DE3587801T2

DE3587801T2 - Zubereitung enthaltend ein saures Fibroblastewachstumfaktor (aFGF).

Info

Publication number: DE3587801T2
Application number: DE3587801T
Authority: DE
Inventors: Kenneth A Thomas
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1984-12-24
Filing date: 1985-12-16
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2005-12-17
Also published as: DE3584005D1; EP0186084B1; EP0186084A2; JPS61180720A; CA1307221C; DE3587801D1; EP0437281B1; EP0186084A3; EP0437281A1; JP2510503B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung für die Stimulierung des Wachstums vaskulärer Endothel- Zellen, umfassend aFGF und Heparin.
Der aus dem Gehirn stammende saure Fibroblasten- Wachstumsfaktor, (aFGF), ist ein aktives Mitogen für vaskuläre Endothel-Zellen in Kultur und ist für das Wachstum solcher Kulturen zur Abdeckung polymerer vaskulärer Transplantate, das Wachstum solcher Kulturen auf röhrenförmigen Trägern zur Herstellung von Blutgefäßen zur Implantation und die Stimulierung oder Erleichterung des Blutgefäßwachstums und der -Wiederherstellung in vivo nützlich.
Die Reinigung und die Wundheilungsaktivität des aus dem Gehirn stammenden aFGF dieser Erfindung wurden in US-A-4 444 760, herausgegeben am 24. April 1984 für Kenneth A. Thomas, Jr., beschrieben. Das Protein wird ebenfalls von Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81, 357-361 (1984) beschrieben. Die gleichen oder ähnliche Proteine können auch in anderen, teilweise gereinigten Extrakten aus dem Zentralnervensystem oder anderen Organen vorhanden sein. Siehe zum Beispiel Maciag et al., Science, 225, 932 (1984).
Obwohl das Wachstum von vaskulären Endothel-Zellen in der Vergangenheit unter Verwendung sehr hoher Konzentrationen von fötalem Kälber- oder erwachsenem Rinderserum (10-30%) bewerkstelligt wurde, waren die Ergebnisse, abhängig vom speziellen Anteil des Kälberserums, verschieden, und die Geschwindigkeit des Zellwachstums war im allgemeinen langsam. Mit aFGF werden schnelle Wachstumsgeschwindigkeiten mit Serumspiegeln von 0 bis 2% erzielt.
Das Verfahren reproduzierbarer Stimulierung von vaskulärem Endothel-Wachstum, welches durch reine Proteinmitogene vermittelt wird, erlaubt:
1) Abdecken von synthetischen polymeren Gefäßen mit nicht-thrombogenen vaskulären Endothel-Zellen des Wirtstiers, einschließlich des Menschen, wobei viele oder alle der Gerinnungsprobleme, welche mit synthetischen Gefäßtransplantaten verbunden sind, beseitigt werden;
2) In vitro-Herstellung von Gefäßen durch Wachstum von vaskulären Endothel-Zellen des Wirts auf röhrenförmigen Trägern, zur Rück-Implantation in das gleiche Wirtstier, einschließlich des Menschen, wobei immunologische Abstoßung des Implantats vermieden wird, und die beständige begrenzte Versorgung guter Gefäße im Patienten zum Transplantat ebenfalls beseitigt wird; und
3) Stimulierung oder Erleichterung von in vivo- Blutgefäßwachstum und -Wiederherstellung, wobei der Blutfluß zu Geweben, denen ausreichend Sauerstoff und/oder andere vom Blut transportierte Bestandteile fehlen, erhöht wird.
Der aus dem Gehirn stammende aFGF, der in den neuen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet wird, wird, wie in US-A-4 444 760 beschrieben, hergestellt.
Die vollständige Aminosäuresequenz wurde für aFGF bestimmt. Sequenz-Bestimmungen reduzierter und carboxymethylierter Proteine zeigten zwei Aminoenden. Die längere Sequenz, aFGF-1, enthält sechs aminoterminale Reste, welche auf der kürzeren aFGF-2-Form nicht gefunden werden. Die relativen Mengen dieser zwei mikroheterogenen Formen des Mitogens variieren von einer Reinigung zur anderen, stehen aber bezüglich der Menge in enger Wechselbeziehung zur Menge der zwei Proteinbanden, die früher durch Elektrophorese in SDS-Polyacrylamidgelen gesehen wurden (Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 357 (1984)). Wie erwartet steht der Gehalt der längeren aminoterminalen Sequenz mit der relativen Menge der höheren Massenbande auf den SDS-Gelen in Wechselbeziehung. Wenn die Länge der Polypeptidkette an den Aminoenden der einzige Unterschied zwischen den zwei mikroheterogenen Formen, die auf den SDS-Gelen beobachtet werden, ist, dann ist der Massenunterschied zwischen ihnen nicht die früher, basierend auf SDS-Gel Wanderungsabständen, geschätzten 200 Dalton, sondern 642 Dalton. Es wird angenommen, daß die aminoterminale Verschiedenartigkeit das Ergebnis beschränkter Proteolyse, entweder in vivo oder während der Reinigung, ist.
Die vollständige Aminosäuresequenz wurde aus Sequenzen der Aminoenden und überlappender Peptide, welche durch proteolytische Spaltungen mit Trypsin (T), Staphylococcus aureus-V8-Protease (V8), Hydroxylamin (HA) und Bromcyan (CN) hergestellt wurden, bestimmt. Die carboxylterminale Sequenz des gesamten Proteins wurde durch regulierte Carboxypeptidase-A-Verdauung bestätigt.
Bei einer Suche in der derzeitigen Dayhoff-Protein- Datenbank ist aFGF einzigartig verglichen mit den etwa 2000 Proteinsequenzen, die in dieser Liste enthalten sind.
Die Sequenz ist wie folgt:
Peptidsequenzen, welche vorzeitig beendet wurden, weil erkannt wurde, daß sie an einem der zwei vorher bestimmten Aminoenden beginnen, werden nach dem letzten Abbauzyklus mit einem Sternchen gekennzeichnet.
Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen Heparin zusätzlich zum oben diskutierten aFGF. Solche Zusammensetzungen können zur Neovaskularisation von Oberflächenwunden und zum internen vaskulären Wachstum verwendet werden.
Das Verfahren für die Stimulierung vaskulärer Endothel- Zellen umfaßt die Behandlung einer Probe der gewünschten vaskulären Endothel-Zellen in einem Nährmedium mit aFGF bei einer Konzentration von etwa 1-10 ng/ml. Die Konzentration von Heparin ist etwa 10 bis 100 ug/ml.
Wenn das Wachstum der vaskulären Endothel-Zellen in vitro durchgeführt wird, ist die Gegenwart eines Nährmediums, wie Dulbeccos modifiziertes Eagle's Nedium oder eine Abwandlung davon, und eine niedrige Konzentrationen von Kälber- oder Rinderserum, wie etwa 0 bis 2 Vol.-% notwendig. Konservierungsstoffe, wie eine Penicillin-Streptomycin- Kombination oder andere Breitband-Antibiotika werden ebenfalls verwendet.
Die neue Zusammensetzung dieser Erfindung ist zum Abdecken von künstlichen Blutgefäßen mit Endothel-Zellen nützlich. Vaskuläre Endothel-Zellen vom Patienten würden durch Entfernen eines kleinen Teils eines peripheren Blutgefäßes oder kapillar-enthaltenden Gewebes erhalten werden, und die gewünschten Zellen würden in Kultur in Gegenwart von aFGF und Heparin und jeder anderen ergänzenden Komponente, die nötig sein könnte, wie Serum, gezüchtet werden. Nach dem Wachstum einer geeigneten Anzahl von Endothel-Zellen in Kultur, um das synthetische polymere Blutgefäß zu bedecken, würden die Zellen auf die innere Oberfläche des Gefäßes aufgebracht werden. Vorheriges Überziehen des künstlichen Gefäßes entweder kovalent oder nicht-kovalent mit entweder Heparin oder Proteinen, wie Fibrin, Collagen, Fibronectin oder Laminin, würde ausgeführt werden, um die Anhaftung der Zellen an die künstliche Gefäßoberfläche zu steigern. Die Zell-gefütterten künstlichen Gefäße würden dann durch Operation in den Patienten implantiert werden und würden, ausgefüttert mit den Patienten-eigenen Zellen, immunologisch verträglich sein. Das nicht-thrombogene Endothel-Zellen-Futter sollte das Auftreten der Blutgerinnsel-Bildung auf der Oberfläche des künstlichen Gefäßes herabsetzen und dadurch die Tendenz der Gefäßblockade oder Embolie anderswo herabsetzen.
Die neue Zusammensetzung ist ebenfalls zur Herstellung von künstlichen Gefäßen nützlich. Vaskuläre Endothel-Zellen und Zellen vom glatten Muskel des Patienten würden erhalten und getrennt in Kultur gezüchtet werden. Die Endothel-Zellen würden in Gegenwart des aFGFs und Heparin, wie vorstehend aufgeführt, gezüchtet werden. Die Zellen der glatten Muskulatur würden in Kultur mittels Standardtechniken gezüchtet werden. Eine röhrenförmige Netzmatrix eines biokompatiblen Polymers (entweder ein synthetisches Polymer, mit oder ohne Überzug aus entweder Heparin oder spezifischen Befestigungs-Proteinen' oder ein nicht-immunogenes biopolymeres Material, wie chirurgischer Nähfaden) würde verwendet werden, um das Kulturwachstum der glatten Muskelzellen auf der äußeren Seite und der vaskulären Endothel-Zellen auf der inneren Oberfläche zu unterstützen. Wenn die Endothel-Zellen einmal eine zusammenfließende Einzelschicht auf der inneren Oberfläche bilden und Mehrfachschichten von glatten Muskelzellen die Außenseite bedecken, wird das Gefäß in-den Patienten implantiert.
Die neue Zusammensetzung kann ebenfalls zur Auslösung vaskulären Wachstums verwendet werden. Der reine Wachstumsfaktor oder das entsprechende menschliche Protein und Heparin würden verwendet werden, um das Wachstum der Blutgefäße im Patienten auszulösen und zu fördern. Das Mitogen und Heparin würden zusammen mit allen nötigen Stabilisatoren und Verstärkern der Wirksamkeit an der Stelle des gewünschten vaskulären Wachstums verabreicht werden. Für Anwendungen, welche Neovaskularisation von Oberflächenwunden, wie Hautabschürfungen oder Verbrennungen, betreffen, würde die Formulierung direkt in einem verzögert freisetzenden Polymer mit einer Geschwindigkeit von etwa 1-100 ng/Tag/cm² der verwundeten Oberfläche verabreicht werden. Für internes vaskuläres Wachstum würde die Formulierung direkt in die Region, die neovaskularisiert werden soll, entweder aus implantiertem verzögert freigesetztem polymerem Material oder aus Pumpen, die langsam freisetzen, freigesetzt werden. Die Freisetzungsrate ist in jedem Fall vorzugsweise 100 ng-10 ug/Tag/cm 3 des verletzten Gewebes.

Beispiel

Gefäßbildende Wirksamkeit von aFGF Hühnerei-Gefäßbildungs-Biotest

Während des anhaltenden vaskulären Wachtums wird beobachtet, daß Endothel-Zellen sich aktiv vermehren. Deshalb testeten wir die Fähigkeit des gereinigten Mitogens, das Wachstum der Blutgefäße im chorioallantoiden Membran- Gefäßbildungstest im Hühnerei hervorzurufen. Basierend auf vorausgehenden Berichten, daß der rohe Tumor- Gefäßbildungsfaktor mit zusätzlich verabreichtem Heparin wesentlich aktiver war, testeten wir die Vaskularisations- Antwort von Heparin allein und Heparin plus reinem aFGF.
Drei Tage alte Hühnerembryos wurden aus ihrer Schale entfernt und in Handiwrap-Beuteln, die in Papierbechern aufgehängt sind, gezüchtet. Die Öffnungen der Becher waren mit Handiwrap bedeckt, und die Eier wurden bei 37ºC in einem Gewebekultur-Inkubator 5-6 Tage inkubiert. Entweder 1 Mg reiner aFGF in etwa 30 ul des HPLC-Elutionslösungsmittels (7 mM Trifluoressigsäure/33% Acetonitril) oder eine identische HPLC-Lösungsmittel-Kontrollösung wurden mit einem gleichen Volumen einer 2%igen bei niedriger Temperatur gelierenden Agarose (Miles), gelöst in lactatierter Ringer's-Lösung (Abbott) mit 10 ug Heparin (aus Schweinedarm-Schleimhaut; Sigma Handelsklasse 1), gemischt. Man ließ Tröpfchen (60 ul) auf dem Zentrum steriler Thermanox-Gewebekultur Abdeckbänder aus Kunststoff mit 1,3 cm im Durchmesser (Miles) gelieren, und mindestens ein Teil des flüchtigen Acetonitrils verdampfte durch 15-30 Minuten Belüftung unter einem mit steriler Luft gefüllten Raum in einer Gewebekultur-Abzugshaube. Die Abdeckbänder wurden, Pellet nach unten, über der chorioallantroiden Membran der Eier angebracht und 3 Tage inkubiert. Eier, welche große weiße fokale Regionen unter den Abdeckbändern am Ende des Tests enthielten, welche vermutlich durch Entzündungszellen gebildet wurden, wurden verworfen. Die chorioallantroiden Membranen wurden mikroskopisch untersucht, und die Proliferation feiner Kapillaren unter dem Zentrum der Abdeckbänder von Beobachtern, die den Inhalt der Agarosepellets nicht kannten, markiert.
Eine 10-ug-Dosis Heparin pro Ei war inaktiv, aber es stellte sich heraus, daß die gleiche Menge an Heparin plus 1 ug aFGF pro Ei das Wachstum kleiner Kapillaren an der Stelle der Anwendung ohne ein Anzeichen von Entzündung förderte (Tabelle 1). Der Test ist reproduzierbar, die Ergebnisse sind eine Kombination aus drei separaten Tests mit verschiedenen Proben von aFGF. Kontrollversuch und positive gefäßbildende Antworten zeigen den Umfang der Kapillar- Proliferation , die durch aFGF induziert wird. Das Mitogen ist deshalb ein wirksames gefäßbildendes Protein in Gegenwart von Heparin. Tabelle 1 Gefäßbildende Wirkung von aFGF Probeninhalte Gefäßbildende Antwort Negativ Positiv Kontrollversuch aFGF
Diese Daten sind eine Kombination aus drei verschiedenen Experimenten. Unter Verwendung von t-Verteilungsstatistiken wurde berechnet, daß die Gruppe der Mitogen-stimulierten Eier mit einem Vertrauensintervall von 99,9% verschieden von der Kontrollgruppe ist.

Claims

1. Eine Zusammensetzung zur Stimulierung des Wachstums vaskulärer Endothel-Zellen, umfassend aFGF und Heparin.

2. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Neovaskularisation von Oberflächenwunden.

3. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1 zum inneren vaskulären Wachstum.