J.
L.Goldstein),エム・エス・ブラウン
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um)(1982)ジャーナル・オブ・リピド・リサー
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l)(1982)米国医学講座(Med.Clin.N
orth Am.)66,441−454。 13.エッチ・ジェー・メンゼル(H.J.Menze
l),アール・ジー・クラデッキー(R.G.Klad
etzky)及びジー・アスマン(G.Assman)
(1983)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイ(J.Biol.Chem,)256,907
7−d9083。 14.ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.H.We
isgraber)等,ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ(J.Biol.Chem.)25
6,9077−9083。 15.エス・シー・ラール・ジュニア(S.C.Ral
l Jr),ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.
H.Weisgraber),ティー・エル・イネラリ
ティ(T.L.Innerarity)及びアール・ダ
ブリュ・マーレイ(R.W.Mahley)(198
2)プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミッ
ク・サイエンス(Proc.Patl.Acad.Sc
i.),米国,79,4696〜4700。 16.エス・シー・ラール・ジュニア(S.C.Ral
l Jr),ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.
H.Weisgraber),ティー・エル・イネラリ
ティ(T.L.Innerarity),アール・ダブ
リュ・マーレイ(R.W.Mahley)及びジー・ア
スマン(G.Assman)(1983)臨床研究会報
(J.Clin.Invest.)71,1023−1
031。 17.ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.H.We
isgraber),エス・シー・ラール・ジュニア
(S.C.Rall Jr),ティー・エル・イネラリ
ティ(T.L.Innerarity),アール・ダブ
リュ・マーレイ(R.W.Mahley),ティー・ク
ーシ(T.Kuusi)及びシー・エーンホルム(C.
Ehnholm)(1984)臨床研究会報(J.Cl
in.Innest.)73,1024−1033。 19.アール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahl
ey),ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inn
erarity),エス・シー・ラール・ジュニア
(S.C.Rall Jr)及びケー・エッチ・ワイス
グレーバー(K.H.Weisgraber)ニューヨ
ーク科学学会年報(Ann.NY Acad.Sc
i.)投稿中。 20.ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inne
rarity),イー・ジェー・フリードランダー
(E.J.Friedlander),エス・シー・ラ
ール・ジュニア(S.C.Rall Jr),ケー・エ
ッチ・ワイスグレーバー(K.H.Weisgrabe
r)及びアール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mah
ley)(1983)生化学会報(J.Biol.Ch
em,)258,12341−12347。 20a.ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inn
erarity),ケー・エッチ・ワイスグレーバー
(K.H.Weisgraber),ケー・エス・アー
ノルド(K.S.Arnold),エス・シー・ラール
・ジュニア(S.C.Rall Jr)及びアール・ダ
ブリュ・マーレイ(R.W.Mahley)(198
4)生化学会報(J.Biol.Chem)259,7
261−7267。 21.ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K・H・We
isgraber),ティー・エル・イネラリティ
(T.L.Innerarity),ケー・ジェー・ハ
ーダー(K.J.Harder),アール・ダブリュ・
マーレイ(R.W.Mahley),アール・ダブリュ
・ミルン(R.W.Milne),ワイ・エル・マーセ
ル(Y.L.Marcel)及びジェー・ティー・スパ
ロウ(J.T.Sparrow)(1983)生化学会
報(J.Biol.Chem)259,12348−1
2354。 26.ユー・ケー・レムリ(U.K.Laemmli)
(1970)ネイチャー(Nature)(ロンドン)
227:680−685。 27.エッチ・タウビン(H.Towbin),ティー
・スターヘリン(T.Staehelin)及びジェー
・ゴードン(J.Gordon)(1979)プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエン
ス(Proc.Natl.Acad Sci.)米国1
48:107−127。 28.エッチ・ジェー・マンゼル(H.J.Manze
l)等(1984),生化学会報(J.Biol.Ch
em.)254:3070−3076(1984)。 29.ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.H.We
isgraber)及びアール・ダブリュ・マーレイ
(R.W.Mahley)(1980)ジャーナル・オ
ブ・リピド・リサーチ(J.Lipid.Res.)2
1,316−325。 30.ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inne
rarity),アール・イー・パイタス(R.E.P
itas)及びアール・ダブリュ・マーレイ(R.W.
Mahley)(1979)生化学会報(J.Bio
l.Chem.)254,4186−4190。 31.ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inne
rarity)及びアール・ダブリュ・マーレイ(R.
W.Mahley)(1978)バイオケミストリイ
(Biochemistry)17,1440−144
7。 32.ディー・ワイ・ヒューイ(D.Y.Hui),テ
ィー・エル・イネラリティ(T.L.Innerari
ty)及びアール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Ma
hley)(1981)生化学会報(J.Biol.C
hem.)256,5646−5655。 33.アール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahl
ey),ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inn
erarity),ケー・エッチ・ワイスグレーバー
(K.H.Weisgraber)及びエス・ワイ・オ
(S.Y.Oh)(1979)臨床研究会報(J.Cl
in.Iuvest.)64,743−750。実施例39 met−asp−gln−bGHアナログの生物学的活
性 最近の研究によれば(ピー・ジェー・エパード(P.
J.Eppard)及びディー・イー・バウマン(D.
E.Bauman)、1984年コーネル食品製造業者
用栄養学会会報(Proceedings of 19
84 Cornell Nutrition Conf
erence for Food Manufactu
rers)5〜12ページ)、メチオニル−ウシ成長ホ
ルモンを12時間に亘り連続投与すると、コントロール
に比較して10〜40%の産乳量の増加が得られた。実
施例13に記載の如く増殖、回収及び精製されたpHG
44プラスミドでコードされたmet−asp−gln
−bGHアナログを使用しても同様の結果が得られた。実施例40 met−pGHアナログの生物学的活性 最近の研究(シー・エー・スペンスC.A.Spenc
e等の論文「雌ブタの胎児内エネルギ蓄積及び乳汗分泌
性能に関する外因性成長ホルモンの効果(Fffect
of Exogeneous Growth Hor
mone OnFetal Energy Stora
ge and LactationPerforman
ce in Sows)」、米国動物科学協会年例会
(The Annual Meeing of The
American Society of Anim
al Science)、ミズーリ大学、1984年8
月7〜10日)によれば、下垂体由来のブタ成長ホルモ
ンは雌ブタの乳汗分泌と同産仔ブタの生存率とを向上さ
せることが判明している。乳汗分泌性能テストに於い
て、met−pGHアナログを妊娠ブタに投与すると、
雌ブタの乳汗分泌と同産仔ブタの生存率とが改良され
た。実施例41 脊髄虚血の治療に於ける組換SODの使用 麻酔をかけた犬をニコレットコンパクト(Nicole
t Compact)4励起ポテンシャルシステムにつ
なぎ、後脳骨神経に4.7回/秒の割合で連続的に25
0回の刺激を与えて基準量SEP(体感励起ポテンシャ
ル(Somatosensory Evoked Po
tentials))を得た。250回の刺激に関する
励起ポテンシャルをFpzとCz(頭皮上の2つの特異
点)での2つの電極から記録し、信号平均化装置で平均
化して信号対ノイズ比を低減し、SEPをスクリーンに
ディスプレイした。次に、左胸部を切開し、左鎖骨下動
脈の真向いの遠位の下行大動脈を解剖単離してクロスク
ランプができるように準備した。動脈のクロスクランプ
を行なう予定部位の近傍に巾着縫合糸を挿入した。ま
た、近位の動脈血圧をモニターし同時に実験グループに
ついては投与薬剤の注入をモニターするために20ゲー
ジサイズのカニューレを挿入した。更に、動脈のクロス
クランプ後の血圧のモニターと血圧調節用の瀉血とを行
なうために14ゲージサイズのカニューレを右大腿動脈
に挿入した。溶血ガスを連続的に採取し、溶血ガスが正
常範囲内に維持されるようにしスピレータを調節した。
次に左鎖骨下動脈の真向の遠位の動脈のクロスクランプ
を実施した。SEPは1分間隔でリピートした。近位動
脈の高血圧をコントロールするために、平均血圧を90
〜110mmHgに維持するように大腿動脈から瀉血し
た。SEP消滅後、動脈クロスクランプを10分間維持
した。SEP追跡図の消滅は、胸大動脈のクロスクラン
プによって生じた脊髄内部の虚血が、脊髄の背柱内部の
求心性インパルスの伝達を調節できないほど重症になっ
たことを意味する。SEP消滅の10分後にクロスクラ
ンプを中止した。犬が低血圧状態になったため、血液、
リンガー(Ringer)乳酸塩及び炭酸水素ナトリウ
ムを注入した。コントロールグループ(8頭)に対して
は組換SODを与えなかった。1つの実験グループ(8
頭)に対しては、クロスクランプ中止以前に組換SOD
25,000単位の丸塊を投与し以後10分間は5,0
00単位/分ずつ投与した。第2の実験グループ(7
頭)に対しては、クロスクランプ中止以前に組換SOD
を50,000単位投与し、以後10分間は10,00
0単位/分ずつ投与した。手術後、後肢の神経状態をタ
ーロブ(Tarlov)の判定基準によって採点した。
この判定基準では、0=後肢麻痺、1=後肢が僅かに運
動可、2=後肢が十分に動けるが起立が不可、3=立て
るが正常ではない、4=完全回復を示す。手術の7日
後、基準量と比較するためにSEPをリピートし記録し
た。その後、動物を殺した。結果は以下の通りである。 手術後7日目の神経状態、(POD):コントロールグ
ループ(8頭) −4頭が評点0 −4頭が評点2又は3 第1実験グループー25,000単位のSOD丸塊プラ
ス5,000単位/分×10回の投与 −6頭が完全回復 −2頭が評点2又は3 第2実験グループ−50,000単位のSOD丸塊プラ
ス10,000単位/分×10回の投与 −7頭全部が完全回復。 動脈クロスクランプの開始後、SEP消滅までに要する
時間は12〜19分である。SEP消滅後にクロスクラ
ンプを十分間継続したので、クロスクランプの総継続時
間は20分より長くなる。切開胸部の縫合後の手術直後
期間内に再度SEPを検査した。コントロール動物では
SEP追跡図が得られなかった。対照的に処置動物では
潜伏期間の波形遅れを伴なうSEP追跡図が回復してい
た。要約すれば、組換SODは脊髄虚血による神経障害
を防止するために有効である。この処置方法は胸大動脈
瘤の外科手術の際に特に重要である。
rmiuationg)から得られるものでありモル当
りの残基として示される。システインは過ギ酸酸化後別
個に定量された。スレオニンとセリンとの値は加水分解
損を補正していない。トリプトファンは測定されなかっ
た。Apo E3配列は参考文献4による。 参考文献目録 1.アール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahle
y)(1978)脂質及びリポタンパク質の代謝障害
(Disturbances in Lipidand
Lipoprotein Metabolism),
ジェー・エム・ディッチー(J.M.Dietsch
y),エー・エム・ゴットー・ジュニア(A.M.Go
tto Jr.)及びジェー・エー・オント(J.A.
Ontko)(米国生理学協会(Americal P
hysiological Society),ベセズ
ダ(Bethesda),メリーランド(MD),18
1〜197ページ。 2.アール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahle
y),ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inne
rarity),エス・シー・ラール・ジュニア(S.
C.Rall Jr)及びケー・エッチ・ワイスグレー
バー(K.H,Weisgraber)(1984)ジ
ャーナル・オブ・リピド・リサーチ(J.Lipid
Res.)25,1277−1294。 3.アール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahle
y)及びティー・エル・イネラリティ(T.L.Inn
erarity)(1983)バイオシミカ・バイオケ
ミカ・アクタ(Biochim.Biopys,Act
a)737,197−222。 4.エス・シー・ラール・ジュニア(S.C.Rall
Jr),ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.H.
Weisgraber)及びアール・ダブリュ・マーレ
イ(R.W.Mahley)(1982)生化学会報
(J.Biol.Chem.)257,4171−41
78。 5.ジェー・ダブリュ・マクリーン(J.W.Mcle
an),エヌ・エー・エルズアワバギー(N.A.El
shourbagy),ディー・ジェー・チャン(D.
J.Chang),アール・ダブリュ・マーレイ(R.
W.Mahley)及びジェー・エム・テイラー(J.
M.Taylor)(1984)生化学会報(J.Bi
ol.chem.)259,6498−6504。 6.ビー・オライゼン(B.Olaisen),ピー・
テイスバーグ(P.Teisherg)及びティー・ゲ
ッドーダールジュニア(T.Gedde−Dahl J
r)(1982)ヒューマン・ジェネテイクス(Hu
m.Genet.)62,233−236。 7.ワイ・ケー・ペイク(Y.K,Paik),ディー
・ジェー・チャン(D.J.Chang),シー・エー
・リアドン(C.A.Reardon),ジェー・イー
・ダビー(J.E.Davies),アール・ダブリュ
・マーレイ(R.W.Mahley)及びジェー・エム
・テイラー(J.M.Tayler)プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス(Pr
oc.Nath.Acad.Sci.),米国,投稿
中。 8.ジー・ユターマン(G.Uterman),ユー・
ランゲンベック(U.Langenbeck),ユー・
ベイジーゲル(U.Beisiegel)及びダブリュ
・ウェーバー(W.Weber)(1980)アメリカ
ン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネテイクス
(Am.J.Hum.Genet.)32,339−3
47。 9.ヴィ・アイ・ザンス(V.I.Zannis)及び
ジェー・エル・ブレスロウ(J.L.Breslew)
(1981)バイオケミストリイ(Biochemis
try)20,1033〜1041。 10.ヴィ・アイ・ザンス(V.I.Zannis),
ジェー・エル・ブレスロウ(J.L.Bresle
w),ジー・ユターマン(G.Uterman),アー
ル・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahley),ケ
ー・エッチ・ワイスグレーバー(K.H.Weisgr
aber),アール・ジェー・ハーヴェル(R.J.H
avei),ジェー・エル・ゴールドシュタイン(J.
L.Goldstein),エム・エス・ブラウン
(M.S.Brown),ジー・ションフェルド(G.
Schonfeld),ダブリュ・アール・ハザード
(W.R.Hazzard),シー・ブラン(C.Bl
um)(1982)ジャーナル・オブ・リピド・リサー
チ(J.Lipid Res.)23,911−91
4。 11.ジー・ユターマン(G.Uterman),エー
・シュタインメッツ(A.Steinmets)及びダ
ブリュ・ウェーバー(W.Weber)(1982)ヒ
ューマン・ジェネテイクス(Hnm.Genet.)6
0,344−351。 12.アール・ジェー・ハーベル(R.J.Have
l)(1982)米国医学講座(Med.Clin.N
orth Am.)66,441−454。 13.エッチ・ジェー・メンゼル(H.J.Menze
l),アール・ジー・クラデッキー(R.G.Klad
etzky)及びジー・アスマン(G.Assman)
(1983)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイ(J.Biol.Chem,)256,907
7−d9083。 14.ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.H.We
isgraber)等,ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ(J.Biol.Chem.)25
6,9077−9083。 15.エス・シー・ラール・ジュニア(S.C.Ral
l Jr),ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.
H.Weisgraber),ティー・エル・イネラリ
ティ(T.L.Innerarity)及びアール・ダ
ブリュ・マーレイ(R.W.Mahley)(198
2)プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミッ
ク・サイエンス(Proc.Patl.Acad.Sc
i.),米国,79,4696〜4700。 16.エス・シー・ラール・ジュニア(S.C.Ral
l Jr),ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.
H.Weisgraber),ティー・エル・イネラリ
ティ(T.L.Innerarity),アール・ダブ
リュ・マーレイ(R.W.Mahley)及びジー・ア
スマン(G.Assman)(1983)臨床研究会報
(J.Clin.Invest.)71,1023−1
031。 17.ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.H.We
isgraber),エス・シー・ラール・ジュニア
(S.C.Rall Jr),ティー・エル・イネラリ
ティ(T.L.Innerarity),アール・ダブ
リュ・マーレイ(R.W.Mahley),ティー・ク
ーシ(T.Kuusi)及びシー・エーンホルム(C.
Ehnholm)(1984)臨床研究会報(J.Cl
in.Innest.)73,1024−1033。 19.アール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahl
ey),ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inn
erarity),エス・シー・ラール・ジュニア
(S.C.Rall Jr)及びケー・エッチ・ワイス
グレーバー(K.H.Weisgraber)ニューヨ
ーク科学学会年報(Ann.NY Acad.Sc
i.)投稿中。 20.ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inne
rarity),イー・ジェー・フリードランダー
(E.J.Friedlander),エス・シー・ラ
ール・ジュニア(S.C.Rall Jr),ケー・エ
ッチ・ワイスグレーバー(K.H.Weisgrabe
r)及びアール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mah
ley)(1983)生化学会報(J.Biol.Ch
em,)258,12341−12347。 20a.ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inn
erarity),ケー・エッチ・ワイスグレーバー
(K.H.Weisgraber),ケー・エス・アー
ノルド(K.S.Arnold),エス・シー・ラール
・ジュニア(S.C.Rall Jr)及びアール・ダ
ブリュ・マーレイ(R.W.Mahley)(198
4)生化学会報(J.Biol.Chem)259,7
261−7267。 21.ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K・H・We
isgraber),ティー・エル・イネラリティ
(T.L.Innerarity),ケー・ジェー・ハ
ーダー(K.J.Harder),アール・ダブリュ・
マーレイ(R.W.Mahley),アール・ダブリュ
・ミルン(R.W.Milne),ワイ・エル・マーセ
ル(Y.L.Marcel)及びジェー・ティー・スパ
ロウ(J.T.Sparrow)(1983)生化学会
報(J.Biol.Chem)259,12348−1
2354。 26.ユー・ケー・レムリ(U.K.Laemmli)
(1970)ネイチャー(Nature)(ロンドン)
227:680−685。 27.エッチ・タウビン(H.Towbin),ティー
・スターヘリン(T.Staehelin)及びジェー
・ゴードン(J.Gordon)(1979)プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエン
ス(Proc.Natl.Acad Sci.)米国1
48:107−127。 28.エッチ・ジェー・マンゼル(H.J.Manze
l)等(1984),生化学会報(J.Biol.Ch
em.)254:3070−3076(1984)。 29.ケー・エッチ・ワイスグレーバー(K.H.We
isgraber)及びアール・ダブリュ・マーレイ
(R.W.Mahley)(1980)ジャーナル・オ
ブ・リピド・リサーチ(J.Lipid.Res.)2
1,316−325。 30.ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inne
rarity),アール・イー・パイタス(R.E.P
itas)及びアール・ダブリュ・マーレイ(R.W.
Mahley)(1979)生化学会報(J.Bio
l.Chem.)254,4186−4190。 31.ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inne
rarity)及びアール・ダブリュ・マーレイ(R.
W.Mahley)(1978)バイオケミストリイ
(Biochemistry)17,1440−144
7。 32.ディー・ワイ・ヒューイ(D.Y.Hui),テ
ィー・エル・イネラリティ(T.L.Innerari
ty)及びアール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Ma
hley)(1981)生化学会報(J.Biol.C
hem.)256,5646−5655。 33.アール・ダブリュ・マーレイ(R.W.Mahl
ey),ティー・エル・イネラリティ(T.L.Inn
erarity),ケー・エッチ・ワイスグレーバー
(K.H.Weisgraber)及びエス・ワイ・オ
(S.Y.Oh)(1979)臨床研究会報(J.Cl
in.Iuvest.)64,743−750。実施例39 met−asp−gln−bGHアナログの生物学的活
性 最近の研究によれば(ピー・ジェー・エパード(P.
J.Eppard)及びディー・イー・バウマン(D.
E.Bauman)、1984年コーネル食品製造業者
用栄養学会会報(Proceedings of 19
84 Cornell Nutrition Conf
erence for Food Manufactu
rers)5〜12ページ)、メチオニル−ウシ成長ホ
ルモンを12時間に亘り連続投与すると、コントロール
に比較して10〜40%の産乳量の増加が得られた。実
施例13に記載の如く増殖、回収及び精製されたpHG
44プラスミドでコードされたmet−asp−gln
−bGHアナログを使用しても同様の結果が得られた。実施例40 met−pGHアナログの生物学的活性 最近の研究(シー・エー・スペンスC.A.Spenc
e等の論文「雌ブタの胎児内エネルギ蓄積及び乳汗分泌
性能に関する外因性成長ホルモンの効果(Fffect
of Exogeneous Growth Hor
mone OnFetal Energy Stora
ge and LactationPerforman
ce in Sows)」、米国動物科学協会年例会
(The Annual Meeing of The
American Society of Anim
al Science)、ミズーリ大学、1984年8
月7〜10日)によれば、下垂体由来のブタ成長ホルモ
ンは雌ブタの乳汗分泌と同産仔ブタの生存率とを向上さ
せることが判明している。乳汗分泌性能テストに於い
て、met−pGHアナログを妊娠ブタに投与すると、
雌ブタの乳汗分泌と同産仔ブタの生存率とが改良され
た。実施例41 脊髄虚血の治療に於ける組換SODの使用 麻酔をかけた犬をニコレットコンパクト(Nicole
t Compact)4励起ポテンシャルシステムにつ
なぎ、後脳骨神経に4.7回/秒の割合で連続的に25
0回の刺激を与えて基準量SEP(体感励起ポテンシャ
ル(Somatosensory Evoked Po
tentials))を得た。250回の刺激に関する
励起ポテンシャルをFpzとCz(頭皮上の2つの特異
点)での2つの電極から記録し、信号平均化装置で平均
化して信号対ノイズ比を低減し、SEPをスクリーンに
ディスプレイした。次に、左胸部を切開し、左鎖骨下動
脈の真向いの遠位の下行大動脈を解剖単離してクロスク
ランプができるように準備した。動脈のクロスクランプ
を行なう予定部位の近傍に巾着縫合糸を挿入した。ま
た、近位の動脈血圧をモニターし同時に実験グループに
ついては投与薬剤の注入をモニターするために20ゲー
ジサイズのカニューレを挿入した。更に、動脈のクロス
クランプ後の血圧のモニターと血圧調節用の瀉血とを行
なうために14ゲージサイズのカニューレを右大腿動脈
に挿入した。溶血ガスを連続的に採取し、溶血ガスが正
常範囲内に維持されるようにしスピレータを調節した。
次に左鎖骨下動脈の真向の遠位の動脈のクロスクランプ
を実施した。SEPは1分間隔でリピートした。近位動
脈の高血圧をコントロールするために、平均血圧を90
〜110mmHgに維持するように大腿動脈から瀉血し
た。SEP消滅後、動脈クロスクランプを10分間維持
した。SEP追跡図の消滅は、胸大動脈のクロスクラン
プによって生じた脊髄内部の虚血が、脊髄の背柱内部の
求心性インパルスの伝達を調節できないほど重症になっ
たことを意味する。SEP消滅の10分後にクロスクラ
ンプを中止した。犬が低血圧状態になったため、血液、
リンガー(Ringer)乳酸塩及び炭酸水素ナトリウ
ムを注入した。コントロールグループ(8頭)に対して
は組換SODを与えなかった。1つの実験グループ(8
頭)に対しては、クロスクランプ中止以前に組換SOD
25,000単位の丸塊を投与し以後10分間は5,0
00単位/分ずつ投与した。第2の実験グループ(7
頭)に対しては、クロスクランプ中止以前に組換SOD
を50,000単位投与し、以後10分間は10,00
0単位/分ずつ投与した。手術後、後肢の神経状態をタ
ーロブ(Tarlov)の判定基準によって採点した。
この判定基準では、0=後肢麻痺、1=後肢が僅かに運
動可、2=後肢が十分に動けるが起立が不可、3=立て
るが正常ではない、4=完全回復を示す。手術の7日
後、基準量と比較するためにSEPをリピートし記録し
た。その後、動物を殺した。結果は以下の通りである。 手術後7日目の神経状態、(POD):コントロールグ
ループ(8頭) −4頭が評点0 −4頭が評点2又は3 第1実験グループー25,000単位のSOD丸塊プラ
ス5,000単位/分×10回の投与 −6頭が完全回復 −2頭が評点2又は3 第2実験グループ−50,000単位のSOD丸塊プラ
ス10,000単位/分×10回の投与 −7頭全部が完全回復。 動脈クロスクランプの開始後、SEP消滅までに要する
時間は12〜19分である。SEP消滅後にクロスクラ
ンプを十分間継続したので、クロスクランプの総継続時
間は20分より長くなる。切開胸部の縫合後の手術直後
期間内に再度SEPを検査した。コントロール動物では
SEP追跡図が得られなかった。対照的に処置動物では
潜伏期間の波形遅れを伴なうSEP追跡図が回復してい
た。要約すれば、組換SODは脊髄虚血による神経障害
を防止するために有効である。この処置方法は胸大動脈
瘤の外科手術の際に特に重要である。
【図1】pAL500の構築説明図。
【図2】pRO211とpRO12の構築説明図。
【図3】pSAL5200−6の構築説明図。
【図4】p3008の構築説明図。
【図5】p5002の構築説明図。
【図6】pHG44とpHG50の構築説明図。
【図7】p8300−10Aの構築説明図。
【図8】pSAL−130/5とpSAL−170/1
0の構築説明図。
0の構築説明図。
【図9】pSAL−210/4の構築説明図。
【図10】pSAL5600−1の構築説明図。
【図11】p3009の構築説明図。
【図12】p5003の構築説明図。
【図13】pSODα2の構築説明図。
【図14】pSODα13とpSODβ1の構築説明
図。
図。
【図15】pSODβ1T11の構築説明図。
【図16】pSODβ1T LT−1の構築説明図。
【図17】pSODβ1−BA2の構築説明図。
【図18】pTV−188の構築説明図。
【図19】p579の構築説明図。
【図20】pTV−170の構築説明図。
【図21】pTV−190の構築説明図。
【図22】pTV−194の構築説明図。
【図23】pSAL160−5の構築説明図。
【図24】pTV−214の構築説明図。
【図25】pTV279−8の構築説明図。
【図26】p9200の構築説明図。
【図27】pTV300の構築説明図である。
【図28】Apo Eアナログの細胞内蓄積に伴う細胞
毒性を示し、横軸は培養時間を、縦軸はコロニー数を表
わす。
毒性を示し、横軸は培養時間を、縦軸はコロニー数を表
わす。
【図29】線維芽細胞のApo−B,E(LDL)レセ
プターに対するApo E・DMPC複合体の結合を示
し、左図は培養線維芽細胞レセプターに対する結合能、
右図は培養線維芽細胞に対する直接結合能を表わす。横
軸はApo E・DMPC複合体の濃度、縦軸は結合率
を表わす。
プターに対するApo E・DMPC複合体の結合を示
し、左図は培養線維芽細胞レセプターに対する結合能、
右図は培養線維芽細胞に対する直接結合能を表わす。横
軸はApo E・DMPC複合体の濃度、縦軸は結合率
を表わす。
【図30】肝臓膜のApo Eレセプターに対する
125I−Apo E・DMPC複合体の結合を示す。
横軸は125I−Apo E・DMPC複合体の濃度、
縦軸は結合の量を表わす。
125I−Apo E・DMPC複合体の結合を示す。
横軸は125I−Apo E・DMPC複合体の濃度、
縦軸は結合の量を表わす。
【図31】ウサギ血漿からのヨウ素化Apo Eのクリ
アランスを示す。横軸は時間、縦軸は血漿中の放射活性
の%を表わす。
アランスを示す。横軸は時間、縦軸は血漿中の放射活性
の%を表わす。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 645119
(32)優先日 1984年8月27日
(33)優先権主張国 米国(US)
微生物の受託番号 ATCC 39782
微生物の受託番号 ATCC 39783
微生物の受託番号 ATCC 39784
微生物の受託番号 ATCC 39785
微生物の受託番号 ATCC 39786
微生物の受託番号 ATCC 39787
微生物の受託番号 ATCC 39788
微生物の受託番号 ATCC 39792
微生物の受託番号 ATCC 39804
微生物の受託番号 ATCC 39805
微生物の受託番号 ATCC 39806
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微生物の受託番号 ATCC 52215
微生物の受託番号 ATCC 53216
微生物の受託番号 ATCC 39384
微生物の受託番号 ATCC 39385
微生物の受託番号 ATCC 39386
微生物の受託番号 ATCC 39782
微生物の受託番号 ATCC 39783
微生物の受託番号 ATCC 53217
微生物の受託番号 ATCC 53218
前置審査
(72)発明者 マリアン・ゴレツキ
イスラエル国、レホヴオツト、ハナシ・
ハリシヨン・ス トリート・5
(72)発明者 ヤコブ・アール・ハートマン
イスラエル国、ホロン、ケドシエイ・カ
ヒール・ストリ ート・30
(72)発明者 ドヴ・カナー
イスラエル国、レホヴオツト、ゴード
ン・ストリート・ 21
(72)発明者 アヴイグドル・レヴアノン
イスラエル国、ネタンヤ、ボロデツキ
イ・ストリート・ 3
(72)発明者 ヒラ・ロツカー−ギラデイ
イスラエル国、エルサレム、ハーラツ
プ・ストリート・ 39
(72)発明者 アモス・ビー・オツペンハイム
イスラエル国、エルサレム、シユレム・
ストリート・5 /12
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.天然のヒトCu/Znスーパーオキシドジスムター
ゼと実質的に同じアミノ酸配列および活性を有するヒト
Cu/Znスーパーオキシドジスムターゼの酵素的に活
性な非グリコシル化および非アセチル化ポリペプチドア
ナログを産生する方法であって、(a)前記ヒトCu/Znスーパーオキシドジスムター
ゼポリペプチドアナログをコードするDNAを内部に取
り込んで含有するプラスミドで形質転換されかつそのD
NAの発現が可能である細菌培養細胞を、産生培地中の
最終Cu ++ 濃度が2ppmより大きくかつZn ++ 濃
度より大きくなるように非増殖阻害量のCu ++ を補充
したZn含有産生培地で増殖させ、 (b)産生された酵素的に活性なヒトCu/Znスーパ
ーオキシドジスムターゼポリペプチドアナログを回収す
る、 ことを包含する方法。 2.産生培地に、培地中のZn++濃度が約2ppmよ
り大きくなるような量のZn++が補充されている請求
項1に記載の方法。 3.Cu++濃度が約50〜250ppmである請求項
1又は2に記載の方法。 4.工程(a)の後、得られた細菌培養細胞を誘導して
DNAを発現させ、酵素的に活性なヒトCu/Znスー
パーオキシドジスムターゼポリペプチドアナログを産生
する請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 5.プラスミドがPSODβ1、pSODα2、pSO
Dβ1T11、pSODβ1−BA2またはpSODβ
1 T11−1である請求項1〜4のいずれか一項に記
載の方法。
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