JPS61111693A - λＰ▲Ｌの下つき▼プロモ−タ−とリボソ−ム結合部位の置換に便利なように工学処理した制限部位とを含有する発現ベクタ−、このベクタ−を含有するプラスミド、このプラスミドを含有する宿主、および関連方法 - Google Patents

λＰ▲Ｌの下つき▼プロモ−タ−とリボソ−ム結合部位の置換に便利なように工学処理した制限部位とを含有する発現ベクタ−、このベクタ−を含有するプラスミド、このプラスミドを含有する宿主、および関連方法

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JPS61111693A
JPS61111693A JP60188317A JP18831785A JPS61111693A JP S61111693 A JPS61111693 A JP S61111693A JP 60188317 A JP60188317 A JP 60188317A JP 18831785 A JP18831785 A JP 18831785A JP S61111693 A JPS61111693 A JP S61111693A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 遺伝子工学の１つの特徴は、真核生物起源に由来する外
来ＤＮＡ配列を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏ
ｌ！　）又はその他の微生物に挿入することにある。遺
伝子工学で得られる別の優れ７を特徴は、外来ＤＮＡが
コードしているポリペプチドの産生をこれら微生物中で
誘導することにある。ポリペプチドの産生け２段階プロ
セスで生じ、各段階が多数のサブステップを含むと考え
られている。２つの段階は転写段階と翻訳段階である。 ポリペプチドを効率的に量産する几めにはプロセスの２
つの段階が共に効率的に行なわれる必要がある。転写に
よって遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡが生成し、翻訳に
よってｍＲＮＡからポリペプチドが生成する。 転写プロセスの重要なサブステップは開始、即ちプロモ
ーター−オペレーター領域へのＲＮＡポリメラーゼの結
合である。プロモーター領域を構成するデオキシリボヌ
クレオチド塩基の配列を変更し、これによってプロモー
ターの相対的効率を加減し得る。この効率はＲＮＡポリ
メラーゼのプロモーターに対する親和性に左右される。 翻訳効率は−ｍＲＮＡの安定性に影響される。２７１Ｒ
Ｎ人の安定性が増すと翻訳効率が上がる。ｍＲＮＡ安定
性の正確麦決定因子は正確にはわかっていないが、その
塩基の配列によって決定されるｍＲＮＡの二次構造が安
定性に寄与することが判明している。 」訳の最初のサブステップでは、シャインーダルガルノ
（５ｈｉｎｅ　−Ｄａｌｇａｒｎｏ　）配列又はリボソ
ーム結合部位（ＲＢｆ９）として知られるｍＲＮＡ上の
塩基配列にリボソームが結合する。リボソームがｍＲＮ
Ａに沿ってＡＵＧＨ訳開始コドンまで移動するとポリペ
プチド合成が開始される。これらのコドンは通常、シャ
インーダルガルノ（８ｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）部
位から約１０塩基“下流に“存在する。翻訳効率を高め
る要因の１つＫ、シャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−
Ｄａｌｇａｒｎｏ　）部位へのリボソームの結合を増強
することが含まれる。シャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎ
ｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　）配列及び人ＵＧコドンの領域
でのｍＲＮＡの構造とシャインーダルガルノ（５ｈｉｎ
ｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　）配列からＡＵＧ；トンまでの
間隔とは、夫々、翻訳効率の決定に関して重要な役割を
果九すことが判明している。翻訳効率に影響を与える別
の要因は、早期終結（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ　ｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｏｎ　）及び転写減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏ
ｎ　）である。減衰部位を除去することによって翻訳効
率を向上させることが可能である。 細菌細胞中で真核生物ポリペプチド金多量に産生ずる計
画の障害となるのは、多量のｍＲＮＡを生成する細胞が
効率良く増殖できないことである。 このような障害は、抑制というプロセスによシ転写を阻
害することによって除去することができる。 抑制に於−ては、オペレーター領域に結合して転写を阻
害するタンパク阻害剤（リプレツナータンパク）の作用
によって遺伝子がスイッチオフされている。微生物が所
望の細胞密度まで増殖した後に、リプレツサーを破壊す
るか又はリプレツサーの効果を凌駕し得る誘導物質とし
て知られる分子を添加することによって抑制されている
遺伝子を活性化する。 スバクテリオ７アージ由来のＰＬプロモーターを含むプ
ラスミド中での真核生物遺伝子のクローニングに関して
は文献中に多くの報告が見られる〔エッチ、ブイ、パー
ナート（Ｈ，Ｖ、　Ｂｅｒｎａｒｄ　）らジーン（Ｇｅ
ｎｅ）（１９７９）ｊ　５９ニジ−、ブロム（０，Ｄｅ
ｒｏｍ　）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９８２）１７゜
４５；　ディー、ゲイセン（Ｄ、　Ｇｈｅｙ　　５ｅｎ
）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９８２）１７，５５ニジ
ニー、ヘジペス（Ｊ、　Ｈｅｄｇｐｅｔｂ　）ら１モル
、ジエン、ジエネット。 （ＭｏＩ．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｍｅｔ、）　（１９７８）
　１６３．１９７　：　イー。 レマート（Ｅ、　Ｒｅｍａｕｔ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ
　）（１９８１）１５．８１：　アール、プリンク（＆
　Ｄｅｒｙｎｃｋ）も、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）
　（１９８０）２８７．１９３）］。更に、１９８１年
１２月１６日公開の欧州特許出願第０４Ｌ７６７号は、
λバクテリオファージ由来のＰＬプロモーターを含む発
現ベクターを記載している。しかしながら、これらの文
献はいずれもＱ　ｔ　ｊ）ボソーム結合部位の使用につ
いては記載していない。 λバクテリオファージ由来のＰＬプロモーターとＣａｌ
リボソーム結合部位とを含むベクターの使用については
、ニー、ピー、オフペンノーイム（人。 ３３、　Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ　）ら、ジエー６モル、バ
イオロ。 （Ｊ、　ＭｏＩ．Ｂｌｏｌ、）（１９８２）　１５８．
３２７並びにエッチ、シマタケ（Ｈ，８ｈｉｍｍｔａｋ
ｅ　）及びエム、ローゼ゛ンベルグ（Ｍ、　Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ　）　、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）（１９
８１）影？３，１２８に記載されている。これらの刊行
物は、高レベルのＯｌタンパクの産生について記載して
いるが、真核生物タンパクの産生を包含又は記載してい
ない。 ＰＬプロモーターと０１リポソ一ム結合部位を含む他の
ベクターも以下の文献に記載されている。 カーンテイ・エム等（０ｏｕｒｎｔｙ、　Ｍ、、　ｅｔ
　ａｌ、　）、ＰＮＡ８（１９８４）胆、ｃｓｅ９−６
７３：　９クテンベルガー・ジエイ・ニー等（Ｌａｕ、
ｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｊ、　Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、　
）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、　１９８３．２３．７５−８
４及びラウテンベルガー・ジエイ・ニー等、サイエンス
（１９８３）。 ２２１、．９５１３−８６０．Ｌかしながら、これらに
記載されたベクターではいずれもＣｌプロティンのアミ
ノ末端部分を含む融合タンパク質が産生ずる。 １９８２年にシャツマン（８ｈａｔｚｍａｎ　）及びロ
ーゼンパーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　）は第１４回マイ
アミ、ウィンター、シンポジウム（Ｍｌａｍｉ　Ｗｉｎ
ｔｅｒ　８ｙｍｐｏｓｉｕｍ）にポスターを提出し九〔
ニー、アール、シャツマン（Ａ、　Ｒ，Ｓｈａｔｚｍａ
ｎ）及びエム、四−ゼンバーグＣＭ、　Ｒｏｓｅｎｂｅ
ｒｇ　）、第１４回マイアミ　ウィンターシンポジウム
（Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　）
抄録９８頁（１９８２）））。この抄録には、λバクテ
リオファージ由来のＰＬとＮｕｔとＣｌリボソーム結合
部位とを含むベクターを使用して１真核生物”ポリペプ
チドを細菌宿主中で細胞タンパクの５チより高い量で合
成することが開示されているが、（ＳＶ４０小Ｔ　（ｓ
ｍａｌｌ　　Ｔ　）抗原は実際には真核生物ポリペプチ
ドでなくウィルスタンパクであるし）、細菌宿主基が示
されていない、使用したオペレーターが定義されていな
い、複製起点（開始点）も選択可能な表現盤の遺伝子も
同定されていない等の理由罠よって上記の開示は実施不
能である。このようなベクターを使用するこの系は、こ
のベクターを安定に形質転換し得るような成る種の宿主
溶原菌（ｈｏｓｔ　Ｉｙｍｏｇｅｎ　）を含むと記載さ
れている。 本出願人は、国立保健協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅｓｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　）　、ヘルス及ヒ
ヒューマン　チービス部門（Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｈｅａ
ｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕ＋ｎａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　）
　、米国。 によるエム、ローゼンベルグ（Ｍ、肋ｓｅｎｂｅｒｇ　
　）名義で係属中の米国特許出願第４５７．３５２号の
存在全知っている。この出願の７部は国立技術情報サー
ビス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ　８ｅｒｖｉｃｅ　）。 米国通商部門（Ｕ、　Ｓ、　Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｃｏｒ
ｌＭｎｅｒｃｅ　）から入手できたが、特許請求の範囲
はまだ機密であ夛入手不能である。本出願人は該出願の
入手し得友部分について検討し、この開示も実施不能で
あるとの結論を得友。即ち、この開示によれば宿主が重
要であるのＫ（ｓ頁１７行）いかなる適当な宿主も同定
されていない。更に該出願はλ突然変異体の使用を基盤
とするのＫこの突然変異体が特定されていない（４頁２
０行）。更に該出願では宿主が溶原（Ｉｙｓｏｇｅｎ）
　ｔ−含む（８頁１８行）が、本発明では宿主が浴原菌
でない。該出願は真核生物遺伝子、すなわちサルメタロ
チオネイン遺伝子のクローニング及び発現に言及してい
るが（７頁１８行）これらについて詳細に説明していな
い。該当、頭ではＣＩリボソーム結合領域のいかなるヌ
クレオチドの配列も位置も変更していな−と述べられて
いる（３頁２７行）。 １９８３年７月１５日出願の、本発明と同様に譲渡され
ている係属中の米国特許出願第５１４１８８号中に細菌
中に於けるポリペプチドの発現に有用な新規なベクター
につ−て記載がある。これらのベクターは、ＰＬ、ＯＬ
＋抗転写終結因子Ｎタンパクｔ−結合するＮ利用部位（
Ｎｕｔ山ｚａｔｉｏｎ　５ｉｔｅ　）　、　　リボソー
ム結合部位１ＡＴＧコドン、所望のポリペプチドをコー
ドしている遺伝子を挿入する為の制限酵素部位、複製起
点及び選択可能なマーカーを含んでいる。これらのベク
ターに於いて、Ｎ利用部位とリボンーム結合部位間の距
離は約３００塩基対よシ大きい。更に５それぞれのベク
ターには、容易に置換され得ない村異的リボソーム結合
部位が含まれている。これらのベクターは様々なポリペ
プチドの発現にどれも同様に用い得るということはでき
ない。 Ｔ＋Ｔ宜ｒＲＮＡ　転写終結配列が、プロシラス・ジエ
イ等（Ｂｒｏａｉ１１８、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、）ジ
エイ・モ１１．＝ｍバイオ／Ｉ／（Ｊ、　ＭｏＩ．　Ｂ
Ａｏｌ、　）　１４８．１０７．　（１９８１）Ｋ記載
されている。このＴ１％ｒＲＮ人終結配列を原核生物遺
伝子の３′濠末端につなぎ、プロモーターによるコント
ロール下で発現させることが記載されている（アマンー
イー等（Ａｍａｎｎ、　Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、　）遺伝
子（Ｇｅｎｅ　）　１９８３．２５．１６７　：ザビュ
ー・エム等（Ｚａｂｅａｕ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　
）エムボ・ジャーナル（ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ
　）　１９８２．１　１２１７　）。 欧州特許出願第８１３０４５７３．９号で１９８２年４
月１４日に公開された欧州特許公開第０４９゜６１９号
には、安定化因子として熱訪導性リプレッサー（ｔｈｅ
ｒｍｏｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　）λ
ご工８５７の使用が記載されている。このリプレッサー
全プラスミド上にクローニングする。リプレッサー合成
を欠陥しているプロファージλｃＩ９０に感染によって
導入する。このプロ７アージは３２℃より低い温度では
クローン化リプレッサーによって維持される。前記プラ
スミドを失つ７？１．細胞はいずれも溶菌する。温度ｔ
−３８℃よシも高くすると、該リプレッサーが破壊され
あるいは不活化されて細胞が溶菌する。この安定化シス
テムはλＰＬプロモーターを含み３８℃より高温でポリ
ペプチドを発現する発明のベクターには用いることはで
きない。 コピー数の多い構成プラスミド（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉ
ｖｅｈｉｇｈ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｐｌａａｍｉ
ｄｓ　）に由来する複製起点は公知である。例えば、０
ｏｌＢ１由来のｐＯＰ１ｊ６複製起点は、ゲルファント
命デーーエイチ等（Ｇｅ１ｆａｎｄ、　Ｄ、　Ｈ，、ｅ
ｔ　ａｌ、　）ＰＮＡＳ（１９７８）　７５．　ｇ５８
６９及びミューシング・エム等（Ｍｕｅｉｉｎｇ、　Ｍ
、＋ｅｔ　ａｌ、　）Ｃ！ａｌｌ　（１９８１）　４５
．２３５　に記載されている。更Ｋ、コピー数の多い脱
落性（ｒｕｎ　−ａｗａｙ　）複製グラスミド（これは
コピー数の多い構成グラスミドとは区別される）も公知
である（レマント・イー等（Ｒｅｍａｎｔ、　Ｈ，、ｅ
ｔ　ａｌ、　）遺伝子（Ｇｅｎｅ　）　１９８３゜■、
１０３）。 本発明は様々なポリペプチドの発現を予期せぬ程高める
発現ベクターに係わる。本発明のベクター中に異なるリ
ボソーム結合部位を採用することで、従来のベクターを
用いて達成されるレベルと比較して高い発現レベルの様
々なポリペプチドを生産することが可能になる。加えて
、従来のベクターと全く同じリボソーム結合部位を用い
ても同じポリペプチドを高い発現レベルで生産すること
が可能である。更に、　Ｔ、Ｔｔ　ｒ　ＲＮ人終結配列
を発現させ良いポリペプチドがコードされている遺伝子
の３′！末端に結げ°ることによって、細菌宿主によっ
て生産される総ポリペプチドに比べてその所望のポリペ
プチドの量を増やすことが可能である。 重要なことに、Ｔ１Ｔ２ｒ几ＮＡ転写終結配列が存在す
ると、コピー数の多い構成プラスミド由来の複製起点を
、数多くのコピーを構成的（ｃｏａｓｔｌｔｕｔＩｖｅ
　）に複製する能力を失なうことなく発現ベクター中に
組み込むことが可能になる。 ｐＢＲ３２２又はコピー数の多い脱落性（ｒｕｎａｗａ
ｙ）プラスミド以外のコピー数の多い非構成プラスミド
（ｎｏｎ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｈｉｇｈ　ｃｏ
ｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄｉ　）由来の複製
起点はこれをベクター中に組み込んだとき励胞当りほん
の限られ穴数の、代表的には細胞当り４０コピーよシ少
ない数を生産することができる。コピー数の多い構成プ
ラスミド由来の複製起点に代えることによって、ポリペ
プチドの発現レベルが予期せぬ程高くなることが判明し
た。 本発明の好適なベクターは細菌宿主内で安定化されてお
り、ベクター及びポリペプチドをコードした遺伝子を含
むプラスミドを含有する細菌が増殖する際にそのプラス
ミドは失なわれることがない。こうして、プラスミドの
不安定性罠帰因するところの収率低下が克服される。更
に、このような好適ベクターを用いることで選択マーカ
ーとして抗生物質抵抗性を用いる必要がなく、従ってポ
リペプチドを低コストで生産することが可能になる。 本発明の新規な発現ベクターを用いて生産され得る幾つ
かのポリペプチドのうちのあるものはスーパーオキシド
ジスムターゼ（ｓｏＤ）及びそのアナログ（類似体）で
ある。 されている前謡客位と異なるリボソーム結合部位を用い
テδ−パーオキシドジスムターゼ及びそのアナログの予
期せぬ程の高められた発現を催ｌす発現プラスミドに係
わる。 本発明はま次、前記プラスミドを利用して細菌内で８０
Ｄ及びそのアナログの高効率に産生ずる方法に係わる。 スーパーオキシドジスムターゼ（８０Ｄ）及び酸素フリ
ーラジカル（０重・−）の現象は１９６８年にマツコー
ド及びフリードヴイツヒによって発見された（マツコー
ド番ジエイ舎エム（ＭｃＯｏｒｄ、　Ｊ、　Ｍ、）及び
フリードヴイツヒ・アイ（ｐｒｉｄｏｖｉｃｈ、　１．
　）ジエイ・パイオル・ケミ（Ｊ、　ＢＡｏｌ、　Ｏｈ
ｅｍ、　）　２４４゜６０４９−６０５５（１９６９）
）。スーパーオキシドラジカル及び他の高反応性酸素種
は全ての呼吸細胞に於いて酸化的代謝の副生成物として
産生じ、広範囲の細胞成分及び高分子に多大の損傷を与
えることが判つ九（フリードヴイツヒ・アイ、アドバン
ス・イン・インオーガニック・バイオケミストリー、ア
イクホーン・ジー・エル（Ｅｉｃｈｈｏｒｎ、　Ｇ。 Ｌ、）版及びマルチリａｘル・ジー（Ｍａｒｚｉｌｌｉ
、　Ｌ。 Ｇ、）、　エルセヴイア／北オランダ、ニューヨーク。 ６７−９０頁（１９７０）並びにフリーマン・ビー拳ｘ
　−（Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｂ、　Ａ、　）及びフラボ・
ジエイΦデー（０ｒａｐｏ、　Ｊ、　Ｄ、　）ラボラト
リ−・インベステイゲーション、４７，４１２−４２６
（１９８２）参照）。 スーパーオキシドジスムターゼとして知られる金属プロ
ティン類は酸化−還元反応２０冨・−＋２Ｈ＋→Ｈ，Ｏ
，＋　ｏｘ　　を触媒し、酸素毒性に対する防御機構を
形成する。タンパク分子中に異なる金属を含有する３種
類のＳＯＤが知られている。即ち、鉄。 マンガン及び銅と亜鉛の両者を含有するものである。こ
れらの酵素は全て同じ反応を究極的な効率で触媒し、金
属が活性部位の触媒因子であるような類似の機構で作用
する。これらの酵素は幾つかの進化論上の群に分類され
る。Ｍｎ−３ＯＤ及びＦｅ−８０Ｄは主に原核細胞中に
見られ、一方Ｏｕ　Ｚｎ　　Ｓ　ＯＤは事実止金ての真
核生物中に認められる（シュタインマン争エイチ拳エム
（８ｔａｉｎｍｌｌｎ。 Ｈ，Ｍ）スーパーオキシドジスムターゼ、オバーレイ＊
　工／ｌ／　ＩＩ　ｚ　Ａ　（０ｂｅｒｌｅｙ、　Ｌ、
　Ｍ、　）版、シーアールシープレス、フロリダ、１１
−６８頁（１９８２））。 ヒ）　Ｃｕ／Ｚｎ　８０Ｄ　　１は同一の非共有結合サ
ブユニットからなる金属−蛋白質二量体であり、各ψつ サブニットは銅１原子と亜鉛１原子とを含有し、１６０
００ダルトンの分子ｉ−を持つ（ハーツ、ジエー、ダブ
リ３−　（Ｈａｒｔｚ、　Ｊ、　Ｗ、）及びドイツチェ
、エイチ、エフ、　（Ｄｅｕｔｓｃｈ、　Ｈ，Ｆ、　）
、ジュー。パイオール、ケム、　（Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　
Ｏｈｅｍ、　）　２４７．７０４３−７Ｏ５０（１９７
２））。各サブユニットは配列が確定され次１５３個の
アミノ酸からなる（ジャブツクユ、ジエー、アール、　
（Ｊａｂ１１８ｃｈ、　Ｊ、　１’Ｌ　）、ファープ、
ディー、エル、　（Ｆａｒｂ、　Ｄ、　Ｌ−）、ケルジ
エンスタイナー、ディー、ニー、　（Ｋｅｒｓｃｈｅｎ
ｉｔｅｉｎｅｒ。 Ｄ、ん　）及びドイツチェ、エイチ、エフ。 （Ｄｅｕｔａｃｈ、　Ｈ，Ｆ−）、バイオケＬＸ）リー
（Ｂｌｏｃｈａｍｌｓｔｒｙ）　１９　：　２３１０〜
２３１６（１９８０）及びパーラ、ディ、　（Ｂａｒｒ
ａ＋　Ｄ、　）、　マｙチニ、エフ。 （Ｍａｒｔｉａｌ、　Ｆ−）、パニスフー、ジエー、ブ
イ。 （Ｂａｎｎ１ａｔｅｒ、　Ｊ、　Ｖ、　）、シニーナ、
エム、ダブリュ。 （１３ｃｈｉｎｉｎａ、　Ｍ、　Ｗ、　）、ロチリオ、
ダブリュー、エイチ、　（Ｒｏｔｉｌｉｏ、　Ｗ、　Ｈ
，）、パニｘター、ダブリュー。 エイ゛チ、　（Ｂａｎｎ１ｓｔｅｒ、　Ｗ、　Ｈ，）及
びボツナ、エフ。 （Ｂｏｓｓａ、　ｐ　）、ＦＥＢＳ　レターズ（ＦＢＢ
Ｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）１２０．５３−５６（１９８０）
）。更に１近年、ヒト８０Ｄ−１の全コード領域を含有
するｃＤＮ人クローンが単離されその配列が決定された
（リーマン−フルウィツツ、ジエー、　（Ｌｉａｍ！ｊ
１−　ＨｕｒｗＩｔｔ、　Ｊ、　）、ダフニ、エフ、　
（Ｄａｆｎｉ、　Ｎ、）、ラグイエ、ブイ。 （Ｌａｖｉｅ、　Ｖ、　）及びグローナー、ワイ、　（
Ｇｒｏｎｅｒ。 Ｙ、）、ブロク、ナットル、アカデ、サイ、Ｕａ人（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ人
）７９．２８０８−２８１１（１９８２）及びジャーマ
ン、エル、　（Ｓｌｌｈｅｒｍａｎ。 Ｌ、）、ダフニ、エフ、　（Ｄａｆｎｉ、　Ｎ、）、ラ
イマンーフルヴイツツ、ジエー、　（Ｌｅｉｍａｎ　−
Ｈｕｒｗｉｔｚ、　Ｊ、　）及びグローナー、ワイ、　
（Ｇｒｏｎｅｒ、　Ｙ、　）、プロ文ナットル、アカゾ
ロサイ、ＵＳ人（Ｐｒｏｃ、　Ｎ１ｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ人）ｇｏ、５４６５−５４
６９（１９８３））。 産生し次ヒ）ＯｕＺｎ８０Ｄアナローグはそのアミノ末
端アラニンがアセチル化されていない点で天然のヒ）　
Ｃｕ−Ｚｎ　Ｓ　ＯＤと異なる。天然のヒト８０Ｄはア
ミノ末端アラニンがアセチル化されている（ハーツ、ジ
エー、ダブリュー−（Ｈａｒｔｔ。 Ｊ、Ｗ、）及びドイツチェ、エイチ、エフ、　（Ｄｅｕ
ｔｓｃｈ。 Ｈ，Ｆ、）、ジュー。パイオール、ケム、（Ｊ、　ＢＡ
ｏｌ。 Ｏｈｅｍ、）（１９７２）２４７．７０４３−７０５０
；　　ジャブツシュ、ジュー。アール、　（Ｊａｂ１１
８ｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，）ら、バイオケミストリー（ＢＡ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　（１９８０）　Ｌｌ。 ２３１０−２３１６　　：バー２（Ｂａｒｒａ）ら、Ｆ
ＢＢＳレターズ（ＦＢＢＳ　Ｌａｔｓａｒｓ）（１９８
０）　１２０．５３及びオパーリー、エル、ダブリュ、
　（０ｂｅｒｌｙ、　Ｌ。 Ｗ、）、Ｘ−パーオキシドジスムターゼ（７ＤＩｆｍｕ
ｔａｓｅ　　）、＠ｉ巻、０ＦＬＯプレス（０ＦＬＯＰ
ｒｅｓｓ　）、フロリダ（Ｆｌｏｒｉｄａ　）、（１９
８２）、３２頁−３３頁）。ウシＳＯＤと同様に天然の
ヒ）ＳＯＤはグリコジル化されていると思われる（ヒユ
ーバー、ダブリュ、（１（ｕｂｅｒ、　Ｗ、　）、米国
特許第４５７へ４９５号明細書、１９７１年５月１８日
発行）。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）が
自分で産生し次蛋白質をグリコジル化しないように、細
菌が産生し九ヒ）ＳＯＤはほとんどグリコジル化されな
い。細菌が産生しｆＦ−８０Ｄアナローグのアミノ酸配
列は成熟ヒトＳＯＤと同じであるが、Ｎ−末端にメチオ
ｑ残基金持たない。 アナローブを細菌内で産生じ精製する方法を提供する。 スーパーオキシドジスムターゼはその薬理学的特性から
非常に興味深い。ウシ由来の天然に与られるスーパーオ
キシドジスムターゼ（オルゴテイン、　　ｏｒｇｏｔｅ
ｉｎ　）は抗炎症作用を持つことが知られておシ、欧州
、例えば***で炎症の治療用に最近市販されている。米
国を含む多くの国でも炎症治療用特に馬の麓の炎症の治
療用に動物薬として販売されている。 又、科学論文はＳＯＤが広範囲に亘シ臨床的に使用でき
るであろうことを示唆している。これＫは、腫瘍形成や
腫瘍増大を防止することや抗癌剤の細胞毒作用や心臓毒
作用を軽減ずること（オバーレイ、エル、ダブリュー　
（０ｂｅｒｌｅｙ、　Ｌ、　Ｗ、）及びビューエトナー
、ジー、アーｋ　、　（Ｂｕｅｌｔｎｅｒ、　Ｇ。 λ）、キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　）３９、１１４１−１１４９（１９７９）　
：虚血組織の保護（マクコード、ジュー。エム、　（Ｍ
ｃＯｏｒｄ、　Ｊ、　Ｍ、　）及びロイ、アール、ニス
、　（Ｒｏｙ、　Ｌ　Ｓ、　）、カン。 −ジュー。フィシオール、ファーム、　（Ｃａｎ、　Ｊ
。 Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｈａｒｍ、）　６０．１３４６−
１３５２（１９８２））：及び***の保護（アルバーレ
ッッ、ジェー、ジー　、　（Ａｌｖａｒｅｚ、　Ｊ、α
）及びスト−レイ、ビー。ティー＋　（８ｔｏｒｅｙ、
　Ｂ、　Ｔ、）、パイオール、リプロダ。 （Ｂｌｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　）　２８．１１２９−
１１３６（１９８３））が包含される。更Ｋ、加令過程
に対するＳＯＤの作用の研究も非常に興味深い（タルマ
ソッ７．ジエー、エム、　（Ｔａｌｍａｍｏｆｆ、　Ｊ
、　Ｍ、）、オルゴテイン。 （Ｏｎｏ、　Ｔ、）及びカトラー、アール、ジー、　（
Ｃｕｔｔｅｒ。 九Ｇ、）、ブロク、ナットル、アカデ、ｆイ、ＵＳ人（
Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ人ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）
　７７、２７７７−２７８２（１９８０））。 本発明は、Ｈ＋の存在下でのスーパーオキシドラジカル
の過酸化水素と分子状酸素への還元を触媒するために組
換えヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈ８０Ｄ）ま
几はそのアナログを使用することにも係る。特Ｋ、本発
明は虚血（ｉｓｃｈｅｍｌａ）　Ｋ伴う再潅流（ｒｅｐ
ｅｒｆ１１８ｉｏｎ　）時の損傷を減少させ、切除し友
摘出！！器の生存期間（５ｕｒｖｉｖａｌ　ｐｅｒｉｏ
ｄ　）　ｆ延長するためのｈｓＯＤアナローグの使用に
関する。 本発明は臓器移植に伴う再潅流時の損傷やを髄虚血（５
ｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　）　ｆ減少
させるためＫｂｓＯＤ又はそのアナローブを使用するこ
とにも係る。 二里二舅力 本発明は、非耐熱性（ｊｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ　）リ
プレッサーＣ１を含有する適切な細菌宿主細胞例えば大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏｌｉ　）に導入す
ると、この宿主細胞が、宿主細胞の温度がリプレッサー
不活化温度　゛まで上昇し次際、前記ベクターに挿入さ
れている所望遺伝子を発現し得かつ前記遺伝子がコード
して−るポリペプチド奢産生し得るようＫなる改良発現
ベクターに係）、このベクターは、５′から３′に向か
つて、 λバクテリオファージ由来のプロモーター−オペレータ
ーＰ、ＯＬを含有するＤＮ人配列と、抗転写終結因子Ｎ
タンパク質を結合する九めのＮ利用部位と、 この後に続くリボソーム結合部位を含有するＤＮ人配列
の置換（ｒｅｐＩａｃｅｍｅｎｔ　）　を可能にする第
１の制限酵素部位と、 所望遺伝子のｍＲＮＡが宿主細胞内のリボソームに結合
し得るようにする九めのリボソーム結合部位を含有する
ＤＮ人配列と、 ＡＴＧ開始コドン、ま次は所望遺伝子をベクタ−内に挿
入するとＡＴＧ開始コドンに変換されるＤＮＡ配列と、 ＡＴＧ開始コドンと位相を合わせて（ｉｎ　ｐｈａｓｅ
）所望遺伝子をベクター内に挿入するための第２の制限
酵素部位と、 をこの順に含む二本鎖ＤＮ人分子を含んでおシ、さらに
、 宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミド由来複製起
点を含有するＤＮＡ配列と、 このベクターが宿主細胞中に存在するときに現れる選択
可能ま次は同定可能な表現形質に関連する遺伝子を含有
するＤＮＡ配列ならびにｃ１４！４という断片（このよ
うな断片はｃＩ番１番リすレツテータンパク質に対する
遺伝子とこれに関連したグーモーター−オペレーター配
列とを含む）を含有するＤＮＡ配列から成る群から選択
される選択手段と、 を含んでおシ、 ＰＸ、ＯＬプロモーターーオペレーター配列の３゛末端
とＮ利用部位の５′末端との間の距離が約８０塩基対未
満であシ、Ｎ利用部位の３′末端とリボソーム結合部位
の５′末端との間の距離が約３００塩基対未満である。 選択手段がｐＪ）１２０Ｇ及びｐＨＧ２１１の如き表現
形質に関連する遺伝子であるベクターが好ましい。 本発明ベクターは第２の制限酵素部位の３’ＫＴｒＴｓ
　ｒＲＮ人　配列を含有するＤ　ＮＡｔ−更に含んでい
てもよい。Ｔ、Ｔｌ　ｒ　ＲＮ人転写終結配列は第２の
制限酵素部位の３′末端から約１００塩基対未満である
ことが望ましく、約２０塩基対未満であることがよシ望
ましい。 ＴＨＴＨｒＲＮ人転写終結配列を含んでいる現状の好ま
しいベクターはその選択手段が表現形質に関連する遺伝
子であるｐ５７９である。 ｃ　１４１４フラグメント（断片）ｔ−含有する本発明
ベクター中で、ｃ　１４Ｍ４フラグメ／トはＴＩＴｔｒ
ＲＮ人終結配列の３′にあることが望ましい。 ベクターが表現形質に関連する遺伝子とｃ　１４　ａ４
フラグメントとの両者を含有していることが望ましい。 両方の遺伝子を含有している現状で好ましいベクターは
Ｃ１ａ　１部位にｃ１４３６フラグメントをクローニン
グし７ｊ　ｐ５７９である。 本発明ベクターは、宿主細胞中で自律複製し得、少なく
とも４００個のベクターの構成コピーを生成し得る細菌
のプラスミド由来の複製起点をも含有していてもよい。 現状で好ましい複製起点Ｆｉｃｏｔ　Ｅｌグラスミド由
来のｐＯＰ１ｊ６である。 Ｔ　＋　Ｔ１　ｒ　ＲＮＡ終結配列、宿主細胞内でベク
ターの構成コピーを少なくとも４００個生成し得る複製
起点を含み且つ表現形質遺伝子とｃ　Ｉ４３４フラグメ
ントの遺伝子との両者を含有しているベクターが好まし
い。 所望のポリペプチド例えばウシ、ブタ、ニワトリ又はヒ
トの成長ホルモンの如き成長ホルモン、ヒトスーパーオ
キシドジスムターゼ、ヒトアポリポプロティンＥ又はこ
れらのアナローブをコート１するｃＤＮ人のような遺伝
子をベクターの第２の制限酵素部位に挿入してプラスミ
ドを作ってもよい。 このプラスミドはその後、遺伝子が発現され所望のポリ
ペプチドを生成することのできる適切な宿主に導入する
ことができる。現状で好ましいプラスミドは、ｂＧＨ用
には、ｐＨＧ１２．ｐＳＡＬ　５２００−６．ｐＨＧ４
４．ｐＳＡＬ　　５６００−１．ｐ７２００−２礼ｐＨ
Ｇ５０．ｐｓａｏｏ−１０人、ｐ８ＡＬ−１７０／１０
ｐ８ＡＬ−２１０／４　及びＩ）９２００　：ヒト　ス
ーパーオキシドジスムターゼ用には、ｐｓＯＤα２．ｐ
８０Ｄβ１．　ｐｉ９０Ｄ／、’ｒ、、、　ｐｓＯＤβ
、−Ｂλ２及びｐ８０Ｄ／。 ＴＴ　　１：ｐＧＨ用には、ｐａｏｏａ及びｐ３０Ｑ９
　：ｃＧＨ用には、ｐ５００２及びｐａｏｏａ；　ｈ　
ＧＨ用には、ｐＴＶｌｏｏ；ヒト　アポリポプロティン
Ｅ用には、ｐＴＶ−１８８，ｐＳＡＬ　　１６０−５．
ｐＴＶ−１７０゜ｐＴＶ−１９０，ｐＴＶ−１９４，ｐ
ＴＶ−２１４及びｐＴＶＲ２７９−８である。 好ましい宿主は大腸菌（Ｅｓｅｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏ
ｉｌ　）Ａ１６３７．　Ａ１６４５．　Ａ２６０２．　
Ａ２０９７及び人１５６３並びにプラスミドがｃ１４Ｊ
４フラグメン）ｔ−含有しているときには、人１６４５
（λｉ　４３４　（Ｑ　ｌ−ｍ１ｎｉ　Ｔｎ　１０）を
包含する・好ましい原栄養性宿主（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐ
ｈｉｃｂｏｓｒｓ　）は大腸菌（Ｅ、　ｃｏｉｌ　）人
４２００．ム４２Ｓ５及びＡ４３４６１包含する。好ま
しい溶解性宿主（１ｙｔｉｃ　ｈｏｓｔｓ　）は大腸Ｉ
Ｉ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）人４０４８を包含する。 得られ次宿主ベクター系はポリペプチドの製造に用いる
ことができる。プラスミドを含有する宿主細胞をポリペ
プチドを生成しうる適切な条件下で増殖させ、得られ之
ポリペプチドを回収する。 宿主ベクター系を用いて、ヒト　アポリボプロティンＥ
１ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ニワトリ成長
ホルモン、ヒト成長ホルモン及びヒト　スーパーオキシ
ドジスムターゼのアナローブが製造される。 このように得られた８０Ｄアナローグは８０Ｄアナロー
グと適当なキャリアー（担体、　　ｃａｒｒｉｅｒ　）
とを含有する動物薬及び医薬組成物に配合される〇これ
らのスーパーオキシドジスムターゼアナログは次の反応
：　２０Ｂ　−＋　２　Ｈ４Ｈ＠へ＋へを触媒するのに
用いられる。 心筋梗塞の大きさを減少させ、切除し次摘出臓器の生存
時間（有効保存期間）を増加させる几めに用いられた。 これらのアナローブはを髄損傷を減少させるために又気
管支締具形成（ｂｒｏ口ｃｈｉａｌｐｕ１ｍｏｎａｒｙ
　ｄｙｍｐｌａｓｉｎ　）に用−ることもできる。 酵素学的に活性な真核生物のスーパーオキシドジスムタ
ーゼ又はそのアナローブを細菌細胞中で生成する方法も
発見され７ｔｏ細菌細胞はスーパオキシドジスムターゼ
又はアナローブをコードするＤＮＡ配列を含有しておシ
、このＤＮＡ配列を発現させることができる。この方法
は、適切な条件下で、培地中の細胞が利用しうるＯｕ＋
濃度が約２ｐｐｍ以上となるような量のＯｕ＋を添加し
几生成（産生）培地中に細菌細胞を維持することからな
るＯ この方法の好ましい具体例では、細菌細胞はヒト　スー
パーオキシドジスムターゼのアナローブｔ−コードする
ＤＮＡ配列を含有するプラスミドを持つ大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃ石ａ凪）細胞である。 本発明は又、本発明方法によル細菌細胞内で生成され九
、精製された酵素学的に活性な真核生物のスーパーオキ
シドジスムターゼ又はそのアナ京−グを回収する方法に
も係る。この方法は、成長（増殖）培地から細菌細胞を
単離し、−が約７．０〜約＆０の適切な溶液中に細菌細
胞を懸濁することからなる。懸濁し次組菌細胞の細胞壁
を破砕し、次に、得られた均質な溶液を適切な条件下で
音波処理する。音波処理し之溶液を適切な条件下で遠心
する。上清部を移して、約２時間約６５℃に加熱する。 次に、上清部を冷却し、適切な条件下で遠心して上清部
に清没な蛋白質溶液を得る。得られた上清部を適切な容
量まで濃縮し、声約７．０〜約＆０で平衡化し次適切な
アニオン交換体でのイオン交換クロマトグラフィーにか
ける。スーパーオキシドジスムターゼ又はアナローブを
含有する得られ次溶液を集めて適切な容Ｅｋまで濃縮し
、−約７．０〜約＆Ｏの緩衝溶液に対して透析する。こ
の濃縮し次緩衝溶液を声約７．０〜約＆０で平衡化した
適切なアニオン交換体でのイオン交換クロマトグラフィ
ーにかける。アニオン交換体−蛋白質複合体を適切な塩
勾配にかける。スーパーオキシドジスムターゼま念はア
ナローブを含有する両分を集めて濃縮し、蒸留水に対し
て透析する。適当なバッファーでこの溶液のｐ＋（を約
４０〜約５．０に調整する。次に、緩衝化し九溶液ｔ−
≠約４０〜約＆Ｏで平衡化した適切なカチオン交換体で
のイオン交換りｉマドグラフィーにかける。蛋白質−カ
チオン交換体複合体を適切な塩勾配にかけ、精製され次
スーパーオキシドジスムターゼ又はアナローブを含有す
る得られ友画分を集める。 本発明はこれらの方法で生成され友、精製され几酵素学
的に活性な組換え体の真核性スーパーオキシドジスムタ
ーゼ又はそのアナローブにも係る。 図面の説明 第１図乃至第３１図に示した各プラスミドの制限地図は
各プラスミドに存在する全ての制限部位を同定するもの
ではない。制限部位が１つの図には示されているが、も
５１つの図には示されていない場合もある。しかしなが
ら、不発ＥＡｔ−完全に理解するｔめに必要な制限部位
は全て示している。 第１図：　ｐＡＬｓｏｏの構築 ｂＧＨｃＤＮＡｔ−含むプラスミドＤ４（人Ｔｏｏ　Ｊ
４６３１８２６　）ｔ−Ｈ憇菖で消化した。得られ７？
−１６００塩基対の大７ラグメントｔ−ｍ製し、ｓ１エ
キンヌクレアーゼで３７℃でＳ分間消化し比。得られた
フラグメントの末端に配列： ＧＧＡムＴＴＯＯ ００ＴＴλ人ＧＧ の合成りｓｓ　Ｒ１’Ｊンカーを連結し次。連結混合物
をシ逓几■で開裂し、ヒ几Ｉで開裂しであるｐＢＲ３２
°２（人Ｔｏｏ　　腐　３７０１７）中に挿入した。 旦ｃｏ　ＲＩで開裂すると５′端に配タ１ド人人ＴＴＯ
ＯＯ人ＧＯＯＡＴＧ、、、。 ＧＧＧＴＯＧＧＴＡＯ，、、。 を有する１２００塩基対フツグメントを遊離するり皇−
ンｐＡＬＲＩが得られ友。この配列が生成するというこ
とは、ｐＡＬＲｌが天然ｂＧＨの１番目の残基（フェニ
ルアラニン＞’ｒｅコードするＴＴＣコドンを含むＥｃ
ｏＲＩ制限部位を含有することを示している。ｐＡＬＲ
ＩをＰｓｔｌで部分開裂しｔ０消化物をＤＮＡポリメラ
ーゼ１０大７ラグメント（フレノウ）で処理し、配列： ＧＡ人ＧＯＴＴＯ ＯＴＴＯＧＡＡＧ のＨｉｎｄ　［ＩＪンカーを連結し次。連結混合物ｔ″
紬Ｒ１とＨｉｎｄ　ｌとで開裂し友。ｂＧＨｃＤＮＡｔ
−含むフラグメントを単離し、シ茎Ｂｌ及び毘聾夏の制
限部位間でｐＢＲ３２２にサブクローニングしｐＡＬｓ
ｏｏ（人Ｔｏｏ　４３９７８２　　）を得友。 第２図：０立虹工μむ主扶辷び燵 プラスミドｐＪＨ２００（人Ｔｏｏ　　４　３９７８３
）ｔ−Ｎｄｅｌで部分消化し、末端を充填（出ｆｉｎ）
するためにＤＮ人ポリメ２−ゼ１（フレノウ）で処理し
几。得られ念末端を再び連結させて発現ベクターｐＲＯ
２１１ｆ！：形成し次。発現ベクターｐＲ０２１１ｔ−
Σ釦■及び１ｉｉＬｄ！で消化した。大フラグメントを
単離し、ｐＡＬ５０Ｇ（ＡＴＯＯ屑　３９７８２）から
単離しｆｔ−Ｎｄｅ　Ｉ　−Ｈｒｎｄ　Ｉ　ｂ　Ｇ　Ｈ
フラグメントど連結してｐＲｏ　１２を得た。（上む■
−Ｗｉｎ庄■フラグメントはｐＡＬｓｏｏをＥｃｏ　Ｒ
Ｉで消化し、′消化産物の末端に配列： ＴＡＴＧＧＡＴＣ ＡＣＣＴＡＧＴＴＡＡ の合成リンカ−を連結させて生成した。連結混合物をＮ
ｄｅ　Ｉ及び主■で消化し、得られ夷ｙ蝕ＩＨ１ｎｄ　
ｌ　ｂＧＨ７ラグメントを単離した。）第３図：　ｐＳ
ＡＬ　５２００−６の構築ｐＲ０１２（第２図）をＰｖ
ｕ　ＩＩで部分消化し、次いでＮｄ＠ｌで消化すること
によシフ２塩基対７ラグメ／トを除去した。消化したｐ
Ｒ０１２に真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ　）　ｂＧＨＯＮ
−末端の最初の２４個のアミノ散をコードする合成りＮ
Ａフラグメ／トを連結した。 合成りＮＡ７ラグメントは配列： ＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＴＴ
ＧＣＣＡＡＣＧＣＴ３’−ＧＣＧＡ ＧＴＧＣＴＣ−３’ ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＧＧ
ＴＣＧＡＣＧの２つのリン酸化し友合成一本鎖ＤＮＡｔ
−アニールして構築した。アニールし九フラグメントを
４つのデオキシリボヌクレオシド三すン酸全ての存在下
にＤＮＡポリメラーゼ１（フレノウ）で処理して、完全
長（ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ　）の二本鎖ＤＮＡを形成
し友。フラグメントをｐｖｕ　ｌと五セ１とで消化し次
後にｐＨ０１２と連結させてｐＳＡＬ５２００−６を形
成し次。 第４図二　〇！姪ｍ ｐａｏｏａ（人ＴＯＯ４３９８０４）は、プラスミドｐ
ｐＧＨ−胎Ｊ／Ｒ１の狛１消化物から単離しｆｉｐＧＨ
７ラグメントと１ａｄｅ　Ｉで消化し７ｔｐ　ＲＯ２１
１（第２図）とを連結して構築した。 ｐｐＧＨ−！！Ｉ！ｉ！Ｉ／Ｒ１は完全長のｐＧＨｃＤ
ＮＡ　　ｔ”含有しており、この両末端には合成リンカ
−によって■０１部位が付加されている。 第５図：　　ｐ５００２の構築 二量体化した合成リンカ−と、プラスミドｐｃＧＨ−Σ
金１／Ｉ’Ｌ　ｌの狛ｌ及び胆ｎ消化物から単離し九２
つのｃＧＨフラグメントとｔ−３点連結（ｔｒＩｐａｒ
ｔｉｔｅ　１４ｇａｔｉｏｎ　）してｐ５００２　′ｆ
ｃＰＪ５した。 連結混合物ｔ−１ｄｅｌで消化し、次いで、予め匣１で
制限しである発現ベクターｐＲＯ２１１（ｇ２図）と連
結し友。プラスミドｐ５００２　ｅ含むコロ＝−を単離
し比。 合成リンカ−は配列： ＴｈＴＱＴＴＣＣＣ丁ＧＣＣム丁ＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣ
ＡＡＣＣテＧ丁丁丁（ｌｅｅＡＡｃＧｃＴＧテａｃｒａ
ｈａａａｃテムＣムム０ＧＯＡＣＧＯ〒ムＣ（ＩＯＧＯ
ＡＯＡＧＧ？ＴａａｈｃｈＡムＣＧＱ丁τＧＣＧＡＣ五
〇〇ＡＣ〒Ｃ全有する２つの一本鎖合成りＮ人から構築
した。 連結前にリンカ−をリン酸化した。このリンカ−は真正
ｃＧＨのＮ−末端の初めの１８個のアミノ酸をコードす
る。 グラスミドｐｃＧＨ−出桓１／Ｒ１は完全長ｃＧＨｃＤ
ＮＡを含有し、その５′端は二進Ｒ１制限部位であり、
３′端は狛！制限部位である。これら制限部位は合成リ
ンカ−を用いて付加し比。 第６図：　ｐＨ０４４及びｐＨ０５０の構築ｐＲＯ１２
（第２図）をＨｔｎｔｌで消化した。アガロースゲルで
線状ＤＮＡ（Ｉ型）をｎ製し、ｒＲＮＡオペロン転写終
結配列’ｒ、’ｒ、を含有する約１２００塩基対の■戚
１−）Ｌ！！１７ラグメントに連結し友。Ｔ、Ｔ、圧剪
■−世回Ｉフラグメントは、Ｈｉｎｄ夏で消化しである
プラスミドｐＰ８１（ＡＴＯＯＡ６３９８０７）から単
離し比。得られ九プ２スオドｐＨＧ４４（ＡＴＯＣ腐３
９８０６）は組換え体（ｒｅｃ）ｂＧＨ配列の３′端に
Ｔ、Ｔ驚配列を含有している。 λＣ１４１４リプレッサー配列を含有するプラスミドｐ
８に４３４（ＡＴＯＯＡ　３９７８４　）を也ジｌで消
化した。λｃ１４畠’　　！！Ｊ！！　Ｉ　　Ｈｐａ　
ｌフラグメントを単離し、９ＱＩで消化しであるｐＨ０
４４と連結し次。得られ九プラスミドｐＨＧ５０（ＡＴ
ＯＯ／ｌ６３９８０５）はＴ、　Ｔ、転写終結配列とλ
ｃ１４ｍ４　　リプレッサー配列とを含有する。 第７図：　ｐｓａｏｏ−１ＯＡの構築 Ｎ−末端にメチオニ／ｌ−有する天然のフェニルアラニ
ン型ｂＧＨ（ｍｅｔ−ｐｈｅｌｂＧＨ）のアナローブを
発現するプラスミドル８３００−１０人（ＡＴＣ！Ｏ／
１６ａ９７ａｓ）ｔ−次のように製造した。プラスミド
ｐ７２０（１−２２はｐＪＨ２ＱＯ（ＡＴＯＯＡｉ　３
９７８３）由来のλＰ１プロモーターとリボソーム結合
部位と、ｍｅｔ−ｐｈｅｂＧＨをコードするＤＮＡと、
Ｔ、Ｔ。 ｒＲＮ人終結配列とを含有している。λＰＬプロモータ
ー、ＯＢリボソーム結合部位、ｍｅｔ　−ｐｈｅ　ｂＧ
Ｈ遺伝子及びＴ、’ｒ、転写終結配列を有する９ρ！−
０４！１フラグメントをプラスミドｐＯＰ１Δ６の唯一
（単一）の色１部位に挿入してｐｓａｏｏ−１ＯＡを形
成し次。このプラスミドｐＯＰ１Δ６は高いコピー数を
有する構成プラスミド （ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｈｉｇｈ　ｃｏｐｙ　ｎ
ｕｍｂｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄ　）である。 第８図：　ｐＳＡＬ−１３０１５及びｐＳＡＬ−１７０
／１０の構築 ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｌ　ｂ　Ｇ　Ｈ蛋白質を発現する
プラスミドｐＨＧ４４（ＡＴＯＯ／１６３９８０６）ｉ
Ｎｄｅ　＋及びμｎｄｌで消化した。得られたＮｄｅ　
Ｉ　−Ｈｉｎｄ　Ｉ　ｈＧＨ７ラグメントを単離し、ｐ
ｓ３ｏｏ−１ＯＡ（Ａ’１ｒ００／ｌ６３９７８５）ｔ
″ｌｄｅ　ＩとＨｉｎｄ　Ｉの両者で部分消化して調製
し几フラグメントに連結し念。このような連結によシ、
ｍｅｔ−ｐｈｅ　ｂ　Ｇ　Ｈ遺伝子７２グメントｆ　ｍ
ｅｔ−ａ＠ｐ−ｇｉｎ　ｂ　Ｇ　Ｈ遺伝子７ラグメント
に置換する。このようにして得たプラスミドｐ８ＡＬ−
１３０１５はｒｅｃｂＧＨｔ−発現する。ｐＢＢａ２２
グラスミド（ＡＴＯＯＡ　３７０１７）のＴａｔ”遺伝
子を含有するＥｃｏ　ＲＩ　−Ａ！ｌ＋　７ラグメント
ｔ−ＤＮ人ポリメラーゼ】（フレノウ）で処理し、予め
−Ｈ１で消化しＤＮ人ポリメラーゼＩ（フレノウ）で充
填し７？：ＧＩＳＡＬ−１３０１５に挿入することＫよ
、ｊ）　ｐ　５ＡＬ−１７０／１０　ｔ−得几つ第９図
：１人七１■Ｚ■」！ ｐ８ＡＬ−１７０／１０を鱒Ｉで部分消化するととによ
シメ線状ＤＮ人（夏型）ｔ、ＡｔＪＬ比。これをアガロ
ースゲルで精製し、プラスミドｐｓＫ４３４（人ＴＣＯ
、％　３９７８４）の且四Ｉ消化物から単離しｆｔＨ２
！−一！！Ｐ！！Ｉ　ｃｌ”’遺伝子７ラグメントに連
結し友。 第１０図：　ｐＳＡＬ５６００−１の構築ｐ８ＡＬ　５
２００−６（第３図）　ｔ−Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｔ消化し次
。アガロースゲルで線状ＤＮ人（夏型）を４青製し、ｒ
　ＲＮＡオペロン転写終結配列Ｔ＋Ｔｔｔ”含有する約
１２００塩基対Ｏ１１ｕ！１！ｉＩ−Ｈｉｎｄ　ｌ［７
ラ／　／　７　）Ｋ連結し次。このＴ１％　Ｈｉｎｄ　
Ｉ　　Ｈｉ煎Ｉ７ラグメントはＨｉｎｄ　ｌで消化し九
プラスミドｐＰｉ９１（人ＴＣＣ腐３９８０７）から単
離した。得られたプラスミドｐ８ｋＬ　　５６０Ｇ−１
はｍｅｔ　−ｍａｐ−ｇｉｎ　ｂ　Ｇ　Ｈ配列の３′端
にＴ、Ｔ、配列を含有する。 第１１図’戸！せ」１至 プラスミドｐａｏｏａ（人ＴＯＯ／％　　３９８０４）
（第５図）から展ηＩ　−Ｎｄｅ　Ｉ　ｐ　ＧＨフラグ
メントヲ単離した。予めＮｄｅ　ｌで消化した発現ベク
ターＰ５７９（第１９図）の唯一の加担１部位にこのフ
ラグメンｈｔ−挿入し次。得られ九プラスミドｐ３００
９はＮ−末端に付加し九メチオニン残基金有する天然の
ブタ成長ホルモン蛋白質のアナローブを発現する。 メン）１−単離し几。予め−１で消化した発現ベクター
９５７９（第１９図）の唯一のｌｄｅ　１部位にこの７
ラグメントを挿入した。得られたプラスミドｐ５００３
（ＡＴＯＯ／Ｆ６３９７９２）はＮ−末端にメチオニン
残基金付加し次天然のニワトリ成長ホルモン蛋白質のア
ナローブを発現する。 第１３図二り旦９士コ＋２Ｆ）１９杏工ｐＪＨ２００（
ＡＴＯＯ腐　３９７８３　）発現ベクター’！ＨＮｄｅ
ｌで消化した。λＰ５プロモーターとＣＩリボソーム結
合部位とを含有する５５０塩基対辻担Ｉ７ラグメントを
単離し、予め仏鎌Ｉで消化し九プラスミドｐ８００　Ｎ
Ｈ−１０の唯一の狂■部位に挿入し次。（プラスミド９
ＳＯＤ　ＮＨ−１０はヒト８０ＤのｃＤＮＡクローン由
来のものである〔リーマ／−フルクイツツ、ジｘ　−、
（Ｌｉｅｍｉ＋ｎ　−Ｈｕｒｗｉｔｚ、　Ｊ、　）ら、
ＰＮＡ８（１９８２）７９：２８０８）。 得られ九プラスミドｐ８０Ｄ　ＮＨ−５５０をＡ／ｎ　
ｌで消化し九。（関連Ａ＆　１部位のみを図示する。）
λＰＬプロモーター及び８０Ｄ遺伝子を含有する大人／
ａ＋７ラグメントを単離した。ＢａｍＨＩリンカ−を結
合し、得られ次フラグメントｆ　Ｂａｎ　Ｈ１で消化し
た。脂四Ｈ１消化産物をＩ）　Ｂ　ＲＭ　Ｃ人ＴＯＯ４
３７２８３）の唯一のＢａｍ　Ｈ１部位に挿入してｐ８
０Ｄα２（人Ｔｏｏ　Ａ　３９７８６　）ｔ−形成した
。 第１４図：　ｐ５０Ｄα１３及びｐ８０Ｄ／１の構築プ
ラスミドｐｓＯＤα２（ＡＴＯＯ／１６３９７８６）を
Ｅｃｏ　ＲＩで部分消化し、得られ九線状ＤＮＡをアガ
ロースゲルにニジ単離した。Ｍ製Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ、（Ｄ
ＮＡポリメラーゼｌ（クンノウ）で充填し、再び連結し
九。得られたクローンｐｓＯＤα１３はリボソーム納会
部位の５′端Ｋ　Ｅｃｏ　Ｒ１部位を１個有する。 ＥＣＯＲＩ及びΔ４４１で消化しであるプラスミドｐＢ
ＬＡ１１（ＡＴＯＯ４３９７８８）からβ−ラクタマー
ゼプロモーター及びリボソーム結合部位を含有するフラ
グメントを単離し次。２００塩基付（ｂｐ）フラグメン
ト’１−ｐｓＯＤｄ１３から単離した大きなフラグメン
トに連結し九〇このｐｓＯＤα１３は出線Ｉで消化し、
ＤＮ人ポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ）で充填し、次
いでＩｃｏ　ＲＩで消化してあつ念。得られたプラスミ
ドｐ８０Ｄ／１はβ−ラクタマーゼ遺伝子のリボソーム
結合部位とλＦ、プロモーターとを含有している。 第１５図：　ｐｓＯＤβ１Ｔ１．の構築プラスミドｐＢ
Ｒ３２２（人ＴＣ！Ｏ４３７０１７）　　１ｋＥｃｏ　
Ｒ１とか！夏で消化した。得られたＤＮＡをＤＮＡポリ
メラーゼ１（クンノウ）で充填し友。 その後、ＴｅｔＲ遺伝子フラグメン）１−単離し、ｐｓ
ｏｐβ１（第１４図）プラスミドから単離した大７ラグ
メントに連結した。このｐＳＯＤβ１プラスミドは予め
、江１で消化し几後−ＨＩで部分消化し、次いでＤＮＡ
ポリメラーゼ１（クンノウ）で充填しておいた。得られ
たプラスミドｐｓＯＤβｉＴｏはＴｅｔ遺伝子を含有し
ている。 第１６図：　ｐｓＯＤＩＩ、ＴＴ−１の構築Ｈｉｎｄ　
Ｉで消化し、ＤＮＡポリメラーゼ１（クンノウ）で充填
しであるプラスミドｐｐｓ＋（人ＴＯＣ４３９８０７）
からｒ　ＲＮＡ　Ｔ、　Ｔ雪　転写終結フラグメントを
単離した。この７ラグメントを、ＩｈｍＨＩで部分消化
しＤＮＡポリメラーゼ１（クンノウ）で充填しであるプ
ラスミドｐ８０Ｄ／＋Ｔｔ＋　（第１５図）に連結した
。 第１７図：ｐ８０Ｄβ１−ＢＡ２の構築天然のβ−２ク
タマーゼリボソーム結合部位の配列に類似の配列： ５−ムム丁τＣムム〒ムム丁ムτ１０ムムムムムＧＧＡ
ＡＧＡ（１−３’を有する合成りＮＡ７ラグメントをリ
ン酸化し、Ｎｄｅ　ｌ及びＥｃｏ　ＲＩで消化しである
ｐ１９０Ｄα１３プラスミド（第１４図）の大フラグメ
ントに連結し九〇 第１８図：　ｐＴＶ−１８８（Ｄ構築プラスミドｐＡｐ
ｏｌ−ＥＸ２（ＡＴＯＯ４３９７８７）を出直１で消化
し、次いでフラグメン）ｔ−ＤＮ人ポリメ２−ゼｌ（ク
ンノウ）で充填した。得られ７ｔＡｐｏＢ遺伝子７ラグ
メントを単離し、ｐ８０ＤβＩＴＩＩプラスミド（第１
５図）の唯一のプラントエンド（平滑端）紐１部位に挿
入し次。得られ九プラスミドｐＴＶ−１８８は人ｐｏ　
Ｂ融合蛋白質を発現する。 第１９図：９５７９の構築 ヒ　Ｉで消化しであるプラスミドｐＰｓ１（ＡＴＯＯＡ
６３９８０７）からｒＲＮ人オペロンＴ、Ｔ。 転写終結フラグメントを単離し７ｔａ　ＴＮＴｓフラグ
メ／トを、−Ｉで消化しであるＰＲ０２１１（第２図）
の唯一の１１！Ｊ３ｉ１１部位に挿入した。得られ九発
現ベクターｐ５７９はλＰＬプロモーター、Ｃｌリボソ
ーム結合部位そしてＴ、Ｔ、転写終結信号を有している
。 第２０図：　ｐＴｖ−１７０の構築 Ｎ■Ｉ−Ｎｄｅ　ＩＡｐｏＥ７ラグメントをプラスミド
ｐＡｐｏｌ！１−ＦｉＸ２（人Ｔｏｏ　Ａ　３９７８７
）から単離し、ｋｌで消化しである発現ベクターｐ５７
９（第１９図）の唯一のＸ封１部位に挿入し次。得られ
九プラスミドｐＴＶ−１７０はＮ末端にメチオニン残基
金付加し次天然のヒト人ｐｏＥ蛋白質のアナローブを発
現する。 第２１図：〔口上１Ｌ虹旦男葱 プ；ｙＸミｔ’ｐＴＶ−１７０（第２０図）ヲ狛１で部
分消化し、ＤＮ人ポリメラーゼＩ（クンノウ）で充填し
た。単離し７ｔｌｉＡ状ＤＮＡ１再連結してプラスミド
ｐＴＶ−１９０ｉ得次。プラスミドｐＴｖ−１９０ｆ！
：分析し九ところ人ｐｏ　Ｅ遺伝子の５′端に唯一０Ｎ
ｄｅ　１部位を持つことが判った。 第２２図：ｐＴＶ−１９４の溝祭胎 几１と人ムＩで消化し次後プラスミドｐＢＬＡ１１（Ａ
ＴＯＯｌ６３９７８８　）からＩ−ラクタマーゼプロモ
ーターとリボソーム結合部位の７ラグメントを単離した
。このフラグメントを、世（Ｉで消化し、ＤＮＡポリメ
ラーゼｌ（フレノウ）で充填し九後７．５５　Ｒ＋で消
化しであるｐＴＶ−１７０（第２０図）プラスミドの大
７ラグメントに連結し九〇 第２３図：　ｐ８ＡＬ　　１６０−５　　の構築Ａｐｏ
　Ｅ　　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を有するＡｖａ　Ｉ　−Ａｖａ
　Ｉ　７ラグメントζ１ｙｖａ　Ｉで消化し７ｔｐＴＶ
−ｉｙｏ　　（第２１図）から単離した。このフラグメ
ント１ＤＮＡポリメラーゼ１（フレノウ）で充填し、ア
ガロースゲルで単離し几。ｎ製λｐｏ　Ｅフラグメント
を、Ｐｓｔ　Ｉで部分消化し、ＤＮＡポリメラーゼ１（
フレノウ）で充填しであるｐＴＶ１０４（２）プラスミ
ド（人Ｔ００腐３９３ｇ４）のＦｊｉ１部位に挿入した
。 得られ念グラスきドｔ−ｐＳＡＬ１６０−５と表わす。 第２４図：ｐＴＶ−２１４の構築 配夕（ド のヒト成長ホルモンの最初の１４個のアミノ酸を含む合
成フラグメントにｒ−”Ｐ−人ＴＰとポリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化し次。リン酸化し次リン力−を、Ｎ
ｄｅ　Ｉで消化しであるｐＴＶ１９０プラスミドの唯一
のμ帥１部位に挿入し次。 第２５図：　ｐＴＶＲ２７９−８Ｏ構築ｐＴＶＲ２７９
−８はＰＴＶ１９Ｇから構築し九Ｉ）Ｔｖ２６４−４５
から構築し比。 Ｍｅｔ−人ｐｏ　Ｅ　３アナローグの発現を支配するプ
ラスミドｐＴＶ１９０ｔ−Δｖａ　ｌで部分開裂し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼｌのフレノウフラグメントを用いて「
充填」し、再連結し几。得られたプラスミドｐＴＶ２６
４−４５には遺伝子の３′端の人ｖａ　１部位がない。 プ５スミ）’　ｐＴＶ２６４−４５　ｆ　狛１　”ｌ？
完全に消化し、配列： のリン酸化した合成リンカ−に連結し友。ｐＴＶＲ２７
９−８と表わされる得られたプラスミドはｍｅｔ−Ｉｅ
ｕ−１ｅｕ−１ｅｕ−ｍｅｔ　−Ａｐｏ　Ｅ　３アナロ
ーグの発現を支配する。 第２６図：　９９２００の構築 ｐＨ０４４からアンピシリン耐性遺伝子のほとんどを除
去しｐＨ０４４のテトラサイクリン耐性遺伝子で置き換
えることによシブラスミドｐ９２００　ｔ−構築し几。 ｐＨ０４４を０４！ＩとＰｓｔ　１で開裂し、ＤＮＡポ
リメラーゼ１のフレノウフラグメントて処理し、ＤＮ人
大７２グメントを単離した。このフラグメントを、ｐ：
、ｃｏ　ＲＩとＡｖａ　ｌでｐＢＲ３２２ｔ−開裂し、
フレノウフラグメントで処理しｔ後に単証し九ｐＢＲ３
２２のＤＮＡ小７ラグメントに連結した。 連結で得九プラスミドｔ−９９２００と表わした。 プラスミドｐ９２００はｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ−ｂＧ
Ｈアナローグの発現を支配し、宿主剤胞をテトラサイク
リン耐性とする。 第２７図：　ｐＴＶ３００（Ｄ構築 ｐＴＶａｏｏはｍｅｔ”−ｈＧＨアナローグの発現を支
配する。 ｐＴＶｌｇ（１）を■釦１で開裂し、ｍｅｔ”−ｈＧＨ
ＤＮＡを単離し、団垣！で開裂したＩ）５７９　（第１
９図）に連結することによ、９　ｐＴＶａｏｏを構築し
た。 ｐＴＶｌｇ（１）は１９８５年１月２３日に公開すした
欧州特許出願公開第０１３１８４３人を明細書又は対応
の１９８３年７月１５日出願の米国特許出願番号第５１
４１８８号明細書（援用して本明細書に包含する）に記
載され次ようにして得ることができる。 第２８図：　Ａｐｏ　Ｅアナローブの細胞内蓄積に伴う
細胞毒性 ｐＴＶ１９４を含有するｃ６００細胞（５ｍｆ）又はト
ランスフェクションしていない対照（コントロール）細
胞を培養し、インキュベーション温度を３０℃から４２
℃に上昇させることによシ誘導し友。図に示し九時間に
、培養物の１ｄアリコートを取り、氷で急冷し、成長培
地で段階的に希釈し、適当な抗生物質の存在下に寒天上
に置き、３０℃で一晩イン中ユペートシ几。コロニー数
ハ２つのプレートの平均から決定し比。ｐＴ’１９４を
トランスフェクトしたｃ６００細胞とトランスフェクト
していないｃ６０Ｇ細胞とを３０℃に維持し几対応培養
物（ｐａｒａｌｌｅｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　）を非誘導対
照とした。 結合 生物工学処理し九人ｐｏ　Ｂ　（ｍｅｔ−人ｐｏＥ３ア
ナローグ）と真正人ｐｏ　ｇのリン脂質複合体は、蛋白
質とＤＭＰＯとｔ−２２℃でインキュベートすることに
よって調製した。（実施例３８の後の参考文献３０に）
記載し友ように、密度勾配超遠心で非複合物質から複合
体を分離し九〇左：４℃において、培養した線維芽細胞
しセグターとの結合についてｔｌＩ標識ヒ）　ＬＤＩ、
と競合する生物工学処理人ｐ。 Ｅ及び真正人ｐｏＥ１１ＤＭＰ（！複合体の能力。右：
１３＠Ｉ−標識人ｐｏ　Ｂアナローブ及び真正人ｐＯＥ
１１ＤＭＰＯ複合体の培養線維芽細胞と直接結合する能
力。 第３０図：肝臓の　のＡｏＥレセグターに対　る”’Ｉ
−ＡｏＥＩＩＤＭＰＯ合体の結Ａ第２９図に記載の通り
にリン脂質（ＤＭＰ　Ｏ）複合体を調製した・コレステ
ロールを与えた成因の肝臓のｇＸｔ″人ｐＯＥレセプタ
ー源として用い、（実施例３８の後の参考文献３２に）
記載の如く調製した。１１８１−標識した生物工学処理
し比及び真正人ｐｏＥ　ＤＭＰＯ複合体を、（実施例３
８の後の参考文献３２）Ｋ記載の如く４℃で膜に結合さ
せ几。 第３１図：ウサギ血漿からのヨウ素化人ｏＢのクリアラ
ンス 生物工学処理し九及び真正λｐｏｅｔ−ウサギ血漿１ｍ
ｌと共に３７℃で３０分間インキエペートした後、この
混合物をウサギの静脈に注射し次。図に示す時間に、約
２ｄの血液１ＥＤＴＡｉ含有するバイアル中に採取し、
計数測定用血漿を調製し次。 （実施例３８の後の参考文献３３に）記載されているよ
うＫ、測定値（カウント）はＴＯ人可溶分解産物に対し
て補正する。 発明の詳細な説明 遺伝子の発現とポリイプチドの産生を増強しつるベクタ
ーが開発された。このプラスミド９は２本鎖ＤＮＡ分子
である。このプラスミド°を非ｆｉｔ　２４性リプレツ
サーＣＩを含有する適切な細菌の宿主細胞に導入すると
、この細胞は、宿主細胞の温度がリプレッサー不活化温
度まで上昇したときに、プラスミドに挿入された所望の
遺伝子を発現して、遺伝子がコードするボＩＪ　、、ｌ
プチト０を産生させることができる。 前記ベクターは５′から３′に向って次のものを順１こ
含んでいる。 ・　ラムダバクテリオファージ由来のプロモーターとオ
はレータ−Ｐ　Ｉ：Ｏｌを含有するＤＮＡ配列；・　抗
転写終結因子Ｎ蛋白質を結合するためのＮ利用部位； ・　その後に続くリボ１ソーム結合部位を含有するＤＮ
Ａ配列を置換できる第１の制限酵素部位；・　所望遺伝
子のｍＲＮＡが宿主細胞内のりボ１ンームと結合しつる
ようにするためのリボソーム結合部位を含有するＤＮＡ
配列； ・　ＡＴＧ開始コーン、又はベクターに所望遺伝子を挿
入するときにＡＴＧ開始開始コン９ン換されるＤＮＡ配
列；及び ・　ＡＴＧ開始コドンと位相を合わせてベクター内に所
望遺伝子を挿入するための第２の制限酵素部イ也。 前記はフタ−は、又、宿主細胞内で自律複製できる細菌
プラスミド由来の複製起点を含有するＤＮＡ配列と、ベ
クターが宿主細胞中に存在するときに現われる選択可能
な又は同定可能な表現形と表わされるフラグメントを含
有するＤＮＡ配列とからなる群から選択される選択手段
とを含んでいる。このようなｃＩ　　　フラグメントは
Ｃｌ４３４リプレツサー蛋白質の遺伝子とそれに関連す
るプロモーター及びオペレーター配列とを含んでいる。 Ｃｒ４３４はＣｒ４３４−溶Ｉ！Ｘ素（ｌｙｓｏｇｅｎ
　）を抑制するので、このプラスミドを損失すると細胞
融解（１ｙｓｉｓ　　）が起こるであろう。ｐＬｏ、、
プロモーター及びオペレーター配列の３′末端とＮ利用
部位の５′末端ど崩り距離は約８０塩基対未満であり、
Ｎ利用部位の３′末端とりボゾーム結合部位の５′末端
との間の距離は約３００塩基対未満である。 （フタ−の適宜付加成分は第２の制限酵素部位の３′末
端に位置するＴ１ＴｚｒＲＮＡ転写終結配列である。Ｔ
１Ｔ２ｒＲＮＡ転写終結配列が第２の制限酵素部位の３
′末端から約１００塩基対未満であると好ましい。より
好ましくは、ＴＩ　ＴＺｒＲＮ人転写終結配列が第２の
制限酵素部位の３′末端から約２０塩基対未満である。 にフタ―は、この（フタ−が宿主細胞内に存在するとき
に現われる選択可能な又は同定可能な表現形質に関連し
ている遺伝子を含有しているＤＮＡ配列か、２１ｍｍ４
３４ＣＩ−杉原素を抑制するＣＩＡ５４　、、プレツサ
ー遺伝子を含有しているＤＮＡ配列のいずれか、又は両
者を含んでいる。 選択可能な又は同定可能な表現形質に関連する適切な遺
伝子は温度感受性又は薬剤耐性例えばアンピシリン、ク
ロラムフェニコール又はテトラサイクリンに対する耐性
に関連するものを包含する。 宿主がＣｒ４５４．、プレツサー遺伝子を含有している
ときには、この宿主内で１１ｍｍ４３４ｃＩ−プロフア
ージが誘発されない。従って、Ｃｒ４３４が存在すると
きには高価な抗生物質選択用生理食塩水を使う必要はな
い。 ベクターは、選択可能な又は同定可能な表現形質ｌこ関
連する遺伝子を含有しているＤＮＡ配列と、Ｉ　’　３
Ａと表わされるフラグメントを含有するＤＮＡ配列との
両方を含んでいるのが好ましい。 ＣｌＡ３４遺伝子が（フタ−ｌこ含まれているときには
Ｔ＋Ｔ２ｒＲＮＡ配列の３′末端の後に位置しているこ
とが望ましい。 ベクターは、宿主細胞内で自律複製しつる細菌プラスミ
ド由来の複製起点をも含んでいる。このような複製起点
の適切なものは多くの眠例えばｐ　Ｂ１０２２又はｐＲ
Ｉから得ることができる。 好ましくは、ベクターは、宿主細胞内ではフタ−の構成
コピーを少なくとも４００個自律複製しつる高い構成コ
ピー数の細菌プラスミド由来の複製起点を有している。 より好ましくは、この複製起点がＣｏＪＥｌである。最
も好ましくは、起点は第７図に示す制限地図を有するプ
ラスミド０ｐＯＰ１Δ６である。 ベクターのもう１つの成分は、その後に続くリボソーム
結合部位を含有するＤＮＡ配列を置換させつる第１の制
限酵素部位である。多数のこのような部位が使用できる
。且工ｏｎｘが適切である。 （フタ−のもう１つの成分は、ＡＴＧ開始コト９ンと位
相を合わせてプラスミドｌこ所望遺伝子を挿入するため
の第２の制限酵素部位である。多数のこのような部位を
使用しつる。適切部位はＮ　ｄｅｌＣｌａ　　Ｉ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、Ｂｇｌ■、ＸｂａＩ３ａｃ　工
及びＬ上且■を包含する。 一般的に、第２の制限＃素部位がリボソーム結合部位を
含有するＤＮＡ配列を置換させつるに必要な第２の制限
部位としても機能することが好ましい。第２の制限酵素
部位をこの目的にも用いることができないときには、本
発明ベクターはリボソーム結合部位の後且つガ２の制限
部位の前に第３の制限酵素部位をも含んでいなければな
らない。 好ましくは、ベクターは２つの非反復（ｕｎｉｑｕｅ）
制限酵素部位を含有している。第１の部位はリボソーム
結合部位を含有するＤＮＡ配列を置換させることができ
る。第２の部位はＡＴＧ開始コドンと位相を合せてプラ
スミドに所望遺伝子を挿入させることができる。本明細
書中で用いられている「非反復〔唯一の、単一の〕制限
酵素」という用語はプラスミド中に１つだけある制限酵
素部位を意味している。現状での好ましい具体例におい
ては、ｌヱヱＲＩが第１の制限酵素部位であり、Σ東口
が第２の制限＃素部位である。 好ましくは、ベクターは共有結合で閉じた環状二本鎖の
分子である。しかしながら、プラスミド。 が共有結合で閉じていることは必須ではない。 宿主細胞をＣｒ　’Ｊプレツサー蛋白實の不活化温度ま
で加熱した後に、プラスミド°の発現しＲルが上昇する
。この目的のためには約３８℃以上の温度が有効である
。又、宿主細胞に対する不必要な熱損傷を最小限にする
ことが望ましいので、温度は４２η量度以上超えないこ
とが一般的に好ましい。 （フタ−の１つの重要な成分はリボソーム結合部位であ
る。適切な部位は、 配列：　ＴＡＡＧＧＡＡＡＴＡＣＴＴＡＣＡＴ　を有す
るラムダバクテリオファージ由来のＣ■； タテリオファージ由来のｃ■の変異体；タテリオファー
ジラムダの主要頭部蛋白質遺伝子；ｐＢＲ３２２由来の
天然のβ−ラクタマーゼ　リボソーム結合部位； する合成オリゴヌクレオチド０； する合成オリゴヌクレオチド；及び バシラス　ツレンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌ１１８悲肛７
　　由来の天然のリボソーム結合部位である。 以前に記載されたはフタ−と比較して、本発明（フタ−
は所望のポリにプチト３生成物をコート０する広範囲の
遺伝子の発現を増強するためｌζ使用することができる
。成長ホルモン例えばウシ、ブタ、ニワトリ又はヒトの
成長ホルモンや、スーパーオキシド９：）スムターゼや
アポリボプロティンＥ又はそれらいずれかのアナローブ
をコート９する遺伝子が適切な遺伝子に含まれる。アナ
ローブ（アナログ、類似体）とは天然のｌリペプチト９
と同じ活性を有しているが、ポリ纜プチドのＮ末端で１
つ以上の異なるアミノ酸が付加されているか、欠失して
いるか又はその両者であるボＩＪ−＝−？プチト９を意
味している。 本発明プラスミドと共に用いる好ましい宿主は大腸菌（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　）　テある。現
状テ好ましい株はＡ１６３７．Ａ１６４５．Ａ２６０２
゜Ａ２０９７．Ａ１５６３及びＡ１６４５（λ１４３４
ｃｒ　　ｍ１ｎｉＴｎｌｏ）である。 スーパーオキシゾジスムターゼ又はそのアナローブの発
現のために現状で最も好ましい株はＡ１６４５である。 Ａ１６４５及びＡ１６４５（λｒ　４３４　Ｃｌ−ｍ１
ｎｉＴｎｌＯ）が動物の成長ホルモン遺伝子を発現する
ための現状でより好ましい株である。 （１）フェニルアラニン型真正ｂＧＨのアミノ末端にア
ミノ酸配列ｍ　ｅ　ｔ　−ａ　ｓ　ｐ　−ｇ　Ｉ　ｎが
ついているｂＧＨアナローグ、又は （２１７１＝ルアラニン型天然ｃＧＨのアミノ末端にア
ミノ酸、メチオニンがついているＣＧＨのアナローブ を産生する遺伝子の発現のための現状で最も好ましい株
はＡ２０９７である。 テトラサイークリン耐性遺伝子を含有するトランスボグ
ンをガラクトース　オペロン内に挿入し、ガラクトース
オペロンに近い所で発現用のラムダ系を挿入することに
よってＣ６００からＡ１６３７を得た。Ｃ６００はアメ
リカン　タイプ　カルチャー　コレクションからＡＴＣ
Ｃ受託番号２３７２４号として入手できる。 Ｑａｌ↑　（ガラクトース発酵能）に関して選択し、テ
トラサイクリン耐性を失わせることにより、Ａ１６３７
からＡ１６４５を得た。Ａｌ６４５はラムグ発現系を含
有しているが選択によってトランスボゾンの一部は取り
除かれている。この表現型はｃｓｏｏｒ　ｍ　　ｇａｌ
　　ｔｈｒ　　１ｅｕ−１ａｃＺ−ｂｌ（λＣ１８５７
ΔＨ１ΔＢａｍＨＩ　Ｎ　）である。 以下により詳細に記載した種々のプラスミド°も含〃、
人１６４５は米国（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、マリ−ラント９（
Ｍａｒｙｌａｎｄ　）、ロックビル（Ｈｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ）のアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託
されている。 Ａ１６４５（λ１４３４ｃｉ　　ｍ１ｎｉＴｎｌｏ）は
３０℃でｉｍｍ４３４ｅＩ３００８ｍｉｎｉＴｎｌＯΔ
１６Δ１７をプラスミド９含有大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　）株Ａ１６４５に感染させる
ことにより得た。テトラサイクリン耐性コロニーを単Ｍ
精製した。プラスミＹｐＨＧ　５０を含有するこの株は
ＡＴＣＣ受託番号３９８０５としてアメリカン　タイプ
　カルチャー　コレクションに寄託しである。 Ａ２６０２及びＡ１５６３は５Ａ５００由来である。こ
れらの表現型は各々５Ａ５００　　ｈｉｓｉｌｅ　　ｇ
ａｌ　　Δ８（λｃ１８５７　　ΔＨ！Δ１３ａｍＮ＋
ン　　）Ｔｈび５Ａ５００ｈｊｓ−ｊｌｅ−ｇａｌ”Δ
８１ａｃｉ−Ａ２１（λｃ１８５７　１ｎｔ２ｘｉｓＩ
　　ｎｕｔＬ３ΔＨ１）である。Ａ２０９７はＡ１６４
５由来である。この表現型はＡ　１６４５ＩａｃΔｘＡ
２１　　ｐｒｏＣ：：ＴｎｌＯである。 最少必須培地中で増殖させたときでさえ高いしくルでポ
リペプチド°を発現することができる大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　の原栄養株も又、本発
明ベクターの宿主として使用できる。好ましい原栄養株
はＡ４２００とＡ４２５５とを包含する。プラスミドｐ
９２００を含有する株Ａ４２５５は受託番号５３２１５
号としてＡＴＣＣに寄託しである。プラスミド”ｐＧＨ
４４を含有するＡ４３４６のようなビオチン非要求（依
存）性原栄養株が更に好ましい。Ａ４３４６は受託番号
５３２１８号としてＡＴＣＣに寄託しである。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｔｉ　ａｈ　ｉａｓ旦工）の溶原株
も本発明Ｒフタ−の宿主として使用できる。ポリペプチ
ド９が産生ずる温度において、ポリはプチト９が産生ず
る速度よりゆっくりと、例えば細胞を融解させるエンド
リシンのような物質を産生ずる溶原株が適切な溶原株に
含まれる。これにより、産生さ、ｑ沖 れた溶解物質の量が細胞融解を起こすレヘル達する前に
、細胞が比較的大量の所望、ｄ　ＩＪはプチト°をプラ
スミド９を含有するものが含まれる。Ａ４０４８は受託
番号５３２１７号でＡＴＣＣに寄託しである。 ｐＢＲ３２２とｐＢＲＭは各々ＡＴＣＣ受託番号３７０
１７号及び３７２８３号としてアメリカン　タイプ　カ
ルチャー　コレクションから入手でき、Ｄ４　は米国特
許出願と関連してＡＴＣＣ受託番号３１８２６号として
寄託した以外、全ての寄託は微生物の寄託の国際的承認
に関するプダはスト条約に従った。 ベクターは本発明が関連する分野の当業者には公知の方
法で形成できる。これらの方法については本明細書中に
記載した種々の文献中により詳細に記載されでおり、従
来技術に関する完全な情報を提供するために本明細書中
に参考としてそれらの内容を包含する〇 現状の好ましいベクターの１つは第２図に示す制限地図
を有するｐＪＨ２００である。Ａ　１６４５株を用い、
従来の形質転換法により大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ玉匹）にこのベクターをフ吃入ψ 号笛９７８３号として寄託しである。所望の、ｄ　リペ
プチド例えばワシ成長ホルモンをコートする遺伝子をｐ
ＪＨ２００に挿入できる。 ２番目の好ましいベクターｐＲＯ２１１はｐＪＨ２００
のＮｄｅ　Ｉ部分消化物から（イ築した。ｐｒ０２１１
は第２図に示す制限地図を有する。このベクターをＮｄ
ｅ　Ｉ及び）（ｉｎｄｌｌｌで消化し、大フラグメント
を単離し、これをＩ）ＡＬ５００（ＡＴＣＣ受託番号３
９７８２号）から得たｂＧＨｃＤＮ人に連結することに
よりウシ成長ホルモンＣＤＮＡをｐＲＯ２１１に挿入し
た。得られたプラスミド９はｐＲＯ１２と表わす。これ
の制限地図も第２図に示す。 （以下余白） プラスミドｐＲＯ１２をｐｖｕｌで部分消化し、続いて
Ｎｄｅｌにより消化する０真性ｂＱＨのＮ末端の最初の
２４個のアミノ酸をコードする合成りＮＡフラグメント
を消化したｐＲ０１２に連結する。得られたプラスミド
はＩ）ＳＡＬ５２００−６と称し、その制限地図を第３
図に示す。 本発明のベクターはまた、ヒトスーパーオキシドディス
ムターゼ（ＳＯＤ）あるいはその類似物（アナログ）を
生産するプラスミドを生成するように工学処理し得る。 λＰＬプロモーター及びＣ■リボソーム結合部位を有す
るｐＪＨ２００（ＡＴＣＣ受託番号３９７８３）のフラ
グメントを、第１３図に示すように、単ｊ離した後ヒト
ＳＯＤ遺伝子を含むプラスミドｐＳＯＤＮＨ−１０に挿
入して、ｐＳＯＤＮＨ−５ｓ　Ｏと称するプラスミドを
形成した０λ゛ＰＬプロモータ及びＳＯＤ遺伝子を含む
フラグメントをｐＳＯＤＮＨ−５５０のＡＪｕｌによる
消化後単離した０旦ヱｍ）（ＩＩＪンカーの添加及びそ
の後の９ａｍＨＩによる１制限の後、フラグメントをｐ
ＢＲＭの唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入した。ｐＢＲＭは
ＡＴＣＣ受託番号３７２８３で寄託されている高コピー
数プラスミド９である。得られたプラスミドをｐｓＯＤ
α２と称する。その制限地図を第１３図に示した。この
プラスミドはＥ、ｃｏｌｉ株Ａ、２０９７中に入れてＡ
ＴＣＣ受託番号３９７８６で寄託されている。 プラスミド＠ｐｓＯＤα２（ＡＴＣＣ受託番号３９７８
６）はＣＩＩ　ＩＪボソーム結合部位を含んでいる。こ
のリボソーム結合部位を、ｐＢＬＡｌｌのＥｃＯＲＩ−
ＡノｕＩダイジェスト（消化物）から単離したβ−ラク
タマーゼる。（プラスミドｐＢＬＡ１１は第１４図に示
す制限地図を有するものであり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ株Ａ１６４５中に入れてＡＴＣＣ受託番号３
９７８８により寄託されている。） ＣＩｆ　ＩＪボソーム結合部位を第１４図に示すように
プラスミドｐｓＯＤα２から除去する。ｐｓＯＤα２を
ＥＣＯＲＩにより部分的に制限し１）ＮＡポリメラーゼ
Ｉ　（Ｋｌｅｎｏｗ）で充填し再連結すると、該プラス
ミド中に残る唯一のＥＣＯ几ｌｆｆ１１位がＣＩＩＲＢ
Ｓの５′末端となる。得られたｐｓＯＤα１３と称する
プラスミドをＮｄｅｉで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ
　（Ｋｌｅｎｏｗ　）　７！充填Ｌ、次にＥｃＯ几■に
より消化する。欠フラグメントを単離し、ｐＢＬＡｌｌ
より単離されたβ−ラクタマーゼプロモーター及びリボ
ソーム結合部位を含むフラグメントに連結してプラスミ
ドｐｓＯＤβ１を構築する。 ｐｓＯＤβ１はアンピシリン抵抗性遺伝子フラグメント
（ＡｗｐｆＬ）の替りにテトラサイクリン抵抗ａ遺伝子
フラグメント（ＴｅｔＲ）を含むように改変し得る。Ａ
句ｐＲフラグメントをｐｓｔ■引き続きＢａｍＨｌ（部
分的）による消化によりｐｓＯＤβ１から除去した。得
られたプラスミドをＤＮＡポリメラーゼ（（Ｋｌｅｎｏ
ｖ）　で充填した。別にＴｅｔＦＬａ伝子フラグメント
をｐＢＢａ２２（７）ＥＣＯＲＩ−ＡＹａｌダイジェス
トから単離し、充填し、上で充填したプラスミドに連結
した。（プラスミドｐＢＲ３２２は広く入手可能で、例
えばアメリカンタイプカルチュアコレクションからＡＴ
ＣＣ受託曽号３７０１７として入手可能である。）得ら
れたプラスミドをｐｓＯＤβｌＴ１１と称する。その制
限地図をｉ１５図に示す。 ヒトスーパーオキシドディスムターゼを生産するのに使
用し得るもう１つのプラスミドをｐＳＯＤβ］−ＢＡ２
と称する口そのｐｓＯＤα１３からの構築を第１７図に
示す。 本発明のベクター、例えばｐＲＯ２］１はまたブタある
いはニワ）　ＩＪ成長ホルモンを生産するように処理す
ることもできる０即ち８ｇ４図に示すように、ブタ成長
ホルモンｃＤＮＡをｐｐＧＨ−Ｎｄｅｌ／Ｒ■のＮｄｅ
ｌダイジェストから単点した。得られたｐＧＨ遺伝子を
含むフラグメントをｐ几０２１１のＮｄｅＪダイジェス
トに連結した。得られたプラス；ドはｐ３００８と称し
、Ｅ、ｃｏｌｉ株Ａ２０９７中に入れてＡＴＣＣ受託番
号３９８０４で寄託されている。 本発明の他の実施態様においては、第５図に示Ｂａｎ１
［ダイジェストから２つのニワトリ成長ホルモンフラグ
メントを単離した。２つのＣＧＨフラグメントを、ｍｌ
：ＣＧＨのＮ末端の最初の１８個のアミノ酸をコードす
るリン酸化合成リンカ−に連結したつりンカーの配列は
下記の通りである。 得られたフラグメントを次にｐ几０２１　］（７：Ｎｄ
ｅｌダイジェストに＝ｇし、ｐ５００２と称するプラス
ミドを形成した。その制限地図を第５図に示す。 アポリポプロティンＥ（ｋｐｏＥ）遺伝子はプラスミド
ｐＡｐｏＥ−ＥＸ２からＮｄｅＩ消化により単離される
。ｐＡｐｏＥ−ＥＸ２は第１８図に示す制限地図を有し
、Ｅ、ｃｏｌｉ株Ａ１６４５中に入れてＡ’Ｉ’ＣＣ受
託番号３９７８７で寄託されている。 ＡｐｏＥ遺伝子（ＣＤＮ人）は櫨々のプラスミド中に配
置し得る。好ましい具体例はプラスミドｐＴＶ−１８８
であり、その制限地図をａｊＪ１８図ニ示すっｐＴＶ−
１８８は、ｐＡｐｏＥ−ＥＸ２から単離されたＡＩ）Ｏ
Ｋ遺伝子をプラスミドｐＳＯＤβＩＴ、□の５ｔｕ）ダ
イジェストに連結することにより構築した。ｐＴＶ−１
８８はＴｅｔＥＬフラグメント、ＰＬプロモータ配列、
Ｉ−ラクタマーゼプロモーター及びシャインーダルガー
ノ配列を含む。このプラスミドはＡｐｏＥ囃せプロティ
ンを発現する。 Ａｐｏ、ｌｉ：遺伝子を含むプラスミドのもう１つの好
ましい具体例は第２３図に示した制限地図を有するＩ）
ＳＡＬ１６０−５である。ｐｓ人Ｌ１６０−５はｐＴＶ
］　０４（２）（ＡＴＣＣ受託番号３９３８４）及びプ
ラスミドｐＴＶ−１７０（４２０図参照）から構築した
。人１）ＯＥ遺伝子はｐＴＶ−１７０から単離し、ｐＴ
Ｖ１０４（２）のｐｓｔ１部位のヒト成長ホルモン遺伝
子配列内に挿入した。得られたプラスミドｐＳＡＬ１６
０−５はＡｍｐａｍルミフラグメント　プロモーター配
列を含む。 現状での好ましいベクターの一つは、第１９図に示す制
限地図を有するｐ５７９である。このべばＡ１６３７．
Ａ２６０２．Ａ１５６３゜ＡＩ６４５あるいはＡ２０９
７に、当業者にとっては公知の慣用の形質転換法により
導入し得る０所望のポリペクテド、例えばブタ成長ホル
モンあるいはニワトリ成長ホルモンをコードした遺伝子
をｐ５７９に挿入し得る。 ブタ成長ホルモンＣＤＮＡを、ベクターｐ５７９をＮｄ
ｅＩにより消化し、このオープンストランドをｐ３００
８（ＡＴＣＣ受託番号３９８０４）より得たｐＧＨｃＤ
ＮＡに連結することによって、ｐ５７９に挿入した。得
られたプラスミドをｐ３００９と称し、その制限地図を
５ｇ１】図に示す。 ベクターｐ５７９をＮｄｅ（で消化し、このオープンス
トランドをｐ５００２から得たｃＱＨＣＤＮｋに連結す
ることによって、ニワｌ−ＩＪ成長ホルモンｃｌ）ＮＡ
を２５７９に挿入した。得られたプラスミドを９５００
３と称し、その制限地図を４１２図に示す、［）５００
３はＥ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　Ａ２０９７株
中に入れてＡＴＣＣ受託番号３９７９２で寄託されてい
る０ ヒトアポリポプロティンＥ（ＡｐｏＥ３）産生遺伝子は
おそらくその最終産物のアミノ末端にアミノ酸メチオニ
ンが付加しているであろうが、これもｐ５７９に挿入し
得る０得られたｐＴＶ−１７０と揶するプラスミドの構
築を第２０図に示す。このプラスミドはｐＪＨ２００（
ＡＴＣＣ受託蕾号３９７８３）白米のＣＩＩ　ＩＪボン
ーム結合部位を有する。 プラスミドｐＴｖ　−１７（ｌＡｐｏＥｆｌ伝子（７）
両端を区切っているＮｄｅ１部位の一つを除去すること
によって改変し得る。得られたプラスミドはｐＴＶ−１
９０と称し、′Ｍ２１図に示す。 １）ＴＶ−１７０はまた、Ｃｌｌリボンーム結合部位を
ｐＢＬＡ］　１（ＡＴＣＣ受託番号Ｎ［Ｌ３９７８８）
から単離されたβ−ラクタマーゼプロモータ及びシャイ
ンーダルガーノリボソーム結合部位配列と置き替えるこ
とにより改変し傅る０得られたプラスミドはｐＴＶ−１
９４と称し、第２２図に示した制限地図を有する。 ｐＴＶ−１９０（第２１図）はまた、ヒト人ｐ。 Ｅ３のアナログを生産するように改変することもでき、
このアナログはそのアミノ末端に３いて、成熟ヒトｋｐ
０Ｅ３の配列に結合した、ヒト成長ホルモンの１４個の
アミノ酸のアミン末端配列及びそれに続くメチオニンを
有する。このプラスミドをｐＴＶ−２１４と称し、第２
４図に示した制限地図を有するっ ＡＩ）ＯＥ３遺伝子を含むプラスミドのもう一つの好ま
しい具体例は第２５図に示した制限地図を有するｐｒＶ
ＦＬ２７９−８である。ｐＴＶＲ２７９−８はｐＴｖ１
９０から構築さ、ｆｔたｐＴＶ２６４−４５から構築さ
れる。プラスミドＩ）ＴＶ１９０（第２１図）をＡｖａ
　ｌにより部分的に開裂し、ＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノーフラクメントを使用して°充；Ａ′し、再連結す
る０得られたプラスミドｊ！ｐＴＶｚ６４−４ｓと称し
、ｆｆｉ伝子（７）　３’末端においてＡｖａｉ部位を
欠除している。プラ：）、ミドｐＴＶ２６４−４ｓをＮ
ｄｅｌにより完全に消化し、下記の配列を有するリン酸
化合成リンカ−に連結する。 ５’−ＴＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴ ＡＣＧＡＣ（）ＡＣＱＡＡ丁−５′ 侍られたプラスミドはｐＴＶｋＬ２７９−８と称しＡＴ
ＣＣに受託番号５３２１６でを託されている。 本発明のベクターはまた、ヒト成長ホルモンを産生ずる
ことかできるプラスミドを形成するように工学処理する
こともできる。このようなプラスミドの１つの例はｐＴ
Ｖ３００であり、第２７図に示した制限地図を有してい
る。９ＴＶ３００は、ｐＴＶｉ８（１）をＮｄｅ）によ
り開裂し、ｍ　ｅ　ｔ　’−ｂＱｆ（ＤＮＡを単離し、
それをＮｄａｌで開裂したｔ）５７９（６ｇ１９図）に
連結することによつＴ：４築シタｏ　ｐＴ　Ｖ　１８　
（１）ハ、１９８５年１月２３日公開のヨーロッパ特許
出願公開Ｎ１０１３１８４３入１号あるいは対応する１
９８３年７月１５日出願のアメリカ特肝出ｆｉ５１４．
１８８号（疲用して＠ 本明細書に含する）に記載されているようにして得られ
る。 本発明のベクターはまた、アミン末端かアセチル化され
ていないという点において天然のヒトＳＯＤと異なって
いるヒトＣｕ−７，ｎスーパーオキシドディスムターゼ
のアナログを産生するプラスミドを生成するように工学
処理することもできる。このようなプラスミドは第１６
図に従って構築され、ｐｓＯＤβＩＴＴ−１と称する。 本発明のベクターは岨換えウシ成長ホルモンを産生ずる
プラスミドを生成するよう（ζ処理し得る。 １つの例として、真１ｂＱＨのフェニルアラニン形のア
ミノ末端に付加されたアミノ酸配列ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇ
Ｌｎｉ有するｂＧ）（アナログの生産かあり、このアナ
ログはｒｅｃｂＱＨとも称される。そのようなホルモン
を産生ずるプラスミドｐＧＨ４４は第６図の式に従って
構築されるものであり、人２０９７株に入れてＡＴＣＣ
受託番号３９８０６で寄託されている。 ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｊｎウシ成長ホルモンを生産するも
う一つのプラスミドはｐ９２００である。このプラスミ
ドｐ９ｉ１０はｐＨＧ４４（第６図）に似ているが、７
ンピシリン抵抗性の替りにテトラサイクリン抵抗性を与
える。ｐ９２００の構築は第２６図に示した６　１）Ｉ
（Ｇ４４をＣ：１ａＩ及びｐｓｔｉにより開裂し、ＤＮ
Ａポリメラーゼ■のクレノーフラグメントを使用して”
充填”し、次いで大ＤＮＡフラグメントを単離した。こ
のフラグメントを、ｐＢＲ３２２をＥＣ０ＲＩ及びＡｖ
ａ　１により開裂しＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフ
ラグメントを使用して”充填”するととｌζより単離し
たｐＢＲ３２２のテトラサイクリン抵抗性遺伝子を含む
ＤＮＡフラグメントに連結した。得られたプラスミ）”
ｐ９２０ｏはＡＴＣＣに受託番号５３２］５で寄託され
ている。 もう一つの例は、天然ｂＧＨのフェニルアラニン形のア
ミノ末端につけ加えられたアミノ葭メチオニンを有する
ｂＧＨアナログの生殖であるっこのようなホルモンを産
生ずるプラスミドｐＳＡＬ５６００−１は第１０図に示
したように＃築した。 プラスミドｐ７２００−２２もこのようなホルモンを産
生ずる。このプラスミド１′ｉ８７図に示した制限地図
を有する。 現状で好ましいベクターの一つは、（：：Ａａ１部位に
クローニングされたＣ１４３４フラグメントを含有する
Ｊ）ＮＡ配列を持ったベクターｐ５７９である。ｐ５７
９は第１９図に示した制限地図を有する。 天然のウシ成長ホルモンのフェニルアラニン形のアミン
末端につけ加えられたｍｅｔ−ａＳｐ−ｇｌｎのアミノ
酸配列を有するウシ成長ホルモンのアナログ（ｒｅｃ−
ウシ成長ホルモンとも称する）を発現するプラスミドを
構築した。このようなプラスミドの１つはｐＨ０５０で
あり、第６図に示した制限地図を有する。このプラスミ
ドは入１６４５株（λｉ４３４ｃｌ−ｍｉｎｉ　Ｔｎｌ
Ｏ）中に入れてＡＴＣＣ受託番号３７８０５でアメリカ
ンタイプカルチ斗アコレクションに寄託されている。 もう一つのこのようなプラスミドはｐＳＡＬ−２１０／
４であり、第９図に示した制限地図を有する。 現状での好ましいベクターの１つはプラスミド１）８３
００−１ＯＡからｍｅｔ−ｐｈｅ　　ｂＧＨを除去する
ことによって得られる。このプラスミドル８３００−１
０人は第７図に示した制限地図を有し、Ａ２０９７株中
に入れてＡＴＣＣ受託番号３９７８５でアメリカンタイ
プカルチュアコレクションに寄託されている０ 現状でのもう一つの好ましいベクターは、プラスミドｐ
ＳＡＬ−１７０／１０からｒｅｃ　　ｂＧ）（遺伝子を
除去して得られる。このプラスミド１）８ＡＬ−１７０
／ｚＯの制限地図を第８図に示した。 現状での好ましい第３のベクターはプラスミド１）ＳＡ
Ｌ−２１０／４からｒｅｃ　　ｂＱＨ遺伝子を除去して
得られる。このプラスミドｐＳＡ−Ｌ−２］０／４の制
限地図を第９図に示したつ本発明のベクターは、宿主に
導入することによりウシ成長ホルモンのアナログを産生
ずるプラスミドを生成するようにも工学処理し得る。ｐ
８３００−１０Ａ（ＡＴＣＣ受託番号３９７８５）はこ
のようなプラスミドの１例であるが、第７図に示したよ
うにして構築した。それにより生産されたこのアナログ
は、天然ｂＧＨのフェニルアラニン形のアミノ末端につ
け加えられたメチオニン残基を有する。 他のプラスミドも、天然ｂＱＨのフェニルアラニン形の
Ｎ末端につけ加えられたｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｔｎアミノ
酸配列配列するアナログを産生ずる。それ等のプラスミ
ドにはｐＳＡＬ−１３０／４（第８図）、Ｉ）ＳＡＬ−
］　７０／］’０（第８図）及びｐＳＡＬ−２１０／４
　（Ａ９図）が包含されるＯ 同じ方法により、プラスミドの第２制限酵素部位に２い
て所望のポリペプチドをコードした遺伝子に置きかえる
ことにより他のプラスミドを講義し得る。 種々の宿主ベクター系さしては、［、ｃｏｌｉＡ１６３
７　、Ａ１６４５．Ａ２６０６．入２０９７あるいはプ
ラスミドか（１４３４フラグメントを含んでいない場合
ｉ！Ａ１５６３及びプラスミドがＣｌ４３４フラグメン
トを含む場合はＡ１６４５株（ｉ４３４ｃｉ−ｍｉｎｉ
　　ＴｎｉＯ）か包含される。本発明の宿主ベクター系
としては、例えばＡ４２００．入４２５５のような原栄
養体Ｅ、ｃｏｌｉ及び例えばＡ４３４６のようなビオチ
ン非依存宿主ベクター系か包含される口重発明の溶解性
宿主ベクター系としては宿主かＡ４０４８．％にＡ３１
】１であるものが包含される。 本明細書に記載する宿主ベクター系及びプラスミドは、
例えばウシ、ブタ、ニワトリ及びヒトの成長ホルモン、
ヒトスーパーオキシドデイズムターゼ及びヒトアポリポ
プロティンＥのような異なるポリペプチドを生産するの
に使用できる口そうするためには宿主ベクター系をポリ
ペプチドを生産し得る適当条件下で成長させ、次いでポ
リペプチドを回収する。 宿主ベクター系の至適生育条件は約４２℃に適当な時間
を保つことである０望ましくは、ヒトアポリポプロティ
ンＥを生産しようとするもの以外の全ての宿主ベクター
系に対しては４２℃で生育させる時間は約１〜５時間で
ある。ヒトアポリポプロティンＥを生産しようとする宿
主ベクター系の場合の生育時間は望ましくは約１５分で
ある０至適培地はカゼイン加水分解物を含む。 上記の方法により多数のｂＱＨ、ｐＱＨ、ＣＧＨｈＧＨ
，ＡｐｏＥ及びＳＯＤアナログを調製したＯＮ末端にお
ける変化以外は天然ＡＩ）ＯＥのものと同一のアミノ酸
配列を有するＡｐｏＥアナログをｇ４製した。例として
は下記のものがある。 １）天然ヒトアポリポプロティンＥのＮ末端に付は加え
られたアミノ酸メチオニン、 ２）ヒトスーパーオキシドディスムターゼのＮ末端の４
２のアミノ酸配列、次いでメチオニンをＮ末端に付加さ
れた天然ヒトアポリポプロティンＥ。 ３）Ｎ末端の１１個のアミノ酸を取り除き、成熟ヒト成
長ホルモンのＮ末端の４５個のアミノ酸配列とそれに続
くメチオニンに置き換えた天然ヒトアポリポプロティン
、 ４）ヒト成長ホルモンのＮ末端の１４個のアミノ酸、続
いてメチオニンをＮ末端に結合した天然ヒトアポリポプ
ロティンＥのアミノ酸配列、及び ５）Ｎ末端にｍｅ　ｔ−１ｅｕ−ｔｅｕ−ｔｅｕ−ｍｅ
ｔのアミノ酸配列を結合した天然ヒトアポリポプロティ
ンＥ３゜ ｖ４製したｐＧＨアナログでは天然ブタ成長ホルモンの
Ｎ末端にアミノ酸メチオニンが結合していた０ 天然ニワトリ成長ホルモンのＮ末端にアミノ酸メチオニ
ンが結合したｃＧＨアナログをＮ１４Ｈした。 天然ヒト成長ホルモンの最初の１３個のアミノ酸が欠失
されているｈＱＨアナログ、即ちｍｅｔ”１１０Ｈを調
製した。 Ｎ末端における変化以外は天然ＳＯＤと同一のアミノ酸
配列を有するＳＯＤアナログを調製したつ例としては下
記のものかある。 】）アセチル化されていない天然ヒｌ−８ＯＤ。 及び ２）アセチル化及びグリコジル化されていない天然ヒト
ｓ　Ｏｏ　。 これ等のＳＯＤアナログは陽子（プロトン）の存在下で
超酸化物（スーパーオキシド）アニオンの不均化（ｄｉ
ｓｍｕｔａｔｉｏｎ　）あるいは等価（ｕｎｉｖａｌｅ
ｒ環元を触媒して下記式に従い過酸化水素を生成する口 ０Ｄ ２０□：　＋　２　Ｈ＋−−→Ｈ２０２＋０□ｂＱＪ（
、ｃＱＨあるいはｐＧＨアナログの一つ以上の有効を及
び適当な牛、ヤリアーを含有する獣医学的組成物を調製
し得る０キヤリアーは当業者にとって公仰のものである
。アナログは直接、あるいは組成物の形状で、ミルクや
内の生産を増加させるためにウシあるいはブタに投与し
たり、肉の生産を増加させるためにニワトリに投与し得
る０ＡｐｏＥあるいはｈＧＨのアナログの一つ以上の有
効量及び適当なキャリアーを含有する薬剤（医薬）組成
物をｒＡ製し得る。キャリアーは当業者にとって公昶の
ものである０アナログは直接あるいは組成物の形状で、
例えばＡｐＯＥの場合はＡｐＯＥ生産不全あるいは動脈
硬化（ａｔｈｅｒｉｏｓｃｅｌｅｒｏｓｉｓ　）の患者
の治療のために、ｂＱＨの場合はｈＱＨ生産不全の患者
の治療のためにヒトに投与し得る。 ＳＯＤあるいは一櫨以上のＳＯＤアナログの有効量及び
適当なキャリアーを含有する獣医学的及び薬剤組成物も
調製し得る０キヤリアーは当業者にとって公知のもので
ある。ＳＯＤあるいはアナログは直接あるいは組成物の
形状で、例えば炎症羅患々者の治療や、全体的虚血症（
ｇｚｏｂｏｌｉｓｃｈｅｍｉａ　）あるいは腎移植のよ
うな臓器移植の後の再潅注における酸素−フリーラジカ
ルによる損傷の軽減のために、動物あるいはヒトに投与
できる。ＳＯＤあるいはアナログはまた、直妥あるいは
組成物の形状で、例えば切除の後の潅注におけるフリー
ラジカル酸素による単離臓器の損傷を４！減し、角膜の
ような臓器の生存時間（ｓｕｒｖｉｖａｌｔｉｍｅ）を
延長するために、単離臓器潅注媒体に加えることもでき
る。さらにはＳＯＤあるいはアナログは神経学的湯害の
軽減にも使用できる。 ＃素的活性真核生物スーパーオキシドディスムターゼ（
ＳＯＤ）またはそのアナログを／ｗｉＭ細胞中で産生ず
る方法を発見した。このバクテリア（〜ハン細胞かスー
パーオキシドディスムターゼあるいはアナログをコード
したｐＮＡ配列を含有しておりかつ発現し得る。該方法
はそのバクテリア細胞を適当な条件下、適当な生産媒地
中に生育維持することから成る。生産培地中には、濃度
が約２　ｐｐｍ以上となるようなＣｕ＋十量を添加する
。 バクテリア細胞は、組換えＤＮ人技術により真核細胞ス
ーパーオキシドディスムターゼをコードしたＤＮＡ配列
を導入できるものならば何でもよい。該バクテリアはこ
のＪ）ＮＡ配列を発現し、タンパク生成物を生産できな
ければならない０バクテリアの檀及び株により、至適条
件及び生産培地は異なる。 バクテリア細胞は例えばプラスミドのようなベクターｐ
ＮＡ分子中に、スーパーオキシドディスムターゼあるい
はアナログをコードするＪ）ＮＡｉｄ列を含有してもよ
い。ベクターあるいはプラスミドは、組換え、［）ＮＡ
技術によりＳＯＤをコードする配列を分子内の適当な位
置に組み込むように構築される。 本発明の好ましい具体例においてはバクテリア細胞は３
４；５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ細胞である。 Ｅ、ｃｏｌｉの好ましい株はＡ１６４５株である。 本発明のＥ、ｃｏｌｉ細胞はＳＯＤあるいはそのアナロ
グをコードするプラスミドを含有する。本発明の好まし
い具体例においてはＳＯＤはヒトスーパーオキシドディ
スムターゼあるいはそのアナログである。 本発明の好ましい具体５例は、プラスミドｐｓＯＤβ１
　＃　ｐ　ｓ　ＯＤα２．９ＳＯＤＩＴ　１　］　、　
ｐＳＯＤβ】−８人２あるいはｐｓＯＤβＩＴＴＩを含
有するｐ、ｃｏｌｉ株に関する。これ等のプラスミドの
溝築方法は前記図面の説明において記載し、プラスミド
自体は後記実施例３に記載した。これ等のプラスミドは
通常の当業者であれば利用可能な出発物質から構築し得
る。真１　ａ　Ｐａスーパーオキシドディスムターゼを
コードするプラスミドを構築するのに有用な撞々のプラ
スミドを含有するｐ、ｃｏｌｉ株は、特許手続上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に
従い、アメリカンタイプ力ルチュアコレクション（ロッ
クビル、メリーランド２０８５２）に寄託しである。こ
れ等のプラスミドのＡＴＣＣ受託番号は、ｐＢ几ＭがＡ
ＴＣＣ３７２８３、ｐｓＯＤα２がＡ’ｆ’ｃｃ３９７
８６、ｐＢ几３２２かＡＴＣＣ３７０１７、ｐＢＬＡｌ
ｌかＡＴＣＣ３９７８８、Ｉ）Ｊ）（２００がＡＴＣＣ
３９７８３、ｐｐｓＩかＡＴＣＣ３９８０７である。 本発明の１つの特定具体例においては、プラスミドｐｓ
ＯＤα２を含有するＥ、ｃｏｌｉ　　Ａ２０９７株によ
り酵素的活性ヒトスーパーオキシＰディスムターゼアナ
ログを産生ずる。この細胞はアメリカン　タイプ　カル
チャー　コレクションに寄託番号ａ９７８６で寄託され
ている◎バクテリア細胞の適当な産生培地は、例えばカ
ゼイン加水分解物あるいはＬＢ（ＬｕｒｉａＢｒｏｔｈ
）培地のような許容可能成長培地であればどのようなも
のでもよい。適当な生育条件はＥ。 ｃｏｌｉの株及びそれに含まれるプラスミドにより変化
し、例えばプラスミドｐｓＯＤβ１Ｔ１１を含有するＥ
、ｃｏｌｉ　　Ａ１６４５は４２℃で誘導し、その温度
で約１〜５時間維持する。接種物の成育、生産段階前で
の培養の所望密度までの生育及び生産期間中の培養の維
持に対する温度、時間、攪拌及び通気の至適条件は後記
実施例２６７ζ記載した。 酵素的活性ＳＯＤの生成に必要なＣｕ　　イオンの培地
中の磯度は、使用培地のタイプにより変化する。カゼイ
ン加水分解物培地の場合、２００ｐｐＩＩのＣｕ　　　
イオン寝度が有効であることが判明した。 ＬＢ培地の場合、Ｃｕ　　　（ＢＪ度は７５四が有効で
あることが判明した。全ての複合型の成長培地において
は、培地中のＣｕ　　＠度が約５０〜ｚｓｏｐ１ｍであ
ることが好ましい。 殆んどの真核細胞スーパーオキシド９デイスムターゼは
ｃｕ／ｚｎ金属タン金属タンパ石質本発明の一つの特定
具体例においては、培地中の蹟度が約２に１１以上とな
るように添加物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）としてＺｎ　
　　を加える。本発明の好ましい具体例においては、Ｃ
ｕ　　　及びｚｎ　　の一度は０．８ｉ／ＩのＣｕ５Ｏ
ａ　＃５ＨｚＯ及び１０ｒｎｇ／ノのｚｎｓｏ４・７■
２０を加えることにより補給する。 適切な保存、培養、接種及び生産培地の特定成分は変化
し得るが、当業者にとっては公知のものである。至適培
地の特定例は実施例２６に記載した。 本発明は、本発明の方法に従って生成したバクテリア細
胞中の精製された酵素的活性Ｘ杉Ｍｉ胞ＳＯＤあるいは
そのアナログの回収方法にも係る。 培養物を急冷した後、バクテリア細胞を先ず生産培地か
ら単離する。細胞の単離は、遠心分離や口過のように細
胞を破壊しない方法であれば何によっても行なえる。次
にＩＩＩｌｌ胞をｐＨ約７．０〜約８．０の適当な溶液
に懸濁する。ｐＨが約７．８の５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム溶液を使用することが好ましい。 プレンダーあるいは細胞破砕機のような適当な手段によ
り細胞壁を破棄し、得られた均一＠濁液を至適条件下で
超音波処理する。超音波処理は連続流型セルを用いて行
なう。得られた超音波処理溶液を適当な条件下で遠心分
離し、細胞砕片と上清タンパク質溶液を分離する。 次に上清液を約２時間、約６５℃に加熱し、冷却して先
の遠心分離ステップと同じ条件において遠心分離して上
清液として清澄タンパク質溶液を得る。次に上清液を適
当な容量に磯縮する。例えば分子量１０．０００カツト
オフの限外口過装置を用いて１ｊに譲縮する。 次に一縮タンパク質溶液を、Ｉ）Ｈを約７．０〜約８．
０に平衡させた適当なアニオン交換物質上のイオン交換
クロマトグラフィーにかける。ｐＨ約７．８の１５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムバッファーにより平衡化したＤＩＡ
Ｉ−セファセル（５ｅｐｈａｃｅｌ　）カラム上でクロ
マトグラフィーを行なうことが好ましい。得られたスー
パーオキシドディスムターゼあるいはアナログを含有す
る通過溶液を収集し、適当な容量に凝縮してｐＨ約７．
０〜約８．０のバッファー溶液に対して透析する。この
操作は限外口過装置中でｐＨ約７．８の２０ｍＭ１−リ
スーＨＣｌ溶液に対して行なうことができる。 この噴度溶液を次に、ｐＨ約７．０〜約８．０に平衡化
した適当なアニオン交換物質上のイオン交換クロマトグ
ラフィーにかける。ｐＨ約７．８の２０ｍＭ）リス−Ｈ
Ｃｊにより平衡化したＱｔＢ−セファロースカラムが適
当である。アニオン交換物質に結合したタンパク質を、
例えばｐＨ７，８の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ中の０〜２
００ｍＭＮａＣｊのような適当な塩勾配にかける。得ら
れたＳＯＤあるいはアナログを含有するフラグ２３４画
分）を回収し、例えば限外口過装置により濃縮し、蒸留
水に対して透析し、適当なバッファーによりｐＨを約４
．０〜約５・Ｏに調整する。好ましい具体例においては
、対象溶液はｐＨ約４．８の１Ｍ酢酸ナトリウムを加え
て１００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液とした。 この緩衝した溶液を今度はカチオン交換物質のイオン交
換クロマトグラフィーにかける。ｐＨ約４．７の１００
ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーにより平衡化したＣＭ−
セファロースカラムが適当である。カチオン交換物質に
結合したタンパク質を、例えばｐＨ４，７の１００ｍＭ
酢酸ナトリウム中の１００〜５００ｍＭ　　ＮａＣｊの
ような適当な塩勾配にかけ、得られるｎＩ製ＳＯＤある
いはアナログを含有するフラクションを回収する。 精製ＳＯＤを含有するフラクションは例えば限外口過に
よって噛縮しかつ貯蔵のために凍結乾燥を行なってもよ
い。 本発明はまた、本発明の方法により生産及び精製された
ｎ製酵素的活性真核細胞スーパーオキシド９デイスムタ
ーゼあるいはそのアナログにも係る。 本発明の好ましい具体例は、本発明の方法により調製及
び精製された精製酵素的活性ヒトスーツ５−オキシドデ
ィスムターゼに係る。 （以下余白） 実施例 以下の実施例は本発明の理解を助けるために提示された
ものであシ、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発
明の範囲を限定すると解釈されるべきものではない。実
施例においては、ベクターの構築、該当ポリペプチドを
コードする遺伝子のベクター内挿入、得られたプラスミ
ドの細菌宿主内導入等のために使用され九従来方法につ
いて詳細に説明していないが、これらの方法は当業者に
公知であ）、以下の如き多数の刊行物に記載されている
。 で、マニアテイス（Ｔ、Ｍａｎｌ畠５ｔｓ）、Ｂ、Ｆ、
７リツチ（Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔａｅｈ）及びＪ、ナンプル
ーク（Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキエツークｔｓ−
二ｙグ；アツメラトリーマ＝ｚアル（ＭｏＩｍ＠ｔ＋ｌ
ａｎ　Ｃｌｏｎｌｎｇ；人Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎ＋ｘａｌ）、コールドスグリングハーバーラゲラトリ
ー（Ｃｏｌｄ　８ｐｒｌｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、−ニーヨーク（１９８２）。 メソッドインエンザイそロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
Ｅｎｊｙｔｎｏｌｏｇｙ）、６５巻、′ニュークレイツ
クアンド（バー）　１　）　（Ｎｕａｌｅｉｅ　Ａａｌ
ｄｓ）”、ローレンスグロスマン（Ｌａｗｒ＠ｒＬｃｓ
　Ｇｒｏａｓｍａｎ）及びキビ−モルダブ（Ｋｌマｌ＠
　ＭｏＩｄｓマ・）編、ア介デミツクプレス（人ｃａｄ
＊ｍｉｅ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８０）。 メソッドインエンザイモロジー、６８巻、１リコンビナ
ントＤ弘（Ｒｅｃｏｍｂｌｎａｎｔ　ＤＮＡ）　　、レ
イク−（Ｒａｙ　Ｗｕ）　＠、アカデミツクプレス、ニ
ューヨーク（１９８１）。 メソッドインエンザイモロジー、１００％、１リコンビ
ナントＤＮＡ　（パートａ）”ルイクー、ローレンスグ
ロスマン及びキビ−モルダブ編、アカテミックプレス、
ニューヨーク（１９８３）。 メソッドインエンザイモロジー、１０１巻、１リコンビ
ナントＤＮ人（パートＣ）″、レイク−、ローレンスグ
ロスマン及ヒキビーモルｆフｌｉＡ、７カテミツクプレ
ス、二ニーヨーク（１９８３）。 プリンシプルズオプジーンマニビエレーション、マンイ
ントロダクションツージエネテイツクエンジニアリング
（Ｐｒｉｎｃｉｐｌ＠ｓ　ｏｆ　Ｇ＠ｎ＠Ｍａｎｌｐｕ
ｌａ−ｔｌｏｎ、　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　
ｔｏ　Ｇｓｍｅｔｉａ　ｇｎｇｌｎ−ｅｅｒｉｎｇ）、
第２版、Ｒ，Ｗ、オールド（Ｒ，ｗ、ｏｔａ）及びＳ、
Ｂ、プリムローズ（Ｓ、Ｂ、Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）Ｉｉ、
エニパーシティーオプカルフオルニアプレス（Ｕｎｉ−
ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｌｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅ
ｓｓ）　（１９８１）。 Ｈ，Ｖ、パーナート（Ｈ，Ｖ、Ｂｅｒｎａｒｄ）他、ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）　（１９７ｑ　）　５　、５９゜人、
Ｂ、オフベ／ハイム（人、Ｂ、Ｏｐｐｓｎｈｓｉｍ　）
他、１１モル、パイオル（Ｊ、ＭｏＩ．Ｂｌｏｌ）　（
１９８２）１５８．３２７゜ Ｅ、ルモー（Ｅ、Ｒ＠ｍａｕｔ）他、ジー７（１９８１
）１５．８１゜ （以下全白） 実施例１ 発現ベクタ一 本明細書中で使用される「発現ベクター」という用語は
、細菌、特に大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｌ）中で所望の遺伝子
を発現させるのに有用な１群のプラスミドを意味する。 所望遺伝子を発現ベクター内に挿入してもよく、又は発
現ベクターのプロモーターを切除して所望遺伝子の手前
【入れてもよい。 ｐＪＩ（２００ 第２図に示したｐＪＨ２００は、マルチコピー　グラス
ミド　ｐＢ１３２２に挿入されたＤＮ人から成る。 λＤＮＡの顕著な特徴は、λＤＮＡがλＰＬ７′ロモー
ター、左側のＮ利用部位（ｎｕｔＬ）　、　Ｋｅｏ　Ｒ
Ｉ制限部位、−〇終結部位、それに続くＣＩＩリボソー
ム結合部位およびＮｄｅＩ制限部位の一部（“あるＡＴ
Ｇ開始コドンを含むことである。第２図に示すように、
Ｎｄ・Ｉ制限部位の下んの１１６塩基対は４個の単一（
非反復ｕｎｌｑｕ＊　）制限部位である。これらの制限
部位によシ所望遺伝子が容易に挿入されうる。 ＣＢ’）ボソーム結合部位は天然のリボソーム結合部位
とただ１個の点変異で異なる。 ＰＪＨ２００はｐＯＧｌｌ（ニー、オフベンハイム（Ａ
、０ｐｐａｒｉ　ｈｅｌｍ）ら、ジュー６モル、パイオ
ル。 （Ｊ、Ｍｏｌ　、Ｂｌｏｌ）、（１９８２）１５８；３
２７）から構築され、ｐＯＧｌｌ中に認められたＣ（ｌ
ＵＭソーム結合部位とλＰＬプロモーターとを含む。し
かしながら、λＰ、グロプロターとＣ１ｌリボンーム結
合部位の間に位置するλＤＮ人の３４６ｂｐは欠失して
おり、Ｅｅｏ　Ｒ１制限部位がこれら２つの要素間の接
合点に導入されている。また、マルチ制限部位リンカ−
をリボソーム結合部位の１下流ＩＣ（ｄｏｗｎｓ−ｔｒ
・ａｆｆｌ）”挿入した。ｐＪＥｆ２００はアメリカン
・タイグーカ化チャー・コレクションに人ＴＣＣＮｏ。 ３９７８３で寄託されている。 Ｒ０２１１ 第２図に示し、前記図面の説明中で詳細【記載したよう
にｐＲＯ２１１は、ｐＪＨ２００から２個のＮｄ・Ｉ制
限部位の１個を脱離させて誘導された。 維持させてもよい。適当な宿主の最も重要な特徴は、こ
の宿主が熱感受性リグレツテ−ｅｌ　８５７および抗転
写終結Ｎタンパクを与えることである。 〔エム、イー、ゴツテスマン（ＭＪ、Ｇｏｔｔ＊ｓｍａ
ｍ）ら、ジュー。七ル、バイオロ、　（Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂ
Ａｏｌ、）、（１９８０）　１４０　：　５７−７５　
）。 ｐＲ０２１１は従来の発現ベクターに比して下記する多
くの利点を有する。 １、発現レベルが極めて高いこと このベクターは、総細胞タンパクの３５チという高レベ
ルで大腸菌（Ｅ、−ｃｏｉｌ）中に外来タンパクを発現
させることができる。 ２、　リボソーム結合部位を１換しうろことｐＲ０２１
１は、リボソーム結合部位の”上流に”位置する非反復
Ｅｃａ　１１部位とリボソーム結合部位の１下流”に位
置する１個のＮｄｅ　Ｉ部位とを含む。従って、リボソ
ーム結合部位の境界は２個の非反復制限部位である。こ
うして、プラスミドの他の特徴を変えることなく、現在
のリボソーム結合部位（λＣＩ！リボソーム結合部位）
を簡単に切除して他の天然あるいは合成ＩＪ　、％’ソ
ーム結合部位のほとんどいずれ−とも置換することがで
きる。これは所望のポリペプチドの至適発現を大きく助
長する。 ３、発現を熱感応的に調節し得ること λＰＬプロモーターは、　ＣＨリグレソテーが結合して
いるときは不活性である。ｃＩ　８５７リグレツサーは
熱感受性である。即ち、１ご４リプレツサーは３０℃で
はプロモーターに結合するが、４２°０で失活する。従
って、発酵温度を４２°ＯＩＣ上げることによシ宿主細
菌で所望タンパクの産生が誘発（誘導）される。 そのような系は以下の利点を有する。 （＆）　　大腸菌（Ｅｇｃｈｇｒｉａｈｉａ　ｃｏｌｔ
）に毒性の外来タンパクを発酵過程の遅くに産生させる
ことがでしかつタンパク分解を回避しうる。〔チェンワ
イ、イー（Ｃｈ＠ｎｇ、Ｙ、Ｅ、）ら、ジー”（Ｇａｎ
＠）（１９８１）　１４　、１２１　）。従って、λＰ
Ｌの如き厳密に調節されたプロモーターを使用する”瞬
間的”産生元通は、連続的な低レベル産生よシ好ましい
であろう。 ４、単純化された誘発プロトコール 本願並びに係属中の米国特許出願第５１４，１８８号に
記載されているプラスミドによるタンパク産生け、熱感
受性上１８５７リプレツサーにより調節要とされる誘発
プロトコールは、４２℃における訪発島それに続く３８
υにおける増殖を含んでいた。対照的に、　べ／／−ｐ
ＪＨ２００，ｐＲＯ２１１あるいはそれらのプラスミド
誘導体を使用するときには、タンパク合成の至適誘発は
４２°０における誘発と同温度（４２°０）における増
殖とを含んでいた。これにより、発酵器を冷却する必要
がなくなる。 ５、コピー数 ｐＪＨ２００およびｐＲＯ２１１中のλＰ２　プロモー
ターは、大腸菌（旦、四）中に存在するλ形質導入７１
−ジベクターよりも高いコピー数をプラスミド上で示し
た。これＫよシ発現レベルが高くなる。 ６、リボソーム結合部位と開始コドン この発現ベクターは、強力な原核生物リボン二ム結合部
位（ＲＢＳ）と翻訳開始コドン（ＡＴＧ　）とを含む。 従って、いずれの真核遺伝子も開始コドンを付加せずに
クローシ層れうる。また、有効なＲＢＳは発現レベルを
増加させる。リボソーム結合部位はλＣｆｌリボソーム
結合部位である。リボソーム結合部位の配列は次の通シ
である。 ’ｌ”ＡＡＧＧＡＡＧＴＡｃＴＴＡｃＡＴλＴＴＣＣＴ
ＴＣＡＴＧＡＡＴＧＴＡ １個の塩基対が野生型λにみられるリボソーム結合部位
と異なる。 ７、適当な制限部位 発現ベクターは唯一のＮｄｅ　Ｉ制限部位を有し、前記
部位内にＡＴＧ開始コドンを含む。これによシ、所望の
遺伝子を適正に位置付けることができる。 唯一のＮｄｅ　Ｉ部位がリボソーム結合部位の直後にみ
とめられる。 Ｎｄ・工制限部位の下流１（配置された１１６塩基対は
、次の項番で４個の他の非反復制限部位である。シ已■
、肋Ｉｌｌ　Ｉ、　［（ｌす■および９す１゜非反復制
限部位が複数個あるため、所望の遺伝子が容易に挿入さ
れうる。 ９、　　ｎｕｔ部位 宿主から与えられるＮタンパクは発現ベクター上のＮｕ
ｔ部位に結合し、それによってｔ１１部位での転写終結
あるいはクローン化された遺伝子内での早期転写終結が
阻止される。 菌株 所望のベクターおよびプラスミドに対する適切な宿主は
、形質転換に適した大腸菌（≧、江見）の菌株であり、
前記菌株は人１６３７．人２６０２．人１５６３、λ１
６４５（ｃ６００　ｒ−ｍ”ｇａｌ”ｔｈｒ−１ｅｕ−
１ａｃ−ｂｉ（λｃ１８５７ΔＩ（１ΔＢａｍＨＩ　Ｎ
”））および人２０９７（人１６４５１ａａ　ｔ）ｊ５
２１　ｐｒａＣ：：ＴｎｌＯ）を含む。 実施例２ ｐＲＯ１２ ｐＲＯ１２の構築は、第２図に示されかつ図面の説明に
記載されている。第１図に示し九構築手順を有するＰＡ
Ｌ５００からのｂＧＨｃＤＮ＆をｐＲＯ２１１に挿入す
る前１’Ｃ処理して、適切な解読枠とＮｄｅ　ｌ制限部
位を作成した。 ｐＲ０１２を、当業者に公知の方法を用いる形メ転換【
よって大腸ｉ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏｌｔ）
人１６４５株に導入した。この沼株は増殖および誘発さ
れるとクク成長ホルモン（ｂＧＨ）のアナログを産生ず
る。前記ｂＧＨアナログは、フェニルアラニン型天然ｂ
ＧＨのＮ−末端に付加されたアミノ３配列ｍｅｔ−ａａ
ｐ−ｇｉｎを有する。ｐＲＯ１２により産生されるｂＧ
Ｈアナログの量は、クーマシープルー染色ＳＤＳポリア
クリルアミドゲルを走査して計算すｐＳＡＬ５２００−
６　　の構築は第３図に示されかつ図面の説明に記載さ
れている。ａｌ・ｔ−ｐｈ＠ｂＧＨをコードするＤＮＡ
配列を、ｐＲＯ１２をＰｖｕ　１１およびＮｄｅ　ｌで
制限し、１０塩基対が重複したセグメントを有する２個
の一重鎖合成オリゴヌクレオチドから形成された合成り
ＮＡ７ラグメント（１！ｌ’ｒ片）を挿入して得た。 ｐ３ＡＬ　５２００−６を、公知の方法を使用する形質
に換によって大腸菌（Ｅｇｅｈａｒｉｃ旧１　ＱＯ旦）
人１６４５株に４人した。この菌株は、増殖および誘発
で、ｐｈｅ　ｂＧＨのアミノ末端に付加されたメチオニ
ンを有するｂＧＨアナログを産生ずる。ｐＳＡＬ　５２
００−６によシ産生されるｍｅｔ−ｐｈｉ　ｂＧＨアナ
ログの１は、クーマシー染色ＳＯＳポリアクリルアミド
ゲルを走査して計算すると、細菌によシ産生された総タ
ンパクの約１８−２０％であった。菌株を増殖させ、産
生されたｂＧＴ（を回収しそしてｂＧＨを精製するため
に便用した方法は、ｐｍ１２からのｂａａｍ生のための
実施例５に後記する方法と同じである。 Ｉ　　ｐ３００８ ｐ３００８の構築は、第４因に示されかつ図面の説明に
記載されている。ｐ３００８は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションに人ＴＣＣＮｏ。 ３９８０４で寄託されている。ｍｅｔ−ｐｈｅ　ｐＧＨ
（豚成長ホルモン）をコードするＤＮＡ配列を、ｐＧＨ
ｃＤＮ＆をｐＲＯ２１１に挿入して得た。 ｐ３００８を、当業者に公知の方法を用いる形質転換に
より大腸Ｗ（Ｅｓｅｈｅｒｌｅｈｌａ　ｅｏｌｌ）菌株
人１６４５に導入した。この菌株は増殖および誘発によ
り、ｐｈ・ｐＧＨのアミノ末端に付加されたメチオニン
を有するｐＧＨを産生する。ｐ３００８　Ｋより産生さ
れるｍ＠ｔ−ｐｈａ　ｐＧＨアナログの量は、クーマシ
ーＳ色３ＤＳポリアクリルアミドゲルを走査して計算す
ると、細菌によシ産生される総タンパクの約Σ １８−２０チであった。薗ｉ殖させ、産生されたｐＧＨ
を回収しかつｐＧＨを精製するために使用した方法は、
ｐＲＯ１２からのｂＧＨ産生のための実施例５に後記す
る方法と同じであった。 Ｎ　　ｐ５００２ Ｐ４Ｏ１０の構築は第５図に示されかつ図面の説明に記
載されている。ｍｅｔ−ｐｈ＠ｃＧＨにワトリ成長ホル
モン）をコードするＤＮＡ配列を、ｃＧＨａＤＮ人をｐ
Ｒ０２１１に挿入し、次いで遺伝子の５′末端を合成オ
リゴヌクレオチドリンカーで完成させることによシ得た
。 ｐ５００２を、公知の方法を用いる形質転換によシ大腸
菌（ＦＪｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）人１６４５
株に挿入した。この菌株は増殖および誘発によシ、ｐｈ
・ｃＧＨのアミノ末端に付加されたメチオニンを有する
ａＧＨを産生する。ｐ５００２により産生されたｍｅｔ
−ｐｈ＠ｃＧＨの景は、クーマシー染色ＳＤ８ポリアク
リルアミドゲルを走査して計算すると、細菌によシ産生
された総タンパクの約１８−２０％であった。菌株を増
殖させ、産生されたｃＧＨを回収し、ｅＧＨｆｌｒ：精
製するために使用された方法は、ｐＲＯ１２からのｂＧ
Ｈ産生のための実施例５に後記する方法と同じである。 表　　　！ ｐＲｅｅ　　２／３　　　　人１６３７　　２３　　　
　　ＡｍｐＲｐＲｏｌｌ　　　　　　　人１６３７　　
２８　　　　　人ｍｐＲｐＲ０１２人１６４５　　　３
０−３６　　　人ｍｐＨｐＨＧ４４　　　　　　　人２
０９７　　　３７−４２　　　人ｍｐ”　＋Ｔ＋７２ｐ
Ｉ（Ｇ５０　　　　　　　Ａ１６４５　　　３７−４２
　　人ｍｐＲＩＴ、Ｔ２；ｃＩ４３４ｐ８ＡＬ−１３０
１５人１６４５　　３９−４４　　Ａｍｐ”；ＣＨＣＮ
；ＴＩＴｚｐＳＡＬ−１７０４０Ａ１６４５　　４０−
４６　　　Ｔ＠ｔ”；ＣＨＣＮ；Ｔ、Ｔ２１、表１才、
ｐＲ０２１１由来の各種プラスミドのｂＧＨ発現レベル
を示す。プラスミドｐＲｓｃ　２／３およびｐＲＯｌｌ
は、１９８３年７月１５日出願の係属中の米国特許出Ｊ
［第５１４，１８８号に記載されている。 ２、産生されたｂＧＨＯ量ｔす化バクテリアプロティン
に対するパーセンテージで表示した。 略号 ＣＨＣＮ＝＋ｌｌ成為イコビー数（ｃｏｎａｔｌｔｕｔ
ｉｖｅ　ｈｉｇｈ　ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒ） 人ｍｐ８＝アンビアリン耐性 Ｔｅ　ｔ”　＝ナト２サイクリン耐性 Ｔ、Ｔ２＝転写終結配列 ｃ　Ｉ　４ｓ’　＝フ？　スミト安定化ｃ　Ｉ”’　系
実施例３ ヒトＣｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ
）Ｃｕ−Ｚｎ　ＳＯＤ　ｃＤＮＡ修飾の出発点は、リー
マンーハービツツ、ジヱー、　（Ｌｌ＊ｍａｎ−Ｈｕｒ
ｖｉｔ”ｉ、Ｊ、）ら、ＰＮＡＳ（１９８２）、７９：
２８０８に記載されているグラスミドｐｓ６１−１０で
ちる。ＳＯＤ　ｃＤＮ人は、１９８３年４月２９日に出
願された係属中の米国特許出願第４８９．７８６号明ａ
書くも記載されている。５ＯＰｃＤＮ＆を修飾すると、
遺伝子の５′末端に凶ρｌ制限部位が′遺伝子の３′末
端にＨｌｎｄ　［制限部位が導入された。得られたグラ
スミドｐｓＯＤ　ＮＨ−１０は両端が非反復制限部位に
なっているＳＯＤ　ｃＤＮ＆を含んでいる。 １、ｐｓＯＤα２ ｐｓｏ　Ｄα２の構築は第１３図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。ｐｓｏ　Ｄα２はアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに人ＴＣＣＮｏ
、　３９７８６で寄託されている。ｐｓｏ　Ｄα２を構
築するためく、λＰＬグロプロターとＮＵｔＬトＣｎリ
ボソーム結合部位とを発現ベクターｐＪＨ２００から切
シ取シ、グラスミドｐｓｏｏ　ＮＨ−１０のＳＯＤ遺伝
子の手前に配置した。次いでプロモーターと一し ＲＢＳとＳＯＤ遺伝子を含有する７ラグメントをベクタ
ー　ｐＢＲＭＫ挿入Ｌり挿入−トマン、シエー・アー／
ｌ／　、（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｊ、Ｒ，）ら、ＰＮＡＳ７
９：２３３−２３７（１９８２））。ｐＢＦＲｉアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションに人ＴＣＣＮ
ｏ、　３７２８３で寄託されている。 ｐｓｏ　Ｄα２を、公知の方法を用いる形質転換で大腸
菌（ｇａｃｈｅｒｌｃｈｉａ　ｃｏ月）人２０９７株に
導入した。 得られたクローンを増殖訃よび誘発させるとＳＯＤアナ
ログタンパクが産生じた。ｐｓＯＤα２によシ産生され
たＳＯＤアナログの量は、クーマシー染色８ＤＳポリア
クリルアミドゲルの走査によって計算すると、細菌によ
シ産生された偲タンパクの約０．１−０．３％であった
。（表２）。産生されたＳＯＤアナログは、下記のｐｓ
ｏｏβ１によ）産生され九祠モアナログと多分同一であ
ろう。 １１、　　ｐｓＯＤβ１ ｐｓｏｏβｌの溝築は、第１４図に示しかつ前記図面の
説明中に記載されている。ｐｓＯＤβｌを構築するため
に、ｐｓＯＤα２の０１　ＲＢＳを、ｐＢＬＡ１１由来
のＲＢＳおよびβ−２クタマーゼプロモーター（β−１
ａｃ−ｐｒｏｍ）で言換した。ｐＢＬＡｌｌはアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションＩｃ　ＡＴＣＣ
Ｎｏ、３９７８８で寄託されている。 ｐＢＬＡｌｌはｐＢＲ３２２中の座標（ｃｏｏｒｄｌｎ
ａｔ＠５）４１５７と４３５３との間にあるβ−ラクタ
マーゼ遺公子のプロモータと、リボソーム結合部位とを
含む。Ｆｒｃｏ　ＲＩクリンカをブロモ−ターの上流に
付加し、マルチ制限部位リンカ−を開始コドノＡＴＧの
直後に付加した。従って、開始コドンで始まるコード鎖
の配タリはＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣである。 ｐｓＯＤβ１を、公知の方法を用いる形質転洟によって
大腸菌（ｇｉｅｈ＠ｒｉａｈｉａ　ａｏｌｉ）菌株人１
６４５て導入した。得られたクローンを増殖および誘発
させるとＳＯＤアナログを産生ずる。産生されると）　
Ｃｕ−Ｚｎ　ＳＯＤアナログは、天然ヒトＳＯＤがアミ
ノ末端アラニンでアセチル化されているのに対して〔ハ
ーツ、ジエー。ダブリュー、　（ＨａｒｔＺ、Ｊ。 Ｗ、）及びドイツチン、エッチ、エフ、（Ｄ＠ｕｔｓｃ
ｈ＋Ｈ，Ｆ、）、リュー。バイオ口。ケム、（Ｊ、ＢＡ
ｏｌ。 Ｃｈｕｍ）（１９７２）２３４ニア０４３−７０５０；
イーブツシュ、ジュー。アール、　（Ｊａｂ１１８ｃｈ
、Ｊ、Ｒ，）らパイロケミストリー（ＢＡｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）　（１９８０）１９：２３１０−２３１６；
パ９（Ｂａｒｒａ）ら、ＦＥＢＳＶターズ（ＬＬｅｔｔ
ｅｒｓ）（１９８０）１２０：５３及びオバーレイ、エ
ル。ダブリュ、　（Ｏｂ＠ｒｌ＠ｙ、Ｌ、Ｗ、）スーパ
ーオギンドジスムターゼ（Ｓｕｐ＠ｒｏｘｉｄｓＤｉｓ
ｍｕｔａｓｅ）　、　ｖｏｌ、Ｉ、（１９８２）　、Ｃ
ＲＣプレス。 フロリダ、ｐｐ、３２−３３）、アミノ酸配列解析化学
量論で示されるようにアミノ末端アラニンがアセチル化
されていない点で天然ヒ）Ｃｕ−ＺｎＳＯＤと異なる。 更に、天然ヒトＳＯＤはグリコシ・ル化されている〔ヒ
エ−パー、ダブリュー、　（Ｈｕｂｅｒ。 Ｗ、）、１９７１年５月１８日付発行ＵＳＰＮｏ。 ３．５７９，４９５）のに対して、細菌産生ヒトＳＯＤ
はほとんど全くグリコクル化されていない。なぜなら、
大腸菌（Ｅｓｃｈｓｒｉｃｈｉａ　ａｏｌΩは自身が産
生ずるタンパクをグリコジル化しないからである。 細菌産生ＳＯＤアナログのアミノ酸配列は成熟ヒトＳＯ
Ｄの配列と同一であシ、七〇Ｎ−末端にメチオニン残基
な含まない。 ｐｓＯＤβ１により産生されるＳＯＤの量は、クー１シ
一染色ＳＤ８ポリアクリルアミドゲルの走査により計算
すると、細菌によシ産生された総タンパクの約３−８チ
であった（表ＩＩ）。菌株の増殖、産生されたＳＯＤの
回収およびＳＯＤの精製のために用いた方法は、ｐＳＯ
Ｄβ１Ｔ１．のための後記実施例７の方法と同じである
。 １、　　ｐＳＯＤβ１Ｔ、。 ｐ　ＳＯＤβ１Ｔ１．の構築は第１５図に示されかつ前
記図面の説明中に記載されている。ｐｓＯＤβ、のβ−
ラクタマーゼ遺伝子を、ｐＢ１３２２由来のテトラティ
クリン耐性をシードする遺伝子で置換した。 ｐ　ＳＯＤβ、Ｔ１．によ〕産生されるＳＯＤアナログ
の量は、クーマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
の走査によシ計算すると、細菌によシ産生される総タン
パクの約８−１３チであった（表■）。産生されるＳＯ
Ｄアナログは、ｐｓＯＤβ１によシ産生されるアナログ
と同一である。 ＩＶ、　　　ｐｓｏｖｌ、−ＢＡ。 ｐｓＯＤβ、−８人２の構築は、第１７図に示されかつ
前記図面の説明中に記載されている。ｐｓｏｏα１３の
Ｃ■リボソーム結合部位を、配列 人人ＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧ／ＬＡＡＡＡＧＧ人人
ＧλＧＧＴＴＡＴ’ｒＡ’ｒ人人Ｃ’［’Ｔ’ｒＴＴＣ
ＣＴＴＣＴＣＡＴを有する合成りＮ人７ラグメントで置
換した。前記配列は天然β−ラクタマーゼＲＢＳの配列
と類似している。 ｐｓｏｖｌ１−８人２を当業者に公知の方法を用いる形
質転換によって、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｌａμ已
土）菌株人１６４５中に４人した。得られたクローンを
増殖および誘発させると、ヒトＳＯＤアナログを産生す
る。ｐｓＯＤβ、−ＢＡ２により産生されるＳＯＤの量
は、クーマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの走
査によシ計算すると、細菌により産生された総タンパク
の約２−４チであった（表■）。産生されたＳＯＤアナ
ログは、ｐｓＯＤβ、によυ産生されたアナログと同一
である。 表　　　　■ グラスミド　　　ＲＢＳ　　　宿主　％８０Ｄ３　　備
考ｐｓＯＤα２　　　　　Ｃ１１人２０９７　　０．１
−０３　　人ｍｐＲｐｓＯＤβ、　　　　ＢＬＡ　　Ａ
ｌ６４５　３−８　　　λｍｐＲｐＳＯＤβ１Ｔ、、　
　　ＢＬＡ　　　Ａ１６４５　　８−１３　　　Ｔ＠ｔ
”ｐＳＯＤβ、ＴＴ−Ｉ　　　ＢＬＡ　　　人１６４５
　　１０−１５　　Ｔ＠ｔＲ；Ｔ、Ｔ２ｐＳＯＤβ、−
ＢＡ２　　　ＢＬＡ　　　人１６４５　　２−４　　　
　人ｒｎｐＲ１、β−２クタマーゼ遺伝子のプロモータ
及びリボソーム結合部位 ２、β−ラクタマー、ゼ遺伝子のリボソーム結合部位に
相当する合成リボソーム結合部位 ３、総組菌性タンパクのバー七ンテージとして表示した
産生ＳＯＤアナログの量 略号 人ｍｐｌ′３＋：アンピシリン財性 Ｔ・ｔｌｔ±テトラサイクリン耐性 ’ｒ、Ｔ２＝転写終結配列 実施例４ ヒトアポリポプロテインＥ（人ｐｏＥ３）人ｐｏＰ、３
　　ｃＤＮ人１伽飾の出発点は、カリホルニア。 サンフランシスコのブラッドストン財団（Ｇｌａｄｇ−
ｔｏｎｅ　Ｆｏｕｎｄ轟ｔｌｏｎ）のジョーンテイラー
（ＪｏｈｎＴａｙｌｏｒ）博士によシ提供されたプラス
ミドｐＮＢ１７８でちった。このプラスミドは、ヒトＡ
ｐｏＥ３遺伝子の完全長ｃＤＮＡｗ’ビーを含む。ｐＮ
Ｂ　１７８中のｃＤＮＡを修飾して、遺伝子の５′末端
の非コード化ＤＮＡを除去しかつ遺伝子の両末端にＮｄ
５Ｉ制限部位を付加した。この人ｐｏＥ３　ｃＤＮ＆フ
ラグメントな（１９８３年７月１５日に出願され九係属
中の米国特許出願８５１４，１．９１３号に記、或され
ている）ベクターｐＮＤＳ中に挿入した。得られたグラ
スミドｐＡｐ。 Ｅ−Ｅｘ２を第１８図に示す。これはアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションに人ＴＣＣＮｏ。 ３９７８７で寄託されている。 １、ｐＴＶ−１８８ ｐＴＶ−１８８の構築は、第１８図に示されかつ前記図
面の説明に記載されている。グラスミドｐＴＶ−１８８
は、ｐＡｐｏＥ−Ｅｘ２のＮｄｓ　Ｉ　−Ｎｄｓ　Ｉフ
ラグメントを充ｔＪｊ（ｆｉｌｌｅｄ−１ｍ）　ｌ、て
得た人ｐｏＥ３７ラグメントを（第１５図に示しかつ図
面の説明中に記載されている）　ｐＳＯＤβ１Ｔ１．の
唯一のプラント末端影遺１部位に挿入して得九。 ｐＴＶ　−１８８を当業者に公知の方法を用いる形質転
換によシ大腸菌（Ｂｍｃｈ＠ｒｌｃｈｉａ　ｃａｌｌ）
菌株人１６４５１ｔ−導入した。得られたクロー／を増
殖及び誘発させると、ヒト人ｐｏＥ３のアナログを産生
ずる。 前記アナログは、真正ヒト人ｐｏＥ３のＮ−末端に糾合
したヒトスーパーオキシドジスムターゼのＮ−シ 末端配列の４２個のアミノ酸を有し、そのＮ−末端には
メチオニンを有する。産生された入ｐｏＥ３アナログは
、クーマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの走査
によって計算すると、細菌により産生される総タンパク
の約１０チであった。菌株の増殖のために使用した方法
は、１２．５　ｍｙ／ｌのテトクナイクリンをアンビン
リンの代表９Ｊこ使用する以外はｐＲＯ１２からのｂＧ
Ｈ産生のための実施例５に記載の方法と同じである。 １、　　ｐｓ入Ｌ　　１６０−５ ｐＳＡＬ１６０−５の溝築け、第２３図に示されかつ前
記口面の説明中に記載されている。プツスミ）”　ｐＳ
ＡＬ　１６０−５を、ＰＴＶ−１７０（第２０図参照）
のＡｖａ　Ｉ　−Ａｖａ　Ｉ　ＡｐＯＥ３遺伝子７ラグ
メントに挿入して得た。 ｐＳＡＬｌ　６０−５を、当業者に公知の方法を用いる
形質転換によって大腸菌（Ｆ、５ｃｈｅｒｌｃｈｉ４　
ｃｏｉｌ）菌株Ａ１６４５に導入した。得られたクロー
ンを増殖および誘発させると、アミン末端にメチオニン
と１１個のＮ−末端アミノ酸が欠失している人ｐ。 Ｅ３に融合したヒト成長ホルモンのＮ−末端由来の４５
個のアミノ酸とを含む人ｐｏＥ３のアナログが産生され
る。ｐＳＡＬ　１６０−５　Ｋよシ産生される人ｐｏＥ
３アナログの量は、クーマシー染色ＳＤＳボリアクリル
アミドゲルの走査により計算すると、細菌によシ生産さ
れる総タンパクの約５チであった。菌株を増殖するため
に使用した方法は、ｐＲ０１２からのｂＧＨ産生のため
の実施例５に記載されている方法と同じである。 実施例５ ｐＲ０１２の増殖 １、保存培養物 ｐＲＯ１２の保存培養物（ｓｔｏｃｋ　ｃｕｌｔｕｒｅ
）をカゼイン培地で増殖しく接種物参照）、次に凍結培
地で２倍（希釈し、−８０℃で保存する。凍結培地は５
００ｍ（あたシ以下の物質を含む。 Ｋ２ＦＩＦＯ４６，３，１Ｆ ＫＨ２ＰＯ４１，８！！ クエン酸Ｎａ　　　　　　　　Ｏ，４５１１ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２，）　　　　　　０．０９ｇ（Ｎ１（４）２Ｓ
ｏ４０．９ｇ グリセロール　　　　　　４４．０．９■、接種物 接種物を２０１１／ｌカゼイン水解物、１０＃／を酵母
抽出物および２９１ｔ　ＮａＣ２中で増殖させた。振盪
フラスコ中の無菌培地に保存培養物を接種し、３０　’
Ｏ、約２０Ｏｒ、ｐ、ｍ、の−、ｔｘ−カー上テ１５時
間インキュベートした。必要に応じ、以後の接種物増殖
段階は攪拌通気した発酵槽で行なった。 無菌培地に２−１０−接種物を接種し、３０℃。 ＰＨ７１０，５で攪拌通気して溶存酸素レベルを空気飽
和の２０％よシ高く維持しながら１５時間インキエベー
トした。 ■、産生 産生培地は以下の物質を含む。 カゼイン氷解物　　　　　　２０１１／を酵母抽出物　
　　　　　　　１０１／１Ｋ２１（ＰＯ４２，５ｙ／１ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ＱＬｊｆ／１ Ｎａ６１　　　　　　　　　　　　５１μビオチン　　
　　　　　　０．Ｉ　Ｗ／ｌチアミン　　　　　　　　
１１１１９／を微量元素溶液　　　　　　　　３ｄ／を
培地は１００〜／ｌのアンピシリンモ含む。アンピシリ
ンは産生のなめｇＰ１任意成分であるが、通常接種物の
増殖用培地には添加されている。 濃縮溶液中のビオチン、チアミ／及びアンピシリンを別
々にフィルター滅菌し、接種以前に無菌産生培地に加え
た。無菌プドク糖溶液を最初にｘｏｇ７ｔになるよう（
添加した。誘発の過糧ではプドク糖を更に１０１／Ｌ　
ｆＡ加した。 微量元素溶液は以下の物質を含む。 Ｆ＠　Ｃ１ｓ　　　　　　　　　１６１／ＬＺ　ｎ　Ｃ
１ｚ　・４　Ｎ２０　　　　　　２　Ｊ’／１ＣｏＣ１
，・６Ｈ２０２１／ｌ Ｎａ　ｚＭｏｏ　４・２Ｈ２０２Ｊ　／ＬＣＡＣ１２・
２Ｈ２０１１／ｌ Ｃｕ　Ｃ１２１Ｆ／Ｌ ＨｓＢＯｓ　　　　　　　　　　　Ｏ，５１／Ｌ濃ＨＣ
Ｉ　　　　　　　　１００１Ｌｔ／を培地に０．５−１
０％の接種培賽物を接種し、３０℃でイン中ユベートす
る。攪拌−通気速度は、空気飽和の２０％よ）高い溶存
酸素レベルが維持されるように設定される。皿、でｐＨ
を７土０．２に維持する。細胞濃度が約３．５１１／ｌ
’　（０１）６６ｏ＝１０　）Ｋ到達含たう誘発逸始め
る。 温度を４２℃に上げ、４２℃で１−５時間維持する。次
いで培養物を急冷し、ホルモン精製のために遠心分離に
よって細胞を回収する。 ｂＧＨの回収 ポリトロン（Ｋｌｎｅｍａｔｉｅａ）配合装置を用い、
５０ｍＭリン酸ナトリクち緩衝液（ｐＨ７，４）と５０
ｍＶ　ＥＤＴ人と１００　ｍＭ　ＮａＣｔとを含む５倍
容の溶液に１３に９の細菌細胞（湿潤ケーキ）を再懸濁
させる。配合装置の速度は泡立ちを最小に抑えるように
調整する。均質懸濁液をダイノミル細胞破砕装置Ｋ　Ｄ
　５　（Ｗｌｌｌｙ　Ａ、　Ｂａｃｈｏｆｅｎ、バーゼ
ル）Ｋ８０ｔ／時の速度で連続的に通し、破砕細胞の均
質懸濁液をＣＥＰ人１０１遠心機で４５ｔ／時の流速で
遠心してｆ＃泄化する。遠心ステップで得られた沈殿物
を回収し、５０　ｍＭＥＤＴ人含有５０ｍＭす／酸六ト
リクム緩衝液ＣｐＨ７，４）　１　！５．５１に再懸濁
させる。終濃度０．０５ダΔｄまでリゾチームを刀ＩＩ
え、懸濁液を３７℃で１６時間イ／＃−ユベートした。 トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を終ｍｒ１１％’
！で加える。次に、ａ濁液を室温で３０分間インキエベ
ートシ、連続流式＃ｌｌ超超音波処理装置加熱システム
）内で１８ｔ／時の速度で超音波処理し、ＣＥＰ人１０
１遠心機で遠心する。沈殿物を収集し、５０−リン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に再懸濁し、前記同様く
超音波処理し、ＣＥＰＡ　１０１遠心機で遠心した。細
胞を５０　ｍＭＥＤＴＡ　ｊ”よび１００ｍＶ　ＮａＣ
２を含む５０−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＥｉ７．４
）１５．５７に再懸濁し、２回沈殿させ、蒸留水１５．
５ｔに再忍濁させる。沈殿物を遠心によって収集し、−
２０’Ｏで保存する。 ｂＧＨの精製 沈殿物を３０〜４０１の蒸１水に再！ご燗させ、０．５
ＮのＮａＯＨでｐｆ（Ｉ　Ｌ、　８　にｍ定して４容化
する。 次に溶液を連続的に超音波処理し、所要によシＣＥＰ人
１０１遠心機で遠心して清澄化するか、またはワットマ
ンＮｏ、１（ｐ祇を通して濾過する。 清澄化プロティン４液（３２，ｔ３１．　２９７，００
０のＯＤ２．。工を含む）を各部分が５０，０００−６
０．００００　Ｄを含むように分ける（６Ｘ５．４Ｌ）
。 各部分を夫々、５　ｆｔ２面積の１００，０００分子】
カット才力セット（タイプＰＴ［）を３個備えたミリポ
ア（Ｍ１１１Ｌｐｏｒ＊）ペリコン（Ｐｅｌｌｌａｏｎ
）限外−過装置を通して限外濾過する。５．４を部分を
１を保留分（ｘｅｔｅｎｔａｔａ）容量に濃縮する。限
外Ｐ液を収集しス存する。保留分を再び新群な１０ｍＭ
ホウ酸塩緩衝液、　ｐＦｌｌ　１．８でもとの８涜にま
で希釈し、十分に混合する。バッチを再びＩＬ保留分容
量に濃縮する。限外Ｐ液を集め、はじめの限外戸液と合
わせる。限外Ｐ液中のＯＤ分の流出屹量が限外−過装置
に最初に充填されたＯＤ分の２０−ホウ酸塩緩衝液（よ
る希釈のサイクルを、０．５２の保留分力）らの限外Ｐ
液の２８０ｎｍ（ｌｃｓｌセル）での吸光度が０．１未
満になるまで継続する。これは通常９−１２回の濃縮・
希釈サイクルを要する。 最終保留分は捨てる。 ２４−４０時間を要する。 １００に限外濾過工程からの合した限外Ｆ液（２８０ｎ
ｎ＋でＺｏｏ、０ＯＯＯＤを含む３８０ｔ）を。 ２３０１／時（２５Ｌ／時）の線流速でセファロースＣ
Ｌ−６Ｂ　ＤＥＡＥイオン交換カラムに充填する。直径
３７ｃｍ、高さ１５ｃＩＩＬのカラムをｐ）１９．０で
１０ｍＭホウ酸塩緩衝液の２ベツド容量（３２Ｌ）で洗
浄する。充填および洗浄ステップからの溶出物は捨てる
。１０ｍＭホウ酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム。 ｐＨ９に溶離液を変えると、カラムからｂ（Ｊが排出さ
れる。ｉ！離流速は２３１７時である。流出の進行を２
８０１での溶出物の吸光度を追諦してモニターする。ｂ
ＧＨピークを４乃至５ベツド容量（２８０ｎｍで４３．
００００Ｄを含む８４ｔ）で収集し、１０．０００分子
量カットオフカセットを備えたミリボアベリコノ限外濾
過装置を用いて約１０ｍ９／ｄに濃縮する。次いで、溶
液を凍結乾、桑する。収量は純ｂＧＩ（約７０ｐである
。 実施例６ ｐＲ０１２により産生されるｂＧＨアナログの活性１、
　　ｂＧＨアナログと天然ｂＧＨとのラジオイムノアツ
セイ比較 リン酸塩緩衝生理食塩水（１チＢＳＡ）中に１００ｎ　
ｇ　／ｄのｂＧＩ（アナログを含む溶液をＮ’Ｗ　ＦＪ
した。この溶液を濃度５０，２５，１２．５，６．２５
，３．１２，１．５６及び０．７８　ｎｇ／Ｌまで順序
希釈した。これらの溶液てりいて各Ｑ、ｌ　ｍｌのサン
プル＃２組を、二抗体法を用いるＲＩＡＫかけた。希釈
曲線は天然ｂＧＦｆで得られる曲線と同等であつ九。 ２、ラジオレセプター結合アツセイ クサギ肝膜に対する２ジオレセプタ一結合アッセイを、
ツシマテイー（Ｔｕ謳ｈ１ｍａ　Ｔ、）及び７ライセン
エツチ、ジー、　（Ｆｒ＠Ｉｍ＠＋ｘ　［（、Ｇ、）　
（フイ、　？ン（Ｙ、Ｃｈｉｍ、）　、エンドクル、メ
タボ、　（Ｅｎｄｏｅｒ。 ｈｉｅｔａｂ）、（１９７３）、３７．３）に記載の方
法で、１２５　Ｉ−ｂＧＨをトレーチーとし、真正ｂＧ
Ｈ溶液を校正曲線用に用いて実施した。３組のサンプル
を０．３ｍのアッセイバッファ（５０ｍＭ　Ｔｒｌｇ、
１５ｍＭ　ＣａＣｌ２及び５　ｍｙ　／ｍｌウシ血清ア
ルプミ７．ｐＨ７，６）中、室温で２時間インキュベー
トした。試験管は、”５ｌ−ｂＧＨ（３０−６０バｉ　
／Ａｇの調製物２０．０００ｃｐｍ）と、１５０−２５
０　ａｇの肝膜タンパクと、天然ｂＧＨ（１−１００ｎ
ｇ）又は細−ｂＧＨの抽出物のいずれかとを収容してい
た。結果は、ｂＧＩ（アナログのｂａａｆ’８性が天然
ｂＧＨの同じ活性に匹敵することを示した。 ３、脛骨テスト 実施例５の細菌細胞から回収されたｐＲＯ１２産生ｂＧ
Ｈアナログの生物活性を脛骨テストで測定した。〔パル
ロー、ニー。エフ　、　（Ｐａｒｌｏｒ　Ａ、Ｆ’、）
ら、エンドクリノロジー（Ｅ＋ｓｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇ
ｙ）（１９６５）７７．１１２６）。生後２８〜３０日
の２ツトを下垂体切除し、次に処置しないで１０−１４
日間維持した。ウシ下垂体又は組換体大腸菌（Ｅｓｅｈ
＠ｒｉ−ｃｈｌａ　ｃｏｉｌ）から誘導したウシ成長ホ
ルモンを０、１５　ＭＮａＣｌ　＋０．ＯＩ　Ｍホウ酸
塩＋ｐＨ１ｏ、ｏに溶解した。２ツト（１群４−７匹ず
つ）を正常食〔プリナラットｇ　（Ｐｕｒｌｎａ　Ｒａ
ｔ−Ｃｈｏｗ）及びｉｌＩ：嵩量の水）で維持し、ｂＧ
Ｉ（溶液の皮下注射（０，２ｃｃ中、５−１２５μｇ／
日）を５１３間毎日続けた。６日目（ｌｃ動物を殺し、
前肢膝骨を取シ出して長手方向に切開し、アセトンで固
定して２チｈｇＮｏ、で染色した。解剖双眼顕微＊にコ
ン）で観察して置端プレートの幅を測定した。（ラット
あた９４０回の読み取シを行なった）平均値を用いて長
期投与一応答曲線を抽いた。結果は、ｐａｏ＋２象生ｂ
ＧＨアナログのｂＧＨ活性が天然ｂＧｆＫの同じ活性に
匹敵することを示した。 （以下余白） 実施例７ ！、保存培養物 ｐｓＯＤβＩＴｔｌの保存培養物をカゼイン培地で増殖
しく接種物参照）、凍結培地で２倍に希釈し、−８０℃
で保存した。凍結培地は５００−あたシ次の物質を含む
。 ＫｓＨＰＯ４６，３／１ ＫＨｚ　ＰＯ４Ｌ８Ｊｉ クエンｒＲＮａ　　　　　　　　　　０．４５ＪＪＭｇ
ＳＯａ　”　７Ｈ２００，０９，９（ＮＨｇ）　２　Ｓ
　０４　　　　　０．９１１グリセロール　　　　　　
　４４．０．９■、接種物 ｉａ物１２０　ｉ／Ｉｔ　　カゼイン水解物、１０１１
／１酵母抽出物及び２１１　／　ｌ　Ｎ　ＪＬ　Ｃｌの
中で増殖させた。 振盪フラスコ中の無菌培地に保存培養物を接在し、３０
℃、約２００　ｒ　ｐ、ｍのシェーカー上で１５時間イ
ンキエベートした。必要に応じ、以後の接種物増殖段階
は攪拌通気した発酵槽で行なった。無菌培地に２〜１０
チの培養物を接種し、３０℃。 ｐＨ７±０．５で攪拌通気して溶存酸素レベルを空気飽
和の２０係より高く維持しながら１５時間インキエペー
トした。 通、産生 産生培地は次の４！ｉ７質を含む。 カゼイン水解ｍ　　　　　　　２０１／ノ酵母抽出物　
　　　　　　　１０１１／ＩＫｌ　ＨＰＯｓ　　　　　
　　　　　２．５１／　ｌＭｇ５Ｏ，・７Ｈ，ＯＬ９／
Ｉ Ｎ息Ｃ７５１／Ｉｔ ビオチン　　　　　　　　　　　０．１ダ／ｌチアミン
　　　　　　　　　　１〜／ｌ微量元素溶液　　　　　
　　　３−／ｌＣｕ８０４　　　　　　　　　　０．８
　Ｆ／　ｌＺｎ８０４　　　　　　　　　１０Ｗ／１培
地には、１２．ｓｍｙ／ｌ　　のテトラサイクリンも含
まれる。テトラサイクリンは産生のためには任意成分で
りるが、通常接種物を増殖させるために使用される培地
には添加されている。 濃縮溶液中のビオチン、チアミン及びテトラサイクリン
を別々にフィルター？ｉ直し、接ね以前に無医産生培地
に加えた。無厘プドク糖溶液を最初ｌｏｐ／ｉになるよ
うにｂ加した。誘発の段階で更にｘｏｇ７ｉのブドウ糖
を添加した。 微量元素爵醋は次の吻實を含む。 Ｆ・Ｃ７ｌ、　　　　　　　　１ａｐ／１ＺｎＣＪ１　
＠４１ｉ１０　　　　　２Ｎ／　ｌＣｏＣ７１２・６Ｈ
１０２１／Ｉ Ｎａ！Ｍｏ０４ｍ２Ｈ１Ｏ２１／Ｉ ＣａＣＩｔ　０２　Ｈｚ　０　　　　　１　ｇ／　にｕ
ｃ１２　　　　　　　　１ｉ／ｉＨ ３Ｂ　Ｏ，０，５１／１ ＠ＨＣＪ　　　　　　　　１００ｎｔ／１培地に０．５
〜１０９６の接種培養物を接種し、３０℃でイン中ユペ
ートした。攪拌−通気速度は、空気飽和の２０係よシ高
いｍ存酸素レベルが維持されるように設建される。ＮＨ
ｓでｐＨを７±０．２に維持する。細胞（ＩＮＫが約ｓ
、ｓ、＠、／　ｌ　に０Ｄｓｓ６＝１０）く達すると誘
発が始まる。 温度を４２℃に上げ、４２℃で１〜５時間維持する。次
いで培養物を急冷し、酵素ｎ製のためＩＱ遠心分離によ
って細胞を回収する。 部）ＤＣ１匣双 ポリトロン（Ｋｉｎｓｒｎａｔｉｃａｌ配合装置を用い
、５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７，８）１２Ｊ中
に１．５に２のＭｊｉＭ細胞（ウエットクーキ］を懸濁
させる。配合装置の速度Ｆｉ泡立ちを最小に抑えるよう
Ｍｇ整した。均質Ｊｌｉ！１１４液をダイノミル（Ｄｙ
ｎｏｍｉ　ｌ目細胞破砕１ｉｉＩＫＤ５ぐＷｉ　１１　
ｙ　＊　Ａ、　Ｂａｃｈｏｆ＠ｎ。 バーゼル）罠逐続的に通す。破砕細胞の均質Ｍ滴液を連
胱流細胞を用いて超音波処理し、Ｃ１Ａ１０１遠心機で
遠心した。上清を６５℃で２時間加熱し、冷却し、前記
処理と同様にして遠心した。清澄な上清を、１０，００
０分子象カットオフカセット（ｐＴａｃ型ン　を備えた
ミ′リポアペリコン限外ム↓処港装置で１）に濃縮する
。製電されたタフバク溶液を、ｌ５６ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液ｆｐＨ７，８）で平衡したＤＥＡＫ−セファ
ロースカラム（２に９　　ＤＥＡＦ、セファロース）に
流す。流出液を収集し、ａ榴し、２０ｍＭ）リス−ＨＣ
ｌ、ｐｕｔ、ｓに対してペリコン限外濾過装置で透析し
、次いで２０ｍＭ）リス−Ｉ（Ｃｌ緩衝液で平衡したＱ
ＡＥ−セファロースカラムに通す。２０　ｍ　Ｍ　）リ
スＨＣＩ緩衝Ｈ，ｐＨ７，ｓと塩勾配（０〜２０ＱｍＭ
ＮａＣｌ）でカラムを展開する。ＳＯＤ含有画分を収集
し、ペリコン限外濾過装置を用いて濃縮し、蒸留水だ対
して透析し、１Ｍ酢酸す）　ＩＪウム緩衝ｇ、ｐＨ４，
８を添加して１００ｍＭ酢はナトリウムとする。 タンノぞり溶液を更に１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
、ｐＨ４，７で平衡したＣＭ−セファロースカラムで分
離する。カラムを同じ緩衝液および塩勾配（Ｚｏｏ　〜
５００ｍＭＮａＣ１）でａｈする。ＳＯＤ含有４１ｉ１
分を収集し、ペリコン限外濾過装置を用いて濃縮し、凍
結乾燥する。 実施例８ ｐｓＯＤβＩ　Ｔｌｌによシ産生されるＳＯＤの活性実
施例７で調製したｐｓＯＤβＩＴＩＩによシ意生される
ＳＯＤアナログの酵素活性を、マツクコード（ＭｃＣｏ
ｒｄｌ及びフライ−ピッチ（Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ）＋ジ
エー・パイオローケム（Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｗ　）（
１９６９）、２工４：６０４９−ｓｏｓｓに記載された
如く、フェリシトクロム−〇の還元抑制をモニターして
アッセイした。得られた結果は、ｐＳＯＤβＩＴｔｌ電
生ＳＯＤアナログ５活性は天然ヒ）ＳＱＤＣシグマ（Ｓ
ｌ−ａｌ〕の活性に匹敵し、ウシＳＯＤ［：オルプテイ
ン（Ｏｒｇｏｔ・１ｎ）ｅグリューネンタール（、ＨＢ
Ｈ）の活性にも匹敵していることを示した。 実施例９ 発現ベクター １、ｐ５７９ 躬１９図に示し、前記図面の説明中で詳細に説明したベ
クターｐ５７９は、ＰＩ、プロモーターとＮ利用部位（
Ｎｕｔ＋、）及び非反復ＫＣｏＲＩおよび凡ｄｅｌ　　
制限部位で境界付けられるＣ１１！Ｊｒｌｆンーム結合
部位とＡＴＧ開始コＰンと大腸画（Ｅａｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｅｏｌｉ）のｒｒｎＢすメソームＲＮＡ遺伝子オペ
ロンの末端に白米するＴ＋Ｔ２に写終結シグナルとから
成る。これらの要素は、アンピシリン耐性遺伝子を有す
るｐＢＲ３２２上でクローンされる。他の特徴は第１９
図に示されている。 ｐ５７９は、プラスミｒｐＰｓ１上にｔまれるＴ、Ｔ、
転写終結シグナルをベクターｐＲ０２１１のＨｉｎｄｌ
１１部位に挿入して調製される。ｐＲ０２１１□は第２
図に示されている。ｐｐｓｌはナルミエントス（Ｓａｒ
ｍｌ＠ｎｔｏｍ）ら、セル（Ｃｍ　１１　）　（１９８
３）３２．１３３７−１３４６に記載され、アメリカン
等タイプ−カルチャー１コレクシヨンにＡＴＣＣ＆３９
８０７　　で薔託されている。ｐ５７９お工び真核生物
遺伝子を含むその誘導体を適当表大腸菌（Ｚｓｃｈ＠ｒ
ｌｃｈｌａ　　ｃａｌＬ’）宿主中に維持することもで
きる。宿主の最も重要な特徴は、この宿主が％感受性リ
ゾレッサーＣｌ８５７と抗転写終結Ｎタンツクを与える
ことである。〔ゴーテスマン。 エム：　（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｍ、）Ｇ）、ジ！−，
モル。 パイオロ、　　（Ｊ、ＭｏＩ．Ｂｌｏｌ、）（１９８０
）１４０゜５７−７５）。 ｐ５７９は、従来の発現ベクターに比較して以下の如き
多くの利点を有する。 このベクターは、大ｐ＆画（Ｅ、　ＣｏＩ１Ｊ中の外米
タンノ臂りの発現を総細胞タンノぐりの４２’ｊという
高レベルで紡発しうる。この発現レベルは、’ｒ、’ｒ
、転写終結配列を欠く他の類似のλＰＬプラスミドの発
現レベルよシも高い。 ２、転写終結シグナル ベクターｐ５７９はλＰ、プロモータとＣ１ｌすメンー
ム結合部位の下流に位置する’ｒ、　Ｔ！転写終結シグ
ナルを含む。このベクターを用いそ得られる高発現レベ
ルは挿入された遺伝子の末端にＴ、　’ｒ！転写終結因
子が存在していることに部分的に起因している。すなわ
ち、この’ｒｔ　Ｔ、転写終結因子はＮ修飾ＲＮ人ポリ
メラーゼの転写を終結しうるからである。 このように、転写終結因子はプラスミＰの非所璽タンノ
ぞりのλＰ１．制御転写を阻止し、これによシ所望のタ
ンＡりの相対収斂を高める。 ３　リゼンーム結合部位が交換しうることＰ５７９は、
ＩＮＮソーム結合部位の上流に位置する唯一のＥｃｏＲ
１部位とＡＴＧ開始コドンの所に位置する唯一のＮｄｅ
／１部位とを含む。従って、リセソーム結合部位の両境
界は２個の非反復制限部位である。これＫよシ、現在の
りｉソーム結合部位（λｃｒｉｖｙｓソーム結合部位）
の切除とプラスミＰの他の特徴を変えることなく他の天
然または合成リボソーム結合部位の実質的な置換を容易
に行ない得る。こうして所望ポリペプチドの至適発現が
大いに促進される。 ４、　発現を熱誘導的に調節し得ることλＰＬプロモー
ターはＣＩリグレツサが結合しているときは不活性であ
る。（’ｒ　８５７リノプレツサは熱感受性である。即
ち、３０℃ではプロモーターに結合するが、４２℃で失
活する。従って、発ｉｓ＠度を４２℃に上げると宿主細
菌で所望タン／ぐりの産生が誘発される。 このような系は以下の利点を含む。 （＆）大腸菌（Ｅｓａｈ＠ｒｌａｈｌａ　　ｃｏｉｌ）
に毒性の外来タン・ぞりを発酵プロセスの後期に産生ず
ることができ、これにニジ早期の細胞死を回避しうる。 （ｂ）　　メンＪＲりの産生先進がこのタンツクを安定
させ、タンパク分解を阻止する〔チェン、ワイ、イー　
（Ｃｈｓｎｇ、Ｙ、Ｅｌ　　ら、ジーン（Ｇｓｎｅ）　
（１９８１）ｚ＋、１２１）。　便って厳′！ＢＫ調π
されたプロモーター例えばλＰ＋、を使用する″′瞬間
的″産生冗進は連続的な低レベル産生よシも好ましいで
あろう。 Ｐ５７９由来のプラスミＰを約４２℃で誘発し、タンパ
ク合成中４２℃に保持する。係属中の米国特許出願第、
５１４，１８８号に記載のνＭＧ１００およヒｐ　ＮＤ
　５から誘導したプラスミドの誘発プロトコールでは、
４２℃への温Ｉｆ変化が必要であシ、その後の増殖は３
８℃で長時ｌ′！１１要する。ｐ５７９の亙適−発プロ
トコールは３８℃への冷却ステップが不戻であシ、簡略
化される。 ｐ５７９のλＰ＋、プロモーターは、大腸菌（Ｉａｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　ａｏｌｉ）中に便用されるλ導入フ
ァージベクターに比較してプラスミド上に多いコピー数
を示す。これＫよシ発現レベルが増加する。 ７、　リボソーム　合　　及°開始コドン　　　ること この発現ベクターは強力な原核生物リボソーム結合部位
（ＲＢＳ）と翻訳開始コドン（ＡＴＧ）とを含む。従っ
て、開始；トンの付加を要せずにいかなる真核生物遺伝
子のクローニングも可能でベクターｐ　Ｎ　Ｄ　５にク
ローン化したλＣ■すメノーム結せ部位である。リボソ
ーム結合部位の配列は次の通シである。 ＴＡＡＧＧＡＡＧＴＡＣＴＴＡＣＡＴ 人ＴＴＣＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＴＡ １＠基対が野生型λで認められるすメソーム瀕合部位と
異なる。 ８、適当な制限部位が存在すること 発現ベクターは、ＡＴＧ開始コドンを含む唯一のＮｄｅ
　　ｌ制限部位を有する。これＫより、所蹟遺伝子を通
正に配電し得る。この咄−のＮｄａ　１部位はリボソー
ム結合部位の直仮にある。 ること Ｎｄｅｌ？１ｒｌｊ限部位の下流に位置する１１６＠１
い得る。 宿主によって与えられるＮタンパクは発現ベクター上の
Ｎｕｔ部位に結合し、これによＪｔ几■部位での転写終
結またはクローン化された遺伝子内の早期転写終精を阻
止する。 菌株 記載さ几たベクター及びプラスミドに対する適当な宿主
は、Ａ１６３７．人２６０２．Ａ１５６３゜ＡＡｌ６４
５（ｃ６００ｒ　　ｇａｌ　　ｔｈｒ　　ｔａｕ　　Ｌ
ａｃｂｌ（λａ１８５７　ΔＫｌ　　ΔＢａ＋ｎＨＩＮ
”）及びＡ２０９７（Ａ１６４５　ｌｉｅ　ｉｉχＡ２
１　ｐｒｏＣ：　：Ｔｎ　１０１を含む形質転保用に適
当な大腸菌（Ｅｙｒ　ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃａｌｌ）の
菌株である。 （以下余白） 実施例１０ 動物成長ホルモン １　１）ＨＧ４４ る。このプラスミドは第２図に示すｐＲＯ１２プラスミ
ドに、第６図に示されサーミエントス（５ａｒｒＷｎｔ
ｏｓ　）ら、セル（Ｃｅｌｌ　）　（１９８３）３２，
３３７−１３４６に記載され、λＴＯＯＡ３９ＢＯ７で
寄託されているシラスミｌ’ｐＰｓ１のＴ、　’ｒ、転
写終結配列を挿入して得られた。ＴＩＴ２転写終結配列
の存在により、ｍＲＮ人転写の長期間継続（ｌｏｎｇ　
ｒｕｎ−ｏｎ　）が阻止され、よってλｐＨプロモータ
ーのコントロール下でのβ−ラクタマーゼ遺伝子と多分
他の非所望タンパクの高レベル発現が阻止される。 シラスミｒｐＨＧ４４を、当業者に公知の方法を用いる
形質転換によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ′ｒａ　
ｃｏ■）Ａ２０９７株中に導入した。この菌株を増殖及
び誘発すると、フェニルアラニン形真正ウシ成長ホルモ
ン（ｂｏｂ）のアミノ末端に付加されたアミノ酸配列ｍ
ｅｔ　−ｍａｐ−ｇｌｎを有するｂＧＨのアナログが産
生ずる。ｐＨ０４４により産生されるｂＧＨアナログの
量は、クーマシー染色ＳＤ８ポリアクリルアミＰグルの
走査によシ計算すると、細菌〈よシ産生される総タンノ
ぐりの約３７−４２％であった。 菌株の増殖、産生されたｂＧＨアナログの回収及びｂＧ
Ｈアナログの精製に使用した方法は実施例１３に記載さ
れている。ｂＧＨ遺伝子の３′末端にＴＩＴ。 終結配列を導入するととＫよシノー２クタマー４発現が
顕著に抑見られているため、発現レベルはｐＲＯＩＺか
ら得られる発現レベル（表■）よシ高い。 １［ｐＳＡＬ５６００−１ ｐ８ＡＬ５６００−１の構築は第１０図に示されかつ前
記図百の僑希叫説明中に記載されている。プラスミドｐ
ＳＡＬ５６００−１は（第３図に示されている）ｐ８Ａ
Ｌ５２００−６からシラスミドｐＰｓ１（ＡＴＯＯ扁３
９８０７　）のＴｌ’ｌ’、終結配列を挿入して得られ
た。 プラスミドｐ１３ＡＬ５６００−１を、当業者に公知の
方法を用いる形質転換により大腸菌（］１８ｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｌｉ西几）菌株Ａ１６４５に導入した。この菌株
を増殖及び誘発すると、フェニルアラニン凰天然ｂＧＨ
のアミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニンを有する
ｂＧＨのアナログが産生された。ｐ８ＡＬ５６００−１
菌株によシ産生されたｂＧＨアナログの量は、クーマー
シー染色ＳｐＳポリアクリルアミＰゲルの走査により計
算すると、細菌により産生される総タンパクの約２２　
２８ｊＪｌでちった。菌株の増殖、産生されたｂＧＨア
ナログの回収及びｂＧＨアナログの精製に使用した方法
は、実施例１３に記載のｐＨ０４４に対する方法と同じ
である。 ｂＧＨ遺伝子の３′末端にＴＩＴ２終結配列を導入する
ことＫよシβ−ラクタ７−ゼ発現が大きく抑えられてい
るため、発現レベルはＰ８ＡＬ５２００−６菌株から得
られるレベルよりも高かった。 ｍ　　　Ｉ）３００９ ９３００９の構築は第１１図に示されかつ前記図面の説
明に記載されている。ｐ５７９発現ベクター（第１９図
）の唯一のｌｄｅ　１部位にＮｄｅ　Ｉ　−Ｎｄｅｌブ
タ成長ホルモンｃＤＮ人フラグメントを挿入して、プラ
スミド９３００９を得た。ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）
フラグメントはＮｄｅ　ｌ消化によシｐ　３００８（人
Ｔｏｏ扁３９８０４　）から単離した。 シラスミド９３００９を、当業者に公知の方法を用いる
形質転換によシ大Ｐ＆菌（Ｉｉｉｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌ＋　）菌株人１６４５に導入した。この菌株を
増殖及び誘発すると、フェニルアラニン形天然ｐＧＨの
７ミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニンを有するｐ
ＧＨのアナログが産生された。産生されたｐＧＨアナロ
グの量は、クーマシー染色５０Ｂプリアクリルアミドゲ
ルの走査によシ計算すると、細菌によシ産生される總タ
ン・ぞりの約３０−３５％てらった。菌株の増殖、産生
されたｐＧＨアナログの回収及びｐＧＨアナログの精製
に使用した方法は、実施例１３に記載されているＩ）Ｈ
Ｇ４４１Ｃ対する方法と同じでちる。 ｐＧＨ遺伝子の３′末端にＴ１Ｔ２終結配列が導入され
てβ−ラクタマーゼ発現が大きく抑えられているために
、ｐ３００９の発現レベルはｐａｏｏａ菌株から得られ
るレベルに比して高かった。 Ｍ　　ｐｓｏｏａ ９５００３の構築は第１２図に示されかつ前記図面の説
明中に記載されている。９５００３はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションにＡＴＯＯＡ３９７９２
で寄託されている。２５７９発現ベクターの非反復Σ鋭
！部位にＮｄｅ　Ｉ　−Ｎｄｅ　Ｉ　＝ワトリ成長ホル
モンｅＤＮ人フ２／メントを挿入して、シラスミＰｐｓ
ｏｏａを得た。 シラスミｒｐｓｏｏａを、当業者に公知の方法を用いる
形質転換によシ大腸菌（ｈσ１吐也組ｃｏｉｌ　）菌株
Ａ２０９７に導入した。この菌株を増殖及び誘発すると
、フェニルアラニン形天然ニワトリ成長ホルモン（ｃＧ
Ｈ）の７ミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニンを有
するＣＧＨのアナログが産生された。 産生されたｃＧＨアナログの量は、クーマシー染色５１
Ｄ８　／リアクリルアミドグルの走査によシ計算すると
、細１ｉＫよシ産生される総タン／瘤りの約３０−３５
％であった。菌株の増殖、産生されるｃＧＨアナログの
回収及びｃＧＨアナログを精製するために使用した方法
は、実施例１３に記載したｐＨ０４４に対する方法と同
じである。 ｃＧＨ遺伝子の３′末端にＴｌＴｌ終結配列を導入する
ことＫよシβ−ラクタマーゼの発現が大きく抑えられて
いるため、ｐｓｏｏａの発現レベルはｐ５００２菌株か
ら得られるレベルよシも高かった。 実施例１１ ヒトＣｕ−２ｆｌスーパーオキシドジスムターゼ（８０
Ｄ） ｌ　　ｐｓｏｎβＩＴＴ−１ ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１の構築は、第１６図に示されか　
。 つ図面の説明中に記載されている。プラスミドｐＳＯＤ
βｔＴＴ−１を、９８０ＤβＩＴＩＩ　（第１５図）の
８０Ｄ遺伝子の３′末端ＫＴ　Ｉ　Ｔ　２終結配列を挿
入して得た。 シラスミｌ’ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１を、当業者に公知の
方法を用いる形質転換によシ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｌｅ
ｈｉａ虱）菌株Ａｌ６４５に導入した。この菌株を増殖
するとＳＯＤアナログと産生した。産生じたｆ９０Ｄア
ナログの量は、クーマシー染色ＳＤ８ポリアクリルアミ
ドゲルの走査によシ計算すると、細菌によシ産生される
総タンパクの約１０　１５Ｘであった。 菌株の増殖、産生されたＳＯＤアナログの回収及び８０
Ｄアナログの精製に使用した方法は実施例１５に記載さ
れている。 非所望ＤＮＡ配列の転写及び翻訳がＴ、ｌ１１２誘発で
抑えられているために、ｐ８０Ｄβｉ’ｒ’ｒ−１の発
現レベルはｐ８０Ｄβｔ’ｒｔｔ　（表■）から得られ
るレベルよシ高かった。 アミノ酸配列解析化学量論によシ示される如くアミノ末
端アラニンがアセチル化されていない点で、産生された
ヒ）　Ｏｕ　−Ｚｎ　ＳＯＤアナログは天然ヒト０ｕ−
Ｚｎ　ＳＯＤとは異なる。天然ヒトＳＯＤはアミノ末端
アラニンでアセチル化されている〔ハーツ、ジエー、ダ
シリュー、（Ｈ訂ｔｚ　、　Ｊ、Ｗ−）及びドイツチェ
、エイチ、エフ、（Ｄｅｕｔｓｃｈ　、　Ｈ，Ｆ、　）
、ジエー・ノ々イオｏ−ケム・（Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｏ
ｈｅｍ、　）（１９７２）　２４７．７０４３−７０５
０、ヤープッシュ、ジエー、アール、　（Ｊａｂｕｊｃ
ｈ、　Ｊ、　Ｒ，）ら、ノ９イオケミストリー（Ｂｌｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　（１９８０）１旦、２３１０
−２３１６；／々−ラ（Ｂａｒｒａ　）ら、Ｐ１！ｌＢ
Ｓレターズ（ｌａｔｔｅｒｓ　）（１９８０）１２０．
　ｓａ及びオノ々−レイ、エル、ダブリュ、　（Ｏｂｅ
ｒｌｅｙ、　Ｌ、Ｗ、）　ｒスーパーオキシＰジスムタ
ーゼ（８ｕｐｅｒｏｘｌｄｅ　ｌ）ｉｓｍｕｔａｓｅ　
）曾ｏＬ、Ｉ、ＯＲＯゾレス、フロリダＴ　１５　（１
９８２）　ｌ帥、３２−３３）。 天然ヒ）８０Ｄはグリコジル化されている〔ヒユーパー
、ダブリ５．　、　（Ｈｕｂａｒ、　Ｗ、　）、１９７
１年５月１８日付発刊米国特許第３，５７９，４９５号
〕。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　）は
自身ｙ％産生スルＩ　／Ａｌ　’ｆｃグリコジル化しな
いので、細菌産生ヒ）ＳＯＤは殆んど全くグリコジル化
されていない。細菌産生８０Ｄアナログのアミノ酸配列
は成熟ヒ）８０Ｄのアミノ酸配列と同一でろシ、Ｎ−末
端にメチオニン残基を含まない。 実施例１２ ヒトアポリポプロティンＢ３（人ｐｏ−１３）Ｉ　　ｐ
ＴＶ−１７０ ｐＴＶ−１７０の構築は、第２０図に示されかつ前記図
面の説明中に記載されている。ｐＡｐｏＥ　−’ＢＸ２
−（人ＴＯＯＡ３９７８７）由来のＮｄｅ　Ｉ　−Ｎｄ
ｅ　Ｉ　Ａｐｏ−Ｆｉ　３フラダメントを発現ベクター
９５７９の非反復Ｎｄｅ！部位に挿入して、プラスミ）
’ｐＴＶ−１７０を得た。 ｐＴＶ−１７０を当業者に公知の方法を使用する形質転
換によシ大腸菌（Ｂｓｃｈａｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　
）菌株人１６４５に導入した。得られたクローンを増殖
させると、多分天然ヒト人ｐｏ　Ｆｉ　３のアミノ末端
に付加されたアミノ酸メチオニンを有するヒ）　Ａｐｏ
　Ｅ　３が産生された。産生されたヒ）　Ａｐｅ　Ｅ　
３アナログの量は、クーマシー染色８Ｄ８ポリアクリル
アミドゲルの走査によシ計算すると、細菌により産生さ
れる総タンノックの約１％であった。菌株を増殖するの
に使用した方法は実施例１７に記載されている。 ＩＩ　　ｐＴＶ−４９４ ｐ’ｆｆ−１９４の構築は第２２図に示されかつ前記図
面の説明中に記載されている。ｐＴＶ−１７０（第２０
図）から、ＯπすＩソーム結合部位をＰＢＬＡＩＩ由来
のβ−２クタマーぜプロモーターとりゼソーム結合部位
で置換すると、ｐＴＶ　　１９４が誘導された。ｐＢＬ
Ａｌｌは、ｐＢＲ３２２中の座標４１５７と４３５３０
間にあるβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーターとり一
ンーム結合部位とを含む。ＥｃｏＲＩリンカ−をプロモ
ーターの上流に付加し、マルチ制限部位リンカ−を開始
コドンＡＴＧの直後に付加した。 従って、開始コドンを始めとするコード鎖の配列は、Ａ
ＴＧＡＧＯＴＯＴＡＧ人人ＴＴＯである。ｐＢＬＡｌｌ
はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡ
ＴＯＯム３’９７８Ｂとして寄託された。 ｐＴＶ−４９４を、当業者に公知の方法を用いる形質転
換によって大腸菌（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｅｏｌ
ｉ　）菌株人１６４５に導入した。得られたクローンを
増殖すると、多分天然ヒト人ｐｏ　Ｆ３３のアミノ末端
に付加されたアミノ酸メチオニンを有するヒト人ｐｏＥ
３のアナログが産生された。産生されたヒト人ｐｏ　−
Ｂアナログの量は、クーマシー染色ＳＤ８　ｙｉ？リア
クリルアミドゲルの走査により計算すると、細ＷＫより
産生される総タンパクの約３％であった。菌株を増殖す
るのに使用された方法は実施例１７に記載されているｐ
ＴＶ−１７０に対する方法と同じである。 ■ｐ’ｐｖ−２１４ ｐ’ｌ’ｖ−２１４の構築は第２４図に示されかつ前記
図面の説明中に記載されている。ヒト成長ホルモンの１
４個のアミノ酸アミン末端配列をコーＰする合成りＮＡ
フラグメントをｐＴＶ−１９０の非反復Ｎｄａ　１部位
に挿入することによシ、（第２１図に示されかつ前記図
面の説明中に記載されている）ｐＴＶ−１９０からｐＴ
Ｖ−２１４を誘導した。 ｐＴＶ−２１４を、当業者に公知の方法を用いる形質転
換によシ大腸菌（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ二肚）菌株Ａ
１６４Ｓに導入した。得られたクローンを増殖及び誘発
すると、ヒト人ｐｏ　Ｅ　３のアナログが産生された。 前記アナログは、アミノ末端にヒト成長ホルモンの１４
個のアミノ酸アミノ末端配列とそれに続く成熟ヒ）　Ａ
ｐｅ　Ｅ　３の配列に付随したメチオニンとを有する。 産生されたヒト人ｐａｌアナログの量は、クーマシー染
色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの走査によシ計算する
と、細菌により産生された総タンパクの約２％てらった
。菌株を増殖するために使用した方法は実施例１７に記
載されているｐＴＶ−１７０に対する方法と同じである
。 （以下余白） 実施例１３ ｐＦＩＧ４４の増殖 １、保存培養株 ｐＨＧ４４の保存株をカゼイン培地（接種材料の項参照
）上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希釈し、−ｓ　
ｏ　’ｏで保存した。凍結培地５００１１１７中の含有
成分を以下に示す。 Ｋ２１（ＰＯ４６，３、！ｉ’ ＫＦＩ２ＰＯ４１，８、！ｉ’ クエン酸Ｎａ　　　　　　０．４ＳＰ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０９，９’ （ＮＨ４）２Ｓｏ４０．９　Ｊ グリセロール　　　４４．ＯＮ Ｌ　接種材料 接種材料を、カゼイン水解物２０１１／ｌ、酵母エキス
ｘｏｙｉｔ及びＮａＣｔ２１／Ｌ中で増殖させた。 製産フラスコ内の滅菌培地に保存株を接種し、製産器上
で３０°０及び約２００　ｒ、ｐ、ｍで１５時間培養し
た。必要に応じて、攪拌通気発酵器中で接種材料増殖の
後続段階を実施した。滅菌培地に２−１０−の接種材料
培養株を接種し、空気飽和の２０チを越えるような溶存
酸素濃度を保つように攪拌及び通気しながら３０℃、ｐ
Ｈ７±０．５で１５時間培養した。 Ｌ産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 カゼイン氷解物　　　２０１１／を 酵母エキス　　　　　　１０１１／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４２，，５ｆｉ／１ Ｍｇ８０４・７Ｈ，０１ｊｊ／１ ＮａＣｔ５ｆｉ／Ｌ ビオチン　　　　　　　０．１ダ／ｌ チアミン　　　　　　　ｌダ／を 微量元素溶液　　　　　３　ｄ／を 培地には更にアンピシリン１００ダ／ｌを含有させた。 アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材料の
増殖用に使用される培地中で常に見出されるものである
。 ピオチン、チアミン及びアンピシリンの濃縮溶液をそれ
ぞれ一過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添加した
。まず１０１１／ｌまで滅菌グルコース溶液を添加した
。誘導段階で更に１０９／ｌのグルゴースを添加した。 微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 Ｆ＠ＣＬ５　　　　　　１６ＪＦ／ｌ Ｚ　ｎ　Ｃｌ３　・４１（２０２９／ＬＣ６Ｃ１−ｚ　
・６　Ｈ２Ｏ２１１／ＬＮａｚＭｏＯ４”　２に２０　
　　２１／１ＣａＣｔ２・２ＨｚＯ１１／Ｌ Ｃｕ　Ｃ１−２１ｇ／Ｌ Ｅｌ、ＢＯ，０，５ｆｉ／ｌ ＠　ＨＣＬ　　　　　　　１００ｎｄ、／Ｌ培地に０．
５−１０チの接種材料培養株を接種し、３０℃で培養し
た。空気飽和の２０チを越えるよう々溶存酸素濃度を保
つように攪拌通気率を設定した。ＰＲは皿、で７±０．
２に維持した。細胞製麦が約３．５１／ｌ　（０Ｄ６６
ｏ＝ｌ　Ｏ）　Ｋ達してから誘導を開始し念。 温度を４２℃まで上昇させ、４２゛０を１−５時間維持
した。次に培養株を冷却し、ホルモ：ｌｆｆ１ａ署−心
分離法により細胞を回収した。 ｂＧＨの回収 ポリトロン（キネマチイカ）　（Ｐ’ｏｌｙｔｒｏｎ（
Ｋｉｎ＊−ｍａｔｉａａ））混合機を使用し、発泡を最
小化するように該混合機の速度を調節しながら、５０　
ｒｎＭＩＪン酸ナトリクム緩衝液（ｐｉｆ７．４）、５
０　ＣｎｙｉＩｉｉＤＴ人及び１００　ｍＭ　ＮａＣｔ
を含有する溶液５容量中に、細菌細胞１３に９（湿潤ケ
ーキ）を再懸濁させた。均質な懸濁液を８ｏｔ１時でダ
イノミル細胞破砕器ケー・ディー・５（クイリー・エイ
・バフ：１フエ／、ベーゼル）　（Ｄｙｎｏ＋ｎ１ｌｌ
　ａｓｌｌ　ｄｌｍｒｕｐｔｏｒ　ＫＤ５（′Ｊｖｉｌ
ｌｙ人、Ｂａｃｈｏｆ＠ｎ、Ｂｍｓ＋５ｌ））に連続的
に通し、破砕した細胞の均質懸濁液を、流量４５ｔ／時
でシー・イー・ビー・エイ（＋ＪＰ人）１０１遠心機で
遠心分離てより清澄化させた。遠心分離段階で分離され
た沈殿物を収集し、５０　ｒａＭ　ＥＤＴ人を含有する
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）、１５
．５Ｌ中に再懸濁させた。最終４度が０．０５−マ、冷
ｊになるセル音波処理装置ｉｆ（熱システム）内で１ｓ
ｔ／時で音波処理し、シー・イー・ビー・エイ・１０１
遠心機内で遠心分離した。沈殿物を収集し、５０ｍＭす
ｙ９ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）中に再懸濁させ、
前記と同様に音波処理し、シー・イー・ビー・エイ・１
０１遠心機内で遠心分離した。５０ｍＭ　ＥＤＴ人及び
１００　ｍＭ　ＮａＣｔを含有する７５０ｍＭ５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液７．４）　１　ｓ、ｓｔ中に細
胞を再懸濁させ、２度沈殿させ、蒸留水１５．５Ａ中に
再懸濁させた。遠心分離により沈殿物を収集し、−２０
℃で保存した。 ｂＧＨの精製 沈殿物を蒸留水３０−４０を中に再懸濁させ、０、５　
Ｎ　Ｎａ０ＫでｐＨ１１，８に滴定して可溶化させた。 次に溶液を連続的に音波処理し、必要に芯じてシー・イ
ー・ビー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離によ〕清澄
化させ、又はワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）随１−ｆ紙
で濾過しな。 清澄化させた蛋白質溶液（２８０ｔ＋ｍ　０Ｄ＝２９７
０００の溶液３２．６１　）を、それぞれ５００００−
６０００００Ｄの各部分（６Ｘ５．４ｔ）に分割した。 各面積５ｆｔ２０３個の１０００００分子量カットオツ
カセット（ビー・ティー・エイチ・ケーＰＴＨＩＫ型）
を備えるｌミリポア拳ベリコン（Ｍ１１１１ｐｏｙｒ＠
Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ）限外−過器で各部分をそれぞれ限外
濾過した。 ５．４ｔ部分を保持物（ｒ＠ｔｅｒＬａｔｅ）容１！に
１ｔまで濃縮した。限外濾過物を収集し、保存した。保
持物をｐＨ１１，８の別の１０ｍＭホウ酸塩８１衝液で
当初の容量まで希釈し、十分混合した。バッチを保持物
容量１ｔまで再び濃縮した。限外濾過物を収集し、先の
限界濾過物と混合した。両者の限外濾過物中のＯＤの合
計値がβ、限外濾過器に初期にチャージされたＯＤの２
０１になったら、次の濃縮段階の保持物容量を１６でな
く　Ｏ，Ｓ　ｔとした。０．５ｔの保持物容量からの限
外濾過物の吸光度が２８０ｎｒｎ（ＩＣＩＩＬセル）で
０．１よシ小さくなるまで、濃縮及び１０ｒｎＭホウ酸
塩優衝液による希釈のサイクルを継続した。一般に、濃
縮及び希釈サイクル数は９から１２の範囲とした。最終
保持物を排出した。 全限外−過物を合し、６　Ｎ　ＨＣｌでｐｌ’！　９．
０　ｉＣ！１１整した。別の５．４を部分を同様に限外
濾過し、ｐＨ調整済みの全限外濾過物を合した。代表的
な一工程から、０Ｄ＝ｌＯＯ０００に相当するｌ吸光度
０．２６の限外−過物価量３８０１が産生され、所要時
間は２４から４０時間であった。 １００に限外−過段階で合した限外ＦｉＡ物（２８０ｎ
ｍで０Ｄ＝１０００００の濾過物３８０ｔ）を、線形流
速２３ｃｎ／時（２５ｔ／時）でセファロース・シー・
エル・６・ヒー、ティー・イー・ニー・イー（Ｓ＊ｐｈ
ａｒｏａｅ　ＣＬ−６８ＤＥＡＥ）イオン交換カラムに
通した。直径３７二、高さ１５ｃＷＬのカラムを、ｐｉ
ｆ９．０の１０ｍＭホウ酸塩緩衝液２床容量（３２Ｌ）
で洗浄した。充填及び洗浄段階からの溶出液を排出した
。溶離液を段階的に１０ｍＭホウ酸塩、１００ｍＭ塩化
ナトリウム、ｐＨ９に変化させ、ｂＧＨをカラムから排
出した。溶出流速は２ｋｉ／時とした。２８０　ｎｍに
おける溶出液の吸光度を追跡することによシ、工程の進
行を監視した。ｂＧＨピークを４から５床容ｉｉ　（２
８０ｎｍで０Ｄ＝４３０００の容量８４ｔ）収集した後
、１００００分子量カットオフカセットを有するミリポ
ア・ベリコン限外濾過器を使用して約１０Ｉ９〆ａに澁
縮した。次に溶液を凍結乾燥した。収量は、純粋ｂＧＨ
約７ｏｌであった。 実施例１４ ノアツセイ比較 リン酸塩でｐＩ（を調節した食塩水（１チＢＳ人）中に
ｂＧＨアナログ１００　ｎ　ｇ／ａｌを含有する溶液を
課陛した。該溶液を逐次、濃度５０．２５　、１２．５
．６．２５　。 ３．１２　、１．５６及び０．７８ｎｇ／Ｌに希釈した
。これらの溶液の０．１−アリニー）ｆ対に対して、二
抗体法【よ）８１人を行った。希釈曲線は、天然ｂＧＨ
で得られる場合と同等であった。 ２、　ラジオレセプタ結合アッセイ トレーサとして”５Ｉ−ｂＧＨ及び較正曲線用として真
正ｂＧＨ溶液を使用し、ツシマ・ティーＴ１１８ｈｉ−
ｍａ、Ｔ及びフレイセ／・エイチ・ジーＦｒ５ｌｓａｎ
。 Ｈ，Ｇ（ワイ・チン［内分酪代謝Ｊ　Ｙ＋Ｃｈｌｎ、Ｊ
ｎｄｏｃｒＭｅｔａｂ、（１９７３）、３７．３）によ
り記載されているように、ウサギ肝臓膜でラジオレセプ
タ結合アッセイを行った。アッセイ用緩衝液Ｑ、３ｍ（
５０城トリス、１５ｍＭＣａＣｔ２及びクシ血清アルプ
ミμｇの禍艷に２００００　ｃｐｍ）、肝ａＳ蛋白質１
５０−２５０μｇ、及び天然ｂＧＨ（１−１１００ｎ　
）又は細菌ｂＧＨエキスのいずれかを充填した。その結
果、ｂＧＨアナログのｂＧＨ活性は天然ｂＧＨのｂＧＨ
活性と同等であることが認められた。 ３、ａ骨試竣 実施例１３に従い細菌細胞から回収したｐＲＯ１２から
産生したｂＧ■アナログの生物活性を脛骨試験によシ評
価した。（パーロク・エイ・二）他「分泌学Ｊ　Ｐａｒ
ｌｏｗ、人、！、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ（１９６５）７７．１１２６参照。）ラッ
トの下画体を２８−３０日蝕で切除した後、無処置で１
０−１４日日間−た。ウシ下垂体又は組換体大腸菌（Ｅ
ｏｃｈ＠ｒｉｅｈＬａ　ｃｏｌｔ）から誘導され九クシ
成長ホルモンをｐＨ１０，０の０．Ｏ１ｌ’ｌホク酸塩
と共に０．１５ＭＮａ　ＣＬに溶解させた。ラット（１
群４−７匹）に毎日ｂＧＨ溶液（０，２ａｃ中に５−１
２５μｇ／日）を５日間皮下注射し、この間常用飼料（
プリナラットチャク及び任意に水）を与え続けたつ動物
を６日月に殺し、前脚膝骨を取出し、長手方向に切断し
、アセトンで固定し、２チ人ｇＮｏ３で染色した。解剖
用双眼鏡にコ／）で観察することにより前端板の幅を測
定した。平均値（ラット１匹当た〕の読み４０回）を使
用して長い投与一応答曲線を形成した。この結果、ｂＨ
Ｇ４４から産生したｂＧＩ（アナログのｂＧＨ活性は天
然ｂＧＨのｂＧＨ活性と同等であることが認められた。 実施例１５ ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１の増殖 Ｉ、保存培養株 ｐ　８０Ｄβ、Ｔ１．の保存株をカゼイン培地（接種材
料の項参照）上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希釈
し、−８０°Ｃで保存した。凍結培地５００ｄ中の含有
成分を以下に示す。 Ｋ２１（ＰＯ４６，３、ｐ Ｋ■２ＰＯ４１，８ｆｉ クエン酸Ｎ亀　　　　　　　０．４５．９ＭＫＳＯ４・
７Ｈ２００，０９ｇ （ＮＨ４）２Ｓｏ４０．９　　ＪＦ グリセロール　　　　４４．０　７７ ■、接種材料 カゼイン水解物２０１／ｌ、酵母エキス１０ｊｉ／を及
びＮａＣＡ　２ｇ／Ｌ中で接種材料を増殖させ念。製置
フラスコ内の滅菌培地に保存株を接種し、３０℃及び約
２００ｒ、ｐ、ｍでｊＩｉｊ＆器上で１５時間培養した
。 必要に応じて攪拌通気発＃器中で接種材料増殖の後続段
階を実施した。滅菌培地に２−１Ｏチの接種材料を接種
し　空気飽和の２０１を越えるような溶存酸素濃度を維
持するように攪拌及び通気しなから３０゛０、ｐｉ（７
±０．５で１５時間培養した。 ■、産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 カゼイン氷解物　　　　　２０ｊｌ／を酵母エキス　　
　　　　　１０ｆｉ／１Ｋ２ＨＰＯ４２，５１１／１ ＭｇＳＯ４・７１（２０１９／１ ＮａＣ２Ｓ　　１／Ｌ ビオチン　　　　　　　　　０．１ダ／ｌチアミン　　
　　　　　　　１　グ／を微量元素溶液　　　　　　　
３　づ／ｌＣｕ　Ｓ　Ｏ４０−８ｇ／Ｌ ＺｎＳＯａ　　　　　　　　　　１０　’Ｑ／Ｌ培地に
は更にテトラサイクリン１２．５Ｍ９／Ｌを含有させた
。テトラサイクリンは産生に任意の成分であるが、接種
材料の増殖用て使用される培地中には常に含有されてい
る。 ビオチン、チアミン及びテトラサイクリ／の濃縮溶液を
それぞれ濾過滅菌し、接ｉ以前の滅菌産生用培地に添加
した。滅菌グルコース溶液をまず１０１１／ｌまで添加
した。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコースを添加し
た。 微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 ＦｅＣ１５１６Ｎ／１ ＺｎＣ１，・４１（２０２２１／１ ＣｏＣ１２’６Ｈ２０２１１／ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４”２Ｈ２０２１／１ ＣａＣ１２・２Ｈ２０１１／１ ＣＥＩＣＩ□ｌ　　１／Ｌ ＨｓＢｏｓ　　　　　　　　　Ｏ，５／ｌ／Ｌ濃、　Ｈ
ＣＩ　　　　　　　Ｚｏｏ　ｔｄｔ／を培地に０，５−
１０俤の接種材料培養株を接種し、３０℃で培養した。 空気飽和の２０チを１えるような溶存酸素一度を維持す
るように攪拌通気率を設定した。ｐＨをＮＨ，で７±０
．２に保った。Ｍｉ胞濃度が約３．５１１／ｌ　（００
６６゜＝１０）に達してから誘導を開始した。 温度を４２℃まで上昇させ、１−５時間４２°０を保っ
た。次に培養株を冷却し、酵素精製蝉漏心分離法によ）
細胞を回収し念。 ＳＯＤの回収 発泡を最小化するように速度を調節しながらポリトロン
（キネマチイカ）混合機内で５０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７，８）１２を中に細菌細胞１．５　ｋｇ（湿潤
ケーキ）を懸濁させた。均質患濁液をダイノミル細胞破
砕器ケー・ディー・５（クイジー・エイ・パショ７エン
、ベーゼ／Ｉ／）に連続的に通過させ念。連続７０−セ
ルを使用して破砕細胞の均質懸濁液を音波処理し、シー
・イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離した。 上清を６５°０で２時間加熱し、冷却して前記と同様に
遠心分離した。１００００分子量カットオフカセット（
ビー・ティー・ジー・シー型）を使用するミリポアペリ
コン限外濾過装置内で清澄な上清をＩＬまで凸縮した。 ａａ！された蛋白質溶液を、１５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，８）で平衡化されたディー・イー・
エイ−・イー・セファロースカラム（２ｋｇディー・イ
ー・エイ・イー・セファロース）に通した溶液中の流れ
を収集し、濃縮し、ベリコン限外濾過装置内でｐ　Ｈ７
ｆ３の２０ｍＭ）リスＩ（Ｃ２で透析してから、２０ｍ
Ｍ）リスＴｌＣ１緩衝液で平衡ｒヒされたキュー・エイ
・イー・セファロースカラム上にｌ′ｙ１ｊ、へた。ｐ
Ｈ７，８の２０　ｒｎ！Ｊ　）リスＨＣｔ緩衝液及び塩
勾配（０−２００＋ｎＭＮａＣｔ）でカラムを展開させ
た。ＳＯＤ含有７ラク７ヨンを収集し、ペリコン限外濾
過装置で濃縮し、蒸留水で透析した後、ｐＨ４，８のＩ
Ｍ酢績ナトリウム緩衝液を添加することにより１０１０
０ＱＩ！２ナトリクムとした。 ｐＨ４，７の１００ｍＭ酢酸ナトリウム優衝液で平衡化
されたシー・エム・セファロースカラム上で蛋白質溶液
を更に分離した。同−緩衝液及び塩勾配（１００−５０
０ｍＭＮａＣｔ）を使用してカラムを展開させた。ＳＯ
Ｄ含有フ２クションを収集し、ペリコン限外−過装置で
濃縮し、凍結乾燥した。 実施例１６ マツクコード及び７リドヴイチ、生化学誌（コｖＭｃ、
ｃｏｒｄ　ａｎｄ　Ｆｒ１ｄｏｖｌｃｈ、　Ｊ、ＢＡｏ
ｌ、Ｃｈ＠ｍ、）（１９６９）、２４４．６０４９−６
０５５　Ｋ記載されティるように７エリシトクロム・シ
ーの還元抑制を監視することくより、実施例１５のｐ　
ＳＯＤβ、　’ｒＴ−１により産生されたＳＯＤアナロ
グの酵素活性を分析した。その結果、ｐｓＯＤβ、　Ｔ
Ｔ−１から産生式れたＳＯＤアナログの活性は、天然の
ヒトＳＯＤの活性及びウシＳＯＤ　（オルゴテイン：グ
リセロ−ル・ゲ実施例１７ ■、保存培養株 ｐＴＶ−ｔ’ｙｏの保存株をカゼイン培地（接４材料の
項参照）上で増殖させ、凍結培地で２倍に希釈し、−８
０′ｏで保存し死。凍結培地５００ｍ１中の含有成分を
以下に示す。 Ｋ２ＨＰＯ４６，３、Ｆ Ｋ２ＨＯ４１，８Ｉｆ クエン！！Ｎａ　　　　　　　　　Ｏ，４５，！ｉ’陶
Ｓ０４・７Ｈ２００，０９ｇ （ＮＨ４）２Ｓｏ４０．９　　ｇ グリセロール　　　　　４４．０　　ｇ■、接種材料 カゼイ／水解物２０１１７１％酵母エキス１０ｊｉ／を
及びＮａＣｔ２１／を中で接種材料を増殖させた。製産
フラスコ内の滅菌培地に保存株を接４し、３Ｉ盪器上で
３０℃及び約２０Ｏｒ、ｐ、ｍ　で１５時間培養した。 必要に応じて、攪拌通気発酵器内で接種材料増殖の後続
段階を実施した。滅菌培地に２−１０俤簸種材料を接種
し、空気飽和の２０チを越えるるような溶存酸素６ｍを
保つように攪拌及び通気しながら３０℃、ｐＨ７±０．
５で１５時間培養し之。 厘、産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 カゼイン氷解物　　　　　　２０　１／を酵母エギス　
　　　　　　　ｘｏｐｉｔＫ２）ＩＰＯ４Ｚ、５１１／
Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１１／１ ＮａＣＬｓ　　ＩＩｌ ビオチン　　　　　　　　　　　０．１ダ／ｌチアミン
　　　　　　　　　１　ｍｆ／を微量元素Ｓ液　　　　
　　　　３　　ｄ／Ｌ培地には更にアンピシリン１０（
Ｉｆ／ｌを含有させた。アンビシリｙは産生に任意の成
分であるが、接１材料の増殖用として使用される培地中
には常に見出される。 ビオチン、チアミン及びアンピシリンのＤ１ｋｍ溶液を
それぞれ一過滅菌し、接種以酌の滅菌産生用培地に添加
した。滅菌グルコース溶液をまず１０ｆｌ／ｌまで添加
しな。誘導段階で更にｘｏｐ／ｌのグルコースを添加し
た。 微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 ＦｅＣｌ３　　　　　　　１６　　Ｆ／’ＬＺｎＣ１ｚ
・４Ｈ２０２ｆｉ／Ｌ ＣｏＣ１２’６Ｈ２０２９／ｌ ＮａｚＭｏＯ４・２Ｈ２０２１／Ｌ ＣａＣ１ｚ２Ｈ２０１ｇ／’ ＣｕＣｌ２　　　　　　　　１　１／ｌ−Ｈ，Ｂｏ、　
　　　　　　　　０．５１／を濃、　Ｉ（ＣＩ　　　　
　１００１１１／を培地に０．５−１０チの接種材料培
養株を接壇し、３０℃で培養した。空気飽和の２０チを
越えるような溶存酸素濃度を保つように攪拌通気率を設
定した。ＰＨをＮ１（ｓで７±０．２に維持し念。細胞
ａ度が約３．５１／ｌ　（ＯＤ、６ｏ＝　１０　）に達
してから誘導を開始した。 分離済によシ細胞を回収した。 実施例１８ ウシ成長ホルモン ｐＨＧ５０ ｐａｃｓｏの構築は第６図に示され、図面の説明中に説
明しである。ＩＩＨＧ４４（エイ・ティー・グー・シー
・人ＴＣＣ番号３９８０６）の単一〇Ａｍ　１部位にｐ
ｓＫ４３４　（人ＴＣＣ番号３９７８４　）のＨｐａ■
−Ｈｐａｌλｃ工４５４　ｙ　ｙグメントを挿入するこ
とによシブラスミドｐＨＧ５０を得意。同様にしてプラ
スミドｐＨ０５１を構築した。しかし乍ら、プラスミド
λ１ｍｍ　４３４をＢａｎ　ＨＩで消化し、Ｒａｍ　Ｉ
Ｉで消化されたｐＢＲ３２２に混合物を連結させること
によシｐＳＫ４３４　（ＡＴＣＣ番号３９７８４）を構
築した。連結された混合物で大腸画人２０９７を形質壜
換し、λｉｎａｍ　４３４ｃ１３００３フアージに免疫
性のコロニーを単離した。これらのコロニーの１個から
単離したプラスミドｐｓＫ４３４は６　ｋｂ　Ｒｍｍ　
Ｋ■７ラグメントを含んでおシ、該フラグメントはλｃ
１４３４遺伝子を含んでおシかつＮ遺伝子外からＰ遺伝
子外に伸びていた。ｐｓＫ４３４は第６図の制限地図を
有する。 当業者く公知の方法を使用する形質転換により、ｐＨＧ
５Ｑ及びｐＨＧ５１を大腸画人１６４５に導入し九。 得られたクローン、それぞれ人３１０８及びＡ３１１２
は、増殖及び誘導後、フェニルアラニノ形天然ｂＧＨの
アミノ末端に付加されたアミノａ配列ｍａｔ−＊ｓｐ−
ｇ１ｍを有するｂＧＨアナフグを産生じた。産生された
ｂＧＨアナログの量を、クーマシーで染色したニス・デ
ィー・ニス・ポリアクリルアミドゲル今蕃十表→を走査
することによシ計算した処、細菌によシ産生される４蛋
白質量の３７−４２チの範囲であった、（第１表） プロファージ導入 λｃＩ４３４選択系を使用するためには、ｐＨＧ５０を
含有する細胞がプｌ：＋７アージλ１ｍｍ４３４ｄ−を
も含有していなければならない。本願発明者はプロファ
ージとして１１ｍｍ４３４ｅ１３００３ｍｌｎｉ　Ｔｒ
１１０Δ１６Δ１７を使用した。珍に起こる安定的々プ
ロファージ挿入現象の単離を容易圧するために、ｎ５ｌ
ｎｉ　ＴｎｌＯΔ１６Δ１７テトラサイクリン耐性マー
カ（フォスター他、細胞（Ｆｏｓｔ＠ｒ、　＠ｔａ１．
。 Ｃ＠１ｌ）（１９８１）２３，２０１−２１３）を７ア
ージ中に導入した。他方、この結果、デトラナイクリン
耐性を監視することＫよシ、プロ７アージの存在を簡単
に試験することも可能になつ念。 アンピシリンの存在下で増殖したグラスミドｐＨＧ５０
　を含有する大腸菌菌株人１６４５に、３０゛０で低感
染多重度で１１ｍｍ４ｌｍｍ４３４ｃＩ３００３　Ｔ＋
１０Δ１６Δ１７を感染させた。テトラナイフリン耐ａ
Ｉコロニーを単離し、精製した。前記菌株はアメリカ菌
寄託センター（λｍ＠ｒｉｃｍ＋ｘ　Ｔ）Ｉｐ＠　Ｃｏ
Ｉ１ｅｅ　−ｔｌｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ）にλＴＣＣ番号
３９８０５で寄託されている。 別の方法として、大腸菌１６４５をｐＨＧ５０及び２１
ｍｍ４３４ｃＩ　３００３ｍｉｎｉ　ＴｎｌＯΔ１６Δ
１７で同時に形質転換し、アンピシリン及びテトラサイ
クリンの双方に耐性のコロニーを選択することにより、
プロ７アージを導入した。ベクター及びプラスミドに好
適な宿主は、人１６３７．人２６０２．人１５６３゜人
１６４５　（Ｃ６００ΔＥΔＢａｍＨＩｒ−″ｍ”ｇａ
ｌ”ｔｈｒ−１＠ｇ−Ｂｌ　）又は人２０９７（人１６
４５１ａｃΔＸ人２１゜ｐｒｏｃ：：Ｔｒ＋１０）を包
含する形質転換に好適な大腸菌の菌株である。上記と同
様にして所望のプロ７アージを全菌株に導入することが
できる。 ｐＨＧ及びｂＧＨ遺伝子の切除によ勺該ｐＨＧから誘導
され得るベクターは、従来開示されている発現ベクター
に対して、以下の点を含む多くの利点を有する。 １、グラスミド安定性の改良 グラスミドは、１１ｍｍ４３４ｅｉ−溶原素を抑制する
６エリグレツサ遺伝子を含んでいる。グラスミドが損失
すると、１１ｍｍ４３４ａＩ−プロ７アージ銹導により
ＮＥＷ細胞溶菌が生じる。従って、高価な抗生物質選択
系を使用しなくてもグラスミドは安定的に保たれる。第
１表は、ｅ工　　安定化系を有するグラスミドの高安定
性を示している。 λＰＬグロプロタの不耐熱性すグレツサがＣＸであるに
も拘らず、ｃＸ４３４プラスミド安定化系は、熱誘導性
λＰＬプロモータ発現系と同時に利用することができる
。 ２１ｍｍ４３４ｃＩ−プロ７アージはいずれもλｉｍｒ
ｎ４３４ｃＩ３００３プロファージとＵｎできるこプロ
７アージきであるう又、任意の抗生物質耐性マーカを先
に＋ｎ１ｎｌ　ＴｎｌＯΔ１６Δ１７に導入したテトラ
サイクリン耐性マーカと置臭することができる。 ２１ｍｍ２１及びλｌｔｎｍ２２のリグレツサマイナス
突然変異体が入手できるので、λ４３４系の代わシに７
アージ２１又はファージ２２の同等の系を使用すること
ができる。 ２、非常に高い発現レベル このプラスミドは、徳細胞蛋白質の４２チという高レベ
ルで大腸菌中に外来蛋白質を発現させることが可能であ
る。この発現レベルは、Ｔ、Ｔ２転写終結配列を含まな
い他の同様のλＰＬプラスミドについて記載されている
発現レベルよりも高い。 ３、転写終結暗号 プラスミドは、λＰＬグロプロタ及びＣＩリボソーム結
合部位の「下流」Ｋ配置されたＴ、Ｔ２転写終結暗号を
含んでいる。Ｔ、Ｔ２転写ターミネータはＮ修飾ＲＮ人
ポリメ２−ゼの転写を終結させ得るので、このグラスミ
ドを使用する場合に得られる高発現レベルは部分的に、
挿入遺伝子の端部にあるＴ、Ｔ２転写ターミネータの存
在に起因し得る。従って、この転写ターミネータは好ま
しくないプラスミド蛋白質のλＰＣ，制御転写を阻止し
、その結果、所望の蛋白質の相対収量を向上させる。 ｐＨＧ５０は、リボソーム結合部位の「上流」に位置す
る１個のＥａｏＲ１部位と、ＡＴＧ開始コドンに位置す
るＮｄ・工部位１個とを含んでいる。従って、リボソー
ム請合部位は２個の別々の制限部位によ）その両端が定
められている。このため、プラスミドの他の特徴を変え
ることなく、容易に現在のリボソーム結合部位（λＣ１
リボソーム結合部位）を切除して別のほとんどあらゆる
天然又は合成リボソーム結合部位にＩｆ２換することが
できる。こうして、所望のポリベチドの最適発現が著し
く容易になる。 ＆　発現の熱誘導調節 λＰＬグロプロ夕は、Ｃ，リプレッサが賭金していると
きは不活性である。ｃＩ８５７リプレツサは熱感受注で
ある。即ち該リプレッサは３０’Ｏではプロモータに結
合するが、４２°０では不活性化する。 従って、発酵温度を４２℃に上昇させることにょシ、宿
主細菌は所望の蛋白質を産生ずるように誘導される。 このような系の利点を以下に述べる。 （ａ）　　大腸菌に対して毒性の外来蛋白質が後期に産
生され得るので、発酵プロセス中における初期細胞死が
避けられる。 （ｂ）　　Ｒ白質の過剰産生によ）蛋白質が安定化し、
蛋白質分解が阻止され得る。（チェノ、ワイ・イー他、
遺伝子（Ｃｈｓｎｇ、Ｙ、Ｅ、、ｅｔａｌ、、Ｇ＊ｎ５
）（１９８１）１４，１２１）。従って、λへのよう々
厳密に調整されたプロモータを使用する「一時的」過剰
産生の方が、連続的低レベル産生よシも好適である。 ６、誘導プロトコールの単純化 ｐ）ＩＧ５０は約４２℃で誘導され、蛋白質合成期間を
通して４２°Ｃに保たれる。本願出願人名義の米国特許
出願第５１４１８８号に′２戟されているｐ篤１００及
びｐＮＤ５から誘導されたプラスミドの誘導プロトコー
ルは、４２℃で誘導後、３８°０の増殖期間を設けるこ
とを定めている。ｐＨＧ５０中誘導プロトコールは３８
°０まで冷却する段階を必要としないので単純である。 ７、高コピー数 グラスミド上【見出されるｐＨＧ５０中のλＰｔ、Ｐｔ
上−タは、大腸菌中の入形質導入ファージベクターよシ
もコピー数が多い。従って、発現レベルが向上する。 この発現ベクターは、強力な原核性リボソーム結合部位
（ＲＢＳ）及び翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を含んでいる
。従って、開始コドンを添加することなくあらゆる真核
性遺伝子がクローン化され得る。更に、高効率のＲＢ８
は発現レベルを向上させろ。リボソーム結合部位はλＣ
■リボソーム結合部位である。リボソーム結合部位の配
列を以下に示す。 １個の塩基対が、野性型λに見出されるリボソーム結合
部位と異なっている。 プラスミドから誘導される発現ベクターは、部位内にＡ
ＴＧ開始コドンを含む１個のＮｄｅ　Ｉ制限部位を有し
ている。従って、所望の遺伝子の適正な配置が可能にな
る。該１個のＮｄｅＩ部位は、リボソーム結合部位のす
ぐ後に見出される。 １０、　　ｎｕｔ部位 宿主によシ供給されるＮｆ白久は発現ベクター上のＮｕ
ｔ部位に結合し、従って、ｔ０部位ておける転写終結又
はクローン化遺伝子内の早期転写終結を阻止する。 第１表 ｃＸ４５４系によシ得られるプラスミド安定性人３１０
２　　　ｐ）ＩＧ４４　　　人２０９７　　　　　　　
　　　　１０−２０人３１０８　　　ｐｉ（Ｇ５Ｑ　　
　人１６４５　　　　　　　　　　　１０−２０人３１
０９　　　ｐＨ０５０人１６４５　　　　　　　　　　
　＜１．０（λ１４３４ｃＩ−ｍｉｎｔ　ＴｎｌＯ）人
３１１２　　　ｐＨＧ５１　　　人１６４５　　　　　
　　　　　１０−２０人３１１３　　　ｐＨＧ５１　　
　人１６４５　　　　　　　　　　　　＜１．０（ハ４
３４ａＩ−ｍｉｎｔ　　　ＴｎｌＯ）菌株人３１０８及
び人３１１２に３０°Ｃで１１ｍｍ４３４１−ｍ１ｎｔ
　Ｔｎｌ　Ｏを感染させ、テトラサイクリン耐性コロニ
ーを分離した。コロニーを精製し、アンピクリン耐性を
試験した。単一のコロニーを選択し、アンビリン５０μ
ｇ／ｒＬｌを含有するＬＢ培地中で３０°Ｃで一晩増殖
させた。培養株をＬＢ培地で１／１０００に希釈し、約
５　Ｘ　１０８株／ｄに増殖させ、更に別のＬＢで１／
１００ＯＯＯＫ希釈し、−晩増殖させた。ＬＢプレート
上及びアンピシリン５０μｇ　／ｍｌを含有する／ＬＢ
プレート上に試料を展開させた。 各ＬＢプレートから約５０コロニーを抽出し、アンピシ
リンを含有するＬＢプレート上の増殖について調査した
。その結果、選択されたクローンのプラスミド安定性が
確認された。 実施例１９ ｐＨＧ５０の増殖 １、保存培養株 ｐＨＧ５０の保存株をカゼイン培地（接種材料の項参照
）上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希釈し、−ｓｏ
’ｏで保存した。凍結培地５００ｒ！Ｌｌ中の含有成分
を以下に示す。 Ｋ２ＨＰＯ４６，３Ｊ ＩＣＨ２ＰＯ４１，８Ｎ クエン酸Ｎ息　　　　　　０．４５．９Ｍｇ５Ｏ４−７
Ｉ（２００，０９Ｉ！ （皿、）２８０４０．９　　Ｎ グリセロール　　　　　４４．０　　／Ｉ■、接種材料 カゼイン水解物２０１／１１酵母エキス１ｏ７を及びＮ
ａＣ４２１／Ｌ中で接種材料を増殖させた。製産７ラス
；内の滅菌培地に保存株を接種し、製産器上で３０℃及
び約２０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１５時間培養した。必要に応
じて攪拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実施
した。滅菌培地に２−１０俤の接種材料を接種し、空気
飽和の２０チを越えるような溶存ａ素濃度を保つように
攪拌及び通気しなから３０°０、ｐＨ７＋０．５で１５
時間培養した。 Ｌ産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 カゼイン氷解物　　　　　　２０　１／を酵母エギス　
　　　　　　１０１／１ Ｋ２ＨＰＯ４２，５，！／ｌ 々ＳＯ４・７Ｈ２０１１／Ｌ ＮａＣ６５１／Ｌ ビチオン　　　　　　　　ｏ、ｉ号／ｌチアミン　　　
　　　　　１　　ｍ９／１ａｆｋ元素溶液　　　　　　
３　プ／を培地にはアノピクリンｌｏｏｍｙ／ｌｔｔ更
に含有させた。アンピシリンは産生知任意の成分である
が、接種材料の増殖用として使用される培地中に常に見
出される。 ビオチン、チアミン及びアンピシリンの、ｉ縮溶液をそ
れぞれｐ過滅菌し、接種以前の滅Ｍ産生用培地に添加し
た。滅菌グルコース溶液をまず１０Ｆ／ｊまで添加した
。誘導段階で更にｘｏｇ７ｔのグルコースを添加した。 微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 Ｆ・Ｃ１，１６１／１ ＺａＣ１２−４Ｈ２０２１７１ ＣｏＣ１２’６Ｈ２０２Ｅ／ｌ Ｎａ　２Ｍｃ＋０４　・２Ｈ２０２１／ＬＣａＣｌ２’
２Ｈ２０１ｆ！／１ ＣｕＣ１ｚ　　　　　　　　　１　１／ＬＦｆ３ＢＯ３
０，５Ｅ／ｌ ｊａ　　ＨＣｌ　　　　　　　　　１００　　ｍｌ／１
培地に０．５−１０俤の接４材料培薯株を接１し、３０
℃で＠養した。空気飽和の２０１を越えるような溶存酸
素４度を保つように攪拌通気率を設定した。ｐＨをＮＨ
，で７±０．２に維持した。細胞１度が約３．５１／ｌ
　（０Ｄ６６ｏ＝　１０　’）に達してから誘導を開始
した。 ＠変を４２°０に上昇させ、４２℃を１−５時間維持し
た。次（培養株を冷却し、ホルモン精製用に遠心分離法
により細胞を回収した。 （以下余白） 実施例２０ ｐ８３００−１ＯＡ ｐ８３００−１０人（ＡＴＣＣ番号３９７８５）の構築
は第７図に示され、図面の説明中に説明されている。構
成多コピーａｆ９スミドｐＯＰ１ｇ　（グルファント、
ディー・エイチ他、ピー・エヌ・エイ・ニス　（ｑｅｌ
ｆａｎｄ、Ｄ、Ｈ，、ａｔ　ａｌ、、ＰＮＡＳ（１９７
８）Ｊ７，５８６９）ミュージング他、細胞（Ｍ＠１１
８ｌｎｇ、ａｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ）（１９８１）２４
．２３５−２４２）からグラスミドｐ８３００−１ＯＡ
を誘導した。同じく第７図に示すｐ７２００−２２を旦
１ａ　Ｉで消化し、λＰＩ、プロモータ、ｂＧＩ（遺伝
子及びＴ　Ｔ２配列を含む旦１ａＩ−立１ｉＩフラグメ
／トを単離した。旦し＆Ｉ−ｍ五ＩフラグメントをｐＯ
Ｐ１副の単−Ｃ１ａ　Ｉ部位に挿入した。〔グラスミド
ｐ７２００−２２は、λＰ１プロモータの「上流」のＢ
ｇｌ　ＩＩ部位に合成旦１ｍｌリンカ−を導入させたｐ
ＳＡＬ５６００−１（第１０図）の誘導体である。 ）グラスミドｐ８３００−１ＯＡは、約４２℃における
λＰＬ７ｓロモータの誘導後も構成高コピー数表現型を
維持することが認められた。これは、ｂＧＨ配列の３″
末端にＴ、　Ｔ２終結配列が存在することに起因すると
思われるこの存在によＪ）　、ｐＯＰ１副の複製起点で
他のｍｌσＡ転写体に干渉し得るλＰＬｆロモータから
の長鎖ｍＲＮＡ転写体が形成されるのを阻止する当業者
に公知の方法を使用する形質転換によシ、ｐ８３００−
１ＯＡを大腸菌菌株人２０９７に導入した。増殖及び誘
導後にこの菌株から、フェニルアラニン形の天然ｂＧ１
（のアミノ末端に付加されたメチオニン残基金有するウ
シ成□長ホルモンのアナログが産生された。ｂＧＨアナ
ログの産生量は、クーマシー染色ニスΦディー・ニス・
ポリアクリルアンドグルの走査によシ計算した処、細菌
によ〕産生される総蛋白質の約３７−４３チであった。 菌株の増殖、産生されたｂＧＨアナログの回収、及びｂ
ＧＨアナログの精製に使用した方法は、実施例２４でｐ
ＳＡＬ−１７０／１０について記載する方法と同様であ
る。 実施例２１ 一般用発現ベクターは、ｂＧＨ遺伝子の切除によ〕グラ
スミドｐ８３００−１０Ａ　Ｃ第７図、ＡＴＣＣ番号３
９７８５　）から誘導され得る。こうして誘導されたベ
クターは、従来開示の発現ベクターに較べて以下に示す
ような多くの利点を有する。 １、著しく高い発現レベル ベクターは、総細胞蛋由質の４４チ程度の高レベルで大
腸菌中に外来１白質を発現させることが可能である。 ２、構成高コピー数 ベクターは、細胞１個当たり約２００−３００コピーの
構成高コピー数を維持する。この点は、低コピー数の他
のλＰＬ発現ベクターと区別される。 高コピー数は発現レベルの向上をもたらす。 ３、転写終結暗号 合部位から「下流」に配置されたＴ、Ｔ２転写終結暗号
を含んでいる。高発現レベルの一因は、挿入遺伝子の端
部にＴ、Ｔ２転写ターミネータが存在するという点にあ
る。というのは、Ｔ１Ｔ２暗号はＮ修飾ＲＮＡポリメラ
ーゼの転写を終結させるからである。 従って、転写ターミネータは、好ましくないプラスミド
蛋白質のλＰＬ制御転写を阻止し、その結果、所望の蛋
白質の相対収量を増加させる。更に、Ｔ１Ｔ２転写終結
暗号の存在は、グラスミドの複製起点を通って続く長鎖
ｍＲＮＡ転写体を阻止する。従って、高コピー表現型の
安定性が向上する。 λへプロモータを含んでいながら転写終結配列を含まな
い同様の高コピー数プラスミドは不安定であシ、高コピ
ー数表現型を失い易い。 ４、　　を換可能なりゼソーム結合部位ｐ８３００−１
ＯＡは、リビンーム結合部位の「上流」に配置された単
−ＥｐＢ　１１部位と、リテノーム結合部位の「下流」
に配置されたＮａｅ１部位とを含んでいる。従って、リ
キソーム結合部位は２個の単一制限部位によりその境界
が定められている。従って、プラスミドの他の特徴を変
えることなく、容易に現在のリテンーム結合部位（λＣ
ｌ［ＩＪ　＆ソーム結合部位）を切除、かつほとんどの
他のあらゆる天然又は合成り♂ソーム結合部位と置換す
ることができる。その結果、所望のポリペプチドの最適
発現が著しく促進される。 ５、発現の熱誘導調節 λＰＬプロモータは、ＣＩリプレッサが結合していると
きは不活性である。＝ｃＩ８５７リプレツサは熱感受性
である。即ち該リグレツサは３０℃でｆロモータと結合
するが、４２℃では不活性化される。 従って、発酵温度を４２℃まで増加させるととくより、
宿主細菌は所望の蛋白質を産生ずるように誘導される。 このような系の利点を以下に述べる。 （１）大腸菌に対して毒性の外来蛋白質が発酵プロセス
の後期に産生され得るので、早期の細菌死が避けられる
。 （”ｏ）　　Ｉｉ蛋白質過剰産生によシ蛋白質が安定化
され、蛋白質分解が阻止される。（チェ７、ワイ・イー
他、遺伝子（１９８１）１４，１２１）。従って、λＰ
！、のような厳密に調整されたプロモータを使用する「
一時的」過剰産生の方が、連続的低レベル産生よりも好
適である。 ６、誘導プロトコールの単純化 本願明細書及び本願出願人名義の米国特許出願第５１４
１８８号中に記載のプラスミドによる蛋白質産生け、熱
感受性９１８５７１Ｊプレツサにより調節される。 前記米国特許出願中に記載のプラスミドに必要な誘導！
ロトコールは、４２℃の誘導後に３８℃で増殖させるこ
とを定めている。一方、グラスミドｐ８３００−１ＯＡ
又はＰＳＡＬ−１３０／１５又はそれらのグラスミド誘
導体を使用する場合の蛋白質合成の最適誘導では、４２
℃で誘導後、同一温度、即ち４２℃で増殖を行った。従
って、発酵器を冷却する必要がなくなる。 ７、すメンーム結合部位及び開始コド／この発現ベクタ
ーは、強力な原核性りＩソーム結合部位（ＲＢ８）と翻
訳開始：トン（Ａ’ｒＧ）とを含んでいる。従って、開
始；トンを添加しなくてもあらゆる真核性遺伝子をクロ
ーン化できる。更に、高効率のＲＢＳによシ発現レベル
が向上する。リゲソーム結合部位はλＣＩＩすメソーム
結合部位である。 す、ｙソーム結合部位の配列を以下に示す。 野性型λに見出されるりメソーム結合部位とは塩基対１
個が異なっている。 ８、好適な制限部位 発現ベクターは、部位内にＡＴＧ開始コドンを含む単一
のＮＪ已Ｉ制限部位を有している。このため、所望の遺
伝子の適正な配置が可能になる。単−Ｎ、ｊｅ、Ｉ部位
は、リコソーム結合部位のすぐ後に見出される。 ９、　　ｎｕｔ部位 宿主によシ供給されるＮ蛋白質は、発現のベクター上の
Ｎｕｔ部位に結合し、その結果、ｔ□部位における転写
の終結又はクローン化遺伝子内における早期転写終結を
阻止する。 菌株 ベクター及びグラスミドに好適な宿主は、人１６３７．
Ａ２６０２．Ａ１５６３．Ａ１６４５（ｃ６００ｒ　　
ｍ　　ｇａｌｔｈｒ−１１−１ａｃ″″ｂｌ（λｃ　１
８５７　」１ΔＢａｄＩ　Ｎ＋）　）２ＥＦＡ２０９７
（Ａ１６４５１ａｃ　〜Ａ２１　ｐｒｏＣ：：Ｔｎ　１
０）を包含する形質転換に好適な大腸菌の菌株である。 ｐ　Ｓ　Ａｎ、−１３０／ｓの構築は第８図に示され、
図面の説明中に説明しである＊　ｍｅｔ−ｐｈｅ　ｂａ
ｇ遺伝子をｍｅｔ−ａａｐ−ｇｉｎ　ｂｃＨ遺伝子に置
換することによシ、ｐ８３００−１ＯＡ（ＡＴＣＣ番号
３９７８５　）からｐＳＡＬ−１３０１５を得た。ｍａ
ｔ−ａｓｐ−ｇｉｎ　ｂＧＨ遺伝子は、ｈｊ４ｅ、　ｌ
及びＨｔｒＨＡ　　ｍ消化によりプラスミドｐＨＧ４４
　（Ｗ６図）（ＡＴＣＣ番号３９８０６　）から得た。 当業者に公知の方法を使用する形質転換によシ、ｐＳＡ
Ｌ−１３０１５を犬り菌菌株Ａ１６４５に導入した。こ
の菌株は、増殖及び誘導後、フェニルアラニン形の天然
ｂＧＨのＮ末端に付加されたｌアミノ酸配列■＋ｔ−ａ
ｓｐ−ｇｉｎを有するウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）のア
ナログを産生じた。ｐＳＡＬ−１３０７５によシ産生さ
れたｂＧＨアナログの鍵は、クーマシ−・ブルー染色ニ
ス拳ディ・ニスポリアクリルアミドダル菌株の増殖、産
生されたｂＧＨアナログの回収、及びｂＧＨアナログの
精製に使用した方法は、実施例２４でｐＳＡＬ−１７０
／１０について記載する方法と同様である。 （以丁余白） 実施例２３ ｐＳＡＬ−１７０／１０ ｐＳＡＬ−１７０／１０の構築は第８図に示され、図面
の説明中に説明されている。 公知方法を使用する形質転換によ、９ｐ３ＡＬ１７０／
１０を大腸菌菌株人１６４５　Ｋ導入した。この菌株は
、増殖及び誘導後、フェニルアラニン形の天然ｂＧＨの
アミノ末端に加えられ九アミノ酸配列ｍｅｔ−ａｓｐ　
　ｇｌｎ　を有するｂＧＨのアナログを＄ 産生’ｉ、、’、、１ｏ　ｐｓ人−１７０／１０によシ
産生され几ｂＧＨアナログの量を、クーラシー染色ニス
拳ディー・ニス・ボリアクリルア、゛ドゲル←謬中表→
の走査によシ計算し几処、細菌によシ産生される総蛋白
質の約４０−４６チであった（ＶＩＡ）。 実施例２４ １）ＳＡＬ−１７０／１０の増殖 ■、保存培養株 ｐＳＡＬ−１７０／１０の保存株全カゼイン培地（接種
材料の項参照）上で増殖させｔ後、凍結培地で２倍に希
釈し、−８０℃で保存した。凍結培地５ＯＯｄ中の含有
成分を以下に示す。 Ｋ１ＨＰＯ４＆３ｇｒ Ｘｌ（１ＰＯ４Ｌ８　　ｇｒ。 クエン酸ＮＡ　　　　　　α４５ｇｒ Ｍｇ８０４＊　７ＨｔＯα０９　ｇｒ （ＮＨ＋）＊８０４ａ、ｅ　　ｇｒ グリセロール　　　４４０ｇｒ １、区１笠丑 カゼイン氷解物２０り／１％酵母エキスｌｏｇを接種し
、電量器上で３０℃及び約２００　ｒ、ｐ、ｍ。 で１５時間培養し九。必要に応じて攪拌通気発酵器内で
接種材料増殖の後続段階を実施し元。滅菌培地に２−１
０チの接種材料を接種し、空気飽和の２０チを越えるよ
うな溶存酸素濃度を保つように攪拌及び通気しながら３
０℃、声７±０．５で１５時間培養し次。 １、産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 カゼイン氷解物　　　　２０ｇ／を 酵母エキス　　　　　　ＩＯｇ／ｌ　　　’に寓ＨＰ０
．　　　　　　　２．ｓｇ／１Ｍｇ！１＋０４・７Ｈｔ
Ｏ１ｇ／Ｌ ＮａＯＬ　　　　　　　　　５　９／Ｌビオチン　　　
　　　　（Ｌｌ■／ｌ チアミン　　　　　　　　１　　ｍ？／Ａ微量元素溶液
　　　　　３−／を 培地には、更にテトラサイクリンｘｚｓｎｙ／１を含有
させ友。テトラサイクリンは産生に任意の成分であるが
、接種材料の増殖用に使用される培地中に常に見出され
るものである。 ビオチン、チアミン及び抗生物質の濃縮溶液をそれぞれ
濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添加し友。滅
菌グルコース溶液ｔ−まず１０ｇ／ｌまで添加し７２．
ｏ誘導段階で更に１０り／Ｌのグルコースを添加し九〇 微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 Ｆｅ０４１６９／１ ＺｎＯｔｅ４　ＨｔＯ２９／Ｌ Ｏｏ０４　＊　６　Ｈ２Ｏ２９／Ｌ Ｎａ１Ｍｏ０６−２Ｈ＠０　　　　２９／１０ａＯＬ＊
・２ＨｔＯ１’ｉ／１ ＣｕＯＬ＠１ｇ／Ｌ ＨｌＢＯ，αｓｇ／を 濃ＨＣｔ１００ｄ／を 培地にαｓ−１０チの接種材料培養株を接種し、３０℃
で培養した。空気飽和の２０４ｔ″越えるような溶存酸
素濃度を保つように攪拌通気率を設定し友。声はＮ）（
１で７±α２に保った。細胞濃度が約ｈｓ９／１（ＯＤ
６．。＝ＩＱ）に達してから誘導を開始し比。 温度ｔ−４２℃まで上昇させ、４２℃を１−５時間維持
し比。次に培養株を冷却し、ホルモン精製１心分離法に
よ１胞を回収し次。 し免１Ω皿玉 ボリトｐン（キネｉテイカ）混合機を使用し、発泡を最
小にするように混合機の速度ｔ−調節しながら、５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）、５０ｍＭＥ
ＤＴ人及び１００ｍＭ　Ｎａ１ｌを含有する溶液５容量
中にａｙｓ細胞１３４（湿潤クー中）を懸濁させ友。均
質懸濁液ｔ−８０Ｌ／時で連続的にダイノミル細胞破砕
器ケー・ディー・５（ウィリー・エイ・パショ７エン、
ｌクーゼル）中に通過させ、破砕細胞の均質懸濁液をシ
ー・イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で４５ｔ／時の
流量で遠心分離により清澄化させ念。遠心分離段階から
得られ之沈殿物を収集し、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　を含有
する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７，４）Ｉ
ＬＳｔ中に再懸濁させ次。最終濃度がα０５ｑ／ｍにな
処理器（熱システム）内で１８ｔ／時で音波処理し、シ
ー命イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離した
。沈殿物を収集し、５０ｍＭ’Ｊン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７，４）に再懸濁させ、上記同様に音波処理し、
シー・イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離し
た。５０ｍＭ　ＥＤＴ人及び１００ｍＭ　ＮａＱＬを含
有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｉ（７，４
）１翫５を中Ｋｍ胞を再懸濁させ、２度沈殿させ、蒸溜
水１ｓ、ｓｔ中に再懸濁させ友。遠心分離によシ沈殿物
を収集し、−２０℃で保存し次。 ｂＧＨの精製 沈殿物を蒸溜水３０−４０１中に再懸濁させ、φ α５　Ｎ　ＮａＯＨの滴定によシ声ＩＬａ客＝可溶化さ
せ次。次に溶液を連続的に音波処理し、必要に応じてシ
ー・イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離によ
シ清澄化させるか又はワットマン＃ａ、１う戸紙で濾過
し之。 清澄化蛋白質溶液（２８０ｎｍで０Ｄ＝２９７０００の
溶液３ｚａｚ）ｔ−１それぞれ５００００−６００００
０Ｄの各部分（ａｘｓ、＋ｚ）に分割した。各面積５ｆ
−の３個の１０００００分子量カットオフカセット（ピ
ー・ティー・エイチ・ケー型）ｔ−備えるミリポア・ベ
リコン限外濾過器で各部分をそれぞれ限外濾過し次。Ｓ
、、４を部分ｔ−１ｔの保持物容量まで濃縮した。限外
濾過物を収集し、保存し友。 保持物ｔ−ｐＨＩＬ８の別の１０ｍＭホウ酸塩緩衝液で
当初の容量まで希釈し、十分混合し友。保持物容量が１
ｔになるまでバッチを更に濃縮し几。限外濾過物を収集
し、最初の限外濾過物と混合した。 限外濾過物中のＯＤの経常合計値が、限外濾過器に最初
にチャージし九ＯＤの２０チになつ友ら、次の濃縮段階
の保持物容量をｌｔでなくα５Ｌとし次。α５ｔの保持
物容量からの限界濾過物の２８０ｎｍ　（にＩＩＬセル
）における吸光度がα１よシ小さくなるまで濃縮及び１
０ｍＭホウ酸塩緩衝液による希釈サイクルを継続し友。 一般に濃縮及び希釈サイクルは９から１２サイクルとじ
九。最終保持物を排出し比。 全限界濾過物ｔ−３１合し、６　Ｎ　ＨｏｔでｐＨ９，
０に調整した。別の＆４を部分を同様に限界濾過し、−
を調整され九全限界デ過物を５１合した。代表的な一工
程から、０Ｄ＝１０００００　Ｋ相当する吸光度α２６
の限界濾過物総量３８０ｔが産生され、所要時間は２４
から４０時間であつ次。 １００に限界濾過段階からの混合され友限界濾過物（２
８Ｇａｍで０Ｄ＝１０００００のｐ過物３８０ｔ）を、
線形流速２３α／時（２５ｔ、７時）でセフ７０−ス・
シー・エル・６拳ビー・ティー・イー壷エイφイー・イ
オン交換カラムに通した。直径３７儂、高さ１５ｃｙｒ
のカラムを、ＰＨ９，０の１０ｍＭホウ酸塩緩衝液２床
容量（３２Ｌ）で洗浄した。 充填及び洗浄段階から得九溶出液を廃棄し几。溶離液を
段階的に１０ｍＭホウ酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム
、ｐＨ９に変化させ、ｂ　ＧＨｔ−カラムから排出させ
比。溶出流速は２３α／時であつ九。 ２８０５ｍにおける溶出液の吸光度を追跡することによ
り工程の進行を監視した。ｂＧＨビークを４から５床容
量（２８ＧａｍでＱｌ）＝４３０００の容量８４ｔ）収
集し几後、１００００分子量切断カセットを備えるミリ
ボア・ペリコン限界濾過装置を使用して約１０■／−に
濃縮し友。次に溶液を凍結乾燥し友。収量は純粋ｂＧＨ
約７０ｇであつ几。 実施例２５ ｐＳＡＬ−１７０／ＩＧによシ産生されるｂＧＨアナロ
グの活性 リン酸塩で緩衝した食塩水（１％ＢＳ人）ｆ：用いて１
００　ｎｇ／−のｂＧＨアナログを含む溶液を調製し７
ｔ、この溶液ｔ−５０，２５，１１５，ｅＬ２５゜ａ、
１２．　　Ｌ５６及び０．７８ｎり／ｌｔＶ濃度に逐次
希釈し友。これら溶液の０．１−アリコートを夫々一対
ずつ用意し、ニオ抗体法を用いるＲＩ人にかけ友。希釈
曲線は天然ｂＧＨの場合とほぼ同じであった。 ２　放射線受容体結合アッセイ トレーサとしてのｌ”Ｉ　−ｂ　ＧＨとカリプレークヨ
ン曲線を形成する几めの真正ｂ　ＧＨ浴溶液を使用し、
ツシマ、ティー（Ｔ１１８ｈｆｎａ、　Ｔ、　）及びフ
ライセン、エッチ会ジー（Ｆｒｅｌｓｅｎ、　ＨｏＧ、
）の方法（グイ。シン（Ｙ、　Ｃｈｉｎ、　）、内分泌
物代謝（Ｅｎｄｏｃｔ。 試料を各３部ずつα３−のアッセイ緩衝液（５０ｍＭの
トリス、１５ｍＭの０ａＯｔｔ及びｓｗｒｇ／ａｔのウ
シ血清アルブミン、ｐＨ７，６）中で室温で２時間イン
キエベートし次。管には”’Ｉ　−ｂ　Ｇ　Ｈ（２０，
０００ｃｐｍの３０〜６０　μＱｉ／ＩＩｇ試料）、１
５０〜２５０μｑの肝臓膜タンパク質及び天然ｂ　ＧＨ
（１〜ｔｏｏｎｇ）又はバクテリアｂＧＨ抽出物のいず
れかを入れ次。アッセイの結果このｂＧＨアナログのｂ
ＧＨ活性は天然ｂＧＨＫ比肩することが判明した。 ３−　塁１ヱｌ」 実施例５に従いバクテリア細胞から回収し友ｐＲＯ１２
産生ｂＧＨアナｐグの生物学的活性を脛骨テストにより
測定し次（パーロー、ニー−エフ（Ｐａｒｌｏｗ、人、
Ｆ、）他、内分易学（ｌｉｆｎｄｏｃｒｌｎｏｌｏｇｙ
　）（１９６５年）７７：１１２６　　参照）。ラット
を生後２８〜３０日で下垂体切除し、その後無処置で１
０〜１４日間放置し次。ウシ下垂体又は組換Ｕ本大腸薗
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　ＣｏＩ１　）から得九ｌ’
成長ホルモンｔ−声１α０の０．１５ＭＮλ０１＋αＯ
ＩＭホウ酸塩に溶解した。ラット（４〜７匹／グループ
）にｂＧＨ溶液（０，２ｃｃで５〜１２５μｇ／日）ｔ
−５日間毎日皮下注射し、その間食餌は普通に与えた（
プリナ　ラット　チャタ（Ｐｕｒｉｎａ　Ｒａｔ　−Ｏ
ｈｏｗ）及び任意に水）。６日目にラットを殺して前ｆ
ｉｌｌ膝骨を取り出し、長手方向に切断し、アセトンで
固定し且つ２　％　ＡｇＮＯｓで染色した。解剖用双眼
顕微鐘にコン）での観察によシ骨端板の幅を測定しｆｃ
ｏ平均値（４０記録／ラツト）ｔ−用いて長い用量一応
答曲線を形成し几。テストの結果ｐ８ＡＬ−１７０／１
０産生ｂＧＨアナログのｂＧＨ活性は天然ｂＧＨと比肩
することが判明し念。 実施例２６ 実施例３の８０Ｄ宿主−ベクター系により産生されるヒ
ト超酸化物ジスムターゼの収率及び活性は前記宿主−ベ
クター系の成長条件の改変により向上し得る、下記のデ
ータが示すように、前記宿主−ベクター系の成長培地に
Ｏｕ及び／又はＺｎを補足すると活性ダイマー形状の前
記酵素の収率が増大する。 バクテリア含有ｐ１９０Ｄβ、Ｔ１１　の成長！、保存
培養 保存培養ｐｓｏｎβｌＴ１１１にカゼイン培地（接種材
料の項参照）で成長させ、次いで凍結用培地（ｆｒｅｅ
ｚｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　）で２倍に希釈し一８０℃で
保存し友。前記凍結用培地の組成は次の通シである。 ＫＩＨＰＯ，こ３ｇ１５００１Ｒｔ ＫＨＩＰＯ，Ｌ　８　ｇ、”ｓ　００　ｍクエン酸Ｎａ
　　　　α４５ｇ１５０（ｌＰＲｔＭり３０．・７Ｈ鵞
ｏ　　Ｏ，０９ｇ１５００ｓｄ（ＮＨＪｔＳＯ４（Ｌ　
９　ｇ／　５００　ｍｌグリセロール　　　４４ｇ１５
０（ｌＰＲｔｌ、接種材料 接種材料ｆ２０９／ｌのカゼイン氷解物、１０９／ｌの
イースト抽出物及び２　ｇ／ｌのＮａ１ｌ中で増殖させ
友。シェークフラスコ内の無菌培地に保存培養物を接種
し、シェーカー内３０℃で且つ約２０　Ｏｒ、ｐ、ｍ、
で１５時間インキュベートした。 必要に応じ、接種材料増殖過程におけるその後のステッ
プは攪拌曝気発静檜中で実施した。無菌培地に２〜１０
チの７２スコ培養物を接種し、溶存酸素レベルを２０チ
空気飽和以上に保持すべく攪拌及びアエレーションを行
ないながらｐＨ７±ａ、５゜３０℃で１５時間インキュ
ベートする。 ■、童産 生生培地は下記の物質を含む。 カゼイン氷解物　　　　２０１２／ｌ イースト抽出物　　　　１０９／１ Ｋ１ＨＰＯ４Ｌ　５９　／　１− Ｍｇ８０４番７Ｈ，０１ｇ／ｌ Ｎａ０１５ｇ／Ｌ ビオチン　　　　　　　α１１Ｒ９／　Ｌチアミン　　
　　　　　　１η／ｌ トレ一ス元素溶液　　　　３−／Ｌ テトラサイクリン　　　１２−５■／を幾つかの実験で
は次の成分も加え友。 ０ｕ８０４　’　５　ＨＩＯα８ｇ／１ＺｎＳＯ４・７
Ｈ鵞０　　　　　　　　　１　０　ｍ９／　を濃縮溶液
状のビオチン、チアミン及びテトラサイクリンは別個に
フィルタ滅菌処理し、接種前の無菌産生培地に加え土。 無菌グルコース溶液を最初に１０９／ｌとなるように加
え几。誘導（１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　）ステップで更にｘ
ｏ９／ｌのグルコＦｅ０４　　　　　　　１６９　／　
ｔＺｎｏｌ、瓢・４　ＨＩＯ２ｇ／　１ ０ｏＯＬ＠　１１６　ＨｔＯ２９／　ＬＮａ１Ｍｏ０４
ｅ　２Ｈ１０２９／　ＬＯａ０４　’　２ＨｔＯ１ｇ／
　ｔ ＯｕＯＬ＠　　　　　　　　　１９　／　ＬＨ，ＢＯ，
α５ｇ／を 濃縮、ＨＣｌ　　　　　　　　１０Ｑｄ／ｌこの培地に
９３〜１０％の接種材料培養物を接種し、３０℃でイン
キエベートする。Ｑｎ−アエレーションは泪を酸素レベ
ルに２０チ空気飽和以上に維持すべく調整する。≠はＮ
Ｈ，で７±α２に維持する。細胞濃度が約ふ５　ｇ／ｌ
　（ＯＤ、、。＝１０）Ｋ達すると誘導が開始される。 温度を４２℃に上げ、１〜５時間４２℃に維持８０Ｄの
回収 ポリトロン（ＰｏＩｙｔｒｏｎ　）プレンダー（キネマ
チ力）ｔ−用い、起泡を最小限に抑えるべく速度調整し
なからＬ５Ｋｇのバクテリア細胞（ウェットケーキ）ｔ
−１２ｔの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，８）に
懸濁させる。この均質懸濁液をダイノミル細胞破砕器（
ＤｙｎｏｍｉｌＩ　ｃｅｌｌ　ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ　）
　Ｋ　Ｄ　５（ウイｌＪ＋、ニー、パショーフエン、バ
ーゼル（Ｗｉｌｌｙ、　Ａ、　Ｂａｃｈｏｆｅｎ、　Ｂ
ａａｅｌ　）　Ｋ連続的に通す。連続フローセル（ｃｏ
ｎｔｉｎｕｏ１１８　ｆｌｏｗ　ｃｅｌｌ　）　ｆ使用
して該破砕細胞均質懸濁液を超音波処理し、ＯＥＰ人１
０１遠心分離器で分離処理する。上澄みを２時間６５℃
に加熱し、冷却後前述の如く遠心分離にかける。 １　ｏｌｏ　ＯＯ分子量カットオフカセット（ＰＴＧＣ
タイプ）ｔ−用いるミリボア　ペリコｙ　（Ｍｉｌｌｌ
ｐｏｒｅＰｅ田ｃｏｎ　）限外濾過装置で前記の透明な
上澄みを１ｔまで濃縮する。この濃縮され次タンパク質
溶液を１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｉ（７，
８）で平衝化し７ｊＤＦｉＡＥ−セファセル（５ｅｐｈ
ａｃｅｌ　）カラム（ｚＫｆのＩ）ＢＡＦｉセファセル
）に通す。通過溶液を回収し濃縮してペリコン限外濾過
器によ、９　ｐＨ７，８の２０ｍＭ）リス−ＨＣｌに対
して透析し、その後２０ｒｎＭ）リスーＨｏｔ緩衝液で
平衝化したＱｊｌ−セファローズ（Ｓｅｐｈｍｒｏｓｅ
　）カラムに通す。 このカラムｔ−ｐＨ７，８の２０ｍＭトリス−ＨＣＬ緩
衝液と塩グラジェント（０〜２００ｍＭ　Ｎａ０Ｌ　）
とで展開する。８０Ｄ含有分画を集め、ベリコン限外テ
過装ｙＩｔ、ｔ″用いて濃縮し、蒸留水に対して透析し
、その後≠４８の１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を加えて１
００ｍＭ酢酸ナトリウムにする。このタンパク質溶液１
ｐＨ４７のｌｏｏｒｎＭ酢酸ナトリウムで平衝化し九〇
Ｍ−セファローズカラムで更に分離処理する。同一の緩
衝液と塩グラジェント（１００〜５００ｍＭ　Ｎａ０Ｌ
　）とを用いて前記カラムを展開する。ＳＯＤ含有分画
を集め、ベリコン限外濾過装置を用いて濃縮し、凍結乾
燥する。 標準的成長条件（即ちＣｕ８０４を補足しない）では実
施例２６のバクテリアによシ産生される精製ヒト５ＯＤ
（ｈｓＯＤ）はウシＣｕ／Ｚｎ５ＯＤと比べて５チの酵
素活性しか示さなかった。金属含量分析の結果、該酵素
はＯｕを予定値の８チに過ぎない極めて少量しか含まな
いことが判明し次。更ンによシ置換されているものと考
えられる。 この溶液は○Ｕ＋＋及びＺｎ　　ｔ−双方共モル活性部
位当りＬ２モルの濃度で含む（表■参照）。 前述のデータは細胞内Ｏｕ　　濃度が限定されておシ、
産生され７２ｈＳＯＤｔ”飽和するには不十分でちるこ
とを示唆している。 一連の実験から、成長培地のＯｕ　　濃度全増加すると
ｈ８０Ｄの比活性が増加することが判明し九。 実際、２００　ｐｐｍ　Ｏｕ　　’に補足したカゼイン
氷解物（実施例２６）中で拷ず互した大腸菌は誘導後尺
然金属組成と十分な酵素活性とをもつ極めて活性の高い
ｈＳＯＤｔ−産生し７ｔ（表■参照）。更に実験を続け
た結果、添加される外因性Ｏｕ　　が５０〜２５０　ｐ
ｐｍであると同様の効果が得られることが判明し念。７
５　ｐｐｍのＯｕ　　を補足したＬＢ（ルリアプロス（
Ｌｕｒｌａ　Ｂｒｏｔｈ　）　）培地でも同様の効果が
観察された。 Ｗかット　　　　活性 タンパク質　　　　Ｏｕ　　　Ｚｎ　　　　ｕ　／■ｈ
ｓＯＤ’　　　　　　　　　Ｑ、０７　　　Ｌ６２　　
　　１６７Ｔ、ｄ酵素　　　　Ｑ、０１　０．０２　　
　　０看４にＳＯＤ　　　　　　α８１　　α８８　　
２９３１ｈ５０Ｄ”　　　　　　ｏ、８８　　０．９０
　　２７３０ウシ８０Ｄ　　　　　　　　Ｑ、９７　　
　ＬＯＩ　　　　２８０５ｈｓｏＤ（シグマ）　　　　
　　　　　　　　　　１６０６ｂｓＯＤ’　は実施例２
６に従い製造。 Ｏｕ　　及びＺｎヲ補足しない培地を使用した。 ｈｓＯＤ”は実施例２６１Ｃ従い製造。 Ｃ，＋’＋及びＺｎ　　ｆｃ補足し九培地を使用した。 基準としてウシ血清アルブミンを使用し、ロウリ−（Ｌ
ｏｗｒｙ　）の方法によってＳＯＤ濃度を測定し次（ロ
ーリ−、オー・エッチ（Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，）Ｌ　）＋
ローズブｖｘ−、Ｚヌ＊ジｘ−（Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ
　Ｎ、　Ｊ、　）＋ファー、ニー−エル（ｌｉ’ａｒｒ
、人、Ｌ、）及びランドール、アール・レター（Ｒａｎ
ｄａｌｌ　Ｂ、、　Ｊ、　）　、生物学化学誌（Ｊ、　
ＢＡｏｌ、　Ｏｈｅｍ、　）、　１９３．２６５〜２７
５（１９５１年）参照）。７エリシトクロムーＣの還元
阻止を検査すべく、マツコード（ＭｃＣｏｒｄ　）及び
フリドビツテ（Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ　）の方法で活性測
定を行なつ几（マツコード、Ｊ、Ｍ、　及び７リドビツ
チ、１．。 Ｂｌｏｔ、　Ｏｈｅｍ誌、２４４．６０４９−６０５５
（１９６９年）参照）。原子吸収釦２り精製ＳＯＤ試料
のＯｕ及びＺｎ含量を測定した。ウィーブ−（Ｗｅｔｅ
ｒ　）及びハートマン（Ｍａｒｔｍａｎ　　）に従って
８０Ｄ１．、ｆ！酵素を製造しくウイーザー、Ｕ、及び
ノ・−トマン、ｌ（。 Ｊ、、ＦＥＢ８　レター（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　）、
　１７．７８−８０（Ｊｅｗｅｔｔ、　Ｓ、Ｌ、　）、
ラトレンタ、ジー９ニス（Ｌａｔｒｅｎｔａ。 Ｇ、Ｓ、）及びペック、シー＊　ｘ　ム（Ｂｅｃｋ、　
Ｏ，Ｍ、　）　。 生化学生物物理字詰（人ｒｃ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂ
Ａｏｐｈｙｉ、　）２１５、１１６−１２８（１９８２
年）参照）６実施例２６に従い製造し７ＨＮｇＳＯＤの
アミノ末端の５つのアミノ酸の配列をエドマンデグラデ
ーション（Ｅｄｍａｎｎ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　）
　Ｋ工り検査し次。 このアミノ酸配列はヒ）　Ｏｕ／Ｚｎ　ＳＯＤのＮ末端
と同一、即ちＡｌａ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　−Ａｌａ−
Ｎ’ａｌである。これは該バクテリア産生物の真正を立
証するものである。従って可溶性ｈｓＱＤＦｉＮ末端メ
チオニンを除去する大腸菌処理酵素を受入れ易いと考え
られる。 薯−考 我々は、ＬＢ又はカゼイン水解物培地で成長すると多量
のｈｉ９０Ｄｉ産生すべく誘導されるバクテリアが酵素
活性をもたないタンパク質を産生すとによって活性化す
ることができる。意外なことＫ、このバクテリアはＯｕ
　　ｆ補足し次培地で成長させると酵素活性をもつｈｓ
ＯＤを産生ずべく誘導され得る。理論として決めっける
つも夛はないが、我々は肥沃培地（例えばＬＢ及びカゼ
イン氷解物）の成る種の成分が有効鋼の大部分と結合し
てキレートを形成し、その次めバクテリアが高レベルで
産生されるＳＯＤ分子の全ての部位を満几す程十分な遊
離鋼を持几ないのだと考える。培地に５０〜２５０　ｐ
ｐｍのＯｕ　　イオンを加えると、バクテリア内部のＣ
ｕ　　イオン濃度は明らかに増加し、過剰産生されるヒ
）　Ｏｕ／Ｚｎ　ＳＯＤに必要な全てのＯｕ”ｋ提供す
るに十分なレベルに到達する。 実施例３の如く大腸菌Ａ１６４５内の宿主−ベクター系
ｐＳＯＤβ１Ｔｌｌによシ産生し、実施例２６のること
が判明した。 −し潅流し几ウサギ心臓 Ｌ２〜２．０ＫＦの雌ニューシーラント白ウサギをヘパ
リン化し、麻酔をかけて心ｇｔ−取出し、低温（４℃）
潅流液中に即刻配置した。上行大動脈にカニユーレを挿
入し、１１７ｍＭ塩化ナトリウム、６　ｍ　Ｍ塩化カリ
ウム、λＯｍ　Ｍ塩化カルシウム、１０ｍＭ硫酸マグネ
シウム、０．５ｍＭ　ＨＤＴＡ及び１ａ７ｍＭグルコー
スを含み最終声が約２４ｍＭの炭酸水素す）ＩＪウムの
添加によｊ５７．４０に調整され次改質りレプスーリン
ガーズ（Ｋｒｅｂｓ　−Ｒｉｎｇｅｒｓ　）緩衝溶液に
よシ一定圧力（水１１０ｃｍ）下でこれら心臓の潅流を
行なつｆｃ。前記潅流液には９５チの酸素及び５チの二
酸化炭素で連続的て気泡を与え比。真空吸引によシＮＭ
Ｒ試料管から冠状流（ｃｏｒｏ口ａｒｙ　ｆｌｏｗ　）
を除去し次。飽和塩化カリウムに浸漬しポリエチレン管
に入れてグラス（Ｇｒａ飄＠　）ｉ９Ｄ−９ステイミユ
レータに接続し几ガーゼ（ｗｉｃｋ　）　ｔ−用い、右
心室ベーシングによってこれらの心臓に１７５指動／分
のペースを与えた。左心室収縮機能全定量すべく、空気
泡を入念に除去し３路ストツプコツクを介してステイサ
ム（８ｔａｔｈａｍ　）　Ｐ２３Ｄｂ変換器に接続し次
長さ１００αのＰＦｉ１９０管の先端にラテックスラバ
ーバルーンを取付は友。等容量圧（ｌｓｏｖｏｌｕｍｉ
ｃ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　）　ｆプラッシュ（Ｂｒ１１８
ｈ　）　２チャネル直接書込みレコーダにより記録した
。前記バルーンは注入器により１１０１１１１Ｈの末端
拡張期圧を得るに足る十分な量３０分間全体的虚血状態
におき、その問直潅流液を周囲に流すことにより３７℃
に保持した。潅流線のクロスクランピングによシ大動脈
流入を完全に遮断し次。前記虚血時間終了後４５分間の
正常温度再潅流（３７±２℃）ｔ−行なつ几。左心室に
発生する圧力の回復を虚血前対照のパーセンテージとし
て計算し几。虚血開始時にはバルーンを収を虚血時に除
去しｔ量と同量だけ再膨満させ次。 虚血の前と、再流後５分の時点と、再潅流開始後１５分
、３０分及び４５分の時点とくおいて真空吸引によシ冠
状血液流の体積測定を行なつ九。 核磁気共鳴法 内径の大きい超伝導磁石内で４．２３テルテ（丁６１ｓ
ａ　）でブラッカー（Ｂｒｕｃｈｅｒ　）　ＷＨ１８０
スペクトロメータによシリ□３１ＮＭＢスペクトルを得
九。この磁界強さでは前記リンは７　Ｚ　８９　ＭＨｚ
で共鳴する。リンプローブの直径は２５ｍである。 この道具はパルス状７−リエ変換モードで作動させ、ノ
コレット（Ｎｏｃｏｌｅｔ　）　１２８０コンピユータ
とインタフェース接続させた。データは高密度磁気ディ
スクに記録した。超伝導磁石の磁界は安定している九め
磁界／周波数ロックは不要である。 ２秒間隔で送出される４５９パルスに続く過渡電流から
５分間プロトン減給合スペクトル（（ｉｖｅｍｉｎｕｔ
ｅ　ｐｒｏｔｏｎ　ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ　５ｐｅｃｔｒ
ａ）　ｆ集め７’ｈｏこれらはスペクトル飽和を最小に
するための既に立証され九条件である。 データは八〇００Ｈｚのスペクトル幅で２にテーブルを
用いて保持し几。 ＮＭＲスペクトルに基づ　組繊細　内　の測細胞内声の
測定値は次の方程式 により無機リン酸塩ビークの化学シフト（δＯ）から求
められる。 組織異種効果（ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｏｍｏｇｅｎｅｉ
ｔｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　）　ｔ＋最小限に抑えるべく、
化学シフト値はこれらの研究で見られる一範囲内では比
較的低い声依存度を示すホスホクレアチンの共鳴に関し
て測定し九（ＰＫＡ＝４６　）。この方程式で使用する
定数は既に知られているようにｐＫ＝ａ９０．　　δ人
＝１２９０ＰＰＭ及びδＢ＝Ｌ８０５ＰＰＭである。 ＮＭＲスペクトルに基づく代謝産物の定量コンピュータ
で決定される標準化定数又は規準化７アクタを考慮に入
れて個々のピーク下の面積をプラニメータ測定すること
Ｋよシ組織のホスホクレアチン（Ｆｏｒ）、アデノシン
三リン酸（人ＴＰ）及び無機リン酸塩（Ｐｉ）ｔ−測定
した。面９積分の実施にはヒユーレット−パラカード（
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　　）デジタル化装置
を使用し次。このようＫして得られるＰＣｒ、ＡＴＰ及
びＰｌの定量データは虚血前対照含量のパーセンテージ
として唇わされる。 実　験７ＱすＶり一し １７個の心臓を次の２グループに分割し几。 グループｌ　　（ｎ＝８）このグループの心臓はｇｏ、
ｏｏｏ単位のヒト組換型超酸化物１５分間を雲霧の間６
０，０００単位を連続注入することによシ処理した。 ｈ８０Ｄは３７℃のクレプスーリン ガーズ重炭酸塩潅流液に溶解し友。 グループＩ（ｎ＝９）このグループの心臓には再流の直
前に１０艷の潅流液濃縮塊 を投与し、次いで正常温度再潅流を 行なった。 結果 左心室機能の回復 この研究で使用し次虚血実験モデルは中程度のひどさの
回復不能傷害を受は且つ治療によって改善する可能性を
保持するような心ａｔ得るべく一連の予備研究に基づい
て特別に選択し友ものである。４５分間の再流終了後の
左心室機能回復は（対照発生圧力のパーセンテージとし
て測定）対照グループの場合４７±５％であり、末端拡
張期圧は４８±７　ｓｗ　Ｈｇでらつ次（１１）ｗＨｑ
の虚血前対照値と比較）。これらのパラメータは３０分
間及び４５分間の再潅流の間に余り変化しなかつ几。 これは比較的安定し九回復状態が得られたことを意味す
る。再流直前と最初の１５分間の再潅流の間とにｈ８０
Ｄｔ−投与し次結果、心臓機能保存状態が著しく改善さ
れ、対照心臓と比較して末端拡張期圧の増加が減少し念
。ｈ　１９０Ｄで処理した心Ｐ　＜　Ｏ，ｆ）１　ｍ　
）。 ｂ　Ｓ　ＯＤ処理心臓に関して虚血の間及びその後の再
潅流の間に順次測定した。３０分間の虚血期間では心筋
クレアチンホスフェート及び人ＴＰ含ｉの漸減が観察さ
れ友。ホスホクレアチン含量は虚血期間終了までに対照
心臓では虚血前基線量値の８±３チに減少し、ｈｓＯＤ
処理求＝賓心臓では対照の１０±５チに減少した。ＡＴ
Ｐ含量は対照心臓では基線量の３６±６チに達し、ｈｓ
ＯＤ処理心臓では３３±６％に達し九。これらのデータ
は２つのグループの心臓がいずれも同程度の虚血を受け
たことを明示している。これらのデータはまた、メカニ
ズム制御されないものによって細胞代謝が虚血期間の間
よシ良く保存されるがために、ｈｓＯＤ受容心臓がよシ
良い機能回復を示し友という可能性を否定する。 ４５分間の再流後にｈｓＯＤ処理心臓がほぼ正常なホス
ホクレアチン含ｔ（対照の９３±９チ）終了時の人ＴＰ
含量はどちらのグループの心臓でも同等であった（対照
心臓では４１±４チ、ｈｓＯＤ処理心臓では４２±５％
）。この人ＴＰ含量に関する結果は、高エネルギーリン
酸塩産生率を増加させる能力が制限されている場合に心
臓がより良い左心室機能回復を得るＫはよシ多くのエネ
ルギを必要とすることを示唆していると考えられる。 これに対し対照心臓のよシ低い機能回復は高エネルギー
リン酸塩代謝産物のよシ低い使用度につながシ、場合に
よってはエネル≠生産のより厳しい制限さえ遮蔽し得る
。 結論としてこれらのデータは、中程度の虚血傷能及び拡
張機能がよシ良く回復し且つ心筋のホスホクレアチン含
量が増加することを示している。 これらのデータはｔ比、虚血心筋の再潅流の結果構造的
及び／又は機能的損傷成分が生じるが、この成分は再潅
流時ＫｈＳＯＤの如き酸素遊離基スカベンジャーを投与
すれば除去又は減少し得ることも示唆している。従って
虚血心筋の再酸素付加に起因する前記再流傷害成分を抑
制することによシ、ｈｓＯＤは急性心筋梗塞後半期に治
療を受ける患者の血栓融解療法及び／又は冠状血管形成
に加えて更に別の利益をもたらし得る。 条件で成長及びｎ↓したヒト超酸化物ジスムターゼは心
臓の硬水サイズを縮小させることが判明した０ 虚血性心筋の時を得几再闇流は梗塞サイズ（工Ｓ）を縮
小せしめる。しかしながらこの有益な効果は、有害酸素
遊離基の発生により媒介される再流傷害の同時発生によ
って低減し得る。組換型ヒト超酸化物ジスムターゼ（ｈ
ｓｏｎ）による遊離基の除去が再潅流のみの場合と比較
してｌ１９ｔ−縮小させる結果をもたらし得るか否かを
テストすべく、１６匹のイヌに麻酔をかけ、どの辺緑枝
よりも手前で回旋冠動脈ｔ−９０分間閉塞した。再潅流
時にこれら動物にｈＳＯＤ（４００，０００単位を濃縮
塊として左心房投与し、次いで３００，０００単位を１
時間静脈内注入：ｎ＝８）又は同量の食塩水（対照。 ｎｗ８）ｔ−投与し次。胸部を閉鎖して動物を回復させ
次。４８時間後にこれら犬を殺し、一般病理た。回旋動
脈を中心に近い方で閉塞し几結果、対照グループでは左
心室（ＬＶ）０４Ｌ８＋２−３％、処理グループでは４
Ｌ８＋２．０％が虚血状態になつ九。対照グループのイ
ヌでは再潅流に伴い危険領域５Ｌ２＋７％の梗塞が生じ
次。これに対しｈｓＯＤ処理は壊死を著しく減少させ、
Ｉ３は危険領域が３　＆６＋１１チであった（ｐ＜αＯ
ｓ　）。 対照動物では危険領域の大部分く亘って広がる壁合性梗
塞が現われた。結論すれば、再潅流時に投与されるり、
９０Ｄによる遊離基除去は、恐らくは再流４害の回避に
よって、壊死の規模を著しく縮小させ比。 素遊離基の役割１ 最近の指摘によれば、ヒト超酸化物ジスムターゼは臓器
移植後の再潅流障害を減少させ得る。次の実施例は腎臓
移植後の再潅流に伴う障害が前記超酸化物ジスムターゼ
により改善されることを示２６の条件で成長させ且つ精
製したものである。 この実施例で括弧内に記されているアラビア数字は該実
施例の後の参考文献表に列挙されている文献を示す。 ブタにおける腎臓の保存及び移植虚血のモデル体重１５
〜１８紛の異系交配雌ブタをアセプロマシン及びアトロ
ビンで薬剤前処理し、ケタミン及びハロタンで麻酔し友
。１５００ｃｃのリンガ−乳酸塩（Ｒｌｎｇｅｒｓ　ｌ
ａｃｌｍｔｅ　）、フロセミド（２０ｍ９）及びマンニ
トール（ＩＬ５ｇ）の静脈内投与により、採取３０分前
にドナーのブタに利尿作用を与え次。ブタにしばしば見
られる腎恩血管痙甲を回避すべくフエノキシペンザミン
（５０〜）全静脈内投与し友。正中線に沿って腹部を切
開し、末端大動脈及び大静脈を分岐の直ぐ近傍まで可動
化し比。尿管を剥離し膀胱レベルで分割し丸。分岐の直
ぐ上の大動脈に導入用カテーテルを配置し、下方大静脈
に導出カテーテルｔ−配置した。ヘパリン（ｓ、ｏｏｏ
単位）ｔ−静脈内投与し、腎臓動脈の直ぐ上の大動脈の
クロスクランピングと会致する末端大動脈を介して４℃
のニーローコリンズ（ｐ：ｕｒ。 −Ｃｏｆｆｉｎｓ　）　ｆｊ液での連続的フラッシュ（
ｆｌ１１８ｈ　）　’に開始した。腎臓をその場で冷却
し比後一括して取出した。次いで腎臓を分離し、一方を
対照他方をテスト腎臓として使用した。これは対による
実験法を容易にするためである。各腎臓を４℃のニーロ
ーコリンズ液で再度フラッシュした。プロトコールによ
シ必要とされる場合にはテスト物質をこの時点で第２腎
豚の保存液に加えた。これら腎臓は双方共無菌状態で包
装し４℃で一晩保存し比。 ２４時間の低温虚血の後、新たなレシピエント動物に麻
酔をかけ、保存腎臓を腸骨管に移植した。 各吻合に要し九時間は２５〜３０分であった。対照（未
処理）腎臓を必ず最初に移植し、テスト腎臓を次に移植
し次。従ってテスト腎臓の再潅流は常に対照腎臓の再閤
流よシ合計１時間遅れた。これは対照腎臓が低温虚血状
態に２３時間おかれ几のに対し、テスト腎臓は２４時間
おかれたことを意味する。８０Ｄアナログの動脈内投与
を対照腎臓の再潅流の１時間後に当九るテスト腎臓の再
商流時に開始した。従って対照腎臓はテスト腎臓に与え
られる全ての物質効果に曝される１時間前に再加熱及び
再潅流の有害効果に曝されたことになる。第２腎臓の再
潅流に次いでレシピエンドｅるブタ自体の腎臓を除去し
念。臨床操作を模倣して更に１０ｇのマンニトールを先
ず対照腎臓の再潅流前に投与し、次いでテスト腎臓の再
潅流前に再び投与した。これによって従来の最適保存／
移植技術に加えられる遊離基改変物質の効果を測定し得
九〇各腎臓からの尿管は皮膚尿管典造設術として別個に
取出し次。 移植後２日間レシピエンド’を軽く麻酔して各腎臓（尿
管造填術）から別個に尿を１時間収集し、量とクレアチ
ニン濃度とを測定し友。血清クレアチニンも測定した。 これは各腎臓毎にクレアチニンクリアランスを計算する
之めである。 全ての結果は平均値±８ＥＭで表わされる。スチューデ
ントｔ−テスト（両側検定）の間にデータを分析し九。 実験が対で行なわれる几め、殆んどの場合に対テスＩｆ
適用し得た。 １　この実施例で使用し九略号； Ｃｃｌ　　クレアチニンクリアランス 人ＴＰ　　　アゾンシンニリン酸 人ＤＰ　　　アゾンシンニリン酸 人ＭＰ　　　アデノシン−リン酸 実　験　７°ロト・コール ４匹のブタのテスト腎臓にシグマウシ血液超酸化物ジス
ムターゼ、酸素遊離基スカベンジャーを投与した。再潅
流の直前に腎臓動脈に５〜の濃縮塊を投与し、再潅流開
始後１５分間１ダ／分で一定の動脈内注入を続けた。そ
の結果合計２０ｍ９の８０Ｄが与えられ次ことになる。 ４匹のブタからなる第２グループでは８０Ｄに加えてカ
タラーゼ（シグマ社）を同一投与量でテスト腎臓に与え
た。 これら各ブタの他方の腎臓は処理せずに対照として使用
した。 ＳＯＤに対する用量応答 最大の保握ヲ得る九めの最小限の用量を決定すべく用量
応答関係（ｄｏｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｒｅｌａｔｉ
ｏｎｓｈｉｐ　）　ｆ調べた・血管再分布（ｒｅｖａｓ
ｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　）時に一方の腎臓には２穏
類の用量のうち少ない方のＳＯＤを注入し他方には多い
方の５ＯＤｆｔ注入した。 実施例９に従い製造し次ヒト組換型ＳＯＤを前述の如く
投与した。各用量範囲内で２つの比較を行なつ九〇最初
の比較では０２ｒｎ９の８０Ｄ’ｉ対照几る食塩水と比
較し九〇段階的に０．２　ｍｆｔ−，２Ｍ９と比較、し
、２１ｎ９（ｉ−２０１ｎ９と比較し、２０ダを１００
ダと比較し次。いずれの場合も少ない方の用量を受容す
る腎臓を最初に移植し次。これは第２移植時にＳＯＤの
循環が滞留し得るという問題を回避するためである。 結果 ウシＳＯＤ及びカタラーゼの効果 我々が使用した大きさのブタの単一正常腎臓のクレアチ
ニンクリアランスは、前述の麻酔及び水分補給（ｈｙｄ
ｒａｔｉｏｎ　）条件下では２＆５＋ａ３ｍ／分でらつ
ｆｃ（ｎ＝ｓ　）。２０Ｉｎ９の８０Ｄｉ再晶流の最初
の１５分間に亘って腎臓動脈内に投与すると低温虚血後
の腎機能減損が実質的に改善された。 ＳＯＤのみで処理し次４つの腎臓は平均クレアチニンク
リアランスが２１２±４５ｄ／分であった。 これは対照腎臓（＆４±Ｌ７ｍｔ１分、ｐ＜αＯｓ）の
ほぼ３倍に当たる。ＳＯＤ及びカタラーゼを組合わせて
使用し次場合にも同程度の保護が得もね−それ以上の効
果は見られなかつ几（ＯＣＲ＝ｔ９．。 ±ｔ５４／分）。先に行なった予備実験では４匹のブタ
からなる別のグループを４０分を越える吻合時間をかけ
て移植処理し次。 ＳＯＤ及びカタラーゼにより腎機能は著しく向上したが
、これらの動物では処理腎臓も対照腎臓も極めて低い機
能を示し７ｔ、　（Ｏｃｘ　＝　４８±α８対し６±α
４−７分）。それ自体再潅流に先立つ虚血に起因してよ
シ重大な傷害を受けたと思われるこれらの腎臓では、遊
離基の危害を改変しても正常腎機能を回復することはで
きなかつ九。 ヒ）ＳＯＤアナログ用量応答関係 ヒ）８０Ｄアナログ（α２■及び２ｍ９）を注入しても
対照と比較して腎機能には何らの改善も見られなかつ九
。しかしながら２０ｍ９のＳＯＤアナログを投与した腎
臓の平均クレアチニンクリアランスは１４２±Ｌ１ｍｊ
／分であり、２ｍｇ注入し九腎臓（７，７±ｔＯＷ１分
、ｐ（０，０５）ｔ−遥かに上回っていた。１００■の
８０Ｄアナログを投与してもそれ以上の効果は得られな
かつｆｃ　（ＯＣＲ＝１６．１±１２ａｄ／分）。従っ
て８０Ｄアナログの最小有効量はこのような方法で投与
する場合には２■より多（２０■より少ない量であるこ
とが判明した。ヒ）８０Ｄアナログはウシ８０Ｄと同程
度の効力を示した。 論考 使用処理法に起因する差異を最大限にし且つ特定ドナー
又はレシピエンド動物に係る種々の変数に関する制御を
行表うべく対で実験する方式を用適利用を可能にするも
のであつ九。 あつ友。対照腎臓は健康なドナー腎臓及びレシピエンド
動物、水分補給、αアドレナリン作用阻害、抗凝血並び
に利尿を含む従来の最適臓器保存法の利益を受は次にも
拘らず重大な機能障害を示し、クレアチニンクリアラン
スのレベルカ正常レベルの十以下に低下した。この２４
時間の虚血状態保持は、同様の臨床的状況下でしばしば
見られるように従来の臓器保存能力を越えるものである
。有効量のウシＳＯＤ又はヒトＳＯＤアナログで処理す
るとこの障害が驚く程効果的に回避され、腎機能がほぼ
正常レベルに維持される。実際、このように処理した腎
臓で、移植後４８時時間区測定し友時に、対をなすもう
一方の未処理対照腎臓の少なくとも２倍のクレアチニン
クリアランスを示さなかつ九ものは１つもない。この利
益の大きさは従って４５〜６０分の温暖虚血後に見られ
るものよシ量的に大きかった。これは、従来の最適保存
技術を用いると虚血自体に起因する障害は最小化され、
再潅流時に発生する障害が優勢になることを示浚する。 この解釈は更に、再潅流に先立ち１８時間保存しておい
た腎臓についての研究によっても裏付けられる。これら
の腎臓では対照グループ及び処理グループの双方共優れ
た機能を示し几。これは、再潅流時の遊離基発生に適し
た条件を設定するだけの十分な代謝産物の蓄積に必要な
時間が未だ十分く経過していなかったことを意味する。 一方、腎臓を吻合時間のより長い（即ち温暖虚血）前記
予備実験の場合のようＫより重大な虚血状態におくと、
ＳＯＤを投与しても明らかな改善は見られ友ものの機能
を正常レベルまで回復させることはできなかった。従っ
てこれらの腎臓はより短時間の温暖虚血（７，８，９）
後に調べ友ものによシ類似していると言えよう。他の器
官と同様に、遊離基傷害除去の利益は主として、再潅流
に起因する禍害と比較し次虚血自体に起因するイ島害の
相対比に関連する。 更にこの利益増加の達成は悉無律的であると考えられる
。５ＯＤＫ関する用量応答検査は、最大限の保護が得ら
れるか又は保護が全く得られないかのいずれかを示した
。カタラーゼはＳＯＤのみに加えてもそれ以上の利益は
もたらさなかった。 この研究を定量的に分析し九限りでは、再血流傷害防止
は悉無律的現象であつ几と思われるっしかしながら、こ
の研究における諸発見事項は臨床的用途に特に適してい
ると考えられる。ここで選択した２４時間の低温虚血は
臨床状況で必要とされる死体移植組織保存期間に十分該
当する。 更にこれらの研究では、従来の最適保存及び移植キシル
基スカベンジャーであるマンニトールの使用が含まれる
。従ってこれらの研究は、遊離基除去を現在使用されて
いる臨床的方法に加えて用いれば同程度の効果が得られ
ることを示唆する。 ８０Ｄは無毎化合物である几め、この方法は有望と思わ
れる。 参考文献 １、パークス、ディー・ニー（Ｐａｒｋｓ　Ｄ、人、）
、パルクレー、ジー・ビー（Ｂｕｌｋｌｅｙ　Ｇ、　Ｂ
、　）　、グレンジャー、ディー・エフ（Ｇｒｌａｇｅ
ｒ、　Ｄ、　Ｎ、　）　。 ハミルトン、ニスφアール（Ｈａｍｉｌｔｏｎ　Ｓ、　
Ｒ，）　。 マツコード、ジエー・エム（ＭｃＯｏｒｄ　Ｊ、　Ｍ、
　）　。 ネコ小腸に対する虚血の危害：超酸化物基の役割　（Ｉ
ｓｃｈｅｍｉｃ　　Ｉｎｊｕｒｙ　　ｔｏ　　ｔｈｅ　
Ｏａｔ　　Ｓｍａｌｌ　　ＩｎｆｅｓｔｉｎＣ：Ｒｏｌ
ｌ　ｏｆ　８ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　Ｒａｄｊｃａｌｓ　
）　。消化器病学（Ｇａａｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ
）　８２　：９（１９８２年）。 ２　マンソン、ビー嘩エフ（Ｍａｎｓｏｎ　Ｐ、　Ｎ、
）、アンテネリ、アールｏｘム（Ａｎｔｈｅｎｅ…Ｒ，
、Ｍ、）、イム、エム・ジエー（ｈｒ＋　Ｍ、　Ｊ、　
）　、パルクレー。 ジー・ピー（Ｂｕｌｋｌｅｙ　Ｇ、　Ｂ、　）　、　７
−プスシエーΦイー（Ｈｏｏｐａｓ　Ｊ、　Ｅ、）、ア
イランド支弁の虚血組織に訃ける酸素遊離基の役割（Ｔ
ｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆＯｘｙｇｅｎ　−Ｆｒｅｅ　Ｒａ
ｄｉｃａｌｓ　ｉｎ　Ｉａｃｈｅｍｉｃ　Ｔｉ５ｓｕｅ
　ｉｎ　ｌ５ｌａｎｄ１３ｋｉｎ　Ｆｌａｐｓ）。年刊
サージユリ−（Ａｎｎ８ｕｒｇ　）１９８　：８７（１
９８３年） λ　シュラ７ター、エム（５ｈｌａｆｔｅｒ　Ｍ、　）
　、ケイ／。 ピー・エフ　（Ｋａｏｅ　Ｐ、　Ｆ、）、キルシュ、エ
ム・エム（Ｋｉｒｓｈ　Ｍ、　Ｍ　）　＋超酸化物ジス
ムターゼ及びカタラーゼが全体的虚血再潅流心ｍｔ−保
獲する几めの心臓麻痺効力の増進（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄ
ｅＤｉｓｍｕｔａｓｅ　Ｐｌ１１８ｅ　Ｃａｔａｌａｓ
ｅ　Ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　Ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ
Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ　Ｏａｒｄｉｏｐｌｅｇｉａ　
ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ＧｌｏｂａｌｌｙＩａ
ｃｈｅｍｉｃ、　Ｒｅｐｅｒｆ１１８ａｄ　Ｈｅａｒｔ
　）。トラフ心血管外科誌（Ｊ　Ｔｏｒａｃ　０ａｒｄ
ｉｏｖａｓｃ　Ｓｕｒｇ）　８３　：８３０（１９８２
年） 本　スチュアート、アール・ニス（５ｔｕａｒｔ　Ｌ　
Ｓ、　）。 ボームガードナー、ダブル會ニー（Ｂａｕｍｇａｒｔｎ
ｅｒＷ０人、）、ボーコン　ニー・エム（Ｂｏｒｋｏｎ
　Ａ、　Ｍ、　）他。酸素遊離基スカベンジャーを用い
友５時間低体温肺保存（Ｆｉｖｅ−Ｈｏｕｒ　Ｈｙｐｏ
ｔｈｅｒｍｉｃ　ＬｕｎｇＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　
ｗ口ｈ　Ｏｘｙｇｅａ　Ｆｒｅｅ−Ｒａｄｉｃａｌ　８
ｃａｖｅｎｇｅｒｉ）。 移植処置（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｃ　）　１７
　：　１４５４（１９８５年）。 ＆　サンフエイ、エッチ（５ａｎｆｅｙ　Ｈ，）　＋パ
ルクレー、ジー・ビー（Ｂｕｌｋｌｅｙ　Ｇ、　Ｂ、　
）　、　カメロン。 ジエー・エル（Ｃ訓ｅｒｏｎ　Ｊ、　Ｌ、　）、急性膵
炎発病における酸素誘導遊離基の役割（ｊＥｈｅ　Ｒｏ
ｌｅ　ｏｆＯｘｙｇｅｎ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｆｒｅｅ　
Ｒａｄｉｃａｌｓ　Ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅ
ｓｌｓｏｆ　Ａｃｕｔｅ　Ｐｉｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ　
）。年刊サージュリー（Ａｎｎ　８ｕｒｇ　）　２００
　：４０５（１９８４年）ａ　ハンンン、アール（Ｈａ
ｎｓｓｏｎ　Ｒ，）　ｒ　ギュスタープソン、ビー（Ｇ
１１８ｔａｖｓｓｏｎ　Ｇ、　）　ｒ　　ジョンソ７＃
オー（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ　Ｏ，）他。虚血後の腎循環に
対するキサンチンオキシダーゼ抑制の効果（Ｅｆｆｅｃ
ｔｏｆ　Ｘａｎｔｈｉｎｅ　０ｘｉｄａｓｅ　Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｒｅｎａｌ　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉ
ｏｎＡｆｔｅｒ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ　　）、移植処置（
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｚ　Ｐｒｏｃ）１４：５１（１９８
２年）。 ７、　ウリエル、ケー（Ｑ、ｕｒｉｅｌ　Ｋ、）　＋ス
フディ２゜エフＯジー（Ｓｍｅｄｌｒａ　Ｎ、　Ｇ、　
）　＋　　リコツタ、ジエー・ジエー（Ｒｌｃｏｔｔａ
　Ｊ、　−Ｊ、　）＋一時的虚血後の腎臓の保護：遊離
基スカベンジャー（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ
　ｋｉｄｎｅｙ　Ａｆｔｅｒ　Ｔｅｍｐｏｒａｒｙ　Ｉ
ｓｃｈｅｍｉａ　：　Ｆｒｅｅ＆街ｃａＪ　Ｓｃ、ａｖ
ｅｎｇｅｒｓ　）　ａ脈管外科誌（Ｊ　Ｖａｓｅ　８ｕ
ｒｇ）２：４９（１９８５年）。 ＆　ペラ−、エム・ニス（Ｐｅ１ｌｅｒ　Ｍ、　Ｓ、　
）　、ホイダルジュニア（ＨｏＩｄａｌ　Ｊｒ　）　、
フエリス、ティー・エフ（Ｆｅｒｒｙｓ　Ｔ、　Ｆ、）
、ラットの虚血性急性腎不全における酸素遊離基（Ｏｒ
ｙｇｅｎ　Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃａｌｓ　ｉｎＩ＊ｃｈ
ｅｍｉｃ　Ａｃｕｔｅ　ｋｎａ皿　Ｆａｉｌｕｒｅ　ｉ
ｎ　ｔｈｅ　Ｒａｔ）、　　臨床研究誌（ＪＯＩＩｎＩ
ｎｖａｓｔ　）　７４：１１５６（１９８４年）。 １　イム、エム・ジエー（Ｉｎ　Ｍ、　Ｊ、　）　、ジ
エン。 ダブルΦエッチ（５ｂｅｎ　Ｗ、　Ｈ，）　、バク、シ
ー・アイ（Ｐａｋ　Ｏ，１，）　、　マンンン、ピーΦ
エフ（Ｍａｎｓｏｎ　Ｐ、　Ｎ、）＋パルクレー　シー
ｅビー（Ｂｕｌｋｌｅｙ　Ｇ、　Ｂ、　）　、　フープ
ス、ジエー・イー（Ｈｏｏｐｅｓ　Ｊ、　Ｅ、）、充血
アイランド支弁の生存に対するアロプリノールの効果（
Ｂｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｌ１ｏ−ｐｕｒｉｎｏｌ　ｏｎ
　ｔｈｅ　５ｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　Ｈｙｐｅｒｅｍｉ
ｃ　ｌ５ｌａｎｄ　５ｋｉｎＦｌａｐｓ　）。プラスチ
ック再建手術（Ｐｌａｓｔ　ｌｋｃｏｎｓｔｒＳｕｒｇ
）７３：２７６（１９８４年）。 １０、パークスケディー嗜ニー（Ｐａｒｋｓ　Ｄ、人、
）、パルクレー、ジー−ビー（Ｂｕｌｋｌｅｙ　Ｇ、　
Ｂ、）、グレンジャー、ディー・エフ（Ｇｒａｎｇｅｒ
　Ｄ、　Ｎ、　）＋ショック、虚血及び臓器保存におけ
る酸素遊離基の役割（Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｏｘｙｇｅｎ　
Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃａｌｓ　ｉｎ　５ｈｏｃｋ。 Ｉｓｃｈｅｍｉａ、　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｐｒｅｓｅ
ｒｖａｔｉｏｎ　）ｏサージユリ−（Ｓｕｒｇｅｒｙ）
　９４：４２８（１９８３年）。 ＩＬ　　）レドーパレイラ、エル・エッチ（Ｔｏｌｅｄ
ｏ　−ｐａｒｔｙｒｍ　Ｌ、　Ｈ，）　、シモンズ、ア
ール・エル（Ｓｉｍｍｏ止λＬ、）、ナシヤリアン、ジ
エー・ニス（Ｎａｊａｒｉａｎ　Ｊ、　Ｓ、　）、プ２
スマ又はプラスマ代換物で潅流し九虚血’ｉｆｆ臓の保
存におけるアクプリノールの効果（Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ
　Ａ１１ｏｐｕｒｉｎｏｌ　ｏｎ　ｔｈｅＰｒｅｓｅｒ
ｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｓｃｈｅｍｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ
ｓ　Ｐｅｒｆｕ＋ａａｄ　ｗｉｔｈＰｌａｓｍａ　ｏｒ
　Ｐｌａｓｍａ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ）。年刊サー
ジユリ−（ＡｎａＳｕｒｇ）　１８０ニア８０（１９７
４年）。 １ｚ　　パスコ、ケー・ニー（Ｖａｓｃｏ　Ｋ、　Ａ、
　）　、　　ドウオール、アール−ニー（Ｄｅｖａｌｌ
　Ｌ人、）、ライシー。 ニー・エム（Ｒ１１ｅｙ　Ａ、　Ｍ、　）、腎臓虚血に
おけるアロプリノールの効果（Ｆｔｆｆｅｃｌ　ｏｆ　
Ａ１１ｏｐｕｒＩｎｏＩＩｎＲｅｎａｌ　Ｉｓｃｈｅｍ
ｉａ　　）。サージユリ−（８ｕｒｇｅｒ）’　）７１
　ニア８７（１９７２年） １λ　オーウニ／ズ、エム・エル（０ｔｖｅａｓ　Ｍ、
　Ｌ、　）　。 ラザルス、エッチ−エム（Ｌａｚａｒ１１８　Ｈ，Ｍ、
　）　ｒ　　ウオルコット、エム・ダブル（Ｗｏｌｃｏ
ｔｔ　Ｍ、　Ｗ、　）　。 ｉクスクエル、ジエー・ジー（Ｍａｒｗｅｌｌ　Ｊ、　
Ｇ、　）。 ティラー、ジエー・ビー（Ｔａｙｌｏｒ　Ｊ、　Ｂ、入
イヌ腎臓ドナーのアロプリノール及びハイポキサンチン
前処理（Ａｌ１ｏｐｕｒｉｎｏｌ　ａｎｄ　Ｈｙｐｏｘ
ａｎｔｈｉｎｅＰｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃａ
ｎ１ｎｅ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｄｏｎｏｒｓ　）　ｏ移植（
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　）　１７　：４２４
（１９７４年）。 １４　　グレンジャー、ディー・エフ（Ｇｒａｎｇｅｒ
　Ｄ、　Ｎ、　）＋ルテイリ、ジー（Ｒｕｔｉｌｌｌ　
Ｇ、）　、マツコード、ジエー（ＭｃＯｏｒｄＪ、　）
、ネコ腸虚血における超酸化物基（５ｕｐｅｒｏｘｉｄ
ｅ　Ｒａｄｉｃａｌｓ　ｉｎ　Ｆｅ１ｌｎｅ　Ｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌＩｓｃｈｅｍｉａ　）。消化器病学（Ｇａ
ｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　）８１：２２（１９８
１年）。 １＆　ロイ、アール・ニス（肋ｙａ、ｓ、）、マツコー
ド、ジエー・エム（ＭｃＯｏｒｄ　Ｊ、　Ｍ、　）、超
酸化物と虚血：キサンチンデヒドロゲナーゼからキサン
チンオキクダーゼへの転換（５ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ａ
ｎｄＩｓｃｈｅｍｉａ　：　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏ
ｆ　Ｘａｎｔｈｉｎｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｔ
ｏ　Ｘａｎｔｈｉｎｅ　０ｘｉｄａｓｅ　）。グリーン
ワルド、アール（Ｇｒｅｅｎｗｓｌｄ　Ｌ）、　ニーヘ
ン、ジー（０ｏｈｅｎ　Ｇ、　）編、オキシラジカル及
びそのスカベンジャー基（第２巻）。細胞及び分子アス
ペクト （０ｘｙｒａｄｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｓｃａ
ｖａｎｇｅｒ　Ｓｙｓ＋ｅｍｓ　（Ｍｏｌ。 ２　）　６０ｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　ＭｏＩｅｃｕｌ
ａｒ　Ａｐｐｅｃｔｓ　）。ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ）　：エルスバイアサイエンス（Ｅｌａｅｖｉｅ
ｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　）　１４５（１９８３年）。 工トレドーバレイラ、エル・エッチ（Ｔｏｌｅｄｏ　−
ｐａｒｅｙｒａ　Ｌ、　Ｈ，）　ｒ　シモンズ、アール
・エル（８ｉｍｍｏｎｓ　Ｒ，Ｌ、　）　＋オルソン、
エル・シー（０１ｓｏｎ　Ｌ、　Ｃ，）　、ナジャリア
／、ジェー争ニス（Ｎａｊａｒｉａｎ　Ｊ、　Ｓ、　）
、保存腎臓に対するアロプリノールの臨床的効果：無作
為二重盲検５ム（Ｃｌ１ｎｉｃａｌＢｆｆｅｃｔ　ｏｆ
　ＡＪＩａｐｕｒｉｎｏｌ　ｏｎ　Ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ
　Ｋｉｄｎｅｙｓ　：λ几ａｎｄｏｍｉｚｅｄ　Ｄｏｕ
ｂｌｅ−Ｂｌｉｎｄ　８ｔｕｄｙ　）。年刊サージユリ
−（Ａｎｎ　Ｓｕｒｇ）１８５：１２８（１９７７年）
。 １７、パークス、ディー・ニー（Ｐａｒｋｓ　Ｄ、人、
）、グンンジャー、ディー・エフ（Ｇｒａｎｇｅｒ　Ｄ
、　Ｎ、　）　。 パルクレー、シー−ビー（Ｂｕｌｋｌｅｙ　Ｇ、　Ｂ、
　）、超酸化物ラジカルと虚血小腸の粘膜損傷（概要）
（５ｕｐｅｒｏｘｌｄｅ　　Ｒａｄｉｃａｌｓ　　ａｎ
ｄ　Ｍｕｃｏｓａｌ　　Ｌｅｓｉｏｎｓ　　ｏｆ　　ｔ
ｈｅＩｓｃｈｅｍｉｃ　Ｓｍａｌｌ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎ
ｅ　（人ｂｓｔｒａｃｔ）　）。フェトブロク（Ｆｅｄ
　Ｐｒｏｃ　）　４１　：１７４２（１９８２年）。 １＆　カゼイル、ニー・ニス（０ａａａｌｅ　Ａ、　Ｓ
、　）　、パルクレー、ジー・ビー（Ｂｕｌｋｌｅｙ　
Ｇ、　Ｂ、　）　、パルクレー、ビー−エッチ（Ｂｕｌ
ｋｌｅｙ　Ｂ、　Ｈ−）、フラハーテイ、ジエ一番ティ
ー（Ｆｌａｈｅｒｔｙ　Ｊ、　Ｔ−）　＊　　ゴツト、
ブイ・エル（Ｇｏｔｔ　Ｖ、　Ｌ）、ガードナー、ティ
ー・ジｘ−（Ｇａｒｄｎｅｒ　Ｔ、　Ｊ、　）、酸素遊
離基スカベンジャーは進行阻止され念全体的虚血心臓を
再閤流時に保護する（　Ｏｘｙｇｅｎ　Ｆｒｅｅ−Ｒａ
ｄｉｃａ！Ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ　Ｐｒｏｔｅｃｔ　ｔ
ｈｅ　Ａｒｒｅｓｔｅｄ、　ＧｌｏｂａｌｌｙＩｓｃｈ
ｅｍｉｃ　Ｈｅａｒｔ　Ｕｐｏｎ　＆ｐｅｒｆ１１８ｉ
ｏｎ　）。サージユリ−フォーラム（Ｓｕｒｇ　Ｆｏｒ
ｕｍ　）　３４　：　３１３（１９８３年）。 実施例３２ 系ＴモＩ！−鯰（よシ産生し、実施例２６０条件とが判
明し次。 この実施例で括弧内に記され九アラビア数字は該実施例
の説明の後に列挙された参考文献を示す。 ｉｎ　ｖｉｔｒｏのウサギ角膜内皮ポンプに対する低濃
度アデノシンの有益な効果は種々の研究で既に立証され
ている（１）。前記流体ポンプの作動は単離角膜に平衡
食塩水中生理濃度グルコース（５ｍＭ）及びアデノシン
（１０−’Ｍ）　１ｆ！：Ｂ流させることによって実現
された。生存時間は約７時間であった。 我々の次の目標は生存時間の延長であつ次。超酸化物ジ
スムターゼ（ＳＯＤ）（２）は反応０．十へ＋２Ｈ→Ｈ
，ｏ、＋ｏ、全促進することによシ超酸化物遊離基を除
去する。 ＳＯＤ投与は部分的散索欠乏後の虚血組織の生存を著し
く高めることが知られている（３）。虚血に起因するか
なシの程度の組織破壊は単離組織の再面流及び再酸素付
加の間に生じる。この危害の大部分は超酸化物ラジカル
とその一族とによって媒介される。本研究の目的は超酸
化物ジスムターゼ（ＳＯＤ）又はカタラーゼが単離角膜
の生存期間全延長させ得るか否かを調べることにある。 体重ｚＯ〜ａｏｘｆのシロウサギから角膜を単離し次。 その技術としては既に詳述されているものを使用した（
１）。要約すれば、眼を切除して角膜上皮を剥離し、次
いで角膜を記載の如＜ｌ離し、潅流処理し次。 結果 ５ｍＭグルコース及び１μアデノシンを含む基礎食塩水
にＳＯＤアナログｔ−２μ／Ｎｔで加えるとφ離角膜の
生存時間が７時間から１４時間まで延び几。アデノシン
を除外すると生存時間は１２時間までしか延長されなか
った。 結論としては、ＳＯＤアナログは単離角膜の主要な役割
を果たし得る。ウシ８０Ｄを用いて得た同様のデータが
エクスペリメンタルアイリサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ　Ｅｙｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　４　：　１５
３−１５４（１９８５年）に発表されている。 参考文献 Ｌ　ニエーワース、オー（Ｎｅｕｗｉｒｔｈ、　Ｏ，）
及びディクスタイン、ニス（Ｄｉｋｓｔｅｉｎ、　８．
　）　（１９８３年）ウサギ角膜内皮流体ポンプに対す
る環状λＭＰの効果（Ｔｈａ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃ
ｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔｃｏ
ｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｆｌｕｉｄ　ｐ
ｕｍｐ　）　。カレントアイリサーチ（Ｃｕｒｒｅｎｔ
　Ｅｙｅ　ｋｓ、　）　色代５６５−５６７゜２　フリ
ドビツチ、アイ（Ｆｉｄｏｖｉｃｈ、　１．　）　（１
９７５年）超酸化物ジスムターゼ（８ｕｐｅｒｏｘｉｄ
ｅｄｉｓｍｕｔａａｅ　）。生化学年刊誌（Ａｎｎ、　
Ｒａｙ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、）胚１４７−１５９゜ ユ　マンソン、ビー・エフ（Ｍａｎｓｏｎ、　Ｐ、　Ｎ
、）　、　　。 バート、エム（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｍ、）　、アンテネリ、
エムｅエム（Ａｎｔｈｅｎｅｌｌｌ、　Ｍ、　Ｍ、）、
マイケル、ジエー（Ｍｌｃｈａｅｌ　Ｊ、）＋　パルク
レー、ジー・ビー（ＢｕｌｋｌｅｙＧ、　Ｂ、）及びフ
ーブス、ジエー拳イ°　（Ｈｏｏｐｅｓ。 Ｊ、Ｂ、）（１９８３年）アイランド支弁の虚血組Ｄｒ
ｕｍにおける酸素遊離基の役割（Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏ
ｆｏｘｙｇｅｎ　−ｆｒｅｅ　　ｒａｄｉｃａｌｓ　　
ｉｎ　　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　　ｔｉｓｓｕｅ　　１ｎｊ
ｕｒｙ　　１ｎＩｓｌａｎｄ　５ｋｉｎ　ｆｌａｐｓ）
。年刊サージユリ−（Ａｎｎ。 ８ｕｒｇ、　）　１９８．８７−９０゜４　　マイケル
ンン、ニー曽エム（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ、人。 Ｍ、）及びピュゲット、ケー（Ｐｕｇｅｔ、　Ｋ、）　
（１９８０年）外因性超酸化物ジスムターゼによる細胞
侵入（０ｅｌｌ　ｐｅｍｅｔｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｅｘ
ｏｇｅｎｏ１１８　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｌｓｍｕｔ
ａｓｅ　）。アクタフイジオロジースカンジナビアサブ
ルメント（人ｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、
　５ｕｐｐ１．）す玉６７−８０゜ ＆　パー、ｎｔ−ｒｙ、エム（Ｐｅｒｌｍａｎ、　Ｍ、
）及びボーム。 ジエー・エル（ＢａｕＩＴ＋、　Ｊ、　Ｌ、）　（１９
７４年）ウサギ角膜内皮細胞の大量培養（Ｔｈｅ　ｍａ
ｓｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ｃｏｒｎｅ
ａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｌａｌ　ｃｅｌｌｓ　）　６眼
科学会誌（Ａｒｃｈ、　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、　）　
籾２３５−２３７゜＆　クライス、ニス（Ｋｌｙｃｅ、
　＋３．）及びモーリス。 ディー・エム（Ｍａｕｒｉｃｅ、　Ｄ、　Ｍ、）　（１
９７６年）ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの角膜厚さの自動記録（
Ａｕｔｏｍａｔｉｃｒｅｃｏｒｄｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｒ
ｎｅａｌ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ　ｉｒ＋　ｙｉｔｒｏ）
ｏ眼科学研究（Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ、
　）　１５．５５０−５５３゜７、　ニューワースリュ
クス、オー（Ｎｅｕｗｉｒｔｈ　Ｌｕｘ。 ０、）（１９８４年）ウサギ角膜内皮ポンプの生存（８
ｕｒｖｌｖａｌ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ｃｏｒｎｅａＩ
　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｕｍ９　）０エルサレム
ヘブライ大学理事会（ｔｈｅ　５ｅｎａｔｅｏｆ　ｔｈ
ｅ　Ｈｅｂｒｅｗ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｊｅ
ｒ１１８ａｌｅｍ　）　Ｋ提出され九博士論文。 実施例３３ ９９２００の構造は第２６図に示されており図面の説明
の項で説明されている。ｐＨＧ４４をＣＬａ　Ｉ及びＰ
ｓｉ　Ｉで分割し、ＤＮ人ポリメラーゼＩＯクレノー（
Ｋｌｅｎｏｗ　）断片を用いて「フィル　インしｆｃン
イ１及びＡｖａ　ＩでｐＢＲ３２２を分割し次いでＤＮ
人ポリメラーゼ１のクレノー断片を用いて「フィル　イ
ン」することによりＹ離し几ｐＢ几３２２のテトラサイ
クリン耐性遺伝子を含むＤＮＮプラスミドル９２０はｐ
ＨＧ４４（第６図）に類似しているが、このプラスミド
はアンピシリン耐性ではなくテトラサイクリン耐性を付
与する。プびＡ４２５５内に導入し友。これらの株は成
長及び誘導時に、真正ｂＧＨのフェニルアラニン形状の
アミノ末端に加えられ友アミノ酸配列ｍｅｔ　−ａｓｐ
　−ｇｌｎ　ｆ　有スるウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）の
アナログ全産生した。これらの株によって産生され几ｂ
Ｇｌ（アナログの量はｐＨ０４４により産生されたもの
とほぼ同等であつ几〇 びｂＧＨアナログの精製に使用した方法は１００ｍｙ／
ｌのアンピシリンに代えて１２５■／ｌのテトラサイク
Ｉ）７を加えた以外はｐＨ０４４に関する実施例１３と
同一である。 Ａ４３２Ｇと称されてき九株人４２５５／ｐ９２０Ｇの
成長及び誘導に使用し元方法は実施例３６に記載の方法
である。ｂＧＨアナログの精製に使用し元方法は実施例
１３のｐＨ０４４の場合と同じであアンピシリン遺伝子
をテトラサイクリン遺伝子で代換すると、アンピシリン
を産生プロセスから除外し得、その几め重大なアレル鴫
反応の原因となシ得る最終産生物のアンピシリン汚染の
可能性が回避されるという利点が得られる。 実施例３４ ｍｅｔ　−１ｅｕ　−１ｅｕ　−１ｅｕ−ｍｅｔヒト人
ｐｏ　ｇアナログの産生 プラスミドｐＴＶＩ’Ｌは新規なアポリポタンパクｆｉ
Ｂ３アナログの発現を支配する。このアナログのＮ−末
端配列はｍｅｔ　−１ｅｕ　−１ｅｕ　−１ｅｕ−ｍｅ
ｔでｓｂこの直後に成熟アポリポタンパク質Ｅ３の配列
が存在する。 ｐＴＶＲ２７９−８の組立は第２５図及び図面説明に示
されている。プラスミドｐ’ｒＶＲ２７９−ＩＳは受託
番号５３２１６号でＡＴＯＯにを託済である。 プラスミドｐＴＶｉ９ｏ　（第２１図）を人ｖａｌでせ
几。得られ次グラスミドは３’Ａｖａ　１部位が除去さ
れておシこれｔ”ｐＴＶ２６４−４５と命名し友。 ナ１２１７　　　５’−ＴＡＴＧＯＴＧＯＴＧＯＴす１
２１８　　　　　　人０ＧＡＯＧＡＯＧＡＡＴ−５’得
られにプラスミドｔ−ｐＴＶ几２７９−８と命名し、当
業者に公知の方法でＥ、　ｃｏｌｉ、　Ａ１６４５を形
質転換した。このプラスミドを含む細胞を、１ａｐ−標
識オリゴヌクレオチド７１１２１８ｔ−プ薗−プとして
コロニーハイブリダイゼーションによって同定し念。Ｄ
ＮＡ配列決定によって間違いなくこのプラスミドである
ことが確認された。ｐＡｐｏＥ　Ｅ２全含む人１６４５
株は受託番号３９７８７号でＡＴＯＯに寄託済である。 ｐ’ｌ’ＶＲ２７９−８は増殖及び誘発によって天然ア
ポリポタンパク質Ｅ３のＮ−末端に付加アミノ醒配列ｍ
ｅｔ　−１ｅｕ　−１ｅｕ　−１ｅｕ　−ｍｅｔ　ｆも
つヒトアポリボＬ タンパク質のアナログを産生ずる。菌株の増殖に使用さ
れる方法は、実施例１７に記載のｐＴＶ−１７０の増殖
方法に等しいが、但し４２℃での誘発期間が１５分でな
く１〜５時間である。 ｐＴＶＲ２？９−８が産生ずるＡｐｏ　Ｅ　３アナログ
はｐＴＶ１７０及びｐＴＶ１９０　にｊ）て産生サレ友
ｍｅｔ−ムｐｏ　Ｅ　３アナログよりも細菌に対する毒
性が小さい◎ｍｅｔ　−１ｅｕ　−１ｅｕ　−１ｅｕ−
ｍｅｔ−人ｐｏ　Ｅ　３アナログは４２℃での誘発後６
０分を経過し次ときも細胞内に蓄積し続けて、培養物１
を当り４００〜６００１９のレベルに到達する。 実施例３５ ｐＴＶａｏｏの組立については第２７図及び図面説明に
示し比。プラスミドｐ　Ｔ　Ｖ　１８　（１）に由来の
ｈＧＨｔ−ｐ５７９（第１９図）ＯＮｄｅ１部位に挿入
してプ５ｘミドｐＴＶａ　ＯＯを構築し友。ｐＴＶ１８
（１）の組立は、１９８５年１月２３日付の欧州特許公
開第０１３１８４３人１号及び対応する１９８３年７月
１５日付の米国特許出願第５１４１８８号に開示されて
いる。引用し次特許出願は本明細書に含まれるものとす
る。 ｈＧＨアナログの合 当業者に公知の方法を用いｐＴＶａｏｏを＆ｃｏｌｉ菌
Ａ１６４５株に形質転換によって導入し九。この菌株は
増殖及び誘発によって天然成長ホルモンの最初の１３個
のアミノ酸が欠失し次ヒト成長ホルモンアナログを産生
し次。菌株の増殖とｈＧＨアナログの精製とのｔめに実
施例１３と等しい方法を使用し次。 実施例３６ 原栄養菌株の組立及び原栄養宿主を用い友ｂＧＨの産生 最小培地で増殖させ次場合であっても多くの前や　。 記プ２スミドによって高レベルタンノ１り質を発現し得
るム一の原栄養株を構築し友。最小培地を使用する細菌
増殖プロトコルの利点は、ｔａ＋　　細菌を高い細胞密
度に増殖できること、（ｂｌ　　培地成分が「よシ簡単
であシ」従って高品質なので増殖条件を再現し易いこと
、及び、（ｃｌ　　培地がより安価なこと である。 本発明の好ましい原栄養株はＡ４２００．Ａ４２５５及
び人４３４６と命名されている。プラスミドｐ９２００
　ｔ−含む菌株人４２５５は受託番号５３２１５号で人
ＴＯＯに寄託済である。これを人４３２０と指称する。 原　　株の選択及び　立 最小培地での増殖率とファージλ、λ４３４及ゆ びファージＰＩＫ対する感受性と基いて以下の菌株をス
クリーニングし比。 菌株 １、　人ＴＣ！０　１２４３５ Ｚ　　ＡＴＯＯ２３７１６ λ　　人Ｔｏｏ　　２７６６２ 本　人Ｔｏ０　２５４Ｇ４ ＆　人ＴＯＯ１１７７５ ａ　人Ｔｏｏ　　２５２５４ ？、　　　ＨｆｒＯ＝人４１３４ ＆　　　Ｗ３３５Ｇ＝Ａ２５０９ １　人１６４５ テストの結果よシ、上記７アージに感受性で増殖率が最
も高−菌株ＡＴＯＯ１２４３５と人ＴＯＯ２５４０４と
に基い几原栄養株を主として開発することに決定し九。 これらの２種の菌株を使用し、λＣｌ８５７ｊＨＩΔＢ
ａｍＨＩ：ＴｎｌＯ’ｆｔ含むＰｌを形質導入してλｃ
１８５７リプレツサーを含有する新しい菌株を構築し友
。テトラサイクリン耐性コロニーｔ−ｆｆ製し、必要な
場合はＦｉｔ−除去し友。 得られた菌株とその遺伝子型とを以下に示す。 Ａ４２００＝ＡＴＯＣ！　１２４３９（λｅ工８５２　
ｊＨＩΔＢａｍＨＩ）：ＴｎｌＯ人４２０６＝λＴｏｏ
　２５４０４（λｃＩ８５７Δ川ΔＢａｍ　Ｈｌ）：Ｔ
ｎｌＯ双方の菌株をｐＨ０４４で形質転換して菌株Ａ４
２０２及び人４２０７を夫々得た〇 増殖及び誘発 以下の条件で菌株Ａ４２０２とＡ４２０７とを増殖培地 成分　　　濃度 ＫＨｌ　ＰＯ２１１６９ｍ／１ （ＮＨａ）＊ＳＯ４２ｇｍ／１ ＭｇＳＯ４”７ＨｔＯＯ，２９ｍ／Ｌ ＯａＣ！Ａ、　　　　α０１　ｇｒｎ／ＬＦｅＳＯ４ｅ
　’ＩＨ雪０　　　αｓ　ｇ７ｔＰＨ７，４ 監韮 グルコース２０チ溶液　　　　　２５ゴ／ｌアンビシリ
フ　２０　ｍ９７ｒｄｌｌ液　　　１　ｍｌ／　ＬＢｌ
　　Ｏ，３チ溶液　　　　　　　　１−／ｌビオチン０
．３チ溶液　　　　　　　１ゴ／ｌ人４２０２と人４２
０７との双方共が最小培地で十分に増殖する。しかし乍
ら人４２０２だけが有意しとほぼ同じレベルでｂＧＨア
ナログを発現する。 人４２００からのテトラサイクリン　　　！テトラサイ
クリン耐性マーカーのみを含むプラスミドで原栄養株Ａ
４２００　？利用するためＫ、Ｔｒ＋ｌＯマーカーを除
去し次菌株を構築した。 人４２００株をマツプ／キー（Ｍａｃｏｏｎｋｙ　）ガ
ラクトースプレートに画線し、ｇａｌ＋　復帰細胞を選
択しテトラサイクリン感受性とλ７アージに対する免疫
性とをテストし友。この菌株をＡ４２５５と命名前記原
栄養株は全てλｃ１８５７ＪＨ１ΔＢａｍＨ１久損グロ
７アージ全含む。ｊＨ１欠失は独Ｉ！Ｂ領域に及び、ビ
オチン生合成オペロンが除去されている。従って、菌株
の増殖培地にビオチンを加える必要がある。 Ａ４２００及び人４２５５由来の菌株のビオチン要求を
除去するｔめＫ、これら菌株に人８９株のＰ′エピソー
ムを導入し比。 人８９株はＦ’ｇａｌプラスミドを含んでいる。このＦ
′プラスミドがビオチンの内因合成に必要な全ての遺伝
子を含むことが判明した。このプラスミドは−オペロン
の好適ソースとなり得る特性を２　このプラスミドはＰ
Ｌｃｏ■中で極めて安定である。 Ｌ　　Ｆ’プラスミドは、出願人等の発現ベクターのベ
ーストするｃｏｌ　Ｅ　１グ２スミドと適合性である。 ４　　Ｆ’ｇａｌは接合性プラスミドでちる。従って細
胞間を容易に移動し得る。 ＆　ビオチン独立性菌株のスクリーニングが容易でちる
。 人４２０２株をＡ８９と３０分間接合し、ビオチン独立
性コロニーを選択し次。得られた人４３４６株を、ビオ
チンを含まない最小グルコース培地で誘発させると高レ
ベルのウシ成長ホルモンアナログが産生じ元。他の増殖
因子は不要である。 当業者に公知の標準方法で人４３４６からｐＨＧ４４ｔ
−除去し得る。得られ九原栄養宿主菌株は、本出願に記
載の全てのプラスミドによって形質転換され得る。 最小培地 原栄養株による産生のために以下の最小培地を標準的に
使用し友。 発酵槽用　　振盪７ラスコ用 に、ＨＦ０．　　　　　　　６９／ｌ　　　　６　ｇ／
ｌＫＨ，ＰＯ４４ｇ／ｌ　　　　４９／ｌＮＨ，０１１
９／Ｌ　　　　１　ｇ／１Ｍｇ８０４・７Ｈ１０３９／
Ｌ　　　Ｇ、２　ｇ／Ｌ１０９４　　ＦｅＮ）ｆ４ シトレート　　　　　　αｓｍｔ／ｌ　　　　ｏ、１ゴ
／を微量元素溶液　　　　３ｍｔ７ｔ　　　　１ｗｔ７
を消泡剤？ジーーン　αｓ−／ｌ オートクレーブ 菌株がアンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性のい
ずれであるか忙従ってアンピシリン（１００■／ｌ）又
はテトラサイクリン（１２−５ｗｚ／ｌ）を培地に添加
し得る。 別に５０チグルコースをオートクレーブ処理しｚｏｙｍ
７ｔｉで加えた。発酵中に５０チグルコースを、Ｆ′エ
ビソームを含まない菌株に対しては０、Ｄ、単位当シグ
ルコースＬＯ８ｇｍの割合で加え、Ａ４３４６株に対し
ては０、Ｄ、単位当シダルコース１８９ｍの割合で加え
た。２５チＮＨ４ｔ−送って声を調節し次。必要に応じ
て消泡剤を加え念。 Ａ４２００．Ａ４２５５及び人４２０６ｔ−ペースとす
る菌株にビオチンｔ−１５ダ／ｌの割合で添加し友。 溶液は以下の微量元素を含有する（バイオテクノロジカ
ル・バイオエンジニアリング（ＢＡｏｔｅｃｈｎｏｌ。 Ｂｌｏｅｎｇ、）１６：９３３−９４１（１９７４）：
ヱａ Ｈ，ＢＯ，（Ｌ５７ ０ｕＯＬ１（，０ｕＳＯ４ｓ　ｓａ、ｏ　）　　　　１
Ｇ（α０４）０託４ｍ２Ｈ＊Ｏｔ、。 Ｍｎ５Ｏ，ｅ　４Ｈ，Ｏα８１ Ｎａ、ＭｏＯ，＊２Ｈ，Ｏ！０ ０Ｒ０４”　６　Ｈ＊０　　　　　　　１０ＺｎＯｔ＊
”４Ｈ＊０（ＺｎＳＯ４・７Ｈ１０）　２．ｏ（ｚ７ｓ
）濃ＨＣ１１０Ｇ　ｍｇ かっこ内の化合物は、かつこの前の化合物の代りに使用
し得る代替化合物である。かっこ内の数値はこの代替化
合物の量である。前出のプラスミドの多くを、原栄養株
Ａ４２００と人４２５５とに導入し友。これら菌株の一
部のリストを次表に示す。 菌株基　　宿主菌株／プラスミド 人４２０２＝人４２００／Ｉ）ＨＯ２４人４２５６　＝
Ａ４２５　ｓ／　ｐＨＧ４４人４３２Ｇ　＝Ａ４２５５
／ｐ９２０ＧＺ１８０３＝Ａ４２５５／ｐｓＯＤＩＴ１
１人４５０Ｇ　＝Ａ４２５５／ｐＴＶ１９４人４３４６
＝Ａ４２００／ｐＨＧ４４．Ｆ’Ｇａ１（以下余白） 実施例３７ 溶菌宿主の組立及びこれら溶菌宿主を使用するｂＧＨの
産生 Ｌ　菌株人４０４８及び人３１１１の組立式７アージの
増殖には多くの場合Ｗ３３５Ｇ株が使用されている（例
えばオフペンノ・イム（Ｑｐｐｅｎ−ｈｅｉｍ）及びサ
ロモン（８ａｌｏｍｏｎ　）　（１９７Ｇ）　、４１グ
イロロジイ（Ｖｌｒｏｌｏｇｙ　）　、　１５１−１５
９参照）　。Ｗ３３５Ｇの原栄養誘導体たる人２５０９
株に人１６３７で増殖し九ＰｌｃＩｔｓを形質導入し、
また、ＴｎｌＯ−ｒ−カーを含むλｃＩ８５７ΔＨ１Δ
１３ａｍＨ１欠損プロファージを形質導入した。得られ
た人４０４８菌株を、欠損プロファージλｃＩ８５７Δ
Ｈ１ΔＢａｍＨ１を含むテトラサイクリン耐性クローン
として選択した。この菌株はまたＰｌｃＩ（ｇプラスミ
ドを含んでいた。この菌株をｐＨ０４４で形質転換して
Ａ３１１１株を作成した。 同様にして、同じく人２５０９株を用いこの菌株にλｃ
Ｉ８５７△Ｈ１Δ１３ａｍ）ｌを挿入しｐＨ０４４で形
質転換する前にＴｎｌＯ）ランスボゾンを除去し且つＩ
’にＩｔｓプラスミドを除去してＡ４０８５株を構築し
た。Ａ４０８Ｓ株は欠損プロファージλｃ工８５７ΔＨ
１ΔＢａｍｌ１を含んでおｊｊ）、ＰＩプラスミドを存
在させずに行なわれるｂＧＨ産生と自己溶菌とを測定す
るためのコントロールとして作用する。人３１１１株は
受託番号５３２１７号でＡＴＯＯに寄託されている。 ２　ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）の合成保存培養物　５
０μｆ／ｌｄのアンピシリン（人ｍｐ）ｔ−含むＬＢ培
地で人３１１１株（人４０４８細胞中のＩ）ＨＯ４４）
の保存培養物を３０℃で一晩増殖した。培養物を５０％
グリセロールで２倍に希釈し一２０℃で保存した。 接種物　接種物は１００μｆ／ｍｌ　（Ｄ　Ａｍ　ｐを
含むＬＢ寒天プレートで増殖し九人３１１１の単一コロ
ニーから得られた。次に、保存培養物から採取した材料
をＬＢプレートに塗抹した。 ５０ｐｆ／ｌｄのＡｍｐを含む３ゴの無菌Ｉ、Ｂ培地に
人３１１１の単一コロンを接種し３０℃の振盪浴で１８
時間増殖させた。 産生　５０μｆ／−のＡｍｐを含むＢＨＩ培地（原石イ
ンフュージョン培地（Ｄｉｒｃｏ）、　３７　μｆ／１
）でｂＧＨを産生した。新鮮ＢＨＩ　＋　５　ＯＮ／ｍ
ｅのＡｍｐを収容したフラスコで接種物をｗｏｏ倍に希
釈し、細胞濃度が約４×１０−細胞／ｍ（ＯＤ０ｇｏｏ
＝０．５）　Ｋなるまで３０℃の振盪浴で増殖させた。 ｂＧＨ産生を誘発するために、フラスコを４２℃に調温
した振盪浴に移した。誘発開始後０分と９０分との時点
で細胞サンプルを採取した。 ｂＧ）（産生の分析　　１０〜２６％の濃度勾配のアク
リルアミｒグルでｂＧＨ産生を分析した。細胞テンプル
をマイクロ遠心機でｍ上清を除去してペレットをサンプ
ルノ々ツ７ア（２％８Ｄ８，５０ｍＭトリスｐＨ７，０
，３％ショ糖、５％β−メルカプトエタノール）に溶解
し、ゲルにローＦした。２００Ｉルトで２−３４時間電
気泳動にかけ、ゲルをクーマシーブルー（Ｏｏｏ＠ｍａ
ｓｅｌｂｌｕｅ　）で染色し、ゲルスキャナーで走査し
てｂＧＨの量を測定した。 ４２０℃での誘発の９０分後にｂＧＨはλ３１１１の飴
タンノぞりの約２０％を含む。 ＆　自己溶菌 人３１１１株は、ｐＨ０４４と欠損プロファージλｃＩ
８５７ΔＨ１ΔＢａｍＨ１と安定なＰｌｃＩｔｓプラス
ミｒとを含む。４２℃で長時間誘発すると、ＰＩ　によ
って支配されるエン１；リシンの産生によって細胞の溶
解が始まる。２．５〜３時間後に培養物が完全に溶解す
る。 調節自己溶解テスト　　４２℃で（９０分間）の誘発の
以前及び以後に５ｔｄＯ人３１１１培養物を採取し、・
ソーＡル（Ｓｏｒｖａｌｌ）遠心機に入れ７０００　ｒ
ｐｍで７分間匣轄団た。上清を除去しペレットを一２０
℃で１晩。 冷凍した。次にペレットをＯ，ＳＭＩの’ｒ、　Ｂ、バ
ッファ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８，０、１ｍ、ＭのＦ
ｉＤ’ｒ人）に再懸濁させ、０．１−をＴ、　Ｂ、で１
０倍忙希釈し、ｏｎ−ｗｏｏを測定した。 この実験のコントロールとして、人３１１１と同様にｐ
Ｈ０４４と欠損ゾロ７アージλｃＩ８５７ΔＨ１ΔＢａ
ｍＨ１を含むがＰにＩｔｓシラスミＰを含まない人４０
８５株を使用した。 この実験の結果を表ＶＫ示す。この表の結果より、Ｐに
Ｉｔｓプラ子ミドを含む細胞（人３１１１）が解凍直後
に溶解することが判明した。解凍混合物の検査によシ、
この処理後に細胞の９５％以上が溶解することも判明し
た。 表Ｖ ”　　株ＰＩｃＩｔ・　凍結以前　解凍後　減量（イ）
ＯＤ・ｓｏ。 人４０８５　　　−　　　　０．９８０　　　０．８５
１　　　１４この溶菌手屓を用いると、ｂＧＨ産生を妨
害すること無く誘発細胞からｂＧＨを簡単に抽出できる
。 実施例３８ 実施例１７の方法で細菌ｐＴＶ１９４を増殖させた。 かっこ内の数字は実施例末尾に列記した参考文献の参照
番号を示す。 細菌抽出物の分析 細菌細胞を遠心採取し、５ｍＭのＦｉＤ’ｌ’Ａと２ｍ
Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオリ）’トｅ含ｔｒ
５０ｍＭのリン酸力ｊｆｌ’ウムノツ７ア、ｐＨ７，５
に懸濁させた。分取サンプルを１．５倍量の、ｆツ７ア
（１５％グリセロール、４．５％ＮａＤｏｄ８０４　、
１　ｍＭのβ−メルカプトエタノール、９３．５ｍＭの
トリス、ＨＯＡ　ｔ　ｏ　−２５％のブロモフェノール
ブルー、ｐＨ６，８）Ｋ溶解し、１００℃で１０分間加
熱し、１０％ＮａＤｏｄＳＯａポリアクリルアミドゲル
でタンパク質を分析した（２６）。ぼりアクリルアミＰ
ゲルで分離したタンノにり質をクーマシー・ブリリアン
ト・ブルーテ染色スルか、又は、ニトロセルロールシー
トに電気泳動させ（２７）　ｉ侯凸標識抗ヒト人ｐｏＥ
モノクローナル又はポリクローナルＩｇＧと反応させた
。免疫プロットを洗い、風乾しＸ線フィルムに露光した
。 人ｐｏＥの単離 従来技術のセファクリ４ＳｅｐｈａｃｒｙＩ）Ｓ−３０
０カラムクロマトグラフイー（１４）を用い、高トリグ
リセレＡラテイブインモピリン等電点電気泳動法（ｐｒ
ｅｐａｒａｔｉｖｅ　　Ｉｍｍｏｂ出ｑａ　１ｓｏｅｌ
ｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃ１１８〆−ｉｎｇ）（エル・ケー
・ピー・インストルメンツＬＫＢＩｎｔｒｕｍｅｎｔｓ
　、ブロン−＋ｒ（Ｂｒｏ＋ｎｍ仏スエーデン＋　ＰＨ
４，９〜ｓ、ｅ　）　（２ｇ）を用いＥ３のアイソフオ
ーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）を得た。λｐＯＥアナログを３
３１の凍結乾燥細胞から単離した。後者はｓｊＬ発酵で
得られる細胞量である。（４℃に）冷した乳鉢と乳棒と
を用い２２ｆのアルミナ（ベーラ−・リミテッド（Ｂｕ
ｅｈｌｅｒ　Ｌｔｄ、）　、工、６ンストン市、イリノ
イ州）によって細胞な微粉に粉砕した。０．１ＭのＮＨ
４ＨＯＯｓと２ｍＭのＦＭＳ　Ｆと０．１％トラシロー
ル（モペー・ケミカル・ニーポレーシ：Ｉン（Ｍｏｂａ
ｙ　Ｏｈｅｍｉｃａｌ細胞を抽出した。不溶細胞残渣を
ベックマン（Ｂａｃｋｍａｎ　）　５Ｗ２８　ｏ−夕内
で（２５，００Ｏｒｐｍで５０分間）４℃で超遠心して
沈降させ、２００ｍの６Ｍ尿素バッファで再抽出した。 上清画分を合せて透析した。透析には、２５ｍＭのＮＨ
，ＨＣＯ，と２ｍＭのＰＭＳＦと２ｍＭのＩＩ）Ｔ人と
０．１％のト２シロール必抽出上溝に〜２００ｄのヘノ
９リン−セファロースを加えた。後者は従来通シに（２
９）調製し、２Ｍ尿尿素ノンソファ平衡させておく。ゲ
ルと上清との混合物を回転上に載せ４℃で一晩インキユ
ペートし、次にガラスカラム（４，ＯＸ３．５ｃｙａ、
コンテス・ガラス（Ｋｏｎｔｅｓ　Ｇｌａｓｓ　）、グ
アインランド（Ｖｌｎｅｌａｎｄ　）、二ニー・シャー
シ（ＮＪ））に充填した。〜３０−の２Ｍ尿素ノ々ツフ
ァを２５ｄ／時の速度でカラムに流してヘパリン−セフ
ァロースに結合しなかった物質をカラムから洗い流した
。次に、２Ｍ尿素に入れた５１）−ｊの１．ＯＭ　ＮＨ
４ＨＯＯ３で結合した物質をカラムから溶出し、５ｍＭ
のＮＨ４ＨＯＯ！１に透析して凍結乾燥した。この半精
製人ｐｏｌｉを０．１ＭのトリスＨＯｊｌと１ｍＭのＥ
ＤＴＡと１．ｏ　９ｔ；のβ−メルカプトシア・ファイ
ン・ケミカルズ（ｐｈ工ｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＭのグ
アニジンと０．ＩＭのトリス、ＨＯぷと１ｍＭのＥＤＴ
Ａと０．１％のβ−メルカプトエタノールヒ（ｐＨ７，
＋）７によって平衡させた。λｐｏｐｉを含む画分をプ
ールし、５ｍＭのＮ）（４ＨＯＯ３に完全に透析して凍
結乾燥した。固定ゲル上の分取形等電点電気泳動法（２
８）を用いて最終精製を終了した。 ＡｐＯＥアナログの構造的特性決定 アミノ酸解析用のタン／＃り質又はペプチドサンプルを
密封減圧管内で１１０℃の６Ｎ　ＨＯＩ中で２０時間加
水分解した。標準的１２６データシステムを備えたベッ
クマン（Ｂｅｃｌ＋ｍａｎ）　１２１　ＭＢアナライザ
ーで分析を実施した。 セファクリル５−ａｏｏカラムで精製した３■のＡｐ（
１Ｂを６００　ｆｉｉ−の７０％ＨＯＯＯＨＫ入れた９
（＋９の０ＮＢｒによシ室温で３０時間消化してアミノ
酸及びその配列を解析するためのベプチＰを得た。 得られたペプチドを前述の真正ＡｐｏＥと同様に（４）
セファデックスＧ−５０カジムで分離した。 最新製ペックマン８９０Ｃシーケンサ（Ｂｅｃｋｍａｎ
８９００　　Ｓ＠ｒｅｎｅｅｒ　）を用い標準０．１Ｍ
カドロール（（１１１ａｄｒｏｌ　）プログラムで配列
解析を実施した。 ３■のポリブレンと０．５％のＮａＤｏｄＳ０４との存
在中で完全形タンパク質を分解し、ポリブレンのみを存
在させてペゾチドを分解した。従来の高性能液体り四マ
ドグラフィー（１４）を用いてフェニルチオヒダントイ
ンアミノ酸の同定及び定量を実施した。 分析用等電点電気泳動法とＮａＤｏｄＳＯ４ｇ　！ｊア
クリルアミｒゲル電気泳動法（１４）とを実施した。シ
ステアミン（β−メルカプトエタノールアミン）による
電荷修正を行なった（１４）。 人ｐｏＦｉアナログの生物学的特性決定人ｐｏｇアナロ
グとシミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＯ）
とのリン脂質複合体を従来通シに調製し単離した（１４
）。従来の線維芽細胞（３１）及び肝膜（３２）の場合
に準じてリポタンノ々り質レセゾター結合アッセイを実
施した。ヨード−ビーズ（Ｉｏｄｅ　−Ｂｅａｄｓ　）
　（ビア、Ｘ　（Ｐｉｅｒｃｅ　）　）を製造業者の指
示通りに用い０．１０ＭのＮＨ４ＨＯＯ１中で人ｐｏｇ
をヨウ素化した。 り？イ及び２ツトのインビデテストのためにヨウ素化し
た真正人ｐｏｐｊと人ｐｏＥアナログ（各９０μｔ）と
を１−のウサギ又はラットの血漿と共に室温で３０分間
インキュベートし、ニュージーランＰ白ウサギの雄に注
射した。従来の沈澱法（３３）を使用し血漿放射能によ
って１０人沈殿可能タンパク質を測定する。血漿量を体
重の４．５％と仮定し、種々の経過時間での注射物質の
血漿中残存パーセントを計算する。 ｐＴＶ１９４でトランスフェクトした細胞の誘発により
、人ｐｏＢに等しい見掛は分子量をもつタンノ臂り質が
特異的に誘発された。この誘発タンツク質は抗ヒト人ｐ
ｏｇ抗体と反応した（図示せず）。 誘発期間が３０分以上の場合細胞溶解が観察された（第
２８図）。この細胞溶解はＡＩ）０１！ｉの細胞内蓄積
と関係がある。３０℃に維持された非誘発細胞は安定で
あった（第２８図）。このような崩壊性（ｔｏｘｌｃｉ
ｔｙ　）細胞溶解はこの発現ベクターの一般的特徴では
ない。何故ならヒト成長ホルモンｅＤＮ人を含むとき同
じ発現系が同じ結果を生じないからでめる。細胞溶解後
のタンパク分解によってＡｐｏＢは破壊された。人ｐｏ
ｌ？ｉ蓄積によって生じる毒性の問題を解決するために
、細胞の誘発を短時間にしく〜２０分）次に発酵槽に氷
を加えて細胞を冷却した。 固相ラジオイムノアッセイで定量すると短時間誘発細胞
中の人ｐｏＢレベルは可溶細胞タン／ぞりの約１％でら
った。人ｐｏｌｉｉを単離し、ヘパリンセファロースと
セファクリル５−ａｏｏクロマトグラフィーとによって
細胞抽出物から精製した。この２段階プロセスで９０％
よシ高純度の人ｐｏｌｉｉ調製物が細胞抽出物中の人ｐ
ｏＢ存在量の約２０χに相描する収率で得られた。特性
決定するための最終精製には分取型インモピリン等電点
電気泳動を用いた。 これらのテストで用いた精製手屓は総量収率を最も良く
するように設計されたものでなぐ特性決定のための純粋
物質が得られるように設計されたものである。 人ｐｏＥアナログの構造的特性決定 インモピリン精製ＡｐＯＥアナログは（５１）ｉ９ゲル
上で真正Ａｐｏｌｉ：に等しい見掛けＭｒをもつ単一ノ
ζンｒとして泳動した。生物工学的（ｂｉｏ−ｓａｇ（
ｎｅｅｒｅｄ　）ＡｐｏＥは等電点電気泳動にかけると
イモピリン精製産物 として集束した。１つのシスティン残基の存在に対応し
てＡｐｏＥアナログはシステアミン修飾後にアノード側
に１電荷ユニツトだけシフトした。イモピリン精製産物
のアミノ酸解析を同じ方法で精製した真正ヒ）　Ａｐｏ
Ｂ３に比較した。表■に示す如くＡｐｏＢアナログと真
正人ＰＯＢとの分析結果は互いにほぼ等しくヒト人ｐＯ
Ｂの従来の配列解析から得られた理論組成にもほぼ等し
い。しかし乍らこの分析結果は、人ｐｏｇアナログが真
正Ａ９０Ｂに比較して付加的なメチオニン残基を含むこ
とを示唆している。 更に１システアミン処理によって示唆された１つのシス
ティン残基の存在も確認された。 完全形ＡｐＯＥアナログ（約６ナノモル）の配列解析の
結果、付加メチオニン残基がタンパク質のＮＨ２末端に
存在し、単鎖配列 Ｍｅｔ　−Ｌｙｓ−Ｍａｌ−Ｇｌｕ−（）Ｉｎ−Ａｌａ
−ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ　−Ｇｌｕ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−人ｒｇ−Ｇｌｎ　−Ｇｌｎ
　−を形成することが判明した。メチオニン以後の配列
はヒト人ｐＯＢの残基１−１７に対応する。これらの結
果よシ、人ｐｏＫのＮＨ２末端をコードする部分を再構
築する合成オリ−ヌクレオチドが正しく翻訳されたこと
及び（ｉｉ菌による翻訳開始コドンとして付加された）
付加的メチオニンがプロセシングメカニズムによって除
去されなかったことが判明した。配列解析に於いて初期
収率は予想外に低かったが（約２０χ）、その理由は恐
ら＜、ＮＨ２−末端メチオニンの一部分がホルミル化さ
れたためでなく、ホルミル化タンパク質が非ホルミル化
ポリペゾチド（及び真正人ｐａｌ）とは明らかに異なし
て特性決定し、（図示しないが）真正人ｐｏｐｉとの間
に違いはないことを知見した。更に０Ｂ４（真正人ｐｏ
Ｅの残基１０９−１２５）の配列解析とＯＲ３の（Ａｐ
ＯＥの１６４位に対応する残基までの）部分配列解析と
によって、人ｐｏ′Ｂアナログが重要なレセプター結合
領域に於いては真正人ｐｏＢ３と等しい配列を有するこ
とを確認した。これらのデータは全て、ＮＨ２末端の付
加メチオニンを除くと人ｐｏＦｉアナログがＡｐｏＥ３
と等しい構造を有することを示す。 ＡｐＯＥアナログのインビトロ及びインビ昶代謝の特性
決定 人ｐｏＥ、　ＤＭＰＯ複合体のレセプター結合の比較に
よシ、ＡｐｏＥアナ四グが真正人ｐｏＥと本質的に等し
い結合特性を有することが判明した。培養線維芽細胞上
でのＡｐｏＩ３　、　Ｂ　（ＬＤＬ）レセプター−の結
合を測定するために１２５１−ＬＤＬを用いた競合テス
トを行なうと、５０χ置換濃度は人ｐｏｐｌアナログで
０．０１９μｆ／ｄ、真正ＡＩ）ＯＦＩで０．０２４μ
ｆ／ｌｄであった（第２９図）。線維芽細胞への直接結
合テストでは、双方のＡｐｏｌＢ調製物が同様に結合し
た（第２９図）。直接結合データのスキャッチャーＰ（
Ｓｃａｔｃｈｓｒｄ　）分析によれば、生物工学λｐｏ
Ｅと真双方のＡｐｏＥ１精製物はイヌ肝膜上の人ＰＯＢ
レセプターにも同様に効率良く結合した（第３０図）。 ＡｐＯＦｔアナ日グと真正Ａｐ６Ｂとのイ／ピゼ代謝特
性とを比較すると、双方の調製物が同様の挙動を示すこ
とが判明した。１３１工標識ＡｐｏＥアナログと１２５
Ｘ標識真正人ｐｏＥとを混合し工学ウサギ血漿と共にイ
ンキエペートし次に混合物を正常ウサギに注射すると双
方のラベルは等しい反応速度論に従って鉱６−ら除去さ
れた（第３１図）。注射後約２０分で双方のラベルの注
射量の５０％が除去された。ラベルを互いに交換して標
識したタンパク質に関しても等しい結果が得られた。ま
たラットを用いたターンオーツ々−テストでも等しい結
果が得得られた（図示せず）。従って、インビトロ及び
インピＩのテストの双方に於いて生物工学ＡｐＯＥと真
正人ｐｏＦｉとは同様の特性を示し、本質的に同様に作
用する。 要約すれば、単離ＡｐｏＢアナログの構造的特性決定の
結果、人ｐｏｐｌアナログはアミン末端の付加メチオニ
ン残基を除いて真性人ｐｏ）ｉｉに等しい構造を有する
ことが判明した。更にインビトロ及びインビゼの双方に
於いてＡｐＯＥアナログと真正Ａ９ＱＥとは等しい代謝
特性を有していた。 表箕 人ｐｏＥ３アナログ　ＡｐｏＢ３　　　配　列Ｌｙｓ　
　　　　１２．１　　　　　１２．０　　　１２Ｈ１ｓ
　　　　　　２．０　　　　　２．０　　　　２人ｒｇ
　　　　　３３．３　　　　　３３．３　　　３４０ｙ
ｓ　　　　　　Ｏ，８０，８１ 人ｉｐ　　　　　　１２．３　　　　　１２．４　　　
　１２Ｔｈｒ　　　　　　１０．５　　　　　１０．５
　　　１１Ｓｅｒ　　　　　　１２．７　　　　　１２
．６　　　１４Ｇｌｕ　　　　　　　　フ２．０　　　
　　　　７１．９　　　　　７１Ｐｒｏ　　　　　　８
．５　　　　　８．４　　　　８ｃｏ７　　　　　１７
．３　　　　　１７．３　　　１７Ａｌａ　　　　　　
３５．６　　　　　３５．５　　　３５Ｖｉｌ　　　　
　　２１．９　　　　　２２．３　　　２２Ｍｅｔ　　
　　　　７．７　　　　　６．５　　　　７ＩＩｅ１．
９　　　　　１．９　　　　２Ｌｅｕ　　　　　３７．
０　　　　　３７．３　　　３７Ｔ５１ｒ　　　　　３
．８　　　　３．９　　　４Ｐｈａ　　　　　　３．２
　　　　　３．２　　　　３Ｔｒｐ　　　　測定不能　
　　測定不能　　７（１）結果は重複定量（ｄｕｐｌｉ
ｃａｔｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｕａｔｉｏａｇ）から得られ
たものでｓｂモル当シの残Ｉとして示される。システィ
ンは過ギ酸酸化後別個に定量された。スレオニンとセリ
ンとの値は加水分解損を補正していない。トリプトファ
ンは測定されなかった。人ｐｏＢ　３配列は参考文献４
による。 参考文献目録 Ｌ　アール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌｅ
ｙ）（１９７８）脂質及びリポタンパク質の代謝障害（
Ｄｔｓｔｍｒｂａｎｃｅｉ　　Ｉｎ　　Ｌｉｐｉｄ　　
ａｎｄ　　ＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＭｅｔａｂｏｌｉａ
ｍ　）　、ジエー・エム・ディッチ−（Ｊ。 Ｍ、　Ｄｔｅｔｓｃｈｙ　）　＋ニー・エム・ゴツト−
・ジュニア（人、　Ｍ、　Ｇｏｔｔｏ　Ｊａｒ、）及び
ジエー・ニー・オント（５０人、　Ｑｎｔｋｏ　）　（
米国生理学協会（人ｍｅｒｉｃａｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　　８　ｏｃｉａｔｙ　）　、ベセズダ（Ｂａ
ｔｈｅｓｄａ　）　。 メリー２ンｒ（ＭＤ）　、　ｔａｘ〜１９７ページ。 Ｚ７−に−ダブリュ・Ｗ　−レイ（Ｒ，Ｗ、　Ｍａｈｌ
ｅｙ　）　。 ティー・エル・イネラリティ（Ｔ、　Ｌ、　Ｉｎｎｅｒ
ａｒｉｔｙ）　。 ニス・シー・ラール・ジュニア（８，Ｃ！、　Ｒａ１ｌ
　Ｊｒ）及びジー・エッチ・ワイスグレーノ々−（Ｋ、
Ｈ。 Ｗｅｌｓｇｒａｂｅｒ）　（１９８４）ジャーナル・オ
ブ・リビド・リサーチ（Ｊ、Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、）　
２５．１２７７−１２９４゜＆７−＃＝ダブリュ・マー
レイ（Ｒ，Ｗ、　Ｍａｈｌｅｙ　）及びティー・エル・
イネラリティ（Ｔ、　Ｌ、　Ｉｎｎｅ−ｒｍｒｉｔｙ　
）　（１９８３）ノ々イオシミカ・ノセイオケミカ・ア
クタ（ＢＡｏｃｈｉｍ、　　ＢＡｏｐｙｓ、人ｃｔａ　
）　７３７．１９７−２２２゜ 本　ニス・シー・２−ル・ジュニア（１３，Ｏ，Ｒａ１
ｌＪｒ）、ジー・エッチ・ワイスグレーノ々−（Ｋ、Ｈ
。 Ｗｅｌｓｇｒａｂｅｒ　）及びアール噛ダブリュφマー
レイ（Ｒ，Ｗ、Ｆ？′Ｉａｈｌｅｙ　）　（１９８２）
生化学会報（Ｊ、ＢＡｏｌ。 Ｃ！ｈｅｍ、　）２５７．４１７１−４１７８゜艮　ジ
エー・ダゾリュ・マクリーン（Ｊ　、　Ｗ、　Ｍｃｌｅ
ａｎ）　。 エフ・ニー・エルズアワノ々ギー（Ｎ、Ａ、εｌｓｈｏ
ｕｒ−ｂａｇｙ）、ディー・ジエー・チャン（Ｄ、Ｊ、
ＯｂａｎｇＬアール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ，Ｗ、Ｍ
ａｈｌｅｙ　）及びジエー・エム・ティｔ−（Ｊ、Ｍ、
Ｔ工ｙｌｏｒ　）　（１９８４）生化学会報（Ｊ　、　
ＢＡｏｌ　、　Ｏｈｅｍ、　）　２５９　、６４９８−
６５０４゜ａ　ピー・オライゼン（Ｂ、　０１ａｉｓｅ
ａ　）　、ピー・テイスＡ−グ（Ｐ、　Ｔｅｉｓｈｅｒ
ｇ　）及びティー・ゲツｒ−ダール　ジュニア（Ｔ、　
Ｇｅｄｄｅ−Ｄａｈｌ　Ｊｒ　）　（１９８２）ヒユー
マン・ジエネテイクス（Ｈｕｍ、　Ｇｅｍｅｔ、）（５
２）２３３−２３６゜ ７、　レイ・ジー・ペイク（Ｙ、に、　Ｐａ１ｋ　）、
ディー・ジエー・チャン（Ｄ、　Ｊ　、　Ｏｈａｎｇ　
）　、シー・ニー・リアトン（０１人、　Ｒｅ１ｒｄｏ
ｎ　）　＋ジエー・イー・ダビー（Ｊ−Ｅ、Ｄａｖｉｅ
ｓ　）、アール・ダブリュ・−ｒ　−Ｌ／イ（Ｒ，Ｗ、
Ｍａｈｌｅｙ　）及びジエー・エム・ティラー（ＪＪＪ
、’Ｉ’ａｙｌｅｒ）プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミツク・サイエンス（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｈ、人ｃｕｄ、　８ｃ１．　）、米国、ｚａｄ中
。 ＆　ジー・ユターマ７　（Ｇ、　Ｕｔｅｒｍａｎ　）　
、　ニーーランゲンペツク（Ｕ、　Ｌａｎｇｅｎｂｅｃ
ｋ　）　、　ニー　、ベイジーゲＡ／　（Ｕ−Ｂｅｉｓ
ｉｅｇｅｌ　）及びダブリュ・ウエーノ々−（Ｗ、Ｗｅ
ｂｅｒ）　（１９８０）アメリカｙ−ジャーナル・Ｈｕ
ｍ、　Ｇｅｍｅｔ、　）　３２　、３３９−３４７゜張
　グイ・アイ・ザンス（Ｖ、　Ｉ−Ｚａｎｎｉｇ　）　
及ヒ・クエー・エル・ブレスロク（Ｊ、Ｌ、Ｂｒｅｓｌ
ｅｗ）　（１９８１）ノ々イオケミストリイ（ＢＡｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２０．１０３３〜１０４１゜ １０、グイ・アイ・ザンス（Ｖ、１．Ｚａｎｎｌｓ）、
ジエー・エル・ブレスロク（Ｊ　、　Ｌ、　Ｂｒｅｓｌ
ｅｗ　）　、ジー・ユターマン（Ｇ、　Ｕｔｅｒｍｍｎ
ｎ　）　、　７−　ｋ　舎ダブＩ）　ニー　？−レイ（
Ｒ，Ｗ、　Ｍａｈｌｅｙ　）　、ジー・エッチ・ワイス
ブレ’−（Ｋ、Ｈ，Ｗｅｌｓｇｒａｂａｒ）、アールー
ジエー＋／Ｓ−グ−Ｃｋ　（Ｒ，Ｊ　、　）（ａｖａｌ
　）　、ジシ・エル・２−ルＰシュタイン（Ｊ　、　Ｌ
、　Ｇｏｌｄｓｔａｉｎ　）　、エムー！ス−ブラウン
（Ｍ、Ｓ、Ｂｒｏｗ＋ｓ）、ジ／−・ジョン７エルド（
Ｇ、１９ｃｈｏｎｆｅｌｄ）、　／プリューアール・ノ
１ザーｒ（Ｗ、　Ｒ，Ｈａｔｚａｒｄ　）　、シー・ク
ラｙ（０，Ｂｌｕｍ）（１９８２）ジャーナル・オブ・
リピド・リサーチ（Ｊ、Ｌｉｐｉｄ　　Ｒａｓ、）　　
２３．　９１１−９１４　。 １１、ジー・ユターマン（Ｇ、　Ｕｔｅｒｍｅａｎ　）
　＋ニー・　シュタインメツツ（Ａ、　Ｓｔｅｉｎｍｅ
ｔｓ　）及びダブリュ・ウエーノ々−（Ｗ、Ｗｅｂｅｒ
　）　（１９８２）　ヒユー　−ｖ　ン・ジエネテイク
ｘ（Ｈｕｍ、　Ｇｅａｅｔ、）６０．３４４−３５１゜
１２、アール・ジエー・／％−ペル（Ｒ，Ｊ、Ｈａｖｅ
ｌ　）（１９８２）米国医学講座（Ｍｅｄ、　０ＬＬｎ
、　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ、）６６、４４１−４５４゜ １λエツチ・ジエー・メンぜル（Ｈ，Ｊ　０Ｍｅｎｚｅ
ｌ　）　。 アール・ジー・クラデツキ−（几、Ｑ、に１ａｄｅｔｚ
ｋｙ）及びジー・アスマン（Ｇ、人ｓｓｍａａｎ）　（
１９８３）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリイ（Ｊ、ＢＡｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２５６．９０７
７−ｄ９０８３゜１４　ジー・エッチ・ワイスグレーノ
々−（ｘ、　Ｈ。 ９０７７−９０８３゜ １５、　　ニス・シー・ラール・ジュニア（Ｓ、ｃ、Ｒ
ａｕＪｒ）、ジー・エッチ・ワイスグレー／マ−（Ｋ、
Ｈ。 Ｗｅｔｓｇｒａｂｅｒ　）　、ティー・エル・イネラリ
ティ（Ｔ、ｌＬ、　Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ　）及びアー
ル・ダブリュ・マーレイ（Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌａｙ）　（
１９８２）プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミツク・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｐａｔｌ、人ｃｓ
ｄ、　８ｃｉ、）、米国、７９゜４６９６〜４７００゜ １＆　ニス・シー・ラール・ジュニア（８，Ｏ，Ｒａ１
ｌＪｒ）、ジー・エッチ・ワイスグレー／マー（Ｋ、Ｈ
。 Ｗｅ　［ｓｇｒａｂｅｒ　）　、ティー・エル・イネラ
リティ（Ｔ、　Ｌ、　Ｉｎｎｅｒａ出ｙ）、アール・ダ
ブリュ・マーレイ（Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ）及びジー・
アスマン（Ｇ。 Ａｉｉｍａｏｎ）　（１１１８３）臨床研究会報（Ｊ、
０Ｉｉｎ。 Ｉｎｖｇｓｔ、）７１．１０２３−１０３１゜１７、　
　ジー・エッチ・ワイスグレーノ？−（Ｋ、Ｈ。 Ｗｅ（ｓｇｒａｂｅｒ　）　、ニス・シー・ラール・ジ
ュニア（８，Ｏ，Ｒａ１ｌ　Ｊｒ）、ティー−Ｚｋ−イ
ネラリティ（Ｔ　、　Ｌ、　Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ　）
　、　７−　Ａ／　・ダブ＋Ｊ　ニー　−ｒ−レイ（Ｒ
，Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ）、ティー・クーシ（Ｔ。 Ｋｕｕａｌ　）及びシー−ニー７ホＡ／　ム（（１，Ｅ
ｈｎｈｏｔｍ）（１９８４）臨床研究会報（Ｊ、０１Ｉ
ｎ、　Ｉａｎｅｓｔ、）７３゜１０２４−１０３３゜ １９、　７−ル・２プリュー？−レイ（Ｒ，Ｗ、　Ｍａ
ｈｌｅｙ）　。 ティー・エル・イネラリティ（Ｔ、　Ｌ、　Ｉｎｎｅｒ
ａｒｉｔＹ）　＋ニス・シー・ラール・ジュニア（８，
Ｏ，Ｒａ１ｌ　Ｊｒ）及びジー・エッチ・ワイスグレー
ノ々−（Ｋ、　Ｈ。 Ｗｅｉｓｇｒｉｂｅｒ　）　ニューヨーク科学学会年報
（Ａｎｎ。 ＮＹ、Ａｃｍｄ、　Ｓ　ｃｌ　、　）　＄４中。 ２０、　　ティー・エル・イネラリティ（Ｔ、　Ｌ、　
Ｉｎｎｅｒ−ａｒｉｔｙ　）　、イー・ジエー・フリー
ドランダー（ＬＪ　、　Ｆｒ１ｅｄｌａ／ｎｄａｒ　）
　、　ｘス・シー・ラール・・ツユニア（８，Ｏ，Ｒａ
１ｌ　Ｊｒ）、ジー・エッチ・ワイスブレー／’　−（
Ｋ、Ｈ，Ｗｅｌｓｇｒａｂｅｒ　）及びアール・　ダブ
リ！、　−７−レイ（Ｒ，Ｗ、　Ｍａｈｌｅｙ）　（１
９８３）生化学会報（Ｊ、ＢＡｏｌ、　Ｏｈｅｍ、）２
５８．１２３４１−１２３４７゜２０２、ティー・エル
・イネラリティ（Ｔ　、　Ｌ、　Ｉｎｎｅｒ−ａｒｉｔ
ｙＬケー・エッジーワイスグレーパ々−（Ｋ。 Ｈ，Ｗｅｉｓｇｒａｋ＋ｅｒ　）　、シー・ニス・アー
ノルｌ’　（Ｋ。 Ｓ　、Ａｒｎｏｌｄ　）　、ニス・シー・ラール・ジュ
ニア（８，０−Ｒａ１ｌ　Ｊｒ）及びアール・メフＩＪ
　ユ、　マーレイ（ＲｌＷ、Ｍａｈｌｅｙ）　（１９８
４）生化学会報（Ｊ。 Ｂｌｏｔ、　Ｏｈｅｍ、）２５９．７２６１−７２６７
゜２Ｌ　　シー・エッチ・ワイスグレーパ々−（Ｋ、Ｈ
。 Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ　）　＋ティー・エル・イネラリ
ティ（Ｔ、Ｌ、　Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ　）　、シー・
ジエー・ハーグ−（Ｋ。 Ｊ　、　Ｈａｒｄｅｒ　）　、アール−ダプリュ・マー
レイ（糧ｗ、　Ｍａｈｌｅｙ　）　、アール・２ブリユ
・ミル２（Ｒ，Ｗ。 Ｍｌｌｎｅ　）　、レイ・エル・ｆｆ−セル（Ｙ、Ｉ、
、Ｍａｒｃｅｌ　）及びジエー・ティー・スパロウ（Ｊ
、Ｔ、８ｐａｒｒｏｗ）（１９８３）生化学会報（Ｊ　
、　ＢＡｏｌ　、　Ｃ！ｈｅｍ、　）　２５９　。 １２３４８−１２３５４゜ ２ａニー・シー・レムリ（Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｌ
　）（１９７０）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　（ｏ
ンｒン）μ巨：６８０−６８５゜ ２７、　　エッチ・タウビン（Ｈ，Ｔｏｗｂｌｎ　）　
、ティー・スターへリン（Ｔ、　５ｔａｅｈｅｌｌｎ）
及びジエー・ヒートｙ　（Ｊ　、Ｇｏｒｄｏｎ）　（１
９７９）プロン−ディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミツク・サイエンス（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　）米国１４８　：
　１０７−１２７゜２＆エツチ・ジ！　−’　”ｆ　７
ゼ＃（Ｈ，Ｊ、λ（ａｎｚｅｌ　）等（１９８４）　、
生化学会報（Ｊ、ＢＡｏｌ、　Ｑｈｅｍ、　）２５４　
：３０７０−３０７６　（１９８４）。 ２９、　　シー・エッチ・ワイスグレー７？−（Ｋ、Ｈ
。 ＷｅＬｓｇｒａｂｅｒ　）及びアール・ダゾリュ・マー
レイ（Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ　）　（１９８０）ジャー
ナル・オブ・　リピＰ・リサーチ（Ｊ、Ｌ＋ｐｔｄ、胞
１．）２１．３１６−３２５゜３０、　　ティー・エル
・イネラリティ（Ｔ、Ｌ、　Ｉｎｎ５−ｒａｒｉｔｙ　
）　、アール・イー・パイタス（Ｒ，Ｂ、ＰＩｔａｓ）
及びア ール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ，Ｗ、　Ｍａｈｌｅｙ　
）（１９７９）生化学会報（Ｊ、ＢＡｏｌ、　Ｏｈｅｍ
、　）２５４　。 ４１８６−４１９０゜ ３１、　　ティー・エル・イネラリティ（Ｔ、Ｌ。 ｒｎｎｃｒａｒ＋ｔｙ）及びアール・ダブリュ・マーレ
イ（Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ）　（１９７Ｂ）　ノ”イオ
ヶミストリイ（ＢＡｏｃｈｅｍｉｓｔ＋７）　１７　、
１４４０−１４４７゜３ｚ　　　ディー・レイ・ヒュー
イ（Ｄ、Ｙ、Ｈｕｉ）、ティー・エル・イネラリティ（
Ｔ、Ｌ、Ｉｎｎａｒｓ＋ｒｉｔｙ）及びアール・ダブリ
ュ・マーレイ（几、Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ　）（１９８１）
生化学会報（Ｊ、ＢＡｏｌ、　Ｏｈｅｍ、　）２５６　
。 ５６４６−５６５５゜ ３ａ　　アール・ダブリュ’？−レイ（Ｒ，Ｗ、　Ｍａ
ｈｌｅｙ）　。 ティー・エル・イネラリティ（Ｔ、Ｌ、　Ｉｎｎｅｒａ
ｒｔｔｙ）　。 シー・エッチ・ワイスグレーパー（Ｋ、Ｈ。 Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ　）及びニス・レイ・オ（ｓ、ｙ
、ｏｈ）（１９７９）臨床研究会報（Ｊ、０１ｌｎ、　
Ｉｕｖｅｓｔ、）６４゜７４３−７５０゜ 実施例３９ ｗｅｔ　−ａｓｐ−ｇｉｎ−ｂＧＨアナログの生物学的
活性最近の研究によれば（ビー・ジエー・エバーＰ（Ｐ
、Ｊ、Ｅｐｐａｒｄ）及びディー・イー・ＡつＷ７（Ｄ
。 Ｅ、　Ｂａｕｍａｎ　）、１９８４年コーネコ−品製造
業者用栄養学会会報（Ｐｒｏｃｅａｄｌｒ＋ｇｓ　ｏｆ
　１９８４０ｏｒｎｅｌｌＮｕｔｒｉｔｌｏｎ　０ｏｎ
ｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｄ　Ｍａｎｕｆａｃｔ
ｕｒｅｒｓ）５〜１２ページ））、メチオニル−ウシ成
長ホルモンを１２週間に亘シ連続投与すると、コントロ
ールに比較して１０〜４０％の産乳量の増加が得られた
。 アナログを使用しても同様の結果が得られた。 最近の研究（シー・ニー・スペンス０９人、Ｂｐｅｎｃ
ｅ等の論文「雌ブタの胎児内エネルギ蓄積及び乳汁分泌
性能に関する外因性成長ホルモンの効果（Ｆｆｆｅｃｔ
　ｏｆ　Ｂｘｏｇｅａｅｏ１１８　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏ
ｒｍｏｒ＜　０ｎＦａｔａｌ　Ｂｎｅｒｇｙ　Ｓｔｏｒ
ａｇｅ　ａｎｄ　Ｌａｃｒｍｔｉｏｘ　Ｐｅｒｆｏｒ　
−ｍａｎｃｅ　Ｉｎ　８ａｗｓ　）Ｊ　、米国動物科学
協会年例会（Ｔｈｅ　Ａｎｎｕａｌ　　Ｍｅｅｔｉｎｇ
　　ｏｆ　　Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ８ｏｃｉｅｔｙ
　ｏｆ　ＡｒＬｌｍｍｌ　８ｃｌｅｎｃｅ）、ミズーリ
大学、１９８４年８月７〜１０日）によれば、下童体由
来のブタ成長ホルモンは雌ブタの乳汁分泌と同産仔ブタ
の生存率とを向上させることが判明している。 乳汁分泌性能テストに於いて、ｍｅｔ−ｐＧＨアナログ
ヲケ娠ブタに投与すると、雌ブタの乳汁分泌と同産仔ブ
タの生存率とが改良された。 実施例４１ を髄虚血の治療に於ける組換１９０Ｄの使用麻酔をかけ
た犬をニコレットコンパクト（ＮｉｃｏｌｅｔＯｏｍｐ
ｍｃｔ）　４励起Ｉテンシヤルシステムにつなぎ、後脳
骨神経に４．７回／秒の割合で連続的に２５０回の刺激
を与えて基準量５Ｆｉｐ　（体感励起ポテンシャル（Ｓ
ｏｍｉｔｏｓｅｙＬｓｏ７Ｆｉｖｏｋａｄ　Ｐｏｔｅｎ
ｔｉａｌｇ）　）を得た。 ２５０回の刺激に関する励起ポテンシャルをｐｐｚとＯ
ｘ（頭皮上の２つの特異点）での２つの電極から記録し
、信号平均化装置で平均化して信号対ノイズ比を低減し
、ＳＥＰをスクリーンにディスプレイした。 次に、左胸部を切闘し、左鎖骨下動脈の真向いの遠位の
下行大動脈を解剖単離してクロスクランプができるよう
に準備した。動脈のクロスクランプを行なう予定部位の
近傍に巾着縫合糸を挿入した。また、近位の動脈血圧を
モニターし同時に実験グループについては投与薬剤の注
入をモニターするために２０ゲージサイズのカニユーレ
を挿入した。更に１動脈のクロスクランプ後の血圧のモ
ニターと血圧調節用の瀉血とを行なうために１４ゲージ
サイズのカニユーレを右大腿動脈に挿入した。溶血ガス
を連続的に採取し、溶血ガスが正常範囲内に維持される
ようにしスピレータを調節した。 次に左鎖骨下動脈の真向の遠位の動脈のクロスクランプ
を実施した。ＳＥＰは１分間隔でリピートした。近位動
脈の高血圧をコントロールするために、平均血圧を９０
〜１１０　ｗｎＨｆに維持するように大腿動脈から瀉血
した。８ＢＰ消滅後、動脈クロスクランプを１０分間維
持した。３ＦＩＰ追跡図の消滅は、膨大動脈のクロスク
ランプによって生じたを髄内部の虚血が、を髄のを柱内
部の求心性イン／ぐルスの伝達を調節できないほど重症
になったことを意味する。５ＦｉＰ消滅の１０分後にク
ロスクランプを中止した。犬が低血圧状態になったため
、血液、リンガ−ｌｉｎｇｅｒ　）乳酸塩及び炭酸水素
ナトリウムを注入した。 コントロールグループ（８頭）に対しては組換　。 １９０Ｄを与えなかった。１つの実験グループ（８頭）
に対しては、クロスクランプ中止以前に組換５ＯＤ２５
　、０００単位の丸塊を投与し以後１０分間はｓ、ｏｏ
。 単位７分ずつ投与した。第２の実験グループ（７頭）Ｋ
対しては、クロスクランプ中止以前に組換ＳＯＤをｓｏ
　、　ｏｏｏ単位投与し、以後１０分間は１０．０００
単位／分ずつ投与した。 手術後、後肢の神経状態をターロブ（Ｔａｒｌｏｖ）の
判定基準によって採点した。この判定基準では、０＝後
肢麻痺、１＝後肢が僅かに運動可、２＝後基準量と比較
するためにＳＥＰをリピートし記録した。その後、動物
を殺した。結果は以下の通シである。 手術後７８目の神経状態、（ＰＯＤ）：コントロールグ
ループ（８頭）−４頭が評点〇−４頭が評点２又は３ 第１実験グループ−２５、０００単位のＳＯＤ丸塊プラ
スｓ　、　ｏｏｏ単位／分×１０回の投与−６頭が完全
回復 一２頭が評点２又は３ 第２実験グルーシーｓｏ　、　ｏｏｏ単位のＳＯＤ丸塊
プラス１０，０００単位／分Ｘ　１０回の投与−７頭全
部が完全回復。 動脈クロスクランプの開始後、ＳＥＰ消滅までに要する
時間は１２〜１９分である。ＳＩＰ消滅後にクロスクラ
ンプを十分量継続したので、クロスクランプの総継続時
間は２０分よシ長くなる。 切開胸部の縫合後の手術直後期間内に再度ｓｇｐを検査
した。 コントロール動物ではＳＥＰ追跡図が得られなかった。 対照的に処置動物では潜伏期間の波形遅れを伴なうＳＥ
Ｐ追跡図が回復していた。 要約すれば、組換ＳＯＤはを髄虚血による神経障害を防
止するために有効である。この処置方法は膨大動脈瘤の
外科手術の際に特に重要である。
【図面の簡単な説明】
第１図はｐ人Ｌ５００の、第２図はＩ）ＲＯ２１１とｐ
ＨＧ１２の、第３図はｐＳＡＬ　５２００−６の、第４
図は９３００８の、第５図はｐ　５００２の、第６図は
Ｉ）ＨＧ４４とｐＨＧ５０の、第７図はｐ　８３００−
１ＯＡの、第８図はｐＳＡＬ−１３０１５とｐ８ＡＬ−
１７０／１０の、第９図はｐＳＡＬ−２１０／４の、第
１０図はｐ８ＡＬ５６００−１の、第１１図はｐ３００
９（７）、第１２図はｐｓｏｏａの、第１３図はｐｓＯ
Ｄα２の、第１４図はｐ８０Ｄα１３とｐｓＯＤβ１　
ＯｌｇＫ　１５図はｐｓＯＤβＩＴＩＩノ、第１６図は
ｐｓＯＤβＩＴＴ−１の、第１７図はｐｓＯＤβ１−Ｂ
Ａ２　Ｏ１第１８図はｐＴＶ−１８８１７）、第１９図
はｐ５７９（７）、第２０図はｐＴＶ−１７０Ｏ１第２
１図はＩ）ＴＶ−１９０の、第２２図はｐＴＶ−１９４
ノ、第２ａ図１１ｐＳＡＬ１６０−５　ノ、第２４図は
ｐＴＶ−２１４の、第２５図はｐＴＶＲ２７９−ｓの、
第２６図はｐ９２００の、第２７図はｐＴＶ３００の構
築説明図である。 第２８図は人ｐｏｌｉｉアナログの細胞内蓄積に伴う細
胞毒性を示し、横軸は培養時間を、縦軸はコ四ニー数を
表わす。 第２９図は線維芽細胞の郊ハ１曵ｎＬ）レセプターに対
する人ｐｏＥ−ＤＭＰＯ複合体の結合を示し、左図は培
養線維芽細胞しセゾターに対する結合能、右図は培養線
維芽細胞に対する直接結合能を表わす。 横軸は人ｐｏＢ　−ＤＭＰＯ複合体の濃度、縦軸は結合
率を表わす。 第３０図は肝臓膜のＡｐＯＥレセプターに対する１２５
Ｉ−人ｐｏトＤＭＰＣ複合体の結合を示す。横軸は１２
５Ｉ−人ｐｏＢ　−ＤＭＰＯ複合体の濃度、縦軸は結合
の量を表わす。 第３１図はウサギ血漿からのヨウ素化ＡｐｏＥのクリア
ランスを示す。横軸は時間、縦軸は血漿中の放射活性の
％を表わす。 図面の、争Ｌ（内６ｆＪ淳３なし） ロｑ８−イＩ ＦＣ、、ノら ＲＪ・１７ Ｒノ８ 才・ シｍＨＩ Ｆ１才、イ９ Ｆ工Ｇ、２６ Ｆ工Ｇ＋　２７ Ｆ工Ｇ、２日 ＦＩＧ、３０ １２５！−Ａｐｏ−ε＠ＯＭＰＣ（Ｈタ＞／％”７Ｗ／
Ｊ）ＦＩＧ、３１ 吋ｒｕ”３　（Ｆｆｒジ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）改良されたベクターであり、 非耐熱性リプレッサーＣ＿ I を含有する適切な細菌宿
    主細胞に導入すると、この宿主細胞が、宿主細胞の温度
    がリプレッサー不活化温度まで上昇した際、前記ベクタ
    ーに挿入されている所望遺伝子を発現し得かつ前記遺伝
    子がコードしているポリペプチドを産生し得るようにな
    り、 ５′から３′に向かつて、 ラムダバクテリオファージ由来のプロモー ターおよびオペレーターＰ＿ＬＯ＿Ｌを含有するＤＮＡ
    配列と、 抗転写終結因子Ｎタンパク質を結合するためのＮ利用部
    位と、 この後に続くリボソーム結合部位を含有するＤＮＡ配列
    の置換を可能にする第１の制限酵素部位と、 所望遺伝子のｍＲＮＡが宿主細胞内のリボソームに結合
    し得るようにするためのリボソーム結合部位を含有する
    ＤＮＡ配列と、 ＡＴＧ開始コドン、または所望遺伝子をベクター内に挿
    入する際にＡＴＧ開始コドンに変換されるＤＮＡ配列と
    、 ＡＴＧ開始コドンと位相を合わせて所望遺伝子をベクタ
    ー内に挿入するための第２の制限酵素部位と、 を含む二本鎖ＤＮＡ分子を含んでおり、 さらに、 宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミド由来複製起
    点を含有するＤＮＡ配列と、 このベクターが宿主細胞中に存在するときに現れる選択
    可能または同定可能な表現形質に関連する遺伝子を含有
    するＤＮＡ配列ならびにｏ I ＾４＾３＾４という断片
    （このような断片はｏ I ＾４＾３＾４リプレッサータ
    ンパク質に対する遺伝子とこれに関連したプロモーター
    およびオペレーター配列とを含む）を含有するＤＮＡ配
    列から成る群から選択される選択手段と、 を含んでおり、 Ｐ＿ＬＯ＿Ｌプロモーターおよびオペレーター配列の３
    ′末端とＮ利用部位の５′末端との間の距離が約８０塩
    基対未満であり、Ｎ利用部位の３′末端とリボソーム結
    合部位の５′末端との間の距離が約３００塩基対未満で
    ある改良ベクター。 （２）選択手段が選択可能または同定可能な表現形質に
    関連する遺伝子を含有するＤＮＡ配列であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項に記載のベクター。 （３）表現形質が薬剤耐性であることを特徴とする特許
    請求の範囲第２項に記載のベクター。 （４）薬剤耐性がアンピシリンまたはテトラサイクリン
    に対する抵抗性であることを特徴とする特許請求の範囲
    第３項に記載のベクター。 （５）さらに、第２の制限酵素部位の３′に位置するＴ
    ＿１Ｔ＿２γＲＮＡ配列を含有するＤＮＡ配列を含むこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のベクター
    。 （６）Ｔ＿１Ｔ＿２γＲＮＡ転写終結配列が第２の制限
    酵素部位の３′末端から約１００塩基対未満であること
    を特徴とする特許請求の範囲第５項に記載のベクター。 （７）Ｔ＿１Ｔ＿２γＲＮＡ転写終結配列が第２の制限
    酵素部位の３′末端から約２０塩基対未満であることを
    特徴とする特許請求の範囲第６項に記載のベクター。 （８）選択手段がｏ I ＾４＾３＾４という断片を含有
    するＤＮＡ配列であることを特徴とする特許請求の範囲
    第１項に記載のベクター。 （９）ｏ I ＾４＾３＾４断片がＴ＿１Ｔ＿２γＲＮＡ
    転写終結配列の３′末端の後に位置することを特徴とす
    る特許請求の範囲第８項に記載のベクター。 （１０）複製起点がｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ受託番号第
    ３７０１７号）に由来することを特徴とする特許請求の
    範囲第１項に記載のベクター。 （１１）複製起点が、宿主細胞内で自律再生し得かつ少
    なくとも４００の構成コピーのベクターを産生し得る細
    菌プラスミドに由来することを特徴とする特許請求の範
    囲第１項に記載のベクター。 （１２）複製起点がＣｏｌＥ I に由来することを特徴
    とする特許請求の範囲第１１項に記載のベクター。 （１３）複製起点がｐＯＰ１Δ６であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１２項に記載のベクター。 （１４）さらに、リボソーム結合部位を含有するＤＮＡ
    配列とＡＴＧ開始コドンとの間に位置する第３の制限部
    位を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
    のベクター。 （１５）第１の制限酵素部位がベクター内の単一部位で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のベ
    クター。 （１６）第１の単一制限酵素部位が￥Ｅｃｏ￥Ｒ I で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第１５項に記載の
    ベクター。 （１７）第２の制限酵素部位がベクター内の単一部位で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のベ
    クター。 （１８）第２の単一制限酵素部位が￥Ｎｄｅ￥ I 、￥
    Ｂｇｌ￥IIまたは￥Ｓｍａ￥ I であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１７項に記載のベクター。 （１９）リボソーム結合部位が、ラムダバクテリオファ
    ージ由来Ｃ＿IIでありかつ配列： 【遺伝子配列があります】 を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
    のベクター。 （２０）リボソーム結合部位が、ラムダバクテリオファ
    ージ由来Ｃ＿IIの変異体でありかつ配列：【遺伝子配列
    があります】 を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
    のベクター。 （２１）リボソーム結合部位がｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
    受託番号第３７０１７号）に由来する天然のβ−ラクタ
    マーゼリボソーム結合部位であることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項に記載のベクター。 （２２）リボソーム結合部位が配列： 【遺伝子配列があります】 を有する合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項に記載のベクター。 （２３）リボソーム結合部位が配列： 【遺伝子配列があります】 を有する合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項に記載のベクター。 （２４）添付の第２図に示される制限地図を有しＡＴＣ
    Ｃに寄託されている（受託番号第 ３９７８３号）ｐＪＨ２００という名称であることを特
    徴とする特許請求の範囲第２項に記載のベクター。 （２５）添付の第２図に示される制限地図を有しｐＲＯ
    ２１１という名称であることを特徴とする特許請求の範
    囲第２項に記載のベクター。 （２６）添付の第１９図に示される制限地図を有しｐ５
    ７９という名称であることを特徴とする特許請求の範囲
    第５項に記載のベクター。 （２７）さらに、￥Ｃｌａ￥ I 部位にクローン化され
    たｏ I ＾４＾３＾４断片を含有するＤＮＡ配列を含む
    ことを特徴とする特許請求の範囲第２６項に記載のベク
    ター。 （２８）添付の第７図に示される制限地図を有するプラ
    スミドｐ８３００−１０Ａ（ＡＴＣＣ受託番号第３９７
    ８５号）からｍｅｔ−ｐｈｅ　ｂＧＨ遺伝子を除去して
    誘導されたベクター。 （２９）添付の第８図に示される制限地図を有するプラ
    スミドｐＳＡＬ−１７０／１０からｒｅｃ　ｂＧＨ遺伝
    子を除去して誘導されたベクター。 （３０）添付の第９図に示される制限地図を有するプラ
    スミドｐＳＡＬ−２１０／４からｒｅｃ　ｂＧＨ遺伝子
    を除去して誘導されたベクター。 （３１）特許請求の範囲第１項に記載のベクターと、第
    ２の制限酵素部位に挿入されたポリペプチドまたはその
    アナログをコードしている遺伝子とを含むポリペプチド
    の産生用プラスミド。 （３２）特許請求の範囲第１項に記載のベクターと、第
    ２の制限酵素部位に挿入されたウシ成長ホルモンまたは
    そのアナログをコードしている遺伝子とを含むウシ成長
    ホルモンまたはそのアナログの産生用プラスミド。 （３３）添付の第２図に示される制限地図を有しｐＲＯ
    １２という名称であることを特徴とする特許請求の範囲
    第３２項に記載のプラスミド。 （３４）添付の第３図に示される制限地図を有しｐＳＡ
    Ｌ５２００−６という名称であることを特徴とする特許
    請求の範囲第３２項に記載のプラスミド。 （３５）添付の第６図に示される制限地図を有し、ＡＴ
    ＣＣに寄託されている（受託番号第 ３９８０６号）、ｐＨＧ４４という名称であることを特
    徴とする特許請求の範囲第３２項に記載のプラスミド。 （３６）添付の第１０図に示される制限地図を有しｐＳ
    ＡＬ５６００−１という名称であることを特徴とする特
    許請求の範囲第３２項に記載のプラスミド。 （３７）添付の第７図に示される制限地図を有しｐ７２
    ００−２２という名称であることを特徴とする特許請求
    の範囲第３２項に記載のプラスミド。 （３８）添付の第６図に示される制限地図を有し、ＡＴ
    ＣＣに寄託されている（受託番号第 ３９８０５号）、ｐＨＧ５０という名称であることを特
    徴とする特許請求の範囲第３２項に記載のプラスミド。 （３９）添付の第９図に示される制限地図を有し、ｐＳ
    ＡＬ−２１０／４という名称であることを特徴とする特
    許請求の範囲第３２項に記載のプラスミド。 （４０）添付の第７図に示される制限地図を有し、ＡＴ
    ＣＣに寄託されている（受託番号第 ３９７８５号）、ｐ８３００−１０Ａという名称である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第 ３２項に記載のプラスミド。 （４１）添付の第８図に示される制限地図を有しｐＳＡ
    Ｌ−１３０／５という名称であることを特徴とする特許
    請求の範囲第３２項に記載のプラスミド。 （４２）添付の第８図に示される制限地図を有しｐＳＡ
    Ｌ−１７０／１０という名称であることを特徴とする特
    許請求の範囲第３２項に記載のプラスミド。 （４３）添付の第２６図に示される制限地図を有し、Ａ
    ＴＣＣにＡ４３２０として寄託されている（受託番号第
    ５３２１５号）、ｐ９２００という名称であることを特
    徴とする特許請求の範囲第３２項に記載のプラスミド。 （４４）特許請求の範囲第１項に記載のベクターと、第
    ２の制限酵素部位に挿入されたヒト成長ホルモンまたは
    そのアナログをコードしている遺伝子とを含む、ヒト成
    長ホルモンまたはそのアナログの産生用プラスミド。 （４５）添付の第２７図に示される制限地図を有しｐＴ
    Ｖ３００という名称であることを特徴とする特許請求の
    範囲第４４項に記載のプラスミド。 （４６）特許請求の範囲第１項に記載のベクターと、第
    ２の制限酵素部位に挿入されたスーパーオキシドジスム
    ターゼまたはそのアナログをコードしている遺伝子とを
    含む、スーパーオキシドジスムターゼまたはそのアナロ
    グの産生用プラスミド。 （４７）添付の第１３図に示される制限地図を有し、Ａ
    ＴＣＣに寄託されている（受託番号第 ３９７８６号）、ｐＳＯＤα２という名称であることを
    特徴とする特許請求の範囲第４６項に記載のプラスミド
    。 （４８）添付の第１４図に示される制限地図を有しｐＳ
    ＯＤβ１という名称であることを特徴とする特許請求の
    範囲第４６項に記載のプラスミド。 （４９）添付の第１５図に示される制限地図を有しｐＳ
    ＯＤβ＿１Ｔ＿１＿１という名称であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第４６項に記載のプラスミド。 （５０）添付の第１７図に示される制限地図を有しｐＳ
    ＯＤβ＿１−ＢＡ２という名称であることを特徴とする
    特許請求の範囲第４６項に記載のプラスミド。 （５１）添付の第１６図に示される制限地図を有しｐＳ
    ＯＤβ＿１ＴＴ−１という名称であることを特徴とする
    特許請求の範囲第４６項に記載のプラスミド。 （５２）特許請求の範囲第１項に記載のベクターと、第
    ２の制限酵素部位に挿入されたブタ成長ホルモンまたは
    そのアナログをコードしている遺伝子とを含む、ブタ成
    長ホルモンまたはそのアナログの産生用プラスミド。 （５３）添付の第４図に示される制限地図を有し、ＡＴ
    ＣＣに寄託されている（受託番号第 ３９８０４号）、ｐ３００８という名称であることを特
    徴とする特許請求の範囲第５２項に記載のプラスミド。 （５４）添付の第１１図に示される制限地図を有しｐ３
    ００９という名称であることを特徴とする特許請求の範
    囲第５２項に記載のプラスミド。 （５５）特許請求の範囲第１項に記載のベクターと、第
    ２の制限酵素部位に挿入されたニワトリ成長ホルモンま
    たはそのアナログをコードしている遺伝子とを含むニワ
    トリ成長ホルモンまたはそのアナログの産生用プラスミ
    ド。 （５６）添付の第５図に示される制限地図を有しｐ５０
    ０２という名称であることを特徴とする特許請求の範囲
    第５５項に記載のプラスミド。 （５７）添付の第１２図に示される制限地図を有し、Ａ
    ＴＣＣに寄託されている（受託番号第 ３９７９２号）、ｐ５００３という名称であることを特
    徴とする特許請求の範囲第５５項に記載のプラスミド。 （５８）特許請求の範囲第１項に記載のベクターと、第
    ２の制限酵素部位に挿入されたヒトアポリポプロテイン
    Ｅまたはそのアナログをコードしている遺伝子とを含む
    、ヒトアポリポプロテインＥまたはそのアナログの産生
    用プラスミド。 （５９）添付の第１８図に示される制限地図を有しｐＴ
    Ｖ−１８８という名称であることを特徴とする特許請求
    の範囲第５８項に記載のプラスミド。 （６０）添付の第２３図に示される制限地図を有しｐＳ
    ＡＬ１６０−５という名称であることを特徴とする特許
    請求の範囲第５８項に記載のプラスミド。 （６１）添付の第２０図に示される制限地図を有しｐＴ
    Ｖ−１７０という名称であることを特徴とする特許請求
    の範囲第５８項に記載のプラスミド。 （６２）添付の第２１図に示される制限地図を有しｐＴ
    Ｖ−１９０という名称であることを特徴とする特許請求
    の範囲第５８項に記載のプラスミド。 （６３）添付の第２２図に示される制限地図を有しｐＴ
    Ｖ−１９４という名称であることを特徴とする特許請求
    の範囲第５８項に記載のプラスミド。 （６４）添付の第２４図に示される制限地図を有しｐＴ
    Ｖ−２１４という名称であることを特徴とする特許請求
    の範囲第５８項に記載のプラスミド。 （６５）添付の第２５図に示される制限地図を有しｐＴ
    Ｖ２６４−４５という名称であることを特徴とする特許
    請求の範囲第５８項に記載のプラスミド。 （６６）添付の第２５図に示される制限地図を有し、Ａ
    ＴＣＣに寄託されている（受託番号第 ５３２１６号）、ｐＴＶＲ２７９−８という名称である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第 ５８項に記載のプラスミド。 （６７）適切な大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）宿主中
    に特許請求の範囲第３１項に記載のプラスミドを含む宿
    主ベクター系。 （６８）宿主が大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）Ａ１６
    ３７株（ＡＴＣＣ受託番号第３９３８５号：プラスミド
    ｐＲｅｃ２／３含有）であることを特徴とする特許請求
    の範囲第６７項に記載の宿主ベクター系。 （６９）宿主が大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）Ａ１６
    ４５株（ＡＴＣＣ受託番号第３９７８７号：プラスミド
    ｐＡｐｏＥ−Ｅｘ．２含有）であることを特徴とする特
    許請求の範囲第６７項に記載の宿主ベクター系。 （７０）宿主が大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）Ａ２０
    ９７株（ＡＴＣＣ受託番号第３９７８６号：プラスミド
    ｐＳＯＤα２含有）であることを特徴とする特許請求の
    範囲第６７項に記載の宿主ベクター系。 （７１）宿主が表現型ＳＡ５００ｈｉｓ＾−ｉｌｅ＾−
    ｇａｌ＾＋Δ８（λｃ I ８５７ΔＨ１ΔＢＡＭＮ＾＋
    ）またはＳＡ５００ｈｉｓ＾−ｉｌｅ＾−ｇａｌ＾＋Δ
    ８ｌａｃＺ＾−Ａ２１（λｃ I ８５７ｉｎｔ２ｘｉｓ
    １ｎｕｔＬ＿３ΔＨ１）の大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ
    ￥）であることを特徴とする特許請求の範囲第６７項に
    記載の宿主ベクター系。 （７２）プラスミドがさらにｏ I ＾４＾３＾４断片を
    含有しており、宿主が大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）
    Ａ１６４５株（λｉ４３４ｏＩ＾−ｍｉｎｉＴｎ１０）
    （ＡＴＣＣ受託番号第３９８０５号：ｐＨＧ５０含有）
    であることを特徴とする特許請求の範囲第６７項に記載
    の宿主ベクター系。 （７３）宿主が原栄養株であることを特徴とする特許請
    求の範囲第６７項に記載の宿主ベクター系。 （７４）宿主が大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）Ａ４２
    ００株（ＡＴＣＣ受託番号第５３２１８号：ｐＧＨ４４
    およびＦ′ｇａｌプラスミド含有：名称Ａ４３４６）で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第７３項に記載の
    宿主ベクター系。 （７５）宿主が大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）Ａ４２
    ５５株（ＡＴＣＣ受託番号第５３２１５号：ｐ９２００
    含有：名称Ａ４３２０）であることを特徴とする特許請
    求の範囲第７３項に記載の宿主ベクター系。 （７６）宿主がピオチン非依存性であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第７３項に記載の宿主ベクター系。 （７７）宿主が適切な溶菌株であることを特徴とする特
    許請求の範囲第６７項に記載の宿主ベクター系。 （７８）宿主が菌株Ａ４０４８（ＡＴＣＣ受託番号第５
    ３２１７号：ｐＧＨ４４含有：名称Ａ３１１１）である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第 ７７項に記載の宿主ベクター系。 （７９）適切な宿主中に特許請求の範囲第３２項に記載
    のプラスミドを含む宿主ベクター系。 （８０）適切な大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）宿主中
    に特許請求の範囲第４４項に記載のプラスミドを含む宿
    主ベクター系。 （８１）適切な大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）宿主中
    に特許請求の範囲第５２項に記載のプラスミドを含む宿
    主ベクター系。 （８２）適切な大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）宿主中
    に特許請求の範囲第５５項に記載のプラスミドを含む宿
    主ベクター系。 （８３）適切な大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）宿主中
    に特許請求の範囲第４６項に記載のプラスミドを含む宿
    主ベクター系。 （８４）適切な大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）宿主中
    に特許請求の範囲第５８項に記載のプラスミドを含む宿
    主ベクター系。 （８５）特許請求の範囲第６７項に記載の宿主ベクター
    系を、ポリペプチドを産生せしめ得る適切な条件下で成
    育せしめ、得られるポリペプチドを回収することからな
    るポリペプチドの製造方法。 （８６）特許請求の範囲第７９項に記載の宿主ベクター
    系を、ウシ成長ホルモンまたはアナログを産生せしめ得
    る適切な条件下で成育せしめ、得られるウシ成長ホルモ
    ンまたはアナログを回収することからなる、ウシ成長ホ
    ルモンまたはそのアナログの製造方法。 （８７）特許請求の範囲第８０項に記載の宿主ベクター
    系を、ヒト成長ホルモンまたはアナログを産生せしめ得
    る適切な条件下で成育せしめ、得られるヒト成長ホルモ
    ンまたはアナログを回収することからなる、ヒト成長ホ
    ルモンまたはそのアナログの製造方法。 （８８）特許請求の範囲第８１項に記載の宿主ベクター
    系を、ブタ成長ホルモンまたはそのアナログを産生せし
    め得る適切な条件下で成育せしめ、得られるブタ成長ホ
    ルモンまたはアナログを回収することからなる、ブタ成
    長ホルモンまたはそのアナログの製造方法。 （８９）特許請求の範囲第８２項に記載の宿主ベクター
    系を、ニワトリ成長ホルモンまたはアナログを産生せし
    め得る適切な条件下で成育せしめ、得られるニワトリ成
    長ホルモンまたはアナログを回収することからなる、ニ
    ワトリ成長ホルモンまたはそのアナログの製造方法。 （９０）特許請求の範囲第８３項に記載の宿主ベクター
    系を、スーパーオキシドジスムターゼまたはアナログを
    産生せしめ得る適切な条件下で成育せしめ、得られるヒ
    トスーパーオキシドジスムターゼを回収することからな
    る、スーパーオキシドジスムターゼまたはそのアナログ
    の製造方法。 （９１）特許請求の範囲第８４項に記載の宿主ベクター
    系を、ヒトアポリポプロテインＥを産生せしめ得る適切
    な条件下で成育せしめ、得られるヒトアポリポプロテイ
    ンＥを回収することからなる、ヒトアポリポプロテイン
    Ｅの製造方法。 （９２）適切な条件が約４２℃で適当な時間宿主ベクタ
    ー系を成育せしめることからなり、前記成育を適切な培
    地上で行なわせることを特徴とする特許請求の範囲第８
    ５項に記載の方法。 （９３）４２℃での適当な時間が約１〜５時間であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第９２項に記載の方法。 （９４）適切な培地がカゼイン水解物であることを特徴
    とする特許請求の範囲第９２項に記載の方法。 （９５）天然のヒトアポリポプロテインＥのＮ−末端に
    付加されたアミノ酸メチオニンを有する、ヒトアポリポ
    プロテインＥのアナログ。 （９６）天然のヒトアポリポプロテインＥのＮ−末端に
    付加されたアミノ酸配列ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｌｅ
    ｕ−ｍｅｔを有する、ヒトアポリポプロテインＥのアナ
    ログ。 （９７）天然のブタ成長ホルモンのＮ−末端に結合した
    アミノ酸メチオニンを有する、ブタ成長ホルモンのアナ
    ログ。 （９８）天然のニワトリ成長ホルモンのＮ−末端に結合
    したアミノ酸メチオニンを有する、ニワトリ成長ホルモ
    ンのアナログ。 （９９）天然のヒトスーパーオキシドジスムターゼまた
    はそのアナログの非アセチル化形からなる、ヒトスーパ
    ーオキシドジスムターゼのアナログ。 （１００）特許請求の範囲第９９項に記載のアナログの
    非グリコシル化形からなる、ヒトスーパーオキシドジス
    ムターゼのアナログ。 （１０１）特許請求の範囲第９９項または第１００項に
    記載のスーパーオキシドジスムターゼのアナログの有効
    量と適切な担体とを含有する獣医用組成物。 （１０２）特許請求の範囲第９９項または第１００項に
    記載のスーパーオキシドジスムターゼのアナログの有効
    量と適切な担体とを含有する医薬組成物。 （１０３）反応体を適切な条件下で、特許請求の範囲第
    ９９項または第１００項に記載のヒトスーパーオキシド
    ジスムターゼのアナログに接触させることからなる、反
    応： ２０＿２＾−＋２Ｈ＾＋→Ｈ＿２Ｏ＿２＋Ｏ＿２を触媒
    する方法。 （１０４）特許請求の範囲第１０３項に従つてスーパー
    オキシドラジカルの還元を触媒することからなる、スー
    パーオキシドラジカルによつて生起される細胞損傷を減
    ずる方法。 （１０５）特許請求の範囲第１０３項に従つてスーパー
    オキシドラジカルの還元を触媒することからなる、再潅
    流に際してスーパーオキシドラジカルによつて生起され
    る損傷を減ずる方法。 （１０６）特許請求の範囲第９９項または第１００項に
    記載のヒトスーパーオキシドジスムターゼまたはそのア
    ナログを有効量で検体に投与することからなる、虚血後
    の再潅流に際して起こる検体の損傷を減ずる方法。 （１０７）再潅流の直前またはその間にスーパーオキシ
    ドジスムターゼを投与することを特徴とする特許請求の
    範囲第１０６項に記載の方法。 （１０８）虚血が全体的虚血であることを特徴とする特
    許請求の範囲第１０６項に記載の方法。 （１０９）特許請求の範囲第１０３項に従つてスーパー
    オキシドラジカルの還元を触媒することからなる、切除
    臓器の潅流に際してスーパーオキシドラジカルによつて
    生起される損傷を減ずる方法。 （１１０）臓器が角膜であることを特徴とする特許請求
    の範囲第１０９項に記載の方法。 （１１１）特許請求の範囲第９９項または第１００項に
    記載のヒトスーパーオキシドジスムターゼのアナログを
    有効量で潅流媒体に添加することからなる、切除単離臓
    器の生存期間を延長する方法。 （１１２）虚血後の再潅流時に特許請求の範囲第９９項
    または第１００項に記載のアナログを有効量で投与する
    ことからなる、検体の心筋梗塞の大きさを減ずる方法。 （１１３）特許請求の範囲第９９項または第１００項に
    記載のアナログを有効量で検体に投与することからなる
    、炎症を有する検体の治療方法。 （１１４）組換えスーパーオキシドジスムターゼまたは
    そのアナログを有効量で受容者に投与することからなる
    、臓器移植後の臓器受容者の損傷を減ずる方法。 （１１５）臓器が腎臓であることを特徴とする特許請求
    の範囲第１１４項に記載の方法。 （１１６）組換えスーパーオキシドジスムターゼがヒト
    スーパーオキシドジスムターゼであることを特徴とする
    特許請求の範囲第１１４項に記載の方法。 （１１７）組換えスーパーオキシドジスムターゼまたは
    そのアナログを有効量で検体に投与することからなる、
    検体の背髄損傷を減ずる方法。 （１１８）組換えスーパーオキシドジスムターゼがヒト
    スーパーオキシドジスムターゼであることを特徴とする
    特許請求の範囲第１１７項に記載の方法。 （１１９）組換えスーパーオキシドジスムターゼまたは
    そのアナログを有効量で検体に投与することからなる、
    背髄虚血後の検体の再潅流に伴なう損傷を減ずる方法。 （１２０）組換えスーパーオキシドジスムターゼアナロ
    グが特許請求の範囲第９９項または第 １００項に記載のアナログであることを特徴とする特許
    請求の範囲第１１４項または第 １１７項に記載の方法。 （１２１）酵素的に活性な真核生物スーパーオキシドジ
    スムターゼまたはそのアナログを、これをコードしてい
    るＤＮＡ配列を含有しかつ発現し得る細菌細胞内で産生
    せしめる方法であつて、前記細菌細胞を適切な条件下で
    適切な産生培地に維持することからなつており、この産
    生培地には培地中のＣｕ＾＋＾＋濃度が約２ｐｐｍより
    大きくなるような量のＣｕ＾＋＾＋が追加されているこ
    とを特徴とする方法。 （１２２）細菌細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
    　ｃｏｌｉ）細胞であることを特徴とする特許請求の範
    囲第１２１項に記載の方法。 （１２３）細菌細胞がプラスミドを含有しており、この
    プラスミドがその中に組み込まれたスーパーオキシドジ
    スムターゼまたはアナログをコードするＤＮＡ配列を含
    有していることを特徴とする特許請求の範囲第１２１項
    に記載の方法。 （１２４）培地中のＺｎ＾＋＾＋濃度が約２ｐｐｍより
    大きくなるような量のＺｎ＾＋＾＋も適切な産生培地に
    追加されていることを特徴とする特許請求の範囲第１２
    １項に記載の方法。 （１２５）スーパーオキシドジスムターゼがヒトスーパ
    ーオキシドジスムターゼまたはそのアナログであること
    を特徴とする特許請求の範囲第１２１項に記載の方法。 （１２６）特許請求の範囲第１項に記載の細菌細胞から
    、精製された酵素活性の真核生物スーパーオキシドジス
    ムターゼまたはそのアナログを回収する方法であつて、 産生培地から細菌細胞を単離し、約７．０〜約８．０の
    ｐＨを有する適切な溶液に細菌細胞を懸濁し、懸濁した
    細菌細胞の細胞壁を破砕し、得られた均質な懸濁液を適
    切な条件で音波処理し、得られた音波処理物を適切な条
    件下で遠心し、上清を約２時間ほぼ６５℃に加熱し、上
    清を冷却し適切な条件で遠心して透明な上清タンパク質
    溶液を生成し、得られた上清を適当な容量に濃縮し、濃
    縮したタンパク質溶液を約７．０〜約８．０のｐＨに平
    衡した適切なアニオン交換体上のイオン交換クロマトグ
    ラフィーにかけ、得られたスーパーオキシドジスムター
    ゼまたはアナログを含有する溶液を集め、適当な容量に
    濃縮し得られた溶液を約７．０〜約８．０のｐＨの緩衝
    溶液に対して透析し、濃縮した溶液を約７．０〜約８．
    ０のｐＨに平衡した適切なアニオン交換体上のイオン交
    換クロマトグラフィーにかけ、アニオン交換体に結合し
    たタンパク質を適切な塩勾配にさらし、得られたスーパ
    ーオキシドジスムターゼまたはアナログを含有する画分
    を集め、集めた画分を適当な容量に濃縮し、濃縮した画
    分を蒸留水に対して透析し、適切な緩衝液で問題とする
    溶液のｐＨを約４．０〜約５．０に調整し、緩衝した溶
    液を約４．０〜約５．０のｐＨに平衡した適切なカチオ
    ン交換体によ るイオン交換クロマトグラフィーにかけ、カチオン交換
    体に結合したタンパク質を適切な塩勾配にさらし、得ら
    れた、精製されたスーパーオキシドジスムターゼまたは
    アナログを含有する画分を集めることからなる方法。 （１２７）精製された酵素的に活性な組換え真核生物ス
    ーパーオキシドジスムターゼ。 （１２８）特許請求の範囲第１２１項に記載の方法によ
    つて産生された酵素的に活性なスーパーオキシドジスム
    ターゼまたはそのアナログ。 （１２９）単細胞微生物内で製造された、ヒトスーパー
    オキシドジスムターゼと実質的に同一のアミノ酸配列を
    有するポリペプチド。 （１３０）転写の流れ方向に沿つて、 （１）プロモーター、 （２）リボソーム結合部位、 （３）開始コドン、 （４）前記開始コドンと解読枠が一致し、３′−末端に
    停止コドンを有するヒトスーパ ーオキシドジスムターゼ構造遺伝子、 および （５）転写終結コドン を含む、微生物内で機能性のＤＮＡ構造体。 （１３１）組換えプラスミドがコードしている外来ポリ
    ペプチドを大腸菌（￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）宿主細胞内
    で産生させる方法において、宿主細胞として大腸菌（￥
    Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥）の原栄養株を使用することを特徴
    とする方法。 （１３２）ブタ成長ホルモンのアナログを有効量で雌の
    ブタに投与することからなる、授乳期 の雌ブタが産生する乳汁の量を増大させる方法。 （１３３）アナログがｍｅｔ−ブタ成長ホルモンである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１３２項に記載の方
    法。 （１３４）ブタ成長ホルモンのアナログを有効量で妊娠
    している雌のブタに投与することからなる、雌ブタの産
    生する乳汁の不足による乳児期の仔ブタの死を予防する
    方法。 （１３５）アナログがｍｅｔ−ブタ成長ホルモンである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１３４項に記載の方
    法。 （１３６）改良されたベクターであり、非耐熱性リプレ
    ッサーＣ＿ I を含有する適切な細菌宿主細胞に導入す
    ると、この宿主細胞が、宿主細胞の温度がリプレッサー
    破壊温度まで上昇した際、前記ベクターに挿入されてい
    る所望遺伝子を発現し得かつ前記遺伝子がコードしてい
    るポリペプチドを産生し得るようになり、５′から３′
    に向かつて、 ラムダバクテリオファージ由来のプロモーターおよびオ
    ペレーターＰ＿ＬＯ＿Ｌを含有するＤＮＡ配列と、所望
    遺伝子のｍＲＮＡが宿主細胞内のリボソームに結合し得
    るようにするためのリボソーム結合部位を含有するＤＮ
    Ａ配列と、ＡＴＧ開始コドン、または所望遺伝子をベク
    ター内に挿入する際にＡＴＧ開始コドンに変換されるＤ
    ＮＡ配列と、所望遺伝子をＡＴＧ開始コドンと位相を合
    わせてベクター中に挿入するための制限酵素部位と、 Ｔ＿１Ｔ＿２γＲＮＡ転写終結配列を含有するＤＮＡ配
    列と、 を含む二本鎖ＤＮＡ分子を含んでおり、 さらに、 宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミド由来複製起
    点を含有するＤＮＡ配列と、 このベクターが宿主細胞中に存在するときに現れる選択
    可能または同定可能な表現形質に関連する遺伝子を含有
    するＤＮＡ配列と、 を含んでいる改良ベクター。 （１３７）改良されたベクターであり、非耐熱性リプレ
    ッサーＣ＿ I を含有する適切な細菌宿主細胞に導入す
    ると、この宿主細胞が、宿主細胞の温度がリプレッサー
    破壊温度まで上昇した際、前記ベクターに挿入されてい
    る所望遺伝子を発現し得かつ前記遺伝子がコードしてい
    るポリペプチドを産生し得るようになり、 ５′から３′に向かつて、 ラムダバクテリオファージ由来のプロモーターおよびオ
    ペレーターＰ＿ＬＯ＿Ｌを含有するＤＮＡ配列と、 所望遺伝子のｍＲＮＡが宿主細胞内のリボソームに結合
    し得るようにするためのリボソーム結合部位を含有する
    ＤＮＡ配列と、 ＡＴＧ開始コドン、または所望遺伝子をベクター内に挿
    入する際にＡＴＧ開始コドンに変換されるＤＮＡ配列と
    、所望遺伝子をＡＴＧ開始コドンと位相を合わせてベク
    ター中に挿入するための制限酵素部位と、 を含む二本鎖ＤＮＡ分子を含んでおり、 さらに、 宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミド由来複製起
    点を含有するＤＮＡ配列と、 ｏ I ＾４＾３＾４という名の断片（このような断片は
    ｏ I ＾４＾３＾４リプレッサータンパク質に対する遺
    伝子とこれに関連したプロモーターおよびオペレーター
    とを含む） を含有するＤＮＡ配列と、 を含んでいる改良ベクター。
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